11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

57 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

39267. Конструкция преобразователя напряжения 12/300В 743 KB
  Требования безопасности при производстве преобразователя напряжения Пожарная безопасность. Для питания электрооборудования от источников постоянного тока широко используются преобразователи напряжения. Наметившаяся тенденция микроминиатюризации в радиоэлектронике привела к тому что полупроводниковые преобразователи...
39268. Разработка конструкции печатного узла регулируемого двухполярного блока питания 950.5 KB
  1 Выбор типа печатной платы односторонняя двухсторонняя; 15 16 4.2 Выбор материала печатной платы; 16 18 4.3 Выбор метода изготовления печатной платы; 18 19 4.6 Расчет размеров печатной платы узла; 23 24 4.
39269. Технико-экономический расчет и проектирование участка изготовления печатных плат для сборки изделия: Реле времени с годовой программой 115000 штук 1.12 MB
  1 Расчет количества оборудования коэффициента загрузки. Технические данные оборудования 2.7 Расходы по содержанию и эксплуатации оборудования 2. По мере развития и совершенствования интегральных схем происходит увеличение сложности и стоимости оборудования для их производства и контроля качества.
39270. Рабочее место электромонтажника 134 KB
  В современных производственных условиях рабочие монтажники радиоэлектронной аппаратуры должны уметь пользоваться сборочномонтажными чертежами читать электрические схемы знать слесарносборочные монтажные и регулировочные операции маркировку современных электрорадиоэлементов обнаруживать и устранять неисправности в собираемых изделиях знать правила безопасности труда. 4 Перечень НТД по охране труда безопасности работы руководящим должностным и производственным инструкциям № № инструкций Наименование инструкций 1 489 По охране...
39271. Устройство защиты аппаратуры от аномальных напряжений сети 284.32 KB
  Котова Устройство защиты аппаратуры от аварийного напряжения сети Радио 2008 № 8 с. Из сетевого напряжения ограничительным диодом VD2 формируется переменное близкое к прямоугольному напряжение амплитудой около 18 В. Варистор RU1 защищает симистор VS1 от бросков напряжения при коммутации нагрузки индуктивного характера. Контроль величины сетевого напряжения осуществляет встроенный АЦП микроконтроллера DD1.
39272. Машиностроительный комплекс 425.17 KB
  Изменение структуры занятости по отраслям хозяйственного комплекса и сферам приложения труда свидетельствует о развитии рыночных структур в экономике. Повышение специализации производства требует использования высокопроизводительного оборудования; внедрения новых методов технологии механизации и автоматизации производственных процессов; повышения уровня квалификации персонала и увеличения производительности труда это снижает себестоимость при одновременном улучшении качества что приводит к увеличению реализации росту прибыли и...
39273. Социология труда и менеджмента. (Ф. Тейлор, Э. Мейо) 17.07 KB
  Социология труда (в развитых государствах Запада чаще она именуется индустриальной социологией) начала развиваться в 20-30-х гг. XX века. Исследуя проблемы, связанные с социальной сущностью труда, индустриальная социология важным объектом анализа ставит социально-трудовые отношения.
39274. АНАЛІЗ АСОРТИМЕНТУ, СПОЖИВНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ І КОКУРЕНТОСПРОМОЖНОСТІ КОМП’ЮТЕРІВ, ЯКІ РЕАЛІЗУЮТЬСЯ В ТОВ «САВ-ДІСТРИБ’ЮШН» В М. ДОНЕЦЬК 727 KB
  Основні тенденції розвитку світового і вітчизняного ринку компютерів Фактори які формують асортимент і якість комп'ютерів Аналіз ринку компютерів в Україні та світі Нові технології в розвитку асортименту компютерів Обґрунтування та удосконалення класифікації компютерів РОЗДІЛ 2. Практичні аспекти реалізації оцінки якості компютерів 2. Споживні параметри компютерів та методи їх оцінки 2.
39275. Изыскание путей повышения эффективности производства на НПК «Динкома» на основе оценки товарной политики предприятия 698.5 KB
  Инновационная политика разработка новой продукции ее торговой марки и упаковки основа эффективности предпринимательской деятельности в рыночных условиях гарантия высоких конкурентных позиций фирмы. Планы поступательного развития компании в средне и долгосрочной перспективе должны основываться на реалистичной и хорошо продуманной стратегической программе обновления ассортимента продукции. В интересах сохранения объемов сбыта или достигаемого уровня рентабельности предприятию необходимо быть готовым к немедленной замене вырабатываемой...