16945

Выделение протопластов

Лекция

Биология и генетика

Выделение протопластов. Цель: выделить протопласты нескольких видов растений и оценить для этих видов изоосмотическую точку. Введение. Протопласты представляют собой растительные клетки без клеточной стенки. Для их получения необходимо разрушить клеточную стенку...

Русский

2013-06-28

30 KB

5 чел.

Выделение протопластов.

Цель: выделить протопласты нескольких видов растений и оценить для этих видов изоосмотическую точку.

Введение.

Протопласты представляют собой растительные клетки без клеточной стенки. Для их получения необходимо разрушить клеточную стенку. Основными компонентами клеточной стенки растений являются целлюлоза, гемицеллюлозы и пектин. Соответственно оптимальная среда для выделения протопластов должна содержать целлюлазу, мацеразу (гидролизует гемицеллюлозы) и пектиназу. Однако часто бывает достаточно одной только целлюлазы.

Растительная клетка в норме находится в состоянии тургора. Очевидно, что при разрушении клеточной стенки тургор исчезает. Если среда для выделения изоосмотична по отношению к содержимому клетки, то протопласт принимает сферическую форму, соответствующую минимуму энергии поверхностного натяжения; в центре протопласта остается большая вакуоль. Если среда для выделения гиперосмотична – протопласт принимает амебообразную форму, вакуоль сильно сжимается. В гипоосмотичной среде происходит разрыв протопластов.

Выполнение работы.

Работа заключается в выделении протопластов в двух различных средах (раствор А и раствор В) для выделения, отличающихся своим осмотическим давлением. В качестве осморегулятора используется маннит, разрушение клеточной стенки проводится целлюлазой. Протопласты выделяем из клеток мезофилла листа. Состав сред для выделения следующий.

Раствор А: 2,5% мас/об раствор целлюлазы (источник – Aspergillus niger, активность 108 ед./г) в растворе маннита 70 г/л, приготовленном на фосфатном буфере (K2HPO4/KH2PO4 pH=5,2 – 5,8).

Раствор В: 2,5% мас/об раствор целлюлазы (источник – Aspergillus niger, активность 108 ед./г) в растворе маннита 90 г/л, приготовленном на фосфатном буфере (K2HPO4/KH2PO4 pH=5,2 – 5,8).

Ход работы.

  1.  Готовим раствор А. 5 г маннита растворяем в 71 мл фосфатного буфера. Берем 26 мл этого раствора, медленно приливаем к 650 мг навеске целлюлазы, растворяем.
  2.  Готовим раствор B. 5 г маннита растворяем в 56 мл фосфатного буфера. Берем 24,5 мл этого раствора, медленно приливаем к 611 мг навеске целлюлазы, растворяем.
  3.  Растворы А и В разливаем по маленьким чашкам Петри.
  4.  Снимаем нижний эпидермис с листа исследуемого растения.
  5.  Из той области листа, с которой снят нижний эпидермис, вырезаем два квадратика 5×5 мм. Один из этих квадратиков погружаем в раствор А, налитый в маленькую чашку Петри нижней стороной вниз, другой – в раствор В нижней стороной вниз.
  6.  Чашки Петри с квадратиками закрываем и ставим на инкубацию в термостат на 3 часа при температуре 37ºС.
  7.  Вынимаем из термостата. Квадратик из листа слегка прижимаем препаровальной иглой. Среду для выделения микроскопируем при помощи светового микроскопа прямо в чашках Петри. Наблюдения заносим в таблицу.

Объект.

Маннит 70 г/л

Маннит 90 г/л

Kalanchoe shizophillia

Выход протопластов высокий. Форма сферическая. Вакуоли крупные.

Образец был уничтожен в ходе выполнения работы.

Kalanchoe  diagremontiana

Выход низкий. Наряду со сферическими клетками присутствуют обрывки клеток и агрегаты хлоропластов.

Выход протопластов высокий. Форма сферическая. Вакуоли крупные.

Crassula arborea

Выход низкий. Преобладают клеточные агрегаты с остатками клеточных стенок. Протопласты имеют сферическую форму; вакуоли крупные.

Выход низкий. Протопласты имеют неправильную форму без вакуолей.

Sedum morganianum

Выход не очень высокий. Присутствуют клеточные агрегаты. Клетки (протопласты) округлой формы. Вакуоли маленькие.

Выход не очень высокий. Присутствуют клеточные агрегаты. Клетки неправильной формы. Вакуолей нет.

Sedum adolphii

Протопласты имеют сферическую форму; вакуоли есть. Присутствуют клеточные агрегаты.

Протопласты имеют неправильную форму. Вакуолей нет. Присутствуют клеточные агрегаты.

Hippeastrum hydridum

Выход не очень высокий. Форма протопластов сферическая; вакуоли крупные. Есть разрушенные клетки.

Выход низкий. Форма протопластов сферическая; вакуоли крупные.

 

Обсуждение результатов.

Присутствие клеточных агрегатов для ряда объектов (Sedum adolphi, Sedum morganianum, Crassula arborea) является следствием неполного разрушения клеточной стенки. Последнее может быть связано как с тем, что клеточная стенка достаточно толстая, и времени инкубации оказалось недостаточно для ее разрушения, так и с тем, что клеточная стенка этих растений содержит относительно много пектинов и гемицеллюлоз, поэтому для ее разрушения присутствия одной целлюлазы недостаточно.

