11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

32146. Стратегический и тактический контролинг 40.5 KB
  Современный контроллинг включает в себя управление рисками страховой деятельностью предприятий обширную систему информационного снабжения предприятия систему оповещания путём управления системой ключевых финансовых индикаторов управление системой реализации стратегического тактического и оперативного планирования и систему менеджмента качества. Стратегический контролинг координация функции стратегического анализа целеполагания планирования и коррекции стратегии; осуществление контроля за функционированием всей системы в целом;...
32147. Элементы сбалансированной системы показателей 24.5 KB
  Элементы сбалансированной системы показателей Основной принцип ССП который во многом стал причиной высокой эффективности этой технологии управления управлять можно только тем что можно измерить. ССП делает акцент на нефинансовых показателях эффективности давая возможность оценить такие казалось бы с трудом поддающиеся измерению аспекты деятельности как степень лояльности клиентов или инновационный потенциал компании. Авторы ССП предложили четыре направления оценки эффективности отвечающие на самые значимые для успешной деятельности...
32148. Задачи и функции подразделения стратегического развития 31 KB
  Перед отделом стратегического развития который должен функционировать на постоянной профессиональной основе стоят две главные задачи: Сведение всех стратегических наработок произведенную в первую очередь самим отделом а также другими по разделениями Организации в заданные определенным форматом проекты решений. Проекты в установление порядке представляются отделом в органы управления организации которые уполномочены принимать соответствующие стратегические решения. В большинстве организаций такими органами управления являются:...
32149. Стратегическая карта и стратегические темы ССП 29 KB
  Эти цели содержат в себе детальное отображение различных аспектов стратегии. Каплан и Нортон рассматривают следующие аспекты: Четкое формулирование стратегии Передачу стратегии внутрь всей компании Согласование стратегии компании с целями персонала Связывание целей с годовым бюджетом Идентификацию и согласование стратегических инициатив Выполнение регулярных проверок с помощью обратной связи и необходимых корректировок стратегии В рамках ССП необходимо различать показатели которые измеряют достигнутые результаты и показатели...
32150. Базовые элементы построения стратегии по Портеру 24.5 KB
  Портер 1985 выделяет три ключевые общие стратегии: лидерство по затратам ндивидуализация и фокусирование. Лидерство по затратам. Жесткий контроль над затратами и накладными расходами сведение до минимума расходов в таких областях как исследования и разработки реклама и т. Стратегия лидерства по затратам часто создает прочную основу для конкуренции в отрасли.
32151. Стратегический переход от экономики производства к экономике знаний 28 KB
  Превращение науки в непосредственную производительную силу отмеченное в начале 1960х гг. На смену экономики фабричных труб когда преобладало массовое производство пришла экономика основанная на интеллектуальном труде человеческом капитале. Появление всемирной электронной рулетки когда реальные инвестиции подменяются спекуляцией когда человеческие ресурсы отвлекаются на бесплодные биржевые игры не может позитивно влиять на развитие мировой экономики. Касаясь вопросов связанных с...
32152. СУ в системе менеджмента 100.5 KB
  Конечная цель системы менеджмента выполнение миссии организации. Миссия это наиболее общая цель организации как конкурентоспособной структуры представленная в наиболее общей форме и четко выражающая основную причину существования организации. Стратегия корпорации это деловая концепция организации на заданную стратегическую перспективу представленная в виде долгосрочной программы конкретных действий которые способны реализовать данную концепцию и обеспечить организации конкурентные преимущества в достижении целей.
32153. Конкурентные преимущества. Базовые конкурентные стратегии 32.5 KB
  Конкурентные преимущества. Базовые конкурентные стратегии Конкретную рыночную позицию организации определяет ее конкурентные преимущества. Портеру конкурентные преимущества делятся на два основных вида: дифференциация продуктовтоваров и более низкие издержки на создание и реализацию товаров. Организации добиваются конкурентного преимущества находя новые способы конкуренции в своей отрасли и выходя с ними на рынок что можно назвать одним словом нововведение.
32154. Цепочка стоимости и система стоимости 24 KB
  Цепочка стоимости и система стоимости Виды деятельности при конкуренции в какойлибо конкретной отрасли можно разделить на категории. Они объединены в так называемую цепочку стоимости. Все виды деятельности входящие в цепочку стоимости вносят свой вклад в конечную потребительскую стоимость продуктатовара. Выбранная конкурентная стратегия определяет способ которым организация выполняет отдельные виды своей деятельности а также всю цепочку стоимости в целом.