15430

Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов

Конспект урока

Медицина и ветеринария

ЗАНЯТИЕ 5 ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов. УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами бактерий. Изучить методы определения ф

Русский

2013-06-13

35.5 KB

165 чел.

ЗАНЯТИЕ 5

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Ферменты бактерий. Изучение ферментативной активности микроорганизмов. Дыхание бактерий. Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомиться с ферментами бактерий. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

ЗАДАЧИ ЗАНЯТИЯ:

1. Ознакомиться с ферментами бактерий.

2. Изучить методы определения ферментативной активности микроорганизмов.

3. Ознакомиться с процессами дыхания бактерий.

4. Изучить методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов.

Ферменты бактерий

Все биохимические процессы в клетке микроорганизмов, связанные с метаболизмом, ростом и размножением, совершаются при участии ферментов (энзимов). Ферменты синтезируются самой микробной клеткой, и имеют сложное строение. Они представляют собой либо только белок с высокой молекулярной массой (трипсин, пепсин и др.), либо состоят из белка (апофермента), связанного с кофактором (коферментом). Кофермент может быть низкомолекулярным неорганическим (металл) или органическим веществом.

Классификация ферментов основана на типах реакций, которые они катализируют. Все ферменты делятся на шесть классов:

1). Оксидоредуктазы - ферменты переноса электронов. Эти ферменты катализируют окислительно-восстановительные реакции. К ним относятся дегидрогеназы (НАД, НАДФ, ФАД), каталаза, цитохромы.

2). Трансферазы - ферменты переноса групп между молекулами от одних соединений к другим. К ним относятся ацетилтрансфераза, фосфотрансфераза, аминотрансфераза.

3). Гидролазы - ферменты переноса функциональных групп с участием воды. К этому классу ферментов относятся пептидгидролазы, глюкозидаза, амилазы, эстеразы, липаза, фосфатаза.

4). Лиазы - ферменты, отщепляющие или присоединяющие без участия воды различные соединения с двойной связью. К этим ферментам относятся пируватдекарбоксилаза, альдолаза.

5). Изомеразы - ферменты, переносящие группы внутри молекул с образованием изомерных форм. К этим ферментам относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза.

6). Лигазы (синтетазы) - ферменты, объединяющие две молекулы с одновременным разрывом фосфатных связей с использованием энергии АТФ.  К лигазам относятся ферменты, катализирующие синтез сложных органических веществ из простых соединений (аспарагинсинтетаза, кокарбоксилазы).

Активность ферментов измеряют в международных единицах (ME). 1 ME соответствует количеству ферментов, превращающему один микромоль субстрата в 1 минуту в стандартных условиях.

У бактерий различают эндоферменты и экзоферменты. Эндоферменты находятся внутри бактериальной клетки, катализируют внутриклеточные процессы обмена веществ. Экзоферменты выделяются во внешнюю среду и выполняют функцию расщепления сложных питательных веществ.

Ферменты агрессии. У патогенных бактерий имеется особая группа экзоферментов, которые называются ферментами агрессии. Они выполняют функции облегчения проникновения и распространения бактерий в тканях организма хозяина и ослабления его защитных свойств.  К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные и индуцибельные ферменты. Ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде называются конститутивными. Индуцибельные (адаптивные) ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в среде. Например, фермент бета-галактозидаза начинает синтезироваться  только при добавлении в питательную среду углевода лактозы, которую этот фермент расщепляет с образованием глюкозы и галактозы.

Методы определения ферментативной активности микробов

Обязательным условием идентификации выделенной чистой культуры бактерий является определение ферментативной активности в отношении углеводов и белков (биохимический «паспорт» вида).

Для выявления ферментов, расщепляющих углеводы (сахаролитические ферменты) используют дифференциально-диагностические среды Гисса. В состав сред Гисса входит пептонная вода, индикатор рН, поплавок для улавливания газа и один из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). Если бактерии расщепляют углевод, то образуется кислота и при этом меняется цвет среды за счет находящегося в ней индикатора рН. Большинство патогенных бактерий расщепляют углеводы с образованием только кислоты; некоторые виды ферментируют углеводы с образование кислоты и газа (СО2). При этом меняется цвет среды и в поплавке появляется пузырек газа.

