11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

20311. Сценические эффекты в театре XIX века 55.5 KB
  Кроме этого появление электрических двигателей послужило мощным толчком для развития механического оборудования сцены. Классические люкипровалы превратились в подъемноопускные площадки и лифтовые сцены греческие выкатные площадки эккиклемы в платформы вывозящие в пределы игровой зоны целые декорационные комплексы небольшие круглые вращающиеся площадки времен театра Возрождения и барокко в различные системы поворотных кругов примитивные веревочные ручные подъемы в механизированные и немеханизированные штанкетные подъемы. Ответы на эти...
20312. Древнерусское искусство: архитектура, иконопись, литература, театр 242 KB
  С образованием государственности и принятием христианства из Византии на Русь пришли новые для нее виды монументальной живописи мозаика и фреска а также станковая живопись иконопись. Византия познакомила русских художников с новой для них техникой живописи дала им иконографический канон неизменность которого строго оберегалась церковью. Это в известной степени сковывало художественное творчество и предопределяло более длительное и устойчивое византийское влияние в живописи нежели в архитектуре. Самые ранние из сохранившихся...
20313. Театр эпохи Романтизма 174 KB
  Театр в эпоху романтизма 27 марта Международный день театра. Во Франции где были сильны традиции классицизма формирование сценического романтизма длилось дольше протекало в острой борьбе с классицизмом. В 1827 было опубликовано предисловие Гюго к его драме Кромвель теоретический манифест романтизма.
20314. Роль фактурной обработки декораций в создании зримого образа спектакля 54.5 KB
  Фактурная обработка декораций занимает одно из ведущих мест в производстве оформления для сцены. Художественное качество исполняемых декораций находится в прямой зависимости от правильно выбранного способа обработки технологии изготовления фактур. Режиссер должен быть знаком с основным технологическим процессом изготовления декораций материалами и инструментами приспособлениями для изготовления бутафории влияющими на качественные характеристики стилевой целостности всего зрелища.
20315. СЦЕНОГРАФИЯ (художественно-декорационное оформление) 121.5 KB
  Вследствие того что образный строй сценографии основывается на зрительном восприятии в конкретном произведении он выражается через определенный материал обладающий параметрами пространства. Развитие простых видов искусства в которых доминирует отдельный вид пространственного вида материала является для сценографии своеобразным лабораторным экспериментом в результате которого проверяется одна из его граней. Дать представление о видах способах и средствах выразительности сценографии о технических возможностях сцены и сценического...
20316. Акимов Н.П. как режиссер и художник 202.5 KB
  Николай Акимов Дата рождения: 16 апреля 1901 Место рождения: город Харьков Дата смерти: 6 сентября 1968 67 лет Место смерти: Москва Гражданство: Российская империя СССР Жанр: театральный режиссёр театральный педагог Награды: Никола́й Па́влович Аки́мов 1901 1968 советский живописец и книжный график театральный художник режиссёр и педагог с 1935по 1949 и с 1956 до конца жизни возглавлявший Ленинградский театр Комедии Народный артист РСФСР Народный артист СССР1960[1].1 Театр им.2 Новый театр Ленинградский театр им.3 Ленинградский...
20317. Европейская культура средневековья: философия, архитектура, литература, театр, музыка 107.5 KB
  Содержание: Введение Особенности культуры западноевропейского Средневековья Аспекты интеллектуальной и художественной культуры западноевропейского Средневековья: Философия Литература Театр и драматургия Музыка Архитектура и строительство Изобразительное искусство Заключение Литература Введение Средние века это время которое находится посередине между Античностью и Новым Временем и по какойто невероятной причине не имеет своего собственного названия.222 14] Историческая ситуация средних веков не может быть както однозначно...
20318. Русское актерское искусство второй половины XX века 98.5 KB
  Восстановление зданий театров развитие киносети расширение издательской деятельности все это создавало необходимые условия для оживления культурной жизни общества. вышли постановления ЦК ВКПб: €œО журналах €œЗвезда€ и €œЛенинград€ €œО репертуаре драматических театров и мерах по его улучшению€ €œО кинофильме €œБольшая жизнь€ €œОб опере €œВеликая дружба€ В. В этих постановлениях писатели журналисты композиторы деятели кино и театра обвинялись в аполитичности и безыдейности в пропаганде буржуазной идеологии. Лишение поддержки со...
20319. Творческое сотрудничество режиссера и художника 123.5 KB
  ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ СОВРЕМЕННОЙ РЕЖИССУРЫ Режиссерское искусство заключается в творческой организации всех элементов спектакля с целью создания единого гармонически целостного художественного произведения. Но такая случайная неофициальная режиссура редко доводила задачу создания идейнохудожественного единства спектакля до конца: разнобой между отдельными его элементами в той или иной степени оказывался неизбежным. Это же происходило и в тех случаях когда коллектив не имея единоличного руководителя сам пытался добиться творческой...