11902

Определение арсеназо 1 и голубого декстрана в их смеси

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа №312 Определение арсеназо 1 и голубого декстрана в их смеси. Краткое теоретическое введение: Общая характеристика метода Гельхроматография или гельпроникающая или эксклюзионная хроматография является одним из вариантов жидкостной хромато...

Русский

2013-04-14

229.5 KB

14 чел.

Лабораторная работа №312

Определение арсеназо 1 и голубого декстрана в их смеси.

Краткое теоретическое введение:

Общая характеристика метода

Гель-хроматография, или гель-проникающая, или эксклюзионная хроматография является одним из вариантов жидкостной хроматографии, в котором растворенное хроматографируемое вещество распределяется между растворителем, окружающим гранулы сорбента (подвижная фаза), и растворителем, находящимся внутри пор гранул сорбента (неподвижная фаза). Ввиду того, что сорбенты, используемые в гель-хроматографии, имеют различные по размерам поры, то разделение в данном случае зависит от соотношения размеров молекул разделяемых веществ и размеров пор сорбента. Помимо размеров, которые можно в первом приближении принять пропорциональными молекулярным массам, существенную роль в гель-хроматографии играет форма молекул. Особенно большое значение этот фактор имеет для растворов полимеров, в которых при одной и той же молекулярной массе молекулы могут принимать различную форму (сферическую или другую) в соответствии с их конформационной подвижностью и вследствие этого они по-разному ведут себя в колонке. Дальнейшие рассуждения справедливы для молекул, имеющих сферическую форму.

При прохождении через колонку компоненты смеси разделяются на фракции в соответствии с их молекулярными массами; первыми вымываются (элюируются) наиболее крупные молекулы, особенно такие, у которых размеры молекул превышают размеры пор сорбента, так как они не в состоянии проникнуть в поры и остаются только в окружающем сорбент слое растворителя (внешнем объеме). При промывании колонки растворителем скорость движения таких молекул максимальна. Молекулы меньшего размера будут проникать в поры полностью или частично (в зависимости от размера пор), и весь процесс разделения будет зависеть, кроме размера пор сорбента, от коэффициента диффузии разделяемых молекул. Согласно уравнению Эйнштейна коэффициент диффузии DH обратно пропорционален радиусу частицы r сорбента:

    

где R — универсальная газовая постоянная; Т— абсолютная температура; η — вязкость среды; NAчисло Авогадро.

Сорбенты.

В зависимости от свойств хроматографируемых соединений в гель-хроматографии применяют гидрофильные или гидрофобные сорбенты с жесткой, полужесткой и мягкой матрицей. В качестве гидрофильных сорбентов используют мягкие декстрановые гели (сефадексы и молселекты), полиакриламидные гели (биогели), гидроксиалкилметакрилатные гели (сфероны), а также макропористые силикагели и макропористые стекла (жесткие сорбенты). В качестве гидрофобных сорбентов применяют некоторые типы сефадексов, полистирольные гели (стирогель, пора-гель), поливинилацетатные гели и также силикагель и макропористое стекло (порасил).

Основное требование к работе сорбентов в гель-хроматографии — исключить адсорбцию и ионный обмен разделяемых веществ, т. е. разделение должно проходить только за счет размеров молекул. Среди гидрофильных сорбентов наиболее применимыми являются декстрановые гели — сефадексы. На примере сефадекса ниже рассмотрены физико-химические основы удерживания в гель-хроматографии, которые справедливы для любых других сорбентов в данном хроматографическом методе.

Декстран — растворимый линейный полисахарид с молекулярной массой до 10 млн., очень гидрофилен вследствие высокого содержания гидроксильных групп. При частичном гидролизе в разбавленной кислоте декстран распадается на фракции, имеющие различную молекулярную массу. Используя реакцию декстрана с эпихлоргидрином, получают трехмерный, нерастворимый в воде гель, называемый сефадексом. Он выпускается в виде гранул. Степень набухания и размеры пор в фракции сефадекса зависят, главным образом, от степени сшивки линейного полимера декстрана и его молекулярной массы. Чем сильнее набухаемость в воде фракций сефадекса, тем больше размеры пор и тем большие по размеру молекулы можно разделять на данной фракции.

Сефадексы практически не оказывают химического действия на исследуемые вещества и не изменяют их природы. Они устойчивы к органическим растворителям, к разбавленным растворам кислот и щелочей в интервале рН от 2 до 10.

