15423

Непрямые серологические реакции. Реакция связывания комплемента (РСК). Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН)

Конспект урока

Медицина и ветеринария

ЗАНЯТИЕ 14 Тема занятия: Непрямые серологические реакции. Реакция связывания комплемента РСК. Реакция непрямой гемагглютинации РНГА. Реакция нейтрализации токсина антитоксином РН. Учебная цель занятия: Продолжение знакомства с основами

Русский

2013-06-13

36.5 KB

24 чел.

ЗАНЯТИЕ 14

Тема занятия: Непрямые серологические реакции. Реакция связывания комплемента (РСК). Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Реакция нейтрализации токсина антитоксином (РН).

Учебная цель занятия:   Продолжение знакомства с основами серодиагностики инфекционных заболеваний, антителами, строением имуноглобулинов, взаимодействием антигена с антителом in vitro, с механизмами непрямых серологических реакций – реакцией непрямой гемагглютинации, реакцией связывания комплемента, реакцией нейтрализации токсина антитоксической сывороткой (РНГА, РСК, РН).

Задачи занятия:  Освоить методику постановки реакции непрямой гемагглютинации, реакции связывания комплемента.

Антитела

Антителами называются белковые молекулы, способные к специфическому связыванию с антигенными детерминантами. Антитела относятся к гамма-глобулинам. Другое название антител – иммуноглобулины.

У млекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Строение иммуноглобулинов.

Наиболее «типичное» строение имеют IgG. Молекула состоит из 4 белковых цепей: двух легких (L) и двух тяжелых (H), которые соединены между собой дисульфидными связями. Центр связывания с антигенной детерминантой называется активным центром антитела. Он образован N-концевыми участками тяжелой и легкой цепей. Участок тяжелых цепей, расположенный вблизи  дисульфидных связей, называется шарнирной областью. С помощью фермента папаина удалось расщепить молекулу  IgG выше шарнирной области. В результате образовывалось  3 фрагмента: 2 из них содержали легкую цепь и часть тяжелой цепи, а также активный центр антитела (Fab-фрагменты); третий фрагмент состоял только из тяжелой цепи (Fc-фрагмент).  Таким образом, было показано, что молекула IgG имеет два активных центра, т.е. является двухвалентной (может связывать 2 молекулы антигена). Благодаря подвижной шарнирной области Fab-фрагменты могут изменять взаимное расположение в пространстве.

Аминокислотные последовательности  легких и тяжелых цепей делятся на константный (постоянный) и вариабельный участки. Вариабельные участки находятся на N-концах легких и тяжелых цепей (VL и VH). Константные участки последовательности находятся на С-концах цепей (СL и СH). В легких и тяжелых цепях аминокислотные последовательности образуют несколько глобулярных структур, которые называются доменами.

Активный центр антитела образуется вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей и представляет собой полость (паратоп), имеющую определенную конфигурацию и  распределение электрических зарядов на своей поверхности. Размер, форма и распределение зарядов в активном центре определяет его специфичность, т.е. способность связываться с определенной антигенной детерминантой (эпитопом), имеющей комплементарную структуру.

Антигенные детерминанты представляют собой участки, выступающие на поверхности молекул антигенов. Поэтому взаимодействие эпитоп-паратоп происходит по принципу «ключ-замок».

Прочность связи активного центра антител с антигенной детерминантой характеризуется понятием аффинность. Аффинность – это мера сродства активного центра и антигенной детерминанты.

На долю иммуноглобулинов класса IgG приходится 75% от общего количества сывороточных имуноглобулинов. Важным свойством IgG является их способность проходить через плаценту. Таким образом, материнские антитела попадают в организм ребенка и защищают его в первые месяцы жизни от инфекции (естественный пассивный иммунитет).

К классу IgM относится около 10% общего пула иммуноглобулинов. Молекула IgM представляет собой пентамер, т.е. состоит из 5 одинаковых молекул, сходных по своему строению с молекулой IgG, имеет 10 активных центров. Субъединицы соединены между собой дисульфидными связями.  В молекуле IgM имеется дополнительная J-цепь, которая связывает субъединицы.  Антитела класса IgM не проходят через плацентарный барьер.

