1732

Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов

Диссертация

Биология и генетика

Синтез и исследование магнитосорбционных органокремнеземных материалов с иммобилизованными биологически активными лигандами. Способы получения антигенов чумы, выделения специфических иммуноглобулинов, получения иммунопероксидазных коньюгатов и их контроль. Применение магнитных иммуносорбентов для диагностики особо опасных инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей.

Русский

2013-01-06

994.91 KB

28 чел.

Министерство здравоохранения Российской Федерации 
 
Федеральное государственное учреждение науки 
 
Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт 
 
 
 

На правах рукописи 
 
 
 

Грядских Диана Анатольевна 
 
 

Синтез композиционных аффинных сорбентов с 
магнитными свойствами и их технологическое 
использование при изготовлении чумных 
иммунобиологических препаратов 
 
 

специальность 03.00.23 – биотехнология 
 
 
 

ДИССЕРТАЦИЯ 
на соискание ученой степени кандидата биологических наук 
 
 
 
 
 

Научный руководитель: 
доктор медицинских наук, 
профессор Тюменцева И.С. 
 
 
 
 
 
 
 

Ставрополь - 2004  

Оглавление 
 
 
 
 
 
 
 
Стр. 
ВВЕДЕНИЕ 
ГЛАВА 1. Обзор литературы 
1.1.  Синтез  и  исследование  магнитосорбционных  органокрем-
неземных материалов с иммобилизованными биологически 
активными лигандами……………………................................                
1.2.  Строение  и  свойства  хитозана,  как  перспективного  компо-
нента  для  синтеза  композиционных  сорбентов,  и  медико-
биологические аспекты его применения                                             
1.3. Культивирование микроорганизмов с применением методов 
их иммобилизации на сорбентах  
1.4. Применение магнитных иммуносорбентов для диагностики 
особо опасных инфекционных заболеваний и индикации их 
возбудителей  
 
ГЛАВА 2. Материалы и методы 
2.1 Характеристики используемых штаммов микроорганизмов 
2.2. Характеристика лабораторных животных 
2.3.Способы 
получения 
антигенов 
чумы, 
выделения 
специфических 
иммуноглобулинов, 
получения 
иммунопероксидазных коньюгатов и их контроль  
2.4.  Материалы  для  синтеза  композиционных  кремнеземных 
сорбентов и физико-химические методы их исследования  
2.4.1. Химический анализ элементоксидных слоев сорбентов 
2.4.2. Физико-химические методы исследования  
2.5. Сублимация биопрепаратов 
2.6. Статистическая обработка результатов исследования  

ГЛАВА 3. Синтез  композиционных  магноиммуносорбентов 
и исследование их свойств 
3.1.  Синтез  хитозанкремнеземных  и  элементосодержащих 
композиционных магносорбентов 
3.2.  Химическое  модифицирование  поверхности  компози- 
ционных магносорбентов функциональными группами 
3.3.  Получение  магноиммуносорбентов  и  иммобилизация 
специфических 
иммуноглобулинов 
на 
поверхности 
сорбента  
        
 
ГЛАВА 4. Использование 
магнитоуправляемых 
иммобилизован-ных 
систем 
для 
глубинного 
культивирования вакцинного штамма чумного микроба  
4.1.Глубинное 
культивирование 
чумного 
микроба, 
иммобилизованного на магнитных носителях 
4.2.Изучение  свойств  чумной  живой  сухой  вакцины, 
выращенной с помощью иммобилизованного инокулята  
4.3. Получение капсульного антигена (Ф1) чумного микроба  
 
ГЛАВА 5. Иммуноферментные 
тест-системы 
для 
диагностики чумы и индикации ее возбудителя 
Заключение 
Выводы 
 
Список использованных источников 
 
Приложения 
 

Перечень сокращений 
Аг  

антиген 
Ат  

антитело 
БСА  
-  бычий сывороточный альбумин 
ДЭО - 
деструкционно-эпитаксиальное осаждение 
ЗФР  
- забуференный физиологический раствор 
ИФА - 
иммуноферментный анализ 
Ig  

иммуноглобулины 
КИФА - 
количественный иммуноферментный анализ 
КМИС - 
композиционные магноиммуносорбенты 
КМС - 
композиционные магносорбенты 
МИС - 
магноиммуносорбент 
МКА - 
моноклональные антитела 
МС  
- магносорбент 
НРИФ - 
реакция непрямой иммунофлуоресценции 
ПЦР - 
полимеразная цепная реакция 
ПЭГ  
-  полиэтиленглюколь 
РНГА - 
реакция непрямой  гемаггютинации 
РА  
- реакция агглютинации 
РИА - 
радиоиммунный анализ 
РИД  
-  реакция иммунодиффузии 
РИФ - 
реакция иммунофлуоресценции 
ФС  
- фармакопейная статья 
ФСБ - 
фосфатно-солевой буфер 
ФХКС - 
феррохитозанкремнеземный сорбент 
ХЛИА - 
хемилюминесцентный иммунный анализ 
ХКС - 
хитозанкремнеземный сорбент 
ЭФСП - 
электрофорез в свободном потоке 
 
 

ГЛАВА 1. Обзор литературы 
1.1.  Синтез  и  исследования  магнитосорбционных  органокремнеземных 
материалов с иммобилизованными биологически активными лигандами 
 
Контакт  различных  биообьектов  окружающего  мира  с  кремнеземами, 
его  активное  участие  в  жизненных  процессах  обосновывают  определенный 
интерес для применения различных видов кремнеземов в биологии, медици-
не,  сельском  хозяйстве,  биотехнологии  (М.Г.  Воронков,  Г.И.  Зельчан,  Э.Я. 
Луковец, 1978; Р.  Айлер, 1982; Г.Д.  Лисичкин, 1989; А.В.  Брыкалов, 1991; 
А.В.  Брыкалов, 1993; А.В.  Брыкалов,  И.В.  Жарникова,  И.С.  Тюменцева, 
1995).  
Медико-биологические  аспекты  применения  кремнеземов  в  качестве 
сорбентов  с  широким  спектром  действия,  носителей  для  конструирования 
твердофазных диагностических тест-систем выдвигают задачи по детальному 
изучению  химии  их  поверхности  для  выявления  наиболее  существенных 
факторов,  которые  определяют  особенности  иммобилизации  биологических 
объектов  на  поверхности  и  влияют  на  их  активность,  а  также  поиска  путей 
целенаправленного модифицирования полезных функций кремнеземов. С це-
лью  понимания  характера  взаимодействия  поверхности  сорбентов  с  актив-
ными  биологическими  веществами:  антителами,  антигенами,  лекарственны-
ми  препаратами,  элементами  крови,  продуктами  метаболизма,  микроорга-
низмами  необходима  достоверная  информация  о  строении  поверхностного  
слоя кремнезема, его гидроксильных группах, природе активных центров по-
верхности,  механизмах  адсорбционных  и  хемосорбционных  процессов,  эф-
фектах структурной перестройки их поверхности при внешних воздействиях. 
В  биотехнологии  для  получения  иммобилизованных  биологически  ак-
тивных веществ широко применяются различные виды кремнеземов, которые 
по сравнению с органическими носителями имеют известные преимущества 
(В.Б.  Алесковский, 1976; В.Б.  Алесковский, 1978; Г.Д.  Лисичкин, 1989; 
Ф.Ходж, 1989). 

 
2
Силикагель,  аэросил,  пористые  стекла  и  силохромы  относятся  к  сор-
бентам на основе кремнеземов. 
Силикагель  является  продуктом  поликонденсации  ортокремневой  ки-
слоты,  которая  образуется  из  силиката  натрия  при  его  обработке  водными 
растворами кислот (С.И. Кольцов, В.Б. Алесковский, 1953). Силикагель так-
же получают в процессе гидролиза эфиров кремневой кислоты (В.Г.Березкин, 
В.П. Похомов, К.И. Сакадынский, 1975). С целью увеличения размера пор в 
структуре силикагеля его подвергают гидротермальной обработке в автокла-
ве при различных температурах и давлении водяного пара. Удельная поверх-
ность и размеры частиц получаемых силикагелей зависят от рН, температу-
ры,  концентрации  реагентов,  режимов  сушки  и  условий  термической  обра-
ботки.  Силикагель  имеет  глобулярную  структуру  (А.П.  Карнаухов, 1971) и 
таким образом представляет собой комплекс сферических частиц, от размера 
и плотности, упаковки которых зависит величина его удельной поверхности, 
объема пор и их размеров. 
Аэросил – пирогенная  форма  двуокиси  кремния.  Его  получают  в  ре-
зультате  высокотемпературного  парофазного  гидролиза  четыреххлористого 
кремния  в  токе  кислорода,  с  последующей  конденсацией  в  парах  воды 
(Н.К.Бебрис, А.В. Киселев, Ю.С. Никитин, 1967). Методом ядерного магнит-
ного резонанса показано, что объемная фаза аэросила представлена в равной 
степени  структурными  мотивами  кварца  и  кристобалита  (Г.Д.  Лисичкин, 
1989). 
Наибольшей  химической  однородностью  с  силикагелем,  аэросилами 
обладают аэросилогели, получаемые спеканием частиц непористого  высоко-
дисперсного диоксида кремния – аэросила (А.В. Киселев, В.М. Лукьянович, 
Ю.С. Никитин, 1969; А.В. Киселев, В.И. Лыгин, 1972; Г.Д.Лисичкин, 1989.).  
Данные сорбенты имеют достаточно крупные поры. Проводя их термообра-
ботку, добиваются получения сорбентов с узким распределением пор по раз-
мерам. 

 
3
В  работе  (К.  Оккерс, 1973) представлены  данные  исследований  непо-
ристого  кремнезема – полисорба,  глобулы  которого,  по  мнению  авторов, – 
это мелкие сферические частицы. По данным совмещенного ИК -  спектраль-
ного и гравиметрического анализа,  сделан вывод о преобладании на поверх-
ности  полисорба  изолированных  гидроксилов,  сравнительно  равномерно 
расположенных на расстоянии 0,6–0,7нм. 
Пористые стекла – особая форма аморфного кремнезема. Образование 
пористых стекол является следствием химических и структурных превраще-
ний, происходящих в силикатных стеклах при взаимодействии с растворами 
кислот (В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвили, 1988).  В результате выщелачива-
ния щелочносиликатных стекол по такому механизму в продуктах образуют-
ся полости, размеры которых сопоставимы с размерами катионов,  присутст-
вующих в исходном стекле, а  общий объем таких полостей находится в пря-
мой зависимости от содержания щелочного оксида в стекле. 
В  работе  авторов  (И.К.  Бебрис,  А.В.  Киселев,  Ю.С.  Никитин, 1967)  
предложен  способ  получения  синтетических  макропористых  кремнеземов – 
силохромов,  представляющих  собой  продукты  гелеобразования  водных 
суспензий 
аэросила. 
Данные 
 
адсорбенты 
без 
дополнительной 
гидротермальной обработки имеют крупные поры, однако распределение пор 
по  размерам  у  них  весьма  широкое  и  с  целью  получения  на  их  основе 
адсорбентов  с  узким  распределением  пор  проводят    термообработку  при 
1073– 1137 К.  Поскольку  силохромы,  выпускаемые  отечественной 
промышленностью,  имеют  развитую  поверхность  и  размеры  пор,  которые 
достаточны  для  проникновения  большинства  биополимеров,  то  это  и 
определяет  целесообразность  синтеза  на  их  основе  адсорбентов  для 
аффинной хроматографии, носителей для твердофазных тест–систем. 
Таким  образом,  широкий  набор  кремнеземов  с  регулируемыми  струк-
турными характеристиками позволяет подобрать материал для  адсорбцион-
ных процессов, обеспечивающий оптимальную площадь контакта адсорбента 
с разделяемыми компонентами. Применяя однородномакропористые кремне-

 
4
земы,  можно  достичь  одинаковой  степени  взаимодействия  молекул  сорбата 
со всей поверхностью адсорбента. 
Для  выяснения  особенностей  поверхностной  структуры  кремнеземов 
проведено  большое  число  исследований  (С.И.  Кольцов, 1965; И.К.  Бебриc, 
А.В. Киселев, Ю.С. Никитин, 1967; Б.Н. Ласкорин, В.В. Стрелко, Д.Н. Стра-
жеско и др., 1977), что дало возможность получить ответы на важные вопро-
сы,  связанные  со  строением  гидроксильных  групп  кремнеземов  (А.В.  Кисе-
лев,  В.И.  Лыгин, 1972; Б.Н.  Ласкорин,  В.В.  Стрелко,  Д.Н.  Стражеско  и  др., 
1977),  их  распределением    (А.В.  Киселев,  В.И.  Лыгин, 1972; В.А.  Тертых, 
В.В. Павлов, И.К. Ткаченко, 1975) и активностью (С.И. Кольцов, 1965; А.В. 
Киселев, В.И. Лыгин, 1972; В.А. Тертых, В.В. Павлов, И.К. Ткаченко, 1975; 
Б.Н.  Ласкорин,  В.В.  Стрелко,  Д.Н.  Стражеско  и  др., 1977). На  поверхности 
кремнезема в различных соотношениях может находиться 5 видов групп:  1) 
свободные,  отдельно  стоящие – ОН  группы; 2) физически  связанная  вода – 
молекулы  воды,  имеющие  водородные  связи    с  силанольными  группами; 3) 
дегидратированные  оксиды – силоксановые  группы; 4) геминальные  гидро-
ксилы,  связанные  с  одним  атомом  кремния; 5) вицинальные  гидроксильные 
группы, связанные друг с другом водородной связью (Ю.П. Айлер, Е.В. Ма-
карова, 1976). 
Научно-практический  интерес  к  изучению  поверхностного  слоя  крем-
неземов  объясняется  тем,  что  гидроксильные  группы  способны  вступать  в 
различные  химические  реакции,  которые  позволяют  регулировать  химиче-
скую природу поверхностных атомов, что приводит к получению адсорбентов 
заданного состава и строения. 
Химические реакции на поверхности кремнеземов широко применяют-
ся для синтеза модифицированных адсорбентов. 
В  настоящее  время  на  поверхности  кремнеземов  осуществлено  боль-
шое число химических превращений, которые предложено разделить по меха-
низму на два класса. 

 
5
Выделяют  большую  группу  реакций,  относящихся  к  первому  классу, 
протекающих  с  процессом  замещения  протона  поверхностной  силанольной 
группы  такими  электрофильными  реагентами,  как  хлоралкоксисиланы,  эле-
ментоорганические соединения, галогениды металлов. На основании экспери-
ментальных  исследований  воздействия  различных  алкилхлорсиланов  с  крем-
неземом (С.И. Кольцов, Г.Н. Кузнецова, В.Б. Алесковский, 1967) установлено, 
что  реакционная  способность  гидроксильных  групп  в  реакциях  электрофиль-
ного  замещения протона определяется эффективным положительным зарядом 
на центральном атоме атакующей молекулы, а также величиной нуклеофиль-
ного содействия со стороны уходящей группы. 
Ко второму классу реакций с поверхностью кремнеземов относятся ре-
акции  нуклеофильного  замещения  гидроксильных  групп  и  реакции  нуклео-
фильного  присоединения  при  расщеплении  связи  у  поверхностного  кремния 
анионами галогенидов и спиртами. Как  указано в работах (А.В. Киселев, В.И. 
Лыгин, 1972; В.А. Тертых, В.В. Павлов, К.И. Ткаченко, 1975), механизм нук-
леофильного  замещения  включает  стадию  образования  промежуточного  цик-
лического комплекса,  последующее перераспределение связей в котором при-
водит к конечному продукту реакции. По мнению авторов (В.В. Стрелко, В.А. 
Каниболицкий, 1971), образование промежуточного комплекса энергетически 
выгодно,  так  как  сводит  к  минимуму  пространственное  разделение  зарядов 
при вытеснении уходящей группы. 
Существуют  химические  реакции  на  поверхности  кремнеземов,  на-
чальная стадия  которых протекает по механизму электрофильного замещения 
протона  в силанольной группе, а затем  образующиеся соединения  претерпе-
вают  перегруппировки,  соответствующие  процессу  нуклеофильного  замеще-
ния у атома кремния. К таким реакциям относят взаимодействие дисперсных 
кремнеземов  с  хлористым  тионилом  (В.В.  Павлов,  В.А.  Тертых,  А.А.  Чуйко, 
1976). 
При взаимодействии гидроксильных групп с алкоксисиланами возмож-
но протекание реакции конденсации с выделением спирта. Эксперименталь-

 
6
но подтверждено (А.А. Чуйко, Г.С. Павлик, 1963; W. Hertl, 1968) по исследо-
ванию кинетики и механизма реакции  моно–,  ди–  и триметоксисиланов (W. 
Hertl, 1968), γ – аминопропилтриэтоксисилана (В.А. Тертых, А.А. Чуйко, И.Е. 
Неймарк, 1965; И.Е. Неймарк, 1982) с кремнеземной поверхностью методом 
ИК–спектроскопии.  Взаимодействие  γ – аминопропилтриэтоксисилана  с  по-
верхностью кремнезема в значительной мере зависит от условий среды, тем-
пературы реакции и структурных особенностей кремнеземного адсорбента. В 
работе (W.D. Bascom, R.V. Timons, 1972) было установлено, что адсорбиро-
ванная  поверхностью  кремнезема  вода  (А.А.Чуйко,  В.А.  Тертых,  Г.Е.  Пав-
лик, 1965; В.А. Тертых, А.А. Чуйко, А.А. Агзамходжаев, 1968; W.D. Bascom, 
R.V. Timons, 1972) способствует ускорению гидролиза молекул алкоксисила-
нов, значительно усложняет процесс протекания реакции и приводит к поли-
меризации алкоксисиланов. В неводных растворах γ – аминопропилтриэток-
сисилана, а также при обработке его парами аэросила при 373–398 К в основ-
ном  осуществляется  химическая  реакция  с  участием  гидроксильных  групп 
кремнезема. 
Аминокремнеземы являются промежуточными продуктами для синтеза 
биоспецифических адсорбентов методом химической сборки. Для химическо-
го превращения аминогрупп, находящихся в поверхностном слое кремнезема, 
в альдегидные носители обрабатывают глутаровым альдегидом (С.В. Рогожин, 
В.Ю. Варламов, Д.Г. Вальковский, 1975). 
Данный  способ  основан  на  способности  аминогрупп  образовывать  с 
карбонильными  соединениями  азометиновые  связи  и  отличается    простотой. 
Однако, поскольку глутарового альдегида практически не существует в моно-
мерном виде (P.I. Robinson, P. Dunmill, 1971; P. Monson, 1978), это приводит к 
неконтролируемости и ненаправленности синтеза в поверхностном слое крем-
незема. Имеющиеся в составе адсорбента альдегидные группы способны всту-
пать в химическую реакцию с аминогруппами селективных лигандов, макро-
молекул биополимеров, ферментов (Н.М. Самошин, Л.Т. Мотина, Л.И. Мере-
щенко, 1978; А.П. Синицин, А.И. Клибанов, 1978). 

 
7
Для  синтеза  поверхностных  карбоксильных  групп  аминосодержащие 
кремнеземы  обычно  модифицируют  ангидридами  кислот  (Р.А.  Жакот,  А.С. 
Корсакевич, 1977; А.П. Синицин, А.И. Клибанов, 1978). 
Для  активации  аминосодержащих  носителей  используются  производ-
ные галоидалкилов. Введенный на поверхность адсорбентов галоидалкил спо-
собен алкилировать молекулы белков по аминогруппам, имидазольному коль-
цу, фенильному гидроксилу и сульфгидрильным группам (В. Ульянсон, 1978).  
К такому же типу химического модифицирования аминокремнеземов следует 
отнести  активирование  их  хлористым  циануром  (В.В.  Янишпольский,  В.А. 
Тертых,  А.А.  Чуйко, 1977; А.В.  Богатский,  Т.И.  Доведенко,  А.В.  Чуенко, 
1979). 
Широкие  синтетические  возможности  представляет  использование 
кремнеземов,  модифицированных  эпоксигруппами.  Сорбенты,  полученные 
обработкой  кремнезема  β – глицидоксипропилтриалкоксисиланами  с  после-
дующей реакцией,  способны раскрывать эпоксицикл. Эпоксицикл  на поверх-
ности  кремнеземов  в  слабокислой  среде  легко  превращается  в  гликоль.  Этот 
сорбент  и  его  производные  находят  широкое  применение  в  хроматографии 
биополимеров в связи с отсутствием неспецифической адсорбции белков (Г.Д. 
Лисичкин, 1989). 
К  достоинствам  метода  ковалентного  связывания  кремнийорганиче-
ских  соединений  на  поверхности  кремнеземов  относится  возможность  полу-
чения  полифункциональных  соединений.  Наиболее  часто  необходимость  в 
таких адсорбентах возникает при выделении биополимеров, когда применение 
только  одного  варианта  разделения  (например,  обращенофазового  или  ионо-
обменного) не позволяет достичь требуемой селективности. Для решения по-
ставленной задачи поверхность носителей модифицируют смесью кремнийор-
ганических  соединений  и  варьированием  количества  исходных  компонентов, 
чем  добиваются  оптимальных  вкладов  «гидрофобного»  и  ионообменного 
взаимодействия  в  процессе  разделения  белков.  Альтернативным  способом 
варьирования вклада «гидрофобных» и ионообменных взаимодействий в хро-

 
8
матографическом разделении является изменение длины углеродной цепи но-
сителя. Данный метод характеризуется большой воспроизводимостью, однако, 
необходимость  специально  синтезировать  набор  кремнийорганических  моди-
фикаторов ограничивается его применением (Г.Д. Лисичкин, 1989). 
Перспективным  методом,  позволяющим  направлено  изменять  реакци-
онную способность поверхности адсорбентов и получать  материалы с задан-
ными  химическим  составом  и  строением,  является  метод  молекулярного  на-
слаивания  (В.Б.  Алесковский, 1976; А.А.  Малыгин, 1986). Молекулярное  на-
слаивание было проведено для целого ряда веществ, в том числе с хлоридами 
германия, олова, алюминия, циркония, железа, фосфора, оксихлоридами вана-
дия и хрома (В.И. Ковальков, Е.П. Смирнов, С.И. Кольцов, 1976; А.А. Малы-
гин, 1979; А.М. Поснова, В.Н. Пак, С.И. Кольцов, 1981). 
Методом  молекулярного  наслаивания  достигнуты  возможности  регу-
лирования  физико-химических  свойств  твердых  веществ,  таких  как  кислот-
ность  (С.И.  Кольцов,  В.М.  Смирнов,  В.Б.  Алесковский, 1970; В.Н.  Пак,  С.И. 
Кольцов, В.Б. Алесковский, 1976), каталитическая активность (С.И. Кольцов,  
В.М.  Смирнов,  В.Б.  Алесковский, 1970; С.И.  Кольцов,  В.М.  Смирнов,  В.Б. 
Алесковский, 1973), изменение реакционной способности привитых функцио-
нальных органических групп (В.Н. Паснов, 1983), селективность биоспецифи-
ческих  сорбентов  и  активность  ферментов  в  иммобилизованном  состоянии 
(В.Н. Паснов, 1983). 
Для практических целей медицины, биотехнологии важное значение в 
настоящее  время  приобретают  композиционные  сорбенты,  содержащие  в  ка-
честве  основного  компонента  кремнезем.  В  работе  (А.В.  Брыкалов, 1993) 
предложено  классифицировать  данные  сорбционные  материалы  на  четыре 
группы. 
Первая группа включает способы получения сорбентов, основанные на 
адсорбции или хемосорбции полимеров из растворов на поверхности кремне-
земов,  имеющих  определенные  структурные  характеристики  (Н.Т.  Брык, 
1981). 

 
9
Вторая группа включает способы получения сорбентов, заключающие-
ся в радикальной или ионной полимеризации мономеров в присутствии крем-
неземного носителя (Г.В. Кудрявцев, С.М. Староверов, 1989). 
Третье  направление  основано  на  поликонденсации  кремнийорганиче-
ских соединений с целью получения объемномодифицированных композици-
онных  сорбционных  материалов  (В.Б.  Алесковский,  А.Я.  Юффа,  1989;           
Ф. Ходж, 1989). 
Четвертое  направление  основано  на  получении  композиционных  сор-
бентов  химической  сборкой структурных  единиц  методом  формирования  по-
ристой структуры кремнеземной матрицы в присутствии полимеров и высоко-
селективных лигандов (А.В. Брыкалов, 1993). 
Достоинство первого способа заключается в его простоте, однако, воз-
никает сложность с регулированием толщины полимерного покрытия и, кроме 
того,  подобные  сорбенты  отличаются  нестабильностью  при  многократном 
использовании,  поскольку  возможна  десорбция  полимера  с  поверхности 
кремнезема. К недостаткам композиционных сорбентов, получаемых методом 
прививочной  полимеризации,  нужно  отнести  нестандартность  их  состава  и 
физико-химических свойств, в связи с тем, что как линейные и разветвленные 
макромолекулы,  так  и  трехмерные  частицы  сшитого  геля  способны  адсорби-
роваться на поверхности кремнезема во время синтеза. 
Четвертое  направление  синтеза  композиционных  сорбентов  позволяет 
направленно создавать заданную геометрическую структуру сорбента, а также 
осуществить  активирование  поверхности  модификатором  органической  при-
роды.  В  результате  исследований  (А.В.  Брыкалов, 1991; А.В.  Брыкалов,  И.В. 
Жарникова, И.С. Тюменцева, 1995; А.В. Брыкалов, О.В. Воробьева, 1996; А.В. 
Брыкалов, О.В. Воробьева, В.Д. Пасечников, 1996) получены стандартные по 
составу и структуре высокостабильные сорбенты, специфичные для ряда био-
логически  активных  веществ  (лизоцим,  хорионический  гонадотропин,  гемо-
глобин). Данные материалы эффективны для иммобилизации ферментов, при-
меняемых в биотехнологии, медицине, пищевой промышленности (А.В. Бры-

 
10
калов, И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева, 1995; А.В. Брыкалов, О.В. Воробье-
ва, 1996; А.В. Брыкалов, О.В. Воробьева, В.Д. Пасечников, 1996). 
Ниже  приведены  примеры  конкретных  исследований  по  разработке  и 
применению композиционных сорбентов по четырем указанным направлени-
ям. 
Для получения носителей при конструировании диагностических тест–
систем известны разработанные технологии, в основе которых синтез компо-
зиционных  сорбентов,  содержащих  в  качестве  биосовместимых  полимеров 
декстран, поливиниловый спирт, N – поливинилпирролидон. 
Перспективным  биосовместимым  полимером  в  составе  композицион-
ных сорбентов является хитозан. Медицинские аспекты применения препара-
тов на основе хитозана связаны с биологическими свойствами данного биопо-
лимера,  имеющего  природное  происхождение  и  известную  химическую 
структуру.  Он  биосовместим  и  биоразрушаем  до  обычных  для  организма  ве-
ществ (N – ацетилглюкозамин  или  глюкозамин),  обладает  иммуномодули-
рующим,  адьювантным,  противомикробным,  фунгистатическим,  противоопу-
холевым, радиозащитным, противовоспалительным, ранозаживляющим, анти-
холестерическим, гемостатическим действием и при этом обладает малой ток-
сичностью  (К.Д.  Жогелев, 2000; К.Д.  Жогелев,  В.Ю.  Никитин,  В.Н.  Цыган, 
2001). 
Хитозан – полностью дезацетилированный продукт – поли [(1-4) – 2 – 
амино – 2  – дезокси –    –Д – глюкозы]. Обычно полного дезацетилирования 
не  достигается,  и  в  состав  хитозана  входит  небольшое  количество N – аце-
тилглюкозамидных звеньев.  
Методом ИК– спектроскопии установлено, что в процессе образования 
хитозана  уменьшается  интенсивность  полос  поглощения  карбонила    
(1625см-1)  амидной  группы (3265 и 31100 см-1)  и  нарастает  интенсивность 
полос при 3365 и 3445 см-1, что свидетельствует о появлении NH2 – группы    
(К.Д. Жогелев, 2000). Рентгеновские исследования хитозана показывают, что 
и он имеет ту же кристаллическую решетку, что и хитин, но меньшую  упо-

 
11
рядоченность макромолекул. Хитозан, регенерированный в виде пленки в со-
левой или основной форме, имеет рентгенограмму, характерную для аморф-
ных веществ.  
Хитозан, в отличие от хитина, растворим в разбавленных растворах ки-
слот, из которых он может быть выделен без изменения. Следовательно, хи-
тозан может быть охарактеризован по вязкости и полидисперсности. В рабо-
те (К.Д. Жогелев, 2000) показано, что раствор солянокислого хитозана обла-
дает структурной вязкостью. Также с помощью рентгеноструктурного анали-
за исследованы некоторые соли хитозана неорганических и органических ки-
слот.  Установлено,  что  молекула  хитозана  принимает  двух–,  либо  восьми-
складчатые спиральные конформации в зависимости от кислот. Соли, в кото-
рых цепь хитозана присутствует в виде двухскладчатой спирали, образуются 
кислотами -  HBr, HI, HNO3, D- и    L-аскорбиновыми  кислотами.  Восьми-
складчатые спирали полимера образуются с HF, HCI, H2SO4, CH3COOH. 
Исследования конформационного поведения кристаллического хитоза-
на в виде ацетатной соли свидетельствуют о существовании четырех гидра-
тированных  и  одной  безводной  форм (A. Yamamoto, I. Kawada, T.  Yui,          
K. Oqawa, 1997). 
Аминная группа сообщает хитозану полиэлектролитные свойства. При 
исследовании хитозана с молекулярной массой Мw=200000 (согласно данным 
светорассеяния), степенью дезацетилирования 0,8 и степенью кристаллично-
сти 75% (Г.М. Тюпенко, Е.Е. Скорикова, А.Б. Зенин, 2001), установлено, что 
благодаря большому количеству аминогрупп в его макромолекулах, хитозан 
хорошо растворим в водных растворах разбавленных кислот, в которых ведет 
себя  как  типичный  поликатион.  Подобно  другим  поликатионам  способен 
взаимодействовать с отрицательно заряженными полианионами, образуя ин-
терполиэлектролитные  комплексы  (Г.М.  Тюпенко,  Е.Е.  Скорикова,  А.Б.  Зе-
нин, 2001). Интерполиэлектролитные  реакции  между  противоположно  заря-
женными полиионами в водных растворах являются кооперативными и пол-
ностью обратимы. 

