15408

Лабораторная диагностика кишечных инфекций. Возбудитель холеры. Биологические свойства. Патогенез и клиника холеры. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика холеры

Конспект урока

Медицина и ветеринария

Практическое занятие 22 Тема: Лабораторная диагностика кишечных инфекций. Возбудитель холеры. Биологические свойства. Патогенез и клиника холеры. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика холеры. 1. Лабораторная диагностика кишечных инфекций Лабо

Русский

2013-06-13

55 KB

19 чел.

Практическое занятие 22

Тема: Лабораторная диагностика кишечных инфекций. Возбудитель холеры. Биологические свойства. Патогенез и клиника холеры. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика холеры.

1. Лабораторная диагностика кишечных инфекций

Лабораторная диагностика кишечных инфекций регламентирована санитарно-эпидемиологическими правилами СП 3.1.1.1117-02 “Профилактика кишечных инфекций”. В соответствии с этими правилами лабораторному обследованию подлежат лица с подозрением на острые кишечные инфекции, лица, контактировавшие с больными, работники отдельных профессий, производств и организаций при поступлении на работу и по эпидемическим показаниям, секционный материал при наличии прижизненного диагноза острой кишечной инфекции (ОКИ). В качестве исследуемого материала для лабораторной диагностики используют фекалии, кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, остатки пищевого продукта. Исследования проводят на определение патогенных (условно-патогенных) энтеробактерий. Любой материал для лабораторного исследования собирают в стерильную стеклянную посуду. Срок доставки материала в лабораторию должен быть не более 2 часов после сбора. При невозможности своевременной доставки в лабораторию материала используют консервант или транспортную среду. При этом материал помещается в холодильник и направляется на исследование не позднее 12 часов после сбора.

Лабораторная диагностика кишечных инфекций включает в себя получение чистой культуры возбудителя, изучение ее морфологических и тинкториальных свойств, биохимической активности, фагочувствительности, серологических характеристик. Для этого на 1-ом этапе исследования производят посев культуры на дифференциально-диагностические питательные среды (Эндо, Левина, Плоскирева, висмут-сульфитный агар). На 2-ом этапе проводят выделение чистой культуры, то есть производят пересев отдельных колоний на скошенный МПА (двухсахарный агар Олькеницкого). На 3-ем этапе проводят идентификацию выделенной культуры по бактериоскопической картине, биохимической активности, серологическим свойствам (в реакции агглютинации). На 4-ом этапе учитывают результаты исследования и выдают заключение.

2. Возбудитель холеры

Холера - опасное инфекционное заболевание, вызываемое Vibrio cholerae (бактериями 2-й группы патогенности), протекающее по типу гастроэнтерита с интоксикацией и нарушением водно-электролитного обмена. В связи с тем, что для нее характерны резко выраженная способность к широкому эпидемическому распространению,  тяжелое течение и высокая летальность, холера относится к числу опасных инфекций.

Историческая справка. В истории холерных эпидемий можно выделить 4 периода.

I период - до  1817 г., когда холера была сосредоточена только в Восточной и Южной Азии (главным образом в Индии) и не выходила за ее пределы.

II период - с 1817 г. по 1926 г. холера вышла за пределы Индии и вызвала 6 пандемий, которые унесли миллионы человеческих жизней. Например, за 1823-1926 гг. Россия пережила 57 холерных лет, в течение которых холерой переболело более 5,6 млн. человек и умерло от нее 2,14 млн. человек (около 40%).

III период - с 1926 г. по 1961 г. Холера вернулась в свой основной эндемический очаг, и наступил период относительного благополучия.

IV период начался в Индонезии в 1961 г. седьмой пандемией, охватившей многие страны мира. С 1961 по 1996 г. холерой в 146 странах переболело 3 943 239 человек.

Таксономия и классификация возбудителя. Возбудитель холеры Vibrio cholerae был открыт в 1883 г. Р. Кохом. Вид V. cholerae относится к роду Vibrio семейству Vibrionaceae отделу Gracilicutes.

В настоящее время известно 4 биотипа возбудителя холеры:

- V. cholerae О1 cholerae (классический), выделенный Р.Кохом в Гонконге в 1883 г. от больного;

- V. cholerae eltor, изолированный от мусульманских паломников в 1906 г. на карантинной станции Эль-Тор а Египте;

- V. cholerae О139 bengal, который был обнаружен в 1993 г. в индийском штате Западная Бенгалия у больных во время крупной вспышки диарейной холероподобной инфекции;

- вибрионы, сходные по морфологическим, культуральным и биохимическим признакам с холерным вибрионом, но отличающиеся от него О-антигенами, называют парахолерными, холероподобными, НАГ-вибрионами (неагглютинирующимися вибрионами), вибрионами, не относящимися к О1-группе - V. cholerae non О1.

