11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

74046. Пути формирования феодальных отношений в Западной Европе в период Раннего Средневековья (V – XI вв.) 42.5 KB
  Проблема происхождения феодализма возникла одноврем. Зато возникла и быстро приобрела популярность теория генезиса феодализма в процессе германороманского синтеза. Энгельс подходя к решению проблемы генезиса феодализма с материалистических позиций рассматривали этот процесс как переход от рабовладельческой социальноэкономической формации к феодальной. и концепция синтезного происхождения феодализма преобладавшая во французской и русской медиевистике.
74048. Картина мира средневекового человека в отражении современной медиевистики 36.5 KB
  Эти компоненты объединены в картине мира специфическим для данной эпохи этноса или субкультуры образом. Восприятие мира обусловленное исторически. Из картины мира вытекает всё остальное и ценности и иерархия и парадигмы научного познания и допустимые способы человеческих действий.
74049. Современная историческая наука о феномене Реформации 77.5 KB
  С католической точки зрения, протестантизм представлял собой ересь, самовольный отход от богооткровенных учений и установлений церкви, ведущий к отступничеству от истинной веры и попранию моральных норм христианской жизни.
74050. Основы количественного анализа 14.59 KB
  Основы количественного анализа. Количественный химический анализ имеет целью определение относительного количества отдельных составных частей какоголибо химического соединения или смеси. Количественный анализ бывает гравиметрический весовой титриметрический объемный Титриметрический метод анализа основан на определении вещества после взаимодействия с раствором вещества в ходе химической реакции. Объемный метод анализа основан на законе эквивалентов.
74051. Основы титриметрического (объемного) анализа 15.5 KB
  Титриметрический анализ титрование метод количественного массового анализа который часто используется в аналитической химии основанный на измерении объёма раствора реактива точно известной концентрации расходуемого для реакции с определяемым веществом. Титрование процесс определения титра исследуемого вещества. Титрование производят с помощью бюретки заполненной титрантом до нулевой отметки. По количеству пошедшего на титрование рабочего раствора рассчитывают результаты анализа.
74052. Физико-химические методы анализа (спектральные, хромотография, электрогравиметрические и др.) 13.89 KB
  Физико-химический анализ — комплекс методов анализа физико-химических систем путем построения и геометрического анализа диаграмм состояния и диаграмм состав-свойство.
74053. Основы химической термодинамики. Первый закон термодинамики. Энтальпия 14.81 KB
  Основы химической термодинамики. Первый закон термодинамики. Химическая термодинамика раздел физической химии изучающий процессы взаимодействия веществ методами термодинамики. Основными направлениями химической термодинамики являются: Классическая химическая термодинамика изучающая термодинамическое равновесие вообще.