11465

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови демонстрационная 1 по ингибированию восстановления нитротетразолия синего Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы СОД свидетельствует его способность тормозить восс...

Русский

2013-04-08

38.5 KB

10 чел.

Лабораторная работа

Оценка активности супероксиддисмутазы в сыворотке крови (демонстрационная)


1) по ингибированию восстановления нитротетразолия синего

Принцип. Об активности фермента супероксиддисмутазы (СОД) свидетельствует его способность тормозить восстановление нитротетразолия синего в присутствии НАДН2 .

Реагенты. 1) хлороформ-спиртовая смесь (соотношение 1:2); 2) порошок калий дигидрогенфосфата; 3) фосфатный буфер (рН=7,4); 4) 0,1М фосфатный буфер (рН=8,3); 5) раствор тетразолия синего (200 мкг/мл); 6) раствор феназинметасульфата (69 мкг/мл); 7) 0,2М раствор НАДН2.

Биологический материал: сыворотка или плазма крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. В центрифужные пробирки наливают по 1 мл 10% гомогената печени в фосфатном буфере (рН=7,4) или плазмы крови. Добавляют по 0,5мл хлороформ-спиртовой смеси (соотношение 1:2) и 300мг калий дигидрогенфосфата. Осадок белка отделяют центрифугированием при скорости 1200 об/мин в течении 15 минут при температуре 4ͦС. Активность фермента определяют в надосадочной жидкости (супернатанте). К 0,2мл супернатанта (в контрольной пробе – 0,2мл фосфатного буфера) добавляют 1,3мл 0,1М фосфатного буфера (рН=8,3), 1мл раствора тетразолия синего (200 мкг/мл), 0,3мл раствора феназинметасульфата (69 мкг/мл) и 2мл 0,2М раствора НАДН2. Пробы выдерживают в темноте 10мин и фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 540нм в кювете толщиной 10мм против контрольной пробы.

Расчет. 

Процент ингибирования редукции нитротетразолия синего определяют по формуле:

  100%,

где:

Эк –экстинкция контрольной пробы;

Эо – экстинкция опытной пробы.

Количество СОД, способное ингибировать восстановление нитротетразолия синего на 50%, принимают за одну условную единицу активности.


2) по торможению автоокисления адреналина

Принцип. Метод основан на способности СОД тормозить реакцию автоокисления адреналина при рН=10,2 [].

Реагенты. 1) 0,05 М Na-карбонатный буфер рН=10,2;
2)
 0,05 М раствор ЭДТА на 0,05 М Na-карбонатном буфере рН=10,2;
3)
1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (готовят ex tempore).

Биологический материал: сыворотка, плазма или гемолизат (разведение 1:100) крови, 10% гомогенат печени в фосфатном буфере (рН=7,4)

Ход работы. Для измерения активности СОД в кювету спектрофотометра вносят компоненты реакционной смеси в следующей последовательности. ОПЫТная проба: 3,0 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера рН=10,2, содержащего 0,05 М раствор ЭДТА, и 0,1 мл плазмы крови, далее добавляют 0,5 мл 1,8103 М водного раствора адреналина рН=2,5 (приготовленного ex tempore), быстро же засекают время и производят первое измерение, затем через 1, 2 и 3 минуты последующие измерения, не вынимая кюветы из прибора. Холостая проба содержит 0,1 мл дистиллированной воды вместо плазмы крови. Сначала записывают и рассчитывают скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром (Е1) при длине волны 489 нм (холостая проба). Затем определяют скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала (Е2) (опытная проба)

Расчет. 

Активность СОД в плазме крови определяют по формуле, используя рассчитанные значения скоростей:

,

где:

А – активность фермента в у.е./л (условные единицы активности),

Е1 – скорость свободного неингибированного автоокисления адреналина в адренохром,

Е2 – скорость автоокисления адреналина в присутствии СОД исследуемого материала.

