16945

Выделение протопластов

Лекция

Биология и генетика

Выделение протопластов. Цель: выделить протопласты нескольких видов растений и оценить для этих видов изоосмотическую точку. Введение. Протопласты представляют собой растительные клетки без клеточной стенки. Для их получения необходимо разрушить клеточную стенку...

Русский

2013-06-28

30 KB

5 чел.

Выделение протопластов.

Цель: выделить протопласты нескольких видов растений и оценить для этих видов изоосмотическую точку.

Введение.

Протопласты представляют собой растительные клетки без клеточной стенки. Для их получения необходимо разрушить клеточную стенку. Основными компонентами клеточной стенки растений являются целлюлоза, гемицеллюлозы и пектин. Соответственно оптимальная среда для выделения протопластов должна содержать целлюлазу, мацеразу (гидролизует гемицеллюлозы) и пектиназу. Однако часто бывает достаточно одной только целлюлазы.

Растительная клетка в норме находится в состоянии тургора. Очевидно, что при разрушении клеточной стенки тургор исчезает. Если среда для выделения изоосмотична по отношению к содержимому клетки, то протопласт принимает сферическую форму, соответствующую минимуму энергии поверхностного натяжения; в центре протопласта остается большая вакуоль. Если среда для выделения гиперосмотична – протопласт принимает амебообразную форму, вакуоль сильно сжимается. В гипоосмотичной среде происходит разрыв протопластов.

Выполнение работы.

Работа заключается в выделении протопластов в двух различных средах (раствор А и раствор В) для выделения, отличающихся своим осмотическим давлением. В качестве осморегулятора используется маннит, разрушение клеточной стенки проводится целлюлазой. Протопласты выделяем из клеток мезофилла листа. Состав сред для выделения следующий.

Раствор А: 2,5% мас/об раствор целлюлазы (источник – Aspergillus niger, активность 108 ед./г) в растворе маннита 70 г/л, приготовленном на фосфатном буфере (K2HPO4/KH2PO4 pH=5,2 – 5,8).

Раствор В: 2,5% мас/об раствор целлюлазы (источник – Aspergillus niger, активность 108 ед./г) в растворе маннита 90 г/л, приготовленном на фосфатном буфере (K2HPO4/KH2PO4 pH=5,2 – 5,8).

Ход работы.

  1.  Готовим раствор А. 5 г маннита растворяем в 71 мл фосфатного буфера. Берем 26 мл этого раствора, медленно приливаем к 650 мг навеске целлюлазы, растворяем.
  2.  Готовим раствор B. 5 г маннита растворяем в 56 мл фосфатного буфера. Берем 24,5 мл этого раствора, медленно приливаем к 611 мг навеске целлюлазы, растворяем.
  3.  Растворы А и В разливаем по маленьким чашкам Петри.
  4.  Снимаем нижний эпидермис с листа исследуемого растения.
  5.  Из той области листа, с которой снят нижний эпидермис, вырезаем два квадратика 5×5 мм. Один из этих квадратиков погружаем в раствор А, налитый в маленькую чашку Петри нижней стороной вниз, другой – в раствор В нижней стороной вниз.
  6.  Чашки Петри с квадратиками закрываем и ставим на инкубацию в термостат на 3 часа при температуре 37ºС.
  7.  Вынимаем из термостата. Квадратик из листа слегка прижимаем препаровальной иглой. Среду для выделения микроскопируем при помощи светового микроскопа прямо в чашках Петри. Наблюдения заносим в таблицу.

Объект.

Маннит 70 г/л

Маннит 90 г/л

Kalanchoe shizophillia

Выход протопластов высокий. Форма сферическая. Вакуоли крупные.

Образец был уничтожен в ходе выполнения работы.

Kalanchoe  diagremontiana

Выход низкий. Наряду со сферическими клетками присутствуют обрывки клеток и агрегаты хлоропластов.

Выход протопластов высокий. Форма сферическая. Вакуоли крупные.

Crassula arborea

Выход низкий. Преобладают клеточные агрегаты с остатками клеточных стенок. Протопласты имеют сферическую форму; вакуоли крупные.

Выход низкий. Протопласты имеют неправильную форму без вакуолей.

Sedum morganianum

Выход не очень высокий. Присутствуют клеточные агрегаты. Клетки (протопласты) округлой формы. Вакуоли маленькие.

Выход не очень высокий. Присутствуют клеточные агрегаты. Клетки неправильной формы. Вакуолей нет.

Sedum adolphii

Протопласты имеют сферическую форму; вакуоли есть. Присутствуют клеточные агрегаты.

Протопласты имеют неправильную форму. Вакуолей нет. Присутствуют клеточные агрегаты.

Hippeastrum hydridum

Выход не очень высокий. Форма протопластов сферическая; вакуоли крупные. Есть разрушенные клетки.

Выход низкий. Форма протопластов сферическая; вакуоли крупные.

 

Обсуждение результатов.

Присутствие клеточных агрегатов для ряда объектов (Sedum adolphi, Sedum morganianum, Crassula arborea) является следствием неполного разрушения клеточной стенки. Последнее может быть связано как с тем, что клеточная стенка достаточно толстая, и времени инкубации оказалось недостаточно для ее разрушения, так и с тем, что клеточная стенка этих растений содержит относительно много пектинов и гемицеллюлоз, поэтому для ее разрушения присутствия одной целлюлазы недостаточно.

