11464

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

Лабораторная работа

Химия и фармакология

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА Определение активности каталазы 1.11.1.6 1 с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа метод Баха и Зубковой ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах а также во всех тканях и жидкост...

Русский

2013-04-08

37 KB

220 чел.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой) 

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н2О2) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2О2     О2 + 2Н2О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы: 1) 1% раствор Н2О2; 2) 10% раствор серной кислоты; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление: в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета: моль-эквивалент Н2О2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н2О2; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н2О2, которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы: каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

показатель каталазы составляет 2-3х10-:6, в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н2О2 (2 Н2О2  2 Н2О + О2) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н2О2; 2) 4 % раствор молибдата аммония. 

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37°С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Еоп и Ехол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,2103– коэффициент экстинкции, ммоль–1см–1.

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6+0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

82649. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО СОВЕРШЕНСТВОВАНИЮ ВНУТРИОРГАНИЗАЦИОННОГО МАРКЕТИНГА НА ПРЕДПРИЯТИИ «ДЁКЕ УРАЛ» 292.5 KB
  Цель выпускной квалификационной работы состоит в исследовании и научном обосновании теоретических положений и практических рекомендаций по совершенствованию внутриорганизационного маркетинга на предприятии, учитывая специфику деятельности ООО «Дёке Урал» и обеспечивающих повышение его конкурентоспособности в целом.
82650. Методи підвищення технічної експлуатації суднових газотурбонагнетачів 3.04 MB
  Одним з основних і розповсюджених способів підвищення потужності дизелів є газотурбінний наддув за допомогою якого збільшується заряд повітря в робочих циліндрах що в свою чергу дозволяє збільшити циклову подачу палива. Дизеля надійні в роботі прості в обслуговуванні та ремонті мають обмежені витрати...
82651. КОНТРОЛЬ ХОЗЯЙСТВЕННЫХ ОПЕРАЦИЙ ПО УЧЕТУ РАСЧЕТОВ ПО ЗАРАБОТНО ПЛАТЕ НА ПРИМЕРЕ КУПСХП «ОСВЕЙСКИЙ» 1.58 MB
  Современная теория оплаты труда Управленческие теории Теории мотивации трудового поведения управление человеческими ресурсами ценностно-ориентированный менеджмент корпоративная социальная ответственность Новые течения Марксизм постиндустриальной эпохи...
82652. Анализ развития ипотечного кредитования российскими банками (на примере Ярославского ФКБ-РЦ «СЕВЕРГАЗБАНК») 2.95 MB
  Актуальность темы дипломной работы на современном этапе развития экономики Российской Федерации связана с тем, что рост инфляции, дефицит и высокая стоимость долгосрочной ликвидности (при отсутствии краткосрочной) — все это поставило сегодня ипотечное кредитование на грань выживания.
82653. Разработка программного обеспечения для дистанционного управления компьютерами, включенными в локальную сеть 1.61 MB
  Целью работы является создание программного комплекса для дистанционного контроля, диагностики и слежения с целью: снижения затрат на обслуживание каждой машины; экономии электроэнергии; сокращения времени реагирования на проблемы пользователей; сокращения обслуживающего персонала...
82654. ПРОБЛЕМЫ ИПОТЕЧНОГО КРЕДИТОВАНИЯ В ДЕЯЕЛЬНОСТИ КОММЕРЧЕСКОГО БАНКА НА ПРИМЕРЕ ЯРОСЛАВСКОГО ФКБ-РЦ «СЕВЕРГАЗБАНК» 2.92 MB
  Цель работы - рассмотрение системы ипотечного кредитования в Российской Федерации и прогноз перспектив ипотечного кредитования в коммерческом банке. В ходе данной работы подробно рассмотрены в I главе сущность и понятие ипотеки основные нормативно-правовые акты ипотечного кредитования...
82655. Расчет нагрузок и определение параметров элементов в СЭС 643.28 KB
  От силового пункта СП 1 получают питание: n1 вытяжных вентиляторов мощностью Рн1 кВт n2 конвейеров мощностью Рн2 кВт n3 водонагревателей мощностью Рн3 кВт n4 полировальных станков мощностью Рн4 кВт n5 шлифовальных станков мощностью Рн5 кВт n6 шлифовальных станков мощностью Рн6 кВт.
82656. РАСЧЕТ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЙ ДАЛЬНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ГИДРОЛОКАТОРА 167.88 KB
  Расчет энергетической дальности действия проводится с использованием уравнения гидролокации в логарифмической форме, обеспечивающего наиболее удобные и экономичные расчеты, которые позволяют избежать вычислительных ошибок.
82657. Застосування теорії ігор для вирішення задач щодо прийняття рішень на митниці 504.85 KB
  Митно-прикордонна служба США – це орган правозастосування федерального законодавства Міністерства національної безпеки США, на який покладена відповідальність за питання, що пов’язані з регулюванням та спрощенням міжнародної торгівлі, збором митних платежів та врегулюванням сотень положень США...