15411

Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Ортомиксовирусы. Вирус гриппа. Биологические свойства. Патогенез и клиника гриппа. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика гриппа

Конспект урока

Медицина и ветеринария

Практическое занятие 29 Тема: Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Ортомиксовирусы. Вирус гриппа. Биологические свойства. Патогенез и клиника гриппа. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика гриппа. 1. Принципы лабораторной ди...

Русский

2013-06-13

87.5 KB

74 чел.

Практическое занятие 29

Тема: Принципы и методы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Ортомиксовирусы. Вирус гриппа. Биологические свойства. Патогенез и клиника гриппа. Лабораторная диагностика. Специфическая профилактика гриппа.

1. Принципы лабораторной диагностики вирусных инфекций

Разделы диагностики вирусных инфекций.

Диагностика вирусных инфекций включает в себя следующие разделы:

1. Клинико-эпидемиологический диагноз:

- анализ эпидемической обстановки;

- клинические проявления заболевания.

2. Лабораторные методы диагностики.

К данным эпидемической обстановки относятся сведения о скорости распространения болезни, об охвате инфекцией населения, о случаях смерти, сезонности, наличии переносчиков инфекции, вакцинации людей против данной инфекции и др.

Клинические признаки болезни включают данные о температуре, пульсе, дыхании, состоянии кожных покровов и другие симптомы.

Тщательный анализ всех названных сведений позволяет поставить клинико-эпидемический диагноз, который носит только предварительный характер. Для того чтобы поставить окончательный диагноз на вирусное заболевание, необходимо провести лабораторные исследования материала, взятого от больных.

Лабораторные методы диагностики вирусных инфекций включают следующие процедуры:

- вирусоскопическое исследование препаратов;

- выделение и идентификация возбудителя;

- обнаружение антигенов вирусов в образцах исследуемого материала;

- обнаружение и определение титров противовирусных антител.

Вирусоскопическое исследование препаратов при диагностике вирусных заболеваний проводится с помощью экспресс-методов, позволяющих обнаружить в патологическом материале вирусные антигены, тельца-включения и элементарные тельца.

Для обнаружения вирусных антигенов в патологическом материале используют наиболее чувствительные методы, так как концентрация антигенов в нем обычно бывает низкой. Наиболее широко используют РИФ (реакция иммунофлуоресценции). Для этого из патологического материала готовят мазки-отпечатки или срезы, которые обрабатывают гипериммунными сыворотками, предварительно мечеными флуорохромами. Препараты просматривают с помощью люминесцентного микроскопа. У гемагглютинирующих вирусов вирусные гемагглютинины в материале обнаруживаются с помощью реакции гемагглютинации. Явление гемагглютинации - склеивание эритроцитов крови в присутствии вируса.

Тельца-включения - это внутриклеточные включения, образующиеся в клетках как результат репродукции в них некоторых вирусов. Как правило, РНК-вирусы образуют цитоплазматические включения, ДНК-вирусы - внутриядерные. Наиболее известны и имеют практическое значение тельца Бабеша-Негри, образуемые вирусом бешенства в цитоплазме нервных клеток. Обнаружение телец-включений при вирусных болезнях имеет лишь вспомогательное диагностическое значение. Крупные вирусы (элементарные тельца) в исследуемом материале обнаруживают под обычным световым микроскопом после их обработки солями тяжелых металлов (например, элементарные тельца при оспе).

Выделение и идентификация возбудителя - главное в диагностике вирусных инфекций. Для выделения вирусов используют следующие биологические системы:

- культуры клеток;

- куриные эмбрионы;

- лабораторных животных.

Культуры клеток. Для заражения культуры клеток во флаконы с монослоем вносят небольшое количество вируссодержащей суспензии. После небольшого контакта добавляют поддерживающую питательную среду и помещаются в термостат. В лабораториях используют следующие виды клеточных культур:

а) Первично-трипсинизированные культуры.

б) Полуперевиваемые линии клеток.

в) Перевиваемые линии клеток.

Признаками размножения вируса в культуре клеток является изменение морфологии клеток, их округление, гибель, фрагментация и другие изменения.

Куриные эмбрионы. Заражение куриных эмбрионов проводят следующими способами:

- на хорион-аллантоисную мембрану;

- в амниотическую полость;

- в аллантоисную полость;

- в желточный мешок.

Признаками размножения вируса в куриных эмбрионах являются их гибель и патологоанатомические изменения на оболочках и структурах эмбриона.