Как говорилось во введении, наличие клеточных обрывков и агрегатов хлоропластов (например, Kalanchoe  diagremontiana в среде, содержащей 70 г/л маннита) говорит о том, что эта среда гипотонична для клеток мезофилла листа этого растения. Для большинства же исследованных растений концентрация маннита 70 г/л является близкой к изотонической, об этом говорит наличие в такой среде сферических протопластов с крупными вакуолями. Для Sedum morganianum эта среда, по всей видимости, является гипертоничной, поскольку протопласты (клетки) в этой среде имеют маленькие вакуоли; сферическую форму клеток можно объяснить неполным разрушением клеточной стенки. Об этом же свидетельствует присутствие клеточных агрегатов. Концентрация маннита 90 г/л является гипертоничной для большинства объектов, кроме Kalanchoe  diagremontiana, для которого она близка к изотонической, и Hippeastrum hydridum, для которого изотоническая концентрация лежит где-то посередине между 70 и 90 г/л. О последнем говорит наличие сферических протопластов с крупными вакуолями в обеих средах.  


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

34306. Модели и методы оценки технологических процессов 23.5 KB
  Модели и методы оценки технологических процессов В настоящее время можно выделить три основных подхода к изучению научнотехнического развития прва описанию технологий и их развития: экономический подход технократический или пифагорский подход системный подход. В рамках экономического подхода развивалось направление связанное с решение задач планирования научнотехнического развития прва для обеспечения заданного необходимого прироста объема выпуска продукции использование так называемых балансовых методов планирования. С целью...
34307. Понятие о системах технологических процессов 24 KB
  Понятие о системах технологических процессов. Система это целое составленное из отдельных частей ке находятся в тесном отношении между собой . Технологическая система это совокупность взаимосвязанных предметов производства исполнителей и направлено на выполнение отдельных операций и процессов в целом. Между операцией в технологическом процессе и системах можно считать условленным так как они имеют опред.
34308. Исторические этапы развития систем технологий 27.5 KB
  В своем развитии системы технологических процессов прошли ряд исторических этапов. Однако сознательная организация системы технологических процессов произошла в средневековье. Впервые организованная система технологических процессов проявила себя в цехах ремесленников. По структуре цехи ремесленников представляли собой систему параллельных технологических процессов.
34309. Классификационные признаки систем технологий 23 KB
  Важнейшим признаком характеризующим технологические системы является их структура. Механизированная отличается использованием различных механизмов для осуществления как рабочих так и вспомогательных процессов в элементах системы участок станков машиностроительного предприятия. Жесткая связь подсистем характеризуются немедленным прекращением функционирования технологической системы в целом при отказе хотя бы одной подсистемы. При нежесткой связи между элементами системы возможно непродолжительное функционирование системы в случае...
34310. Структура технологической системы производства 25.5 KB
  Структура технологической системы производства. Свойства элементарных технологических процессов распространяются и на технологические системы более высокого иерархического уровня которые образованы совокупностями технологических процессов. Таким образом технологическую систему производства образуют параллельные последовательные и комбинированные системы технологических процессов. Еще одним важным фактором в формировании технологических систем являются технологические связи между элементами системы а также их характер.
34311. Взаимосвязь технологических и организационных структур производства 26 KB
  Взаимосвязь технологических и организационных структур производства. Характер формирования систем технологических процессов а также связей между ними имеет определяющее значение для формирования управляющих воздействий. Поэтому можно четко проследить взаимосвязь технологических и организационных структур производства. Например ремесленный цех с его ярко выраженной параллельной системой технологических процессов на определенном этапе исторического развития видоизменился в мануфактуру с последовательными технологическими процессами.
34312. Специфика развития параллельных и последовательных технологических систем 26 KB
  Перевод слабых составляющих системы на более высокую ступень позволит улучшить характеристики системы так как в ней ликвидируются звенья которые обуславливали в наибольшей степени неудовлетворительное функционирование системы. Таким образом ориентация на два различных типа развития позволит ставить задачу определения предпочтительности одного из них применительно к составляющим элементам параллельной системы. Такое целенаправленное развитие дает больший эффект чем при одновременном развитии всех составляющих изза различной готовности...
34313. Основные закономерности и направления развития систем технологических процессов 23.5 KB
  При этом важной особенностью развития технологических систем является их тип параллельной или последовательной связи элементов системы. Технологические системы в общем случае развиваются как и технологические процессы эволюционным и революционным путем. Однако системы технологических процессов неоднородны по восприятию рационалистического и эвристического развития. Как и в случае развития технологических процессов необходимым и достаточным условием революционного развития является совершенствование рабочих процессов хотя бы в...
34314. Реальный и потенциальный уровень технологии системы 25.5 KB
  Реальный и потенциальный уровень технологии системы. Реальная технологическая система характеризуется не только величиной уровня технологии который соответствует конкретным пропорциям между производительностью и затратами прошлого труда то есть реальным уровнем технологии но и максимальным потенциальным уровнем технологии который может быть достигнут в данной технологической системе при неизменных уровнях технологии ее составляющих. Потенциальный уровень технологии является верхней границей достижение которой будет означать что...