Антитела класса IgА составляют 15-20% от общего содержания иммуноглобулинов. Молекула IgА состоит из 2-х легких и 2-х тяжелых цепей, имеет 2 активных центра. В сыворотке крови IgА присутствуют в мономерной форме, тогда как в секретах слизистых оболочек  IgА представлены в виде димеров и называются секреторными  или sIgА, имеют 4 активных центра. С-концы тяжелых цепей  в молекуле sIgА соединены между собой  J-цепью и белковой молекулой, которая называется секреторный компонент. Секреторный компонент защищает sIgА от расщепления и инактивации протеолитическими ферментами, которые содержатся в большом количестве в секрете слизистых оболочек. Основная функция sIgА – защита слизистых оболочек от инфекции. IgА не проникают через плацентарный барьер. Высокая концентрация sIgА обнаруживается в женском грудном молоке, особенно в первые дни лактации. Они защищают желудочно-кишечный тракт новорожденного от инфекции.

IgD – в основном находятся на мембране В-лимфоцитов. Имеют строение, подобное IgG, 2 активных центра. Биологическая роль до конца не известна.

IgЕ – концентрация этого класса иммуноглобулинов в сыворотке крови чрезвычайно низкая. Молекулы IgЕ в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов. По своему строению IgЕ сходен с IgG, имеет 2 активных центра. Предполагается, что IgЕ имеет существенное значение в развитии антигельминтозного иммунитета. IgЕ играет главную роль в патогенезе некоторых аллергических заболеваний (бронхиальная астма, сенная лихорадка) и анафилактического шока.

Эффекторные функции антител

Кроме специфического связывания антигена антитела выполняют другие – эффекторные функции: связывание с клеточной мембраной и активацию комплемента.

На мембране клеток, участвующих в иммунном ответе присутствуют рецепторы, способные связывать С-концевые участки антител различных классов. Молекулы IgG и IgА способны фиксироваться на моноцитах, макрофагах и нейтрофилах. Иммуноглобулины класса IgE связываются с рецепторами мембран тучных клеток и базофилов. Реакция АГ с антителом, фиксированным на поверхности клеток называется клеточно-опосредованной.

Активация комплемента. На тяжелых цепях молекул IgG и IgМ имеются рецепторы для фракции С1 комплемента. Однако они становятся доступными только после взаимодействия антитела с антигеном (после образования иммунного комплекса). Комплекс АГ+АТ называется малым иммунным комплексом, который активирует систему комплемента по классическому пути (С1-С4-С2-С3-С5---С9), в результате чего образуется большой иммунный комплекс – АГ+АТ+Комплемент. Активировать комплемент способны иммунные комплексы с участием только иммуноглобулинов классов IgG и IgМ. Большие иммунные комплексы, в отличие от малых, распознаются и поглощаются макрофагами. В результате этого происходит удаление антигенов из кровеносного русла.

Самостоятельная работа:

  •  Осуществить постановку РНГА микрометодом капельным способом, учесть результат.
  •  Осуществить постановку РСК, учесть результат.
  •  Рассмотреть методику постановки реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой.

Методические указания к выполнению самостоятельной работы:

  •  Реакция непрямой гемагглютинации.
    Компоненты реакции. Для постановки РНГА необходимы:
    •  фосфатный буферный раствор (рН 7,2);
    •  сыворотка крови больного сыпным тифом (разведение 1:25);
    •  сыпнотифозный эритроцитарный диагностикум (эритроциты, нагруженные антигеном  риккетсий Провачека);
    •  промывной раствор.

 Постановка РНГА. В семь лунок планшета для иммунологических исследований внести по две капли фосфатного буферного раствора. В первую лунку   прибавить две капли сыворотки крови больного сыпным тифом, после чего из первой лунки перенести 2 капли во вторую лунку, из второй – в третью и т.д. Из шестой лунки 2 капли удалить.  Во все семь лунок (6 опытных и 1 контрольную) прибавить по 2 капли  эритроцитарного диагностикума. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе.    Планшеты оставить при комнатной температуре на 45 минут, после чего учесть результаты.

  •  Реакция связывания комплемента.
    Компоненты реакции. Для постановки РСК необходимы:
    •  сыворотка крови здорового донора;
    •  сыворотка крови больного гонореей (в разведении 1:5);
    •  лизат гонококков (антигенный компонент реакции - инактивированный возбудитель гонореи);
    •  комплемент  в разведении, соответствующем рабочей дозе. Комплемент получают из сыворотки крови морской свинки. Титром комплемента является его минимальная доза, которая в присутствии гемолитической сыворотки вызывает полный гемолиз эритроцитов. Рабочая доза комплемента, используемая при постановке РСК, на 30% больше его титра.
    •  гемолитическая система. Гемолитическая система представляет собой взвесь эритроцитов барана, обработанных кроличьими антителами к эритроцитам барана.
    •  промывочный раствор.

