11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

43 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

13968. Виразне читання байок Л. Глібова напам’ять 24.5 KB
  УРОК № 17 Тема.Виразне читання байок Л. Глібова напам’ять. Мета:розвивати навички виразного читання пам’ять артистичні здібності учнів; виховувати почуття справедливості почуття гумору естетичні смаки. Обладнання:портрет письменника збірки його творів; збірки...
13969. Акровірші «Хто вона?», «Що за птиця?» Л. Глібов 30.5 KB
  УРОК № 18 Тема.Л. Глібов. Акровірші Хто вона Що за птиця. Мета:ознайомити учнів із поняттям акровірш творами цього виду Л. Глібова; розвивати навички виразного читання аналізу акровіршів кмітливість спостережливість творчі здібності учнів; виховувати кращі ...
13970. МУЗИЧНИЙ ЗВУК. ЗВУКОРЯД. ЕНГАРМОНІЗМ ЗВУКІВ 47 KB
  Тема 1. МУЗИЧНИЙ ЗВУК. ЗВУКОРЯД. ЕНГАРМОНІЗМ ЗВУКІВ План 1.Звук як фізичне явище 2.Назви та позначення звуків 3. Знаки альтерації Загальне поняття про звук. Звук як фізичне явище є наслідком швидкого коливання будьякого пружного тіла струни металевої платівки нат
13971. Музичне мистецтво східних словян доби Київської Русі 16.74 KB
  Музичне мистецтво східних словян доби Київської Русі досягло високого рівня. Про це свідчать фольклорна спадщина давньоруський культовий спів музика княжого двору ратна військова музика. В усній народній традиції продовжують розвиватись ігри календарні та родинн
13972. Музыкальные выразительные средства в музыке 165.5 KB
  Музыкальные выразительные средства в музыке Фактура – от лат. – обработка – способ изложения склад музыкального произведения может быть одноголосная полифоническая гомофонная смешанная Мелодия – от греч. – напев пение одноголосное последование звуко...
13973. Анализ музыкальных произведений. Лекционный курс 679 KB
  В. В. Аннинская Лекции по курсу Анализ музыкальных произведений Учебное пособие Печатается по решению предметноцикловой комиссии Теория музыки музыкального училища им. Г.И. Шадриной Ульяновского государственного университета Рецензент – методис
13974. Башкирские музыкальные инструменты 73.5 KB
  Башкирские музыкальные инструменты. Башкирская инструментальная культура – наследие уходящее своими корнями в глубокую древность. Ее изучение началось сравнительно недавно первому подробному исследованию немногим более 100 лет а регулярный поиск и систематизация ин...
13975. Анатолий Константинович Лядов (1855-1914) 77.78 KB
  Будущий композитор родился в семье известного русского дирижёра Константина Лядова. Первые уроки музыки начал получать в пять лет от отца, а в 1870 году поступил в Петербургскую консерваторию в классы фортепиано и скрипки
13976. Биография П.И. Чайковского 16.76 KB
  Сообщение На тему: Биография П.И.Чайковского. Биография П.И.Чайковского Петр Ильич Чайковский родился в Предуралье в заводском поселке Воткинске. Его отец был горным инженером начальником завода. С раннего детства будущий...