Эпидемиология. Холера - типичная кишечная инфекция. Природный  резервуар - больные и бактерионосители, а также вода, загрязненная их выделениями. Основной механизм передачи - фекалъно-оралъный, редко контактный. Факторы передачи - пищевые продукты, вода, объекты окружающей среды. Пути заражения - основной - через воду, используемую для питья, купания и хозяйственно-бытовых нужд; контактно-бытовой; через пищу.
Никакие животные в природе холерой не болеют. Определённую роль играют мухи, способные переносить возбудитель с испражнений на пищевые продукты.
Выделяют два типа эпидемий холеры:

- эпидемии-вспышки с едиными источником инфекции и путями распространения, характеризующиеся одномоментным появлением большого количества больных;

- вялотекущие эпидемии с перманентной заболеваемостью небольшого контингента и трудно выявляемыми путями передачи возбудителя.

Все крупные эпидемии и пандемии холеры были связаны с водой. Холерные вибрионы обладают такими приспособительными механизмами, которые обеспечивают существование их популяций как в организме человека, так и в определенных экосистемах открытых водоемов. Обильная диарея, характерная для холеры, способствует широкому распространению возбудителя в окружающей среде, прежде всего в сточных водах и в открытых водоемах. Человек, больной холерой, выделяет возбудителя в огромном количестве - от 100 млн. до 1 млрд. на 1 мл испражнений, носитель выделяет 100-100000 вибрионов в 1 мл, заражающая доза составляет около 1 млн. вибрионов. Продолжительность выделения холерного вибриона у здоровых носителей составляет от 7 до 42 дней, у переболевших - 7-10 дней.

Особенностью холеры является то, что после нее, как правило, не остается длительного носительства и не формируется стойких эндемических очагов. Однако загрязнение в летнее время открытых водоемов сточными водами, содержащими в большом количестве органические вещества, способствует не только сохранению в них возбудителя, но и его размножению и накоплению. Эндемическим очагом холерного вибриона Эль-Тор является Индонезия.

Морфологические и тинкториальные свойства. V. cholerae представляют собой прямые или изогнутые подвижные палочки. Подвижность холерного вибриона связана с наличием одного жгутика (монотрих). Жгутик снабжён чехликом и продольным выростом, напоминающим ундулирующую мембрану. Подвижность холерных вибрионов является важным диагностическим признаком.
Палочки грамотрицательные, короткие, не образуют спор и капсул. Диаметр палочек 0,5 мкм, длина 1,5-4,0 мкм. Для вибрионов характерен полиморфизм - типичные формы наблюдают в клиническом материале, в мазках из колоний доминируют палочковидные формы. Под действием пенициллина холерные вибрионы способны образовывать L-формы. Вибрионы хорошо окрашиваются анилиновыми красителями; для их окраски обычно используют водный фуксин Пфайффера и карболовый фуксин Циля.

Культуральные свойства. Холерный вибрион хорошо и быстро растет на обычных средах с высоким значением рН (7,6-8,0), хемоорганотроф, ферментирует углеводы с образованием кислоты без газа. На плотных питательных средах возбудитель холеры образует небольшие круглые дисковидные прозрачные колонии S-формы с ровными краями, голубоватые в проходящем свете, что сразу отличает их от более грубых и мутно-белых колоний энтеробактерий. Старые культуры несколько грубеют и приобретают желтовато-коричневый оттенок.
При посеве уколом в столбик желатина вибрион через 48-72 часа при 22-23°С вызывает воронкообразное разжижение.

В жидких средах вибрион вызывает помутнение и образование нежной голубоватой плёнки на поверхности, её края приподняты вдоль стенок пробирки; при встряхивании пленка легко разрушается и оседает на дно. На 1% пептонной щелочной воде (рН 8,6-9,0) холерный вибрион растёт, опережая рост бактерий кишечной группы, и через 6-8 часов образует нежную голубоватую плёнку и умеренную муть. Пептонная вода с добавлением 0,5-1% NaCl является наилучшей средой накопления для возбудителя холеры. В молоке вибрион быстро размножается, вызывая через 24-48 часов свертывание, а затем пептонизацию молока.

