11901

Определение аминокислот в их смеси

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа №309 Определение аминокислот в их смеси. Краткое теоретическое введение: Общая характеристика метода Создание метода бумажной хроматографии в 1944 г. значительно расширило возможности разделения идентификации и количественного определен...

Русский

2013-04-14

289 KB

12 чел.

Лабораторная работа №309 

Определение аминокислот в их смеси.

Краткое теоретическое введение:

Общая характеристика метода

Создание метода бумажной хроматографии (в 1944 г.) значительно расширило возможности разделения, идентификации и количественного определения малых количеств веществ в различных областях химии и биохимии. В зависимости от того, какого типа применяют бумагу или чем ее пропитывают, механизм разделения может быть различным: распределительным, адсорбционным, ионообменным, осадочным или смешанным. Однако в большинстве случаев на практике используют метод, в котором реализуется распределительный механизм, когда разделение достигается за счет различного распределения вещества между двумя жидкими фазами — вариант жидкость-жидкостной хроматографии. Поэтому ниже бумажная хроматография будет рассмотрена в идеальном варианте распределительного механизма, когда неподвижная фаза, как правило, вода, удерживается твердым носителем — хроматографической бумагой, а подвижная фаза представляет собой органический растворитель (или смесь растворителей) с добавлением кислот и воды.

Анализ смеси веществ этим методом проводится по следующей схеме: на полоску бумаги различной формы на небольшом расстоянии от одного из ее концов наносят на линию старта в виде капли (или полоски) смеси разделяемых веществ. После высыхания капли край бумаги ниже линии старта погружают в подвижную фазу, налитую на дно хроматографической камеры, затем подвешивают вертикально полоску бумаги, плотно закрывают камеру и оставляют на некоторое время (восходящий вариант). Подвижная фаза под действием капиллярных сил поднимается по бумаге, вместе с ней перемещаются с различной скоростью анализируемые вещества. Когда фронт подвижной фазы приблизится к противоположному концу бумаги или пройдет заданное расстояние, лист вынимают и сушат.

Зоны разделяемых веществ в виде пятен, которые могут быть как видимыми, так и невидимыми, обнаруживают, отмечают положение и проводят определение (качественное и количественное) разделенных компонентов.

Хроматографическая бумага. Подвижная фаза.

Хроматографическую бумагу изготавливают из высококачественного хлопка, т. е. из практически чистой α-целлюлозы (до 98%). Древесину в качестве исходного сырья не применяют, так как при длительной переработке ее и очистке получаются короткие и хаотично расположенные волокна бумаги. Хроматографическая же бумага должна представлять собой длинные, ориентированные в определенном направлении волокна. В этом случае нанесенная на бумагу жидкость перемещается по капиллярам, образуемым волокнами хроматографической бумаги. Наиболее четкое и воспроизводимое разделение достигается в том случае, когда направление движения подвижной фазы совпадает с направлением волокон бумаги.

α-Целлюлоза даже после сушки содержит в порах значительное количество связанной воды (гигроскопическая влага, до 25%), которая и служит неподвижной фазой. Физическая структура связанной воды в целлюлозе сильно отличается от структуры "свободной воды", которая иногда применяется в качестве подвижной фазы или входит в ее состав.

Хроматографическая бумага должна отвечать следующим требованиям:

1) быть химически чистой, для чего ее предварительно обрабатывают растворами минеральных кислот, щелочей или ацетоном и спиртами, которые вымывают различные органические и неорганические примеси;

2) быть химически и адсорбционно инертной по отношению к разделяемым веществам и подвижной фазе;

3)  быть однородной по плотности и толщине; чем плотнее бумага, тем медленнее скорость движения зон по ней, но тем большее количество вещества можно разделить (сорбционная емкость бумаги выше);

4)  иметь длинные и определенным образом ориентированные волокна.

Хроматографические параметры.

