11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

49860. Расчет привода электродвигателя АИР132М8 1.01 MB
  Расчёт производим в форме проверки коэффициента запаса прочности, значение которого можно принять. При этом должно выполняться условие, что, где – расчётный коэффициент запаса прочности, и – коэффициенты запаса по нормальным и касательным напряжениям, которые определим ниже.
49861. Автоматика и регулирование РДТТ 578 KB
  Значение основных параметров при регулировании с использованием центрального тела: Конструкция центрального тела Задание на курсовое проектирование Вариант №10. Для РДТТ стартующих в диапазоне температур окружающей среды и имеющего номинальные параметры кН МПа: Определить количество сменных вкладышей если их будет более 4 нужно изменить величину разброса и вычислить каждого вкладыша для определенного диапазона окружающей среды при настройке на Р=const; Построить в натуральную величину профиль обечайки по известным...
49862. Автоматика и регулирование РДТТ. Расчёт сменных сопловых вкладышей 745.5 KB
  Определить количество сменных вкладышей (если их будет более 4, нужно изменить величину разброса) и вычислить каждого вкладыша для определенного диапазона окружающей среды при настройке на Р=const;
49863. Расчет схемы управления и защиты трехфазного асинхронного двигателя 392 KB
  Защита трансформатора от токов короткого замыкания и перегрузки осуществляется автоматическим выключателем Q0. Нижестоящий выключатель Q1 защищает от токов к. Для защиты нагрузок 2 7 и соединяющих их линий l2 l7 от токов короткого замыкания перегрузки и токов утечки ниже установлены автоматические выключатели нагрузки FD2 FD7. Защита двигателя от токов короткого замыкания осуществляется автоматическим выключателем QF1.
49864. Проектирование технологического процесса сборки и средств технологического оснащения 2.62 MB
  Темой данного курсового проекта является разработка технологического процесса сборки прибора точной электромеханики и средств технологического оснащения. Исследуемым прибором является гиромотор (ГМ), который является трёхфазным асинхронным двигателем обращённого типа.
49865. Расчет электродвигателя и его составляющих 779.29 KB
  Кинематическая схема механизма Выбор электродвигателя Мощность на выходе: кВт Мощность электродвигателя: кВт Принимаем: кВт Определение частоты вращения вала: мин1 Определение частоты вращения электродвигателя: Принимаем двигатель: АИР90L4 мин1 ; р=2. Допускаемые напряжения для расчета на контактную выносливость: За расчетное допускаемое напряжение принимаем меньшее из полученных 7. Коэффициент нагрузки Принимаем Схема передачи 5 с учетом варианта а соотношений термических обработок. Коэффициент...
49866. Ленточный транспортер 563.29 KB
  Для передачи крутящего момента от двигателя использован цилиндрический соосный двухпоточный мотор-редуктор, который состоит из прямозубых зубчатых колес с внешним зацеплением(быстроходная ступень) и внутренним (тихоходная ступень). Чугунный корпус имеет разьем в вертикальной плоскости.
49867. Автоматика и регулирование РДТТ. Расчет параметров двигателя 4.43 MB
  Расчет основных параметров двигательной установки Газовая постоянная продуктов сгорания топлива: Физикохимическая константа топлива: Постоянную топлива: Комплекс Ак: Секундный массовый расход при номинальных условиях окружающей среды: Скорость горения при нормальных условиях: Определим потребную площадь горения: Коэффициент сопла: φс = 098 Коэффициент тепловых потерь: χ = 098 Площадь критического сечения при номинальной температуре заряда: Задаем значение давления на срезе сопла: ра = 01 МПа; Определим значение приведенной скорости:...
49868. Цифровая фильтрация и дискретная обработка сигналов 447.14 KB
  Рассчитать и построить спектральные характеристики аналогового сигнала. Рассчитать прохождение сигнала через цепь операторный или временной метод Дискретная обработка аналогового сигнала. Спектральный анализ аналогового сигнала Разложение сигнала на типовые составляющие.