16945

Выделение протопластов

Лекция

Биология и генетика

Выделение протопластов. Цель: выделить протопласты нескольких видов растений и оценить для этих видов изоосмотическую точку. Введение. Протопласты представляют собой растительные клетки без клеточной стенки. Для их получения необходимо разрушить клеточную стенку...

Русский

2013-06-28

30 KB

3 чел.

Выделение протопластов.

Цель: выделить протопласты нескольких видов растений и оценить для этих видов изоосмотическую точку.

Введение.

Протопласты представляют собой растительные клетки без клеточной стенки. Для их получения необходимо разрушить клеточную стенку. Основными компонентами клеточной стенки растений являются целлюлоза, гемицеллюлозы и пектин. Соответственно оптимальная среда для выделения протопластов должна содержать целлюлазу, мацеразу (гидролизует гемицеллюлозы) и пектиназу. Однако часто бывает достаточно одной только целлюлазы.

Растительная клетка в норме находится в состоянии тургора. Очевидно, что при разрушении клеточной стенки тургор исчезает. Если среда для выделения изоосмотична по отношению к содержимому клетки, то протопласт принимает сферическую форму, соответствующую минимуму энергии поверхностного натяжения; в центре протопласта остается большая вакуоль. Если среда для выделения гиперосмотична – протопласт принимает амебообразную форму, вакуоль сильно сжимается. В гипоосмотичной среде происходит разрыв протопластов.

Выполнение работы.

Работа заключается в выделении протопластов в двух различных средах (раствор А и раствор В) для выделения, отличающихся своим осмотическим давлением. В качестве осморегулятора используется маннит, разрушение клеточной стенки проводится целлюлазой. Протопласты выделяем из клеток мезофилла листа. Состав сред для выделения следующий.

Раствор А: 2,5% мас/об раствор целлюлазы (источник – Aspergillus niger, активность 108 ед./г) в растворе маннита 70 г/л, приготовленном на фосфатном буфере (K2HPO4/KH2PO4 pH=5,2 – 5,8).

Раствор В: 2,5% мас/об раствор целлюлазы (источник – Aspergillus niger, активность 108 ед./г) в растворе маннита 90 г/л, приготовленном на фосфатном буфере (K2HPO4/KH2PO4 pH=5,2 – 5,8).

Ход работы.

  1.  Готовим раствор А. 5 г маннита растворяем в 71 мл фосфатного буфера. Берем 26 мл этого раствора, медленно приливаем к 650 мг навеске целлюлазы, растворяем.
  2.  Готовим раствор B. 5 г маннита растворяем в 56 мл фосфатного буфера. Берем 24,5 мл этого раствора, медленно приливаем к 611 мг навеске целлюлазы, растворяем.
  3.  Растворы А и В разливаем по маленьким чашкам Петри.
  4.  Снимаем нижний эпидермис с листа исследуемого растения.
  5.  Из той области листа, с которой снят нижний эпидермис, вырезаем два квадратика 5×5 мм. Один из этих квадратиков погружаем в раствор А, налитый в маленькую чашку Петри нижней стороной вниз, другой – в раствор В нижней стороной вниз.
  6.  Чашки Петри с квадратиками закрываем и ставим на инкубацию в термостат на 3 часа при температуре 37ºС.
  7.  Вынимаем из термостата. Квадратик из листа слегка прижимаем препаровальной иглой. Среду для выделения микроскопируем при помощи светового микроскопа прямо в чашках Петри. Наблюдения заносим в таблицу.

Объект.

Маннит 70 г/л

Маннит 90 г/л

Kalanchoe shizophillia

Выход протопластов высокий. Форма сферическая. Вакуоли крупные.

Образец был уничтожен в ходе выполнения работы.

Kalanchoe  diagremontiana

Выход низкий. Наряду со сферическими клетками присутствуют обрывки клеток и агрегаты хлоропластов.

Выход протопластов высокий. Форма сферическая. Вакуоли крупные.