 
12
Выделены  два  типа  участков  в  комплексах:  упорядоченные  участки, 
образованные  противоположно  заряженными  звеньями  обоих  полиэлектро-
литов,  связанных  друг  с  другом  (А),  которые  чередуются  с  дефектами  или 
петлями,  образованными последовательностями  разобщенных звеньев поли-
электролитов  (В).  Благодаря  наличию  гидрофильных  звеньев  в  дефектных 
участках  (В),  интерполиэлектролитные  комплексы  набухают  в  воде.  Гидро-
фобные упорядоченные участки (А) ограничивают способность к набуханию 
и обуславливают их нерастворимость в воде. 
Все  свойства  интерполиэлектролитных  комплексов    также  присущи 
комплексам на основе хитозана (Г.М. Тюпенко, Е.Е. Скорикова, А.Б. Зенин, 
2001; K. Oqawa, Ibukai, 1987). По данным авторов (Г.М. Тюпенко, Е.Е. Ско-
рикова,  А.Б.  Зенин, 2001), комплекс  хитозана  и    полиакриловой  кислоты 
устойчив  в  водных  средах  в  интервале  рН 5-8, хорошо  набухает  в  воде, 
образуя  гидрогели,  которые  используются  в  качестве  тромборезистентных 
материалов.  В  водных  средах  гидрогели  сохраняют  высокую  механическую 
прочность,  стабильность,  эластичность,  поэтому  мембраны,  полученные  из  
них, не нуждаются в дополнительном упрочнении средствами химической и 
физической модификации. 
Наличие  в  структурных  звеньях  хитозана  двух  гидроксильных  и  пер-
вичной аминогруппы расширяет возможности его модификации. Особый ин-
терес при синтезе производных хитозана представляет получение направлен-
ных замещенных соединений (синтез О – или N – производных). 
В  работе  Е.А.Плиско  и  др. (Е.А.  Плиско,  Л.А.  Нудьга,  С.Н.  Данилов, 
1977)  проведено  сульфирование  хитозана  смесью  серного  и  сернистого  ан-
гидридов при температуре кипения смеси. Полученный эфир содержал 14,8% 
серы и обладал  антикоагуляционной активностью. Для получения N – суль-
фохитозана,  содержащего  одну    сульфаматную  группу  на  каждую  глюкоза-
минную  единицу,  использовали  пиридин – серный  ангидрид  в  водно – ще-
лочной среде при рН 9-10. При последующей обработке N – сульфохитозана 
смесью  сернистого  и  серного  ангидрида  на  холоду  было  произведено  О–

 
13
сульфирование (замещалось 75% гидроксильных групп). По результатам ис-
следований  установлено  отсутствие  антикоагуляционного  действия  у N– 
производного и высокая активность у  О, N – производного хитозана. 
Ацетилирование  хитозана  осуществляли  уксусным  ангидридом  (А.В. 
Ильин, В.П. Варламов, 2001).  Были получены образцы с различной степенью 
ацетилирования.  Показано,  что  с  увеличением  степени  ацетилирования  ха-
рактеристическая и динамическая вязкость уменьшаются на 40% и 66% соот-
ветственно. Конформация молекулы, а следовательно, и характеристическая 
вязкость заметно зависят от ионной силы и величины рН раствора. При дан-
ной  ионной  силе  и  кислых  значениях  рН  раствора  вытянутость  молекулы 
увеличивается  с  возрастанием  степени  ацетилирования,  что  обусловлено 
тенденцией к образованию водородных связей между ОН– группой в шестом 
положении одного гексозного звена с карбонилом в ацетамидной группе со-
седнего звена. Растворимость образцов хитозана при значении рН, близких к 
нейтральным (рН 5-8), увеличивается с возрастанием степени  ацетилирова-
ния (А.В. Ильин, В.П. Варламов, 2001). При рН 6,0  растворимость образцов 
хитозана увеличилась в 2-3 раза, при возрастании степени ацетилирования от 
0,15 до 0,75. 
Таким образом, проведенный анализ данных литературы по системати-
ческим  исследованиям  в  области  физико-химических  особенностей  поверх-
ности  дисперсных  кремнеземом  позволяет  выделить  единую  систему  пред-
ставлений  о  структуре  поверхностного  слоя,  природе  активных  центров, 
строении гидроксильного и гидратного покрова, механизмах адсорбционных 
и  хемосорбционных  процессов,  на  основе  которой  возможно  объяснение 
многочисленных  данных  по  рассматриваемой  проблеме  и  выяснение  общих 
принципов  фиксации  на  поверхности  кремнеземов  полярных  молекул,  что 
представляет собой важный этап в понимании закономерностей иммобилиза-
ции биологически активных соединений на  указанных носителях. 
Особое место в изучаемых проблемах принадлежит  химическому мо-
дифицированию  поверхности  кремнеземов  для  изменения  химического  со-

 
14
става  поверхностного  слоя  в  заданном  направлении.  Изменение  состава  по-
верхности сорбентов может осуществляться и в результате термического де-
гидроксилирования  поверхности  или  в  процессе  его  гидротермальной  обра-
ботки.  Однако  наибольшие  возможности  для  изменения  в  лучшую  сторону  
свойств кремнезема представляют прививки тех или иных химических групп 
в  результате  разнообразных  реакций  с  участием  центров  поверхности  (А.В. 
Брыкалов, 1993).  
Анализ данных литературы показывает, что в настоящее время усилия-
ми многих исследователей  разработано значительное число способов хими-
ческого  модифицирования  с  участием  поверхности  кремнеземов.  Как  спра-
ведливо отметил Бурвэл (R.R. Burwell, 1974), используемые при этом приемы 
часто напоминают органическую химию, чем неорганическую. Разнообразие 
реакций химического модифицирования поверхности кремнеземов связано с 
многосторонностью решаемых при этом важных практических задач. 
Закрепленные  на  поверхности  кремнеземов  химические  радикалы  с 
функциональными различными группами (– NH2 – COOH, – CH=CH2, – CN  
и др.) открывают перспективы в направлениях синтеза новых специфических 
сорбентов. 
Функциональные органокремнеземы после активации с помощью био-
функциональных  сшивающих  реагентов  широко  используются  для  иммоби-
лизации биологически активных веществ. Значительный прогресс достигнут 
в  последние  годы  при  создании  на  основе  модифицированных  кремнеземов 
высокоспецифичных биоспецифических сорбентов. Наконец, изменяя харак-
тер связи одного или нескольких лекарственных соединений с поверхностью 
модифицированного кремнезема, возможно получение соответствующих ап-
пликационных  сорбентов  с  пролонгированным  и  сочетанным  действием 
(C.G. Brine, P.R. Austin, 1974; L.Y. Lim, Khor, C.E. Ling, 1999 ). 
Применение кремнеземов в медико-биологическом направлении требу-
ет изучения механизмов их взаимодействия с теми или иными биоструктура-
ми, характеризующих специфической или неспецифической адсорбцией как 

 
15
биомакромолекул,  так  и  малых  неорганических  соединений,  присутствую-
щих в биосреде. В случае применения иммобилизованных биологически ак-
тивных  веществ  возникает  необходимость  теоретического  объяснения  осо-
бенностей взаимодействия с микроорганизмами не только белков, но и носи-
теля,  а  также  его  влияния  на  защитные  функции  организма,  поведение  кле-
точных  мембран.  Теория  адсорбции  хорошо  объясняет  экспериментальные 
данные по сорбции малых молекул веществ (T. Парфит, К. Рочестер, 1986), 
но  при  взаимодействии  биополимеров  с  твердым  телом  возникает  много 
трудностей  для  теоретической  интерпретации  данных (T. Парфит,  К.  Роче-
стер, 1986). В случае же взаимодействия дисперсных твердых тел с микроор-
ганизмами, задачи, стоящие перед теорией, усложняются в еще большей сте-
пени (Д.Г. Звягинцев, 1973; А.Б. Рубин, 1987). 
Практическое  использование  кремнеземов  в  медико-биологическом 
направлении  выдвигает  определенные  требования  к  соответствующим  фор-
мам препаратов. 
В  настоящее  время  широко  обсуждается  вопрос  о  критериях  оценки 
сорбентов  различного  назначения,  применяемых  в  медицинской  практике 
(гемо -, энтеросорбция) (Н.Т. Картель, Е.Д. Молюк, М.Е. Чудновский, 1988). 
Для сорбентов выдвинуты следующие требования: 
–  высокая  адсорбционная  емкость  в  отношении  широкого  спектра  
биологически активных веществ; 
–  атоксичность; 
–  отсутствие повреждающего действия  в отношении антител,  антиге-
нов; 
–  механическая прочность; 
–  легкость стерилизации; 
–  стабильность свойств при хранении; 
–  химическая инертность. 
На наш взгляд, в наибольшей степени  данным требованиям удовлетво-
ряют  кремнеземные  сорбенты.  Существующие  проблемы  связаны  с 

 
16
выбором видов кремнеземов, способами оптимального модифицирова-
ния их поверхности для иммобилизации специфических лигандов (ан-
тигенов, антител). 
 
 1.2. Строение и свойства хитозана, как перспективного компонента син-
теза  органокремнеземных  сорбентов,  и  медико-биологические  аспекты 
его применения 

 
К природным полимерам, которые составляют основу опорных, по-
кровных тканей и внешнего скелета  низших растений и животных относится 
хитин. По распространению в природе он считается вторым после целлюло-
зы полисахаридом и доступность хитина и его производного хитозана на по-
рядок выше других природных полисахаридов (P.R. Austin, C.G. Brine, I.E. 
Castle, I.P. Zikakis, 1981). Так, ежегодное доступное количество хитина из ра-
кообразных составляет 40 тысяч тонн,  из альгинатов – 25 тысяч тонн, а из 
ирландского мха – 12 тысяч тонн. 
Хитин относится к природным полимерам аминосахаров и представля-
ет собой гомополисахарид с неразветвленной цепью, 1,4 – соединенных 2–
ацетамидо–2–дезокси–Д–глюкозных остатков.  Впервые данный полисахарид 
был выделен из панциря майского жука французским ученым Одье в 1823 
году (A. Domard, 1966). Хитин имеет кристаллическое строение и при этом 
различают три взаимопревращающиеся друг в друга формы хитина: α – ;  β – 
; и  γ – хитин, каждая из которых обладает рядом индивидуальных свойств 
(R. Yackman, M. Goldberg, 1974).  
Хитин  образует  комплексы  с  природными  биологически  активными 
веществами –  протеинами, липидами, каротиноидами, солями. Доказано су-
ществование комплексов хитина с протеинами, которые чувствительны к рН 
среды,  при  рН 9 находятся  в  полностью  диссоциированном  состоянии      (B. 
Jirgensons,1958). Хитин нерастворим в воде, органических растворителях, не 
набухает в щелочных растворах (Y.Filar, M.C. Winick, 1977). Данный полиса-
харид характеризуется биологической активностью, устойчивостью к волок-

 
17
но-  и  пленкообразованию.  Однако  для  практического  применения  более 
ценным является хитозан, который растворим в разбавленных кислотах, что 
расширяет  возможности  его  практического  применения.  Хитозан  был  впер-
вые получен в 1859 году при обработке хитина горячим раствором гидрокси-
да натрия (A. Domard,1996). По химическому строению данный полисахарид 
представляет собой полимер с неразветвленной цепью β– 1–4  соединенных 
2–амино–2–дезокси–2 глюкозных остатков. 
Ряд ученых причисляет хитозан к семейству линейных бинарных гете-
рополисахаридов,  как  содержащий  остатки 2–ацетамид–2–дезокси–β–D – 
глюкозы (звено А) и 2–амино–2–дезокси–β–D –глюкозы (звено D) в различ-
ных  соотношениях,  соединенных  между  собой 1–4 гликозидными  связями. 
Доказано, что распределение звеньев А и D в водных растворах частично де-
ацетилированного  хитина  подчиняется  статистическому  закону  Бернулли. 
Связи  А–А  менее  прочны,  чем  А– D и  D  – D, и  подвержены  гидролизу  под 
воздействием ряда ферментов, например, лизоцима, выделенного из яичного 
белка.  Причем,  лизоцим  воздействует  специфично:  только  на 2 из 16 воз-
можных тетрад – А–А–А–А и  А–А–А– D, преимущественно посередине свя-
зи (Л.Ф. Горовой, 1999). 
Хитозан  нерастворим  в  воде,  слабых  и  концентрированных  растворах 
щелочей, органических растворителях. Растворяется хитозан в минеральных 
и  органических  кислотах.  Наличие  аминогруппы  придает  хитозану  интерес-
ные  функциональные  свойства (G. Kumar, P. Smith, G.F. Payne, 1999). При 
значении рН выше 7 аминогруппа депротонизирована, хитозан нерастворим в 
воде. 
Однако  в  этом  интервале  рН  аминогруппа  проявляет  нуклеофильные 
свойства,  и  неподеленная  электронная  пара  обуславливает  возможность  об-
разования  связей  с  противоположно  заряженными  группами  ряда  соедине-
ний,  в  том  числе  альдегидов,  некоторых  кислот,  ангидридов,  эпоксидных 
смол. На этом свойстве хитозана основано получение водорастворимых (при 
рН 7) производных хитозана, в том числе сукцината хитозана. 

 
18
При низких значениях рН (рКа<6.3) аминогруппа протонизирована, хи-
тозан  представляет  собой  катионный  водорастворимый  полиэлектролит.  В 
кислой  среде  хитозаны,  дезацетилированные  на 75% и  более,  растворяются 
быстро,  образуя  прозрачные,  гомогенные  и  вязкие  растворы.  Вязкость  рас-
творов хитозана является одним из важнейших его свойств и зависит от ряда 
факторов (G. Kumar, P. Smith, G.F. Payne, 1999).  Она  увеличивается  с 
уменьшением  температуры  дезацетилирования,  с  ростом  концентрации  и 
снижается с повышением температуры. Вязкость растворов хитозана в опре-
деленной степени зависит от вида объекта, из которого он выделен. Хитозан, 
полученный из ракообразных, образует в уксусной кислоте растворы вязко-
стью 340 сПз, а такой же раствор хитозана из отходов переработки креветок 
имеет вязкость 180–200 сПз (C.G. Brine, P.R. Austin, 1974). Вязкость раство-
ров хитозана зависит от условий проведения деминерализации. Наличие ми-
нерального остатка в хитозане обусловливается снижением скорости его рас-
творения. 
Хитозан, как и хитин, во всех случаях устойчив к γ– излучению и к ра-
диации. Как хитин, так и хитозан обладают высокой термической устойчиво-
стью. В Национальном Университете Сингапура проведены исследования по 
изучению  влияния  различных  режимов  тепловой  обработки  на  физические 
свойства хитозана (L.Y. Lim, Khor, C.E. Ling, 1999). Установлено, что изме-
нение его структуры возможно лишь при нагревании свыше 1700С, разруше-
ние при  t–2300С.  Нагревание до 800С приводит к некоторому снижению же-
сткости  связей,  что  влечет  за  собой  увеличение  растворимости  и  незначи-
тельное повышение кинематической вязкости растворов хитозана. Основные 
функциональные  свойства  сохраняются.  При  стерилизации  выше 1200С  и 
выдержке свыше 1 часа наблюдается растворимость хитозана и образование 
хромофоров,  вызывающих  изменение  окраски  от  желтой  до  коричневой  за 
счет межмолекулярных связей с участием NH2 – групп. Высокая термическая 
устойчивость полисахарида позволяет проводить не только пастеризацию, но 

 
19
и  стерилизацию  растворов  хитозана,  что  является  необходимым  условием 
при использовании его в качестве компонента фармацевтических препаратов. 
Благодаря  своей  химической  природе,  хитозан  способен  к  различным 
видам взаимодействия с образованием 4 основных типов связей: ионных, во-
дородных,  гидрофобных,  связей  по  типу  комплексообразования,  в  котором 
хитозан  выступает  в  роли  комплексообразователя.  Ионные  взаимодействия 
происходят за счет аминной группы. Поликатионный характер данного поли-
сахарида  открывает  широкие  перспективы  его  использования.  Абсолютное 
большинство  поверхностей  природных  объектов  заряжены  отрицательно. 
Поэтому, когда хитозан в катионной форме добавляется к водным растворам 
(дисперсиям)  минеральных,  органических  или  живых  объектов,  в  зависимо-
сти  от  концентрации  происходит  либо  флокуляция  (Т.М.  Сафронов,  Т.М. 
Бойцова, 1999), либо стабилизация частиц в водной среде. На этом механиз-
ме  основано,  в  частности,  выделение  живых  клеток  из  растворов  методом 
концентрирования  в  присутствии  хитозана  (Н.В.  Мельник,  Н.Д.  Скич-
ко,Е.А.Шубина,1999). 
Способность хитозана к комплексообразованию обусловлена наличием 
неподеленных электронных пар у атома азота и, в ряде случаев, связи обра-
зуются  за  счет  неподеленных  электронных  пар  атома  кислорода.  На  этом 
принципе  основано  образование  многочисленных  связей  хелатного  типа  с 
металлами. Хитозан способен образовывать указанные связи со многими ме-
таллами за исключением щелочных и щелочноземельных. Данный полисаха-
рид образует водородные и гидрофобные связи при взаимодействии с рядом 
органических веществ (A. Domard, 1966). 
Описанные  выше  особенности  строения  и  свойства  хитозана  свиде-
тельствуют  о  практическом  значении  данного  полимера,  а  широкое  распро-
странение в природе позволяет рассчитывать на значительную сырьевую ба-
зу промышленного значения (В.Е. Красавцев, 1999; С.В. Немцев, В.С. Божко, 
1999). 

 
20
Ведущую роль в мире по исследованиям хитозана и хитина,  производ-
ству данных полисахаридов занимает  Япония (В.П. Быков, 1999). Именно в 
Японии в 1972 году впервые в мире начато производство хитозана, которое к 
настоящему  времени  достигло  около 2000 тонн  в  год.  В  США  выпускается 
свыше 700 тонн хитозана в год, и по мнению американских экспертов, назы-
вающих хитозан «полимером XXI века”, мировой рынок продукции на осно-
ве хитозана в данном столетии будет носить глобальный характер (В.П. Вар-
ламов, 1999). 
Основным  потребителем  хитозана  (В.П.  Варламов, 1999) являются 
здравоохранение, на долю которого приходится до 65% производимого хито-
зана. Далее следует сельское хозяйство (12%), утилизация отходов и очистка 
сточных вод (7%),  пищевая промышленность (5%), косметическая промыш-
ленность (5%).   
В  настоящее  время  известно  более 70 направлений  использования  хи-
тина  и  хитозана  и  их  производных  в различных  отраслях  промышленности, 
наиболее важными из которых во всем мире признаны: 
– 
пищевая промышленность – в качестве загустителя и структуро-
образователя продуктов диетического питания, способствующих выведению 
радионуклидов  из  организма;  для  создания  простых  и  многокомпонентных 
эмульсий, соусов, паст (В.Д. Богданов, 2001; Т.М. Бойцова, 2002), съедобных 
колбасных  оболочек;  осветления  пива,  соков,  вин (N.V. Soto-Peralta, H. 
Muellr, D. Knorr, 1989); 
– 
медицина (Г.И. Тюпенко, И.Н. Горбачева, Е.Е. Скорикова, 2001) 
– для лечения ран, ожогов, язв (В.С. Лившиц, 1988; Б.А. Никонов, С.Ф. Ан-
тонов, А.И. Кобатов и др., 1998; B. Sagah, P. Mamlyn, D. Wales, 1991): произ-
водства хирургических нитей, искусственной кожи, лекарственных форм ан-
тисклеротического,  антикоагулянтного  и  антиартрозного  действия;  диагно-
стики и лечения опухолей (К.А. Трескунов, Б.А. Комаров, 1998), язвы желуд-
ка:  хитозан  улучшает  всасывание  и  эффективность  труднорастворимых  ле-
карственных форм (O. Felit, P. Buri, R. Gumi, 1998); эффективен при лечении 

 
21
заболеваний зубов и полости рта (Г.И. Тюпенко, И.Н. Горбачева, Е.Е. Скори-
кова, 2001); в  качестве  средства  борьбы  с  ожирением (E. Ernst, M.H.Pittler, 
1998), связывания и выведения из организма вредных веществ (Н.А. Самой-
лова,  В.Е.  Рыженков,  И.Я.  Ямчков, 1999; B. Sagah, P. Mamlyn, D. Wales, 
1991);  профилактики  и  лечения  сердечно-сосудистых  заболеваний  (В.Г.  Те-
рещенко, 1999); ветеринарии  (А.И. Албулов, А.Я. Самуйленко, Н.Э. Нифан-
тьев и др., 1999; М. И. Рабинович, А.Р. Таирова, 1999); 
– 
косметика – использование в качестве увлажнителя, эмульгатора, 
антистатика  и  смягчающего  средства  для  ухода  за  волосами  и  кожей         
(Л.В. Симонова, Л.К. Пашук, 1998). В косметических препаратах хитозан вы-
ступает как биостимулятор, усиливая физиологическое действие альгиновых 
кислот; 
– 
сельское  хозяйство – в  качестве  биостимулятора,  обеспечиваю-
щего повышение урожайности овощей на 25–40%, средства борьбы с заболе-
ваниями  растений  (С.Л.  Тютерев, 2000), почв,  животных;  специальные  по-
крытия  для  фруктов,  увеличивающие  сроки  хранения  (Le Doan Dien, Tran 
Quang Binh, 1996); кормовые добавки с хитозаном    (Е.А. Гамыгин, Т.И. Са-
зонова, Е. Д. Близнюк, И.В. Сушков, 1999); 
– 
биотехнология  –
очистка  сточных  вод  от  загрязнений             
(С.Л.  Тютерев, 1998; S.P. Mayer, 1989); иммобилизация  ферментов            
(В.А. Веселова, Т.Н. Шеховцова, Г.Д. Бадун, 1999);  концентрирование бак-
суспензий, сорбция тяжелых металлов и радионуклидов; добавка при произ-
водстве  стиральных  порошков,  производство  биоразлагаемых  полимерных 
материалов (В.А. Веселова, Т.Н. Шеховцова, Г.Д. Бадун, 1999). 
На мировом рынке имеется несколько видов хитина и хитозана, разли-
чающихся  по  качеству  и  направлению  использования:  медицинский,  пище-
вой, стандартный для технических целей и специального назначения. 
Хитозан образует гель более текучий и более стабильный, чем другие 
некрахмальные  полисахариды  (Л.В.  Симонова,  Л.К.  Пашук, 1998). Хитино-

 
22
вые волокна выполняют  те же функции, что и растительные, однако эффек-
тивность их как минимум на 55% выше. 
Основная  функция  коммерческих  препаратов  хитозана  медицинского 
назначения заключается в снижении массы организма при значительной его 
детоксикации,  что  уменьшает  риск  заболеваний  сердечно-сосудистой  систе-
мы, рака прямой кишки, холецистита (Р. Муццарели, 2001). Способность хи-
тозана  не  только  впитывать,  но  и  химически  связывать  липиды  и  продукты 
их распада, при создании фармакологических препаратов может быть усиле-
на. Для множественного лечебно-профилактического эффекта хитозан и его 
производные  соединяют  с  органическими  кислотами,  витаминами,  антоциа-
нами,  индолами  и  другими  биологически  активными  веществами  (Л.В.  Си-
монова, Л.К. Пашук, 1998; В.П. Варламов, 1999). 
Актуальным и перспективным является использование хитозанов в ка-
честве сорбента. 
По  сравнению  с  другими  сорбентами,  хитозан  в  составе  препаратов  в 
наибольшей  степени  отвечает  требованиям  сорбентам  медицинского  назна-
чения (Р. Муццарели, 2001): 
-     механическая прочность; 
-     обладание заданными гранулометрическими параметрами; 
-     наличие определенного химического состава; 
-     пористость структуры; 
-     минимально травмирующий эффект структуры на живые клетки; 
-     отсутствие связывания белков из крови и лимфы; 
-     отсутствие нарушения минерального баланса в организме; 
-    наличие селективности в отношении определенных классов соеди-
нений; 
-     высокая сорбционная емкость; 
-    отсутствие токсического воздействия на органы и ткани биологиче-
ского объекта. 

 
23
Перспективным представляется направление по использованию хито-
зана в качестве компонента для синтеза композиционных сорбентов, приме-
няемых для иммобилизации лигандов и конструирования на основе данных 
сорбентов диагностических тест систем. 
 
1.3. Культивирование микроорганизмов с применением метода их иммо-
билизации на сорбентах 
 
Одним из перспективных направлений при разработке технологий по 
получению различных биологически активных веществ и биомассы микроор-
ганизмов являются использование иммобилизованных на носителях микроб-
ных клеток. Для иммобилизации микроорганизмов в качестве носителей ши-
роко используют микрогранулированные сорбенты на основе полиакрила-
мидного геля, желатины, альгината кальция (Д.Вудворд, 1988). 
Для иммобилизации микроорганизмов используется альгинат кальция. 
Альгинат – основной структурный полисахарид бурых морских водорослей и 
состоит  из  регулярных  последовательностей,  связанных  между  собой  в  по-
ложениях 1 и 4 остатков β–Д – маннопиранозилуроната и α - L -  гулопира-
нозилуроната (D.A. Rees, E.A. Morris, 1982). Условия включения в гель аль-
гината кальция мягкие,полимер можно стерилизовать автокловированием, и, 
кроме  того,  процесс  иммобилизации  обратим,  что  достигается  добавлением 
агента,  связывающего  кальций  (например,  ЭДТА  или  лимонной  кислоты). 
Установлено, что стабильность геля возрастает с увеличением концентрации 
полимера, но при высоких концентрациях альгината кальция суспензия аль-
гинат/микробные  клетки  становится  очень  вязкой,  что  затрудняет  процесс 
образования  гранул.  При  автоклавировании  вязкость  раствора  альгината 
кальция уменьшается из-за частичного гидролиза полимера (D.A. Rees, E.A. 
Morris, 1982).  
В биотехнологии для включения клеток в гель применяют полисахари-
ды  каррагинаны,  содержащие  в  структуре  эфиры  α - Д - галактопиранозил-

 
24
серной  кислоты.  Нерастворимую  в  воде  фракцию  полимеров  получают  до-
бавлением  ионов  кальция  к  водному  экстракту  каррагинана.  Установлено, 
что температура и качество геля зависят как от концентрации полимера,  так 
и  от  количества  присутствующих  катионов.  Так, 5% водный  раствор  карра-
гинана, поставляемого фирмой Sigma Chemical CO, находится в жидком со-
стоянии при температуре > 45 –500С, а такой же раствор  препарата карраги-
нана, поставляемого фирмой FMC Corporation, специально предназначенного 
для  иммобилизации клеток, – при температуре > 25 – 300С (H.Y. Wand, D.I. 
Hettwer, 1982). 
В последнее время для иммобилизации клеток микроорганизмов широ-
ко  применяют  полиакриламид.  Однако  некоторые  вещества,  используемые 
при  радикальной  полимеризации  акриламидов,  токсичны  для  микробных 
клеток. 
Разработан  метод  устранения  контакта  между  клетками  и  токсически-
ми веществами полиакриламида. Полученный линейный полимер полиакри-
ламида,  содержащий  гидразиновые  группы,  смешивали  с  клетками,  а  затем 
полимерные цепи сшивали глиоксалем.  Клетки Mentha, иммобилизованные 
данным способом,  сохраняли жизнеспособность и биосинтетическую актив-
ность (A.Freeman, 1981). 
Для иммобилизации клеток Capsicum frutescens к суспензии их культур 
добавляли  предварительно  приготовленные  кубики  пористого  полиуретана. 
Клетки,  связанные  внутри  полимера,  использовали  в  течение  всего  периода 
культивирования,  составляющего 21 сутки.  После  пересева  в  свежую  среду 
через 3-4 суток  в  иммобилизационном  состоянии  оставалось  не  менее 95% 
клеток (Д.Вудворд, 1988). 
Известно, что органические носители имеют некоторые отрицательные 
характеристики, к которым относятся неспецифическая сорбция, подвержен-
ность  микробиологической  атаке,  нестандартность  состава  (Д.Вудворд, 
1988). 

 
25
Перспективно  использование  для  иммобилизации  микроорганизмов 
композиционных сорбентов, имеющих заданный состав и определенную на-
правленность биологического действия (А.В. Брыкалов, 1991; А.В. Брыкалов, 
1993; А.В. Брыкалов, О.В. Воробьева, 1996). 
Применение метода иммобилизации, как показывает анализ многочис-
ленных  обзорных  публикаций  и  монографий,  способствует  повышению  эф-
фективности биотехнологических процессов, и при этом следует остановить-
ся на многих составляющих, которые обосновывают преимущества иммоби-
лизованных систем (В.Н. Постнов, 1983; А.В. Брыкалов,1991; А.В. Брыкалов, 
О.В.  Воробьева, 1996; И.В.  Владимцева,  В.М.  Самыгин,  А.А.  Степин,  О.В. 
Колотова, 2001; И.В. Владимцева,2002; P. Monson, 1978). 
При  иммобилизации  отмечается  значительное  увеличение  фермента-
тивной активности микробных клеток. В ряде работ авторов было показано, 
что в результате иммобилизации наблюдается повышение удельной активно-
сти  микроорганизмов  (Д.Вудворд, 1988; И.В.  Владимцева,  В.М.  Самыгин, 
А.А. Степин, О.В. Колотова, 2001; И.В. Владимцева,2002; P. Monson, 1978). 
  По-видимому, это связано с увеличением скорости биоконверсии суб-
страта в  целевой продукт, увеличение скорости потребления субстрата фер-
ментативной реакции.  
В  результате  иммобилизации  достигается  возможность  многократного 
использования  биокаталитической  системы.  В  работах  исследователей  опи-
саны экспериментальные данные по стабильной работе ферментеров с иммо-
билизованными микробными клетками в течение от 9 до 20 циклов биотех-
нологического процесса (Д.Вудворд, 1988; И.В. Владимцева, В.М. Самыгин, 
А.А. Степин, О.В. Колотова, 2001). 
Таким  образом,  многократность  применения  иммобилизованных  био-
катализаторов  позволяет  перейти  от  периодических  к  более  технологичным 
непрерывным  процессам  (Д.Вудворд, 1988; И.В.  Владимцева, 2002), значи-
тельны при этом экономические преимущества. 

 
26
Одним  из  аспектов  иммобилизации  микробных  клеток  на  носителях 
является изменение метаболизма микроорганизмов. Автор (Р. Monsоn, 1987)  
установил пятикратное увеличение метаболической активности и изменение 
спектра  метаболитов  дрожжевых  клеток  вследствие  их  иммобилизации.  
Культура гриба рода   Aspergillus в иммобилизованном состоянии, в отличие 
от свободных клеток, продуцирует несколько пектинрасщепляющих изофер-
ментов,  различающихся  по  электрофоретической  подвижности,  оптимуму 
рН, молекулярной массе и механизму действия на субстрат. Основными при-
чинами,  которые  влияют  на  изменение  метаболизма  микроорганизмов  при 
иммобилизации,  является  изменение  снабжение  клеток  кислородом,  удале-
ние углекислого газа, а также изменение проницаемости мембран микробных 
клеток (P. Monson, 1978). 
Важной  технологической  особенностью  применения  иммобилизован-
ных  систем  является  то,  что  значительно  упрощаются  стадии  выделения, 
концентрирования  и  очистки  целевого  продукта.  При  иммобилизации  мик-
робных клеток, например, в альгинате кальция возможно проведение прямой 
экстракции    антибиотика  циклогексимидина  из  культуральной  жидкости,  и 
при  этом    из  технологической  схемы  исключаются  стадии  промывки,  экс-
тракции  растворителями,  ионообменной  хроматографии,  степень  очистки 
указанного  антибиотика  достигает 95% (Д.Вудворд, 1988; D.A. Rees, E.A. 
Morris, 1982). 
Самым  главным  преимуществом  при  использовании  иммобилизован-
ных систем является то,  что в целом повышается эффективность, производи-
тельность  биотехнологического  процесса  (Д.Вудворд, 1988; И.В.  Владимце-
ва,2002; D..A. Rees, E.A. Morris, 1982).  
Таким  образом,  по  сравнению  с    традиционными  процессами  микро-
биологического синтеза, использование в биотехнологии иммобилизованных 
клеток  микроорганизмов  приводит  к  увеличению  ферментативной  активно-
сти  микробных  клеток,  увеличению  скорости  биоконверсии  субстрата  в  ко-
нечный  продукт,  стабилизации  свойств  микробных  ферментов,  повышению 

 
27
уровня термостабильности, устойчивости к действию ингибиторов, создается 
возможность  целенаправленного  управления  изменением  метаболизма  мик-
роорганизмов.  
Возможности  многократного  использования  иммобилизованных  сис-
тем, а также упрощение и сохранение стадий выделения, концентрирования и 
очистки  конечного  продукта  в  целом,  повышают  производительность  био-
технологических процессов.  
Важную  роль  при  реализации  преимуществ  играет  аппаратурное 
оформление процессов с иммобилизованными клетками, то есть выбор кон-
струкции  реакторов.  Обычные  биоректоры  с  простым  перемешиванием  не 
подходят  для  иммобилизованных  клеток,  так  как  разрушают  частицы  носи-
теля (B.V. Chomel, E.E. DeBess, D.M. Mabqiameie, 1994). В литературе описа-
ны  различные  типы  биореакторов,  рассмотрены  их  преимущества  и  недос-
татки  (П.А.  Вершилова,  А.А.  Голубева, 1972; И.М.  Климова,  В.Г.  Пушкарь, 
1995; В.И. Ефременко, 1996; M.F. Clark, A.N. Adams, 1977; B.V. Chomel, E.E. 
DeBess, D.M. Mabqiameie, 1994). Выбор  конструкции  биореактора  для  про-
цессов  с  иммобилизованными  клетками  зависит  от  метода  иммобилизации, 
от  необходимости  поддерживания  жизнеспособности  микроорганизмов  и 
снабжения их кислородом. Для конструирования реакторов нужно учитывать 
размеры  частиц  носителя,  их  плотность,  устойчивость  к  механическим  воз-
действиям, необходимость аэрации и перемешивания жидкости, проходящей 
через ферментер (M.F. Clark, A.N. Adams, 1977). Высокая концентрация мик-
роорганизмов  в  рабочем  объеме  реактора  с  иммобилизованными  клетками 
определяет  необходимость  создания  высоких  скоростей  массопереноса,  что 
особенно  важно  для  аэробных  процессов  (П.А.  Вершилова,  А.А.  Голубева, 
1972). 
Для  культивирования  иммобилизованных  микроорганизмов  описаны 
различные  конструкции  ферментеров,  например,  реактор  периодического 
действия с рециркуляцией среды (D.M. Boorsma, J.G. Strefkert, 1979), реактор 
с  вращающимися  дисками,  реактор  с  «кипящим  слоем» (P.Z. Masson, C.Z. 

