11902

Определение арсеназо 1 и голубого декстрана в их смеси

Лабораторная работа

Химия и фармакология

Лабораторная работа №312 Определение арсеназо 1 и голубого декстрана в их смеси. Краткое теоретическое введение: Общая характеристика метода Гельхроматография или гельпроникающая или эксклюзионная хроматография является одним из вариантов жидкостной хромато...

Русский

2013-04-14

229.5 KB

14 чел.

Лабораторная работа №312

Определение арсеназо 1 и голубого декстрана в их смеси.

Краткое теоретическое введение:

Общая характеристика метода

Гель-хроматография, или гель-проникающая, или эксклюзионная хроматография является одним из вариантов жидкостной хроматографии, в котором растворенное хроматографируемое вещество распределяется между растворителем, окружающим гранулы сорбента (подвижная фаза), и растворителем, находящимся внутри пор гранул сорбента (неподвижная фаза). Ввиду того, что сорбенты, используемые в гель-хроматографии, имеют различные по размерам поры, то разделение в данном случае зависит от соотношения размеров молекул разделяемых веществ и размеров пор сорбента. Помимо размеров, которые можно в первом приближении принять пропорциональными молекулярным массам, существенную роль в гель-хроматографии играет форма молекул. Особенно большое значение этот фактор имеет для растворов полимеров, в которых при одной и той же молекулярной массе молекулы могут принимать различную форму (сферическую или другую) в соответствии с их конформационной подвижностью и вследствие этого они по-разному ведут себя в колонке. Дальнейшие рассуждения справедливы для молекул, имеющих сферическую форму.

При прохождении через колонку компоненты смеси разделяются на фракции в соответствии с их молекулярными массами; первыми вымываются (элюируются) наиболее крупные молекулы, особенно такие, у которых размеры молекул превышают размеры пор сорбента, так как они не в состоянии проникнуть в поры и остаются только в окружающем сорбент слое растворителя (внешнем объеме). При промывании колонки растворителем скорость движения таких молекул максимальна. Молекулы меньшего размера будут проникать в поры полностью или частично (в зависимости от размера пор), и весь процесс разделения будет зависеть, кроме размера пор сорбента, от коэффициента диффузии разделяемых молекул. Согласно уравнению Эйнштейна коэффициент диффузии DH обратно пропорционален радиусу частицы r сорбента:

    

где R — универсальная газовая постоянная; Т— абсолютная температура; η — вязкость среды; NAчисло Авогадро.

Сорбенты.

В зависимости от свойств хроматографируемых соединений в гель-хроматографии применяют гидрофильные или гидрофобные сорбенты с жесткой, полужесткой и мягкой матрицей. В качестве гидрофильных сорбентов используют мягкие декстрановые гели (сефадексы и молселекты), полиакриламидные гели (биогели), гидроксиалкилметакрилатные гели (сфероны), а также макропористые силикагели и макропористые стекла (жесткие сорбенты). В качестве гидрофобных сорбентов применяют некоторые типы сефадексов, полистирольные гели (стирогель, пора-гель), поливинилацетатные гели и также силикагель и макропористое стекло (порасил).

Основное требование к работе сорбентов в гель-хроматографии — исключить адсорбцию и ионный обмен разделяемых веществ, т. е. разделение должно проходить только за счет размеров молекул. Среди гидрофильных сорбентов наиболее применимыми являются декстрановые гели — сефадексы. На примере сефадекса ниже рассмотрены физико-химические основы удерживания в гель-хроматографии, которые справедливы для любых других сорбентов в данном хроматографическом методе.

Декстран — растворимый линейный полисахарид с молекулярной массой до 10 млн., очень гидрофилен вследствие высокого содержания гидроксильных групп. При частичном гидролизе в разбавленной кислоте декстран распадается на фракции, имеющие различную молекулярную массу. Используя реакцию декстрана с эпихлоргидрином, получают трехмерный, нерастворимый в воде гель, называемый сефадексом. Он выпускается в виде гранул. Степень набухания и размеры пор в фракции сефадекса зависят, главным образом, от степени сшивки линейного полимера декстрана и его молекулярной массы. Чем сильнее набухаемость в воде фракций сефадекса, тем больше размеры пор и тем большие по размеру молекулы можно разделять на данной фракции.

Сефадексы практически не оказывают химического действия на исследуемые вещества и не изменяют их природы. Они устойчивы к органическим растворителям, к разбавленным растворам кислот и щелочей в интервале рН от 2 до 10.