Crassula arborea

Выход низкий. Преобладают клеточные агрегаты с остатками клеточных стенок. Протопласты имеют сферическую форму; вакуоли крупные.

Выход низкий. Протопласты имеют неправильную форму без вакуолей.

Sedum morganianum

Выход не очень высокий. Присутствуют клеточные агрегаты. Клетки (протопласты) округлой формы. Вакуоли маленькие.

Выход не очень высокий. Присутствуют клеточные агрегаты. Клетки неправильной формы. Вакуолей нет.

Sedum adolphii

Протопласты имеют сферическую форму; вакуоли есть. Присутствуют клеточные агрегаты.

Протопласты имеют неправильную форму. Вакуолей нет. Присутствуют клеточные агрегаты.

Hippeastrum hydridum

Выход не очень высокий. Форма протопластов сферическая; вакуоли крупные. Есть разрушенные клетки.

Выход низкий. Форма протопластов сферическая; вакуоли крупные.

 

Обсуждение результатов.

Присутствие клеточных агрегатов для ряда объектов (Sedum adolphi, Sedum morganianum, Crassula arborea) является следствием неполного разрушения клеточной стенки. Последнее может быть связано как с тем, что клеточная стенка достаточно толстая, и времени инкубации оказалось недостаточно для ее разрушения, так и с тем, что клеточная стенка этих растений содержит относительно много пектинов и гемицеллюлоз, поэтому для ее разрушения присутствия одной целлюлазы недостаточно.

Как говорилось во введении, наличие клеточных обрывков и агрегатов хлоропластов (например, Kalanchoe  diagremontiana в среде, содержащей 70 г/л маннита) говорит о том, что эта среда гипотонична для клеток мезофилла листа этого растения. Для большинства же исследованных растений концентрация маннита 70 г/л является близкой к изотонической, об этом говорит наличие в такой среде сферических протопластов с крупными вакуолями. Для Sedum morganianum эта среда, по всей видимости, является гипертоничной, поскольку протопласты (клетки) в этой среде имеют маленькие вакуоли; сферическую форму клеток можно объяснить неполным разрушением клеточной стенки. Об этом же свидетельствует присутствие клеточных агрегатов. Концентрация маннита 90 г/л является гипертоничной для большинства объектов, кроме Kalanchoe  diagremontiana, для которого она близка к изотонической, и Hippeastrum hydridum, для которого изотоническая концентрация лежит где-то посередине между 70 и 90 г/л. О последнем говорит наличие сферических протопластов с крупными вакуолями в обеих средах.  


