11458

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение содержания ТБКреактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова Вследствие индукции перекисного окисления липидов ПОЛ клеточных мембран и ...

Русский

2013-04-08

90.5 KB

55 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови
(метод А. Кона и В. Ливерсейджа в модификации Ю. Владимирова и А. Арчакова)

Вследствие индукции перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротеинов крови в организме накапливаются различные дериваты полиненасыщенных жирных кислот. Активность ПОЛ оценивают по накоплению продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основную массу которых составляет малоновый диальдегид (МДА). Возможна частичная реакция ТБК с различными альдегидами, аминокислотами, веществами, содержащими SH-, NH2-группы, поэтому при использовании метода говорят об изменении концентрации не МДА, а ТБК-реактивных продуктов или МДА-подобных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. В основе метода лежит реакция между МДА и 2-ТБК, которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК. Максимум поглощения этого комплекса определяется при длине волны 532 нм.

 

Основные этапы работы. В опытную центрифужную пробирку добавляют 0,5 мл сыворотки крови, в контрольную – 0,5 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку последовательно добавляют 1,5 мл трис-HCl буфера (рН 7,2), 1,0 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты и 1,0 мл 0,75 % свежеприготовленного раствора ТБК (навеску реактива растворяют в дистиллированной воде при нагревании на водяной бане). Пробы инкубируют 15 минут в кипящей водяной бане, содержимое окрашивается в розовый цвет. Пробы охлаждают, осадок белка удаляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Оптическую плотность надосадочной жидкости опытной пробы измеряют в кювете толщиной 1,0 см при длине волны 532 нм против контрольной пробы.

РАСЧЁТ. Расчеты проводят по формуле, учитывая коэффициент молярной экстинкции:

,      где:

V – объем вносимой плазмы крови в литрах,

1,56 · 105 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса

Е – экстинкция опытной пробы,

С – концентрация малонового диальдегида, мкмоль/л.


Вариант выполнения работы

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА)

Принцип. При высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при длине волны 532нм.

Ход работы. К 3мл фосфатного буфера (рН 7,4) добавляют 0,2мл сыворотки донорской крови, 0,5мл 1мМ калий перманганата, раствор перемешивают, через 10 минут добавляют 0,5мл 1мМ раствора феррум сульфата, 1мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугируют 10 минут при скорости 3000об/мин. К 2мл супернатанта добавляют 0,5мл 1М раствора хлоридной кислоты и 1мл 0,7% тиобарбитуровой кислоты. Смесь выдерживают 20минут на кипящей водяной бане. После быстрого охлаждения в пробирку наливают 3мл бутанола, старательно перемешивают и центрифугируют 10мин при скорости 3000об/мин.

Экстинкцию раствора определяют спектрофотометрически.

Концентрацию выражают в мкмоль МДА/мл сыворотки:

, где

Э – экстинкция раствора;

52,88 – коэффициент пересчета;

0,2 – объем сыворотки крови в пробе, мл.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации МДА свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ, что лежит в основе возникновения таких патологических состояний как канцерогенез, лучевая, ожоговая, язвенная болезни и т.д.


лабораторная работа

Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в сыворотке крови
(
метод Плацера в модификации В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной)

Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается преобразованиями в области двойных связей полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов клеточных мембран. Смещение таких связей приводит к появлению сопряженных диеновых и триеновых конъюгатов гидроперекисей липидов, которые имеют максимумы поглощения света в ультрафиолетовой области.

ПРИНЦИП МЕТОДА. О содержании конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов судят по интенсивности поглощения липидным экстрактом при длине волны 233 нм.

РЕАКТИВЫ: концентрированная HCl, гептан, изопропанол.

ХОД РАБОТЫ. К 0,2 мл сыворотки крови (в контроле – 0,2 мл H2O) добавляют 4 мл смеси гептан : изопропанол (1:1) и встряхивают 10–15 мин на лабораторном встряхивателе. Экстракцию удобно проводить в высоких пробирках (18–20 см) во избежание потери гептановой фазы, что может привести к завышению результатов. Для расслоения смеси добавляют 0,4 мл концентрированной HCl. Для устранения мутности из-за преципитированного белка желательно центрифугировать пробы в течение 10 мин при 3000 об/мин. После центрифугирования проб и расслоения фаз отбирают верхний гептановый слой и измеряют интенсивность поглощения опытных проб против контроля при длине волны 233 нм (ультрафиолетовый диапазон).

РАСЧЁТ. Результат анализа представляют в относительных единицах оптической плотности с пересчётом на 1 мл сыворотки крови. Расчёт производят по формуле:

С =  , где:

      VЭ    конечный объём гептан-изопропанолового экстракта (4,0 мл);

      VПЛ – объём сыворотки крови (0,2 мл);

      D233 – оптическая плотность гептан-изопропанолового экстракта,

 измеренная при длине волны 233 нм.