Лабораторные животные. Наиболее часто используют белых мышей, белых крыс, хомячков, морских свинок, кроликов, птиц и обезьян. Существует большое количество методов введения инфекционного материала лабораторным животным. Выбор метода заражения зависит от тропизма вирусов и чувствительности животного. За зараженными животными устанавливают контроль, отмечая изменение в их поведении, появление специфических признаков болезни. Признаками репродукции вирусов в организме животных являются их гибель, клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения в тканях.

Идентификация вирусов. После выделения вируса необходимо провести идентификацию, то есть определить вид выделенного вируса. Идентификацию вирусов осуществляют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических признаков, гибель и т. д.), куриных эмбрионах и культурах клеток. Под воздействием конкретных вирусов возможно изменение морфологии, роста, репродукции клеток, либо их разрушение. Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по следующим критериям:

- цитопатические эффекты;

- бляшкообразование;

- тельца включений;

- феномен гемадсорбции;

- “цветная реакция”.

Цитопатические эффекты (ЦПД - цитопатическое действие, ЦПЭ -цитопатический эффект) оценивают при микроскопии клеточных культур. ЦПД - это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в ней вируса. Оно устанавливается под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД разнообразны - от едва заметных изменений в цитоплазме до полного распада клеток на фрагменты. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита) сопровождается появлением характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Бляшкообразование. Бляшками называют негативные колонии - участки разрушенных клеток (зоны просветления) на монослое клеток, покрытом слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).

Тельца включений. Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований - скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).

Феномен гемадсорбции. Методом гемадсорбции обнаруживают вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами. Гемадсорбция - это прилипание эритроцитов к поверхности клеток, зараженных гемагглютинирующим вирусом. Для наблюдения гемадсорбции необходимо из флакона с зараженной вирусом культурой клеток удалить культуральную жидкость и добавить 2-3 капли 2,5%-ной суспензии эритроцитов. Флаконы оставляют в горизонтальном положении в течение 10 минут, затем слой клеток споласкивают физраствором, чтобы смыть эритроциты. Если в зараженной культуре клеток происходит репродукция вируса, на таких клетках под микроскопом можно видеть адсорбированные эритроциты.

“Цветная реакция”. В культуральную среду, используемую для поддержания клеток, вносят индикатор. Рост клеток сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом рН среды и изменением окраски индикатора. Заражение культур вирусом резко ингибирует клеточный метаболизм, и среда сохраняет первоначальный (красно-оранжевый) цвет. Если клетки остаются жизнеспособными, питательная среда желтеет.

Определение инфекционности вирусов. Наиболее доступная форма количественного определения - подсчет числа вирусных бляшек. Прямые тесты на инфекционность применяют для установления инфекционной дозы (ИД) или летальной дозы (ЛД) изучаемого вируса (обычно выражают в lg). ИД50 - разведение, инфицирующее 50% клеток; ЛД50 - разведение, убивающее 50% пораженных клеток или животных.

Количественную электронную микроскопию применяют для подсчета общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом объекте (например, культуральной жидкости). Однако чаще всего этот метод недоступен из-за отсутствия столь дорогого и сложного прибора.

Для выявления вирусных антигенов наиболее распространенным методом является реакция гемагглютинации. Метод основан на способности вирусов сорбироваться на поверхности эритроцитов животных и человека.

Если вирус выделен на культуре клеток, и он дает гемадсорбцию, то используют реакцию торможения гемадсорбции - РТГАд.

Если вирус обладает гемагглютинирующей активностью, наиболее целесообразно для идентификации использовать реакцию торможения гемагглютинации - РТГА.

Если выделенный вирус указанными свойствами не обладает, то его идентификацию проводят с помощью реакции диффузной преципитации в агаровом геле - РДП. Но для постановки этой реакции вирусный антиген и гипериммунная сыворотка должны быть в высоких титрах, так как РДП обладает сравнительно низкой чувствительностью.

Если РТГАд, РТГА и РДП воспользоваться не представляется возможным, то для идентификации выделенного вируса используют реакцию связывания комплемента (РСК) с разными разведениями известных сывороток и несколькими дозами комплемента. Предпочтительнее ставить эту реакцию длительно на холоде (18-20 часов при +2…-4°С).

Наиболее универсальной и дающей более достоверные результаты при идентификации выделенных вирусов является реакция нейтрализации - РН. Вместе с тем постановка РН требует длительной работы и вложения большого труда.