Скорость перемещения по бумаге разделяемых веществ определяется соответствующими коэффициентами распределения КД . Чем меньше величина КД тем быстрее вещество передвигается по бумаге. Определить КД непосредственно из хроматографического эксперимента, т.е. найти концентрацию в подвижной и неподвижной фазах, довольно сложно. Поэтому в качестве основной характеристики удерживания вещества, показывающей положение его зоны на полоске хроматографической бумаги, используется фактор Rf, определяемый как отношение скорости (или расстояния) движения фронтов зоны и подвижной фазы:

Rf = l/L

где / — расстояние от линии старта до середины зоны хроматографируемого соединения, см; Lрасстояние, пройденное подвижной фазой от стартовой линии до линии фронта.

Таким образом, величина Rf указывает на местоположение зоны вещества на хроматограмме. Если Rf = 0,5, значит зона расположена на середине пути подвижной фазы. Фактор Rf меняется от 0 (зона на старте) до значения, близкого к 1 (зона движется с фронтом подвижной фазы). Величина Rf не зависит от концентрации определяемого вещества (если не превышена емкость бумаги) и от присутствия других веществ, но зависит от ряда других факторов: от природы вещества (возможны пространственные затруднения, возникающие при взаимодействии с растворителем функциональной группы определяемого вещества); от природы подвижной и неподвижной фаз; от сорта бумаги и от температуры.

Значения Rf  для многочисленных веществ при определенных условиях приведены в справочной литературе.

Разделение двух веществ возможно, если Rf1Rf2 и ∆Rf ≥ 0,1. Критерий разделения R рассчитывается по формуле:

Коэффициент распределения связан с Rf соотношением:

где VП / VHотношение объемов подвижной и водной фаз в полоске бумаги, которое находится экспериментально взвешиванием хроматографической полосы до и после эксперимента.

Для более строгого вычисления КД требуется измерить отношение площадей поперечного сечения подвижной АП и неподвижной АН фаз:

   

Типы хроматограмм.

В зависимости от направления движения подвижной фазы различают несколько способов получения хроматограмм: восходящий и нисходящий, линейные способы, круговой, электрофоретический, двумерный и др.

Оборудование. Методика эксперимента.

Применяемая в бумажной хроматографии аппаратура отличается своей простотой и доступностью, что выгодно отличает этот метод от колоночной хроматографии.

Хроматографирование проводят в хроматографической камере, в качестве которой можно применить любой сосуд с герметической крышкой, чтобы не происходило испарения растворителя, которое может привести к нежелательному изменению состава одной или обеих фаз. Таким сосудом может быть цилиндр, высокий стакан, эксикатор, чашка Петри (для круговой хроматографии). Внутрь камеры вставляют держатель или подставку-стойку для полоски хроматографической бумаги и небольшую емкость для подвижной фазы.

Анализируемый раствор наносят на стартовую линию в объеме не более 5—10 мкл с помощью микропипетки, калиброванного капилляра или микрошприца. Чем меньше площадь стартового пятна, тем менее размытой будет зона вещества после хроматографирования. Поэтому пробу смеси веществ объемом более 1 мы наносят в одну и ту же точку повторно в несколько приемов, каждый раз подсушивая пятно. Подсушивать пятно над нагревательными приборами надо осторожно, чтобы не удалить из пор хроматографической бумаги неподвижную фазу.

Во время хроматографирования ни в коем случае нельзя открывать крышку сосуда, чтобы не сместить равновесие между фазами.

После развития хроматограмм их сушат под тягой в специальном шкафу в токе теплого воздуха или под инфракрасной лампой. После высушивания приступают к обнаружению и идентификации пятен.

Качественный анализ.

Если хроматографируемые вещества окрашены, то зоны их наблюдаются визуально. Если зоны бесцветны, то их обнаруживают на полоске бумаги следующими приемами.

Проявляют хроматограмму раствором-проявителем, который дает с определяемым веществом окрашенный продукт реакции. Проявитель наносят путем распыления с помощью пульверизатора. Очень часто хроматограмму помещают в пары иода (в закрытый сосуд), который вступает в реакцию с различными органическими веществами, окрашивая их в желтый, коричневый или чернильно-синий цвет. Используют также специфическую реакцию на алифатические амины и аминокислоты с нингидрином: после опрыскивания реагента и последующего нагревания бумаги на ней появляются окрашенные в малиново-красный цвет пятна. Для проявления неорганических ионов, например Fe3+ и Со2+, на хроматограмму распыляют 10%-ный раствор роданида аммония в ацетоне, при этом зона железа окрашивается в красно- коричневый цвет, кобальта — в синий вследствие образования комплексных роданидных ионов этих элементов. Иногда реактив наносят на хроматограмму кисточкой, если требуется проявление на ограниченном участке бумаги.