 
28
Cambiasso, D. Collet-Cassat, C.G. Magmisson et al., 1981).  Была  предложена 
оригинальная конструкция реактора для клеток, включенных в гелевый блок. 
Суспензию  микроорганизмов  в  растворе  альгината  переносили  в  аппарат,  в 
который  вертикально  вставляли  металлические  стержни.  После  окончания 
гелеобразования стержни вынимали. В результате получается блок геля, не-
обходимый  для  удаления  углекислого  газа  и  подачи  субстрата.  Такой  фер-
ментер,  по  данным  авторов,  работал  стабильно  в  течение 111 дней 
(Д.Вудворд, 1988). 
Л.В.  Мирясова  с  соавторами  в 1999 году  опубликовали  эффективную 
технологию  культивирования  иммобилизованных  коклюшных  бактерий 
(Л.В. Мирясова, 1999).Стенки биореактора “Биотек” с рабочим объемом 2 л 
авторы выстилали  полосами губчатого полиуретанового носителя, который 
служил  для  иммобилизации  микроорганизмов.  Созданы  также  специальные 
реакторы  для  культивирования  иммобилизованных  животных  и  раститель-
ных клеток (L.B. Tabatabai, B.L. Deyoe, 1984). 
Разработанные  учеными  методики  культивирования  иммобилизован-
ных клеток в настоящее время широко применяются во многих отраслях био-
технологии:  в  процессе  спиртовой  ферментации  при  получении  этанола,  в 
пивоварении,  виноделии,  приготовлении  фруктовых  и  овощных  продуктов, 
уксуснокислой  ферментации,  в  молочной  промышленности,  при  получении 
аминокислот, антибиотиков, стероидов, углеводов, ферментов, алкеноксидов 
(Д.Вудворд, 1988; M.F. Clark, A.N. Adams, 1977). Важной областью  приме-
нения иммобилизованных клеток является экология, поскольку прикреплен-
ные к носителям микроорганизмы могут осуществлять метановое сбражива-
ние  сточных  вод,  биодеградацию  ксенобиотиков,  деструкцию  поверхностно 
активных веществ, нефтяных загрязнений. Однако коммерциализация техно-
логий,  предусматривающих  использование  иммобилизованных  микроорга-
низмов,  требует  продолжения  экспериментов  с  целью  разработки  более  эф-
фективных  и  экономичных  технологических  процессов  (В.Г.  Терещенко, 
1999;  И.В.  Владимцева,  В.М.  Самыгин,  А.А.  Степин,  О.В.  Колотова, 2001; 

 
29
И.В.  Владимцева,2002; M.F. Clark, A.N. Adams, 1977; H.J. Konig, H. Vob, 
1990). 
Использование  носителей  с  магнитными  свойствами  для  иммобилиза-
ции  биообъектов  открывает  новые  перспективы  интенсификации  процессов  
биотехнологии.  Применение  магнитных носителей позволяет повысить  мас-
сопередачу в биореакторах, особенно при аэробных процессах, где массопе-
редача является лимитирующим фактором (S.P. Stahe, A. Marmonier, M.I. Mi-
coud, 1982). По  мнению  некоторых  авторов (S.P. Stahe, A. Marmonier, M.I. 
Micoud, 1982), использование ферментеров с генераторами магнитного поля 
для непрерывных процессов позволит отказаться от перемешивания с помо-
щью  обычных  мешалок.  Носители  биообъектов  с  магнитными  свойствами  
приобретают повышенную стабильность и могут быть использованы в реак-
торах с большими скоростями потоков и более высокими давлениями (S.M. 
Avrameas, J.L. Gutsdon, 1980). Магнитные  свойства  носителей  биокатализа-
торов (ферментов и клеток) позволяют с помощью магнитного поля удалять 
их  после  использования  в  биотехнологическом  процессе  (В.И.  Ефременко, 
1996; И.А. Соколова, А.Ф. Брюханов, 2000). 
Перспективы  магнитного  манипулирования  микроорганизмами – про-
дуцентами  очень заманчивы, однако до настоящего времени разработке этих 
технологий  уделялось  мало  внимания.  В  научной  литературе  встречаются 
публикации по применению иммобилизованных в магнитные носители фер-
ментов для биотехнологических целей (Д.Вудворд, 1988;      В.И. Ефременко, 
1996).  
В работах авторов (И.В. Владимцева, В.М. Самыгин, А.А. Степин, О.В. 
Колотова, 2001; И.В. Владимцева,2002) методически обоснованы и экспери-
ментально представлена биотехнология использования в магнитных носите-
лях форм инокулянтов при глубинном культивировании бактериальных кле-
ток.  Показаны  технологические  преимущества  применения  магнитоуправ-
ляемого инокулянта, позволяющие упростить работу с бактериальными клет-
ками и сократить время получения биомассы микроорганизмов. 

 
30
Имеются сообщения о создании в США (A.B. Stavitsky, 1964), Швеции 
и Англии (R. Sting, G. Ortmann, 2000) компаний, работающих в области био-
технологии с биокатализаторами, иммобилизованными в магнитные носите-
ли. Многообещающие исследования в этой области в настоящее время нахо-
дятся в начальной стадии изучения. 
 
1.4. Применение магнитных иммуносорбентов для диагностики особо  
опасных инфекционных заболеваний и индикации их возбудителей 
 

На современном этапе развития биотехнологии и микробиологии весь-
ма  актуальными  являются  исследования,  направленные  на  решения  пробле-
мы  разработки  методов  экспресс - диагностики  особо  опасных  инфекций  и 
индикации их возбудителей. Для достижения цели широко используют мето-
ды:  радиоиммуноанализ  (РИА),  иммунофлюоресценции  (РИФ),  иммунофер-
ментный анализ (ИФА). Достижением современной науки является разработ-
ка  сочетанных  методов  детекции  возбудителей  особо  опасных  инфекций: 
магноиммуносорбция – ПЦР – анализ  и  магноиммуносорбция – хемилюми-
несцентный иммунный анализ (Е.Н. Афанасьев, И.С. Тюменцева, М.Н. Кас-
торная, 1999; И.А. Соколова, Г.И. Лямкин, А.Ф. Брюханов, 2000). 
Многочисленные монографии и обзорные статьи содержат сведения об 
особенностях  методов  РИА,  РИФ  и  иммуноферментного  анализа,  их  чувст-
вительности, специфичности, а также данные о преимуществах и недостатках 
каждого  из  методов  (Г.Т.  Нго,  Г.М.  Ленхофор,1988;  Е.В.  Анапова,  Л.С.  Ка-
менова,  И.С.  Мещерякова, 1989; И.В.  Владимцева,  А.А.  Степин, 1990; А.Д. 
Манолов,  Л.Ф.  Зыкин,  Г.П.  Голубинский, 1991; Л.Ф.  Зыкин,  А.Т,  Яковлев, 
1993;   H. Webster, J. Bone Adrian, A. Katherine Webster, J. Terence Wilkin, 
1990). 
В  соответствии  с  данными  литературы  (Б.Б.  Дрантиев,  А.М.  Егоров, 
1982),  иммуноферментный  анализ  обладает  преимуществом  перед  другими 
методами экспресс - диагностики из-за своей высокой специфичности и чув-

 
31
ствительности. В основе данного метода лежит специфическое взаимодейст-
вие  определяемого  вещества  с  антителами  и  детекция  комплекса  антиген – 
антитело с помощью ферментативной реакции (Б.Б. Дрантиев, А.М. Егоров, 
1982; Г.Т. Нго, Г.М. Ленхофор,1988;). 
Принцип  метода  ИФА  заключается  в  том,  что  после  иммобилизации 
антител (антигенов) на нерастворимой основе вносят исследуемый биологи-
ческий  материал,  и  образовавшийся  комплекс  антиген-антитело  выявляют  с 
помощью  конъюгата  антител  (антигена)  с  ферментом,  активность  которого 
регистрируют 
по 
превращению 
субстрата 
спектрофотометрически             
(Б.Б. Дрантиев, А.М. Егоров, 1982). 
Ферментами – маркерами, используемыми в ИФА, могут быть щелоч-
ная фосфатаза, галактозидаза, глюкооксидаза, глюкоамилаза, пенициллиназа, 
но  чаще  применяют  пероксидазу  (Б.Б.  Дрантиев,  А.М.  Егоров,  1982;          
Г.Т. Нго, Г.М. Ленхофор,1988;). 
Для приготовления иммуноферментных конъюгатов обычно использу-
ют  перйодатный,  глутаральдегидный    методы  (Н.С.  Умнова,  И.П.  Павлова, 
Г.В. Михеева, 1986; P.K. Nakane, A. Kawaoie, 1974), иногда используют ма-
леимидный  метод  приготовления  пероксидазного  конъюгата (K. Kato, Y. 
Hamguchi, H. Fukui, 1975), но наиболее перспективным считается перйодат-
ный метод окисления (S. Anaokar, P.J. Sorry, J.C. Standefer, 1979). 
В качестве твердой фазы тест-систем, основанных на принципах имму-
ноферментного анализа, используют синтетические полимеры, такие как по-
листирол,  поливинил,  дакрил  и  другие  в  виде  пробирок  (Б.Б.  Дрантиев,     
А.М.  Егоров, 1982), 96-луночных  планшет  (Г.Т.  Нго,  Г.М.  Ленхофор,1988), 
магнитных  частиц  (А.В.  Волков,  М.А.  Москвина,  А.Л.  Волынский  и  др. 
2001),  магнитных  бус (H. Webster, J. Bone Adrian, A. Katherine Webster, J. 
Terence Wilkin, 1990). Наиболее широко применяются 96–луночные планше-
ты  из полистирола, т.к. этот полимер доступен и химически инертен. В рабо-
те авторов (Г.Т. Нго, Г.М. Ленхофор,1988) отмечено, что поверхность любых 
планшетов  характеризуется  неравномерностью  распределения  гидрофобных 

 
32
участков. Так, на равных участках полистирола может  находится различное 
остаточное  количество  химического  компонента,  используемого  в  процессе 
получения полимера. Нестандартность адсорбционной поверхности полисти-
роловых  планшетов  приводит  к  непрочному  связыванию  антител  и  их  де-
сорбции на этапах ИФА. В связи с этим необходимы исследования по опти-
мизации способов получения твердых носителей, обеспечивающих прочную 
иммобилизацию  лигандов  (Ат  и  Аг)  при  сохранении  их  биологической  ак-
тивности. 
Согласно  данным  литературы  (И.В.  Березин,  А.А.  Клесков, 1976; М. 
Тривен, 1983; И.В.  Владимцева,  А.А.  Степин, 1990; H. Webster, J. Bone 
Adrian, A. Katherine Webster, J. Terence Wilkin, 1990), связывание  антител  с 
твердым носителем проводят путем физической адсорбции или методом ко-
валентной иммобилизации. В случае физической адсорбции носитель в тече-
ние  нескольких  часов  обрабатывают  раствором  соответствующих  антител, 
при  этом  связывание  антител  с  поверхностью  полистиролового  носителя 
обеспечивается, в основном, за счет гидрофобных взаимодействий. Затем из-
быток  антител  отмывают,  а  носитель  помещают  в  раствор  альбумина  для 
предотвращения неспецифической адсорбции конъюгата. Связывание белка с 
носителем  зависит  от  концентрации,  причем  совместное  влияние  рН  и  ион-
ной  силы  особенно  проявляется  при  более  высоких  концентрациях  белка  в 
растворе. Связывание белков с полистироловым носителем зависит от време-
ни и температуры обработки. Так, при 370С связывание белка вдвое больше, 
чем  при  40С.  Кроме  того,  при 3–х  часовой  иммобилизации  уровень  адсорб-
ции белка достигает 80%, после 36–ти часовой – 100% (Г.Т. Нго, Г.М. Лен-
хофор,1988). 
Инкубирование носителя с белком, например альбумином или желати-
ной,  позволяет  заблокировать  остаточные  свободные  центры  связывания,  с 
которыми могли бы неспецифически взаимодействовать молекулы конъюга-
та. 

 
33
Первые  работы  по  диагностике  чумы  у  людей,  хищных  животных  и 
грызунов с помощью ИФА для определения иммуноглобулинов и специфи-
ческого чумного антигена фракции 1 были опубликованы в работах (Е.П. Го-
лубинский,  В.С.  Рудник,  М.П.  Рудник, 1980; D.C. Cavanaught, M.K. Fortier, 
D.M. Robinson, 1979). В 1980г.  Е.П.Голубинский  с  соавторами  (Е.П.  Голу-
бинский, В.С. Рудник, М.П. Рудник, 1980) показали возможность обнаруже-
ния антигена Ф1 чумного микроба иммуноферментным методом при иссле-
довании  чистых  и  смешанных  культур  возбудителя  чумы.  В.И.Журавлев  с 
соавторами (В.И. Журавлев, А.Т. Яковлев, В.С. Рыбкин, 1983) использовали 
ИФА для обнаружения антигенов не только в бактериях чумы, но также и в 
органах  биопробных  животных  и  диких  грызунов  из  природных  очагов.  В 
работе авторов (О.Н. Лопаткин, Н.Т. Лазарева, Л.И. Калмыкова, О.В. Малец-
кая, 1985) показаны преимущества ИФА на основе моноклональных антител 
к  Ф1  чумного  микроба.  Была  разработана  иммунопенициллиназная  тест-
система  на  основе  моноклональных  антител  к  Ф1.  В  настоящее  время  для 
идентификации  капсульного  антигена  Ф1  возбудителя  чумы  выпускаются 
иммуноферментные  моноклональные  тест-системы  (Л.Ф.  Зыкин,  А.Т.  Яков-
лев, 1993). 
ИФА  для  иммунологического  подтверждения  туляремии  впервые 
предложили  авторы (E. Carlsson, A. Lindberg, 1979). В этой же работе пока-
зано,  что  ИФА  в 10 раз  чувствительнее  РА.  Основное  преимущество  ИФА 
при индикации туляремии перед обычными тестами – его способность рано 
выявлять  антитела.  Методика  ИФА  для  туляремийных  антигенов  и  антител 
была  одновременно  апробирована  Е.П.Голубинским  с  соавторами  (Е.П.  Го-
лубинский, С.П, Меринов, Л.В. Меринова, 1984). Чувствительность ИФА при 
исследовании  сыворотки  реконвалесцентов  оказалась  в 10 – 1000 раз  выше 
РА.  По  данным  В.М.Поляченко  с  соавторами  (В.М.  Поляченко,  С.П.  Мери-
нов,  Е.П.  Голубинский, 1983), туляремийные  антигены  обнаруживаются  в 
ИФА в концентрации 1,2х105 – 2 – 105 мк/мл и 40–80 нг/мл. Близкие показа-
тели  чувствительности  получили  И.С.Мещерякова  с  соавторами  (И.С. 
Мещерякова, И.С. Умнова, К.А. Шаханина, 1986). В работе (Е.Г. Чернявская, 

 
34
рякова, И.С. Умнова, К.А. Шаханина, 1986). В работе (Е.Г. Чернявская, П.Г. 
Свешников, Е.С. Северин, Н.Ф, Василенко, 1990) предложен ИФА с исполь-
зованием  моноклональных  антител  к  антигену  возбудителя  туляремии.  По 
результатам  исследований  установлено,  что  использование  пероксидазных 
конъюгатов  на  основе  моноклональных  антител  позволяет  выявлять 10–30 
нг/мл дезинтеграта или 75х103 – 150–103 мк/мл вакцинного штамма и не дает 
перекрестных 
результатов 
с 
гетерологичными 
микроорганизмами. 
В.С.Хлебников  с  соавторами  (В.С.  Хлебников,  Г.В.  Гречко,  С.С.  Ветчинин, 
1990) предложили тест-систему для диагностики туляремии на основе моно-
клональных  антител  и  ферментов  пероксидазы  и  пенициллиназы.  Чувстви-
тельность таких конъюгатов 1–5 нг/мл липополисахарида и 8–30х105 мк/мл. 
В работе (S.M. Avrameas, J.L. Gutsdon, 1980) представлены данные об 
использовании магнитных сорбентов в разработанной тест–системе ИФА ан-
тигенов Y.pestis. Установлены  оптимальные  параметры  ИФА:  зависимость 
адсорбирующей  способности  магносорбента  от  его  содержания  в  пробе,  за-
висимость степени адсорбции антигена от продолжительности инкубации его 
с МС. Результаты исследований показали, что 15–45мг МС в пробе и 20–30 
мин  инкубации  достаточно,  чтобы  произошло  «насыщение»  его  клетками. 
Чувствительность  метода  в  случае  обнаружения  клеток  составляла 104–105 
мк/мл, при обнаружении фракции 1–10 нг/мл. 
Представленный  выше  материал  дает  возможность  сделать    заключе-
ние о высокой чувствительности и специфичности ИФА при определении ан-
тигенов чумного микроба,  о целесообразности его применения для диагно-
стики чумы и туляремии, индикации в объектах внешней среды, эпизоотоло-
гического обследования природных очагов этой инфекций. 
Многочисленные работы последних лет (И.М. Климова, В.И. Ефремен-
ко,  В.Г.  Пушкарь, 1989; М.Н.  Касторная,  Е.Н.  Афанасьев,  И.С.  Тюменцева, 
2000;  И.В.  Владимцева. 2002) показали  перспективность  использования  ус-
тойчивых  иммуносорбентов  для    конструирования  высокоэффективных  ди-
агностических тест–систем. 

 
35
Для  иммобилизации  различных  лигандов  используют  сорбенты,  обла-
дающие магнитными свойствами (И.М. Климова, В.И. Ефременко, В.Г. Пуш-
карь, 1989; И.В. Жарникова, А.В. Брыкалов, И.С. Тюменцева, 1994).  В рабо-
те (С.Д. Гавенский, И.М. Климова, В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь, В.Ю. Пе-
ров, 1989) описано  создание  иммуносорбентов  с  магнитными  свойствами, 
что  значительно  расширило  область  их  применения.  Показана  возможность 
использования  отечественных  препаратов  магнитных  иммуносорбентов  для 
концентрирования и идентификации патогенных микроорганизмов. Разрабо-
танный  способ  упрощает  проведения  анализов  и  ускоряет  манипуляции  на 
всех  этапах  исследования.  Применение  магносорбентов  исключает  необхо-
димость предварительного концентрирования микроорганизмов на мембран-
ных  фильтрах  или  путем  центрифугирования,  позволяет  максимально  изба-
виться от многочисленной сопутствующей микрофлоры и повышает вероят-
ность выделения микробов  из больших объемов исследуемых проб. 
В  работах  (И.В.  Владимцева. 2002; И.М.  Климова,  В.И.  Ефременко, 
В.Г. Пушкарь, 1989; И.В. Жарникова, А.В. Брыкалов, И.С. Тюменцева, 1994) 
описано получение магносорбентов и преимущество их использования. Бла-
годаря  применению  магнитного  поля  для  сепарации  магнитных  сорбентов 
удается исключить центрифугирование, тем самым сокращается время инди-
кации  особо  опасных  инфекций.  Кроме  того,  увеличивается  скорость  отмы-
вания твердой фазы на промежуточных этапах анализа. 
Материалы,  используемые  для  приготовления  магнитных  сорбентов, 
должны  удовлетворять  следующим  требованиям:  обладать  инертностью  по 
отношению  к  биологическим  препаратам,  иметь    мелкодисперсное  состоя-
ние, коррозийную устойчивость в жидких средах, хорошую включаемость в 
гранулы,  стабильность  свойств  и  механическую  прочность.  Введение  маг-
нитного материала в полимерные гранулы осуществляют во время их приго-
товления  методами  эмульсионной  полимеризации  (И.М.  Климова,  В.И.  Еф-
ременко, В.Г. Пушкарь, 1989). Для придания магносорбентам биоспецифиче-
ских  свойств  проводят  иммобилизацию  лигандов,  которая  обеспечивает 

 
36
прочное  присоединение  их  на  поверхность  сорбентов.  Активные  функцио-
нальные группы на носителе чаще всего получают предварительной актива-
цией его поверхности, которая может осуществляться в достаточно жестких 
условиях с использованием широкого круга реагентов. Но при этом должны 
соблюдаться условия, обеспечивающие сохранность  функциональных групп 
лигандов, эффективность ковалентного связывания антител или антигенов. 
Магноиммуносорбенты могут эффективно быть использованы для соз-
дания  твердофазных  диагностических  тест-систем,  а  также  для  индикации 
возбудителей  инфекционных  заболеваний  в  объектах  окружающей  среды. 
Весьма актуальны разработки новых методов выделения и индикации возбу-
дителей  инфекционных  заболеваний  и  их  антигенов    из  объектов  внешней 
среды. С этой целью в практической микробиологии в  последнее время для 
выделения  культур  микроорганизмов  из  объектов  внешней  среды  успешно 
применяют сорбционные методы и, в частности, магноиммуносорбенты, осо-
бенно  в  тех  случаях,  когда  концентрация  исследуемых  бактерий  в  пробах 
низкая, а исследуемые объекты загрязнены посторонней микрофлорой. Маг-
ноиммуносорбенты (МИС) осуществляют на своей поверхности селективное 
концентрирование  микроорганизмов    (И.М.  Климова,  В.И.  Ефременко,  В.Г. 
Пушкарь, 1989; И.М.  Климова,  В.Г.  Пушкарь, 1995; И.В.  Владимцева,  В.М. 
Самыгин, А.А. Степин, О.В. Колотова, 2001; И.В. Владимцева, 2002). 
Преимуществами использования МИС является то, что при их исполь-
зовании не требуется предварительного концентрирования исследуемых проб 
с  отделением  выявляемых  микроорганизмов  от  контаминируеющей  микро-
флоры  и  других  примесей,  возможность  проведения  индикации  на  качест-
венно  более  высоком  уровне.  В  результате  использования  магносорбентов, 
способных осуществлять на себе селективное концентрирование микроорга-
низмов, появляется возможность исследования проб с высокой степенью за-
грязненности, возможность забора проб при неорганических объемах из объ-
ектов  внешней  среды,  с  низкой  концентрацией  микроорганизмов.  При  этом 
метод обладает высокой чувствительность и специфичностью к близкородст-

 
37
венным  микроорганизмам ((И.М.  Климова,  В.И.  Ефременко,  В.Г.  Пушкарь, 
1989). 
В  работах  авторов  (И.В.  Жарникова,  А.В.  Брыкалов,  И.С.  Тюменцева, 
1994; Е.Н. Афанасьев, 2000) показано, что магноиммуносорбентные сибире-
язвенные антиспоровые и чумные бивалентные диагностикумы были с поло-
жительным результатом испытаны в полевых условиях применительно к им-
муноферментному  и  количественному  иммунофлюоресцентному  анализам. 
Так, во время вспышки сибирской язвы в Красногвардейском районе Ставро-
польского края в июле 1996 г. были проведены исследования 66 проб, подоз-
рительных  на  наличие  возбудителя  этой  инфекции (22 пробы  сливочного 
масла, 10 проб сухого молока, 5 проб сыра, 2 пробы воды, 2 смыва с обору-
дования сыродельного цеха, 1 проба ила из водоема, 10 проб почвы, патоло-
гический материал от крупного рогатого скота и др.) 
Параллельно  с  классическим  методом  пробы  исследованы  в  полиме-
разно-цепной реакции, иммуноферментном анализе и количественной имму-
нофлюоресценции  с  применением  МИС.  Положительные  результаты  иссле-
дования  материала  на  наличие  возбудителя  сибирской  язвы  всеми  перечис-
ленными методами получены из патологического материала от КРС. В одной 
из  проб  (почва  из  очага  после  дезинфекции)  в  КИФА  с  применением  МИС 
выявлены  споры  сибиреязвенного  микроба.  Положительные  результаты  ис-
следования  почвы  с  МИС  после  дезинфекции  при  отсутствии  выделения 
культуры  могут  свидетельствовать  о  наличии  нежизнеспособных  спор  и,  с 
одной  стороны,  быть  полезными  для  ретроспективного  анализа  эпизоотоло-
гической ситуации, а с другой – для оценки качества проводимой дезинфек-
ции. 
Полевые испытания чумных бивалентных МИС проводили в 1997, 1998 
гг. в Центрально-Кавказском природном очаге чумы (аул Хасаут Карачаево-
Черкесской Республики и с.Булунгу Кабардино-Балкарской Республики). Ис-
следовано 344 пробы (блохи разных видов, почва из гнезд грызунов, субстра-

 
38
ты гнезд, трупы грызунов, а также суспензии органов биопробных животных, 
зараженных взвесью из блох). 
Кроме проведения иммуноферментного анализа и количественной им-
мунофлуоресценции с использованием МИС, пробы параллельно исследова-
лись  традиционными  методами:  бактериологическим  (прямой  посев  мате-
риала),  биологическим  (заражение  белых  мышей)  и  серологическим  (прове-
дение РПГА). При этом  процент положительных находок при использовании 
магноиммуносорбентов  был  выше  в 3,8 раза,  что  свидетельствует  о  целесо-
образности  применения  МИС  при  изучении  природных  очагов  чумы  (Е.Н. 
Афанасьев, 2000). 
Выступая в качестве твердой фазы,  МИС используются в бактериоло-
гическом и экспрес-анализах:  иммуноферментом, иммунофлюоресцентном и 
других иммуноанализах, обеспечивая их специфичность и чувствительность 
(Е.В.  Анапова,  Л.С.  Каменова,  И.С.  Мещерякова, 1989; А.В.  Манолов,  А.Ф. 
Зыкин, Е.П. Голубинский,  1991). 
В  работе  авторов  (И.В.Жарникова,  А.В.Брыкалов,  И.С.Тюменцева, 
1994) представлены сведения о конструировании композиционных магноим-
муносорбентов (КМИС) для диагностических тест-систем на основе сорбци-
онного материала –аэросила, обладающего стандартностью состава и струк-
турных  характеристик.  Показано,  что  использование  МИС  в  качестве  твер-
дой  фазы  в  ИФА  по  сравнению  с  полистироловыми  планшетами  имеет 
преимущества, связанные с повышением чувствительности метода в 1000 раз 
по  корпускулярным    антигенам.  Отмечено,  что  проведение  ИФА  с 
использованием МИС обеспечивает экспрессность анализа микроорганизмов 
с высокой чувствительностью и специфичностью, время постановки анализа 
сокращается  в 7 раз.  Лиофилизированные  препараты  КМИС  стабильны  в 
течение 10 лет,  тогда  как  хранение  сенсибилизированных  планшет 
ограничено 7 сутками,  что  свидетельствует  о  преимуществах  применения 
КМИС в ИФА
Также  . 
были  сконструированы  магноиммуносорбентные  диагностику-
мы  для  использования  их  в  методах  иммунофлуоресценции  и  определена 

 
39
чувствительность  КМИС,  которая  составила  1х102 – 1х103  мк.  кл./мл,  что  в 
100–1000 раз превышает чувствительность общепринятого метода иммуноф-
луоресценции  (И.В.Жарникова,  А.В.Брыкалов,  И.С.Тюменцева, 1994; Е.Н. 
Афанасьев,  И.С.  Тюменцева,  М.Н.  Касторная, 1999; М.Н.  Касторная,  Е.Н. 
Афанасьев, И.С. Тюменцева, 2000; Е.Н. Афанасьев, 2000). 
В работе (М.Н. Касторная, 2003) были разработаны оптимальные усло-
вия сочетанных методов детекции возбудителей особо опасных инфекций, в 
частности,  бруцеллеза  на  основе  магноиммуносорбции – ПЦР - анализа    и 
магноиммуносорбции – хемилюминесцентного  иммунного анализа. Автора-
ми  работы  показано,  что  выбор  условий  сочетанного  применения  избира-
тельного  концентрирования  возбудителей  бруцеллеза  на  магноиммуносор-
бенте с последующей постановкой ПЦР – анализа позволяет повысить чувст-
вительность  метода  не  менее  чем  в 1000 раз  и  сократить  время  проведения 
анализа до 3 часов. 
Представленный выше анализ литературных данных дает возможность 
сделать заключение о высокой эффективности применения иммуносорбентов 
с  магнитными  свойствами  для  диагностики  особо  опасных  инфекций,  для 
индикации их возбудителей в объектах  окружающей среды, в целом для ре-
шения  задач  эпизоотологического  обследования  природных  очагов  этих  ин-
фекций. 
Успешное  решение  проблемы  повышения  специфичности,  чувстви-
тельности,  экспрессивности  твердофазного  иммуноанализа  особо  опасных  
инфекций  возможно  в  направлении  разработки  новых  органокремнеземных 
магносорбентов  с  количественной  характеристикой  магнитных  свойств,  об-
ладающих  простотой  технологии  получения  с  использованием  отечествен-
ных  реагентов,  экономичностью,  целенаправленностью  специфических 
свойств. 
 
 
   

Глава 2.  Материалы и методы 
2.1. Характеристики используемых штаммов микроорганизмов 
Для  выполнения  исследований  по  конструированию  диагностических 
тест–систем  использованы  штаммы  микроорганизмов I-IV группы 
патогенности, основные характеристики которых представлены в таблице 1. 
Все  штаммы  микроорганизмов  получены  из  коллекционного  центра 
Ставропольского научно-исследовательского противочумного института. 
                                                                                           
2.2. Характеристики лабораторных животных 
 В опытах использовали 50 белых мышей, массой 18-20г обоего пола и 
10  кроликов  породы  «Шиншилла»,  массой 2,5-3кг.  Животных  получали  из 
питомника  Ставропольского    научно-исследовательского  противочумного 
института  и  после  карантинизации  использовали  в  опытах.  В  процессе 
содержания  животных  поддерживали  рекомендуемый  режим  питания 
согласно приказу №1179  (М., 1983).  
Все  процедуры  на  экспериментальных  животных,  включая  эвтаназию, 
проводили  согласно  методических  рекомендаций  (В.В.  Карпенко,  В.И. 
Сачкова, 1985; С.А. Куфлина, Т.Н. Павлова; 1985). 
 
2.3. Способы получения антигенов чумы и выделения специфических 
иммуноглобулинов, получения иммунопероксидазных коньюгатов и их 
контроль в ИФА 
 
Выращивание  чумного  микроба  проводили  с  использованием  бульона 
Хоттингера pH 7,2-7,4, агара  Хоттингера pH 7,2-7,4 (А.С.  Лабинская, 1963). 
Стерилизацию биомассы осуществляли холодным (-400С) ацетоном в течение 
48 часов. 
 
Контроль  общей  и  специфической  стерильности  проводили 
биологическим и бактериологическим методами СП 1.2.011– 94 (Санитарные 
правила, 1994).  
 

Таблица 1.  Характеристики штаммов микроорганизмов, 
использованных в работе                                                                                                    

Характеристика штамма 
Наименование и 
№ 
обозначение 
Морфология и 
Культуральные свойства 
Биохимические свойства 
п/п 
штамма 
тинкториальные 
свойства 
1 2 
3 4 

Грамотрицатель
На агаре Хоттингера (рH 
Не разжижает желатину, 
ная палочка с 
7,2±0,1) с сульфатом натрия 
не образует индола, 
закругленными 
при температуре 28±10С дает 
ферментирует глюкозу с 
концами, 
рост колоний через 1 сутки в 
образованием  кислоты, 

Yersinia pestis EV 
неподвижная,1-
виде «кружевных платочков» 
образует сероводород, 
2мкм.  
с шероховатым центром.  На 
ферментирует арабинозу 
бульоне Хоттингера -  в виде 
и ксилозу, 
придонного хлопьевидного 
глицериннегативный 
осадка. 
штамм. 

Yersinia pestis 461 
Полиморфные 
На твердых питательных 
Не разжижает желатину, 
овоидные 
средах – типичные 
не образует индола, 
биполярные 
шероховатые колонии, на 
ферментирует глюкозу с 
палочки, 
жидких питательных средах – 
образованием  кислоты, 
грамотрицатель-
бульон прозрачный, рыхлый 
образует сероводород, 
ные, 
осадок, хлопьевидная взвесь, 
ферментирует арабинозу 
неподвижные,об
нежная пленка. 
и ксилозу. 
разуют капсулу 
при температуре 
370С. 
3-5  
Yersinia 
Грамотрицатель-
Через 24 часа роста на 
Ферментируют 
enterocolitica 64, 
ные, 
твердых питательных средах 
арабинозу, сорбит, 
178, 383 (9) 
кокковидные 
при температуре (24±10С) 
арабитол, арбутин, 
 
палочки.  
образуют мелкие колонии, 
ксилозу; сероводород не 
 
которые увеличиваются в 
образуют. 
 
размерах через 2 суток. 
 
 
 
 
 
6 - 11 
Yersinia 
Грамотрицатель-
На плотных средах образуют 
Ферментируют 
pseudotuberculo- 
ные, 
S- и R- колонии. 
арабинозу, адонит, 
sis I-VI серотипов 
кокковидные 
Факультативные анаэробы. 
арабитол, арбутин. 
палочки. Имеют 
Оптимальная температура 
Сероводород и индол не 
жгутики и  
роста 30-350С. 
образуют. Нитраты не 
образуют 
редуцируют. 
капсулу. 
12 - 14   Escherichia 
coli    Грамотрицатель-
S-формы на агаре Хоттингера 
Желатин не разжижают, 
0-10, 0-11, 0-18 
ные, 
(7,2±0,1) единиц рН 
образуют индол, 
неподвижные 
формируют опалово-
сероводород, 
палочки. Имеют 
мутноватые влажные, с 
восстанавливают 
выраженную 
ровным краем и блестящей 
нитраты в нитриты, 
капсулу, 
поверхностью колонии. На 
ферментируют лактозу с 
образуют 
жидкой питательной среде 
образованием кислоты и 
слизистые 
вызывают равномерное 
газа, глюкозу, мальтозу, 
колонии. 
помутнение с образованием 
манит, арабинозу, 
небольшого осадка. 
галактозу. 