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления антигенов некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 минут. Для выявления антигенов на твердой фазе сорбируют известные антитела и добавляют исследуемую сыворотку, содержащую антиген. После инкубирования несвязанный антиген декантируют, систему промывают и вносят меченые антитела, специфичные к сорбированным антителам. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключенные в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

Выявление противовирусных антител в сыворотке крови. Более простой и доступный подход - выявление противовирусных антител в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 недели. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырехкратное увеличение титра антител, выявленное при исследовании второй пробы.

РТГА выявляет антитела, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные антитела в сыворотке больного.

РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций. Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов антител, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с антителами, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определенные выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления антител известный антиген сорбируют на твердом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся антитела удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных антител и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических антител, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом.

Серологические методы диагностики вирусных болезней. В вирусологии широко используют следующие серологические реакции:

- нейтрализации – РН;

- торможения гемагглютинации – РТГА;

- непрямой гемагглютинации – РНГА;

- связывания комплемента – РСК;

- диффузной преципитации – РДП;

- торможения гемадсорбции – РТГАд;

- иммунофлуоресценции - РИФ.

1. Реакция нейтрализации (РН) основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными антителами. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных антител.
Реакция нейтрализации ставится в двух модификациях:
а) с разными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой известного вируса для обнаружения и титрования неизвестных противовирусных антител;
б) с постоянным разведением известной гипериммунной сыворотки и разными дозами вируса для идентификации неизвестного выделенного вируса по индексу нейтрализации.

2. Реакция торможения гемагглютинации - РТГА. Ее принцип состоит в том, что при контакте вируса с гомологичными антителами происходит связывание антител с гемагглютининами вируса, в результате чего вирус теряет свойство агглютинировать (склеивать) эритроциты. Для этого исследуемую сыворотку в разных разведениях смешивают с одинаковыми дозами известного вируса и после контакта ко всем смесям добавляют суспензию эритроцитов, которые служат индикатором вирусных гемагглютининов. При высшем разведении исследуемой сыворотки, когда еще подавляется гемагглютинация, и определится титр антител в этой сыворотке.

3. Реакция непрямой гемагглютинации - РНГА. Ее принцип состоит в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы вирусы, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных антител, содержащихся в исследуемой сыворотке крови. РНГА позволяет обнаруживать и титровать антитела. За титр антител в сыворотке крови принимают наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию сенсибилизированных вирусом эритроцитов. РНГА можно поставить макро- и микрометодами.

4. Реакция связывания комплемента (РСК). На первом этапе в реакции участвуют антиген и антитело, а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии вирусного антигена и специфического к нему антитела образуется комплекс, и он связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы, состоящей из бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки кролика. Если комплемент связался при взаимодействии вирусного антигена и специфических к нему антител, то лизис (растворение) бараньих эритроцитов не происходит, что свидетельствует о положительной РСК. При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов, по которому судят о результатах реакций.

5. Реакция диффузной преципитации (РДП) основана на способности специфических антител сыворотки крови и специфических растворимых вирусных антигенов диффундировать в толще агарового геля навстречу друг другу, в результате чего образуется комплекс “антиген+антитело”. Этот комплекс не обладает способностью диффундировать в агар и выпадает в осадок на месте образования в виде полосы преципитации, видимой невооруженным глазом. Если же антитела и антиген не соответствуют (негомологичны) друг другу, то полосы преципитации не образуются, что свидетельствует об отрицательной РДП.

6. Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой, содержащей антитела к этому вирусу. Она позволяет идентифицировать гемагглютинирующий вирус в культуре клеток намного раньше появления отчетливых цитопатических изменений в пораженных вирусом клетках.

7. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Ее сущность состоит в обработке препаратов-отпечатков из патологического материала сывороткой крови, содержащей специфические антитела к определенному вирусу и обработанной флуорохромом (веществом, способным светиться при облучении светом). Если вирусный антиген и меченая сыворотка, содержащая специфические к данному вирусу антитела, соответствуют друг другу, то происходит образование комплекса "антиген+антитело", и он обнаруживается с помощью люминесцентного микроскопа по специфическому свечению. Наибольшее распространение получила реакция прямой иммунофлюоресценции.

8. Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами антитела, но сложность и дороговизна метода ограничивает его применение.