Клинико-диагностическое значение.

СОД катализирует реакцию обезвреживания супероксидного анион-радикала кислорода, то есть в организме является антиоксидантом – веществом, которое уменьшает активность перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Оформление работы. Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

33234. Электрическая цепь, Устройство трансформатора 13.12 KB
  Электрической цепью называется совокупность устройств и объектов образующих путь для электрического тока электромагнитные процессы в которых могут быть описаны с помощью понятий об электрическом токе ЭДС электродвижущая сила и электрическом напряжении. trnsformo преобразовывать это статическое электромагнитное устройство имеющее две или более индуктивно связанных обмоток на какомлибо магнитопроводе и предназначенное для преобразования посредством электромагнитной индукции одной или нескольких систем напряжений переменного тока в...
33235. Зако́н О́ма 13.08 KB
  закон Ома для полной цепи: сила тока в полной цепи равна электродвижущей силе источника деленной на сумму сопротивлений однородного и неоднородного участков цепи.
33236. Последовательное и параллельное соединения в электротехнике 13.47 KB
  Режим при котором вторичная обмотка трансформатора разомкнута а на зажимы первичной обмотки подано переменное напряжение называется холостым ходом трансформатора. Если к первичной обмотке подвести напряжение U1 по ней потечет ток который обозначим I0. Магнитный поток Ф возбуждаемый первичной обмоткой индуктирует во вторичной обмотке э. Тот же самый магнитный поток индуктирует в первичной обмотке э.
33237. Первый закон Кирхгофа 13.56 KB
  2Сердечник статора набирается из стальных пластин толщиной 035 или 05 мм. В продольные пазы статора укладывают проводники его обмотки которые соответствующим образом соединяют между собой образуя трехфазную систему. Для подключения обмоток статора к трехфазной сети они могут быть соединены звездой или треугольником что дает возможность включать двигатель в сеть с двумя различными линейными напряжениями. Для более низких напряжений указанных на щитке обмотки статора соединяются в треугольник для более высоких в звезду.
33238. Работа электрического тока 13.09 KB
  Мощность электрического тока показывает работу тока совершенную в единицу времени и равна отношению совершенной работы ко времени в течение которого эта работа была совершена.
33239. Второй закон Кирхгофа 13.06 KB
  В любом замкнутом контуре электрической цепи алгебраическая сумма ЭДС равна алгебраической сумме падений напряжений на всех его участках
33240. Магни́тное по́ле 13.55 KB
  Принцип работы асинхронного электродвигателя основан на взаимодействии вращающегося магнитного поля возникающего при прохождении трехфазного переменного тока по обмоткам обмоткам статора с током индуктированным полем статора в обмотках ротора в результате чего возникают механические усилия заставляющие ротор вращаться в сторону вращения магнитного поля при условии что частота вращения ротора n меньше частоты вращения поля n1 .
33241. Электромагнит 13.3 KB
  Обычно электромагнит состоит из обмотки и ферромагнитного сердечника который приобретает свойства магнита при прохождении по обмотке ток Регулирование скорости асинхронного двигателя Наиболее распространены следующие способы регулирования скорости асинхронного двигателя: изменение дополнительного сопротивления цепи ротора изменение напряжения подводимого к обмотке статора двигателя изменение частоты питающего напряжения а также переключение числа пар полюсов. Регулирование частоты вращения асинхронного двигателя путем введения...
33242. Закон полного тока 13.38 KB
  2Преимущества асинхронных электродвигателей с короткозамкнутым ротором следующие: приблизительно постоянная скорость при разных нагрузках; возможность кратковременных механических перегрузок; простота конструкции; простота пуска и легкость его автоматизации; более высокие соs j и к. чем у двигателей с фазным ротором. Практически асинхронные электродвигатели с короткозамкнутым ротором применяются в тех случаях когда не требуется регулирования скорости вращения двигателя. Преимущества асинхронных электродвигателей с фазным ротором: большой...