Растворитель в колонке, заполненной сорбентом, например гелем, состоит из неподвижной фазы (растворитель в порах геля) и подвижной фазы (растворитель между гранулами геля). Общий объем столбика геля (объем колонки) Vt складывается из внешнего объема (объема растворителя между гранулами, т. е. подвижной фазы) Vo , внутреннего объема (объема растворителя внутри гранул, т. е. неподвижной фазы) VH и объема сухого геля (объема матрицы) Vм:

    

Значение Vо определяют, пропуская по колонке высокомолекулярное вещество, не способное проникать в гранулы геля, т. е. размер молекул которого больше размера пор геля. Объем растворителя, прошедшего через колонку от момента внесения высокомолекулярного вещества до момента появления максимума его концентрации в элюате на выходе колонки, точно соответствует внешнему объему Vo. Значение VH определяют по формуле:

где а — масса сухого геля, г; Sемкость геля по растворителю, г/г геля; р — плотность растворителя, г/см3.

Если размеры молекул вещества значительно меньше пор гранул геля и беспрепятственно проникают внутрь пор, то для таких молекул коэффициент распределения КД = 1. Молекулы вещества, по своим размерам занимающие промежуточное положение, могут проникать в поры ограниченно, т. е. для них доступны не все поры и, следовательно, не весь внутренний объем гранул. Для них справедливо соотношение: 0 < КД < 1. При разделении на данном геле коэффициент КД является константой вещества и зависит только от размеров и конформации молекул вещества.

Параметры элюирования. Удерживание веществ в гель-хроматографии (объем удерживания VR) подчиняется общему уравнению хроматографии:

Из-за сложности определения объема растворителя внутри пор, т. е. величины Vн, вместо КД в гель-хроматографии иногда используют величину Каv — так называемую константу доступности. От КД она отличается тем, что вместо внутреннего объема VH для ее вычисления берут общий объем геля. Константу доступности вычисляют по формуле:

    

Различие между КД и Каv тем меньше, чем более пористым является сорбент. Значения КД и Kav изменяются от 0 до 1 только в отсутствие взаимодействия с фазой геля. Если эти константы превышают единицу, то, значит, на гель-фильтрацию накладыва ются другие процессы, в частности, адсорбция на поверхности геля и распределение между раствором и фазой геля в целом Поэтому общее уравнение, описывающее процесс гель-хроматографии, имеет вид:

   

где Sповерхность гранул сорбента; К1 = КД; К2 и К3 соответственно коэффициенты адсорбации и распределения.

В этом уравнении второй член описывает проникновение вещества в поры, третий член К2Sадсорбцию веществ на скелете сорбента (для слабонабухающих), четвертый член К3Vм — распределение вещества между подвижной фазой и фазой геля в целом, что наблюдается только для малопересеченных сильнонабухающих гелей, для которых VH >> VM. Для таких гелей принимают, что не существуют раздельно поры и матрица, а есть одна система, в которой и происходит распределение макромолекул.

Явления адсорбции и распределения в гелях разделить очень трудно, и обычно оба явления рассматривают вместе. Например, низкомолекулярные ароматические и гетероциклические соединения (фенол и пиридин) сильнее задерживаются в гранулах сефадекса, чем это можно ожидать только вследствие диффузии, т. е. VR > VR теор, что, вероятно, можно объяснить в некоторых случаях образованием водородных связей между ОН-группами сефадекса и молекулами разделяемых соединений. В отсутствие взаимодействия веществ с фазой геля К2 = 0 и К3 = 0 и общее уравнение приобретает первоначальный вид.

Элюенты. В гель-хроматографии элюенты (подвижная фаза) выбирают, главным образом, исходя из требований, чтобы они растворяли разделяемые вещества и обладали малой вязкостью. Для гидрофильных веществ при работе с мягкими гелями используются водные растворы с определенной ионной силой и рН. Для разделения полимеров, не растворимых в воде, применяют органические растворители такие, как тетрагидрофуран, диметилформамид, толуол и др. Кроме того, при выборе элюента следует учитывать, что подвижная фаза должна быть совместима с используемым сорбентом. Иногда замена одного растворителя другим приводит к достижению разделения вследствие взаимодействия растворителя и разделяемых веществ.