9. К методам, основанным на принципе использования меченых антител, относится иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Принцип метода состоит в обнаружении антигена, фиксированного на носителе, специфическими глобулинами, мечеными ферментами (пероксидаза хрена, кислая или щелочная фосфатаза). Фермент проявляют различными субстратами, дающими с ним характерное окрашивание, которое определяют фотометрическим методом.

10. Радиоиммунный метод основан на использовании меченого радиоактивным йодом антигена. Антиген, соединяясь с антителом, образует меченый иммунный комплекс антиген-антитело. Результат определяют на счетчике.

11. Метод иммуноэлектрофореза основан на способности антигенов и антител диффундировать в геле под действием электрического поля.

12. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счет интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на нее), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в нее вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым антителам.

2. Ортомиксовирусы

Семейство Orthomyxoviridae (от греч. orthos - правильный, прямой и myxa - слизь) объединяет группу вирусов, которые имеют особое сродство к мукополисахаридам и гликопротеидам клеточных рецепторов, а также сходные биологические свойства (способность агглютинировать эритроциты, тропизм к органам дыхания, легкость культивирования в куриных эмбрионах, наличие гемагглютинина, а у некоторых вирусов – также и нейраминидазы).

Классификация. Согласно международной таксономии вирусов, семейство Orthomyxoviridae включает четыре рода: Influenzavirus А, Influenzavirus В, Influenzavirus С и Togotovirus.

Род Influenzavirus А включает один вид - вирус гриппа А. Этот вирус открыли В. Смит, С. Эндрюс и П. Лейдлоу в 1933 г. Внутри этого вида различают субтипы вируса по гемагглютинину и нейраминидазе. Внутри субтипов могут быть сероварианты. Номенклатура вновь выделенных изолятов вируса гриппа А складывается из следующих критериев: род/хозяин/место выделения/обозначение штамма/год выделения/формула (тип гемагглютинина Н и нейраминидазы N), например, А/крачка/ Южная Африка/1/61/(Н5N3).

Род Influenzavirus В включает один вид - вирус гриппа В, который выделили Т. Фрэнсис и Р. Меджилл в 1940 г. У него в отличие от вируса гриппа А не установлены антигенные субтипы. Вирусы гриппа В обозначаются по следующим критериям: род/место выделения/обозначение штамма/год выделения.

Род Influenzavirus С также включает один вид - вирус гриппа С, который открыл Р. Тэйлор в 1947 г. Данный вид инфицирует только людей. Антигенных субтипов у вируса гриппа С не отмечено. Чаще всего вирусы гриппа С вызывают инфекцию у детей в виде отдельных спорадических вспышек.

Род Togotovirus включает 2 вида, из которых вирус Togoto является прототипным. Тоготовирусы передаются между позвоночными через клещей.

Морфология вирионов. Геном ортомиксовирусов представлен односпиральной линейной фрагментированной молекулой минус-РНК. Количество фрагментов в геноме различных представителей ортомиксовирусов разное. Так, вирусы гриппа А и В имеют 8 фрагментов, вирусы гриппа С – 7 фрагментов; тоготовирусы - 6 фрагментов. Каждый фрагмент в отдельности и все фрагменты в совокупности покрыты белковой оболочкой, образуя нуклеокапсид. Снаружи вирион ортомиксовирусов покрыт суперкапсидной оболочкой, имеющей шипы, образованные гемагглютинином и нейраминидазой. Между нуклеокапсидом и суперкапсидом располагается матриксный белок М. Нуклеокапсид с М-белком в совокупности составляют сердцевину вириона.

Устойчивость. Ортомиксовирусы слабо устойчивы во внешней среде. Под действием ультрафиолетового света они погибают в течение 5 минут. В 70%-ном этиловом спирте вирусы гибнут через 5 минут, в 3%-ном феноле, 1%-ной настойке йода, 1%-ной сулеме, 1%-ном купоросе – через 3 минуты.

3. Вирус гриппа

Морфология. Вирионы вируса гриппа являются “одетыми”, сферической формы, полиморфные, размером 80-120 нм, содержат 32 капсомера. Снаружи они имеют липопротеиновую оболочку, которая образует выступы (шипы). Вирионы ортомиксовирусов состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки (суперкапсида), которая имеет выступы, образованные из гемагглютинина и нейраминидазы. Между нуклеокапсидом и суперкапсидом располагается М-белок.