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

31030. ВНЕШНЯЯ ПОЛИТИКА РОССИИ ВО ВТОРОЙ ПОЛОВИНЕ XIX в 13.9 KB
  Сложившийся против России англоавстрофранцузский блок так называемая Крымская система был нацелен на сохранение ее политической изоляции и военностратегической слабости обеспеченной решениями Парижского конгресса. дальневосточное направление во внешней политике России постепенно изменяло свой периферийный характер. добровольным вхождением Мерва территория пограничная с Афганистаном в состав России.
31031. РЕВОЛЮЦИЯ 1905-1907 гг. 44 KB
  Причины Нерешенность аграрного вопроса: малоземелье крестьян при господствующем помещичьем землевладении Противостояние самодержавия и либеральнонастроенных слоев общества вызванное отсутствием политических гражданских свобод Высокая степень эксплуатации рабочих Поражение России в РусскоЯпонской войне Неравноправие народов национальных окраин империи Задачи: Свержение самодержавия Введение демократических свобод Сокращение рабочего дня Равноправие всех народов По задачам буржуазный характер по движущим силам...
31032. НЭП 19.38 KB
  Ленин заставил ЦК послать обоих т. Крестьяне по Ленину должны набраться терпения: большевики восстановят промышленность вернут долг и будет всем светлое будущее аля Ленин: коммунистическое производство и распределение. Ленин Троцкий Платформа рабочей оппозиции Коллонтай Шляпников Платформа демократического централизма Бубнов Осинский Сапронов Профсоюзы – школа коммунизма. Приняли ленинский проект о профсоюзах.
31033. Внешняя политика Советского государства в 1920-е годы 112.85 KB
  после падения Советской власти в республиках Прибалтики правительство РСФСР заключило Договоры о мире с буржуазными правительствами Эстонии Литвы Латвии признававшими их независимость и самостоятельность. Ленин ставил вопрос не только о соревновании государств представлявших разные системы собственности но и о необходимости экономического сотрудничества между странами путем предоставления концессий заключения торговых договоров и соглашений. В местечке недалеко от Генуи Рапалло Россия заключила Рапалльский договор с Германией в...
31034. Внешняя политика СССР в 1933-41гг 17.83 KB
  Внешняя политика СССР в 1933-41гг. У СССР также виды на Маньчжурию. –пакт о ненападении Германии на СССР но А. 1934 – вступление СССР в Лигу Наций 1935 – договоры о взаимопомощи с Францией и Чехословакией.
31035. Глобальные социально-экономические изменения в 1930-х 23.4 KB
  Теперь он занимается лишь воспитанием своих членов в духе преданности делу Ленина Сталина производственной и культурновоспитательной работой. Со страниц газет и журналов с помощью радио советских людей убеждали в том что благодаря умелому руководству партии и Сталина страна сделала небывалые успехи в построении социализма что эти успехи могли бы быть еще больше если бы не подрывная деятельность бесчисленных врагов. В общественное сознание внедряется идея торжества марксизмаленинизма олицетворением которого стала личность Сталина....
31036. СССР в годы перестройки (1985 1991 гг.) 267 KB
  Подобная смена власти еще более подрывала авторитет и доверие к ее представителям не только со стороны граждан СССР но и мирового общественного мнения. Холодная война нанесла удар по идее естественных союзников выдвинув на первый план в США концепцию империи зла в СССР тезис о кровавом империализме . С периодом холодной войны совпало существование биполярной структуры СССР США которая привела к соперничеству двух стран и непрерывной гонке вооружений. Продолжавшаяся гонка вооружений не только изматывала экономику СССР но и подрывала...
31037. СТОРОННИКИ ПЕРЕСТРОЙКИ ПРАВЫЕ РЕФОРМАТОРЫ ВЫСТУПАВШИЕ ЗА РЕФОРМЫ, НО НЕ В ГОРБАЧЕВСКОМ ВАРИАНТЕ 52.5 KB
  АЛЬТЕРНАТИВЫ ПОЛОГЕТЫ СТАРОЙ ПОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ БЕЗ ВСЯКИХ РЕФОРМ СТОРОННИКИ ПЕРЕСТРОЙКИ ПРАВЫЕ РЕФОРМАТОРЫ ВЫСТУПАВШИЕ ЗА РЕФОРМЫ НО НЕ В ГОРБАЧЕВСКОМ ВАРИАНТЕ Полозков Чебриков Валентин Зорин глава ВС СССР Лукьянов член Политбюро Шенин а также члены ГКЧП Горбачев Яковлев Рыжков и др. СССР в годы Перестройки. ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Перестройка – это политикоэкономический и социальный курс на реформирование тоталитарной системы в СССР проводимый руководством КПСС во главе с М. Горбачёвым во второй половине 1980х в СССР и...
31038. Внешняя политика СССР в годы Перестройки 48.5 KB
  Внешняя политика СССР в годы Перестройки ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Холодная война – геополитическая экономическая и идеологическая конфронтация между странами первого капиталистического лагеря и второго социалистического лагеря мира и их союзниками длившаяся с середины 1940х гг. до развала СССР. и характеризующегося отказом от удержания любой ценой в сфере своего влияния восточноевропейских и иных зависимых от СССР стран. ПЕРСОНАЛИИ: ШЕВАРДНАДЗЕ Эдуард Амвросиевич – член Политбюро ЦК КПСС и по совместительству Министр иностранных дел СССР в...