11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

44 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

81789. Эмпирический и теоретический уровни научного знания, критерии их различия 30.8 KB
  Эмпирический уровень научного познания включает в себя наблюдение эксперимент группировку классификацию и описание результатов наблюдения и эксперимента моделирование. Теоретический уровень научного познания включает в себя выдвижение построение и разработку научных гипотез и теорий; формулирование законов; выведение логических следствий из законов; сопоставление друг с другом различных гипотез и теорий теоретическое моделирование а также процедуры объяснения предсказания и обобщения. Соотношение эмпирического и теоретического...
81790. Структура эмпирического знания. Эмпирический факт 32.87 KB
  Вторым более высоким уровнем эмпирического знания являются факты. Научные факты представляют собой индуктивные обобщения протоколов это – обязательно общие утверждения статистического или универсального характера. Понятие факт имеет следующие основные значения: 1 Некоторый фрагмент действительности объективные события результаты относящиеся либо к объективной реальности факты действительности либо к сфере сознания и познания факты сознания . Эйнштейн считал предрассудком убеждение в том будто факты сами по себе без свободного...
81791. Специфика теоретического познания. Структура и функции научной теории 42.94 KB
  Структура и функции научной теории. Гипотеза является необходимым элементом естественнонаучного познания которое обязательно включает в себя: а собирание описание систематизацию и изучение фактов; б составление гипотезы или предположения о причинной связи явлений; в опытную проверку логических следствий из гипотез; г превращение гипотез в достоверные теории или отбрасывание ранее принятой гипотезы и выдвижение новой. В результате этой проверки гипотеза либо переходит в ранг научной теории или опровергается сходит в научной сцены . В...
81792. Основания науки и их структура. Идеалы и нормы исследования 29.55 KB
  Под основаниями науки понимают систему различных регулятивов детерминирующих цель и способы получения научного познания представление и понимание изучаемой реальности а также формы и степень обоснованности научного знания и его включения в человеческую культуру. В данной дефиниции ясно видна и структура оснований науки: цель и способы научного познания определяются идеалами нормами и критериями обобщенное представление и понимание исследуемой реальности воплощается в научной картине мира формы и степень обоснованности научного знания и...
81793. Научная картина мира, ее исторические формы и функции 36.34 KB
  В познании структуры и свойств универсума большое значение имеет научная картина мира являющаяся формой систематизации и обобщения научных знаний. Научная картина мира НКМ – система общих представлений о фундаментальных свойствах и закономерностях универсума возникающая и развивающаяся на основе обобщения и синтеза основных научных фактов понятий и принципов. Современная научная картина мира состоит из трех относительно самостоятельных блоков – естественнонаучного технического и социальногуманитарного единство которых обеспечивают...
81794. Философские основания науки. Роль философских идей и принципов в обосновании научного знания 32.6 KB
  Социальное познание исторически первоначально развивалось в рамках философии истории раздела философии связанного с интерпретацией исторического процесса и исторического познания. Термин философия истории используется в настоящее время в следующих основных значениях: а учение об исторической реальности в ее целостности и развитии общая теория исторического процесса как единства прошлого настоящего и будущего; б часть философии науки исследующая историческое познание рациональными средствами и методами т. Это философская версия...
81796. Динамика научного знания: Модели роста 39.09 KB
  Важнейшей характеристикой знания является его динамика т. Дело в том что для логического позитивизма в целом были характерны: а абсолютизация формальнологической и языковой проблематики; б гипертрофия искусственно сконструированных формализованных языков в ущерб естественным; в концентрация исследовательских усилий на структуре готового ставшего знания без учета его генезиса и эволюции; г сведение философии к частнонаучному знанию а последнего к формальному анализу языка науки; д игнорирование социокультурного контекста анализа...