11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

207 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

20133. Способы уменьшения ожидаемой погрешности 23.5 KB
  Недостатки обоих способов : Невозможность воздя на систематическую составляющую суммарной погрешности. уменьшить в обоих случаях значение конечной погрешности.
20134. Основные понятия и определения теории надежности 26 KB
  К общим понятиям отнся: работоспть отказ наработка резервирование неисправность. Работоспть – это состояние изд. из работоспго состя в неработоспное. Безотказность – это свво изделия сохранять свою работоспть в течении заданного времени без вынужденных перерывов.
20135. Экономические показатели надежности 35 KB
  к длитти его эксплции. покль надежти Qи – стоимость изготя нового прибора Qэ – суммарные затраты на эксплцию и ремонт Тэ период целесообразной эксплции прибора. капиталовложений между сферой произва и сферой эксплции. Чем дешевле изделие тем больше затрат приходится на его эксплцию.
20136. Методика выбора основных показателей надежности 22.5 KB
  Выбор показателей надежности осуществляется исходя из характеристик изделия а также требований предъявляемых к изделию в процессе эксплуатации. Основными показателями надежности являются показатели полученные при оценке средней величины общего дохода изделия. Они характеризуют ожидаемый средний уровень надежности изделия и по ним осуществляют сравнение изделий по надежности. Они позволяют полнее охарактеризовать надежность изделия и определяют либо безотказность либо ремонтопригодность либо сохраняемость либо долговечность...
20137. Источники и причины отказов измерительных устройств 38.5 KB
  Силы кот. Механическая энергия может возникнуть как следствие затрат энергии кот. Воздух кот. Обратимые процессы –это часть процессов кот.
20138. Надежность, определяемая процессами, происходящими в элементах и узлах приборов 55 KB
  Такое деление соответствует трем явно выраженным периодам работы любого прибора или машины. Из кривой видно что в первый период – период приработки интенсивность отказов в начале высокая а затем быстро падает. Во второй период – период нормальной эксплуатации интенсивность отказов устанавливается на постоянном min уровне. В период износа – интенсивность отказа вновь возрастает.
20139. Общая схема изменения показателей работоспособности 123.5 KB
  1 по вертикали отложены показатели характеризующие точность выполнения прибором заданной функции инструментальная погрешность а по горизонтали – время работы прибора. Узлы прибора обладают некоторой геометрической неточностью и другими показателями которые определяют начальную погрешность прибора Δо. Когда прибор начинает работать так называемые быстро протекающие процессы приводят к рассеиванию показателей работоспособности в результате чего точность прибора уменьшается на величину Δ1. Эти процессы заканчиваются в пределах цикла работы...
20140. Функциональное резервирование, его методы и способы 51 KB
  Повышение надежности систем путем резервирования достигается за счет рационального применения избыточных элементов. Поэтому при резервировании основное внимание обращают на выбор рациональных путей создания резервируемых систем при этом используются методы математического вероятностного исследования возможных резервных схем. Будем рассматривать резервирование как путь совершенствования рациональной схемы системы.
20141. Виды испытаний на надежность и их классификация 26 KB
  Испытания на надежность предусматривает : Определение уровня надежности и соответствие нормам надежности. Перед поставкой потребителю изделия проходят приемосдаточные испытания. Для оценки стабильности ТП проводят периодические испытания при внесении изменений в конструкцию материал и технологию – типовые испытания. В зависимости от стадии разработки и производства проводятся:1 испытания опытных образцов новых конструкций 2 испытание образцов установочной серии 3 испытание серийных и массовых изделий 4 испытания модернизированных...