11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

49 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

29389. Принципы построения учебных книг по литературному чтению: традиционное и инновационное. Детские книги как особый учебный материал для формирования читателя 23 KB
  Эту функцию выполняет учебник. Учебник рассматривает текст как информационное поле на котором состоится встреча автора и читателя. Типы книг для начальной школы: Обязательные: учебник хрестоматия учебникхрестоматия Факультативные: справочник энциклопедия словари рабочие тетради Принципы организации учебника: тематический по темам жанровый стихи рассказы сезонный Виды вопросов и заданий в учебниках: до текста и после текста репродуктивные на выявление первичного восприятия на анализ на синтез продуктивные...
29390. Урок литературного чтения и его особенности. Моделирование урока литературного чтения в логике одной из образовательных программ (на примере одного литературного произведения) 57 KB
  Урок литературного чтения и его особенности. Моделирование урока литературного чтения в логике одной из образовательных программ на примере одного литературного произведения Современный урок литературного чтения имеет свои особенности: Каждый урок рассматривается как часть более широкой системы литературное развитие школьника Урок это этап в изучении литературного произведения Урок это художественнопедагогическое целое содержание форма уока будет определяться жанром и особенностями произведения а так же художественным миром...
29391. Конструктивное исполнение электрооборудования в НГП 30 KB
  Конструктивное исполнение электрооборудования в НГП должно соответствовать условиям его эксплуатации. исполнение характеризуется тем что электродвигатели имеют специальные приспособления крышки кожухи сетки. Водозащищенное IP55 IP56 исполнение электродвигатели недоступны проникновению внутрь струй воды любого направления.
29392. Нерегулируемый ЭП буровых насосов 27.5 KB
  Двигатели брызгозащишенные с влагостойкой изоляцией с самовентиляцией; наверху корпуса двигателя смонтирован возбудитель связанный клиноременной передачей с валом двигателя. Номинальное напряжение двигателя 6 кВ частота вращения 750 об мин. Так как условия пуска двигателя бурового насоса сравнительно легкие момент статического сопротивления на валу двигателя составляет примерно 20 от номинального момента двигателя а время разгона составляет 34 сек в схеме предусмотрен прямой пуск двигателя с наглухо подключенным возбудителем. Для...
29393. Особенности конструкции ЭД станка-качалки 21 KB
  имеют повышенный пусковой момент который обеспечивается за счет специальной конструкции обмотки ротора это может быть или глубокопазная обмотка 10:1 или двойная беличья клетка причем внутренняя клетка выполнена из меди а наружная из латуни имеющей большее удельное сопротивление чем медь. После вытеснения тока на поверхность сечение проводника по которому течет ток уменьшается при этом активное сопротивление обмотки ротора увеличивается и момент развиваемый ЭД при пуске возрастает так как он пропорционален приведенному активному...
29394. Регулируемый ЭП буровых насосов 66.5 KB
  В небольших пределах регулирование скорости электродвигателя буровых насосов можно осуществлять при применении асинхронных двигателей АД с фазным ротором при помощи включении в цепь ротора регулировочных реостатов. При снижении скорости на 2030 скольжение становится равным 0203 и потеря мощности в пусковых реостатах достигнет также 2030. Поэтому в настоящее время реостатный способ регулирования скорости АД не применяется. Схема обеспечивает изменение скорости вращения АД на 40 выше от номинальной.
29395. СИНХРОННЫЕ МАШИНЫ 37 KB
  Синхронные машины обладают свойством обратимости то есть могут работать как генератором так и двигателем.1а изображена схема синхронной машины с явно выраженными полюсами.1 Конструкция и электрическая схема синхронной машины с явно выраженными полюсами а б.
29396. Электрооборудование установок для насосной добычи нефти 237.5 KB
  Глубинный насос 1 станкакачалки подвешивается на колонне насосных труб 3рис. Плунжеру 2 насоса сообщается возвратнопоступательное движение с передачей энергии от балансира станкакачалки при помощи колонны штанг 4. Колонна штанг станкакачалки на устье скважины через шток соединена с головкой балансира 6 станкакачалки. Балансирный и кривошипный противовесы служат для уравновешивания нагрузки подвижной системы станкакачалки и двигателя при ходе колонны штанг вниз и вверх рис.
29397. Бесштанговые насосные установки с погружными центробежными насосами 36 KB
  Конструктивные особенности насосной установки с ЭЦН и электропривода. Установка с ЭЦН состоит из следующих основных элементов см. Серийно выпускаются ЭЦН около 30 типоразмеров с подачей от 40 до 500 м3 в сутки и номинальным напором от 400 до 1500 м. Погружной электродвигатель ПЭД ЭЦН представляет собой трехфазный асинхронный двигатель на 3000 об мин в герметичном исполнении с короткозамкнутым ротором помещенный в стальную трубу заполненную трансформаторным маслом и рассчитанный для работы при температуре пластовой жидкости до 90 0С.