11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

43 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

54669. Запилення. Урок 261.5 KB
  Основні терміни і поняття: запилення перехресне запилення самозапилення. Вправа Дешифрувальник Запилення тема нашого уроку. Запилення.
54670. Опис власної системи роботи вчителя початкових класів 1.09 MB
  Проводити урокителепередачі вже стало традицією. Крім уроків –телепередач практикую уроки-подорожі уроки-ігри уроки-змагання інтегровані уроки.
54671. АКТУАЛЬНІСТЬ ДОСВІДУ 394.5 KB
  Глибінні засади освітніх реформ в Україні пов’язані із зміною освітньої парадигми з принципово новим цілепокладанням у педагогічному процесі із визнанням результатом навчання не ЗУНів а компетентності учнів і це суттєво впливає на цілі та зміст навчання організаційні форми методи та засоби. Зміст та методика викладання будьякого навчального предмету мають певні специфічні риси стосовно формування компетентностей учнів. додаток 4 Основні ідеї педагогічного досвіду полягають в наступному: підготувати учнів з...
54672. КАК ПОМОЧЬ СЛАБОУСПЕВАЮЩЕМУ УЧЕНИКУ 173 KB
  Задание 1. Посмотри вокруг операция абстрагирования Ученику предлагается посмотреть вокруг себя и увидеть как можно больше предметов одной и той же формы одного цвета из одного материала; предметов названия которых начинаются из одной и той же буквы Задание 2. Задание 1. Задание 1.
54673. Как помочь учиться учащимся 107.5 KB
  Для сильных учащихся подбираю задания требующие самостоятельности творческого поиска высокого уровня обобщения и систематизации изучаемого. Для слабых – задания повышающие активность в процессе восприятия осмысления нового материала задания оказывающие школьникам оперативную помощь в процессе первичного закрепления материала обучающие приемам рациональной умственной деятельности. Я объясняю новый материал второй раз и самостоятельные задания получают учащиеся средней группы. В конце урока я проверяю задания которые выполняли учащиеся...
54674. Опора і рух 149 KB
  Тіло згниває а кістки не стлівають. Під час розкопок при добуванні будівельних матеріалів піску вапняку мармуру люди знаходили кістки за ними визначали геологічний вік людини і починали їх вивчати. Історія вивчення скелета Повідомлення учня Давньогрецький вчений – філософ Демокріт сам збирав кістки на цвинтарі щоб вивчати скелет. А відомий римський лікар Клавдій Гален примушував своїх учнів приносити кістки мерців.
54675. Порушення функцій скелета та їхня профілактика 48.5 KB
  Мета уроку: розглянути вікові особливості опорнорухової системи показати причини що негативно й позитивно впливають на опорнорухову систему ознайомити учнів з наслідками порушень гігієни опорнорухової системи навчити дотримуватись правильної постави як запоруки здоров’я та довголіття закріпити знання про опорнорухову систему виховувати естетичну насолоду від споглядання правильної постави як складової зовнішньої краси Обладнання та...
54676. Година спілкування 42 KB
  Виховувати почуття патріотизму поваги до ветеранів;поважне ставлення до історичної пам’яті свого народу своїх рідних;моральну культуру учнів розвивати здатність відчувати співпереживати вміння слухати оточуючих. Обладнання: фотографії дідусів учасників Великої Вітчизняної війнифотографії пам’ятників нашого міста малюнки дітей. Не щезне в пам’ятілюдській як в ті страшні 19411945 роки воїни захищали рідну землю. Це свято не затьмариться в віках В цей день нестимуть люди квіти Ну обміліє пам’ятіріка В серцях нащадків буде жити.
54677. Органи чуття людини. Узагальнення 13.22 MB
  Мета: Узагальнити знання учнів про будову та функції сенсорних систем. Встановити особливості будови та функцій органів чуття людини, та їх пристосовування для дії в певних умовах. Сформувати усвідомлення цілісності організму людини. Навчити дітей самостійно обирати інформацію, коментувати її, створюючи презентації у програмі M.P.P.