Растворитель в колонке, заполненной сорбентом, например гелем, состоит из неподвижной фазы (растворитель в порах геля) и подвижной фазы (растворитель между гранулами геля). Общий объем столбика геля (объем колонки) Vt складывается из внешнего объема (объема растворителя между гранулами, т. е. подвижной фазы) Vo , внутреннего объема (объема растворителя внутри гранул, т. е. неподвижной фазы) VH и объема сухого геля (объема матрицы) Vм:

    

Значение Vо определяют, пропуская по колонке высокомолекулярное вещество, не способное проникать в гранулы геля, т. е. размер молекул которого больше размера пор геля. Объем растворителя, прошедшего через колонку от момента внесения высокомолекулярного вещества до момента появления максимума его концентрации в элюате на выходе колонки, точно соответствует внешнему объему Vo. Значение VH определяют по формуле:

где а — масса сухого геля, г; Sемкость геля по растворителю, г/г геля; р — плотность растворителя, г/см3.

Если размеры молекул вещества значительно меньше пор гранул геля и беспрепятственно проникают внутрь пор, то для таких молекул коэффициент распределения КД = 1. Молекулы вещества, по своим размерам занимающие промежуточное положение, могут проникать в поры ограниченно, т. е. для них доступны не все поры и, следовательно, не весь внутренний объем гранул. Для них справедливо соотношение: 0 < КД < 1. При разделении на данном геле коэффициент КД является константой вещества и зависит только от размеров и конформации молекул вещества.

Параметры элюирования. Удерживание веществ в гель-хроматографии (объем удерживания VR) подчиняется общему уравнению хроматографии:

Из-за сложности определения объема растворителя внутри пор, т. е. величины Vн, вместо КД в гель-хроматографии иногда используют величину Каv — так называемую константу доступности. От КД она отличается тем, что вместо внутреннего объема VH для ее вычисления берут общий объем геля. Константу доступности вычисляют по формуле:

    

Различие между КД и Каv тем меньше, чем более пористым является сорбент. Значения КД и Kav изменяются от 0 до 1 только в отсутствие взаимодействия с фазой геля. Если эти константы превышают единицу, то, значит, на гель-фильтрацию накладыва ются другие процессы, в частности, адсорбция на поверхности геля и распределение между раствором и фазой геля в целом Поэтому общее уравнение, описывающее процесс гель-хроматографии, имеет вид:

   

где Sповерхность гранул сорбента; К1 = КД; К2 и К3 соответственно коэффициенты адсорбации и распределения.

В этом уравнении второй член описывает проникновение вещества в поры, третий член К2Sадсорбцию веществ на скелете сорбента (для слабонабухающих), четвертый член К3Vм — распределение вещества между подвижной фазой и фазой геля в целом, что наблюдается только для малопересеченных сильнонабухающих гелей, для которых VH >> VM. Для таких гелей принимают, что не существуют раздельно поры и матрица, а есть одна система, в которой и происходит распределение макромолекул.

Явления адсорбции и распределения в гелях разделить очень трудно, и обычно оба явления рассматривают вместе. Например, низкомолекулярные ароматические и гетероциклические соединения (фенол и пиридин) сильнее задерживаются в гранулах сефадекса, чем это можно ожидать только вследствие диффузии, т. е. VR > VR теор, что, вероятно, можно объяснить в некоторых случаях образованием водородных связей между ОН-группами сефадекса и молекулами разделяемых соединений. В отсутствие взаимодействия веществ с фазой геля К2 = 0 и К3 = 0 и общее уравнение приобретает первоначальный вид.

Элюенты. В гель-хроматографии элюенты (подвижная фаза) выбирают, главным образом, исходя из требований, чтобы они растворяли разделяемые вещества и обладали малой вязкостью. Для гидрофильных веществ при работе с мягкими гелями используются водные растворы с определенной ионной силой и рН. Для разделения полимеров, не растворимых в воде, применяют органические растворители такие, как тетрагидрофуран, диметилформамид, толуол и др. Кроме того, при выборе элюента следует учитывать, что подвижная фаза должна быть совместима с используемым сорбентом. Иногда замена одного растворителя другим приводит к достижению разделения вследствие взаимодействия растворителя и разделяемых веществ.

В разделении методом гель-хроматографии участвует лишь незначительная часть объема колонки (VtVо) (см. рисунок), поэтому число компонентов, которое можно разделить, ограничено. И, как следствие, в гель-хроматографии применяют довольно длинные колонки, но в этом случае происходит размывание зон и увеличивается ВЭТТ. Особенно значительно размывание зоны в колонке при разделении высокомолекулярных веществ, так как на ВЭТТ влияет скорость диффузии вещества внутрь пор: чем больше молекулярная масса диффундирующего вещества, тем больше сопротивление массопередаче (меньше скорость диффузии) при определенной молекулярной массе оно достигает максимума а затем начинает уменьшаться и становится равным нулю когда размеры молекул становятся больше размеров пор. Вследствие этих причин максимальное число разделяемых компонентов в гель-хроматографии в три раза меньше, чем на аналогичной колонке в газовой или жидкостной хроматографии при равном числе теоретических тарелок.