 
 
Фракцию 1 чумного  микроба  для  экспериментальных  исследований 
получали по  E.E. Baker et al. (1952).   
Водорастворимый белковый комплекс чумного микроба изолировали по 
схеме Е.Н.Афанасьева  (2000): 
 I 
 
стадия. Фракционирование сернокислым аммонием 
          Обеззараженную  и  проверенную  на  специфическую  стерильность 
бактериальную  массу Y.pestis Е.V  экстрагировали 2,5% раствором NaCl, 
после    чего    центрифугировали  при 20000g  в  течение 30 минут  на 
центрифуге    «  Весman L – 75». Отделяли  супернатант  от  осадка.  Для 
фракционирования белков в супернатант добавляли сульфат аммония до 80% 
насыщения  и  перемешивали  на  магнитной  мешалке  в  течение 30 минут. 
Полученный  раствор  оставляли  на 16-18 часов  при  40С  для  формирования 
осадка  и  стабилизации  белка.  Центрифугировали  при  20000g в  течение 30 
минут,  супернатант  удаляли,  а  осадок  растворяли  в 0,9% растворе  хлорида 
натрия рН 7,2 в соотношении 1:1 и проводили диализ против водопроводной, 
а  затем  дистиллированной  воды  до  отсутствия  ионов NH +
4 ,  определяли 
реактивом Несслера.  
  
II стадия. Механическая дезинтеграция 
          Осадок, полученный после центрифугирования бактериальной массы и 
растворимый  в 0,9% растворе  хлорида  натрия  рН 7,2 в  соотношении 1:1, в 
объеме 30 мл  помещали  в  камеру  дезинтегратора,  предварительно 
охлажденного  в  течение 2 часов  при  температуре  минус 400С.  Микробные 
клетки в  дезинтеграторе замораживали при той же температуре в  течение 8 
часов. После этого проводили разрушение клеток на гидравлическом прессе, 
четырехкратно  продавливая  бакмассу  через  калиброванное  отверстие 
патрона дезинтегратора. Далее биомассу размораживали и центрифугировали  
при 20000g в течение 30 минут. 
      III стадия. Ультразвуковая дезинтеграция 

               Осадок,  полученный  после  предыдущей  стадии,  суспендировали  в 
0,9%  растворе  хлорида  натрия  рН 7,2 в  соотношении 1:1, добавляли 
детергент  твин-80  до  конечной  концентрации 0,1% для  улучшения  
солюбилизации  белковых  компонентов  структур  рибосом  и  мембран 
клеточных  элементов.  Полученную  суспензию  микробных  клеток  в  объеме 
30 мл помещали в дезинтегратор УЗДК – 2 Т и воздействовали ультразвуком 
в  течение 20 минут  при  частоте 22 кГц.  На  заключительном  этапе 
приготовления антигенного комплекса все полученные антигенные фракции 
смешивали. 
 
Метод иммунизации животных и получение специфических сывороток 
Для иммунизации использовали кроликов породы «Шиншилла», весом 
3–3,5  кг.  Животных  получали  из  питомника  Ставропольского  НИПЧИ  и 
после карантина использовали в опытах. 
Иммунизацию проводили по схеме, разработанной И.С. Тюменцевой с 
соавторами  (И.С.  Тюменцева,  Е.В.  Жданова,  Е.Н.  Афанасьева, 1994). В 
качестве  иммунокорректора  использовали  феракрил  (ФС 42-2742-90). Для 
получения высокоэффективных антител были подобраны оптимальные дозы 
антигена  и  сроки  иммунизации  животных.  Известно,  что  сыворотки, 
полученные  на  ранних  этапах  иммунизации,  обычно  имеют  более  низкую 
аффинность,  чем  полученные  позднее (T.P. Werblin, Tai Kim Young, G. W. 
Siskind, 1973). На аффинность антител влияет также величина дозы антигена, 
используемого  для  иммунизации.  Иммунизация  высокими  дозами  антигена 
не  только  вызывает    продукцию  низкоаффинных  антител,  но  и  приводит  к 
образованию  антител  против  посторонних  примесей.  Чтобы  уменьшить 
нежелательный  ответ  на  посторонние  антигены,  предпринята  попытка 
вызвать  к  ним  толерантность  путем  введения  животным  гомологичных 
антител (P. Qold, S.O. Freedmmam, 1965) в  период  основного  цикла  
иммунизации. 

Титр  антител  в  сыворотках  определяли  через 7 дней  после  последней 
иммунизации.  Иммунологическую  активность  сыворотки  определяли  в 
реакции радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (O. Ouchterlony, 1949) 
или в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). 
Если  титр  антител  исследуемых  сывороток  в  реакции  преципитации 
составлял – 1:16–1:32, то  проводили  полное  обескровливание  животного. 
При  низких  значениях  титра  животных-продуцентов  после  месячного 
перерыва подвергали процедуре реиммунизации. 
Методы контроля антигенов и сывороток 
Постановку  реакции  радиальной  иммунодиффузии  по  Оухтерлони 
проводили по методике (O. Ouchterlony, 1949).  
 Для  этого  в  чашках  Петри  с  агаровым  гелем  равномерной  толщины 
радиально вырезали лунки диаметром 3-4 мм на расстоянии 4-5 мм и вносили 
соответствующие  растворы.  При  контроле  титра  чумного  антигена 
центральную  лунку  заполняли  чумной  сывороткой  в  нативном  состоянии  с 
титром 1:16-1:32, остальные  лунки  заполняли  антигеном  чумным  в 
разведениях  от 1:2 до 1:64. Результат  учитывали  через 24 часа.  Последнее 
разведение  антигена,  дающее  преципитат,  считали  его  титром.  Титры 
чумного  антигена  составляли 1:32-1:64. При  контроле  титра  сывороток  
центральную  лунку  заполняли  соответствующим  антигеном,  а  остальные 
лунки заполняли сыворотками, в разведениях от 1:2 до 1:64.  
Постановка реакции непрямой иммунофлуоресценции 
Контроль  титра  сывороток    определяли  так  же  в  РНИФ             
(А.С. Лабинская, 1963; T.H. Weller, A.H. Coous, 1954). 
Полученную  чумную  сыворотку  разводили 1:10 в 0,9% растворе 
хлорида  натрия  рН 7,2 и  титровали  в  этом  же  растворе  двукратными 
разведениями  до  разведения 1:1280. На  фиксированные  мазки  чумного 
микроба  наносили  различные  разведения  сывороток  и  инкубировали 15-20 
мин  во  влажной  камере  при  температуре (22±4)0С.  Затем  промывали 
препараты  в 0,9% растворе  хлорида  натрия  по 10 мин  для  удаления  не 

адсорбированных белков сыворотки, подсушивали на воздухе и на 20-30 мин 
наносили  капли  рабочего  разведения  люминесцирующей  сыворотки  против 
иммуноглобулинов кролика, далее препараты промывали и высушивали, как  
описано  ранее.  Готовые  препараты  изучали,  предварительно  нанеся  на  них 
каплю  смеси  глицерина (9 частей)  и 0,9% раствор  хлорида  натрия (1 часть) 
(Н.А.  Самойлова,  В.Е.  Рыженков,  И.Я.  Ямчков, 1999). Микроскопию 
препаратов осуществляли в падающем отраженном свете в люминесцентном 
микроскопе серии «Люмам», используя соответствующие фильтры  согласно 
инструкции  по  эксплуатации  прибора.  За  положительный  результат 
принимали  яркую (4+, 3+) флуоресценцию  периферии  микробных  клеток. 
При исследовании полученных сывороток в РНИФ титр составлял не менее 
1:800-1:1600. 
Выделение иммуноглобулинов путем фракционирования 
полиэтиленгликогелем 
Иммуноглобулины из гипериммунных чумных сывороток выделяли по 
методу А.Polson et al. (A. Polson, Q.M. Potqieter, I.E. Larqier, 1984) с помощью 
полиэтиленгликоля  (ПЭГ).  С  этой  целью  смешивали  равные  количества 
иммунной  сыворотки  и 20% раствора  ПЭГ  рН 7,2. Раствор 
полиэтиленгликоля  добавляли  постепенно,  перемешивали  смесь  на 
магнитной мешалке в течение 30 мин при температуре (22±4)0С.  Оставляли 
смесь  при  40С  в  течение 18 часов  для  формирования  осадка,  затем 
центрифугировали  при 6000g  в  течение 45 минут.  Супернатант  удаляли. 
Осадок  ресуспендировали  в  дистиллированной  воде  рН 7,0 в  объеме 
исходной сыворотки, вновь добавляли равный объем 20% ПЭГ и повторяли 
вышеуказанную процедуру. После центрифугирования супернатант удаляли, 
а  осадок  ресуспендировали  в 0,1 М  ФСБ  рН 7,2 до  исходного  объема 
сыворотки.  В  полученный  раствор  вносили  хлороформ  до  конечной 
концентрации 1% к общему объему, герметически закрывали и помещали на 
встряхиватель  на 24 часа.  Центрифугировали 45 минут  при 6000g . Осадок 
удаляли,  а  супернатант,  содержащий  IgG, фильтровали  через  бумажный 

фильтр.  Выход IgG при  таком  методе  выделения  составлял 87-90% (S.P. 
Mayer, 1989). Концентрация  белка  полученных  иммуноглобулинов  чумных 
составила 15 мг/мл.   Рабочий титр в РИД – 1:16-1:32, в РНИФ – 1:800-1:1600. 
 
Получение иммунопероксидазных конъюгатов и их контроль в 
ИФА 
Иммунопероксидазные  чумные  конъюгаты    получали  методом 
перйодатного окисления по методикам (P.K. Nakane, A. Kawaoi, 1974). С этой 
целью  использовали  иммуноглобулины  чумные,  полученные  по  ранее 
описанной методике с рабочим титром в РИД 1:16-1:32. 
Для  конъюгации IgG с  ферментом  использовали  пероксидазу  хрена, 
тип VI, Rz 3.0 (Serva) с  активностью 500 ед,  которую    в  количестве 5 мг 
растворяли  в 1 мл 0,3 М  раствора  натрия  углекислого.  Добавляли 0,025 мл 
0,32% раствора формалина, перемешивали на магнитной мешалке в течение 
30  минут.  Добавляли 1 мл 0,04 М  раствора  перйодата  натрия  и 
перемешивали,  как  ранее  описано.  По  истечении  времени  инкубации 
добавляли 1 мл 0,16 М  раствора  этиленгликоля,  перемешивали 1 час.  Все 
перечисленные  операции  проводили  при  температуре (22±4)0С.  Затем 
раствор  диализовали  против 0,01 М  карбонат  бикарбонатного  буферного 
раствора рН 9,5 при 40С в течение 18 часов. Раствор переносили во флакон, 
добавляли 1 мл  иммуноглобулинов  чумных  с  концентрацией 10 мг/мл, 
перемешивали 2 часа при температуре (22±4)0С. Добавляли 5 мг боргидрида 
натрия, оставляли без перемешивания на 2 часа при 40С. Раствор диализовали 
против 0,1 М  ФСВ  рН 7,2 в  течение 18 часов  при  40С.  Затем  раствор 
наносили  на  хроматографическую  колонку  с  сефадексом G-100, 
уравновешенную 0,1 М  ФСБ  рН 7,2. Элюировали  тем  же  буферным 
раствором  при  40С,  собирали  фракции    по 3 мл.  Каждую  фракцию 
фотометрировали  при  длине  волны 280 нм  и 403 нм.  Отбирали  фракции,  у 
которых  отношение  экстинций 403/280 нм (Rz) было 0,35-055. Во  фракции 

добавляли бычий сывороточный альбумин 10 мг на 1 мл. Фракции разливали 
в ампулы по 0,2 мл и лиофилизировали. 
Рабочий  титр  иммунопероксидазного  конъюгата  чумного  определяли 
методом  двойного  антительного  «сэндвича»  по  методике  (Н.Ф.  Василенко, 
Л.И. Заревина, А.И. Мирошниченко, О.Н. Лопаткин, Г.И. Башкова, 1988). В 
работе  использовали  полистироловые  планшеты  для  иммунологических 
реакций Московского опытного экспериментального завода. 
Планшеты 
сенсибилизировали 
иммуноглобулинами 
чумными, 
полученными  по  ранее  описанной  методике,  в  концентрации 100 мкг/мл  в 
объеме 0,1 мл  ФСБ  рН 7,4, инкубировали 3 часа  при  температуре 370С. 
Несорбированные иммуноглобулины удаляли, в лунки вносили по 0,1 мл 1% 
бычьего  сывороточного  альбумина,  инкубировали 1 час  при 370С.  После 
удаления в лунки вносили по 0,1 мл чумного антигена, полученного по ранее  
описанной  методике,  с  концентрацией  белка 0,1 мг/мл,  инкубировали 1 час 
при  температуре 370С.  Несвязавшиеся  антигены  удаляли,  планшеты 
промывали 5-кратно  по 3-4 мин 0,05% раствором  твин-20  в  ФСБ  и 
просушивали.  Затем  вносили  по 0,1 мл  разведенного  пероксидазного 
конъюгата  от 1:100 до 1:800 и  инкубировали 1 час  при  температуре 370С. 
После  промывки  добавляли  по 0,1 мл  свежеприготовленного  субстрат-
индикаторного раствора (0,1 М лимонная кислота с 0,2 М раствором натрия 
фосфорнокислого  однозамещенного  рН 5,0 в  присутствии 0,006% перекиси 
водорода  и  ортофенилендиамина  в  концентрации 0,4 мг/л)  и  инкубировали 
10 мин при температуре (22±4)0С без доступа света. Для остановки реакции 
использовали 0,2 М раствор серной кислоты. 
Результаты  реакции    учитывали  визуально  и  на  анализаторе 
колориметрическом  иммуноферментном  АКИ-Ц – 0,1 при  длине  волны 492 
нм  путем  определения  оптической  плотности  проб,  находящихся  в  лунках 
планшета. Рабочий титр иммунопероксидазных чумных конъюгатов составил 
1:200 – 1:400. 

2.4.  Материалы для синтеза композиционных кремнеземных 
сорбентов и физико-химические методы их исследования 
При исследованиях использовали аэросил А-380 (ГОСТ 14922-77, х.ч.), 
с  содержанием  основного  вещества SiO2 – 99%. Данный  кремнеземный 
сорбент  представляет  собой  продукт  высокотемпературного  парофазного 
гидролиза  четыреххлористого  кремния  в  токе  кислорода  с  последующей 
конденсацией в парах воды. Аэросил – это непористый кремнезем, имеющий 
форму  частиц,  которая  близка  к  сферической.  В  качестве  объекта  для 
сравнения  структуры  использованы  образцы  макропористого  кремнезема  
силохром  С–120,  а  также  аэросилогель,  полученный  на  основе  аэросила  А–
380. 
Характеристики кремнеземных сорбентов представлены в табл. 2. 
В  качестве  модификаторов  сорбентов  использовали  следующие 
вещества: хитозан – полностью дезацетилированный продукт – поли [(1-4) –2 
–амино – 2-дезокси –   – D  –  глюкозы],  полученный на заводе им. Войкова 
(г. Москва), молекулярной массой Мw = 200000, степенью дезацетилирования 
0,8 и степенью кристалличности 75%. 
В  экспериментальных  исследованиях  были  использованы  хлориды 
титана,  алюминия,  циркония  марки  о.с.ч.,  а  также  пероксид  водорода, 
азотная, соляная, серная и уксусная кислоты марки х.ч. 
 Удельную  поверхность  сорбентов  определяли  по  низкотемпературной 
адсорбции  азота,  используя  методику  Клячко–Гурвича  (А.А.  Клячко–
Гурвича, 1961), а  объем  пор  и  их  распределение  по  размерам – методом 
ртутной порометрии (Т.Г. Плаченов, 1965). 
2.4.1. Химический анализ элементоксидных слоев сорбентов 
Определение титана 
В  ходе  анализа  навеску  титаносодержащего  кремнеземного  сорбента 
массой 0,1–0,15 г  помещали  в  колбу  на 25 мл,  приливали 5 мл 
концентрированной  H2SO4  и  нагревали  на  водяной  бане  в  течение 3 часов. 
Далее  раствор  сливали  в  мерную  колбу  на 25 мл,  навеску  сорбента 

промывали  небольшими  порциями  дистиллированной  воды,  которую 
переносили  в  ту  же  колбу,  затем    добавляли 3 мл 3%–ного  пероксида 
водорода  и  доводили  объем  раствора    до  метки  дистиллированной  водой. 
Измеряли  оптическую  плотность  раствора  при 410 нм  на  спектрофотометре 
СФ–46  и  определяли  содержание  титана  в  мг-экв/г  по  калибровочному 
графику в соответствии с методикой, описанной в работе (А.П. Нечипоренко, 
Г.К. Шевченко, С.И. Кольцов, 1981). 
 Определение алюминия 
Количественное определение алюминия в составе сорбентов проводили 
спектрофотометрическим  методом  на  приборе  СФ–46,  основанном  на 
измерении  оптической  плотности  сернокислого  раствора  алюминия  с 
красителем  алюмином.  Извлечение  данного  химического  элемента  и 
контроль  осуществляли  по  методике,  предложенной  в  работе  (А.П. 
Нечипоренко, Г.К. Шевченко, С.И. Кольцов, 1981). 
Определение циркония 
Содержание 
циркония 
в 
образцах 
сорбентов 
определяли 
спектрофотометрическим  методом  на  приборе  СФ–46,  измеряя  при 540 нм 
оптическую  плотность  раствора,  содержащего  комплекс  циркония  с 
красителем 2,4–(пиридилазо) – резорцином по методике (А.П. Нечипоренко, 
Г.К. Шевченко, С.И. Кольцов, 1981). 
Методика определения гидроксильных групп  
кремнеземных сорбентов 
Определение  гидроксильных  групп  в  исходном  аэросиле  А-380  и  образцах 
пористых  кремнеземов  проводили  с  применением  реактива  Гриньяра.  В 
основе  метода  определения  гидроксильных  групп  использована  их 
способность к взаимодействию с соединением CH3MgI с выделением метана. 
Данный метод ранее был применен для определения гидроксильных групп в 
образцах  силохромов  и  силикагелей  (С.И.  Кольцов,  Г.Н.  Кузнецова,  В.Б. 
Алесковский, 1967). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
Таблица 2.                  Характеристики кремнеземных сорбентов 
 
 
Содержание 
Удельная 
Размер пор, 
Объем пор, V, 
Наименование сорбента 
-ОН групп, 
поверхность, 
Тип структуры 
SiO
 d, нм 
cм3/г 
2,     % 
S,  м2/г 
мг-экв./г 
Аэросил А–380 99,9 
1,95  380 

-  Аморфная 
Силохром С–120 
Аморфно-
99,8 1,28 
127 
40 
1,46  глобулярная 
Аэросилогель 
Аморфно-
99,8 1,45 
140 
36 
1,44  глобулярная 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
2.4.2. Физико-химические методы исследования 
Электронная микроскопия сорбентов 
Микроструктуру  сорбентов  исследовали  на  сканирующем  электронном 
микроскопе IMZ – Т3000  при  ускоряющем  напряжении 15 кВ,  разрешении 
70  А0  и  увеличении  в 10000 раз.  Навески  сорбентов  по 20 мг    помещали  в 
специальный  держатель  из  латуни,  покрытый слоем  графита.  Затем  образец 
вводили в вакуумный пост прибора и на поверхность наносили слой никеля 
толщиной 80–100А0,  после  этого  проводили  исследования  микроструктуры 
как описано в работе (Я. Фрайфельдер, 1980). 
 
Электронная спектроскопия сорбентов в УФ – области 
Исследование  сорбентов  проводили  методом  спектроскопии  в 
отраженном  диффузно – рассеянном  свете  относительно  стандарта MgO на 
приборе AQV – 50 ”Shimadzu” в диапазоне 290-700 нм (Г.Г. Русин, 1990). 
 
ИК – спектроскопия 
ИК– спектры сорбентов исследованы на спектрофотометре Specord-75 
IR (Германия)  в  диапазоне  волновых  чисел 500-4000 см-1.  Из  образцов 
исследуемых  сорбентов  и  наполнителя  бромистого  калия  прессованием 
получали  прозрачные  однородные  таблетки,  которые  далее  использовали  в 
ИК– спектроскопии. Идентификацию поверхностных функциональных групп 
сорбентов  проводили,  используя  корреляционную  диаграмму  отнесения 
полос поглощения основных групп и связей (А.В. Киселев, 1972). 
 
2.5. Сублимация биопрепаратов 
Препараты  (антигены,  иммунные  сыворотки,  иммуноглобулины, 
конъюгаты,  вакцина Y. pestis EV), разлитые  в  ампулы,  замораживали  в 
морозильном  столе  НС 700/50 «Frigera» (ЧССР)  до  температуры -400С  и 
выдерживали  в  течение 16-18 часов.  Перед  загрузкой  ампул  в  лиофильную 

установку  (ТG-S  Германия)  температуру  десублиматора  доводили  до -700С. 
В  камеру  загружали  ампулы,  герметизировали,  устанавливали  рабочее 
давление 10-30 Па.  Препараты  высушивали  до  температуры (28±10С), 
выдерживали  при  этой  температуре 3-4 часа,  что  позволяло  достичь 
величину потери массы при высушивании 2-4%. Время лиофилизации (18±2) 
часа.  Ампулы  с  препаратами  запаивали  на  газокислородной  горелке  и 
хранили  при  температуре 4-60С.  По  внешнему  виду  лиофилизированные 
препараты имели вид пористой таблетки без признаков микрооттаивания.  
 
2.6. Статистическая обработка результатов исследований 
С  целью  подтверждения  достоверности  и  воспроизводимости 
результатов, полученных при экспериментальных исследованиях, применяли 
математические методы (Т.Н. Зайцев, 1991). 
Обработку  результатов  экспериментов  проводили  на  компьютере 
“Pentium-3”.  Для  расчета  средней  квадратичной  ошибки  отдельного 
измерения (S), выборочной дисперсии, вероятного квадратичного отклонения 
среднеарифметического (Е0,95) использованы ниже приведенные формулы: 
 
(1) 
 
где:  Сi – единичное  измерение;С – среднее  арифметическое  из  всех 
измерений; f–число  степеней  свободы,  показывает  число  вероятных 
измерений, которые соответствуют первому результату. 
Доверительный  интервал  среднего  арифметического  зависит  от 
степени свободы f и вычислен по формуле:  
          t х S 
E =      n   
   (2) 
          
где:   S –  число  параллельных  определений; n– число  параллельных 
определений; t–критерий Стьюдента.   
 

Глава 3. Синтез композиционных магноиммуносорбентов и 
исследование их свойств 
3.1. 
Синтез 
хитозанкремнеземных 
и 
элементсодержащих 
композиционных магносорбентов 
Анализ  данных  литературы,  который  представлен  в 1 главе, 
свидетельствует  о  том,  что  оптимизация  состава  и  структуры  твердого 
носителя  является  одним  из  важнейших  факторов,  способствующим 
повышению  экспрессности  и  чувствительности  метода  количественного 
твердофазного иммунохимического анализа микроорганизмов. 
Целью  данного  раздела  является  получение  ферромагнитных 
сорбентов, обладающих заданным составом, адсорбционными и магнитными 
свойствами,  которые  могут  быть  использованы  для  проведения 
иммуноанализов  микроорганизмов.  Одной  из  задач  исследований  также 
является  исследование  магнитоуправляемых  сорбционных  материалов  для 
глубинного культивирования вакцинного штамма  чумного микроба. 
Синтез  магносорбентов  с  высокой  сорбционной  активностью 
осуществлен  методом  формирования  пористой  структуры  носителя  в 
присутствии  органических  полимеров  в  соответствии    с  принципами, 
сформулированными в работе А.В. Брыкалова  (1993). 
Кремнезем-аэросил  А-380,  характеристики  которого  предоставлены  в 
главе 2, использован  в  качестве  структурного  компонента,  формирующего 
остов композиционного сорбционного материала. 
В качестве органических компонентов синтеза использован 3% раствор 
хитозана  в 3% уксусной  кислоте.  В  качестве  магнитного  компонента  при 
синтезе применяли магнетит (Fe3O4),  а также разработан способ получения 
магносорбентов  путем  введения  на  стадии  получения  гидрогеля  оксалата 
железа (II). 
Схема  получения  магноиммуносорбентов  включает 8 стадий  и 
представлена ниже (рисунок 1). 

 
Стадии 1-3 характеризуют  процесс  синтеза  магносорбентов  на  основе 
формирования  пористой  структуры  органокремнеземной  матрицы  в 
присутствии компонентов синтеза. 
На  стадии I за  счет  протекающих  процессов  конденсации  с  участием 
силанольных групп кремнезема – аэросила образуется гидрогель. На стадии 2 
при  созревании  и  синерезисе  гидрогеля  протекают  дегидратационные 
процессы, что приводит к уменьшению объема гидрогеля, его уплотнению. 
 
 
 
Стадия 1 
Получение гидрогеля из аэросила и компонентов 
 
синтеза (хитозан, Fe3O4, оксалат железа (II) ) 
 
  
Стадия 2 
 
Созревание и синерезис композиционного 
 
гидрогеля 
 
 
Стадия 3 
Термообработка гидрогеля и образование ксерогеля
 
 
 
 
Механическое размельчение ксерогеля 
Стадия 4 
 
 
Выделение высокодисперсной фракции 
Стадия 5 
магносорбента методом рассева 
 
 
 
Стерилизация магносорбента методом 
Стадия 6 
автоклавирования 
 
 
 
Химическое модифицирование магносорбента 
 
функциональными группами (метод 
Стадия 7 
бензохиноновый, глутаральдегидный, окисления 
 
перхлоратом) 
 
 
Стадия 8 
Ковалентное присоединение к магносорбенту 
 
лиганда (антигены, антитела) 
Рисунок 1.  Схема получения магноиммуносорбентов 

 
На стадии 3 при термообработке гидрогель превращается в ксерогель, 
при  этом  объем  его  уменьшается  в 8–15 раз  благодаря  действию 
капиллярных  сил.  На  стадиях 4–8 завершается  процесс  синтеза 
композиционных 
магносорбентов, 
обеспечивающий 
выделение 
высокодисперсной 
фракции, 
получение 
стерильного 
сорбционного 
материала,  а  также  его  активирование  функциональными  группами  с 
последующей иммобилизацией лигандов. 
Структура  композиционных  сорбентов  представлена    корпускулярной 
системой,  которая  состоит  из  частиц  кремнезема,  покрытых  полимером 
хитозаном. Размер корпускул определяет величину удельной поверхности, а 
плотность  их  упаковки - объем  и  радиус  пор.  Механизм  образования 
пористых  хитозанкремнеземных  магносорбентов  можно  представить  как 
сложный  процесс,  сопровождающийся  формированием  корпускулярной 
структуры  кремнеземного  остова  из  непористых  частиц  аэросила  А–380  и 
включением  в  него  органического  полимера  хитозана  и  магнетита. 
Рассмотренный 
механизм 
образования 
композиционных 
сорбентов 
согласуется  с  данными  литературы  по  получению  органокремнеземных 
сорбентов  для  аффинной    хроматографии  и  носителей  для  иммобилизации 
ферментов (А.В. Брыкалов, 1993).  
Получение  магносорбентов  проводили  разработанными  нами  двумя 
методами (И.С. Тюменцева, Д.А. Грядских, 2002; Д.А. Грядских, 2002; Д,А. 
Грядских, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, 2003). 
По  первому  методу  на  первой  стадии  синтеза  сорбента  использовали  
готовый  магнетит.  Для  этого  к  5г  аэросила  А–380  добавляли 3% раствор 
хитозана в 3% уксусной кислоте и магнетит в количестве 0,5–3г. Полученный 
продукт  подвергали  гелеобразованию  в  течение 4 часов  при 22оС, 
предварительно поместив гидрогель в кварцевые кюветы. Затем полученный 
продукт  высушивали  до  образования    ксерогеля  в  течение 2 часов  при 
температуре 95-105оС,  измельчали,  а  затем  методом  рассева  выделяли 
фракции размером частиц 70–150 мкм. 

 
По  второму  методу  на  первой  стадии  синтеза  использовали  оксалат 
железа. Для этого к 5г аэросила А–380 добавляли 3% раствор хитозана в 3% 
уксусной  кислоте  и  далее  оксалат  железа  в  количестве 1,5–3г.  Процесс 
синтеза  сорбентов  затем  проводили  по  схеме  получения  магносорбентов, 
приведенной  ранее  (рисунок 1). Отличие  в  том,  что  на  стадии 3 
термообработку  гидрогеля  и  высушивание  ксерогеля  проводили  при 
температуре 180оС.  При  этом  происходит  разложение  оксалата  железа  до 
FeO, далее образование Fe2O3 и получение магнетита Fe3O4. 
Проведены исследования структурных характеристик магносорбентов. 
Методом,  основанным  на  низкотемпературной  сорбции  азота,  была 
определена  удельная  поверхность  сорбционных  материалов.  Суммарный 
объем  пор  и  диаметр  пор  определены  методом  ртутной  порометрии  на 
приборе AYTO PORE 9200. 
В  таблице 3 представлены  структурные  характеристики  сорбентов, 
полученные  методом  формирования  пористой  структуры  кремнеземной 
матрицы  в  присутствии  органического  полимера  хитозана  и  использовании 
магнетита. 
Таблица 3.     Характеристики магносорбентов в зависимости от 
количества магнетита, используемого в синтезе 
 
Массовое  соотношение  Время 
Удельная 
Объем 
Наименование 
компонентов синтеза 
гелеобра-
Диаметр 
поверх-  
пор, 
образца 
зования, 
пор, нм 
SiO2 Fe3O4  Хитозан 
ность, м2/г  см3/г 
ч 
МХКС2,5 
5 2,5 
1,5  4 
68 
1,5 35 
МХКС1,5 5 
1,5 
1,5 4  74  1,4 
32 
МХКС0,5 5 
0,5 
1,5 4  82  1,2 
26 
 
 
Результаты,  представленные  в  таблице 3, показывают,  что  при 
увеличении  количества  магнетита,  вводимого  в  компонентный  состав 

 
сорбента, наблюдается некоторое снижение величины удельной поверхности 
сорбентов и увеличение объема пор. 
В 
таблице 4 представлены 
структурные 
характеристики 
хитозанкремнеземных  магносорбентов,  полученных  методом  формирования 
пористой  структуры  кремнеземной  матрицы  в  присутствии  полимера 
хитозана и оксалата железа.  
 
Таблица 4.   Характеристики магносорбентов в зависимости от 
количества оксалата железа,  используемого в синтезе 
Массовое соотношение 
Время 
Удельная 
Объем 
Наименование 
компонентов синтеза 
гелеобра-
Диаметр 
поверх-  
пор, 
образца 
Оксалат 
зования, 
пор,нм 
SiO2  Хитозан 
ность, м2/г 
см3/г 
железа 
ч 
МХКС3 
5 1,5  3 

70  1,63  37 
МХКС2,5 5 
1,5 2,5 4  73 1,55 
34 
МХКС2 5 
1,5 
2 4 78 
1,35 
30 
 
 
При сравнительном анализе данных таблиц 3 и 4 следует отметить, что 
с  использованием  в  качестве  компонента  для  синтеза  сорбентов  оксалата 
железа  получаемые  магносорбенты  имеют  несколько  меньшую  удельную 
поверхностью  и  большее  значение  объема  пор.  Это  объясняется,  по-
видимому,  разрыхляющим  и  активирующим  влиянием  газообразных 
продуктов, выделяющихся при разложении оксалата железа, с образованием 
FeO, далее Fe2O3 и магнетита. 
В  последующем  проведены  исследования  по  количественной  оценке 
магнитных  свойств  разработанных  композиционных  магносорбентов.  При 
этом  использовали  вибрационный  метод.  Для  определения  магнитных 
свойств  сорбент  закреплялся  на  конце  тонкого  стержня  из  немагнитного 
материала,  который  с  помощью  цангового  зажима  соединялся  с 
вибрационной  системой,  приводящей  образец  в  колебательное  движение. 
Образец  магносорбента  располагался  между  четырьмя  измерительными 

 
катушками,  которые  неподвижно  закреплялись  на  полюсах  электромагнита. 
Магнитный  момент  сорбента  определяли  по  магнитному  моменту  эталона–
пластинки из никеля. 
 Расчет удельной намагниченности проводили по следующей формуле: 
             Еобр. х mэт.                                             
Муд. =    
              Еэт.  х mобр.                                  (3) 
 
где Еэт.,  mэт. - ЭДС и масса эталона; 
       Еобр., mобр. – ЭДС и масса сорбента 
 
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 5. 
 
