11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

204 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

11289. Магнитное вращение плоскости поляризации (эффект Фарадея) 328 KB
  Магнитное вращение плоскости поляризации эффект Фарадея Указания содержат краткое описание рабочей установки методику изучения явления вращения плоскости поляризации в магнитном поле и получения зависимости угла вращения плоскости поляризации от индукции магн...
11290. Изучение явления интерференции света при помощи бипризмы Френеля 273.5 KB
  Изучение явления интерференции света при помощи бипризмы Френеля Указания содержат краткое описание рабочей установки и методику получения интерференции с помощью бипризмы Френеля. Методические указания предназначены для студентов инженерных специальностей в
11291. ОПЫТ ФРАНКА И ГЕРЦА 202 KB
  ОПЫТ ФРАНКА И ГЕРЦА Цель работы. 1.Определение первого потенциала возбуждения атомов инертного газа аргон или криптон по вольтамперной зависимости IU электронной лампы. 2. Определение энергии возбуждения атомов инертного газа длины волны и массы излученного фот
11292. Электропроводность полупроводников 666 KB
  Электропроводность полупроводников Указания содержат краткие сведения об электропроводности полупроводников основы зонной теории твердых тел и порядок выполнения лабораторной работы. Методические указания предназначены для выполнения лабораторной работы студен...
11293. Вольт-амперные характеристики p-n переходов 521.5 KB
  Вольтамперные характеристики pn переходов В краткой форме рассмотрены процессы протекающие в pn переходе полупроводникового диода. Методические указания предназначены для студентов инженерных специальностей всех форм обучения в лабораторном практикуме по физик
11294. Изучение явления поглощения света 635 KB
  Изучение явления поглощения света Указания содержат краткую теорию поглощения света и порядок выполнения лабораторной работы. Методические указания предназначены для выполнения лабораторной работы студентами всех форм обучения в лабораторном практикуме по физи
11295. Определение индукции магнитного поля соленоида 254 KB
  Определение индукции магнитного поля соленоида Указания содержат краткое описание рабочей установки и методику определения индукции магнитного поля соленоида. Методические указания предназначены для студентов инженерных специальностей всех форм обучения в лаборат
11296. Изучение автоколебаний (на примере лампового генератора) 471 KB
  Изучение автоколебаний на примере лампового генератора Указания содержат краткое описание метода и экспериментальной установки для изучения автоколебаний в простейшем ламповом генераторе с индуктивной обратной связью определение частоты электромагнитны...
11297. Исследование электростатического поля, лабораторная работа 429 KB
  Исследование электростатического поля Указания содержат краткое описание измерительной установки и методику исследования электростатического поля. Методические указания предназначены для студентов инженерных специальностей всех форм обучения в лабораторно