11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

77767. Экономическая сущность строительной деятельности и ее правовые основы 21.54 KB
  Виды строительства. Продукцией капитального строительства являются вводимые в действие и принятые в установленном порядке производственные мощности и объекты непроизводственного назначения. Более 70 отраслей национальной экономики обслуживают отрасль строительства в ней используется около 20 продукции черной металлургии большая часть продукции промышленности строительных материалов конструкций деталей и др. Отрасль строительства объединяет деятельность проектноизыскательских научноисследовательских организаций предприятий...
77768. Договорные отношения в строительстве 15.26 KB
  Понятие и содержание договора строительного подряда. Функции договора строительного подряда и его особенности. В тексте договора не должны содержаться пункты противоречащие законодательству а также не относящиеся к взаимоотношениям сторон по договору. Общие правила и положения о договорах подряда регламентируются ГК РК ст.
77769. Особенности учета в строительной деятельности 18.71 KB
  Для успешного управления строительной организацией необходимо знать что строить в каком количестве и во что обходится выполнение определенных строительных работ возведение объекта строительства и т. Например определяется не только объем выполненных работ но и их себестоимость издержки обращения полученный доход и т. К настоящему моменту можно выделить следующие основные задачи бухгалтерского учета строительной организации: формирование полной и достоверной информации о деятельности строительной организации и ее имущественном...
77770. Учет источников финансирования капитальных вложений в строительстве 28.33 KB
  При учете амортизационных отчислений использование данного источника не отражается на синтетических счетах т. По дебету счета отражается начисление амортизации за отчетный период по объектам по кредиту счета отражается использование амортизации по тем суммам которые были учтены как затраты на строительство или как выплаты авансов подрядчикам. Застройщику на строительство объектов в порядке долевого участия от участников поступают деньги на счета по учету денежных средств. При этом...
77771. Сметная стоимость строительной продукции 24.82 KB
  Методы определения сметной стоимости строительства. Сметная стоимость строительства это денежные средства сумма которых определяется на основе проектных материалов. Сметная стоимость строительства ССС является основой для определения размера инвестиционных средств на строительство формирования цен на строительную продукцию служит ориентиром при осуществлении закупа подрядных строительных услуг заказчиком с целью заключения договора подряда расчетов за выполненные подрядные работы согласно действующему законодательству РК. В...
77772. Электронные системы программного управления 2.18 MB
  На сегодняшний день практически каждое предприятие занимающееся механической обработкой имеет в своем распоряжении станки с ЭСПУ. Применение станков с ЭСПУ позволило качественно изменить металлообработку получить большой экономический эффект а также повысить производительность труда...
77773. Разработка маркетинговой стратегии на примере ЧП «Автомотошкола» 200.15 KB
  Теоретические основы разработки маркетинговой стратегии предприятия Понятие и виды маркетинговой стратегии Стратегический анализ как основа разработки стратегии Последовательность этапов формирования стратегии Алгоритм разработки стратегии...
77774. Разработка и обоснование комбинированного маршрута в Национальный парк Таганай 158.77 KB
  Национальный природный парк «Таганай» – один из самых молодых национальных парков России. Парк находится в одном из наиболее уникальнейших уголков Южного Урала – в районе Таганайского горного узла, чуть севернее старинного уральского города Златоуста, на границе Европы и Азии.