Таблица 5.  Магнитные свойства хитозанкремнеземных  магносорбентов 
 
Массовое соотношение 
Удельная 
Наименование 
Удельная намагниченность 
компонентов синтеза 
поверх- 
образца 
насыщения, МН, А х м2/кг 
SiO2  Хитозан Fe3O4 
ность, м2/г 
МХКС2,5 
5 1,5  2,5  68 
17,4 
МХКС1,5 5 
1,5 1,5 74 
10,2 
МХКС0,5 5 
1,5 0,5 82 
4,3 
 
Результаты 
исследований, 
представленные 
в 
таблице 5, 
свидетельствуют,  что  величина  удельной  намагниченности  насыщения 
возрастает с увеличением содержания магнетита в составе композиционных 
хитозанкремнеземных сорбентов. 
На  сканирующем  электронном  микроскопе IMZ–Т3000  проведены 
исследования 
микроструктуры 
полученных 
композиционных 
магносорбентов  по  сравнению  с  известными  кремнеземными  материалами, 
такими  как  макропористое  стекло  МПС 200 ВГХ,  силохром  С–120  и 
гидротермальный  силохром  по  методике,  представленной  в  разделе 
«Материалы  и  методы».  При  этом  сорбент  помещали  в  специальный 
держатель  из  латуни,  покрытый  слоем  графита.  Затем  образец  вводили  в 
вакуумный пост   прибора и на поверхность наносили слой никеля толщиной 
80–100А0.  На  рисунке 2 представлены  фотографии  микроструктур 

 
композиционного хитозанкремнеземного сорбента в сравнении с силохромом 
С–120. Для силохрома С–120 характерна однородная глобулярная структура 
с размером сросшихся корпускулярных частиц оксида кремния около 20 нм. 
В  отличие  от  силохрома,  топография  поверхности  макропористого  стекла 
представлена  губчатой  структурой  (рисунок 3). Измененную  глобулярную 
структуру 
имеет 
композиционный 
хитозанкремнеземный 
сорбент. 
Особенностью  его  структуры  является  сочетание  обширных  участков 
аморфных образований с губчатой структурой. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 

Рисунок 2. Электронная микроскопия   
1- композиционный хитозанкремнеземный магносорбент (МХКС1,5) 
2- силохром С-120     Увеличение х10000 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
Рисунок 3. Электронная микроскопия 
1. - макропористое стекло МПС 2000 ВГХ 
2. - гидротермальный силохром С–120    
Увеличение х10000  

 
На приборе AQY–50 “Shimadzu” выполнены исследования по спектрам 
диффузного 
отражения 
композиционных 
хитозанкремнеземных 
магносорбентов  в  сравнении  с  аэросилом  А–380  и  аэросилогелем  на  основе 
данного  аэросила  (рисунок 4,5). Установлено,  что  близкие  спектры 
диффузного  отражения  в  диапазоне 550–700 нм  имеют  магнетит  и 
композиционный  сорбент,  содержащий 50% магнетита.  С  уменьшением 
содержания  магнетита  в  составе  магносорбента  наблюдается  закономерное 
уменьшение поглощения в спектральной области 350–660 нм. По сравнению 
с  аэросилом  и  с  аэрогелем  увеличение  количества  хитозана  и  магнетита  в 
составе  композиционных  сорбентов  приводит  к  разному  увеличению 
поглощения.  
Полученные  данные  по  спектрам  диффузного  отражения  могут  быть 
использованы для оптимизации условий синтеза композиционных сорбентов, 
а  также  их  идентификации,  количественного  определения  содержания 
полимера хитозана в сорбционном материале. 
Разработана технология получения элементсодержащих кремнеземных 
сорбентов 
на 
основе 
аэросила 
А–380 
методом 
деструкционно-
эпитаксиального 
осаждения 
(ДЭО), 
ранее 
используемого 
для 
модифицирования  силикагеля  такими  химическими  элементами,  как  медь, 
цинк, кобальт, магний, марганец (В.Б. Алесковский, 2001). 
Для  синтеза  элементсодержащих  кремнеземных  сорбентов  к 4 г 
аэросила  А–380  добавляли 100 мл 0,15 М  растворов  соответствующих  для 
каждого  отдельного  синтеза  солей CuSO4, MgSO4, CoSO4, MnSO4, FeCl2  в 
0,25М  растворе  водного  аммиака.  Суспензию  выдерживали  в  течение 24 
часов  при 230оС.  Далее  сорбент  отмывали  дистиллированной  водой  до 
нейтральной реакции в промывных водах, высушивали при температуре 95-
110оС  в  течение 2 часов.  Затем  сорбент  измельчали  и  методом  рассева 
выделяли фракцию с размером частиц 80–120 мкм. 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 4. Спектры диффузного отражения сорбентов 
1. - аэросил А–380 
2. - аэросилогель на основе аэросила А–380 
3. - хитозан 
4. - хитозанкремнеземный сорбент (ХКС1,5) 
5. - хитозанкремнеземный сорбент (ХКС0,75) 
6. - хитозанкремнеземный сорбент (ХКС0,39) 

 
Количественный 
химический 
анализ 
полученных 
сорбентов 
подтвердил образование поликремневых солей химических элементов, таких 
как  медь,  магний,  марганец,  кобальт,  и  процесс  образования 
модифицированных  кремнеземов  согласуется  с  механизмом,  предложенным 
в работе В.Б. Алесковского  (2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 5. Спектры диффузного отражения сорбентов 
1. - магнетит Fe3O4 
2. - магнитоуправляемый хитозанкремнеземный сорбент (МХКС2,5) 
3. - магнитоуправляемый хитозанкремнеземный сорбент (МХКС1,25) 
4. - магнитоуправляемый хитозанкремнеземный сорбент (МХКС0,5) 
5. - магнитоуправляемый хитозанкремнеземный сорбент (МХКС0,25) 
 

 
Так, при  контакте  кремнезема с аммиачным раствором  сульфата  меди 
происходит  ионный  обмен:  протоны  гидроксильных  групп  кремнезема 
замещаются комплексными ионами в соответствии с уравнением химической 
реакции: 
[SiO2]x HOH+[Cu(NH3)4]2+                      [SiO2]x O[Cu(NH3)4] +2H+     (4) 
 
Далее происходит гидролиз сорбированного аммиаката меди: 
 
 
[SiO2]x O • [Cu(NH3)4] + 4H2O         [SiO2]x O •  Cu +4NH4OH  
(5) 
 
В аммиачном растворе растворимость кремнезема увеличивается и при 
этом  накапливается  растворенная  кремниевая  кислота.  В  растворе, 
содержащем ионы меди и кремниевую кислоту, образуется силикат меди. 
 
Cu2+ + H2SiO3            CuSiO3 + 2H+               (6) 
 
Как  известно,  силикат  меди - трудно  растворимое  соединение  и  в 
процессе  превращений  на  поверхности  кремнезема  начинается  его 
осаждение, что в  целом заключает процесс деструкционно-эпитаксиального 
осаждения. При высушивании сорбента с использованием в качестве основы 
для  синтеза  непористого  аэросила  А–380  протекает  сложный  процесс 
образования  аморфно-корпускулярной  структуры  за  счет  конденсационных 
процессов с участием гидроксильных групп кремнезема.  
В  таблице 6 представлены  структурные  характеристики  и  содержание 
некоторых химических элементов в составе сорбционных материалов. 
 
 
 
 
 

 
Таблица 6.     Характеристика сорбентов 
 
Удельная 
Суммарный 
Содержание  химических  элементов, 
Сорбенты 
поверхность,  объем  пор,  мг-ион/г SiO2 
м2/г 
см3/г 
Cu Mg Ca  Co  Mn Fe 
Аэросилогель–Со 
170 1,35 - 


1,15 


Аэросилогель–Cu 
164 1,40 1,2 - 




Аэросилогель–Mg 
175 1,30 - 
1,13 - 



Аэросилогель–Ca 
150 1,50 - 

1,1 



Аэросилогель–Mn 
160 1,42 - 



1,1 

Аэросилогель–Fe 
153 1,40  
 
 
 
 
1,1 
 
Данные  таблицы 6 свидетельствуют  о  том,  что  хотя  синтез 
элементсодержащих  кремнеземных  сорбентов  протекает  в  присутствии 
разных  по  химическому  составу  веществ,  однако  при  этом  проявляется 
общая закономерность в формировании пористой структуры. 
Спектры  диффузного  отражения  элементсодержащих  образцов 
кремнеземов,  выполненные  на  спектрофотометре AQV–50 “Shimadzu” с 
интегрирующей  сферой  относительно  непоглощающего  стандарта MgO, 
представлены на (рисунок 6). 
Наиболее 
активное 
влияние 
химического 
модифицирования 
кремнеземного  сорбента  проявилось  в  спектральной  области 250–400 нм. 
Спектр  диффузного  отражения  кремнеземов,  имеющих  в  составе  кальций  и 
магний,  близки  к  спектру  аэросила  А–380.  Хромофорные  металлы, 
содержащиеся  в  элементсодержащих  кремнеземах,  приводят  к  резкому 
увеличению  поглощения  в  спектральной  области 250–400 нм,  причем 
кобальт и марганец дают широкую полосу поглощения,  а медь способствует 
сдвигу  полосы  поглощения  в  коротковолновую  область.  Полученные 
результаты  по  спектрам  диффузного  отражения,  на  наш  взгляд,  можно 
использовать  для  оптимизации  условий  синтеза  элементсодержащих 
сорбентов, их идентификации. 

 
Таким  образом,  нами  разработан  синтез  элементсодержащих  
сорбентов 
с 
магнитным 
компонентом–магнетитом. 
Технология             
получения  магносорбентов  соответствует  приведенной  ранее,  с  тем  лишь 
отличием,  что  на  начальном  этапе  включают  введение  магнетита  в 
количестве от 0,5 до 2,5 г. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 6.  Спектры диффузного отражения сорбентов 
1. - аэросилогель Са;  2.- аэросилогель Mg;  3. - аэросилогель Cu; 
4. - аэросилогель Co;  5. - аэросилогель Mn;  6. - аэросилогель A–380 
 
Проведены 
исследования 
кислотных 
свойств 
поверхности 
композиционных  сорбентов,  полученных  методом  формирования  пористой 
структуры кремнеземной матрицы в присутствии полимера хитозана, а также 
элементсодержащих  сорбентов,  синтезированных  методом  деструкционно-
эпитаксиального осаждения. 

 
Для 
определения 
Бренстедовских 
кислотных 
центров 
модифицированных 
композиционных 
сорбентов 
применяли 
метод 
ионообменной адсорбции в водном растворе (А.В. Брыкалов, С.И.  Кольцов, 
В.И. Ковальков и др., 1986). 
В качестве химического вещества – зонда для определения кислотных 
свойств  сорбентов  использовали  титрованный  раствор 0,13М  ацетата 
аммония, ионный обмен которого с поверхностью сорбентов осуществлялся 
по следующей схеме: 
 
Нсв. + NH
 св.
4 +                     H+ + NH4
                       (7) 
 
где Н+, NH  +
4   – ионы в растворе; 
Hсв., NH  св.
4
 – ионы, связанные с поверхностными центрами сорбента 
 
Для  проведения  исследований  брали 4 навески  сорбента  массой 0,1; 
0,3; 0,5 и 1 г,  помещали  в  плоскодонные  колбы  на 50 мл  и  добавляли  в 
каждую  по 25 мл 0,13М CH3COONH4,  плотно  закрывали  колбы  пробками. 
Содержимое  инкубировали  при  температуре 24оС  в  течение 24 часа.  Далее 
надосадочную  жидкость  декантировали  в  химический  стакан  на 50 мл  и 
измеряли рН раствора на иономере универсальном ЭВ–74. 
Расчет концентрации бренстедовских кислотных центров В0 проводили 
по формуле: 
Сх х 25 
В0=                                                (8) 
Р х S 
 
 
где:  Сх – концентрация  уксусной  кислоты,  образовавшейся  при 
взаимодействии  ацетата  аммония  с  кислотными  центрами  сорбента  в  мг-
экв/мл; 
Р – навеска образца в г; S – удельная поверхность образца в м2/г. 

 
Поскольку между ионами Н+ и NH +
4   в растворе и ионами Нсв. и NHсв.4, 
адсорбированными  поверхностными  центрами  сорбентов,  существует 
динамическое  равновесие,  были  рассчитаны  константы  равновесия  Кср., 
позволяющие оценивать относительную силу кислотных центров: 
                  [H+] х [NH+4] 
Кср.  =  
               [Hсв.] х [NH+4] 
  (9) 
 
В  приведенной  формуле  величина  концентрации  ионов [H+] 
соответствует величине измеряемых значений рН раствора ацетата аммония, 
в котором находится исследуемый образец сорбента; [Hсв.] – равна разности 
общей  концентрации  кислотных  центров  и [NHсв.4]; [NH+4] – находят  из 
концентрации ионов [NH+4] в исходном растворе ацетата аммония за вычетом 
концентрации [NHсв.4], [NHсв.4] – соответствует  значению  концентрации 
уксусной  кислоты,  образовавшейся  при  взаимодействии  ацетата  аммония  с 
сорбентами. 
В таблицах 7 и 8  представлены данные концентрации бренстедовских 
кислотных  центров  и  констант  равновесия  Кср.  для  образцов  сорбентов, 
полученных  методом  формирования  пористой  структуры  кремнезема  в 
присутствии  полимеров  декстрана  и  хитозана,  а  также  элементсодержащих 
сорбентов,  синтезированных  методом  деструкционно-эпитаксиального 
осаждения. 
 Из  данных  таблицы 7 видно,  что  композиционные  органо- 
кремнеземные сорбенты, по сравнению с исходным аэросилом А-380, имеют 
меньшие значения концентрации протонодонорных кислотных центров В0 и 
констант равновесия. Данную закономерность можно объяснить тем, что при 
синтезе  органокремнеземных  сорбентов  в  процессе  формирования 
корпускулярной  структуры  полимеры  декстран  и  хитозан  частично 
экранируют Бренстедовские центры кремнеземной матрицы. 
 

 
Таблица 7.    Расчет концентрации Бренстедовских кислотных центров 
в мг-экв/м2, констант равновесия Кср для композиционных 
сорбентов 
Навеска 
B0х10-3 
[NHc4]х10-3  [H+] х 10-3 [H6] х 10-3 [NH+4]х10-3 
Ксрх10-5 
сорбента 
мг-экв/м2 
Аэросил   
 
 
 
 
 
А-380 
0,1003 0,9 
5,62  - 

 
 
0,3000 1,0 
5,89  3,2 
126,1  1,1 
1,02 
0,5010 1,1 
6,16  5,9 
125,8   
 
1,0007 1,5 
7,94  12,5  124,1   
 
*ДКС 
 
 
 
 
 
 
0,1005 0,5 
1,32  - 

 
 
0,3012 0,9 
1,82  1,5 
131,1  0,83 
0,72 
0,5002 1,1 
2,19  2,9 
130,9   
 
1,0020 1,8 
3,39  6,19  130,2   
 
*ХКС 
 
 
 
 
 
 
0,1001 0,4 
1,17  - 

 
 
0,3004 0,5 
1,35  1,55  131,5  0,72 
0,44 
0,5010 0,7 
1,58  2,79  131,3   
 
1,005 0,9 
2,0  6,09  131,1   
 
 
*
ДКС – декстранокремнеземный сорбент 
*ХКС – хитозанкремнеземный сорбент    
При  синтезе  композиционных  сорбентов,  содержащих Fe2O3,  вводимый  до 
массового  количества 15% относительно  общей  массы  получаемого 
композиционного  сорбента,  наблюдается  усиление  кислотных  свойств 
поверхностных центров модифицированных кремнеземов (таблица 8). Кроме 
того  введение  в  состав  композиционного  сорбента Fe2O3  приводит  к 
уменьшению  на 25-30% удельной  поверхности  сорбентов,  что,  вероятно, 
обусловлено 
стабилизирующим 
действием 
оксида 
железа (II), 

 
проявляющимся  в  противодействии  процессу,  связанному  с  укрупнением 
корпускулярных  частиц в структуре модифицированного кремнезема. 
В  таблице 8 представлены  данные  по  кислотным  свойствам  элемент-
кремнеземных 
сорбентов, 
полученных 
методом 
деструкционно-
эпитаксиального  осаждения  содержащих  медь–,  кобальт– , железооксидные 
слои. 
Таблица 8.Расчет концентрации Бренстедовских кислотных центров 
и констант равновесия  ионного обмена для сорбентов 
№ 
Наименование сорбента 
В0 х10-3 мг-экв/м2  Кср. х 10-5 
п/п 
1.   Аэросил А-380 1,1 1,02 
2.   Аэросилогель СО 0,74  0,63 
3.   Аэросилогель Fe 
0,78 
0,71 
4.   Аэросилогель AI 
1,2 
1,12 
5.   Аэросилогель Сu 0,64 0,7 
6.   *ФХКС 1,2 
0,84 
 
*ФХКС – феррохитозанокремнеземный сорбент 
 
Синтез  элементсодержащих  кремнеземных  сорбентов  методом 
деструкционно-эпитаксиального  осаждения,  в  отличие  от  общеизвестных 
методов  синтеза  твердых  веществ,  протекает  не  путем  хаотичного 
междуатомного  и  межмолекулярного  взаимодействия,  а  путем  переноса  и 
закрепления  на  заранее  подготовленной  поверхности  каждый  раз  только 
одних, избранных структурных единиц. Данным методом по оригинальному 
синтезу получены магносорбенты, обладающие магнитными свойствами. 
Таким  образом,  в  результате    проведенных  исследований  получен 
набор  композиционных  сорбентов  с  оптимизированным  составом  и 
структурными характеристиками, изучены их спектральные характеристики, 
микроструктура  поверхности,  кислотные  свойства,  что  позволяет 

 
целенаправленно  использовать  сорбционные  материалы  для  последующего 
получения на их основе специфичных иммуносорбентов.  
 
3.2.  Химическое  модифицирование  поверхности  композиционных 
магносорбентов функциональными группами 
 
В  предыдущем  разделе  данной  главы  представлены  результаты 
исследований  по  синтезу  композиционных  сорбентов,  содержащих  в 
структуре полимер хитозан. 
С  целью  дальнейшего  активирования  композиционных  сорбентов 
функциональными 
группами 
нами 
разработаны 
три 
варианта 
модифицирования  носителей - бензохиноновый,  окислением  и  с 
применением глутарового альдегида: 
         
 
  
SiO2 
   
 
NaCIO4   SiO2     
 

  
(Fe2O3) 
   OH   
 
 
(Fe2O3) 
 C 
            (10) 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 H 
 
 
 
Синтез  альдегидосодержащего  магносорбента  проводили  следующим 
образом:  к 1 г  хитозанкремнеземного  сорбента  приливали 20 мл 
дистиллированной  воды,  содержащей 0,5 г  перхлората  натрия.  В  течение 1 
часа в темноте при температуре (22 ± 4)0С инкубировали сорбент. Затем его 
отмывали дистиллированной водой (6 кратно, по 70-80 мл). Была определена 
концентрация  альдегидных  групп  магносорбентов  в  соответствии  с 
методикой,  описанной  в  работе  автора  (В.А.  Климова, 1971), концентрация 
альдегидных  групп  на  поверхности  сорбентов  составила 0,42 мг-экв/г, 
результаты  по  достоверности  и  воспроизводимости  аналитического  метода 
представлены в таблице 9. 
 

 
Разработан 
метод 
модифицирования 
бензохиноном 
хитозанкремнеземных сорбентов:  
 
 
 
 
 SiO2  
 
OH   
 
 
 
 
 О 
            (11) 
(Fe2O3) 
 
 

 
 
 SiO2    
 
 
 
 
  
 
ОН   
 
 
(Fe2O3)  
           
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  
 
 
Получение  магносорбента  проводили  следующим  образом:  к 1 г 
композиционного  хитозанкремнеземного  сорбента  приливали  5мл 0,1 М 
фосфатного буфера с рН 8,5, содержащего 2,5 мг бензохинона. Инкубировали 
сорбент  при  температуре 22 +  40С  в  течение 1 часа.  Затем  магносорбент 
промывали трижды по 60–80 мл фосфатным буфером с pH 8,5. 
При 
данном 
химическом 
модифицировании 
образуются 
функциональные  группы  на  поверхности  сорбента,  которые  способны  к 
ковалентному  связыванию  с  остатками  аминокислот – тирозина,  лизина, 
гистидина, входящих в состав белкового лиганда (М. Тривен, 1983). 
В 
экспериментальных 
исследованиях 
использован 
вариант 
модифицирования поверхности магносорбентов глутаровым альдегидом. 
Получение  магносорбента  проводили  следующим  образом:  к 1 
хитозанкремнеземного  сорбента  добавляли 2 мл  дистиллированной  воды  и 
1,5  мл 25% глутарового  альдегида.  Инкубировали 15–17 часов  при 
температуре 22±40С.  Затем  сорбент  отмывали  шестикратно    по 60 мл 
дистиллированной водой. 
 

 
Таблица 9.       Воспроизводимость экспериментальных данных 
при определении альдегидных групп композиционных магносорбентов 
 
Образец 
E0.95  100% 
магносор-
Ci Ci–C C 
мг-экв/г 
S2 S 
С мг-экв/г 
С 
бента 
Альдегидо-
0,42 0 
 
 
 
 
 
компо-
0,42 0 
0,42  1,0х10-4 1,0х10-2 2,5х10-2 
0,42+0,03 
зиционный  0,41  +0,01  
 
 
 
 
сорбент 
1,25  
 
 
 
 
 
 
 
 
В таблице 10 представлены характеристики разработанных сорбентов. 
 
Таблица 10.    Характеристики композиционных сорбентов 
для иммобилизации лигандов 
Наименование синтеза 
Функциональные группы 
Применение 
 
Формирование 
 
Иммобилизация  антител 
пористой структуры 
и антигенов 
кремнезема в 
присутствии хитозана 
Бензохиноновый метод   
Ковалентная 
иммобилизация 
Метод окисления 
 
 
Деструкционно-
 
Координационно-ионная 
эпитаксиальное 
 
иммобилизация лигандов 
осаждение 
 
Где Э–Cu, Ca, Mg, Fe 
 

Таким  образом,  в  результате  проведенных  исследований  разработан 
набор композиционных сорбентов, имеющих следующие преимущества: 
–  стандартность  структурных  характеристик  сорбентов  таких  как 
удельная  поверхность,  объем  и  размер  пор,  что  обеспечивает  высокую 
адсорбционную емкость; 
–  химическая инертность; 
–  механическая прочность; 
–  атоксичность; 
–  легкость стерилизации; 
–  стабильность свойств при хранении; 
–  наличие  с  количественным  содержанием  магнитной  составляющей 
обеспечивает упрощение манипуляции с магносорбентами. 
 
 
3.3.   Получение магноиммуносорбентов иммобилизацией 
специфических иммуноглобулинов на поверхности магносорбентов 
 
Одним  из  важнейших  условий  получения  магноиммуносорбентов  с 
высоким  уровнем  емкости,  специфичности  и  чувствительности  является 
выбор эффективных методов иммобилизации лигандов. 
Иммобилизацию  иммуноглобулинов  на  поверхности  магносорбентов 
проводили  следующим  образом:  к 0,2 мл 10% взвеси  магносорбента 
приливали 1 мл  иммуноглобулинов  чумных,  варьируя  количество  белка  от 
0,5  до 10 мг/мл,  ковалентное  связывание  проводили  в  течение 1–24 часов, 
при температуре 50С; 22+40С и 380С. 
Проведены 
исследования 
кинетических 
параметров 
процесса 
иммобилизации 
с 
поверхностью 
сорбентов 
специфических 
иммуноглобулинов.  Результаты,  представленные  на  рисунке 7, 
свидетельствуют  о  том,  что  равновесный  процесс  наблюдается  после  1часа 
иммобилизации. 
В 
ходе 
исследования 
кинетики 
иммобилизации 

 
иммуноглобулинов  чумных  установлены  значения  констант  согласно 
методики, предложенной автором (И.В. Березин, 1976). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 7. Количество иммобилизованного белка в зависимости от 
времени и температуры 
Установленные 
значения 
констант 
иммобилизации 
чумных 
иммуноглобулинов на магносорбенте, активированном методом окисления и 
содержащим  альдегидные  группы,  имеют  близкие  значения,  которые 
составляют соответственно 0,93 х 10-2 мин-1 и 0,96 х 10-2 мин-1. 
Для  сравнительного  аспекта  нами  использованы  три  разных  метода 
получения  иммуносорбентов  иммобилизацией  чумных  иммуноглобулинов. 
Ниже  представлена  схема  получения  иммуносорбентов  бензохиноновым  
методом: 
 
SiO2 
 
 
 O 
      
 
 

 
   
 
 
(12) 
 
             
 
+ H2N – AT  
SiO2 
  NH–AT 
 
В  процессе  иммобилизации  олигогидрохиноновые  группы  на 
поверхности сорбента взаимодействуют с аминогруппами белка. 

 
Далее  представлена  схема  иммобилизации  антител  через  альдегидные 
группы, 
которые 
были 
получены 
перхлоратным 
окислением 
хитозаномагносорбентов: 
 
 

 
 
SiO2     C   + H2N – AT 
SiO2   
CH=N – AT               (13) 
               
Н 
 
При 
ковалентном 
связывании 
антител 
с 
активированным 
магносорбентом  имобилизация  осуществлена  с  образованием  азометиновых 
связей. 
По 
третьему 
варианту 
схема 
получения 
композиционных 
магноиммуносорбентов  с  применением  глутарового  альдегида  имеет 
следующий вид: 
 
 
 
   O   
 
SiO2   N= CH– (CH2)3 – C     + N2N – AT     SiO2 N=CH(CH2)3–CH=N–AT    (14) 
 
 
 
   H   
 
 
Для  оптимизации  условий  получения 
магноиммуносорбентов 
проведены исследования влияния таких факторов, как температура, значение 
рН  раствора  иммуноглобулинов  на  свойства  магноиммуносорбентов – 
специфическая активность и чувствительность. 
Для  изучения  влияния  рН  раствора  иммоноглобулинов  на  процесс  их 
иммобилизации,  в  первом  случае  доводили  значение  рН  до 9,0 с  помощью 
0,5%  раствора  едкого  натрия,  а  во  втором  случае – до  значения  рН,  равное 
5,5,  при  помощи 2 М  раствора  соляной  кислоты.  Иммобилизацию 
иммуноглобулинов  с  разными  магноиммуносорбентами  осуществляли  в 
течение 1 часа  при  температуре 22+40С.  Далее  иммуносорбенты 
использовали  в  тест-системах  для  иммуноферментного  анализа.  Результаты 
представлены в таблице 11.  

 
Таблица 11.     Чувствительность композиционных чумных 
магноиммуносорбентов 
Значение рН 
Метод синтеза КМИС 
Чувствительность м.к/мл 
иммуноглобулинов 
БХА 
102 
9,0 
ГХА 
103 
АХА 
102 
БХА 
102 
7,0 
ГХА 
104 
АХА 
102 
БХА 
102 
5,5 
ГХА 
103 
АХА 
102 
7,0 
FeKC 103 
 
 
БХА – бензохинонхитозаноаэросилогель 
ГХА – глутаральхитозаноаэросилогель 
 АХА – альдегидохитозаноаэросилогель 
FeKC – железокремнеземный элементсодержащий сорбент 
 
 
Исследуемые  диагностические  тест-системы  специфичны,  поскольку 
при  учете  результатов  ИФА  показания  оптической  плотности  опытных 
образцов  (с  гомологичными  микроорганизмами)  в 1,5 раза  превышали 
показания контрольных (с гетерологичными микроорганизмами). 
Проведены  экспериментальные  исследования  по  иммобилизации 
чумных  иммуноглобулинов  на  композиционных  магносорбентах  при 
температуре  50С, 22+40С, 370С  и 550С.  Результаты  исследований, 
представленные  в  таблице 12, свидетельствуют,  что  максимальная 
адсорбционная  емкость  композиционных  магносорбентом  наблюдается  при 
температуре  50С  и 220.  Повышение  температуры  до 550  в  процессе 

 
иммобилизации  иммуноглобулинов  приводит  к  снижению  уровня 
специфической  активности  и  чувствительности  композиционных  сорбентов, 
применяемых в ИФА. 
 
Таким  образом,  в  соответствии  с  экспериментальными  данными, 
оптимальными 
факторами, 
которые 
обеспечивают 
получение 
иммуносорбентов, обладающих высоким уровнем специфической активности 
и  чувствительности,  являются  следующие:  время  иммобилизации 
специфических иммуноглобулинов 1,5 часа при значении рН раствора белка 
6–8 и температуры от 5 до 220С. 
Таблица 12.    Зависимость количества иммобилизованного белка, 
чувствительности 
хитозанкремнеземных 
композиционных 
магноиммуносорбентов от температуры при иммобилизации лиганда 
 
Наименование 
Температура 
Количество 
Время 
Чувствительность 
иммуноглобу-
иммобил. 
иммобилизован-  
иммобили-
м.к/мл 
линов 
белка,  0С 
ного белка,  % 
зации, ч 

68 
1,5 
102 
22 
65 
1,5 
102 
Чумные 
37 
65 
1,5 
102 
55 
26 
1,5 
103 
 
На 
основе 
хитозанкремнеземных 
сорбентов, 
активированных 
бензохиноном  и  окислением  с  помощью  перхлората  натрия,  разработаны 
эффективные 
композиционные 
магноиммуносорбенты, 
имеющие 
преимущества 
по 
уровню 
чувствительности 
и 
специфичности, 
технологичности  получения  перед  глутаральдегидным  методом  получения 
активированных  сорбционных  материалов.  В  данном  случае  проявились 
недостатки  этого  метода,  связанные  с  тем,  что  глутарового  альдегида 
практически  не  существует  в  мономерном  виде (P. Monson, 1978), и  это 
приводит  к  неконтролируемости  процесса  активирования  поверхности 

 
сорбента,  а  также  к  нестандартности  в  синтезе  активированного 
магносорбента  по  количеству  альдегидных  групп.  Магноиммуносорбенты, 
получаемые  бензохиноновым  методом  и  окислением,  при  хранении (40С) 
сохраняли стабильность свойств в течение одного года (срок наблюдения). 
Вышеизложенные  научные  разработки  легли  в  основу  заявки  на 
изобретение  № 2003136322/15 «Способ  получения  иммуносорбента»,  на 
которую  получено  положительное  решение  формальной  экспертизы  ФИПС  
о т 13.01.04г. 

ГЛАВА 4. Использование магнитоуправляемых иммобилизован-
ных систем для глубинного культивирования вакцинного штамма чум-
ного микроба 
4.1.  Глубинное  культивирование  чумного  микроба,  иммобилизо-
ванного на магнитные носители 
Исследования  особенностей  глубинного  аппаратного  культивирования 
иммобилизованных в магнитные носители бактериальных клеток весьма ак-
туальны,  поскольку  позволяют  использовать  преимущества  иммобилизации 
и магнитного манипулирования продуцентом биотехнологического процесса. 
Однако применение магниточувствительных биологических систем для 
управления культивирования микроорганизмов недостаточно изучено. Одной 
из попыток использования магносорбента с иммобилизованными микробны-
ми клетками для глубинного культивирования были исследования И.В. Вла-
димцевой (2002) на модели вакцинного штамма Y. pestis EV. Метод глубин-
ного аппаратного культивирования для данного микроорганизма достаточно 
хорошо изучен и имеет важное практическое значение, т.к.  Y. pestis EV при-
меняется в качестве продуцента при производстве живой чумной вакцины с 
1943г. В своих экспериментах автор  (И.В. Владимцева, 2002) использовала 
15  микрогранулированных  носителей  различной  химической  природы,  им-
мобилизуя живые микробные клетки внутрь микрогранул во время их синте-
за. Из всех исследованных носителей наиболее пригодными оказались альги-
натные, в связи с тем, что у остальных отмечались недостатки: низкая меха-
ническая прочность,   возможность микробной утилизации, токсическое дей-
ствие  компонентов  синтеза  на  живые  микроорганизмы,  трудоемкость  и 
сложность при изготовлении. 
Целью  настоящих  исследований  явилось  изучение  возможности  и  эф-
фективности  использования  композиционного  магноиммуносорбента  для 
глубинного культивирования вакцинного штамма Y. pestis EV. Выбор компо-
зиционного сорбента для этих целей не случаен и базируется на ряде его по-
ложительных  свойств:  использование  нетоксичных  отечественных  компо-

 
нентов  технологии,  простота  изготовления,  механическая  и  химическая 
прочности,  высокая  сорбционная  емкость,  химическая  инертность.  Кроме 
этого,  органокремнеземный  сорбент  обладает  свойством  прочно  ковалентно 
связываться  со  специфическими  иммуноглобулинами,  которые,  в  свою  оче-
редь, вступая в реакцию с антигеном (микробной клеткой), образуют прочное 
соединение из антигена и антитела, называемое иммунным комплексом. Еще 
одним  преимуществом  такого  сорбента  является  то,  что  все  иммобилизиро-
ванные микробные клетки находятся на поверхности иммуносорбента, имея 
свободный  доступ  к  питательной  среде,  и  интенсивно  размножаются.  В  то 
время, как микробные клетки, иммобилизированные в  другие виды сорбен-
тов механическим включением внутрь микрогранул и находящиеся у их по-
верхности, имеют ограниченный доступ к питательной среде. Клетки же, на-
ходящиеся  внутри  сорбента,  лишены  возможности  контакта  с  питательной 
средой  и,  следовательно,  не  участвуют  в  накоплении  микробной  биомассы 
(рисунок 8). 
Компонентами  синтеза  магноиммуносорбента  явились  микрогранули-
рованный хитозанкремнеземный магносорбент (глава 3) и иммуноглобулины 
G, выделенные из гипериммунной  чумной кроличьей сыворотки крови. Для 
получения гипериммунной сыворотки использовали водно-солевой экстракт, 
извлеченный  из  биомассы  Y. pestis EV, выращенной  на  агаре  Хоттингера 
при (27±10С) в течение 48 часов. Этот выбор обоснован тем, что данные ряда 
исследователей  показывают,  что  такие  экстракты  обладают  наиболее  слож-
ным макромолекулярным составом, и в них обнаруживаются в тех или иных 
количествах  все  выявленные  у  чумного  микроба  антигены  (Н.А.  Бельская, 
В.С. Митина, В.И.  Вейнблат, 1970; Н.А. Бельская,  В.С.  Митина,  В.И. Вейн-
блат, 1972; В.И.  Вейнблат,  В.В.  Каминский,  Л.С.  Орлова, 1972; В.И.  Вейн-
блат, 1974; В.И. Вейнблат, М.С. Веренков, С.М. Дальвадян,1983;     М.М. Ти-
тенко, В.И. Вейнблат, 1985; E.E. Baker, H. Sommer, L.E Foster, 1952). 
 
