11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

209 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

42712. Электронные таблицы MS Excel. Основные понятия. Элементы форматирования. Вычисления по формулам 155 KB
  Пересечение строки и столбца образует Ячейку. Ссылка на ячейку адрес ячейки состоит из номера столбца обычно латинские буквы и номера строки. При этом произойдет заполнение диапазона ячеек: Если в активной ячейке было значение входящее в пользовательский список то при копировании будет выведено следующее значение из списка; Если в ячейку была введена формула то произойдет пересчет значений. В ячейку D3 введем формулу.
42713. Электронные таблицы. Вычисления по формулам с использованием абсолютных ссылок 57.5 KB
  В некоторых ситуациях в формулах требуется использовать содержимое конкретной ячейки и не изменять ее адрес при копировании формул. Чтобы отменить автоматическое изменение адреса ячейки, ей следует назначить «абсолютный адрес». Для этого перед номером столбца и номером строки в адресе ставят знаки доллара $ (или нажать клавишу F4). В Excel предусмотрен и другой, очень удобный способ ссылки на ячейку с помощью присвоения ей имени. Чтобы присвоить имя ячейке, выделите её и выберите команду Вставка – Имя – Присвоить. В появившемся диалоговом окне введите имя ячейки. В дальнейшем это имя можно использовать вместо адреса.
42714. Электронные таблицы. Анализ и управление данными 119 KB
  Выделите весь диапазон ячеек с данными и объявите его списком Данные – Список – Создать список. Отметьте пункт Список с заголовками; 3. Отсортируем список сразу по трем ключам: по отделам внутри отдела по должностям для одинаковых должностей сортировка продолжится по фамилиям. Самостоятельно отсортируйте список по отделам по возрастанию далее по величине зарплат по убыванию.
42715. Электронные таблицы. Использование функций 140.5 KB
  Для облегчения поиска нужной функции все функции разделены на категории: математические статистические и т. После выбора функции в окне мастера имеется ссылка на справку по применению конкретной функции с примерами. При выполнении лабораторной работы читайте справочные сведения по каждой применяемой функции.
42716. Электронные таблицы. Использование функции Если 101.5 KB
  Использование функции ЕСЛИ И В приведенном ниже списке задана информация о сдаче сессии студентами. Учтите что в этом случае условие будет сложным с использованием функции И.
42717. Электронные таблицы. Построение диаграмм 237 KB
  Горизонтальная ось X – ось категорий вертикальная ось Y – ось значений. Горизонтальная ось X – ось значений вертикальная ось Y – ось категорий. они отображают зависимость данных ось Y от величины которая меняется с постоянным шагом ось Х.
42718. ОЦЕНКА ХАРАКТЕРИСТИК ПРОГРАММ НА ОСНОВЕ ЛЕКСИЧЕСКОГО АНАЛИЗА 199.5 KB
  Определить значения метрик Холстеда на основе которых дать оценку качества разработанного исходного текста программы.1 Реализация программы Текст программы для реализации возможного решения поставленной задачи разработанной с использованием языка программирования С приведен в таблице 1: Таблица 1 Текст программы для вычисления значения функции F Номер строки Строки программы 1 using System; 2 nmespce holsted 3 { 4 clss Progrm 5 { 6 sttic void Minstring[] rgs 7 { 8 double x y F; 9 chr check; 10 do 11 { 12 Console.2 Словарь программы В...
42719. Оценка характеристик программ на основе лексического анализа. Метрики 262.5 KB
  Наиболее ценным для практики является то что такая оценка может быть получена вручную на основе зрительного анализа текста программы либо автоматически с помощью специально разработанных программных анализаторов причем относительно несложных. Джилб предположил что логическая сложность должна являться значимым если не определяющим фактором для оценки стоимости программы на начальных этапах ее проектирования. Логическая сложность программы Джилб определяет как насыщенность программы условными операторами типа IFTHENELSE и...
42720. Оценка надежности программных средств 227.5 KB
  Она основана на предположении об экспоненциальной зависимости плотности вероятности интервалов времени между проявлением ошибок от интенсивности ошибок. Кроме того в модели полагается что интенсивность ошибок на каждом случайном интервале времени линейно зависит от количества оставшихся в программе ошибок. Если допустить что ошибка после ее каждого проявления устраняется и при этом в программный модуль не вносятся новые то интенсивность ошибок ti на интервале ti определяется следующим соотношением: 1 где N количество ошибок...