11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

74568. Развитие науки в период Нового времени 98.15 KB
  Предпосылки развитию науки формировались во всех сферах жизни общества. Обществу становилась все более ясной практическая польза науки как и взаимная заинтересованность научных исследований в новых общественных отношениях. Этот период можно с полным правом назвать веком науки и научной революции.
74569. Современный этап в развитии науки 38.56 KB
  Как известно XIX век – это период дисциплинарного оформления науки. Дифференциация научного знания приведшая к появлению новых научных дисциплин со своим предметом и специфическими средствами познания продолжала оставаться ведущей тенденцией развития науки того времени. Сформировались образ науки как дисциплинарно организованного знания и дисциплинарный подход ориентированный на изучение специфических частных закономерностей и явлений.
74570. Возникновение науки, основные стадии её исторической 36.5 KB
  Наука была всегда с момента зарождения человеческого общества т. Наука начинает отсчет с египетской цивилизации. Наука возникла в Древней Греции т. Наука возникла в Западной Европе в 1214 веках поскольку появился интерес к опытному знанию и математике.
74571. Научное знание Древнего Египта 41 KB
  Цивилизация Древнего Египта того времени располагала глубокими знаниями в области математики медицины географии химии астрономии и других областях. За тысячи лет до талантливых мужей Эллады жрецы Древнего Египта в совершенстве изучили и овладели секретами которые мы заново открываем в наш стремительный век.
74572. Горные породы 734 KB
  Горные породы различаются по цвету структуре текстуре минеральному составу и форме залегания. Текстура характеризует относительное расположение и распределение составных частой породы. Минералы образующие горные породы называются породообразующими.
74573. МАГМАТИЗМ 431.5 KB
  Подъем магмы и прорыв ее в вышележащие горизонты происходят вследствие так называемой инверсии плотностей при которой внутри литосферы появляются очаги менее плотного но мобильного расплава. В зависимости от характера движения магмы различают магматизм интрузивный и эффузивный. Преобладающим компонентом магмы является кремнезем.
74574. Метаморфизм 53 KB
  Преобразованию могут подвергаться любые горные породы осадочные магматические и ранее образовавшиеся метаморфические. В физикохимических условиях отличных от тех в которых образовались горные породы происходит изменение их минерального состава структуры и текстуры. без изменения химического состава метаморфизуемой породы и метасоматически т.
74575. Тектонические движения и деформации земной коры 1.08 MB
  Среди них различают следующие основные формы: моноклинали флексуры и складки. Складки – это изгибы слоев горных пород без разрыва сплошности под действием давления. Складки являются основной формой пликативных дислокаций. Антиклинальными называются выпуклые складки в которых пласты падают в противоположные стороны а в центральных частях залегают более древние породы чем на периферии рис.
74576. Геологические науки и их задачи 74 KB
  Общим этот курс называется потому что рассматривает общие сведения о Земле начиная с положения Земли в мировом пространстве и кончая геологической деятельностью человека. Свое продолжение он находит в ряде последующих геологических дисциплин изучающих вопросы строения наружной оболочки Земли земной коры ее химический вещественный состав физические свойства геологическую историю. Каждая геологическая наука имея общую цель изучение Земли в то же время решает свои задачи. Историческая геология изучает историю и закономерности...