Бесцветные вещества можно обнаружить при воздействии ультрафиолетовых лучей по возникновению их собственной флуоресценции или путем обработки их каким-либо реагентом, дающим специфическую флуоресцентную реакцию (флуоресцируют продукты реакции). Чтобы получить флуоресценцию, полоску бумаги помещают в ультрафиолетовый свет ртутной лампы с определенными фильтрами и тут же обводят карандашом появившиеся пятна.

После обнаружения на бумажной хроматограмме зон разделяемых веществ обычно приступают к их идентификации. Как правило, исследователь знает примерно состав анализируемой смеси. В этом случае идентифицировать зоны, т.е. определить принадлежность их к определенным веществам, можно несколькими способами.

1. Зная проявляющий реагент и окраску продукта реакции, по характерному цвету пятна соотносят зону тому или другому определяемому веществу. Аналогично можно провести идентификацию по окраске флуоресцирующих пятен.

2. Сравнивают измеренные величины Rf  с известными.

3. Проводят хроматографирование со "свидетелем". Для этого рядом с каплей определяемого вещества на линию старта наносят столько капель растворов индивидуальных веществ, сколько их содержится в анализируемой смеси. После хроматографирования и проявления сопоставляют положения пятен исследуемой смеси и "свидетелей" и делают вывод о присутствии или отсутствии их в анализируемом растворе.

Количественный анализ.

В бумажной хроматографии существует две группы способов количественного анализа: непосредственно на хроматограмме или после извлечения (элюирования) зоны с хроматограммы. Количественное определение вещества на хроматограмме проводят следующими методами.

Исходят из пропорциональности между количеством вещества и площадью пятна. В интервале микрограммовых количеств хро-матографируемых веществ между площадью пятна и содержанием вещества в нем наблюдается линейная зависимость

 или 

где Sплощадь пятна, мм; g — содержание вещества в пятне.

В этом случае на полоску бумаги наносят несколько капель, содержащих разные, но определенные концентрации вещества (метод градуировочного графика). После хроматографирования измеряют площадь пятен. Затем строят градуировочный график или методом наименьших квадратов получают числовое значение коэффициентов а и b. Измерив площадь пятна определяемого вещества, его содержание в пятне находят по графику или рассчитывают по уравнению.

Используют и такой метод: вырезают и взвешивают пятно на бумаге и аналогичный по площади чистый кусочек той же бумаги, по разности находят массу вещества.

Если зоны (пятна) на хроматограмме окрашены, содержание вещества определяют по интенсивности окраски. В этом случае сравнивают интенсивность окраски с полученной на бумаге шкалой пятен различной интенсивности (и, следовательно, различного содержания данного вещества). Сюда же можно отнести определение содержания вещества по степени почернения фотопленки или фотобумаги в методе авторадиографии. Можно также измерить интенсивность окраски пятна на бумаге фотометрически на денситометре в отраженном или проходящем свете. Денситометр записывает пики, которые сравнивают с пиками стандартных проб.

Количественный анализ можно провести путем извлечения (элюирования) вещества с хроматограммы водой или другим растворителем с последующим измерением концентрации вещества в экстракте различными химическими, физико-химическими или физическими методами (титрование, фотометрия, потенциометрия, полярография и т. д.).

Практическая часть:

В работе анализируют смесь аминокислот — β-фениланилина (1), α-аланина (2), аспарагиновой кислоты (3), аргинина гидрохлорида (4):

Разделение смеси основано на различии коэффициентов распределения аминокислот между подвижной и неподвижной фазами. Для проявления хроматограммы используют специфичный реактив на аминокислоты — нингидрин. По проявленной хрома-тографической зоне устанавливают качественный состав смеси (измеряют величины Rf) и количественное содержание одной из кислот по линейной зависимости площади пятна аминокислоты от ее содержания в пятне (метод градуировочного графика).

Приборы и реактивы

Хроматографическая бумага марки "С", круг диаметром 12 см.