Как говорилось во введении, наличие клеточных обрывков и агрегатов хлоропластов (например, Kalanchoe  diagremontiana в среде, содержащей 70 г/л маннита) говорит о том, что эта среда гипотонична для клеток мезофилла листа этого растения. Для большинства же исследованных растений концентрация маннита 70 г/л является близкой к изотонической, об этом говорит наличие в такой среде сферических протопластов с крупными вакуолями. Для Sedum morganianum эта среда, по всей видимости, является гипертоничной, поскольку протопласты (клетки) в этой среде имеют маленькие вакуоли; сферическую форму клеток можно объяснить неполным разрушением клеточной стенки. Об этом же свидетельствует присутствие клеточных агрегатов. Концентрация маннита 90 г/л является гипертоничной для большинства объектов, кроме Kalanchoe  diagremontiana, для которого она близка к изотонической, и Hippeastrum hydridum, для которого изотоническая концентрация лежит где-то посередине между 70 и 90 г/л. О последнем говорит наличие сферических протопластов с крупными вакуолями в обеих средах.  


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

81349. Особливості звернення стягнення на предмет іпотеки 22.32 KB
  Звернення стягнення на предмет іпотеки і його реалізація для задоволення вимог іпотекодержателя здійснюються відповідно до умов іпотечного договору. У разі звернення стягнення на предмет іпотеки на підставі виконавчого напису нотаріуса на нотаріально посвідчених примірниках іпотечного договору та договору про іпотечний кредит чи на нотаріально посвідчених копіях цих документів або за рішенням суду орган державної виконавчої служби здійснює реалізацію предмета іпотеки в порядку установленому іпотечним договором. Відчуження предмета іпотеки...
81350. Звернення стягнення на грошові кошти боржника - юридичної особи 27.5 KB
  Готівка в національній та іноземній валюті яка знаходиться в касах або інших сховищах боржника юридичної особи підлягає невідкладному вилученню після її виявлення Державний виконавець звертає стягнення на кошти боржника юридичної особи що знаходяться в кредитних установах в тому числі в органах Державного казначейства в порядку передбаченому Законом. Якщо даних про наявність у боржника юридичної особи рахунків і вкладів у банках чи інших кредитних установах немає то державний виконавець одержує такі дані в податкових органах які...
81351. Звернення стягнення на інше майно боржника - юридичної особи 28.88 KB
  У разі відсутності в боржника юридичної особи коштів достатніх для покриття заборгованості стягнення звертається на інше майно належне боржникові юридичній особі на праві власності або закріплене за ним у тому числі на майно яке обліковується на окремому балансі філії представництва та іншого відокремленого підрозділу боржника юридичної особи за винятком майна виключеного з обороту або обмеженого в обороті незалежно від того хто фактично використовує це майно. На зазначене майно накладається арешт і воно реалізується в такій...
81352. Порядок звернення стягнення на майно при реорганізації та ліквідації боржника - юридичної особи 23.4 KB
  У разі реорганізації злиття приєднання розділення виділення перетворення боржника юридичної особи стягнення за виконавчими документами звертається на кошти та інше майно тієї юридичної особи на яку відповідно до закону покладено відповідальність за зобовязаннями боржника юридичної особи. У разі ліквідації боржника юридичної особи у тому числі внаслідок визнання боржника банкрутом виконавчий документ передається до ліквідаційної комісії або арбітражного керуючого для вирішення питання про подальший порядок виконання рішення у...
81353. Порядок звернення стягнення на зарплату та інші доходи боржника - фізичної особи. Розмір відрахувань із зарплати та інших доходів боржника 28.68 KB
  Розмір відрахувань із зарплати та інших доходів боржника Умови звернення стягнення на заробітну плату та інші доходи боржника Стягнення на заробітну плату заробіток пенсію стипендію та інші доходи боржника звертається за відсутності в боржника коштів на рахунках у банках та інших кредитних установах відсутності чи недостатності майна боржника для повного покриття належних до стягнення сум а також при виконанні рішень про стягнення періодичних платежів та стягнень на суму що не перевищує двох мінімальних розмірів заробітної плати. При...
81354. Особливості і виконання рішень про стягнення аліментів 28.71 KB
  У разі неможливості стягнення аліментів із заробітної плати чи інших доходів боржника протягом трьох місяців підряд якщо боржник не працює і не одержує доходів стягнення звертається на майно боржника. Розмір заборгованості з аліментів визначається державним виконавцем за місцем виконання рішення виходячи з фактичного заробітку доходів одержаного боржником за час протягом якого стягнення не провадилося або одержуваного ним на момент визначення заборгованості в твердій грошовій сумі або у відсотковому відношенні. Державний виконавець у...
81355. Виконання рішення про обов’язок боржника вчинити певну дію чи утриматися від її вчинення 23.5 KB
  ісля відкриття виконавчого провадження за виконавчим документом, який зобовязує боржника вчинити певні дії або утриматися від їх учинення, державний виконавець відповідно до статті 24 Закону визначає йому строк добровільного виконання рішення.
81356. Порядок виконання рішення про поновлення на роботі 23.92 KB
  Закону виконавчий документ про поновлення на роботі незаконно звільненого або переведеного працівника виконується негайно ч. Виконання вважається завершеним з моменту фактичного допущення працівника до виконання попередніх обовязків на підставі відповідного наказу органу який прийняв незаконне рішення про звільнення або переведення працівника. У разі невиконання власником підприємства установи організації або уповноваженим ним органом фізичною особою фізичною особою підприємцем рішення про поновлення на роботі незаконно звільненого...
81357. Виконання рішення про відібрання дитини 22.11 KB
  Під час виконання рішень про відібрання дитини державний виконавець провадить виконавчі дії з обовязковою участю особи якій дитина передається на виховання із залученням представників органів опіки і піклування а при потребі представників органів та установ освіти медичних працівників. У разі потреби державний виконавець може звернутися до суду з поданням про вирішення питання про тимчасове влаштування дитини до дитячого чи лікувального закладу...