11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

7258. Расчет цифрового радиоприёмника по исходным данным: 786 KB
  1. Задание. Произвести расчёт цифрового радиоприёмника по следующим исходным данным: Приёмник работает с ФМ сигналом на частоте F0=22 МГц. Необходимо обеспечить перестройку по 19 каналам. Скорость цифрового потока в последовательном коде V: 7000 бит...
7259. Книга. Сто великих сокровищ 1.84 MB
  Сто великих сокровищ. История человечества столь удивительна и разнообразна, что всякая ее достопримечательность потрясает наше сознание. Любой драгоценный предмет имеет очень интересную судьбу, порой таинственную и загадочную. История каж...
7260. Гидравлика. Учебное пособие 3.04 MB
  Гидравлика Учебное пособие подготовлено в соответствии с Государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования по дисциплине Гидравлика. Рассматриваются основные теоретические положения гидростатики, кинематики и динамик...
7261. Економіка підприємства. Опорний конспект лекцій 3.95 MB
  Зміст Вступ до економіки підприємства Підприємство як субєкт господарювання Поняття, цілі та напрямки діяльності підприємства Правові основи функціонування підприємства Класифікація підприємств Добровільні та інституціон...
7262. Специфіка мовлення фахівця. Поняття ділового спілкування 69 KB
  Тема. Специфіка мовлення фахівця. Поняття ділового спілкування Спілкування, основні його види та форми. Майстерність публічного виступу. 3. Ділова бесіда. 1. Сфера використання усного літературного мовлення сьогодні надзвичайно розширюєт...
7263. Вироби з дріжджового тіста 94 KB
  Вироби з дріжджового тіста Способи приготовлення дріжджового тіста - Безопарний спосіб приготування дріжджового тіста - Опарний спосіб приготування дріжджового тіста Процеси, що відбуваються під час замісу і броді...
7264. Конфлікти у великих групах 80.5 KB
  Тема Конфлікти у великих групах. План. Конфліктологічна проблематика в історії соціології. Загальна соціологічна теорія конфліктної взаємодії. Конфліктологічна проблематика в історії соціології. Соціологія - та ...
7265. Економічна система суспільства. Типи економічних систем 117.5 KB
  Система як загальнонаукове поняття - це сукупність взаємоповязаних і розміщених у належному порядку елементів певного цілісного утворення...
7266. Ординалістська теорія поведінки споживача 62 KB
  Ординалістська теорія поведінки споживача План: Особливості аналізу функції корисності з ординалістських позицій. Криві байдужості: побудова та властивості. Гранична норма заміщення благ: суть і методика обчислення. Недосконалість абсолютно...