 

 
Способ  гипериммунизации  заключался  в  следующем:  кроликам-
продуцентам  вводили  по 0,6мл 3% водно-спиртового  раствора  феракрила  в 
подушечки  задних  лап.  На 5-7 день  водорастворимый  антиген  возбудителя 
чумы (0,2 мг) смешивали с 1,2мл 1% водно-спиртового раствора феракрила и 
по 0,6мл вводили в подколенные лимфатические узлы. Через три дня такую 
же смесь вводили внутримышечно трехкратно с промежутками в 4 дня. На 30 
день  от  животных  получали  по  4мл  иммунной  сыворотки,  добавляли  поло-
винные дозы антигена в каждую сыворотку. Полученный комплекс антиген-
антитело  (Аг-Ат) вводили четырехкратно по 1мл с промежутками  в 3-4 дня 
внутривенно тому же животному, от которого получена иммунная сыворот-
ка.  Специфическая  активность  полученных  сывороток  в  РНИФ  достигала 
1:393,84±64,32 – 1:1772±252,28, а в РИД - не ниже 1:28,8±2,5. Проверка спе-
цифичности полученных сывороток на гетерологичных штаммах различных 
микроорганизмов показала, что перекрестные реакции в РНИФ отсутствуют 
со всеми взятыми штаммами (Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, E. coli.). 
Из  гипериммунной  сыворотки  выделяли  фракцию IgG преципитацией 
каприловой кислоты (В.И. Вейнблат, 1974). При таком способе в преципита-
те содержится до 70% иммуноглобулинов класса G. Метод выделения имму-
ноглобулинов заключался в следующем (рисунок 8): к  40 мл сыворотки до-
бавляли 64мл 0,06М раствора ацетатного буфера и 0,28мл каприловой кисло-
ты, интенсивно перемешивали на магнитной мешалке, инкубируя 30 минут. 
Центрифугировали при 6000g в течение 40 минут, фильтровали, осадок уда-
ляли, а супернатант представлял собой IgG. Доводили pH до 7,2 и помещали 
на  диализ  против 0,1М  раствора  фосфатно-солевого  буфера.  Концентрация 
белка  после  диализа  составляла 5-7мг/мл,  поэтому  проводили  концентриро-
вание,  помещая  диализные  мешки  с  иммуноглобулинами  в  ПЭГ-6000.  Маг-
носорбент получали по методу, изложенному в разделе 3.3.   
 
 
 

 
 
Сыворотка крови 
Ацетатный буфер, рН 6,0 
Смешивание и инкубация  
Каприловая кислота 
30 мин при 240С 
Центрифугирование при 
6000 g, 45 мин   
Супернатант 
Осадок удалить 
Фильтрация-Ig G 
Диализ 
Контроль иммуноглобу-
линов 
Рисунок 8. Схема получения иммуноглобулинов с помощью каприловой кислоты  
 
Все  манипуляции по приготовлению КМИС осуществляли в стериль-
ных условиях. Иммуноглобулины G стерилизовали методом ультрафильтра-
ции на установке  «Millipor» (США) или  «Владистарт» (Россия). 
Для получения иммобилизованных на магнитном носителе бактериаль-
ных  клеток  использовали  производственную  культуру  вакцинного  штамма 
Y.pestis EV,находящуюся  в R-форме  (колонии  шероховатые  с  зернистым 
центром коричневого цвета и кружевной зоной по периферии), обладающую 
морфологическими, культуральными и биохимическими   свойствами глице-
ринонегативной  разновидности  чумного  микроба,  стойко  удерживающую 
свой биохимический тип. Культуру Y. pestis  EV  засевали в бульон Хоттин-

 
гера рН (7,1±1) и инкубировали при температуре (27±10С) в течение 48 часов. 
После просмотра мазков, окрашенных по Граму, на отсутствие посторонней 
микрофлоры  во  флаконы  с  выросшей  культурой  вносили  магноиммуносор-
бент,  при  этом  концентрация  микроорганизмов  была  не  ниже  1х109м.кл./мл 
среды. В течение 40±5 минут контакта микробных клеток с магнитным носи-
телем  происходила  прочная  иммобилизация  чумного  микроба  на  поверхно-
сти магнитоуправляемого хитозанкремнеземного иммуносорбента на основе 
реакции  «антиген-антитело».  После  чего  магноиммуносорбент  с  фиксиро-
ванными микробными клетками вносили в лабораторный ферментер   (LKB, 
Швеция), представленный на рисунке 9, и использовали в качестве инокулята 
при глубинном аппаратном культивировании вакцинного штамма возбудите-
ля чумы.   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 9. Лабораторный ферментер (LKB, Швеция) 
 

 
  Для создания постоянного электромагнитного поля, необходимого для 
удерживания  магноиммуносорбента  с  иммобилизованными  микробными 
клетками,  использовали  соленоид,  представляющий 15 витков  катушки  (ри-
сунок 10 ). Соленоид помещали в сосуд ферментера, полностью погружая его 
в среду культивирования, которой служил питательный бульон. Питание со-
леноида осуществляли постоянным током при напряжении 4-5В от выпрями-
теля  ВС-26,  соединенного  реостатом.  Параметры  напряженности  электро-
магнитного  поля  в  центре  ферментера  во  время  культивирования  были 60 
Эрстед, возле обмотки катушки – около 230 Эрстед, при этом взаимодействие 
электромагнитного поля на бактериальные клетки нивелировалось, благодаря 
перемешиванию культуральной среды. 
 
 
 
Ф 
 
С 
ВС - 26 
Р 
Обозначения:  Ф – ферментер 
                                   С – соленоид 
                                   ВС-26 – выпрямитель 
                                   Р – реостат 
 
 
Рисунок 10. Блок-схема  системы  для  глубинного  культивирования 
чумного микроба 
 
Глубинное культивирование Y.pestis EV проводили согласно регламен-
та производства (РП) № 702-97. Для выращивания микробной взвеси в фер-
ментере  в  качестве  питательной  среды  использовали  бульон  Хоттингера  рН 
(7,1±0,1), инкубирование проводили при температуре (27±10С). Через 3-6 ча-
сов после начала культивирования в питательную среду добавляли стериль-

 
ный 40% раствор  глюкозы,  используемый  для  подкормки  капельным  мето-
дом.  Критерием  интенсивности  введения  глюкозы  служил  показатель  реак-
ции среды (рН), который должен находится в пределе 6,8-7,6. За цикл выра-
щивания вводили (15±3)г глюкозы в сухой массе на 1литр бульона. Выращи-
вание прекращали в начале стационарной фазы роста микробной популяции, 
на  что  косвенно  указывали  следующие  показатели:  максимальное  неизме-
няющееся количество бактерий в течение 2-3 часов роста; уменьшение ско-
рости  потребления  глюкозы  при  неизменяющейся  или  даже  возрастающей 
концентрации  микробов.  Контролем  служило  глубинное  культивирование 
Y.pestis EV по  методике  периодического  выращивания  в  ферментере  без 
применения  иммобилизованного  сорбента.  Для  определения  фазы  роста  в 
процессе  культивирования    каждые  три  часа  отбирали  стерильно    пробы  и 
0,1мл  взвеси  высевали  на  пластинке  агара  Хоттингера  рН (7,2±0,1). После 
трех суток инкубации подсчитывали количество выросших колоний по фор-
муле: 
 
 

n = 3,3lq ———,     где      
 
 
 

     
b – количество бактерий в начале;   В – количество бактерий в конце 
определенного промежутка времени, а также период генерации – q:  
  

q = ———,   где t – время роста культуры; n – число поколений. 
 
n   
 
Анализируя динамику накопления биомассы производственного штам-
ма Y.pestis EV  в  процессе  глубинного  культивирования  с  использованием 
магнитоуправляемых  иммобилизованных  систем,  можно  отметить,  что  при 
первом  выращивании lag-фаза  в  среднем  длилась 8-9 часов,  после  чего  на-
ступала  экспоненциальная  фаза,  во  время  которой  отмечались  интенсивный 
рост и размножение клеток.  Через 18-20 часов наступала стационарная фаза 
роста, в начале которой производили слив культуральной жидкости, оставляя 

 
соленоид  в  рабочем  состоянии.  В  сосуд  заливали  свежую  порцию  бульона 
Хоттингера и проводили повторное выращивание биомассы, не внося допол-
нительное количество инокулята. Так повторяли пять раз.  
Анализ  динамики  роста  при  повторных  выращиваниях  иммобилизо-
ванных клеток вакцинного штамма чумного микроба показал, что   lag-фаза 
практически  отсутствовала,  а  стационарная  фаза  роста  наступала  через   
(15±1) часа. При этом «урожай» биомассы при первом и повторных глубин-
ных культивированиях был фактически одинаковым и составлял в    среднем  
7х1010м.к./мл  среды.  По  сравнению  с  контролем  (без  иммобилизованного 
инокулята)  количество  биомассы  увеличивалось  на 40±5% (рисунок 11). 
Описанные эксперименты были проведены на пяти сериях ферментативного 
бульона Хоттингера. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 11.    Кривые роста популяции  Y.pestis EV при глубинном культивировании   
1.  Выращивание без МИС – инокулята (контроль) 
2.  Первичное выращивание с МИС-инокулятом  
3.  Повторное выращивание с МИС-инокулятом    
 
 
 
Методические  приемы  аппаратного  культивирования Y.pestis EV  с 
применением  МИС-инокулята  изложены  в  методических  рекомендациях 
«Глубинное  культивирование  вакцинного  штамма  чумного  микроба  с  ис-

 
пользованием  магнитоуправляемых  иммобилизованных  систем»,  одобрен-
ных Ученым Советом института (протокол №____ от _____ 2004г.) и утвер-
жденных директором СтавНИПЧИ.  
 
Выращенную вакцину подвергали лиофилизации на установке для суб-
лимационной сушки ТГ-5. Вакцинную взвесь разливали в ампулы ШПВ-6 по 
2  мл  и  помещали  в  низкотемпературный  холодильник  НС 700/50 «Frigera», 
(ЧССР),  имеющей  температуру  в  рабочей  камере  минус 400С,  выдерживали 
при этой температуре не менее 5 часов.  
 
Доведя  температуру  в  камере  высушивания  до  минус 700С,  начинали 
лиофилизацию  по  достижению  в  сушильной  камере  аппарата  остаточного 
давления 13,3Па.  В  процессе  лиофилизации  осуществляли  почасовой  кон-
троль  и  регистрацию  основных  параметров  (вакуум,  температура  конденса-
тора, полок, высушиваемого материала, охлаждающей жидкости). Через 8-12 
часов, когда температура препарата достигала 50С, включали подогрев и до-
сушивали препарат до температуры (28±1)0С, выдерживая при этой темпера-
туре 3-4 часа (рисунок 12). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 12.   График режима сублимационного высушивания чумной вакцины 
 

 
 Температура материала  
 
 
 Температура подогрева 
 
 
 Температура конденсатора 
  
    Вакуум в системе  
 

 
 
Время лиофилизации 24-36 часов.  Ампулы  с  вакциной  запаивали  на 
газокислородной горелке и хранили при температуре 4-60С.  
 
4.2. Изучение свойств вакцины чумной живой сухой, выращенной с 
помощью иммобилизованного инокулята 
Изучение свойств вакцинного штамма Y.pestis EV, выращенного в ус-
ловиях  глубинного  аппаратного  культивирования  при  использовании  иммо-
билизованного на магнитном сорбенте инокулята, проводили в соответствии 
с фармакопейной статьей 42-3877-99. Для этого из каждой серии отбирали по 
три ампулы вакцины. 
При  посеве  на  чашку  Петри  с  агаром  или  в  бульон    Хоттингера  рН 
(7,1±0,1) при (27±1)0С через 48 часов отмечался типичный рост штамма чум-
ного микроба в R-форме на агаре, в бульоне - агглютинативный с образова-
нием на дне рыхлого осадка, без помутнения бульона. В мазках, окрашенных 
по Граму и Гинсу (для выявления капсулы): из агаровой культуры - короткие 
грамотрицательные полиморфные палочки овальной формы; из бульонной – 
биполярноокрашенные, располагающиеся цепочками палочки; инкубирован-
ные при температуре (37±1)0С образуют капсулу (рисунок 13).  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 13.  Чумной микроб: А – окраска по Граму; Б – окраска по  Гинсу                         
(1 – чумной микроб; 2 – капсула чумного микроба) 

 
Штамм не ферментировал сахарозу, лактозу, рамнозу, глицерин в тече-
ние  шести  суток,  лизировался  бактериофагами  диагностическими  чумными 
Л-413 С и Покровской: на газоне культуры в чашке Петри, засеянном фагом 
бактериологической петлей (1х105-1х106 корпускул в 1мл) – четкое стериль-
ное пятно. 
При  определении  выживаемости  микробов  использовали  культураль-
ный метод согласно ТУ 42.14.214 – 81.  
Ампулу с вакциной вскрывали, сухую культуру растворяли забуферен-
ным  физиологическим  (ЗФР)  раствором  до  первоначального  объема.  Полу-
ченную взвесь десятикратно титровали по 0,5мл в 4,5мл ЗФР. Из разведений 
10-7 и 10-8 засевали по 0,1мл на три чашки Петри с дрожжевым агаром. После 
инкубации в течение 2-4 суток при 27±10С подсчитывали колонии. Для каж-
дого образца вычисляли процент живых микробов к числу засеянных, кото-
рых рассчитывали, исходя из показателя оптической концентрации. Послед-
нюю  определяли по ОСО  мутности (ОСО 42-28-59-85-П), 10 единиц которо-
го эквивалентно 1х109м.к. чумного микроба. 
После определения процента живых микробов в трех образцах рассчи-
тывали среднюю арифметическую, которую принимали за показатели жизне-
способности в данной серии вакцины. 
Результаты  изучения  жизнеспособности  (опытных  и  контрольных  об-
разцов) свидетельствуют, что при глубинном культивировании в электромаг-
нитном поле с использованием иммобилизованного инокулята на магнитном 
носителе процент живых микробных клеток достигает не менее (55,4±5,8)%, 
в то время, как в контрольных образцах этот показатель – не более (30±5)%. 
Показатель  термостабильности  (срок,  в  течение  которого  в  препарате 
сохраняется 50% живых микробных клеток по отношению к первоначально-
му числу) при температуре хранения  вакцины     (37±1)0С был в пределах 8-9 
суток,  что  соответствует  ФС,  согласно  которой  термостабильность  вакцины 
должна  быть  не  менее 7 суток.  Определение  проводили  в  течение 14 суток 
хранения.  

 
Показатель термостабильности рассчитывали по формуле: 
        0.3х14      
t = ——–——,      где: t – показатель термостабильности в сутках;  
      lgAo - lgAn 
                                      lgAo – логарифм первоначального числа микроб-
ных клеток в 1мл;    lgAn -  логарифм числа живых микробных клеток в 1мл 
через 14 суток хранения вакцины при температуре (37±1)0С; 0,3 – постоянная 
величина; 14 – срок хранения вакцины при температуре   (37±1)0С в сутках. 
Потерю в массе при высушивании определяли по ФС 42-3877-99. Для 
этого 0,15-0,2 г  препарата  помещали  в  бокс  и  сушили  в  вакуум-сушильном 
шкафу при температуре 600С в течение трех часов. Расчет показателя в про-
центах  производили  по  разности  веса  навески  до  и  после  высушивания  по 
формуле: 
             (B – C) х 100 
А = ————————,   где: А – потеря в массе; В – вес навески до  
                       В 
                                             сушки; С – вес навески после сушки.  
Данные  по  изучению  свойств  чумной  вакцины,  выращенной  методом 
глубинного культивирования, представлены в таблице 13. 
Таблица 13.  Характеристика чумной вакцины EV, выращенной 
при глубинном культивировании 
Серия  
Количество живых 
Потеря в массе при 
Термостабильность, 
микробных клеток,%
высушивании, % 
сутки 
1–первичное  выра-
 
 
 
щивание  с  МИС-
54,0 ± 4,4 
2,3 
10,0 
инокулятом 
3-повторное 
выра-
 
 
 
щивание  с  МИС-
57,3 ± 3,9 
2,1 
10,5 
инокулятом 
Контрольное  выра-
 
 
 
щивание  без  МИС-
28,9 ± 2,6 
1,9 
9,4 
инокулята 
Иммуногенность  вакцины  проверяли  на    белых  нелинейных  мышах 
массой (19±1) г и оценивали по величине ЕД50. Для иммунизации использо-

 
вали  культуру  вакцинного  штамма EV, полученную  при  первичном  и  по-
вторном  глубинном  культивировании.  Микробную  взвесь,  равную  по  кон-
центрации 10 единицам  ОСО  мутности,  готовили  в 0,9% растворе  хлорида 
натрия  и  вводили  белым  мышам  в  дозах  8х102, 4х103, 2х104  и  1х105  живых 
микробных клеток  по 0,2 мл подкожно. На  каждую дозу брали по 6 живот-
ных.  Подкожное  заражение  для  животных,  привитых  вакциной,  составило 
200  ДСL (Dosis certa Letalis=LD100)  вирулентного  штамма Y. pestis 461, 1 
ДСLкоторого не превышала 100 микробных клеток. Для контроля 5 неимму-
низированных животных заражали 1 ДСL. Наблюдение за зараженными жи-
вотными вели в течение 20 суток. Контрольные животные погибали от чумы 
в  течение  первых 10 суток  после  заражения.  Павших  животных  вскрывали, 
органы и ткани подвергали бактериологическому исследованию, высевая их 
методом отпечатков на чашках с агаром Хоттингера рН (7,0±0,1) с метилвио-
летом в концентрации  0,05 г на 1 л и сернистокислым натрием в концентра-
ции 0,2 г  на 1 л.  Иммуногенность  по  показателю  ЕД50  вычисляли  методом 
Кербера в модификации И.П. Ашмарина и А.А.Воробьева (1962), используя 
формулу: 
 
LgED50= lg Dn – δ(Σ Li – 0,5) 
Dn- максимальная иммунизирующая доза, взятая в опыт; 
δ– логарифм кратности используемых разведений;  
Σ- сумма 
Li –  отношение числа выживших после заражения животных к числу  
взятых в опыт на данную дозу; 
0,5 – постоянный коэффициент. 
 Результат проверки иммуногенности по показателю ЕД50  в опытах на 
белых  мышах  (от 9465 до 20188 живых  микробных  клеток)  не  превышали 
регламентные нормы: 40000 м.к. для белых мышей. 
Таким  образом,  проведенные  экспериментальные  исследования  по  ис-
пользованию  композиционного  хитозанкремнеземного  иммуносорбента  с 

 
магнитными  свойствами  с  иммобилизованными  на  нем  микробами Y.pestis 
EV  при  глубинном  аппаратном  культивировании  показали  преимущества, 
связанные  с  возможностью  многократного  использования  посевного  мате-
риала, сокращением времени выращивания биомассы при повторном культи-
вировании,  повышением  жизнеспособности  микробных  клеток  вакцинного 
штамма  чумного  микроба.  Придание  иммуносорбенту  магнитных  свойств 
позволяет надежно удерживать его с инокулятом на соленоиде за счет ЭПП, 
при этом свойства чумной вакцины, выращенной таким способом, полностью 
соответствуют требованиям НД (фармакопейной статьи 3877-99), что свиде-
тельствует  о  возможности  и    перспективности  использования    этого  метода 
при производстве живой чумной вакцины. 
 
    4.3 Получение капсульного антигена (Ф1) чумного микроба 
Большинство  коммерческих  и  экспериментальных  диагностических 
препаратов  для  различных  вариантов  экспрессных  методов  (флуоресцирую-
щих  антител,  иммуноферментного  и  радиоиммунного  анализов,  хемилюми-
несценции,  реакции  непрямой  гемагглютинации  и  др.)  сконструированы  на 
основе  поли–  и  моноклональных  антител  к  капсульному  антигену  чумного 
микроба (Ф1), а также на основе самой фракции (Т.М. Тараненко, С.М. Даль-
вадянц, Т.П. Боровикова, И.Ф. Ковалев, В.С.  Дернова, 1972; В.И. Вейнблат, 
С.М. Дальвадянц, М.С. Веренков, 1983; М.М. Титенко, В.И. Вейнблат, М.С. 
Веренков,  А.С.  Васенин, 1983; В.И.  Вейнблат,  М.М.  Титенко,  М.С.  Верен-
ков, 1985; Г.П. Апарин, Е.П. Голубинский, 1989). 
Общепринят  препаративный  метод  получения  капсульного  антигена, 
разработанный E.E.Baker, H.S.Sommer, L.E.Foster et al (1951). Как  известно, 
по этому методу чумные микробы выращивают на плотной питательной сре-
де и высушивают ацетоном, экстрагируют водным раствором хлористого на-
трия.  Очищенный  препарат  капсульного  антигена  получают  в  виде  двух 
фракций (IА и I В) путем многократного переосаждения вещества сульфатом 
аммония. В исследованиях, представленных в работах (В.И. Вейнблат, С.М. 

 
Дальвадянц,  М.С.  Веренков, 1983; В.И.  Вейнблат,  М.М.  Титенко,  М.С.  Ве-
ренков, 1985), было показано, что метод Е. Бейкера  не лишен определенных 
недостатков.  Среди  них  наиболее  существенными  являются  сравнительно 
небольшой конечный выход очищенных препаратов с единицы питательной 
среды, распад исходной молекулы капсульного антигена, отличающихся ме-
жду собой физико-химическими свойствами и иммунобиологической актив-
ностью, загрязнение отдельных фрагментов капсульного антигена агаром пи-
тательной среды и т.д. 
Чтобы  нивелировать  эти  недостатки,  мы  проводили  выращивание  
биомассы  на  жидкой  питательной  среде  (бульон  Хоттингера  рН (7,1±0,1) с 
добавлением солей марганца и железа, стимулирующих рост клеток чумного 
микроба при 370С) с использованием иммобилизованного на МИС инокулята 
(чумных  микробов  штамма  ЕV,  выращенных  при 280С).  Выращивание  про-
водили в ферментере. Среду в процессе роста бактерий аэрировали стериль-
ным воздухом, периодически обогащали глюкозой, поддерживая рН в преде-
лах (7,1±0,1) добавлением  бикарбоната  натрия.  Культивирование  чумных 
микробов  начинали  при 280С,  постепенно  повышая  температуру  в  течение 
10–16 часов до 370С, и затем продолжали выращивание при этой температуре 
еще  в  течение 24–26 часов.  Выращивание Y.pestis ЕV  в  таких  условиях  по-
вышает выход капсульного антигена в культуральную жидкость (В.И. Вейн-
блат, М.М. Титенко,  М.С. Веренков, 1985). 
После  завершения  процесса  выращивания  культуральную  жидкость  и 
микробную  массу  разделяли  центрифугированием.  Оба  продукта  использо-
вали  для  выделения  капсульного  антигена.  Ведущей  областью  применения 
препарата,  полученного  по  методу  Бейкера,  является  изучение  структуры  и 
функций  капсульного  антигена,  второстепенной – конструирование  профи-
лактических  и  диагностических  препаратов  (В.И.  Вейнблат,  С.М.  Дальва-
дянц, М.С. Веренков, 1983). При выделении Ф1 из культуральной жидкости 
(методом  изоэлектрической  преципитации)  получают  более  гетерогенный 
белок,  однако он практически свободен от нуклеиновых кислот и полисаха-

 
рида, а его выход намного превышает вышеуказанный метод,  что связано с 
максимальным выделением антигена в осадок. Ведущая область  применения 
такого  препарата – конструирование  химических  вакцин  и  диагностикумов 
(Т.М.  Тараненко,  С.М.  Дальвадянц,  Т.П.  Боровикова,  И.Ф.  Ковалев,  В.С. 
Дернова, 1972; М.М. Титенко, В.И. Вейнблат, М.С. Веренков, А.С. Васенин, 
1983). 
Фракцию 1 чумного  микроба  выделяли  из  биомассы  по  методу 
Е.Е.Вaker et al. с той разницей, что  мы отказались от получения ацетонового 
порошка. Осадок клеток после центрифугирования экстрагировали 2,5% рас-
твором NaCl  с  добавлением  тиомеросала (1:10000 для  стерилизации).  В 
дальнейшем проводили переосаждение капсульного вещества сульфатом ам-
мония (рисунок 14). Выход препарата составлял 8±2 мг/л питательной среды. 
Капсульный антиген из культуральной жидкости изолировали методом 
изоэлектрической преципитации (М.М. Титенко, В.И. Вейнблат, М.С. Верен-
ков, А.С. Васенин, 1983).  
 
 
  1 
Выращивание биомассы Y.pestis на бульоне 
 
Хоттингера с добавлением солей марганца 
и железа при 370С 
  
  2 
Центрифугирование 20000 g при 40С 
Супернатант (полу-
чение Ф1 из культу-
 
ральной жидкости)
 
  3 
 Экстракция осадка  2,5% раствором NaCl  
1:20 (с добавлением тиомерсала (1:10000) 
 
при перемешивании 24 часа) 
 
  4 
Центрифугирование 4000 g 45±5 мин
 
 
 
Экстракция осадка 2,5% 

 Су
 
пернатант   I (V
раствором NaCl 1:5 при 
1)   
 
перемешивании 24 часа

 
 
 
 
    6 
 
Центрифугирование 20000g 45 мин 
                   7 
 
Супернатант II (V

2) 
Осадок отбрасывают 
V1+V2= V3 
Осаждение балластных белков 
                     9  (NH4)2SO4 до25% насыщения V3      
 
(соль добавляют медленно в тече-
ние 30 мин. на мешалке (V4) 
 
 
       10  Формирование осадка при темпера-
 
туре 40C 24 ч 
 
Центрифугирование 20000 g 45±5 
 
       11 
мин 
 
12 
   
Супернатант  
Осадок отбра-
 
 
(V4) 
     13 
сывают 
Осаждение Ф1 (NH4)2SO4 до 
30% насыщения V
 
4 (соль до-
бавляют медленно в течение 
 
30 мин на мешалке) 
 
 
 
     14 
Формирование осадка при 
температуре 40C 24 ч 
 
 
 
     15 
Центрифугирование 20000 g 
45±5 мин 
 
 
16  Осадок. Растворе-
Супернатант  
ние в дН2О  
отбрасывают 
 
V4 V5 
 
 
 
Шестикратное по-
вторение манипу-
 
ляций 9–16 
Диализ против водопро-
 
 
 
 
 
 
 
   17 
водной воды 2 сут,      
дист.  Н2О – 3 суток 
 

 
 
 
      19  
 
 
Лиофилизация   препа-  
   18 
Концентрирование до 
рата Ф1 
15–20 мг/мл 
 
 
Рисунок 14. Схема  получения  капсульного  антигена Y.pestis из 
микробных клеток 
 
Преципитацию капсульного антигена проводили при рН 4,1–4,3. Выход 
препарата  Ф1составлял 70±10 мг/л  питательной  среды,  что  на  порядок  пре-
вышает таковой при получении капсульного антигена первым способом. 
На  рисунке 15 приведена  схема  получения  капсульного  антигена 
Y.pestis из культуральной жидкости изоэлектрической преципитацией. 
 
 
Выращивание биомассы Y.pestis на 
    1 
бульоне Хоттингера с добавлением 
солей марганца и железа при 370С 
 
    2 
Центрифугирование 20000g при 40С
Осадок клеток (получение Ф1 по 
Е.Е.Baker) 
 
     3 
Супернатант. Добавление 1–2н HCl
до рН 4,1–4,3. Экспозиция 1,5±0,5 
 
2 часа 
 
      4 
Центрифугирование 20000g при 40С 
Супернатант отбрасывают 
 
       
        Растворение осадка в д. Н2О. 
      5 
Нейтрализация 0,1н NaOH 
 
      6 
Добавление (NH4)2SO4 до 25%  
насыщения. 
  Экспозиция при комнт.t020±2 часа 
 
Осадок отбрасывают 
      7 
Центрифугирование 8000g 45±5 мин 
при 40С 

 
 
      8 
Добавление (NH4)2SO4  
до 40% насыщения. 
  Экспозиция 24 часа при комнт. t0 
  Центрифугирование 8000g 45±5 мин 
Супернатант отбрасывают 
      9 
при 40С 
 
     10   Растворение осадка в д  Н2О (дово-
дят рН до 4,9–5,0 0,1н HCl) 
 
     11 
Центрифугирование 8000g 45±5 
Осадок отбрасывают 
 
мин при 40С 
 
Осаждение Ф1 при рН 4,1–4,3. 
     12 
Центрифугирование 8000g на  
Супернатант отбрасывают 
 
холоду 
   Растворение осадка в дН2О при  
     13 
подщелачивании 0,1н NaOH до 
7,0–7,2. Манипуляции 12–13 по-
 
вторяют трижды 
 
Растворение осадка в д Н
      
2О при 
рН 7,0–7,4. 
  Концентрирование до 20–30 мг/мл
 
 
Рисунок 15. Схема  получения  капсульного  антигена Y.pestis из 
культуральной жидкости изоэлектрической преципитацией 
 
 
 
Против фракции 1, изолированной из микробной биомассы Y.pestis EV 
и культуральной жидкости, были получены гипериммунные кроличьи сыво-
ротки. По специфической активности и гомогенности, оцененные в реакции 
преципитации  по  Оухтерлони,  они  были  практически  идентичны  (рисунок 
16). 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 16. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле 
1 – Ф1(1), полученная из биомассы  Y.pestis EV по Е.Е. Baker et al. 
2 – Ф1(2),  полученная  из  культуральной  жидкости  при  выращивании 
Y.pestis EV 
3 – антисыворотка против Ф1(1) 
4 – антисыворотка против Ф1(2) 
5-9 – разведение антисывороток от 1:2 до 1:32  
Таким  образом,  при  глубинном  культивировании  вакцинного  штамма 
чумного  микроба  для  получения  капсульного  антигена  Ф1  появляется  воз-
можность  использовать  как  микробную  биомассу,  так  и    культуральную 
жидкость,  что  значительно  увеличивает  выход  целевого  продукта  высокого 
качества. 
 
