11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

209 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

52807. Менеджмент у підприємницькій діяльності 2.44 MB
  Мета: познайомити з функціями менеджменту складанням бізнесплану; розвиватися вміння практикуватися в прийнятті управлінських рішень організаційній структурі підприємства. Знаючи сильні і слабкі боки свого підприємства економіст може запропонувати найефективнішу стратегію розвитку. Наприклад розпочати кар'єру з позиції рядового бухгалтера і поступово дорости до фінансового директора підприємства. Аналізуючи дані бухобліку економіст шукає шляхи оптимізації бізнесу вираховує слабкі місця у роботі підприємства: фонд...
52808. Education. Schools in Ukraine and Great Britain 1.63 MB
  Aims: To practise the pupils in using the topic words and expressions in speech; To develop the pupils’ skills in listening to the text ignoring unknown words; To develop reading skills; To do creative exercises connected with the texts of reading and listening;
52809. The System of Education in Great Britain 32.5 KB
  Good afternoon, pupils. I’m glad to see you again. How are you today? How is your day going? Great! We heard much about England, and we learn the language of this country, but we have never thought how pupils and students live there. So today we are going to discuss the system of education in Great Britain. I hope we will find out much new information for us. I think we can start.
52810. Єгипет – перлина стародавніх цивілізацій 39.5 KB
  Пояснювати структуру суспільства. Обладнання: роздавальний матеріал Структура єгипетського суспільства атлас контурні карти підручник. Структура суспільства. Опрацювати відповідний текст параграфа і дати відповіді на запитання: Як зрошувалися землі до яких не доходила вода Чому на роботах з осушення і зрошення долини Нілу брало участь усе доросле населення Хто організовував роботу людей давав їм завдання стежив за порядком Структура суспільства Поки шестикласники дають відповіді на поставлені запитання у класі починає...
52811. Розквіт та занепад Давньоєгипетської держави 97.5 KB
  Мета: Сформувати уявлення про передумови перетворення Єгипту в могутню державу; з'ясувати напрямки та наслідки військових походів фараонів; охарактеризувати релігійну реформу; розвивати вміння використовувати історичну карту та висловлювати думку щодо причин занепаду держави. Актуалізація опорних знань учнів Пригадайте коли утворилась Давньоєгипетська держава Хто очолював державу Якою була влада фараона ІІ. до нашої ери фараони дуже багато воювали. Але проводячи військові походи фараони втратили контроль над номархами...
52813. Польща. Білорусь. Особливості ЕГП та господарства 141 KB
  Сформувати в учнів загальні уявлення про особливості ЕГП природноресурсного потенціалу господарства країни; виявити географічну та економічну специфіку Польщі та Білорусі. Розвивати вміння учнів складати порівняльну економіко – географічну характеристику країн за планом. Актуалізація опорних знань Прийом Блицопитування На які історико географічні регіони поділяється Європа З якими країнами Західної Європи ви вже ознайомлені Який рівень...
52814. ЕЛЕМЕНТИ ЕЙДЕТИКИ НА УРОКАХ УКРАЇНСЬКОЇ ЛІТЕРАТУРИ 53.5 KB
  Вивчення теорії літератури на уроках української літератури починається вже з п’ятого класу. Але вчитель повинен зробити все для того щоб знання з теорії літератури стали інструментом для розуміння та аналізу того чи іншого твору. Мабуть перед кожним постають питання: Як пояснити поняття з теорії літератури доступно й зрозуміло Як спонукати глибоко розуміти їх застосовувати на практиці Як актуалізувати раніше набуті знання Пропоную Вашій увазі метод запам’ятовування окремих термінів та понять на пальцях який використовую...
52815. Einkaufen. Wir gehen in den Supermarkt 60 KB
  Liebe Kinder, ich freue mich euch gesund und lustig zu sehen. Wie geht es euch? Sind alle Kinder da? Gibt es etwas Neues? Gibt es etwas Interessantes? (Die Schüler beantworten die Fragen des Lehrers)