11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

204 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

83996. Власні і загальні іменники. Велика буква у власних іменниках 47.5 KB
  Мета: навчити дітей записувати географічні назви з великої літери; ознайомити учнів шляхом уявної подорожі з деякими країнами; розвивати навички правильного каліграфічного письма уміння складати повні відповіді на запитання; виховати бажання дізнаватись про щось нове...
83997. Закріплення і систематизація знань про граматичні ознаки дієслова 61.5 KB
  Удосконалювати вміння розпізнавати часові форми дієслова. Виробляти навички правопису особових закінчень дієслова. Що таке дієслово Як змінюється дієслово Які часи мають дієслова Як змінюються дієслова минулого часу Яким членом речення найчастіше дієслово виступає в реченні...
83998. Закріплення вивченого матеріалу про частини мови 57 KB
  Мета: Систематизувати і закріпити знання дітей про частини мови. Виховувати почуття любові до рідного краю до української мови. Тож і ми часу не гаймо Урок мови починаймо Девіз уроку: Мову рідну я вивчаю Її люблю не забуваю.
83999. Розвиток зв’язного мовлення. Твір-розповідь з елементами опису. Опис калини 105 KB
  Мета: формування в учнів навички вільного володіння рідною мовою, сприяти розширенню їх словникового запасу; розвивати зв’язне мовлення учнів, уміння порівнювати і зіставляти; розширити знання дітей про калину, як рослину-символ України;виховувати любов до рідного слова...
84000. Узагальнення вивченого про прислівник 44 KB
  Мета: вдосконалювати вміння розпізнавати прислівники в усному і писемному мовленні. Розвивати вміння використовувати прислівники у текстах визначати їх роль; розвивати здатність учнів до взаємодії мовне чуття мислення увагу пам’ять; виховувати самостійність старанність наполегливість...
84001. Колективне складання текстів різного типу про осінь 207 KB
  Учитель читає вірш: Лоскоче душу промінь золотавий Убравши пишно парки і ліси Йде краєм осінь Туман ранковий стелиться над ставом І лине сум прощальної краси. звучить тиха мелодія і на дошці розміщені ілюстрації осені в природі Скажіть хто створює цю красу Так осінь.
84002. Вживання прикметників у прямому і переносному значенні 39.5 KB
  Мета: Формувати вміння розрізняти прикметники вжиті в прямому і переносному значенні; закріплювати знання про прикметники Їхню роль у тексті; розвивати інтерес до усної народної творчості; збагачувати словниковий запас учнів; виховувати любов до рідної мови.
84003. Космічна подорож. Закріплення знань про часові форми дієслова 37.5 KB
  Мета: формувати вміння учнів визначати час дієслів та змінювати дієслова за часами; спостерігати за роллю дієслів у реченні; збагачувати словниковий запас; розвивати мовлення; виховувати гордість за свою Батьківщину. Що називається дієсловом Як змінюються дієслова Як визначити час дієслова...
84004. РІД IМЕННИКIВ. ЗМІНЮВАННЯ IМЕННИКIВ ЗА ЧИСЛАМИ 96.5 KB
  Мета: - перевірити знання учнів про іменник, як частину мови, закріпити знання дітей про змінювання іменників за числами, повторити з учнями рід іменників, розвивати вміння правильно ставити рід у словах, повторити антоніми, збагачувати активний словник школярів, продовжувати роботу...