Протеолитическая активность бактерий. Показателями  глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Для выявления этих газообразных веществ делают посевы чистой культуры бактерий на мясо-пептонный бульон или пептонную воду в пробирки со специальными бумажными индикаторами. При наличии продуктов расщепления меняется цвет соответствующего индикатора.

        Протеолитическую активность бактерий определяют также путем посева чистой культуры уколом в столбик желатина по наличию и характеру разжижения среды, например, в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки и т.д.

Энергетический метаболизм

Это совокупность биохимических реакций, результатом которых является образование (накопление энергии) и расщепление (расход энергии) макроэргических связей в молекулах АТФ.  У бактерий АТФ может синтезироваться в результате процессов брожения и дыхания.

Брожение. Более древний, низкоэффективный способ получения энергии, при котором в результате расщепления молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ. Конечными продуктами брожения являются СО2, вода, спирты и органические кислоты. Процесс происходит без участия кислорода.

 Дыханием называют процесс окислительного фосфорилирования углеводов с образованием молекул АТФ,  СО2 и воды.  При распаде одной молекулы глюкозы высвобождаются 12 электронов, которые проходят через цепь дыхательных ферментов, отдавая энергию для синтеза 36 молекул АТФ. Освобождение дыхательной цепи от электронов осуществляют вещества, называемые акцепторами электронов. К таким веществам относится кислород, сульфаты, нитраты, карбонаты. Если конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород, дыхание называют аэробным. В случае конечной акцепции электронов другими соединениями дыхание называют анаэробным.

По типу дыхания бактерии классифицируют на четыре основные группы:

1. Облигатные (строгие) аэробы растут при свободном доступе кислорода (возбудитель туберкулеза).

2. Микроаэрофилы растут при низкой (до 1%) концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислого газа (гемофильная палочка).

3. Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и в анаэробных условиях (кишечная палочка).

4. Облигатные (строгие) анаэробы могут расти только при полном отсутствии кислорода в окружающей среде (возбудители столбняка, ботулизма, газовой гангрены).

Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов

Необходимым условием при культивировании анаэробов является защита их от токсического воздействия молекулярного кислорода. Это достигается при помощи физических, химических и биологических методов.

Физические методы:

1. Регенерация сред. Для удаления растворенного в питательных средах кислорода производят их кипячение в течение 15-20 минут на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50°С. После посева культуры для предотвращения проникновения кислорода в жидкую питательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев в “высокий столбик агара”. Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С и вносят исследуемый материал. Пробирки с посевами помещают в обычный термостат.  В высоком столбике плотной или полужидкой питательной среды кислород воздуха диффундирует обычно на расстояние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине остаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в механическом удалении воздуха из герметически закрытого сосуда, который называется анаэростат, при помощи вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом или бескислородной газовой смесью.

Химические методы:

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде

2. Применение гидросульфита натрия для поглощения кислорода из замкнутого пространства.

3. Использование редуцирующих веществ. Для связывания остатков кислорода в питательных средах используют вещества-редуценты, к которым относятся тиогликолевая кислота, аскорбиновая кислота, различные сахара, цистин и цистеин.

4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород генерируется таблетками боргидрида натрия. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.

Биологический метод

Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). На одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую – лабораторную культуру известных аэробных бактерий. После посева чашку герметично закрывают крышкой. Вначале вырастают аэробы, поглощающие кислород, а затем – анаэробы.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Для получения изолированных колоний облигатных анаэробов используют следующие методы:

Метод Цейсслера. Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной питательной среды, помещают в анаэростат и выдерживают в термостате при 37°С в течение 24-72 часов.

Метод Вейнберга. Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капилляром и переносят в пробирку с расплавленным и охлажденным до 45-50°С сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро охлаждают. Пробирки инкубируют в обычном термостате.