Холерный вибрион предпочитает аэробные условия и быстро погибает в анаэробных условиях. Вибрионы хорошо растут при температуре 18-37ОС, рН 6,0-9,6. Температурный оптимум для холерных вибрионов составляет 37°С.
Для выделения холерного вибриона используются селективные среды: щелочной МПА, щелочной агар с кровью, желточно-солевой агар. Чаще всего используют щелочной МПА, на котором холерный вибрион образует гладкие стекловидно-прозрачные с голубоватым оттенком дисковидные колонии вязкой консистенции.

Биохимические свойства. Холерный вибрион ферментирует с образованием кислоты многие углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, лактозу, гликоген, крахмал и др.). Холерные вибрионы обладают плазмокоагулирующим (свёртывают плазму кролика) и фибринолитическим (разжижают свёрнутую сыворотку по Лёффлеру) свойствами. Они свёртывают молоко и разлагают другие белки, образуют аммиак и индол, сероводород не образуют.

Антигенная структура. У холерных вибрионов выделяют термостабильные О- и термолабильные Н-антигены. Холерные и холероподобные вибрионы имеют общий Н-антиген, но различаются по О-антигенам. По структуре О-антигена выделяют 139 серогрупп вибрионов (О1 - О139). Холерный вибрион относится к группе О1. Принадлежность к ней отличает их от холероподобных и парахолерных вибрионов. Поэтому при исследовании на холеру обязательно проводят типирование О1-антисывороткой. О-антиген О1 группы холерных вибрионов неоднороден и включает А, В и С компоненты. По этим компонентам различают три серотипа V. cholerae - серотип Огава (АВ), серотип Инаба (АС) и серотип Гикошима или Хикоджима (АВС). Холерный вибрион в стадии диссоциации имеет ОR-антиген. В связи с этим для идентификации V. cholerae используют О-сыворотку, ОR-сыворотку и типоспецифические сыворотки Инаба и Огава.

По Н-антигенам вибрионы разделяются на группы А и В. В группу А входят холерные вибрионы; в группу В - вибрионы, биохимически отличные от холерных.

Фагочувствительность. Для фаготипирования V. cholerae С. Мукерджи предложил наборы бактериофагов, которые позволяют выделить среди V. cholerae 16 фаготипов. Холерный диагностический фаг ХДФ-3 избирательно лизирует холерные вибрионы классического типа, ХДФ-4 - вибрионы Эль-Тор, а ХДФ-5 лизирует вирулентные вибрионы обоих типов и не лизирует нехолерогенные вибрионы.

Резистентность. Холерный вибрион мало устойчив во внешней среде и плохо переносит инсоляцию и высушивание, но хорошо и долго сохраняется и даже размножается в открытых водоемах и сточных водах, богатых органическими веществами, имеющих щелочную рН и температуру выше 10-12°С. В стоячих водоёмах возбудитель может сохраняться до 2-3 недель, в выгребных ямах - до 3-4 месяцев. Вибрион длительно сохраняется в продуктах с щелочным рН и высокой влажностью, а также на одежде и постельном белье, загрязнённых испражнениями больных. Вибрионы биотипа Эль-Тор более устойчивы во внешней среде, что позволяет легко выделять их из воды и испражнений. Все вибрионы очень чувствительны к действию дезинфектантов, особенно с кислым значением рН.

Холерные вибрионы хорошо выживают при низкой температуре; во льду сохраняют жизнеспособность до 1 месяца; в морской воде - до 47 суток, в речной воде - от 3-5 дней до нескольких недель, в кипяченой минеральной воде сохраняются более 1 года, в почве - от 8 дней до 3 месяцев, в свежих испражнениях - до 3 суток, на вареных продуктах (рис, лапша, мясо, каши и др.) выживают 2-5 дней, на сырых овощах - 2-4 дня, на фруктах - 1-2 дня, в молоке и молочных продуктах - 5 дней; при хранении на холоде срок выживания увеличивается на 1-3 дня. Холерные вибрионы при 80°С погибают через 5 минут, при 100°С - моментально.

Факторы патогенности.

1. Подвижность и хемотаксис. С помощью этих свойств вибрион преодолевает слизистый слой и вступает во взаимодействие с эпителиальными клетками.

2. Факторы адгезии и колонизации, с помощью которых вибрион прилипает к микроворсинкам и колонизирует слизистую оболочку тонкого кишечника. Адгезию вибрионов к клеткам слизистой обусловливают пили.