Геном вирионов вируса гриппа образован однонитевой спиральной молекулой минус-РНК. Геном состоит из отдельных фрагментов (у вирусов гриппа А и В – 8 фрагментов, у вируса гриппа С – 7 фрагментов). Каждый фрагмент вирусной РНК покрыт отдельным белком. РНК упакована в комплексе с белками в виде спирали, составляя cor или нуклеокапсид. На поверхности вирионов имеется множество мелких шипов, построенных из гликопротеинов с гемагглютинирующей или нейраминидазной активностью.

Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии. Сердцевина окружена мембраной, состоящей из белка М, который соединяет рибонуклеопротеин с двойным липидным слоем внешней оболочки (суперкапсидом) и шиповидными отростками гемагглютинина и нейраминидазы.

Суперкапсид образован липидным бислоем, который пронизывают гликопротеиновые шипы (спикулы), определяющие гемагглютинирующую (Н) или нейраминидазную (N) активность. В вирионе обнаружено 7 структурных белков, из которых 3 белка являются наружными и 4 белка - внутренние. К наружным структурным протеинам относятся гемагглютинин (Н), нейраминидаза (N) и белок М. Гемагглютинин и нейраминидаза входят в состав суперкапсида. Они заякорены гидрофобными концами в липидном бислое суперкапсида и структурно оформлены в виде шипов, выступающих на поверхности вириона. Внутри вириона гемагглютинин и нейраминидаза контактируют с М-белком, а через него - с сердцевиной.

Гемагглютинин и нейраминидаза являются гликопротеинами и входят в состав липопротеиновой оболочки вириона (суперкапсида). Гемагглютинин изменчив (у вирусов гриппа А человека и животных выявлено 16 антигенных типов или вариантов гемагглютинина – от Н1 до Н16). Антитела к нему обеспечивают защитный эффект.

Функции гемагглютинина:

- прикрепительная (связывается с сиаловой кислотой рецепторов поверхности эпителиальных клеток);

- участие в слиянии (содержит пептид слияния) оболочки вириона с мембранами клетки и гемагглютинации, агрегируя (склеивая) эритроциты;

- протективные свойства, способствующие развитию иммунитета (вируснейтрализующие антитела).

Нейраминидаза распознает и взаимодействует с рецепторами клетки, содержащими N-ацетилнейраминовую кислоту, то есть приводит к проникновению вируса внутрь клетки, а также, отщепляя нейраминовую кислоту от дочерних вирионов и клеточной мембраны, к выходу вирусов из клеток и распространению вирионов. Нейраминидаза изменчива – у вируса гриппа А человека и животных выявлено 9 вариантов нейраминидазы (от N1 до N9). У вируса гриппа типа С нейраминидаза отсутствует; ее заменяет ацетилэстераза, отрезающая ацетильные группы гликопротеинов. Нейраминидаза образует отдельные шипы, которых меньше, чем количество шипов гемагглютинина. Нейраминидаза отделяет вирионы от сиалированных муцинов, покрывающих слизистую оболочку, способствуя продвижению вируса к поверхности эпителиальных клеток. При завершении репликативного цикла она помогает отделению созревших вирионов от эпителиоцитов.

Протеин М (матриксный белок) выстилает липопротеиновую оболочку изнутри вирусной частицы. Он представлен белками М1 и М2. Матриксный белок М1 и мембранный белок М2 окружают нуклеокапсид и защищают геном. При этом М1-белок взаимодействует с нуклеокапсидом и оболочкой, а М2-белок формирует мембранный канал.

Три внутренних структурных протеина (РВ1, РВ2, РА) формируют нуклеокапсид, а также участвуют в транскрипции и репликации вируса. Так, белки Р1 или РВ1 являются транскриптазой, Р2 или РВ2 – эндонуклеазой, Р3 или РА – репликазой. Четвертый внутренний белок () связан с наружным фрагментом РНК и выполняет регуляторные и структурные функции.

Кроме структурных белков для вируса гриппа характерны неструктурные белки NS1и NS2, существующие только в инфицированной клетке.

Репродукция вируса гриппа состоит из следующих этапов:

1. Адсорбция и проникновение вируса внутрь клетки. Вирус адсорбируется на клетках за счет взаимодействия гемагглютинина с сиаловой кислотой рецепторов клеточных мембран и проникает внутрь.