 
 

ГЛАВА 5. Иммуноферментные  тест–системы  для  диагностики  чумы  и  
индикации ее возбудителя 
 
В  настоящее  время  метод  иммуноферментного  анализа  завоевал 
прочные  позиции  в  клинической  диагностике,  эпидемиологических 
исследованиях,  биотехнологии,  потеснив  другие  серологические  методы, 
благодаря  ряду  существенных  преимуществ.  Так,  обладая  высокой 
чувствительностью  и  специфичностью,  ИФА  позволяет  анализировать 
одновременно  большое  число  проб,  использовать  полностью  или  частично 
автоматизированные  системы  или  проводить  анализ    практически  без 
оборудования;  метод  не    требует  очистки  для  обогащения  проб,  прост  в 
выполнении.  Известны  два  вида  ИФА:  гомогенный  и  твердофазный 
(гетерогенный).  При  гомогенном  ИФА  реакция  взаимодействия  антиген-
антитело и ее детекция осуществляется в гомогенном растворе и учитывается 
по  изменению  активности  фермента–маркера  антигена.  Отсутствие  стадии 
разделения  свободного  и  связанного  с  антителами  антигена  значительно 
сокращает  время  анализа,  составляющего 2–20 минут.  На  основе 
гомогенного  ИФА  разработаны  диагностические  системы  экспресс–анализа 
биологически  активных  соединений,  нашедшие  широкое  применение  в 
химической  токсикологии,  фармакологии  и  эндокринологии.  В 
инфекционной  диагностике  гомогенный  анализ  до  сих  пор  не  получил 
применения. 
Методы 
твердофазного 
ИФА 
основаны 
на 
использовании 
серологически 
активных 
 
компонентов, 
иммобилизованных 
на 
нерастворимых  носителях,  что  обеспечивает  их  быстрое  и  эффективное 
разделение. Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только 
степенью  чистоты  и  активности  используемых  ингредиентов,  но  и 
свойствами  твердой  фазы,  которая  должна  сохранять  иммунологические 
свойства  и  стабильность  в  иммобилизованном  состоянии,  обладать 
минимальной 
активностью 
неспецифически 
связывать 
компоненты 

 
анализируемой  системы  и  быть  удобной  при  разделении  фаз.  Наиболее 
широкое  применение  получили  микроплаты  с 96 лунками  из  оптически 
прозрачного  полистирола,  позволяющие  производить  весь  цикл  анализа  от 
стадии  иммобилизации  до  измерения  активности  фермента  в  каждой  из 
лунок. С полистиролом могут быть связаны сорбционно как антитела, так и 
антигены различной природы. Однако наряду с достоинствами, твердофазная 
система  имеет  ряд  проблем.  Микроплаты,  выпускаемые  зарубежными  и 
отечественными 
фирмами, 
обладают 
различными 
сорбционными  
свойствами, что существенно влияет на достоверность и воспроизводимость 
получаемых  результатов  (К.Л.  Шаханина,  А.А.  Соколенко,  И.П.  Павлова  и 
др., 1987; Л.Ф. Зыкин, А.Т. Яковлев, 1993). Количество антител (антигенов), 
используемое  для  образования  иммунного  комплекса,  ограничено 
возможностями  твердой  фазы.  Недостаточная  концентрация  антител 
(антигенов)  ограничивает  чувствительность  ИФА.  Качество  адсорбции 
зависит  от  температуры,  рН,  ионной  силы,  времени  инкубации.  Процесс 
сорбции  обратим  и,  следовательно,  иммуносорбенты,  полученные 
сорбционным путем, не подлежат длительному хранению (срок хранения 20 
дней  на  холоде  при  герметизации) (О.А.  Калинина,  И.В.Емельянова,  М.А. 
Лактионова, 1997). 
В  связи  с  этим,  постоянно  проводится  поиск  инертных  носителей 
(отдельные  ячейки,  бусы,  кюветы,  нейлон,  активированная  бромцианом 
фильтровальная  бумага,  нитроцеллюлозные  мембраны  и  т.п.),  на 
поверхности которых протекают все процессы реакции ИФА. 
В  последние  годы  с  целью  повышения  чувствительности  и 
специфичности  лабораторных  методов,  а  также  для  создания  новых 
диагностических  препаратов  стали  применять  иммуносорбционные  методы 
на  основе  иммобилизированных  антигенов  и  антител.  Дополнительные 
удобства  и  значительные  преимущества  перед  общепринятыми  методами 
появились  с  началом  использования  сорбентов  с  магнитными  свойствами, 
которые,  в  частности,  нашли  применение  в  качестве  твердой  фазы  при 

 
осуществлении прямого и непрямого вариантов  иммуноферментного метода 
при  выявлении  микроорганизмов,  их  антигенов  и  специфических 
иммуноглобулинов  (В.И.  Покровский, 1986; А.М.  Сухоруков,  А.М. 
Пономарева, 1987; К.Л. Шаханина, А.А. Соколенко, И.П. Павлова и др., 1987; 
Л.И.  Ванеева, И.Ю. Гридина, О.Н. Пантелеева и др., 1989; В.И. Ефременко, 
1995; И.С. Тюменцева, 1996; М.Н. Касторная, 2003). 
Синтезированный 
нами 
хитозанкремнеземный 
магносорбент, 
активированный  перхлоратом  натрия  (глава 3), был  использован  в  качестве 
матрицы  при  конструировании  антительной  и  антигенной  чумной 
диагностических тест–систем для иммуноферментного анализа (рисунок 17 ). 
При  этом  лигандами  служили  иммуноглобулины G, выделенные  из  
гипериммунной  чумной  кроличьей  сыворотки,  и  Ф1  чумного  микроба, 
изолированная из культуральной жидкости изоэлектрической преципитацией 
(глава 4). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 17. Схема  постановки  ИФА  и  использованием  МИС:  А – для 
обнаружения антител; Б – для обнаружения антигена 
1 – антиген; 
2 – специфическое антитело (АТ); 
3- антивидовое АТ-фермент 
4 – специфическое АТ-фермент 
 

 
Для 
получения 
чумных 
иммуноферментных 
коньюгатов 
и 
магноиммуносорбента 
были 
использованы 
иммуноглобулины 
из 
антифракционной  гипериммунной  сыворотки,  выделенные  с  помощью   
ПЭГ–6000. 
В  основу  коньюгирования  пероксидазы  хрена  с  антителами  положен 
метод  предварительного  окисления  фермента  до  альдегидной  формы 
перйодатом  натрия (P.K. Nakane, A. Kawaoi, 1974). Навеску  пероксидазы 
хрена (5мг)  растворяли  в 1  мл  раствора  натрия  углекислого  кислого  в 
концентрации 0,1 М  и  добавляли 0,25 мл 0,32% раствора  формалина.  К 
растворимой  пероксидазе  добавляли 0,04М  раствор  перйодата  натрия  из 
расчета 1 мл на 5 мг пероксидазы, инкубировали при легком помешивании в 
темноте 20 мин.  Затем  к 5 мг  пероксидазы  приливали 1,0 мл  раствора 
этиленгликоля  в  концентрации 0,16М  и  после  инкубации  в  темноте  при  
легком  помешивании  в  течение 1 часа  раствор  диализовали  против 
карбонатного буфера в концентрации 0,01 М (9,65±0,05) ед. рН в течение 18–
20 часов при (4±2)0С с двухкратной сменой буфера. К активной пероксидазе 
добавляли 1 мл  раствора  иммуноглобулинов  в  карбонатном  буфере  с 
концентрацией 0,01М (9,65±0,05) ед.  рН  с  содержанием  белка 10 мг/мл    и 
инкубировали 2 часа  при  слабом  помешивании  в  темноте.  Далее  к  смеси 
добавляли 5 мг  натрия  боргидрида,  инкубировали 2 ч  при  температуре 
(4±2)0С и диализовали против фосфатного буфера в концентрации 0,1М 7,2–
4,4ед. рН в течение 18–20 часов при температуре (4±2)0С. Очистку коньюгата 
от  несвязавшегося  фермента  осуществляли  методом  гель–фильтрации  с 
использованием  сефадекса G–100 на  установке  LКВ–2137 (Швеция).  В 
качестве  элюата  использовали 0,1М  фосфатный  буфер 7,2–7,4 ед  рН. 
Фракции собирали в объеме 30 мл и исследовали светопоглащение каждой из 
них при длинах волн 280 нм и 430 нм. Фракции, имеющие RZ (соотношение 
экстинций при длинах волн 430–280нм), равное 0,4–0,6, объединяли. 
В 
соответствии 
с 
вышеуказанной 
схемой 
конъюгации  
иммуноглобулинов  и  пероксидазы  хрена,  мы  получили 5 серий 

 
иммуноферментных конъюгатов. Рабочий титр и специфическую активность 
конъюгатов  определяли  по  методике  авторов  М.Clark  и A.Adams в 
«сэндвич»–варианте ИФА . При постановке ИФА использовали стандартные 
планшеты для иммунологических реакций. Для первого покрытия микроплат 
применяли  иммуноглобулины  из  антифракционной  чумной  сыворотки.  В 
лунки  вносили  по 100 мкл  иммуноглобулинов,  разведенных  фосфатным 
буфером  с  рН 7,2–7,4 до  концентрации  белка 100 мкг/мл.  Стабилизацию 
планшетов  производили  при  температуре  (37±1)0С  в  течение  трех  часов. 
Несорбированные  иммуноглобулины удаляли,  в  лунки вносили  по 100 мкл 
1%  бычьего  сывороточного  альбумина  и  выдерживали 1 ч  при  температуре 
(37±1)0С.   Затем  в  первую  лунку  вносили  антиген  (Ф1)  в        концентрации 
0,05 мг/мл и титровали в шахматном порядке на фосфатном буфере с рН 7,2–
7,4,  содержащем 0,05% Твин 20 и 0,1% бычьего  сывороточного  альбумина, 
12–я  лунка  не  содержала  антигена  и  являлась  контрольной.  После  часовой 
инкубации  при  температуре (37±1)0С  несвязавшийся  антиген  удаляли, 
микропласты  отмывали 4–5 раз 0,05% раствором  твина–20  на  фосфатном 
буфере  и  подсушивали.  Далее  в  течение 1 часа  при  температуре (37±1)0С 
проводили  инкубацию  с  антителами,  меченными  пероксидазой  хрена,  от 
1:100 до 1:800. Коньюгат вносили в лунку в объеме 100 мкл и инкубировали 
при (37±1)0С 1 час.  После 4–5 кратной  промывки  планшет  производили 
определенные  присутствия  антигена.  В  качестве  субстрат–индикаторной 
смеси  применяли  раствор,  содержащий 10 мл    цитратного  буфера  рН 
(5±0,05), 5мг ортофенилендиамина и 0,05% перекиси водорода. 
Субстрат–индикаторную  смесь  добавляли  по 100 мкл  во  все  лунки  и 
инкубировали  при  комнатной  температуре  без  доступа  света  в  течение 10 
минут.  Для  остановки  реакции  использовали 2 М  раствор    серной  кислоты, 
который  вносили  в  лунки  в  объеме 50 мкл.  Результаты  реакции  учитывали 
визуально  или  на    вертикальном  денситометре «Multiskan» и  считали 
положительным, если оптическая плотность (ОП) исследуемого образца в 2 и 
более  раза  превосходила  среднее  значение    ОП  отрицательных  контролей. 

 
Рабочий  титр  иммунопероксидазных  чумных  конъюгатов  составил 1:200– 
1:400.  Все  серии  конъюгатов  давали  отрицательные  результаты  с 
водорастворимыми антигенами из гетерологичных штаммов Y.enterocolitica, 
E.coli, Y.pseudotuberсulosis,что свидетельствовало о их специфичности.  
При  изготовлении  магноиммуносорбента  лигандом  служили IgG, 
выделенные  из    антифракционных  чумных  иммунных  сывороток, 
иммобилизацию которых на магносорбент осуществляли, как описано выше 
(глава 3). 
Все  манипуляции  с  магноиммуносорбентом  в  наших  экспериментах 
производились  с  применением  ряда  технических  устройств,  разработанных 
сотрудниками Ставропольского и Волгоградского научно–исследовательских 
противочумных  институтов.  Данные  технические  средства  обеспечивают 
фиксацию  магносорбентов,  их  сепарацию,  перенос,  эффективное 
перемешивание  в  заданном  режиме  (В.И.  Ефременко, 1996). Устройства 
размещены  в  компактной  укладке,  транспортируемой  ручным  способом  и 
позволяющей  осуществлять  работу  с  ней  как  в  лабораторных,  так  и  в 
полевых  условиях. В  состав укладки  входят магнитные ловушки  различных 
конструкций  для  забора  проб  из  объектов  внешней  среды,  контейнеры  для 
транспортировки  магнитных  сорбентов  с  фиксированными  на  их 
поверхности  микроорганизмами,  их  антигенами,  устройство  для  переноса 
магносорбентов  с  магнитной  поверхности  ловушки,  устройство  для 
отделения магносорбентов от жидкой фазы.  
Для  повышения  эффективности  исследований  с  применением 
магноиммуносорбента  пробы  пропускали  через  специальную  проточную 
ловушку  с  фиксированным  чумным  КМИС,  используя  проточную  систему 
(рисунок 18). 
Исследуемая  проба  из  верхней  колбы  самотеком  проходила  через 
магнитную ловушку. Скорость протекания, регулировалась зажимом. 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 18. Исследование  твердых  проб  с  использованием 
проточной магнитной ловушки с КМИС 
 
Обозначения: 
а- установка: 
1– колба с суспензией пробы; 2–сетчатый фильтр на конце стеклянной 
трубки; 3–ватный фильтр; 4–зажим; 5–проточная магнитная ловушка с МИС; 
6–соединительные трубки; 7–колба для приема пробы; 
б–проточная магнитная ловушка: 
1–фиксатор  магнитной  пробки; 2–пробка  с  постоянным  магнитом; 3–
проточный контейнер. 
 
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Рисунок 19. Схема  проведения  иммуноферментного  анализа  во 
флаконах типа «пенициллиновых» с использованием КМИС  
 
 

 
Меняя местами колбы, можно многократно пропускать через ловушку  
исследуемую  пробу,  достигая  максимального  концентрирования  инфекта  на 
КМИС.  После  чего  систему  промывали 5–10 объемами  (от  исследуемой 
пробы) 0,9% раствором  хлористого  натрия,  тем  самым,  обеспечивая 
отмывание  магноиммуносорбента  от  контаминирующей  микрофлоры  и 
загрязнений.  
Эксперименты  проводили  с  обеззараженными  клетками  вакцинного 
штамма Y.pestis EV, а  также  с  использованием  вирулентных  штаммов 
чумного  микроба    и  в  модельных  опытах  на  садовой  почве, 
контаминированной  исследуемым  возбудителем.  Из    культур Y. рestis, 
выращенных  при  температуре 370С,  готовили  по 500 мл  суспензии  с 
содержанием  1х101; 1х102; 2х102; 5х102; 8х103  м.к.  в  этом  объеме  пробы,  в 
которые  вносили  по 1 мл  суспензии  из  гетерологичных  штаммов 
(Y.pseudotuberculosis I–VI серотипов, Y.enterocolitica, E.coli) в концентрации 
1х109 м.к./мл. 
После  пропускания  проб  через  описанную  систему,  в  результате 
которого  осуществлялось  селективное  концентрирование  патогена  на  
магноиммуносорбенте,  проводили  иммуноферментный  анализ.  Во  флаконы 
помещали 200 мкм  исследуемой  взвеси  магноиммуносорбента.  Контролем 
служили  КМИС,  не  контактировавшие  с  пробой.  Затем  в  опытные  и 
контрольные  флаконы  вносили  по 200 мкл  иммунопероксидазного 
коньюгата, изготовленного нами, в его рабочем разведении, инкубировали 1 
час при комнатной температуре, отмывали 3–4 раза 0,9% раствором хлорида 
натрия  с  твин–20,  используя  постоянный  магнит.  После  этого  вносили 
свежеприготовленный  субстратный  раствор.  Реакцию  останавливали 
внесением  во  флаконы  стоп–реагента  (рисунок 19). Учет  результатов 
проводили  визуально  через 1–5 минут.  При  положительном  результате 
происходило  оранжево–коричневое  окрашивание,  при  отрицательном – 
раствор ингредиентов реакции оставался бесцветным. Для учета результатов 
на  колориметрическом  анализаторе  содержимое  флаконов  после  остановки 

 
реакции переносили в микропланшеты и снимали показания прибора при 492 
нм. Положительным считали пробы, показатели цвета которых в 1,5 и более 
раз превышали контрольные.  
На 
основе 
проведенных 
исследований 
установлено, 
что 
чувствительность 
чумного 
магноиммуносорбентного 
диагностикума, 
оцененная  в  ИФА,  во  всех  проведенных  опытах  была  не  менее  1х102  м.к.  в 
пробе. 
Специфичность  препаратов  позволяла  проводить  анализы  без 
перекрестных 
реакций 
с 
исследованными 
гетерологичными 
микроорганизмами.  Аналогичные результаты получены и с пробами почвы. 
Кроме  антительного  магноиммуносорбентного  хитозанкремнеземного 
сорбента  был  изготовлен  антигенный  КМИС,  лигандом  для  получения 
которого  служила  Ф1  чумного  микроба.  Данный  КМИС  применяли  для 
обнаружения  специфических  антител  в    экспериментальных  сыворотках  от 
лабораторных  животных,  зараженных  чумой.  Для  проведения  ИФА  во 
флаконы  вносили  по  200 мкл  10% взвеси  КМИС.  Контролем  служил 
магноиммуносорбент,  не    контактировавший  с  сыворотками.  В  опытные 
флаконы вносили по 100 мкл испытуемых сывороток в разведениях от 1:100 
до 1:3200. Выдерживали при температуре при 370 С в течение 1 часа. Сорбент 
отмывали 3–4 раза фосфатным буфером с твином, удерживая его постоянным 
магнитом.  Затем  в  опытные  и  контрольные  флаконы  вносили  по 200 мкл 
рабочего разведения антивидового пероксидазного конъюгата, в который на 
1  мл  добавляли 10 мг  БСА,  выдерживали  при  температуре 370С 30 минут. 
Промывали, как описано выше, но не менее 5–6 раз, используя  постоянный 
магнит. После чего во флаконы вносили по 200 мкл хромогенной смеси. Как 
только  надосадочная  жидкость  слегка  желтела,  ее  в  количестве 200 мкл 
переносили  в  лунки  планшета  и  останавливали  реакцию 50 мкл  стоп-
реагента.  Аналогичную  операцию  проводили  с  контролем.  Для  учета 
результатов    производили  измерения  оптической  плотности  на  приборе 
«Мультискан» при длине волны 492 нм. Ответ считали положительным при 

 
превышении  оптической  плотности  опытного    раствора  над  контрольным  в 
1,5 и более раза.  
Таким  образом,  нами  показана  принципиальная  возможность 
применения  хитозанкремнеземных  иммуносорбентов  с  магнитными 
свойствами  для  диагностики  чумы  и  индикации  ее  возбудителя  в 
экспрессном иммуноанализе (ИФА).   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  
 
 

Выводы 
 
1. 
Проведены 
исследования 
по 
синтезу 
композиционных 
магносорбентов  методом  формирования  пористой  структуры  кремнезема  в 
присутствии  полимера  хитозана,  имеющих  стандартные  структурные 
характеристики – удельную поверхность в пределах 68-82 м² /г, объем пор 1,2-
1,5м³/г.  При  этом  достигнут  результат  количественного  регулирования 
магнитных 
свойств 
сорбентов 
с 
изменением 
величины 
удельной 
намагниченности  насыщения  от 4,3 до 17,4 МН,  А  х  м²/кг,  достигаемые 
увеличением содержания  магнитной составляющей в составе магносорбентов.  
2. 
Впервые 
разработана 
технология 
получения 
пористых 
магносорбентов  из  кремнеземного  материала  аэросила - А-380,  хитозана  и 
оксалата железа. Изучены их структурные характеристики, химический состав 
в  сопоставлении  с  данными  ИК-спектроскопии  и  спектроскопии  диффузного 
отражения.  Синтезированы  элементосодержащие  кремнеземные  сорбенты 
методом  молекулярного  наслаивания  и  деструкционно-эпитаксиального 
осаждения для координационной иммобилизации белковых лигандов. 
3.  
Проведены  исследования  по  разработке  технологии  получения 
магноиммуносорбентов  иммобилизацией  на  поверхности  композиционных 
хитозанкремнеземных  носителей  чумных  иммуноглобулинов  и  капсульного 
антигена чумного микроба (Ф1) методами окисления и бензохиноновым. 
4. 
Использование 
хитозанкремнеземного 
композиционного 
иммуносорбента  с  магнитными  свойствами  с  иммобилизованными  на  нем 
живыми  микробными  клетками Y. pestis EV в  качестве  инокулята  при 
глубинном  культивировании  позволило  существенно  сократить  время 
выращивания  чумной  вакцины  (до 15 часов)  при    значительном  увеличении 
выхода  биомассы  (на 40±5%) и  повышении  жизнеспособности  микробных 
клеток  (с 30% до 55%), при  этом  инокулят  можно  использовать  многократно.  
Выращенная  таким  методом  чумная  вакцина  соответствует  всем  требованиям 
нормативной документации. 

5. 
Увеличение биомассы Y. pestis EV при глубинном культивировании 
с использованием магноиммуносорбентного инокулята существенно повышает 
выход  капсульного  антигена  Ф1  за  счет  возможности  его  извлечения  как  из 
биомассы, так и из культуральной жидкости. 
6. 
На  основе  хитозанкремнеземного  магносорбента  сконструированы 
высокочувствительные  специфичные  диагностические  чумные  тест-системы 
(антительная и антигенная) для иммуноферментного анализа. Установлено, что 
основным 
фактором 
повышения 
их 
чувствительности 
являются  
иммунохимические  свойства  магноиммуносорбента,  определяемые  качеством 
носителя, способом иммобилизации белкового лиганда. 

Заключение 
С  90-х  годов  прошлого  столетия  начался  подъем  заболеваемости 
чумой  в  мире,  который  продолжается  и  в  настоящее  время.  Наличие 
обширных природных очагов на территории многих государств мира, в том 
числе    и  России,  социально-экономические  различия  этих  стран  и,  как 
следствие,  различие  арсеналов  методов  профилактики  и  диагностики  этой 
инфекции  и  борьбы  с  ней,  возможность  антропонозного  выноса  чумы  на 
неэнзоотичные  территории  и  тому  подобные  факторы  не  позволяют 
надеяться  на  полное  искоренение  чумы  в  природе  в  ближайшее  время  (Г.Г 
Онищенко,  А.М.  Кокушкин,  О.В.  Кедрова  и  др., 1998; Г.Г.  Онищенко,  Б.Л. 
Черкасский,  Ю.М.  Федоров  и  др., 1998; Г.Г.  Онищенко, 2002). После 
событий 11 сентября 2001 года в Нью-Йорке в одном ряду с возбудителями 
оспы,  сибирской  язвы,  вирусами  Эбола  и    Марбурга  в  списке  наиболее 
вероятных  и  опасных  агентов  биотерроризма  отмечен  чумной  микроб. 
Именно  поэтому  вопросам  специфической  защиты  и  экспрессным  методам 
диагностики  (индикации)  этой  инфекции  уделяется  столь  пристальное 
внимание. 
Одним  из  приоритетных  научных  направлений  современной 
биотехнологии  является    разработка  технологий  на  основе  использования 
иммобилизованных  форм  биологических  объектов,  в  первую  очередь 
микроорганизмов и их метаболитов. Несмотря на большое количество работ, 
посвященных явлению иммобилизации, в настоящее время реализована лишь 
часть потенциальных возможностей данного направления.  
Придание 
носителям 
биомолекул 
и 
клеток 
свойства 
магнитоуправляемости 
открыло 
новые 
перспективы 
применения 
иммобилизованных микробиологических систем (В.И. Ефременко, 1996; И.С. 
Тюменцева, 1996; Е.Н. Афанасьев, 2000). 
Анализ  литературных  данных  по  синтезу  биотехнологических 
сорбентов  свидетельствует  о    том,  что  в  данном  направлении  существует 
множество  проблем,  связанных  с  выбором  сорбционных  материалов, 

поиском  селективных  лигандов,  разработкой  методов  фиксирования 
лигандов  на  поверхности  матриц.  Решение  вышеуказанных  проблем 
возможно  на  основе  целенаправленных  исследований  по  разработке 
сорбентов,  обладающих  высокой  специфичностью  к  определяемым 
биологически  активным  веществам  и  микроорганизмам,  отличающихся 
стабильностью 
в 
условиях 
присоединения 
лигандов, 
а 
также 
обеспечивающих  оптимизацию  в  процессах  сорбции  и  десорбции             
(А.В. Брыкалов, 1993; В.Б. Алесковский, 2002).  
В настоящее время для практических целей медицины, биотехнологии 
важное  значение  приобретают  композиционные  сорбенты,  содержащие  в 
качестве  основного  компонента  кремнезем.  Данные  сорбенты  могут  быть  с 
успехом  использованы  при  конструировании  твердофазных  тест-систем  для 
диагностики  особо  опасных  инфекций,  что  является  актуальным  решением 
проблемы  для  медицины  и  ветеринарии  (И.В.  Жарникова,  И.С.  Тюменцева, 
А.В. Брыкалов, 1995). 
Современные  технологии  синтеза  органокремнеземных  сорбентов 
включают  четыре  направления.  Первое – основано  на  сорбции  или 
хемосорбции  полимеров  из  растворов  на  поверхности  сорбентов,  имеющих 
определенные  структурные  характеристики;  второе – включает  синтезы 
сорбентов,  заключающиеся  в  радикальной  или  ионной  полимеризации 
мономеров  в  присутствии  кремнезема;  третье  направление – для  получения 
объемно-модифицированных  композиционных  сорбентов  предусматривает 
поликонденсацию 
кремнийорганических 
соединений. 
Способ 
и 
технологические 
аспекты 
получения 
композиционных 
сорбентов, 
основанные на формировании пористой структуры кремнеземной матрицы в 
присутствии  полимеров  (декстран,  поливиниловый  спирт)  формируют 
четвертое направление по конструированию органокремнеземных сорбентов. 
Многочисленные  публикации  авторов  (М.Т.  Брык, 1981; Г.В.  Кудрявцев, 
С.М. Староверов, 1989; В.Б. Алесковский, А.Я Юффа, 1989; А.В. Брыкалов, 

1993;  В.Б.  Алесковский, 2002) содержат  информацию  по  достоинствам  и 
недостаткам каждого из направлений синтеза сорбента. 
Целью  начального  этапа  исследований  по  диссертационной  работе 
являлось  получение  ферромагнитных  сорбентов,  обладающих  заданным 
составом,  адсорбционными  и  магнитными  свойствами,  используемыми  для 
проведения  твердофазного  иммуноанализа  микроорганизмов  на  основе 
методов  ИФА.  Одной  из  ключевых  задач  являлось  применение 
магнитоуправляемых 
сорбционных 
материалов 
для 
глубинного 
культивирования вакцинного штамма чумного микроба. 
Синтез  магносорбентов  с  высокой  сорбционной  емкостью  проведен 
методом  формирования  пористой  структуры  носителя  в  присутствии 
полимера  хитозана.  В  качестве  кремнеземного  компонента  использован 
высокодисперсный  непористый  кремнезем -  аэросил  А-380.  В  технологии 
получения  сорбента  применялся  полисахарид  хитозан,  представляющий 
собой  полностью  дезацетилированный  продукт -  поли [(1-4)- 2 амино-2-
дезокси-β-Д-глюкозы].   
В  строении  хитозана  выделяют  два  участка:  упорядоченные  участки, 
образованные  противоположно  заряженными  звеньями  полиэлектролитной 
системы,  и  участки,  чередующиеся  с  дефектами.  Наличие  в  хитозане  двух 
гидроксильных  и  первичной  аминогруппы  расширяет  возможности  его 
модификации (Т.И. Тюпенко, 2001).  
 
Технология 
получения 
хитозанкремнеземных 
магносорбентов 
включала  восемь  стадий.  Стадии  технологии 1-5 характеризуют  процесс 
получения  композиционного  магносоорбента,  а  последующие  стадии 6-8 – 
отражают этапы модифицирования поверхности сорбента функциональными 
группами:  методом  окисления,  бензохиноновым,  а  также  процессы 
иммобилизации антигена или антител с последующей стабилизацией КМИС. 
Технологии синтеза магноиммуносорбента подробно представлены в главе 3 
диссертации.  

 В  качестве  магнитного  компонента  при  синтезе  применялся  магнетит  
(Fe3O4), а также разработан способ получения магносорбента путем введения 
на стадии получения гидрогеля оксалата железа (II). 
Структура  композиционных  сорбентов  представлена  корпускулярной 
системой,  которая  состоит  из  частиц  кремнезема,  покрытых  полимером 
хитозана.  Размер  корпускул  определяет  величину  удельной  поверхности,  а 
плотность  их  упаковки – объем  и  радиус  пор.  Механизм  образования 
пористых  хитозанкремнеземных  магносорбентов  можно  представить,  как 
сложный  процесс,  сопровождающийся  формированием  корпускулярной 
структуры  кремнеземного  остова  из  непористых  частиц  аэросила  А-380,  и 
включением в него органического полимера хитозана и магнетита. 
При  сравнительном  анализе  данных  этих  двух  методов  следует 
отметить,  что  с  использованием  в  качестве  компонента  для  синтеза 
сорбентов  оксалата  железа  получаемые  магносорбенты  имеют  несколько 
меньшую  удельную  поверхность  и  большее  значение  объема  пор.  Это 
объясняется,  по-видимому,  разрыхляющим  и  активирующим  влиянием 
газообразных продуктов, выделяющихся при разложении оксалата железа, с 
образованием FeO, далее Fe2O3 и магнетита. 
Синтезированные  нами  хитозанкремнеземные  магносорбенты  имели 
следующие  стандартные  структурные  характеристики – удельную 
поверхность  в  пределах 68-82 м2/  г,  объем  пор 1,2-1,5 м3/  г.  При  этом 
достигнут  результат  количественного  регулирования  магнитных  свойств 
сорбентов с изменением величины  удельной намагниченности насыщения от 
4,3 до 17,4 МН , А х м2/кг, достигаемые увеличением содержания магнитной 
составляющей в составе магносорбентов. 
Разработана технология получения элементсодержащих кремнеземных 
сорбентов 
на 
основе 
аэросила 
А-380 
методом 
деструкционно- 
эпитаксиального 
осаждения 
(ДЭО), 
ранее 
используемого 
для 
модифицирования  силикагеля  такими  химическими  элементами,  как  медь, 
цинк, кобальт, магний, марганец (В.Б. Алесковский, 2001). 