3. Ферменты муциназа, протеазы, нейраминидаза, лецитиназа способствуют адгезии и колонизации, так как разрушают вещества, входящие в состав слизи. Нейраминидаза, отщепляя от гликопротеинов эпителия сиаловую кислоту, создает “посадочную” площадку для вибрионов. Кроме того, она увеличивает количество рецепторов для холерогена путем модификации три- и дисиалоганглиозидов в моносиалоганглиозид, который служит рецептором для холерогена.

4. Экзотоксин холероген - главный фактор патогенности V. cholerae. Молекула холерогена имеет молекулярную массу 84 кД и состоит из двух фрагментов - А и В. Фрагмент А состоит из двух пептидов (А1 и А2) и обладает специфическим свойством холерного токсина. Фрагмент В состоит из 5 одинаковых субъединиц и выполняет две функции: 1) распознает рецептор (моносиалоганглиозид) энтероцита и связывается с ним; 2) формирует внутримембранный гидрофобный канал для прохождения субъединицы А. Пептид А2 служит для связи фрагментов А и В. Собственно токсическую функцию выполняет пептид А1. Он взаимодействует с НАД, вызывает его гидролиз, образующаяся при этом АДФ-рибоза связывается с регуляторной субъединицей аденилатциклазы. Это ведет к угнетению гидролиза ГТФ. Возникший комплекс ГТФ+аденилатциклаза вызывает гидролиз АТФ с образованием цАМФ. Холероген вызывает нарушение вводно-солевого обмена, оказывает цитотоксическое действие, вызывает гибель эпителия тонкой кишки.

5. Фактор, повышающий проницаемость капилляров.

6. Экзотоксины типа LТ, SТ и SLT. Способность вибрионов, не относящихся к О1-группе, вызывать спорадические или групповые диарейные заболевания людей, связана с наличием у них энтеротоксинов типа LТ или SТ, стимулирующих либо аденилат-, либо гуанилатциклазные системы соответственно.

7. Эндотоксин. Липополисахарид V. cholerae обладает сильным эндотоксическим свойством. Он отвечает за общую интоксикацию организма и рвоту. Антитела, образующиеся против эндотоксина, обладают выраженным вибриоцидным действием (растворяют вибрионы в присутствии комплемента)
и являются важным компонентом постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Эндотоксин угнетает фагоцитоз, снижает кровяное давление; вызывает инфекционно-токсические явления.

Патогенез поражений. Попав в организм человека, значительная часть вибрионов погибает под действием кислой среды желудка, и лишь небольшая часть достигает тонкой кишки. Попав в просвет тонкого кишечника, холерные вибрионы за счет подвижности и хемотаксиса к слизистой оболочке направляются к слизи. Чтобы проникнуть через нее, вибрионы вырабатывают ряд ферментов (нейраминидазу, муциназу, протеазы, лецитиназу), которые разрушают вещества, содержащиеся в слизи, и облегчают продвижение вибрионов к эпителиальным клеткам. Путем адгезии вибрионы прикрепляются к гликокаликсу эпителия и, теряя подвижность, начинают интенсивно размножаться, колонизируя микроворсинки тонкого кишечника и одновременно вырабатывая большое количество экзотоксина-холерогена. Молекулы холерогена связываются с моносиалоганглиозидом Gm1 и проникают в мембрану клетки, где активируют аденилатциклазную систему, а накапливающийся цАМФ вызывает гиперсекрецию жидкости, катионов и анионов Na+, НСО3-, К+, Сl- из энтероцитов, что и приводит к холерной диарее, обезвоживанию и обессоливанию организма. В ответ на проникновение бактерий эпителиальные клетки выделяют щелочной секрет, служащий идеальной средой для размножения возбудителя.

Клинические проявления. Инкубационный период при холере варьирует от нескольких часов до 6 суток, чаще всего - 2-3 дня. Различают три типа течения болезни:

- бурное, тяжелое обезвоживающее диарейное заболевание, приводящее к смерти больного через несколько часов;

- менее тяжелое течение, или понос без обезвоживания;

- бессимптомное течение заболевания (вибриононосительство).

У большинства инфицированных лиц заболевание протекает бессимптомно, возможна лёгкая диарея. Заболевание проявляется общим недомоганием, болями в животе, рвотой и развитием выраженной диареи.

При тяжелой форме холеры у больных появляется понос, стул учащается, испражнения становятся все более обильными, принимают водянистый характер, утрачивают фекальный запах и имеют вид рисового отвара (мутная жидкость с плавающими в ней остатками слизи и клетками эпителия). Для холерной диареи характерно выделение значительного количества (до 10 л в сутки) водянистых бесцветных испражнений. В зависимости от степени интоксикации симптоматика может иметь характер гастроэнтерита или энтерита.