2. Депротеинизация капсида и его проникновение в ядро клетки. В цитоплазме клетки нуклеокапсид освобождается от суперкапсида и выходит в цитоплазму. Отсюда вместе с М-белком он транспортируется в ядро, где уже через несколько минут после заражения появляются первые РНК-транскрипты.

3. Образование полных и неполных плюс-нитей РНК. В ядре клетки происходит трансформация геномной минус-нити РНК с помощью вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы в неполные и полные плюс-нити. Неполные плюс-нити являются иРНК для синтеза вирусных белков, а полные плюс-нити служат матрицей для синтеза геномных минус-нитей РНК.

4. Трансляция вирусных белков. После выхода молекул мРНК из ядра в цитоплазму клетки происходит трансляция вирусных белков (NP, РВ1, РВ2, РА и М) на полирибосомах. Белки NP, РВ1, РВ2 и РА после синтеза из цитоплазмы возвращаются в ядро, где связываются с вновь синтезированной вирусной РНК, а затем в виде нуклеокапсида возвращаются в цитозоль. Матриксный белок М после синтеза в цитоплазме движется к внутренней поверхности клеточной мембраны, вытесняя из нее в этом участке клеточные белки. Белки N и H синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, подвергаются гликозилированию и транспортируются на внешнюю поверхность клеточной мембраны, встраиваясь напротив белка М и образуя шипы. Белок Н при этом подвергается разрезанию на субъединицы НА1 и НА2.

5. Формирование потомства вирионов. На границе ядерной мембраны белки капсида и РНК потомства формируют нуклеокапсиды, которые мигрируют в цитоплазму для дальнейшего созревания. В модифицированных М-белком участках клеточной мембраны нуклеокапсиды окончательно созревают и выходят из клеток путем почкования.

6. Выход вирионов из клетки происходит почкованием. При этом сформированный нуклеокапсид, проходя через мембрану клетки, окружается белком М и измененной мембраной клетки, содержащей гемагглютинин и нейраминидазу.

Грипп. Слово “грипп” заимствовано из французского языка и в понятии “эпидемический (заразный) насморк” используется в России с начала XIX в. Значительно раньше болезнь называли “инфлюэнцей”. Термин “инфлюэнца” принят во многих странах, но у нас утвердилось понятие “грипп”, отражающее клинико-эпидемиологическую сущность болезни: острое начало, быстрое развитие и распространение среди людей (фр. grippe - хватать, схватывать). Первая из наиболее полно описанных эпидемий гриппа относится к 1510 г. В 1918 г. случилась необычная по масштабам и последствиям пандемия (глобальная эпидемия) гриппа. Как и большинство крупных вспышек, она возникла в Юго-Восточной Азии (Китае), но по случайному стечению обстоятельств зафиксирована в истории как “испанский грипп”, или просто “испанка”. В течение 2-3 лет от испанки погибло более 20 млн. человек. Последующие эпидемии гриппа, хотя и перерастали неоднократно в пандемии, не приносили столько жертв.

Современная история гриппа началась в 1933 г., когда был выделен его возбудитель – вирус гриппа типа А. Это удалось сделать В. Смиту и его коллегам при заражении африканских хорьков ультрафильтратом смыва из зева больного гриппом (им был В. Смит - один из авторов открытия). Заболевание, которое последовало у зараженных животных, очень напоминало грипп человека. В 1940 г. был изолирован вирус гриппа типа В, а в 1947 г. – вирус гриппа типа С.

Экология. Кроме человека в естественных условиях вирусы гриппа инфицируют млекопитающих и птиц. Так, в последние годы зарегистрированы случаи заражения людей штаммами вируса гриппа А, циркулирующими среди птиц. Реальная тревога возникла в 1997 г. в Гонконге, когда 18 человек напрямую заразились от домашних птиц вирусом Н5N1; 6 человек погибло. В 2003 г. высоковирулентные штаммы птиц Н5N1 и Н7N7 спровоцировали фатальные случаи гриппа среди жителей Южной Азии. Вирусы типов В и С поражают людей и в естественных условиях не инфицируют других хозяев.

Патогенез. Вирусы гриппа проникают в респираторный тракт с каплями аэрозоля и частицами пыли. Чем мельче их величина, тем глубже проникает вирус; самые мелкие частицы достигают бронхиол и альвеол. Главным местом размножения вируса служат реснитчатые и бокаловидные клетки слизистой оболочки верхних дыхательных путей, но инфекция может охватить весь респираторный тракт - от носовых ходов до терминальных бронхиол и альвеол. Повреждение зараженных эпителиоцитов приводит к выходу вируса в кровь. Находясь в крови, вирус гриппа не оказывает патологического воздействия из-за отсутствия сывороточных и тканевых протеаз, способных активировать вирусный гемагглютинин.