В разделении методом гель-хроматографии участвует лишь незначительная часть объема колонки (VtVо) (см. рисунок), поэтому число компонентов, которое можно разделить, ограничено. И, как следствие, в гель-хроматографии применяют довольно длинные колонки, но в этом случае происходит размывание зон и увеличивается ВЭТТ. Особенно значительно размывание зоны в колонке при разделении высокомолекулярных веществ, так как на ВЭТТ влияет скорость диффузии вещества внутрь пор: чем больше молекулярная масса диффундирующего вещества, тем больше сопротивление массопередаче (меньше скорость диффузии) при определенной молекулярной массе оно достигает максимума а затем начинает уменьшаться и становится равным нулю когда размеры молекул становятся больше размеров пор. Вследствие этих причин максимальное число разделяемых компонентов в гель-хроматографии в три раза меньше, чем на аналогичной колонке в газовой или жидкостной хроматографии при равном числе теоретических тарелок.

Возможности метода.

Гель-хроматография широко применяется в биохимии, синтетической органической химии и химии полимеров. Основные направления применения гель-хроматографии следующие.

1.   Групповое отделение высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных. В биохимии это разделение называется обессоливанием. Этот метод позволяет получить чистые белки, нуклеиновые кислоты с большой молекулярной массой, при этом низкомолекулярные соли, например NaCl, задерживаются в порах сорбента.

2. Разделение (фракционирование) компонентов смеси, различающихся по молекулярным массам, но не столь значительно, как для указанных в пункте 1. Например, на сефадексе G-150 достигается разделение ферментов селезенки с молекулярными массами 100000, 45000 и 24000. В связи с разработкой сорбентов особо высокой дисперсности гель-хроматографию все чаше применяют для разделения низкомолекулярных соединений, например, триглицеридов высших жирных кислот (М ≈  200 - 500) в процессе физико-химических превращений олигомеров в полимеры  500 - 1000).

3. Определение молекулярных масс белков, олигомеров, полимеров, углеводородов, основанное на линейной зависимости объемов выхода веществ от молекулярной массы:

  

Каждый сорбент характеризуется своей градуировочной кривой, по которой находят молекулярные массы веществ.

В качестве калибровочных соединений (стандартов) используют вещества, близкие по своей природе к исследуемым веществам. Так как на данной колонке объем выхода вещества воспроизводится очень точно, то вначале через колонки пропускают стандартные вещества и определяют их объемы выхода, строят градуировочный график, а затем, зная VR вещества с неизвестной молекулярной массой, находят ее по графику.

4. Тонкослойная гель-хроматография находит широкое применение для определения молекулярно-массового и композиционного распределения полимеров, в клинической диагностике как экспресс-метод для определения патологических белков в сыворотке крови, спинномозговой жидкости, для проверки чистоты препаратов и т. д.

Экспериментальная часть.

Разделение красителя арсеназо 1 (молекулярная масса 592,3) и нитрофенола (молекулярная масса 139,1) на колонке с сефадексом G-25 происходит вследствие различия их молекулярных масс. Первым вымывается арсеназо 1, как имеющий большую молекулярную массу, а затем нитрофенол. Для определения внешнего объема колонки (величина Vo) в анализируемую смесь добавляют высокомолекулярный полисахарид—голубой декстран (молекулярная масса до 2 млн.) Это вещество вымывается из колонки во внешнем объеме.

Количественное определение голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола проводят фотометрически по их собственной окраске.

Приборы и реактивы:

Хроматографическая колонка с сефадексом G-25 длиной 45 см, диаметром 2,5 см.

Фотоэлектроколориметр.

Градуированные пробирки вместимостью 5 мл.

Стаканы вместимостью 100 мл.

Пипетки вместимостью 1 мл.

Раствор NaOH, 20%-ный.

Анализируемый раствор: смесь растворов голубого декстрана, арсеназо 1 и нитрофенола, содержащие по 1 мг/мл, подкисленная двумя каплями 2М СН3СООН.

Выполнение работы

Хроматографирование анализируемой смеси.

 Воду в колонке опускают до уровня сефадекса. Не допускайте проскока жидкости ниже уровня сефадекса! Анализируемый раствор (около 2 мл) в один прием осторожно по стеклянной палочке вливают из бюкса в колонку, стараясь не взмутить верхний слой сефадекса. Одновременно под кран колонки подставляют мерный цилиндр и открывают кран. Бюкс дважды ополаскивают дистиллированной водой порциями около 0,5 мл (5—10 капель) и осторожно пере носят в колонку после впитывания анализируемого раствора в слой декстрана. Такая осторожность необходима для формирования четкой, неразмытой зоны. После этого объем вносимой воды в верхнюю часть колонки не имеет значения, и воду добавляют по мере ее протекания через колонку.