Затем присоединяется изнурительная рвота, сначала содержимым кишечника, а затем рвотные массы приобретают вид рисового отвара. Температура у больного падает ниже нормы, кожа становится синюшной, морщинистой и холодной.

В результате обезвоживания происходит сгущение крови, развивается цианоз, кислородное голодание, резко страдает функция почек, появляются судороги, больной теряет сознание и наступает смерть. Летальность от холеры во время седьмой пандемии варьировала от 1,5% в развитых странах до 50% в развивающихся странах.

В тяжёлых случаях у больных резко снижается объём мочи с развитием острой почечной недостаточности. Характерна охриплость голоса или афония. Ведущие патогенетические факторы - гиповолемия и выраженные нарушения электролитного баланса, вследствие чего развиваются артериальная гипотензия, сердечная недостаточность, нарушение сознания и гипотермия. Подобное состояние определяют как холерный алгид. Характерный признак обезвоживания – “гиппократово лицо” (facies hippocratica): запавшие глаза, заострённые черты лица с резко выступающими скулами. При отсутствии лечения летальность больных в алгидной стадии достигает 60%. Выздоровление сопровождается приобретением непродолжительной невосприимчивости. Нередко отмечают случаи повторного заражения.

Микробиологическая диагностика. Материал для исследований - испражнения, рвотные массы, желчь, секционный материал (фрагменты тонкой кишки и желчного пузыря), пищевые продукты и др. Материалом для исследования на вибриононосительство служат испражнения. Из объектов внешней среды чаще всего исследуют воду открытых водоемов и сточные воды. При проведении исследований необходимо соблюдать следующие правила:

- материал следует доставлять в лабораторию не позже 2 часов после забора (так как возбудитель быстро погибает, особенно в испражнениях). При невозможности срочной доставки образцы помещают в транспортные среды (1% пептонная вода с рН 8,2-8,6);

- ёмкости для материала нельзя обеззараживать химическими веществами, так как возбудитель чувствителен даже к их следовым количествам. Все образцы помещают в герметически закрываемую транспортную тару;

- как можно быстрее произвести посев материала от больного (холерный вибрион сохраняется в испражнениях короткий срок);

- исключить возможность загрязнения и заражения окружающих объектов.

Выделение культуры проводят по схеме:

- посев на пептонную воду (ПВ), одновременно - на щелочной МПА или другую избирательную среду;

- через 6 часов исследуют пленку, образующуюся на ПВ, и в случае необходимости делают пересев свежую ПВ. С ПВ делают пересев на щелочной МПА. Если на первом этапе при исследовании материала получают положительные результаты, пересев на вторую ПВ не проводят;

- подозрительные колонии (стекловидно-прозрачные) пересевают для получения чистой культуры, которую идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, подвижности и окончательно типируют с помощью диагностических агглютинирующих сывороток О, ОR, Инаба и Огава, а также с использованием холерных диагностических фагов ХДФ.

Серологическая диагностика холеры имеет вспомогательный характер. С этой целью может быть использована реакция агглютинации, иммуноферментный или иммунофлюоресцентный методы.

Постинфекционный иммунитет прочный, длительный, повторные заболевания наблюдаются редко. Иммунитет антитоксический и антимикробный.

Лечение больных холерой должно заключаться в регидратации и восстановлении нормального водно-солевого обмена. С этой целью рекомендуется использовать солевые растворы. Из антибиотиков используют препараты тетрациклинового ряда. Альтернативные антибактериальные препараты - левомицетин, ко-тримоксазол и фуразолидон.

Профилактика холеры включает организацию санитарно-гигиенических мероприятий, предупреждающих занос заболевания; проведение санитарно-просветительной работы среди населения; раннее выявление больных и носителей; массовое профилактическое назначение тетрациклинов (или других эффективных антибиотиков) в районах эпидемической опасности. Для специфической иммунопрофилактики предложены различные вакцины, в том числе из убитых штаммов Инаба и Огава; холероген-анатоксин для подкожного применения и энтеральная химическая бивалентная вакцина, состоящая из анатоксина и соматических О-антигенов серотипов Инаба и Огава, так как перекрестный иммунитет не формируется. Эффективность их использования не превышает 60-70%, невосприимчивость сохраняется в течение 3-8 месяцев, поэтому вакцинопрофилактику применяют по эпидемиологическим показаниям.