15427

Бактериоскопический метод. Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Методы выявления капсул, жгутиков, спор. Изучение микробов в живом состоянии

Конспект урока

Медицина и ветеринария

ЗАНЯТИЕ 2 ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Бактериоскопический метод. Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Методы выявления капсул жгутиков спор. Изучение микробов в живом состоянии. УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Продолжить изучение бактериос

Русский

2013-06-13

57 KB

254 чел.

ЗАНЯТИЕ 2

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Бактериоскопический метод. Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Методы выявления капсул, жгутиков, спор. Изучение микробов в живом состоянии.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Продолжить изучение бактериоскопического метода. Ознакомиться с простыми и сложными методами окраски бактерий. Освоить окраску по Граму. Изучить структуру бактериальной клетки. Освоить методы выявления капсул, жгутиков, спор микробов. Освоить методы изучения микробов в живом состоянии. Ознакомиться с бактериоскопическим методом исследования, методами окраски бактерий, а также изучения микробов в живом состоянии. Изучить строение бактериальной клетки и методы выявления спор, жгутиков, капсулы.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Познакомиться с простыми и сложными методами окраски бактерий. Освоить метод окраски по Граму.

2. Изучить структуру бактериальной клетки.

3. Изучить методы выявления капсул, жгутиков, спор микробов.

4. Освоить методы микроскопии микробов в живом состоянии.

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Бактериоскопический метод. Простые и сложные методы окраски. Окраска по Граму. Структура бактериальной клетки. Методы выявления капсул, жгутиков, спор. Изучение микробов в живом состоянии.

Простые и сложные методы окраски микробов

Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.

Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.

При окраске по методу Грама в модификации Синева на первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают. На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя. Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.

Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:

1. Грамположительные бактерии:

- кокки (за исключением гонококков и менингококков);

- бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);

- микобактерии, коринебактерии и листерии.

2. Грамотрицательные бактерии:

- некоторые кокки (гонококки и менингококки);

- все остальные палочковидные бактерии;

- все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Структура бактериальной клетки

 

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

- основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

- временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:

- защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

- определение формы бактерий;

- участие в метаболизме бактерий;

- токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);

- наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).

В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный  линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%. Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.

Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма) представлен пептидогликаном в виде тонкой непрерывной сетки. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана) состоит из липополисахарида, белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм. Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают   токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами. У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты - это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они  образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий - это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) - это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое количество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

- барьерная функция (молекулярное “сито”);

- избирательный перенос различных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

- превращение клеточной энергии;

- репликация и последующее разделение хромосомы.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом. По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.

Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль - гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы - это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.

Рибосомы - органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.

В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включения, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество - гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, называемых волютиновыми, или метахроматиновыми, зернами.

Нуклеоид является аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды, которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).

К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.

Капсула - это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.

Функции капсулы:

- место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;

- защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;

- способность прикрепления клеток к субстрату.

Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:

- монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;

- амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

- лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;

- перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином.

К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили. Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.

У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях - эндоспоры. Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.

Расположение спор в клетке:

- центральное (возбудитель сибирской язвы);

- субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);

- терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

Методы выявления капсул, жгутиков, спор

Для выявления некоторых бактерий и отдельных структур клеток применяют специальные методы окраски.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3-5 минут.

2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.

3. На мазок наносят 5% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта на 1-2 минуты для обесцвечивания.

4. Промывают водой.

5.   Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут.

6. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Выявление капсулы по методу Гинса:

1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.

2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.

3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.

Окраска жгутиков по Леффлеру:

1. Взвесь бактерий переносят в каплю воды, не перемешивают и высушивают.

2. Обрабатывают препарат 15-20 минут протравой (1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина + смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа).

3. Тщательно промывают водой и высушивают на воздухе.

4. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании.

5. Промывают водой, высушивают, микроскопируют.

Окраска спор по методу Ожешки:

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.

2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Изучение микробов в живом состоянии

Клетки микроорганизмов в живом состоянии изучают методом раздавленной капли и методом висячей капли.

Метод раздавленной капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом х40. Метод раздавленной капли удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также для изучения крупных микроорганизмов - плесневых грибов, дрожжей.

Метод висячей капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят каплю бактериальной суспензии. Затем предметное стекло с лункой, края которого предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии используют вначале малый сухой объектив х8, под увеличением которого находят края капли, а затем устанавливают объектив х40 и исследуют препарат.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Основные структурные элементы бактериальной клетки, их функции.

2. Особенности строения клеточной стенки. Строение клеточной  стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

3. Спорообразование у бактерий.

4. Включения в цитоплазму бактериальной клетки.

5. Простые методы окраски микробов.

6. Сложные методы окраски микробов (методы Грама, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Ожешко). Методы обнаружения капсул, жгутиков, спор бактерий.

7. Сущность окраски микробов по Граму.

8. Техника приготовления мазков на предметных стеклах. Техника приготовления двух и более мазков на одном стекле.

9. Техника окраски микробов по Граму. Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму.

10. Методы изучения микробов в живом состоянии.

Литература для подготовки к занятию:

Основная литература:

1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

Дополнительная литература:

1. Л.Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев. Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА, 2005.

Ультраструктура бактериальной клетки

1. Нуклеоид – генетический аппарат бактерий. Содержит ДНК, РНК, белки (отсутствуют мембрана, гистоны, не делится митозом).

2. Цитоплазма - коллоидный раствор белков, углеводов, липидов, минеральных веществ (цитозоль), в котором находятся структурные элементы (рибосомы, нуклеоид, включения, плазмиды):

- рибосомы – место синтеза белка;

- плазмиды – автономная молекула ДНК с дополнительной генетической информацией (способность к конъюгации, резистентность к лекарственным препаратам, синтез токсинов и др.);

- включения (волютин, гликоген, крахмал, сера) – запас питательных веществ.