В пробирки вместимостью 5 мл начинают собирать первые окрашенные в голубой цвет капли голубого декстрана. Записывают объем элюата (объем воды в цилиндре). Всего отбирают пробы объемом по 5 мл в 22 пробирки.

Определение голубого декстрана и арсеназо 1.

Содержимое пробирки (5 мл) переносят в кювету с толщиной поглощающего слоя  

l =10 мм и измеряют оптическую плотность А на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (λ= 630 нм) для голубого декстрана и с зеленым светофильтром = 540 нм) для арсеназо 1. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.

По градуировочным графикам находят содержание обоих компонентов в каждой пробирке (gi, мг). Содержание голубого декстрана и арсеназо 1 по отдельности в исходной смеси определяют суммированием количеств этих веществ в пробирках:

PAGE  1


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

38464. Организация оперативно-тактических действий подразделений по чрезвычайным ситуациям Хойникского гарнизона при ликвидации ЧС на аммиачно-холодильном участке Хойникского РайПО, расположенного по ул. Колесника 61, г. Хойники 460.5 KB
  Свойства аммиака. Прогнозирование масштабов заражения. Действия подразделений по чрезвычайным ситуациям. Экономическое обоснование затрат на ликвидацию ЧС выброс разлив аммиака. Основные формулы и справочные данные для расчета экономического обоснования затрат на ликвидацию ЧС выброс разлив аммиака. Расчет затрат на ликвидацию ЧС выброс разлив аммиака Мероприятия по охране труда.
38468. Производство РЭС на безвыводных ЧИП-ЭРЭ и миниатюрных ЭРЭ с применением поверхностного монтажа 1.52 MB
  Для обеспечения механической прочности изделия нужно выбрать материал печатной платы с достаточной прочностью стеклотекстолит. Габариты изделия должны быть не более 125x70x30 мм.2 Расчет надежности изделия Исходные данные вносим в таблицу 1 в которой содержится перечень тип и количество используемых компонентов и произведем их анализ. Надёжность – свойство изделия выполнять заданные функции в определенных условиях эксплуатации при сохранении значений основных параметров в заранее установленных пределах.
38469. Программы производственной преддипломной практики, итогового междисциплинарного экзамена и методические указания по выполнению выпускных квалификационных работ 372 KB
  Цель прохождения студентами производственной преддипломной практики – закрепить и расширить теоретические знания, полученные в университете по дисциплинам: «Бухгалтерский финансовый учет», «Бухгалтерский управленческий учет», «Комплексный экономический анализ хозяйственной деятельности», «Контроль и ревизия», «Бухгалтерская финансовая отчетность» и других дисциплин.
38470. Перспективи підвищення ефективності функціонування та ролі фінансового ринку в Україні 3.86 MB
  Фінансовий ринок - це складова частина інфраструктури фінансової системи, яка забезпечує територіальне (місце, віртуальне місце), часове і функціональне здійснення трансакцій субєктів національної та міжнародної економіки, встановлення рівноважної ціни за відповідних обсягів купівлі-продажу фінансових активів, інструментів, технологій, а також надання фінансових послуг, необхідних для здійснення господарської та фінансової діяльності.
38471. МЕНЕДЖМЕНТ ОРГАНИЗАЦИИ 1.18 MB
  Анализируется структура дипломного проекта устанавливается последовательность работ выполняемых при его подготовке. Определяются требования к оформлению дипломного проекта и правила проведения его защиты.4 Отчет по практике [4] 2 МЕСТО И НАЗНАЧЕНИЕ ДИПЛОМНОГО ПРОЕКТИРОВАНИЯ В УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ [5] 3 ЦЕЛИ ДИПЛОМНОГО ПРОЕКТИРОВАНИЯ [6] 4 ВЫБОР ТЕМЫ ДИПЛОМНОГО ПРОЕКТА [7] 5 СРОКИ РАЗРАБОТКИ ДИПЛОМНОГО ПРОЕКТА [8] 6 МЕТОДИЧЕСКАЯ ОСНОВА ФОРМИРОВАНИЯ ДИПЛОМНОГО ПРОЕКТА [8. Эта часть проекта особо важная для дипломного проекта.
38472. Менеджмент организации. Методические рекомендации к производственной практике 235 KB
  Производственная практика студентов проводится на предприятиях производственной и финансово-банковской сфер, в научно-исследовательских учреждениях, государственных организациях и структурах, а также в компаниях и фирмах различных форм собственности.