Фильтровальная бумага, 8 х 8 см.

Эксикатор.

Пульверизатор.

Микрошприц вместимостью 10 мкл.

Пинцет.

Транспортир.

Канцелярская булавка.

Шаблон.

Растворы -"свидетели" аминокислот (β-фенилаланин, α-аланин, аспарагиновая кислота, гидрохлорид аргинина), содержащие по 0,8—1 мг/мл аминокислот; соотношение изопропилового спирта и воды 1:9.

Подвижная фаза: смесь воды, изопропилового спирта и уксусной кислоты (5:4:1); компоненты встряхивают в делительной воронке и после расслоения используют в качестве подвижной фазы верхний слой смеси.

Проявитель: 0,25%-ный раствор нингидрина в водно-насыщенном «-бутиловом спирте.

Выполнение  работы

Все манипуляции с хроматографической бумагой проделывают с помощью пинцета. Бумагу следует брать руками только за внешний край круга.

На круг хроматографической бумаги накладывают шаблон с пятью секторами и простым карандашом очерчивают линию фронта (на рис. 5.32). В четыре сектора с помощью микрошприца в 2—3 приема в одну и ту же точку на стартовой линии (на рисунке обозначено звездочками) наносят по 4 мкл растворов-"свидетелей" четырех аминокислот. После каждого нанесения пробы пятну дают подсохнуть. Диаметр пятна не должен превышать 3 мм и ни в коем случае пятно не должно касаться границ секторов. Последовательность нанесения растворов-"свидетелей" аминокислот записывают в тетрадь. На стартовую линию пятого сектора микрошприцем наносят раствор, содержащий смесь аминокислот неизвестного состава (объем пробы указывает преподаватель).

Из квадрата обычной фильтровальной бумаги сворачивают конус и с помощью канцелярской булавки скрепляют его. Вершину конуса вставляют в отверстие круга и круг с конусом помещают в эксикатор строго горизонтально таким образом, чтобы край круга лежал на внутреннем выступе эксикатора, а основание конуса было погружено в подвижный растворитель, находящийся в чашке на дне эксикатора (рис. 5.33). Движение растворителя и зон компонентов   происходит  от центра к периферии.

Развитие хроматограммы останавливают примерно через 30—40 мин, когда фронт растворителя достигнет очерченной линии финиша. Хроматограмму извлекают из эксикатора пинцетом и помешают для высушивания в бокс под тягу. Сухую хроматограмму опрыскивают из пульверизатора проявителем и снова подсушивают. Опрыскивать следует так, чтобы хроматограмма становилась лишь влажной Недопустимо, чтобы раствор проявителя стекал с хроматограммы струйками. Затем хроматограмму осторожно нагревают над закрытой электроплиткой до появления окрашенных пятен в виде части колец.

Измеряют величины Rf индивидуальных аминокислот и устанавливают качественный состав смеси.

Для проведения количественного анализа рассчитывают площадь части кольца — проявленная хроматографическая зона — с центральным углом φ:

   

Угол φ (в градусах) находят с помощью транспортира.

По установленной линейной зависимости  (график прилагается) находят содержание одной из аминокислот. Хроматограмму помещают в лабораторный журнал.

PAGE  1


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

23202. Філософське мислення та його специфіка 30 KB
  Філософське мислення та його специфіка. Філософський стиль мислення з’являється тодіколи людина починає масштабно мислити і шукати оптимальний варіант свого життя. Філософський тип мислення є не тільки любов’ю до мудрості. рівнях: звичайний буденнийпочуття; теоретичниймислення; практичнийна осн.
23207. Діалектика та метафізика як філософські методи 38.5 KB
  Діалектика метод філософського дослідження при якому речі явища розглядаються гнучко критично послідовно з врахуванням їх внутрішніх протиріч змін розвитку причин і наслідків єдності і боротьби протилежностей. Метафізика метод протилежний діалекціку при якому об'єкти розглядаються: відособлено як самі по собі а не з точки зору їх взаємозв'язаної ; статично ігнорується факт постійних змінсамору хурозвитку; однозначно ведеться пошук абсолютної істини не приділяється уваги протиріччямне усвідомлюється їх єдність....