11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

44 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

79421. Процессы проектирования. Методики описания системной архитектуры 94.71 KB
  Методики описания системной архитектуры. IEEE 1471 IEEE 1471 Рекомендуемые методы описания архитектуры программных систем. В нем излагается концепция отношений между архитектурой описанием архитектуры заинтересованными сторонами соображениями точками зрений разрезами представлениями и моделями а также подход к работе с ними. См подробное описание ссылка Модель Захмана Модель Захмана основана на дисциплине классической архитектуры и обеспечивает общий словарь и набор перспектив или структур для описания современных сложных...
79422. Процессы проектирования. Архитектурные стили и шаблоны проектирования 80.97 KB
  Шаблон проверяют на: Целостность и непротиворечивость Конструкция полностью покрывает заявленные требования к функционалу Устойчивость и производительность Два подхода проектирования: От общих функций к реализации От частного к общему Архитектурные стили Репозиторий: Описание Все совместно используемые подсистемами данные хранятся в центральной базе данных доступной всем подсистемам. Рекомендации Логично использовать если система обрабатывает большие объёмы данных. Преимущества Совместное использование больших объёмов данных эффективно...
79423. Процессы проектирования. Проектирование информационной архитектуры 44.84 KB
  Задачи решаемые во время проектирования информационной архитектуры: Идентификация и инвентаризация существующих данных включая определение их источников процедур изменения и использования ответственность оценка качества; Сокращение избыточности и фрагментарности данных с целью уменьшения стоимости хранения данных повышение качества данных за счет исключения противоречивости и неоднозначности различных экземпляров данных; Исключение ненужных перемещений и копирований данных; Формирование интегрированных представлений данных таких...
79424. Процессы проектирования. Построение ER модели. Виды нотации 56.27 KB
  С её помощью можно выделить ключевые сущности и обозначить связи которые могут устанавливаться между этими сущностями. Степень конца связи указывается графически множественность связи изображается в виде вилки на конце связи. Модальность связи так же изображается графически необязательность связи помечается кружком на конце связи. Наименование может быть одно для всей связи или два для каждого из концов связи.
79425. Процессы проектирования. Построение логической модели данных 47.37 KB
  Построение логической модели данных. Создание схемы базы данных на основе конкретной модели данных например реляционной модели данных. Для реляционной модели данных даталогическая модель набор схем отношений обычно с указанием первичных ключей а также связей между отношениями представляющих собой внешние ключи. Концептуальная модель хранилища данных представляет собой описание главных основных сущностей и отношений между ними.
79426. Процессы проектирования. Построение физической модели данных 44.2 KB
  Построение физической модели данных. Создание схемы базы данных для конкретной СУБД. Специфика конкретной СУБД может включать в себя ограничения на именование объектов базы данных ограничения на поддерживаемые типы данных и т. Кроме того специфика конкретной СУБД при физическом проектировании включает выбор решений связанных с физической средой хранения данных выбор методов управления дисковой памятью разделение БД по файлам и устройствам методов доступа к данным создание индексов и т.
79427. Процессы проектирования. Проектирование программной архитектуры 48.05 KB
  Подход на основе шаблонов примеры шаблонов можно найти в вопросе 26 Стандартная структура подхода на основе шаблонов: Имя паттерна Задача паттерна Описание решения алгоритм без привязки к реализации Плюсы применения паттерна Минусы применения паттерна Иногда 4 и 5 пункт заменяют рекомендацией. Плюсы применения шаблонов проектирования: Инструмент для решения простых задач на любом языке разработчикам легче взаимодействовать увеличивается скорость программирования. Минусы применения шаблонов проектирования: Зацикливание разработчика...
79428. Процессы проектирования. Шаблоны программной архитектуры 112.61 KB
  Как применять политику ценообразования Вырабатывается стратегия приоритета скидок объект Продажа не должен обладать информацией о применяемых скидках но можно было бы применить стратегию расчета скидок. Имеются классы проектирования Продажа ТоварПродажа продажа отдельного вида товара в рамках продажи в целом ТоварСпецификация описание конкретного вида товара. Объект Продажа должен передать сообщение Рассчитать промежуточную сумму каждому экземпляру класса ТоварПродажа которые в свою очередь передают сообщения СообщитьЦену объектам...
79429. Процессы проектирования. Проектирование инфраструктуры 42.3 KB
  В последнее время чаще начинают использовать стороннюю инфраструктуру – облачные сервисы etc. Это выгодно с точки зрения цены не покупаем оборудование а платим деньги только за аренду однако если вмешивается безопасность или очень критично производительность – то приходится тратить деньги на свою инфраструктуру. Следует различать инфраструктуру ИС и инфраструктуру проекта по созданию ИС. в этом билете имеется в виду инфраструктура ИС про инфраструктуру проекта можно читать в билете 11.