Провести расчет можно, исходя из величины молярного коэффициента экстинкции для сопряженных диенов при 233 нм:    2,2 · 105 М–1см–1.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

75756. Классификация горючих жидкостей по температуре вспышки 12.31 KB
  Несгораемые материалы которые при воздействии огня или высокой температуры не воспламеняются не тлеют и не обугливаются. К несгораемым относятся все неорганические строительные материалы: бетон железобетон газобетон металл стекло асбест кирпич природные камни цемент известь. Трудносгораемые материалы которые при воздействии огня или высокой температуры с трудом воспламеняются тлеют или обугливаются и продолжают гореть или тлеть при наличии источника огня. К этой группе относят: смешанные строительные материалы органического и...
75757. Понятие о взрыве паров и газов. Степень взрывоопасности газовоздушной смеси 13.99 KB
  Степень взрывоопасности газовоздушной смеси. Взрывоопасную среду могут образовать смеси веществ газов паров пылей с воздухом и другими окислителями кислород озон. Газовоздушные смеси могут воспламеняться взрываться только тогда когда содержание газа в смеси находится в определенных для каждого газа пределах. Нижний предел соответствует минимальному а верхний максимальному количеству газа в смеси при котором происходят их воспламенение при зажигании и самопроизвольное без притока тепла извне распространение пламени...
75758. Характеристика производственных помещений по степени пожарной опасности 13.33 KB
  Все помещения и здания подразделяются на 5 категорий. Б помещения где осуществляются технологические процессы с использованием ЛВЖ с температурой вспышки свыше 28 С способные образовывать взрывоопасные и пожароопасные смеси. В помещения и здания где обращаются технологические процессы с использованием горючих и трудногорючих жидкостей твердых горючих веществ которые при взаимодействии друг с другом или кислородом воздуха способны только гореть. Г помещения и здания где обращаются технологические процессы с использованием негорючих...
75759. Пожарная сигнализация, ее виды 12.36 KB
  Пожарная связь и сигнализация играют важную роль в мероприятиях для предупреждения пожаров способствуют своевременному их обнаружению и вызову пожарных подразделений к месту возникшего пожара а также обеспечивают управление и оперативное руководство работами на пожаре. Пожарную связь можно подразделить на связь извещения своевременный прием вызовов на пожары диспетчерскую связь управление силами и средствами для тушения пожаров и связь на пожаре руководство пожарными подразделениями. Наиболее надежное и быстродействующее средство...
75760. Понятие системы «Человек-среда обитания» 14.32 KB
  Человеку эти потоки необходимы для удовлетворения своих потребностей в пище воде воздухе солнечной энергии информации об окружающей среде и т. В то же время человек в жизненное пространство выделяет потоки механической и интеллектуальной энергии потоки масс в виде отходов биологического процесса потоки тепловой энергии и др. Естественная среда обеспечивает поступление на нашу планету потоков солнечной энергии что создает в свою очередь потоки растительной и животной масс в биосфере потоки абиотических веществ воздух вода...
75761. Причины региональной деградации биосферы. Формирование техносферы-нового типа среды обитания 15.71 KB
  Этим изменениям во многом способствовали: высокие темпы роста численности населения на Земле демографический взрыв и его урбанизация; рост потребления и концентрация энергетических ресурсов; интенсивное развитие промышленного и сельскохозяйственного производства; массовое использование транспорта; рост затрат на военные цели и ряд других процессов. Достижения в медицине повышение комфортности деятельности и быта интенсификация и рост продуктивности сельского хозяйства во многом способствовали увеличению продолжительности...
75762. Взаимодействие человека и техносферы 12.42 KB
  Взаимодействие человека и техносферы Человек и окружающая его среда гармонично взаимодействуют и развиваются лишь в условиях когда потоки энергии вещества и информации находятся в пределах благоприятно воспринимаемых человеком и природной средой. Любое превышение привычных уровней потоков сопровождается негативными воздействиями как на человека так и природную среду. и действиями человека. комфортное оптимальное когда потоки соответствуют оптимальным условиям взаимодействия: создают оптимальные условия деятельности и отдыха;...
75763. Понятие опасных и вредных производственных факторов 42.64 KB
  Понятие опасных и вредных производственных факторов По степени и характеру действия на организм все факторы условно делят на вредные и опасные. К вредным относятся такие факторы которые становятся в определенных условиях причиной заболеваний или снижения работоспособности. Опасными называют такие факторы которые приводят в определенных условиях к травматическим повреждениям или внезапным и резким нарушениям здоровья. И опасные и вредные факторы могут быть естественного или природного и антропогенного характера т.
75764. Теоретические основы и практические функции БЖД 21.59 KB
  Иначе говоря традиционно в данном научном направлении рассматривается преимущественно лишь локальная система жизнедеятельности как образующая своего рода фундамент безопасности для системы более высокого уровня так называемой глобальной системы жизнедеятельности. Соответственно можно выделить пространство локальной безопасности жизнедеятельности которое составляет часть более общего пространства глобальной безопасности жизнедеятельности. Кроме того говоря о локальной безопасности жизнедеятельности следует учитывать что в последнее время...