11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

29128. Требования, на которые исковая давность не распространяется 27 KB
  Требования на которые исковая давность не распространяется. Исковая давность не распространяется на: требования о защите личных неимущественных прав и других нематериальных благ; требования вкладчиков к банку о выдаче вкладов; требования о возмещении вреда причиненного жизни или здоровью гражданина. требования собственника или иного владельца об устранении всяких нарушений его права хотя бы эти нарушения не были соединены с лишением владения.
29129. Содержание права собственности 25.5 KB
  Собственнику принадлежат права 1 владение т. Собственник вправе по своему усмотрению совершать в отношении принадлежащего ему имущества любые действия не противоречащие закону. Собственник несет бремя содержания принадлежащего ему имущества если иное не предусмотрено законом или договором. Риск случайной гибели или случайного повреждения имущества несет его собственник если иное не предусмотрено законом или договором.
29130. Формы права собственности 49 KB
  В РФ признаются: Негосударственная Государственная: на праве собственности РФ федеральная собственность на праве собственности субъектам РФ собственность субъекта РФ. Земля и другие природные ресурсы не находящиеся в собственности граждан юридических лиц либо муниципальных образований являются государственной собственностью. Имущество находящееся в государственной собственности закрепляется за государственными предприятиями и учреждениями во владение пользование распоряжение.
29131. Основания возникновения права собственности и их классификация 32 KB
  Находка Нашедший потерянную вещь обязан немедленно уведомить об этом лицо потерявшее ее или собственника вещи и возвратить ему найденную вещь. Вещь может быть также сдана транспортной организации в милицию или орган местного самоуправления. В случае неустановления владельца вещи в 6 месяцев нашедший вещь приобретает право собственности на нее. При возврате вещи владельцу нашедший вещь вправе потребовать от него вознаграждение за находку в размере до 20 стоимости вещи а также возмещение необходимых расходов связанных с хранением или...
29132. Приобретательская давность как основание возникновение права собственности 26.5 KB
  Приобретательная давность лицо гражданин юридическое лицо не являющееся собственником имущества но добросовестно открыто и непрерывно владеющее как своим собственным недвижимым имуществом в течение 15 лет либо иным имуществом в течение 5 лет приобретает право собственности на это имущество. Приобретательная давность это новая для отечественного законодательства форма приобретения права собственности. Право собственности на недвижимое и иное имущество подлежащее государственной регистрации возникает у лица приобретшего это...
29133. Прекращение права собственности 39.5 KB
  Прекращение права собственности – право прекращающие юридические факты которые могут быть связаны с действиями по отчуждению имущества с событиями смерть. Классификация прекращения права собственности: Добровольная – собственник передает это право другому лицу на основании различных договоров административных актов а также при отказе его от права собственности гибели или уничтожении имущества и при утрате права собственности на имущество. Принудительная – обращение взыскания на имущество по обязательствам на основании решения суда...
29134. Отступное в гражданском праве 29.5 KB
  По какимлибо причинам вы ничем кроме честного слова должника свой договор не обеспечили. Пришел час расплаты а денег у должника нет. Первый подать в суд потребовать продажи имущества должника и обязать его расплатиться с вами деньгами вырученными от продажи его имущества. Получив имущество вы отступаете от должника со своими требованиями о возврате долга.
29135. Прекращение обязательства зачетом. Недопустимость зачета 27 KB
  Обязательство прекращается полностью или частично зачетом встречного однородного требования срок которого наступил либо срок которого не указан или определен моментом востребования. Не допускается зачет требований: если по заявлению другой стороны к требованию подлежит применению срок исковой давности и этот срок истек; о возмещении вреда причиненного жизни или здоровью; о взыскании алиментов; о пожизненном содержании; в иных случаях предусмотренных законом или договором. Зачет производится если требование возникло по основанию...
29136. Новация 26 KB
  Новация. Новация обязательство прекращается соглашением сторон о замене первоначального обязательства существовавшего между ними другим обязательством между теми же лицами предусматривающим иной предмет или способ исполнения. Новация не допускается в отношении обязательств по возмещению вреда причиненного жизни или здоровью и по уплате алиментов. Новация прекращает дополнительные обязательства связанные с первоначальным если иное не предусмотрено соглашением сторон.