Возможности метода.

Гель-хроматография широко применяется в биохимии, синтетической органической химии и химии полимеров. Основные направления применения гель-хроматографии следующие.

1.   Групповое отделение высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных. В биохимии это разделение называется обессоливанием. Этот метод позволяет получить чистые белки, нуклеиновые кислоты с большой молекулярной массой, при этом низкомолекулярные соли, например NaCl, задерживаются в порах сорбента.

2. Разделение (фракционирование) компонентов смеси, различающихся по молекулярным массам, но не столь значительно, как для указанных в пункте 1. Например, на сефадексе G-150 достигается разделение ферментов селезенки с молекулярными массами 100000, 45000 и 24000. В связи с разработкой сорбентов особо высокой дисперсности гель-хроматографию все чаше применяют для разделения низкомолекулярных соединений, например, триглицеридов высших жирных кислот (М ≈  200 - 500) в процессе физико-химических превращений олигомеров в полимеры  500 - 1000).

3. Определение молекулярных масс белков, олигомеров, полимеров, углеводородов, основанное на линейной зависимости объемов выхода веществ от молекулярной массы:

  

Каждый сорбент характеризуется своей градуировочной кривой, по которой находят молекулярные массы веществ.

В качестве калибровочных соединений (стандартов) используют вещества, близкие по своей природе к исследуемым веществам. Так как на данной колонке объем выхода вещества воспроизводится очень точно, то вначале через колонки пропускают стандартные вещества и определяют их объемы выхода, строят градуировочный график, а затем, зная VR вещества с неизвестной молекулярной массой, находят ее по графику.

4. Тонкослойная гель-хроматография находит широкое применение для определения молекулярно-массового и композиционного распределения полимеров, в клинической диагностике как экспресс-метод для определения патологических белков в сыворотке крови, спинномозговой жидкости, для проверки чистоты препаратов и т. д.

Экспериментальная часть.

Разделение красителя арсеназо 1 (молекулярная масса 592,3) и нитрофенола (молекулярная масса 139,1) на колонке с сефадексом G-25 происходит вследствие различия их молекулярных масс. Первым вымывается арсеназо 1, как имеющий большую молекулярную массу, а затем нитрофенол. Для определения внешнего объема колонки (величина Vo) в анализируемую смесь добавляют высокомолекулярный полисахарид—голубой декстран (молекулярная масса до 2 млн.) Это вещество вымывается из колонки во внешнем объеме.

Количественное определение голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола проводят фотометрически по их собственной окраске.

Приборы и реактивы:

Хроматографическая колонка с сефадексом G-25 длиной 45 см, диаметром 2,5 см.

Фотоэлектроколориметр.

Градуированные пробирки вместимостью 5 мл.

Стаканы вместимостью 100 мл.

Пипетки вместимостью 1 мл.

Раствор NaOH, 20%-ный.

Анализируемый раствор: смесь растворов голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола, содержащие по 1 мг/мл, подкисленная двумя каплями 2М СН3СООН.

Выполнение работы

Хроматографирование анализируемой смеси.

 Воду в колонке опускают до уровня сефадекса. Не допускайте проскока жидкости ниже уровня сефадекса! Анализируемый раствор (около 2 мл) в один прием осторожно по стеклянной палочке вливают из бюкса в колонку, стараясь не взмутить верхний слой сефадекса. Одновременно под кран колонки подставляют мерный цилиндр и открывают кран. Бюкс дважды ополаскивают дистиллированной водой порциями около 0,5 мл (5—10 капель) и осторожно пере носят в колонку после впитывания анализируемого раствора в слой декстрана. Такая осторожность необходима для формирования четкой, неразмытой зоны. После этого объем вносимой воды в верхнюю часть колонки не имеет значения, и воду добавляют по мере ее протекания через колонку.

В пробирки вместимостью 5 мл начинают собирать первые окрашенные в голубой цвет капли голубого декстрана. Записывают объем элюата (объем воды в цилиндре). Всего отбирают пробы объемом по 5 мл в 22 пробирки.

Определение голубого декстрана и арсеназо 1.

Содержимое пробирки (5 мл) переносят в кювету с толщиной поглощающего слоя  

l =10 мм и измеряют оптическую плотность А на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (λ= 630 нм) для голубого декстрана и с зеленым светофильтром = 540 нм) для арсеназо 1. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.

По градуировочным графикам находят содержание обоих компонентов в каждой пробирке (gi, мг). Содержание голубого декстрана и арсеназо 1 по отдельности в исходной смеси определяют суммированием количеств этих веществ в пробирках:

PAGE  1