11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

66046. Формирование пенсий. Проблемы пенсионной реформы 30.18 KB
  До 2002 года выплаты пенсий происходили по четко отлаженной схеме: те кто на пенсии получали деньги за счет налогов которые платились предприятиями за работающих граждан. Трудовые пенсии делятся на три типа: трудовая пенсия по старости трудовая пенсия по инвалидности трудовая...
66048. Приоритеты программы антикризисных мер 579.77 KB
  Глобальный экономический кризис приводит во всех странах мира к падению производства росту безработицы снижению доходов населения. Практически во всех странах будут значительно снижаться доходы населения.
66049. Оффшорные зоны 38.44 KB
  Слово офшор впервые было применено в конце 50х годов прошлого века одной из газет США для обозначения конкретной финансовой компании переместившей свою деятельность на территорию с более благоприятной чем в США налоговой системой. Сегодня понятие офшор используется для обозначения офшорного бизнеса...
66050. Целевые бюджетные фонды 13.91 KB
  Понятие целевые бюджетные фонды появилось в 1995 г. когда подобный статус был закреплен за некоторыми ранее внебюджетными фондами создаваемыми в качестве целевого источника финансирования отдельных государственных расходов и отдельными...
66052. Лондонский клуб Парижский клуб и РФ 61.5 KB
  Клуб практикует продление сроков погашения долга или его части списание 3060 задолженности наименее развитых государств продажу их долгов третьим странам или международным организациям. По результатам переговоров с должниками на многосторонней основе члены Парижского клуба подписывают...
66053. ЗОЛОТОВАЛЮТНЫЕ РЕЗЕРВЫ МИРА И РФ 640.5 KB
  В мировой практике под золотовалютными резервами понимаются официальные запасы золота и иностранной валюты в центральном банке и финансовых органах страны, включая счета в международных валютно-кредитных организациях.