11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

215 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

31867. МИКРОСХЕМА АЦП К1113ПВ1 34 KB
  МИКРОСХЕМА АЦП К1113ПВ1 Полупроводниковая БИС функционально завершенного АЦП типа КП13ПВ1 А Б В предназначена для применения в электронной аппаратуре в составе блоков аналогового ввода. Она содержит все функциональные узлы АЦП ПП включая КН ЦАП РПП ИОН ГТИ выходной буферный регистр с тремя состояниями схемы управления рис. Несколько АЦП могут обслуживать один МП и наоборот. По уровням входных и выходных логических сигналов АЦП сопрягается с цифровыми ТТЛ ИС.
31868. Редагування растрових зображень 74.5 KB
  У класі форми обявити обєкти доступні для різних методів PictureBox pictureBox1; Lbel lbel1; Point spotClicked; 6.Size = new Size640 480; Завантажити малюнок в елемент PictureBox і вставити у форму додати до проекту відповідну папку з малюнком або вказати адресу малюнка pictureBox1 = new PictureBox; pictureBox1.jpg ; pictureBox1.SizeMode = PictureBoxSizeMode.
31869. История возникновения и развития учета 27 KB
  Историю развития и возникновения учета можно условно разделить на несколько периодов. Одним из этапов развития учета связан с Древним Римом. На Руси упорядочивание учета началось с конца IX в.
31870. Здоров’я людини. Здоровий спосіб життя 77.5 KB
  Вважається, що здоров’я – це нормальний стан організму, який характеризується оптимальною саморегуляцією, повною узгодженістю при функціонуванні всіх органів та систем, рівновагою поміж організмом та зовнішнім середовищем при відсутності хворобливих проявів. Тому основною ознакою здоров’я є здатність до значної пристосованості організму до впливів різноманітних чинників зовнішнього
31872. ЭНДОСКОПИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОЙ РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНИ 2.34 MB
  Ацидометрия и исследование моторнодвигательной функции пищевода и желудка. Необходимость дальнейшего изучения различных сторон этиопатогенеза данного заболевания не вызывает сомнений так как до конца не определены вопросы диагностики и выбор оптимального метода лечения в связи с чем целесообразным представляется исследование морфофункционального статуса пищевода у больных данным заболеванием при неэффективности проводимого лечения. В доступной зарубежной и отечественной литературе нет единого мнения о причинах способствующих...
31873. Культурологическая семантика названий улиц и их влияние на формирование культурного фона и мировоззрения человека 108 KB
  Синявского весь мир: глава о советском языке в его книге имеет именно такой подзаголовок: Переименованный мир The Renmed World 1 . Оба процесса и переименования и перепереименования несут значительную культурноидеологическую нагрузку и несомненно создают определенный культурноидеологический мир определенную систему ценностей для тех поколений которые приходят в этот мир без груза прошлых названий и соответственно прошлых миров и систем. Отверженные обиженные разочаровавшиеся они поехали за американской мечтой...
31874. Использование трудовых ресурсов в СПК «Новый путь» Шахунского района Нижегородской области 1.66 MB
  Кроме того это объясняется тем что при возрождаемой конкуренции все большее значение приобретает результативность труда все заметнее сказываются на итогах деятельности как потери понесенные вследствие упущений так и выигрыш полученный от реализации резервов роста производительности труда и повышения эффективности производства. Затраты труда на единицу этих продуктов увеличились почти вдвое что связано в основном со снижением продуктивности животных урожайности культур. Увеличение этого продукта и особенно его основной части вновь...