3. Цитоплазматическая мембрана – трехслойная мембрана (два слоя фосфолипидов и слой белка); функция - транспорт питательных веществ.

4. Мезосомы – производные (впячивания) цитоплазматической мембраны (ламинарные, везикулярные, трубчатые); функция – участие в делении клетки и в секреции веществ.

5. Клеточная стенка – структура, придающая бактериям постоянную определенную форму. Основа – пептидогликан (параллельно расположенные поперечные молекулы гликана, соединенные тетрапептидом). У грамположительных бактерий пептидогликан многослойный, прошит тейхоевой и липотейхоевой кислотами. У грамотрицательных бактерий пептидогликан однослойный, связан с помощью липопротеина с наружной мембраной, состоящей из липополисахаридов, фосфолипидов и белков.

6. Жгутики – тонкие нити, берущие начало от цитоплазматической мембраны, аппарат передвижения: монотрихи, амфитрихи, лофотрихи, перитрихи (аэротаксис, фототаксис). Состав – белок флагеллин (Н-антиген). Обнаруживаются при окраске по Леффлеру.

7. Пили (ворсинки, фимбрии) – нитевидные образования, берущие начало от поверхности клетки:

- пили первого типа – общие пили (100-200), адгезивные;

- пили второго типа – конъюгативные (половые) пили (1-4).

Состав – белок пилин.

8. Капсула (макрокапсула, слизистый чехол, микрокапсула). Химическое строение – полисахарид. Образуется главным образом в макроорганизме. Защищает бактерии от факторов макроорганизма. Определяет типоспецифичность бактерий. Обнаруживается при окраске по Бурри-Гинсу.

9. Спора – форма сохранения вида в неблагоприятных условиях. Не является способом размножения. Место расположения в клетке – центральное, субтерминальное, терминальное. Обнаруживаются при окраске по методу Ожешки (Цилю-Нильсену).


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

48128. Основи менеджменту та маркетингу 1.28 MB
  Поняття про організації. Всі організації мають загальні характеристики. 1 всі організації використовують чотири основних види ресурсів: людські ресурси; фінансові ресурси; фізичні ресурси сировина устаткування тощо; інформаційні ресурси. розподіл праці в організації.
48129. ОСНОВИ НАУКОВИХ ДОСЛІДЖЕНЬ 954 KB
  У студентів має сформуватися система знань про загальнонаукові і специфічні методи наукового дослідження основні категорії і принципи наукового пізнання. Метою вивчення дисципліни є формування у студентів системи знань про загальнонаукові і специфічні методи наукового дослідження про основні категорії і принципи наукового дослідження закріплення поглиблення розширення і систематизація знань отриманих під час аудиторних занять; самостійне оволодіння новим навчальним матеріалом формування умінь і навичок самостійної розумової праці...
48130. Реклама і звязки з громадськістю 655.5 KB
  Очевидно, що діяльність зі звязків з громадськістю передбачає багатосторонню та складну роботу, що вимагає від фахівців в цій області широкого комплексу знань і навичок
48132. Теорія держави і права 1.45 MB
  Відомо, що держава існувала не завжди, а її утворенню передував первіснообщинний устрій, який являв собою стародавній тип колективного виробництва і був результатом слабкості окремої людини перед навколишнім природним середовищем. З моменту виникнення колективної праці труд окремої людини стає частиною спільної праці всього колективу общини, яка по суті була економічною формою організації людей
48133. Держава і право 892 KB
  Основи конституційного права України 6 Загальна характеристика конституційного права як провідної галузі права України 2 2 7 Правовий статус особи в Україні 8 Конституційноправові форми народовладдя в Україні 2 9 Конституційна система органів державної влади України. Окремі галузі права 10 Цивільне та сімейне право України 6 2 11 Основи трудового права 2 12 Основи адміністративного права України 2 2 13 Основи кримінального права 2 Всього 22 10 Лекція 2. Після проголошення незалежності України 1991 р. концепція громадянського суспільства...
48134. ОСНОВЫ ПРАВА 2.29 MB
  Это провозглашено в качестве важнейшей основы конституционного строя Республики Беларусь и должно найти отражение при изучении основ права. В отличие от других социальных идей и политических ориентаций демократическое правовое государство при верховенстве правового закона и приоритете прав человека и гражданина практически воспринято обществом как будущее конституционного строя Республики Беларусь. Целью преподавания дисциплины Основы права является изучение системы законодательства Республики Беларусь ознакомление с важнейшими...
48135. Основные виды гражданско-правовых договоров 209.5 KB
  С другой стороны договор розничной куплипродажи наиболее распространенный вид договора куплипродажи. 396 ГК а также часто может позиционироваться в качестве договора присоединения ст. Элементы договора розничной куплипродажи. Необходимость приобретения товаров предназначенных для использования в предпринимательской деятельности может быть обеспечена посредством заключения договора поставки где покупателем является лишь субъект предпринимательства.
48136. Основы семиотики и семантики 628.5 KB
  Основанный на неизобразительной символике орнамент был почти исключительно геометрическим состоящим из строгих форм круга полукруга овала спирали квадрата ромба треугольника креста и их различных комбинаций. французский ученый Эжен Бурнуф впервые дал четырехконечному кресту с загнутыми концами санскритское название свастика что примерно означает несущая добро. Например: египетский крест анх прочитывался жизнь изображение коленопреклоненной фигурки хех вечность и др. Появляются в декоре Византии эмблемы и символы новой...