В зонах выраженного повреждения эпителия могут развиваться осложнения, вызванные присоединением бактериальной инфекции.

Освобождение от вируса начинается после повреждения слизистой оболочки. Продукты распада эпителиоцитов и медиаторы воспаления стимулируют продукцию слизи, а уцелевшие клетки мерцательного эпителия и кашлевые толчки проталкивают ее вверх вместе с основной массой вируса. Этот простой, но надежный механизм в сочетании с ринореей предупреждает распространение инфекции по респираторному тракту, способствуя выздоровлению.

Вирус гриппа А.

Эпидемиология. Источник инфекции - только больной человек. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Инкубационный период очень короткий, возникшая эпидемия распространяется очень быстро и при отсутствии коллективного иммунитета может перерасти в пандемию.

Особенности патогенеза и клиники. Инкубационный период при гриппе короткий - 1-2 суток. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки дыхательных путей с преимущественной локализацией в области трахеи, что клинически проявляется в виде сухого мучительного кашля с болями по ходу трахеи. Продукты распада пораженных клеток попадают в кровь, вызывают сильную интоксикацию и повышение температуры тела до 38-39°С. Вирус гриппа оказывает угнетающее действие на кроветворение и иммунную систему. Все это может приводить к вторичным вирусным и бактериальным инфекциям, которые осложняют течение болезни.

Постинфекционный иммунитет. Главная роль в формировании приобретенного иммунитета принадлежит вируснейтрализующим антителам, блокирующим гемагглютинин и нейраминидазу, а также секреторным иммуноглобулинам IgAs. Перенесенное заболевание оставляет за собой антитела, которые сохраняются долгие годы. Связанный с этими антителами иммунитет имеет штаммовую направленность и не гарантирует защиты от заражения новыми вариантами вируса.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования служит отделяемое носоглотки, которое получают либо путем смыва, либо с помощью ватно-марлевых тампонов, и кровь. Для диагностики гриппа применяют следующие методы:

1. Вирусологический - заражение куриных эмбрионов, культур клеток почек зеленых мартышек (Vero) и собак (МDСК). Культуры клеток особенно эффективны для выделения вирусов А (Н3N2) и В.

2. Серологический - выявление специфических антител и определение возрастания их титра (в парных сыворотках) с помощью РТГА, РСК, иммуноферментного метода.

3. В качестве ускоренной диагностики используют иммунофлуоресцентный метод, позволяющий быстро обнаружить вирусный антиген в мазках-отпечатках со слизистой оболочки носа или в смывах из носоглотки больных.

4. Разработаны методы иммуноферментного анализа для выявления вирусных антигенов непосредственно в материале от больных, а также метод РНК-зонда.

5. Предложена иммуноферментная методика “бескровного” обнаружения специфических секреторных IgAs в слюне в качестве самостоятельного способа диагностики гриппа.

Вирус гриппа В.

Структура вириона сходна со структурой вируса гриппа типа А. Геном состоит из 8 фрагментов, кодирующих 3 неструктурных и 7 структурных белков. По антигенным свойствам гемагглютинина и нейраминидазы различают несколько серовариантов. Процесс антигенного дрейфа выражен слабее, чем у вируса типа А. Вирусы гриппа типа В вызывают локальные вспышки и эпидемии; пандемий не вызывают. Клиника заболевания такая же, как и при гриппе типа А. Лабораторная диагностика такая же, вирус дифференцируется серологически. Специфическая профилактика осуществляется так же, как против гриппа А.

Вирус гриппа С.

Вирион типа С имеет такую же форму, как вирусы типов А и В. Однако он отличается от них не только антигенными свойствами, но и рядом других признаков. Геном представлен однонитевой негативной РНК из 7 фрагментов, нуклеотидная последовательность которых существенно отличается от таковых вирусов типов А и В. Геном кодирует 1-2 неструктурных и 6 структурных белков. У вируса типа С отсутствует нейраминидаза, поэтому на наружной мембране вириона имеется только один тип шипов.

