11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

211 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

65816. Недостатки произношения свистящих звуков «С» - «Сь», «З» - «Зь», «Ц» (сигматизм, парасигматизм) 15.74 KB
  Правильная артикуляция: При произнесении свистящих звуков губы имеют тенденцию растягиваться в улыбке зубы сближены широкий кончик языка упирается в нижние резцы. Передняя часть спинки языка выгарбливается к верхним резцам при произнесении звука Ц она в первый момент образует смычку во второй щель.
65817. Государственная антимонопольная политика - ее цели и задачи 14 KB
  Для недопущения таких негативных процессов государственное антимонопольное регулирование осуществляется в двух направлениях: формирование антимонопольного законодательства; создание системы антимонопольных органов призванных осуществлять регулирование и контроль монополистической деятельности.
65818. Инвентаризация основных средств 21.5 KB
  Инвентаризация основных средств это проверка соответствия основных средств учетным записям о них. Одновременно с инвентаризацией собственных основных средств проверяются основные средства находящиеся в аренде.
65819. Интерполирование 344 KB
  Цель: Применяя методы интерполяции найти аппроксимацию функции заданной таблично. значения этой функции при указанных значениях аргумента х. Выполнить интерполирование и построить график зависимости интерполирующей функции от х на отрезке определенном крайними узлами таблицы.
65820. Исследование модели шинной ЛВС с маркерным доступом 810.5 KB
  Цель работы: Исследование особенностей построения и функционирования шинной ЛВС с маркерным методом доступа и определение основных характеристик сети. Определить основные характеристики ЛВС шинной топологии с маркерным методом доступа на основе исследования аналитической модели сети.
65821. Управление функциональностью ядра операционной системы 20.82 KB
  Основной частью модуля является процедура выдачи разрешения на доступ. Изначально файл полностью доступен всем пользователям, так как основное распределение доступа происходит позже. В процедуре определения возможности предоставления доступа...
65822. Настройка точки доступа 41.5 KB
  Внимание Во избежание помех между точками точки подключать по одной Соединяем точку доступа сетевым кабелем с сетевым адаптером подаем питание. Сбрасываем настройки точки.