11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

57 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

2695. Through Centuries with Love/ Через віки з любов’ю 603 KB
  Тема заходу: Through Centuries with Love Через віки з любов’ю Мета заходу: Методична: вдосконалити методику проведення позааудиторного заходу  з використанням індивідуальних і групових форм роботи з метою удо...
2696. Рыцарский турнир 45 KB
  Внеклассное мероприятие Рыцарский турнир Добрый день, дорогие друзья! Мы собрались сегодня с вами на праздник, который назвали Рыцарский турнир. А вы знаете, кто такие рыцари? В средние века рыцарями называли отважных, смелых воинов, котор...
2697. Человеческие чувства. О любви немало слов уж сказано 71 KB
  формирование и развитие у учащихся осознания существующих незыблемых общечеловеческих ценностей, идентичности восприятия их разными народами, необходимости бережного отношения не только к человеческим чувствам, но и к тому хрупкому миру, в котором им...
2698. 8 марта. Воспитательное мероприятие 48 KB
  Цели мероприятия: Образовательная - расширение и углубление знаний и умений учащихся. Развивающая - развивать чувство уважения друг к другу. Воспитательная - формирование у учащихся морально-нравственных качеств. Оборудование: бумага, фломастеры, цв...
2699. Золотой век российской науки и другие воспитательные мероприятия по физике 434 KB
  Устный журнал, посвященный истокам русской науки. Журнал включает в себя 3 блока: информационный, дискуссионный, игровой. Ведущими информационного блока выступают дети, исполняющие роли журналистов. Дискуссионный блок проводит классный руковод...
2700. Путешествие по англоязычным странам 4.56 MB
  Путешествие по англоязычным странам Цели:  обучающая: развивать познавательный интерес учащихся, развитие и поддержание интереса к странам изучаемых языков, воспитательная: воспитание толерантности и уважения к другой культуре, чуткости и...
2701. Актуальные вопросы ВИЧ-инфекции 109.38 KB
  Актуальные вопросы ВИЧ-инфекции Цель: Сформировать убеждение в необходимости избегать форм поведения, связанных с неоправданным риском для здоровья и жизни. Оборудование: Карты с изображением компании подростков (одна на парту). Текст История...
2702. Бинарный интегрированный урок по географии в 6-м классе на тему: 20.62 KB
  Бинарный интегрированный урок по географии в 6-м классе на тему: Облака Цель: Сформировать представление об облаках, их видах, условиях образования и значении. Задачи: Развитие умений анализировать, классифицировать, выявлять причинно-...
2703. Биогеоценоз леса. Растительный и животный мир лесов Мордовии 31.23 KB
  Биогеоценоз леса. Растительный и животный мир лесов Мордовии. ЦЕЛЬ УРОКА: продолжить формировать знания учащихся о биогеоценозах Мордовии, познакомить учащихся с биогеоценозом леса, его растительным и животным миром, воспитывать чувство бережного о...