Вирусу типа С не свойственна такая изменчивость, как вирусу типа А. Хотя вирус гриппа С не вызывает пандемий и больших эпидемий, он часто является причиной спорадических заболеваний гриппом. Клиника заболевания такая же, как при относительно умеренных формах гриппа А. Диагностика основана на выделении вируса в куриных эмбрионах; применяются также иммунофлуоресцентный метод и другие серологические реакции.

Лечение гриппа у людей проводится с использованием амантадина, ремантадина, противогриппозного иммуноглобулина, интерферона.

Специфическая профилактика заключается в применении вакцин:

- живая из аттенуированного вируса;

- убитая вакцина цельновирионная;

- субвирионная вакцина (из расщепленных вирионов);

- субъединичная вакцина (вакцина, содержащая только гемагглютинин и нейраминидазу).

Полимер-субъединичная вакцина “Гриппол” представляет собой конъюгат поверхностных белков вирусов гриппа А и В, который связан с сополимером полиоксидионием (иммуностимулятор).


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

79042. Философия познания И.Канта и ее значение для развития науки XVIII - XIX веках 36.5 KB
  Философия познания И. В рамках этого течения была переосмыслена и заново сформулирована проблема отношения субъекта и объекта разработан диалектический метод познания и преобразования действительности. Основной период критический ознаменовался созданием трех главных произведений: Критика чистого разума 1781 Кри тика практического разума 1788 и Критика способности суждения 1790 В свете философии науки и техники наибольший интерес представляет первое из этих произведений поскольку именно в нем исследуется процесс...
79043. Система и метод Г.Гегеля и их значение для развития науки XIX века 56.5 KB
  Его диалектический метод ГЕГЕЛЬ Hegel Георг Вильгельм Фридрих 17701831 немецкий философ создавший на объективно-идеалистической основе систематическую теорию диалектики. Что Гегель понимал под свободой Свобода–это осознанная необходимость. Хотя Гегель и утверждает что спекулятивный метод и его правила дедуцируются самим движением мысли а не предпосылаются его системе но на деле подобная дедукция возможна только в сфере спекулятивного мышления приемы которого должны быть известны заранее. Гегель считает что разум должен не...
79045. Неклассическая и постнеклассическая наука в XX веке 37.5 KB
  Если задача классической и неклассической науки состояла в постижении определенного фрагмента действительности и выявлении специфики предмета исследования то содержание пост-неклассической науки определяется комплексными исследовательскими программами. Гуманитарные и естественные науки больше не представляются разделенными непреодолимой пропастью.
79046. Становление Российской науки (XVIII - первая половина XIX в.) и русская философия 46 KB
  Основные этапы становления отечественной науки ее выдающиеся представители: Создание Петербургской Академии наук в России XVIII событие революционного характера ознаменовавшее перелом в хозяйственно-экономическом научном и культурном развитии страны совершившей решительный скачок от зачаточного состояния науки до ее передового для той эпохи уровня. Именно Лейбниц развернул перед русским царем грандиозную перспективу превращения России в просвещенное государство. Лейбница с Петром проходила идея создания в России Ученой коллегии ...
79047. Российская наука в конце XIX в. и XX веках 44.5 KB
  Главный научный руководитель атомной проблемы в СССР один из основоположников использования ядерной энергии в мирных целях. Академик АН СССР 1943. Андрей Дмитриевич Сахаров 21 мая 1921 14 декабря 1989 советский физик академик АН СССР и политический деятель диссидент и правозащитник один из создателей советской водородной бомбы.
79048. Особенности профессионального труда в науке. 35.5 KB
  Для того чтобы удовлетворить этим требованиям он должен: хорошо знать все то что сделано и делается в его области науки; публикуя результаты своих исследований четко указывать на какие исследования предшественников и коллег он опирался и именно на этом фоне показывать то новое что открыто и разработано им самим. Одной из острых тем обсуждаемых в дискуссиях по вопросам социальной ответственности является свобода научных исследований. Результаты и приложения фундаментальных исследований очень часто непредсказуемы. Но можно сказать что...
79050. Наука как познавательная деятельность 24.5 KB
  Особенности науки и ее взаимосвязи с другими способами познавательной деятельности и культуры находят свое выражение в 3х основных аспектах ее существования и функционирования. Как и другие способы познания наука возникает из практической деятельности людей. Основными системообразующими факторами способствующими превращению науки в важнейший и определяющий способ познавательной деятельности являются: ориентация на объективный характер закономерностей изучаемых предметов и открывает возможность опережающего изучения объектов неохваченных...