11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

223 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

20293. Свет в театре и на эстраде 56.5 KB
  Его история во многом определялась теми источниками света которые имелись в распоряжении театра в те или иные периоды его развития. особенно в его вторую половину стремительно модернизировались новыми техническими возможностями и расширяли сферу применения света как средства сценической выразительности. С точки зрения эстетической искусство сценического света в 1718 вв.Станиславского партитуры сценического света особенно в чеховских спектаклях на сцене передавались меняющиеся состояния природы утро день вечер ночь; солнечно...
20294. Русская художественная культура середины 50-х - 60-х годов XX века 266.5 KB
  В связи с разоблачением культа личности Сталина происходило преодоление откровенно лакировочного искусства особенно характерного для 30 40х годов. Коммерциализация литературы и искусства привела к распространению произведений не отличающихся высокими художественными достоинствами. В советской культуре наблюдались две противоположные тенденции: искусства политизированного лакирующего действительность и искусства формально социалистического но по существу критически отражающего действительность в силу сознательной позиции художника...
20295. Западно-европейский театр второй половины XIX века 264.5 KB
  Театр XIX в. европейский театр растерял многие свои ценные завоевания. Повсюду в театрах для высшего общества вновь воцарилось величественное но холодное искусство классицизма утратившего после французской революции 1789 1794 гг.
20296. Костюм и декорация 74.5 KB
  В спектаклях первого Русского сезона оформленных Бакстом Клеопатра и Рерихом Половецкие пляски у Бенуа сложились некоторые принципы новой сценографии хореографического театра. Ряд статей Бенуа под рубрикой Русские спектакли в Париже знакомит читателей газеты Речь с ходом сезонов. Они по словам Бенуа не только создавали обрамление в котором блистали Фокин Нижинский Павлова Карсавина Федорова и столько других но им принадлежала генеральная идея спектаклей. Но как бы то ни было в создании мастеров сплотившихся вокруг...
20297. Современная русская художественная культура 78 KB
  Художественная культура современной России. Однако в самой России творчество букеровских лауреатов постоянно вызывало неоднозначную реакцию поэтому в 1995 г. Тополь Завтра в России А. Читателю предлагается непривычная для РУС России было присуще стремление подняться над описательностью и бытовизмом найти тот единственный и точный конкретнозримый образ который воплотил бы в себе всю полноту и драматизм многогранной жизни.
20298. Реализм в сценическом искусстве Европы XIX века 63.5 KB
  Центральной фигурой театральной жизни рубежа XIX XX вв. Наряду с ростом прогрессивных тенденций в развитии европейского театра в последние десятилетия XIX в. все явственнее проявляются признаки глубокого идейнотворческого кризиса театральной культуры. Если раньше черты надвигающегося кризиса проявлялись в отрыве театра от большой литературы в натуралистическом перерождении критического реализма то в конце века театр приобретает иное свойство он становится выражением кризиса всей духовной культуры буржуазного мира.
20299. Значение фактуры, отделки и ткани в историческом и современном костюме 193.5 KB
  Как уже стало понятно за состояние костюмов их создание пошив эксплуатацию и чистку тоже отвечает заведующий ХПЧ как правило это чисто мужская должность которому подчиняется начальник костюмерного цеха. Читатель злорадно хихикая вполне может автора спросить к чему столько подробностей о закулисной жизни театра не пора ли начать рассказ о химической чистке театральных костюмов. Это максимум что может себе позволить рядовой театр оставляя на долю предприятия химической чистки 7080 женских и мужских костюмов пошитых в...
20300. Искусство постмодернизма 375 KB
  Искусство постмодернизма. Постмодернизм основное направление современной философии искусства и науки. В контексте диалогизма хаос не только провоцируется на ответные выпады но и главное впервые пожалуй становится равноправным участником диалога с художником ПОСТМОДЕРНИЗМ В ИСКУССТВЕ фр. Постмодернизм представляет собой скорее умонастроение интеллектуальный стиль.
20301. Русская режиссура первой четверти XX века 108 KB
  Так как оба сезона Старинного театра предварялись программными статьями Евреинова диссертант соотносит теоретические манифестации и их сценическое воплощение. Примитивность исполнения и наивность чувств вот главные по мнению Евреинова качества средневекового актера. Как показывает автор исследования наиболее принципиальной была для Евреинова реконструкция публики ее непосредственного участия в сценическом действе. Пьеса Евреинова Три волхва должна были стать наглядным примером всетеатральности Средневековья в театре которого...