Метод Виньяля-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до температуры 40-45°С сахарным агаром вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Затем содержимым пробирки заполняют капилляры трех пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаивают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов.

Метод Перетца. Готовят разведения исследуемого материала в 0,5% расплавленном агаре. Содержимое пробирки выливают в стерильную чашку Петри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках располагается стеклянная пластинка размером 6x6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод “перевернутых чашек”. При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином и термостатируют при 37°С до появления изолированных колоний анаэробов.

Выращивание чистой культуры анаэробов производят путем посева материала из изолированной колонии на среду Китта-Тароцци, в состав которой входит мясной бульон, глюкоза и кусочки печени или фарша. Для предотвращения доступа кислорода среда покрыта слоем вазелинового масла.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

74068. Франция в Новейшее время 99 KB
  Развитие государственного устройства Франции в Новейшее время. Право Франции в Новейшее время. Развитие государственного строя в период между двумя мировыми войнами Государственный строй Франции после Первой мировой определялся Конституцией 1875 г. В 30е годы в условиях острого социального и экономического кризиса во Франции активизируется деятельность профашистских организаций...
74069. Государственное развитие Германии в ХХ веке 140.5 KB
  Государственное развитие Германии в ХХ веке. Право Германии в Новейшее время. Революция 1918 года в Германии. Поражение Германии в Первой мировой войне внутренние противоречия влияние событий в России привели к революционному взрыву в ноябре 1918 г.
74070. Государство и право Китая и Японии в Новое и Новейшее время 168 KB
  Парламент Китая под нажимом Юань Шикая совершившего государственный переворот вносит во Временную конституцию изменения целью которых было расширить права президента и ограничить права парламента. еще больше расширили права президента. Провозглашалось равенство граждан перед законом и национальное равноправие гарантировались...
74071. Предмет, методы и основные источники «Истории права зарубежных стран» 48.5 KB
  Предмет методы и основные источники Истории права зарубежных стран. Истоки права. История ПЗС иногда ее называют Всеобщая история государства и права – изучает возникновение оформление и функционирование правовых обычаев и законов а также их последующие изменения у разных народов мира в отдельные периоды от древности до современной эпохи...
74072. Право Древнего Востока 88.5 KB
  Право Древнего Востока. Право Древнего Египта. Право Древнего Вавилона. Это в свою очередь сказалось на застойном характере восточных социальных структур на отсутствии на Востоке условий для развития тех политических и правовых институтов которые были призваны обслуживать нужды нарождавшегося гражданского общества: общественное самоуправление с правами и обязанностями каждого полноправного гражданина правовые гарантии его интересов прав и свобод.
74073. Право Юго-Восточной Азии в античное время 89.5 KB
  Особое место в истории Индии занимает Магадско-Маурийский период (IV-II вв. до н.э.), отмеченный созданием (впервые в истории Индии) объединенного государства - Магатха. Наивысшего могущество оно достигло при правлении династии Маурьев, и особенно, при Чандрагупте I (основателе династии) и Ашоке.
74074. Право Древней Греции 60 KB
  Право Древней Греции План. Государственноправовое устройство греческих полисов. Право Древней Греции. По достижении 18 лет они начинали пользовались политическими правами и правом получения различных пособий от государства.
74075. Римское право 71 KB
  Древний Рим – одно из крупнейших рабовладельческих государств – оставил ярчайший след в истории человечества. Его культурное наследие оказало глубокое влияние на все последующее развитие европейской цивилизации. Как гласит известное выражение. Римляне трижды покоряли мир – первый раз легионами, второй раз – христианством, третий раз – правом.
74076. ВОЗНИКНОВЕНИЕ И РАЗВИТИЕ ФЕОДАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВА И ПРАВА 66 KB
  Для феодальной земельной собственности были характерны следующие особенности: 1 иерархический характер; 2 сословный характер; 3 ограничение права распоряжаться землей а некоторые категории например церковные земли вообще были изъяты из гражданского оборота. Основные черты феодального права Одновременно со складыванием феодальной государственности шел процесс становления феодального права. Можно выделить следующие характерные черты феодального права.