Постановка РСК. РСК ставят в двух пробирках – опытной и контрольной. В опытную пробирку внести 0,5 мл сыворотки крови больного гонореей, в контрольную внести 0,5 мл сыворотки крови здорового донора, в обе пробирки внести по 0,5 мл лизата гонококков, а также по 0,5 мл комплемента. После каждой операции необходимо промывать пипетку в промывочном растворе. Пробирки поместить в термостат при температуре  37 °С на 30 минут. После инкубации в обе пробирки внести по 1,0 мл гемолитической системы. Пробирки встряхнуть и поместить в термостат при температуре  37 °С на 30 минут. При положительной реакции в опытной пробирке отмечают задержку гемолиза (жидкость бесцветная и осадок эритроцитов), в контрольной пробирке – гемолиз эритроцитов.

  •  Принцип реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой.

Реакция нейтрализации (РН) используется для определения в исследуемом материале наличия бактериальных токсинов или вирусов. Индикаторной системой служат биологические объекты. Постановка РН осуществляется в 2 этапа (первый этап – in vitro, второй этап - in vivo):

  •  Смешивание исследуемого материала с антитоксической (противовирусной) сывороткой, инкубация в течение часа;
    •  Введение смеси материал+сыворотка в организм лабораторных животных либо заражение клеточных культур (опытная группа).

Одновременно исследуемый материал (без антисыворотки) вводят контрольной группе животных (клеточных культур).
Учет результатов РН проводят после гибели животных (клеточных культур) контрольной группы. Если при этом в опытной группе животные (клеточные культуры) не погибают, реакцию считают положительной: антитела в этом случае нейтрализуют биологическое действие токсина (вируса).


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

71891. Методы отбора инновационных проектов 16.63 KB
  Инновационные проекты представленные инвесторам должны быть сопоставимы по: 1 качественным параметрам инноваций; 2 фактору времени; 3 уровню цен тарифов маркетинговой проработке условиям оплаты труда.
71892. Виды эффекта от использования инноваций 15.17 KB
  Экономическая ценность инноваций определяется ростом прибыльности расширением масштабов бизнеса и возможностей накопления для последующего реинвестирования капитала. Оценивая результаты инноваций можно использовать систему взаимосвязанных эффектов: научно-технический эффект...
71893. Французский классический пейзаж XVII века Н. Пуссен, К. Лоррен 16.1 KB
  В ученические годы 1612-1623 уже проявился определенный интерес Пуссена к античному искусству и искусству Возрождения. Римская античность Рафаэль живопись болонцев вот наиболее сильные впечатления Пуссена.
71894. Общая экономическая эффективность инноваций - система показателей 15.53 KB
  Интегральный эффект чистый дисконтированный доход чистая приведенная или чистая современная стоимость чистый приведенный эффект Эинт представляет собой величину разностей результатов и инновационных затрат за расчетный период приведенных к одному моменту времени то есть с учетом дисконтирования...
71895. Виды конкурентных преимуществ 16.14 KB
  Конкурентные преимущества на основе инновационных ресурсов уникальные свойства хозяйствующего субъекта определяющие его превосходства над конкурентами и основанный на эффективном использовании ресурсов инновационного процесса.
71896. Формирование конкурентных преимуществ 15.74 KB
  Разработка стратегии формирования конкурентных преимуществ должна быть экономически технологически и социально обоснованной. Максимальное наращивание конкурентных преимуществ возможно в некой идеальной модели при соблюдении следующих условий. Жизненный цикл конкурентного преимущества.
71898. Французский классицизм. Н. Пуссен 12.6 KB
  Пуссен Никола (Poussin Nicolas) (1594-1665), французский живописец и рисовальщик. Учился у К.Варена и других французских художников; с 1624 Пуссен жил в Риме (в 1640-1642 - в Париже), испытал влияние Карраччи, Доменикино, Рафаэля, Тициана, Микеланджело...
71899. Инновационная продукция 15.1 KB
  Результаты инновационной деятельности в виде инновационной продукции которая может иметь конкретную вещественную форму или быть в неовеществленной форме например ноу-хау. В России законодательная охрана интеллектуальной собственности гарантирована Конституцией Российской...