Для  синтеза  элементсодержащих  кремнеземных  сорбентов  к 4 г 
аэросила  А-380  добавляли 100 мл 0,15 М  растворов  соответствующих  для 
каждого  отдельного  синтеза  солей  СuSO4, MgSO4, CoSO4, MnSO4, FeCI2    в 
0,25  М  растворе  водного  аммиака.  Суспензию  выдерживали  в  течение 24 
часов  при 2300С.  Далее  сорбент  отмывали  дистиллированной  водой  до 
нейтральной реакции в промывных водах, высушивали при температуре 95-
1100С  в  течение 2 часов.  Затем  сорбент  измельчали  и  методом  рассева 
выделяли фракцию с размером частиц 80-120 мкм. 
Количественный 
химический 
анализ 
полученных 
сорбентов 
подтвердил образование поликремневых солей химических элементов, таких 
как  медь,  магний,  марганец,  кобальт,  и  процесс  образования 
модифицированных  кремнеземов  согласуется  с  механизмом,  предложенным 
в работе (В.Б. Алесковского, 2001). 
При  определении  концентрации  Бренстедовских  кислотных  центров  и 
констант  равновесия  Кср  для  образцов  сорбентов,  полученных  методом 
формирования  пористой  структуры  кремнезема  в  присутствии  полимеров 
декстрана 
и 
хитозана, 
а 
также 
элементсодержащих 
сорбентов, 
синтезированных  методом  деструкционно-эпитаксиального  осаждения, 
показано, что композиционные органокремнеземные сорбенты, по сравнению 
с  исходным  аэросилом  А-380,  имеют  меньшие  значения  концентрации 
протодонорных  кислотных  центров  В0  и  констант  равновесия.  Данную 
закономерность можно объяснить тем, что при синтезе органокремнеземных 
сорбентов  в  процессе  формирования  корпускулярной  структуры  полимеры 
декстран  и  хитозан  частично  экранируют    Бренстедовские  центры 
кремнеземной  матрицы.  При  синтезе  композиционных  сорбентов, 
содержащих Fe2O3,  вводимый  до  массового  количества 15% относительно 
общей  массы  получаемого  композиционного  сорбента,  наблюдается 
усиление  кислотных  свойств  поверхностных  центров  модифицированных 
кремнеземов.  Кроме  того,  введение  в  состав  композиционного  сорбента 
Fe2O3 приводит к уменьшению на 25-30% удельной поверхности сорбентов, 

что, вероятно, обусловлено стабилизирующим действием оксида железа (II), 
проявляющимся  в  противодействии  процессу,  связанному  с  укрупнением 
корпускулярных частиц в структуре модифицированного кремнезема. 
Синтез  элементсодержащих  кремнеземных  сорбентов  методом 
деструкционно-эпитаксиального  осаждения,  в  отличие  от  общеизвестных 
методов  синтеза  твердых  веществ,  протекает  не  путем  хаотичного 
междуатомного  и  межмолекулярного  взаимодействия,  а  путем  переноса  и 
закрепления  на  заранее  подготовленной  поверхности  каждый  раз  только 
одних, избранных структурных единиц. Данным методом по оригинальному 
синтезу получены магносорбенты, обладающие магнитными свойствами. 
Таким образом, в результате проведенных исследований получен набор 
композиционных  сорбентов  с  оптимизированным  составом  и  структурными 
характеристиками, 
изучены 
их 
спектральные 
характеристики, 
микроструктура  поверхности,  кислотные  свойства,  что  позволяет 
целенаправленно  использовать  сорбционные  материалы  для  последующего 
получения на их основе специфичных иммуносорбентов. 
Химическое  модифицирование  дисперсных  твердых  тел  представляет 
собой  процесс  изменения  химического  состава  поверхностного  слоя  в 
заданном направлении. 
С  целью  дальнейшего  активирования  композиционных  сорбентов 
функциональными 
группами 
нами 
разработаны 
три 
варианта 
модифицирования носителей: бензохиноновый, окислением и с применением 
глутарового альдегида. 
Одним  из  важнейших  условий  получения  магноиммуносорбентов  с 
высоким  уровнем  емкости,  специфичности  и  чувствительности  является 
выбор эффективных методов иммобилизации лигандов. 
Иммобилизацию  иммуноглобулинов  на  поверхности  магносорбентов 
проводили  следующим  образом:  к 0,2 мл 10% взвеси  магносорбента 
приливали 1 мл  иммуноглобулинов  чумных,  варьируя  количество  белка  от 

0,5 до 10 мг/мл, ковалентное связывание проводили в течение 1-24 часов, при 
температуре 50С; 22+40С и 380С. 
В  соответствии  с  экспериментальными  данными,  оптимальными 
факторами, 
которые 
обеспечивают 
получение 
иммуносорбентов, 
обладающих 
высоким 
уровнем 
специфической 
активности 
и 
чувствительности, 
являются 
следующие: 
время 
иммобилизации 
специфических иммуноглобулинов 1,5 часа при значении рН раствора белка 
6-8 и температуры от 5 до 220С. 
На 
основе 
хитозанкремнеземных 
сорбентов, 
активированных 
бензохиноном и окислением перхлоратом натрия, разработаны эффективные 
композиционные магноиммуносорбенты, имеющие преимущества по уровню 
чувствительности  и  специфичности,  технологичности  получения  перед 
глутаральдегидным  методом  получения  активированных  сорбционных 
материалов.  В  данном  случае  проявились    недостатки  этого  метода, 
связанные  с  тем,  что  глутарового  альдегида  практически  не  существует  в 
мономерном  виде (P. Monson, 1978), и  это  приводит  к  неконтролируемости 
процесса активирования поверхности сорбента, а также к нестандартности в 
синтезе  активированного магносорбента по количеству альдегидных групп. 
Магноиммунносорбенты, 
получаемые 
бензохиноновым 
методом 
и 
окислением,  при  хранении (40С)  сохраняли  стабильность  свойств  в  течение 
одного года (срок наблюдения). 
Одним из современных направлений научных исследований в области 
биотехнологии 
является 
использование 
иммобилизованных 
клеток. 
Иммобилизация  биообъекта  способствует  увеличению  продуктивности  и 
производительности  биотехнологического  процесса,  стабилизации  свойств 
продуцента, 
возможности 
использования 
и 
быстрого 
удаления 
микробиологической  системы  из  зоны  культивирования  (Н.С.  Егоров, 
А.В.Олескин, 
В.Д.Самуилов, 1987; А.П.Синицын, 
Е.И.Райкина,             
В.Н.  Лозинский  и  др., 1994; И.В.  Владимцева, 2002; J.Naihu, 1987). 
Магнитное  манипулирование  микроорганизмами – продуцентами,  фиксиро-

ванными  на  магнитных  носителях,  весьма  перспективно,  однако  до 
настоящего  времени  разработке  этих  технологий  уделялось  мало  внимания. 
Это  и  определило  характер  следующего  направления  наших  исследований: 
изучение  возможности  и  эффективности  использования  хитозанкремне- 
земного магноиммуносорбента для глубинного культивирования вакцинного 
штамма Y.pestis ЕV.  Лигандом  для  получения  МИС  служили 
иммуноглобулины G, выделенные  из  гипериммунной  кроличьей  сыворотки 
крови,  полученной  при  иммунизации  животных  водорастворимыми 
антигенами,  изолированными  из  биомассы Y.pestis EV, выращенной  при 
(27±1)0С.  Для  получения  иммобилизованных  на  магнитном  носителе 
бактериальных клеток использовали производственную культуру вакцинного 
штамма Y.pestis EV. После  контакта  микробных  клеток  с  магнитным 
носителем  происходила  прочная  иммобилизация  чумного  микроба  на 
поверхности  магнитоуправляемого  хитозанкремнеземного  иммуносорбента 
на основе реакции «антиген-антитело». 
Магноиммуносорбент  с  фиксированными  микробными  клетками 
вносили  в  лабораторный  ферментер (LКВ,  Швеция)  и  использовали  в 
качестве  инокулята,  который  удерживали  на  соленоиде  путем  создания 
электромагнитного поля. Для выращивания микробной взвеси в ферментере 
в качестве питательной среды использовали бульон Хоттингера рН (7,1±0,1), 
инкубирование  проводили  при  температуре (27±1)0С  дискретным 
добавлением глюкозы согласно РП №702-97. 
Контролем  служило  глубинное  культивирование Y.pestis EV по  мето- 
дике    периодического  выращивания  в  ферментере  без  иммобилизованного  
сорбента. 
Анализируя  динамику  накопления  биомассы  производственного 
штамма Y.pestis EV в  процессе  глубинного  культивирования  с 
использованием  магнитоуправляемых  иммобилизованных  систем,  можно 
отметить,  что  при  первом  выращивании lag-фаза  в  среднем  длилась 8-9 
часов,  после  чего  наступала  экспоненциальная  фаза,  во  время  которой 

отмечались  интенсивный  рост  и  размножение  клеток.  Через 18-20 часов 
наступала  стационарная  фаза  роста,  в  начале  которой  производили  слив 
культуральной  жидкости,  оставляя  соленоид  в  рабочем  состоянии.  В  сосуд 
заливали  свежую  порцию  бульона  Хоттингера  и  проводили  повторное 
выращивание биомассы, не внося дополнительное количество инокулята. Так 
повторяли пять раз. 
Анализ динамики  роста повторных выращиваниях иммобилизованных 
клеток  вакцинного  штамма  чумного  микроба  показал,  что lag-фаза 
практически  отсутствовала,  а  стационарная  фаза  роста  наступала  через 
(15±1)  часа.  При  этом  «урожай»  биомассы  при  первом  и  повторных 
глубинных  культивированиях  был  фактически  одинаковым  и  составил  в 
среднем  7х1010  м.к./мл  среды.  По  сравнению  с  контролем  (без 
иммобилизованного  инокулята)  количество  биомассы  увеличивалось  на 
40±5%.Описанные  эксперименты  были  проведены  на  пяти  сериях 
ферментативного бульона Хоттингера. 
Изучение  свойств  вакцинного  штамма Y.pestis EV, выращенного  в 
условиях  глубинного  аппаратного  культивирования  при  использовании 
иммобилизованного  на  магнитном  сорбенте  инокулята,  проводили  в 
соответствии  с  ФС 42-3877-99. Морфологические,  тинкториальные, 
биохимические  свойства,  иммуногенность,  термостабильность  вакцины 
соответствовали  НД.  Результаты  изучения  жизнеспособности  (опытных  и 
контрольных 
образцов) 
свидетельствуют, 
что 
при 
глубинном 
культивировании 
в 
электромагнитном 
поле 
с 
использованием 
иммобилизованного  инокулята  на  магнитном  носителе  процент  живых 
микробных  клеток  достигает  не  менее (55,4±5,8)%, в  то  время,  как  в 
контрольных образцах этот показатель – не более (30±5)%. 
Вышеизложенное дает основание высказаться в пользу перспективнос- 
ти  использования  этого  способа  глубинного  культивирования  при 
производстве живой чумной вакцины. 

Кроме  того,  при  глубинном  культивировании  чумного  микроба 
появляется  возможность  использовать  как  микробную  биомассу,  так  и 
культуральную жидкость для получения его капсульного антигена (Ф1), что 
значительно  увеличивает  выход  целевого  продукта  высокого  качества, 
который  является  основой  при  конструировании  различных  чумных 
иммунобиологических препаратов. 
Методы 
твердофазного 
ИФА 
основаны 
на 
использовании 
серологически  активных  компонентов,  иммобилизованных  на  нераство- 
римых  носителях,  что  обеспечивает  их  быстрое  и  эффективное  разделение. 
Чувствительность  и  специфичность  ИФА  обусловлена  не  только  степенью 
чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твердой 
фазы, которая должна сохранять иммунологические свойства и стабильность 
в  иммобилизованном  состоянии,  обладать  минимальной  активностью, 
неспецифически связывать компоненты анализируемой системы. 
Проведенные  эксперименты  показали,  что  хитозанкремнеземный 
магносорбент полностью отвечает перечисленным требованиям. 
Синтезированный  нами  композиционный  магносорбент,  активиро- 
ванный  перхлоратом  натрия,  был  использован  в  качестве  матрицы  при 
конструировании  антительной  и  антигенной  чумной    диагностических  тест-
систем  для  иммуноферментного  анализа.  При  этом  лигандами  служили 
иммуноглобулины G выделенные  из  гипериммунной  чумной  кроличьей  
сыворотки,  и  Ф1  чумного  микроба,  изолированная  из  культуральной 
жидкости изоэлектрической преципитацией. 
Чувствительность  чумного  антительного  магноиммуносорбентного 
диагностикума,оцененная  в  ИФА,  всех  изготовленных  серий  была  не  менее 
1х102 м.к. в пробе. Специфичность препаратов позволяла проводить анализы 
без  перекрестных  реакций  с  исследованными  гетерологичными  микроор- 
ганизмами.  Изготовленный  нами  антигенный  КМИС  обладал  высокой 
чувствительностью при выявлении специфических антител. 
  

Список использованных источников 
 
1. Айлер, Ю.П. Планирование эксперимента при поиске опти-
мальных условий / Ю.П. Айлер, Е.В. Макарова.  - М.: 1976.-146с. 
2.  Айлер,  Р.  Химия  кремнезема / Р.  Айлер. - М.:  Мир, 1982.-
127с. 
   
3.  А.С.  №1425910  А61К 39/02. Способ  получения  туляремий-
ного антигена / Н.Ф. Василенко, И.В. Кронгауз, О.Н. Лопатин, Т.И. 
Башлова, И.В. Жарникова.–1988. 
4. Албулов, А.И. Применение хитозана в ветеринарии для ле-
чения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодня-
ка сельскохозяйственных животных / А.И. Албулов, А.Я. Самуйлен-
ко, Н.Э. Нифатьев // Матералы V конференции «Новые перспективы 
в исследовании хитина и хитозана». – М,1999.- С. 115-117. 
5. Алесковский, В.Б. Стехиометрия и синтез твердых соедине-
ний / В.Б. Алесковский  - Л: Высшая школа, 1976.-2 18с. 
6. Алесковский, В. Б. Химия твердых веществ / В.Б. Алесков-
ский. - М.: Высшая школа, 1978.-350с. 
7.  Алесковский,  В.Б.  Модифицирование  поверхности  неорга-
ническими  соединениями / В.Б.  Алесковский,  А.Я.  Юффа // Журн. 
Всес. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. -1989-№3. - С.317-324. 
8. Алесковский, В.Б. Химия высокоорганизованных веществ // 
Химия  высокоорганизованных  веществ  и  научные  основы  биотех-
нологии:  Автореф.  Докл. III Междунар.  Конф. /СПбГУ.–Санкт-
Петербург, 2001, –  С.7–13 
9.Анапова,  Е.В.  Обнаружение  возбудителя  туляремии  у  боль-
ных с помощью реакции иммунофлуоресценции / Е.В. Анапова, Л.С. 
Каменова, И.С. Мещерякова //ЖМЭИ.–1989.–№4.–С.46–49. 

10. Апарин, Г.П. Микробиология чумы / Г.П. Апарин, Е.П. Го-
лубинский // Руководство.- Иркутск.- 1989.- 90с. 
11.  Афанасьев,  Е.Н.  Научно-методические  аспекты  экспресс 
диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чу-
ма, бруцеллез,  сибирская  язва) // Автореф. Дис…. докт.  мед. наук / 
Е.Н. Афанасьев Ставрополь 2000, –с.450. 
12.Бактериологический  метод  определения  концентрирующей 
способности  магнитных  иммуносорбентов / С.Д.  Гавенский,  В.И. 
Ефременко,  И.М.  Климова,  В.Г.  Пушкарь,  В.Ю.  Перов // Сб.  на-
уч.работ.– Волгоград, 1989. – Выш.4, – С.23–27. 
13. Бебрис, Н.К. - Получение чистого макропористого кремне-
зема  аэросила - адсорбента  для  газовой  хроматографии / Н.К.  Беб-
рис, А.В. Киселев, Ю.С. Никитин // Коллоид. журн.-1967.-Т.29, №3. 
– С. 326-332. 
14.Бельская,  Н.А.  Микрометод  фракционирования  и  инденти-
фикации белков бактерий / Н.А. Бельская, В.С. Митина, В.И. Вейн-
блат // Материалы  Северо-Кавказской  биохим.  конф.-  Махачкала, 
1970.- С. 270-271. 
15.Бельская,  Н.А.  Микрометод  фракционирования  и  инденти-
фикации белков бактерий / Н.А. Бельская, В.С. Митина, В.И. Вейн-
блат // Лаб. дело.- 1972.- №10.- С. 514-516. 
16. Березкин, В.Г. Твердые носители в газовой хроматографии 
/ В.Г. Березкин, В.Г. Пахомов, К.И. Сакодинский. - М.: Химия, 1975. 
- 210с. 
17.Богатский,  А.В.  Иммобилизация  протеиназы  Е  и  П  на  по-
верхности аминорганокремнезема / А.В. Богатский, Т.И. Давиденко, 
А.В. Чуенко // Укр. биохим. журн.-1979.-Т. 51., №4.-С. 315-318. 

18. Богданов, В.Д. Структурообразователи в технологии  рыб-
ных продуктов / В.Д. Богданов.-М:. ВНИЭРХ, 2001.- сер.3.-высш.3.- 
С.11-20. 
19.  Бойцова,  Т.М.  Обоснование  и  разработка  ресурсосбере-
гающих технологий рыбнофарма и пищевых продуктов на его осно-
ве // Автореферат дис. … д-ра техн. наук / Т.М. Бойцова .- Владиво-
сток, 2002.-24с. 
20.  Брей,  В.В.  Теоретическая  и  экспериментальная  химия / 
В.В. Брей. – М:. 1982. -Т.18, №1.-С.122-125. 
21. Брык, М.Т. Полимеризация на твердой поверхности  неор-
ганических  веществ / М.Т.  Брык - Киев:  Наукова  Думка. - 1981. - 
271с. 
22.  Брыкалов,  А.В.  Сорбенты,  на  основе  кремнеземов  и  акти-
вированных  углей  в  биотехнологии  и  медицине / А.В.  Брыкалов // 
Мат. конф. химиков Сев. Кавказа. - Нальчик, 1991.-С. 185-186. 
23. Брыкалов, А.В. Получение  биопрепаратов  на основе  ме-
тодов    -  аффинной  сорбции  и  иммобилизации //  Дис. ... д-ра  хим. 
наук / А.В. Брыкалов. -1993,СПб. - 330с. 
24.  Брыкалов,  А.В.  Метод  получения  магнитоиммуносорбен-
тов для диагностических тест-систем / А.В. Брыкалов, И.В. Жарни-
кова,  И.С.  Тюменцева // Сб.  стр. 58 науч.-  метод,  конф.  СГМИ. - 
Ставрополь, 1995.- С. 19-20. 
25. Брыкалов, А.В.  Новые композиционные носители для им-
мобилизации  ферментов / А.В.  Брыкалов,  О.В.  Воробьева // Совре-
менные  достижения  биотехнологии:  Материалы  Всерос.  конф. - 
Ставрополь. 1996.- С.279. 
26. Брыкалов,  А.В. Разработка  твердофазной   тест-системы   
для      диагностики хеликобактер  пилори / А.В.  Брыкалов,  О.В.  Во-

робьева,  В.Д. Пасечников // Современные   достижения   биотехно-
логии:   Материалы   Всерос.   конф.- Ставрополь, 1996.-С.274. 
27. Быков, И.П. Состояние и перспективы развития производ-
ства хитина, хитозана и продуктов на их основе из панциря ракооб-
разных / И.П. Быков.- М., 1999.- С. 15-18. 
28.  Владимцева,  И.В.  Использование  магнитных  сорбентов  в 
медицине и биотехнологии / И.В. Владимцева, А.А. Степин // Моле-
кулярная  биология  и  медицина:  Тез.докл.научн.конф.–Ленинград, 
1990.–С.32. 
29. Варламов, В.П. Место российской науки в мировом хито-
зановом буме / В.П. Варламов.- М., 1999.- С. 7-8 
30.  Вейнблат,  В.И.  Иммуноэлектрофорез  антигенов  чумного 
микроба / В.И. Вейнблат, В.В. Каминский, Л.С. Орлова // Проблемы 
особо опасных инфекций.- Саратов, 1972.- Вып.4(26).- С. 196-200. 
31. Вейнблат,В.И. Антигены Y.pestis (биохимические и имму-
нологические  аспекты) // Дис. … д-ра  мед.  наук  /В.И.  Вейнблат .- 
Саратов,1974.-324с. 
32.  Вейнблат  В.И.  К  вопросу  разработки  и  стандартизации 
препаративных  методов  получения  очищенных  антигенов  возбуди-
теля чумы / В.И. Вейнблат, М.С. Веренков, С.М. Дальвадянц // Био-
хим.  Парафизиол.  и  микробиология  особо  опасных  инфекций.-  Са-
ратов,1983.- С. 38-42. 
33. Вейнблат В.И.. Методы получения и очистки капсульного 
антигена  и  эндотоксина  возбудителя  чумы / В.И.  Вейнблат,  С.М. 
Дальвадянц, М.С.Веренков // Лабор. дело, 1983. №12.- С. 37-39 
 34.Вершилова,  П.А.,  Эпидемиология  бруцеллеза / П.А.  Вер-
шилова,  А.А.  Голубева // Бруцеллез.–М.:  Медицина, 1972.–С.319–
347. 

35. Веселова, И.А. Использование хитозана и его производных 
для  иммобилизации  ферментов / И.А.  Веселова,  Т.Н.  Шеховцова, 
Г.А.  Бадун // Новые перспективы в исследовании хитина и хитоза-
на: Материалы Пятой конференции – М.: 1999.–с.265–267. 
36.  Владимцева,  И.В.  Научно-методические  аспекты  приго-
товления и использования магнитоуправляемых иммобилизованных 
микробиологических  систем // Дис.…  д–ра  биол.  наук / И.В.  Вла-
димцева. – Ставрополь, 2002.–304с. 
37.  Воронков,  М.Г.  Кремний  и  жизнь / М.Г.  Воронков,  Р.И. 
Зельчан, Э.Я. Луковец  - Рига: Зинотне, 1978.-587с. 
38.  Вудворд,  Д.  Иммобилизованные  клетки  и  ферменты / Д. 
Вудворд  М.: Мир, 1988.- 161с. 
39.  Гибридомы,  синтезирующие  моноклональные  антитела  к 
полисахаридному  антигену  возбудителя  туляремии / Е.Г.  Черняв-
ская, П.Г. Свешников, Е.С. Северин, Н.Ф. Василенко // Особо опас-
ные  инфекционные  заболевания:  Сб.  науч.работ.–Волгоград, 1990.–
в. 4. – С.254–258. 
40. Голубинский, Е.П. Обнаружение фракции 1 чумного мик-
роба ферментным иммунологическим методом / Е.П. Голубинский,  
В.С. Рудник, М.П. Рудник // Проблемы изучения механизмов эпизо-
отии чумы: Тез. Докл. Всес. Конф.– Саратов, 1980–С.9. 
41. Голубинский, Е.П. Применение иммуноферментного мето-
да  для  обнаружения  антигенов  туляремийного  микроба  антител  к 
ним у людей и эпизоотологическим обследованиям / Е.П. Голубин-
ский, С.П. Меринов, Л.В. Меринова // Современные аспекты профи-
лактики зоонозных инфекций. – Иркутск, 1984.–№2. –С.129. 
42.  Горовой , Л.Ф.  Хитозансодержащие  материалы,  получае-
мые  из  грибной  биомассы / Л.Ф.  Горовой // Материалы  пятой  кон-

ференции перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М.: Из-
дат, 1999.- С. 130-133. 
43. Грядских, Д.А. Композиционные сорбенты для иммобили-
зации микроорганизмов / Д.А. Грядских //Современные достижения 
биотехнологии: Мат.Всерос.конф. - Ставрополь, 2002, –с.68–69. 
44.  Грядских,  Д.А.  Магноиммуносорбенты  для  глубинного 
культивирования чумного микроба / Д.А. Грядских, И.С. Тюменце-
ва, Е.Н. Афанасьев // Биотехнология 2003: Мат.Всерос. конф. - Сочи, 
2003.–С.79. 
45.  Девдариани,  З.Л.  Научно-методические  основы  конструи-
рования моноклональных иммуноглобулиновых реагентов с исполь-
зованием  гибридомной  технологии //  Дис. … д-ра  мед.  наук / З.Л. 
Девдариани.- Саратов,1993.- 52 с. 
46.  Домарадский,  И.В.  Чума:  современное  состояние,  гипоте-
зы, проблемы / И.В. Домарадский.- Саратов, 1993.- 129 с. 
47. Дрантиев, Б.Б. Современное состояние и перспективы раз-
вития  иммуноферментного  анализа / Б.Б.  Дрантиев,  А.М.  Егоров // 
Журнал.Всес.химич.  об-во  им.Д.И.Менделеева.–1982.–т.27,  №4.-
С.82–89. 
48.  Егоров,  Н.С.  Биотехнология  /Н.С.  Егоров,  А.В.  Олескин, 
В.Д.  Самуилов // Проблемы  и  перспективы  биотехнологии.-  М:. 
Высшая школа.- 1987.- 115 с. 
49. Ефременко, В.И. Магнитосорбенты в микробиологических 
исследованиях.  Применение  магнитных  сорбентов  в    иммунофер-
ментном  и  радиоиммунном  анализах  (обзор  литературы) / 
В.И.Ефременко, И.С. Тюменцева // Деп. в ВИНИТИ 26.12.95, №344-
В95. 
50.  Ефременко,  В.И.  Магносорбенты  в  микробиологических 
исследованиях / В.И. Ефременко. – Ставрополь, 1996.–130с. 

51.  Жакот,  Р.А.  Иммобилизация    ферментов    на  силикатных 
носителях / Р.А. Жакот,  А.С. Корсакевич  // Успехи биолог, химии.- 
1977.-Т. 18. - С.140-161. 
52.Жарникова  И.В.  Использование  композиционных  иммуно-
ферментов  в  реакции  иммунофлуоресценции  (РИФ)  для  экспресс–
диагностики  возбудителей  ООИ / И.В.  Жарникова,  А.В.  Брыкалов, 
И.С.  Тюменцева // Акт  вопросы  профилактики  чумы  и  других  ин-
фекционных  заболеваний:  Матер.науч.-практич.конф.посвященная 
100-ю открытия возбудителя чумы.– Ставрополь, 1994.– С. 224–225 
53.  Жарникова,  И.В.  Разработка  технологии  композиционных 
магноиммуносорбентов и конструирование на их основе диагности-
ческих  тест-систем  для  иммуноанализа  возбудителей  чумы  и  туля-
ремии // Автореоф.Дис. …. канд.биолог.  наук / И.В.  Жарникова .- 
Ставрополь, 1995.- 22С. 
54.  Жоголев,  К.Д.  Препараты  на  основе  хитина  и  хитозана  в 
медицине  и  рациональном  питании / К.Д.Жоголев,  В.Ю.Никитин, 
В.Н.Цыган. – МПб,2000.– 32с. 
55. Журавлев, В.И. Опыт применения реакции энзиммеченных 
антител  в  практике  эпизоотологического    обследования  природных 
очагов чумы / В.И. Журавлев, А.Т. Яковлев, В.С. Рыбкин // ЖМЭИ, 
1983, №11.- С.116–117. 
56.  Зайцев,  Т.Н.  Математический  анализ  биологических  дан-
ных /Г.Н.Зайцев. – М.: Наука, 1991.–184с. 
57. Закревский, В.И. Иммуносорбенты их применение в имму-
нологии  микроорганизмов / В.И.  Закревский //ЖМЭИ.–1980.–№4.–
С.9–15. 
58.  Звягинцев,  Д.Г.  Взаимодействие  микроорганизмов  с  твер-
дыми поверхностями / Д.Г. Звягинцев – М: Изд.МГУ, 1973–1976 с. 

59.  Зыкин,  Л.Ф.  Иммуноферментный  анализ  в  лабораторной 
диагностике  некоторых  опасных  инфекций.  ИФА  при  чуме / Л.Ф. 
Зыкин,  А.Т.  Яковлев // Очерки по лабораторной диагностике особо 
опасных инфекций.- Саратов: Сарат. ун-та.- 1993.- С. 10-15. 
60. Зыкин, Л.Ф. Очерки по лабораторной диагностике опасных 
инфекций / Л.Ф. Зыкин, А.Т. Яковлев. – Саратов, 1993.–109с.. 
61.  Изучение  сорбционной  способности  полистирольных 
планшетов, используемых в иммуноферментном анализе  / Л.И. Ва-
неева, И.Ю. Гридина, О.Н. Пантелеева и др., // ЖМЭИ.- №9.- 1989.- 
С. 86-89. 
62.  Ильин,  А.В.  Ацетилирование  низкомолекулярного  водо-
растворимого  хитозана  /А.В.Ильин,  В.П.Варламов//Новые  достиже-
ния в исследовании хитина и хитозана: Материалы Международной   
конференции.- Москва,2001.- С.280-283.           
63. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Сини-
цын, Е.И. Райкина, В.Н Лозинский, С.Д. Спасов // М:. Изд-во МГУ, 
1994.- 228с. 
64. Использование инфракрасной спектроскопии для изучения 
химического  состава  чумного  и  псевдотуберкулезного  микробов / 
Т.М.  Тараненко,  С.М.  Дальвадянц,  Т.П.  Боровикова,  И.Ф.  Ковалев, 
В.С.  Дернова // Пробл.  особо  опасн.  инф., 1972.- Вып.1(23).-  С. 37-
41. 
65. Иммуноферментный анализ / Под ред. Г.Т Нго, Г.М. Лен-
хофор .–М:. 1988.–С.25–167. 
66.  Использование  магнитоуправляемых  иммобилизованных 
систем  для  глубинного  культивирования / И.В.  Владимцева,  М.В. 
Самыгин,  А.А.  Степин,  О.В.  Колотова //  Биотехнология, –2001, 
№4.–с.74–78. 

67.  Исследование   структуры  гидроксильного    покрова   пиро-
генного  кремнезема  методами  ИК-спектроскопии  и  масс-
спектрометрии /В.В.Брей, Н.И.Горлов, Э.Н.Король, В.В.Стрелко   // 
Теорет. и эксперим. химия. -1982, №1.-С. 122-125. 
68.  Исследование  кислотных  свойств  силохрома  с–120,  моди-
фицированного элемент оксидными слоями методом молекулярного 
наслаивания / А.В.Брыкалов,  С.И.Кольцов,  В.И.Ковальков  и  др. // 
Журн.физ.химии, – 1986. т.60. –№4.–С. 950–952. 
69.  Калинина,  О.А.  ИФА  в  серодиагностике    сифилиса / О.А. 
Калинина,  И.В.  Емельянова,  М.Ф.  Лактионова // Современные  во-
просы  дерматовенерологии:  Сб.  юбил.  науч.  тр.  посвящ., 70-летию 
обл. кож.-вен.дисп. г. Курска.- Курск.- 1997.- С. 65-67. 
70.  Карнаухов,  А.П.  Глобулярная  модель  пористых  тел  кор-
пускулярного  строения / А.П.  Карнаухов // Кинетика  и  катализ.- 
1971. - т. 12, №4.- с. 1025-1033. 
71.  Карпенко,  В.В.  Обезболивание  животных  в  эксперименте 
/В.В. Карпенко, В.И. Сачков // Метод. рек..- М., 1985.- 53с 
72.  Картель,  Н.Т.  Новые  критерии  оценки  свойств  сорбентов 
медицинского назначения / Н.Т. Картель, Е.Д. Молюк, М.Е. Чуднов-
ский // тез.IV республ. конф. по сорбентам мед. назначения– Донецк, 
1988.–С.14–15. 
73.  Касторная,  М.Н.  Бруцеллез / М.Н.  Касторная,  Е.Н.  Афа-
насьев, И.С. Тюменцева // Лабораторная диагностика.–Дет.в ВИНИ-
ТИ 21.08.00.№148–151. 
74. Касторная, М.Н. Конструирование диагностических препа-
ратов  для  экспрессных  методов  лабораторной  диагностики  бруцел-
леза  и  детекция  его  возбудителей //  Дис….  канд.биол.наук / М.Н. 
Касторная.-  Ставрополь, 2003.–180с. 

 75. 
Киселев,  А.В.  Влияние  температуры  гидротермальной      об-
работки   на   изменение пор и скелета промышленного силикагеля / 
А.В.  Киселев,  В.М.  Лукьянович,  Ю.С.  Никитин.  // Коллоид.  журн.-
1969.-Т.31, №3. С.388-393. 
76. Киселев, А.В. – Инфракрасные спектры поверхностных со-
единений. /А.В.Киселев, В.И.Лыгин.–М.: Наука, 1972.–459с. 
77. Климова, В.А. Основные методы анализа органических со-
единений / В.А. Климова. – М:. Химия, 1971. –С.159–161. 
78. Климова, И.М. Магнитный иммунофермент анализ антиге-
нов Yersinia pestis / И.М. Климова, В.И. Ефременко, В.Г. Пушкарь // 
ЖМЭИ.– 1989. –№7. –С. 62–65. 
79. Климова, И.М. Способ получения МИС: Патент №5040754 
РФ, А в/к 39/385 с.12. № 11/00 //01, заявл.29.04.92. опубл.7.06.95. 
80.  Клячко–Гурвич,  А.А.  Методы  определения  удельной  по-
верхности / А.А. Клячко–Гурвич. – М:. 1961, –№10.–с.1885. 
 81. 
Ковальков, В.И. Синтез протонодонорных   групп   на   по-
верхности      высоко  дисперсного      углерода / В.И.  Ковальков,  Е.П. 
Смирнов, С.И. Кольцов  //Журн. общ. Химия, 1976. - Т. №9.- С.2151. 
82. Коликов, В.М. Хроматография биополимеров на макропо-
ристых кремнеземах  / В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвили. - Л.: Нау-
ка, 1988.- С.189. 
83.  Кольцов,  С.И.  Силикагель,  его    строение  и  физико-
химические  свойства / С.И.  Кольцов,  В.Б.  Алесковский. - Л.:  Гос-
химиздат, 1953.- С.94-98. 
84. Кольцов, С.И. Изучение   взаимодействия   трихлорсилана   
с силикагелем / С.И. Кольцов // Журн. прикл. химии., 1965.- Т.38, №6.- 
С.1384-1389. 
 

85.  Кольцов,  С.И.  Изучение  стехиометрии  продуктов  реакции 
трихлорсилана    с  функциональными  группами  поликремнекислоты / 
С.И. Кольцов, Г.Н. Кузнецова, В.Б. Алесковский // Журн. прикл. хи-
мии. – 1967. – Т.47.№1. – С.70-72. 
86. Кольцов, С.И. Изучение влияния носителей на свойства ка-
тализаторов / С.И. Кольцов, В.М. Смирнов, В.Б. Алесковский // Ки-
нетика и катализ.-1970.-Т.11,№4.-С.1013-1021. 
87. Кольцов, С.И. Изучение влияния носителя на свойства ка-
тализатора / С.И. Кольцов, В.М. Смирнов, В.Б. Алесковский //  Ки-
нетика и катализ. - 1973.- Т.14, №5.-С.1300-1303. 
88.  Красавцев,  В.Е.  Криль  как  сырьевая  основа  хитинового 
производства  /В.Е.  Красавцев // Материалы  исследования  хитина 
«хитозана».-М.,1999.- С. 35-37. 
89.  Кудрявцев,  Г.В.  Структура  привитого    слоя  модифициро-
ванных    кремнеземов / Г.В. Кудрявцев, С.М. Староверов //    Журн. 
Всес. хим. об-ва  им. Д.И.Менделеева. – 1989, №3- С.308-316. 
90.  Куфлина,  С.А.  Эвтаназия  экспериментальных  животных / 
С.А. Куфлина, Т.Н. Павлова // Метод. рек.по выведению животных 
из экспериментов.- М., 1985.- 9с. 
91. Лабинская, А.С. Практикум по микробиологическим мето-
дам исследования / А.С. Лабинская. – М.: Медизд. 1963.–С.425–446. 
92.  Лившиц,  В.С.  Полимерные  покрытия  на  раны  и  ожоги / 
В.С.  Лившиц //Химикофармацетический  журнал.- 1988, №7. – С. 
790-798. 
 93. 
Лисичкин, Г.Д.    Достижения    и    перспективы    химиче-
ского  модифицирования  поверхности  минеральных  веществ / Г.Д. 
Лисичкин // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева.-1989.Т.34. 
№3.- С.291-297. 

94.  Лисичкин,  Г.Д.  Достижения  и  перспективы  химического 
модифицирования поверхности минеральных веществ / Г.Д. Лисич-
кин // Журн. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менднлеева.-1989.-Т. 34, №3.- 
С.219-297. 
95.  Малыгин,  А.А.  О  химическом  составе  продуктов  взаимо-
действия  хромсодержащего  кремнезема  с  оксихлоридом  ванадия / 
А.А. Малыгин // Журн. общ. химия. -1979.-№8-С.1686-1690. 
96. Малыгин, А.А. Химическая сборка материалов с заданны-
ми свойствами / А.А. Малыгин. - Л.: Наука, 1986.- 49с. 
97. Манолов, А.Д. Радиоиммунологический анализ при изуче-
нии персистенции чумного антигена в организме грызунов и у экто-
паразитов  природных  очагов  Сибири / А.Д.  Манолов,  Л.Ф.  Зыкин, 
Е.П. Голубинский // ЖМЭИ.–1991.–№3.–С.44–47. 
98.  Мельник,  И.В.  Применение  хитозана  и  его  производных 
для  концентрирования  баксуспензий / И.В.  Мельник,  Н.Д.  Скичко, 
Е.А. Шубина.-М., 1999.- С. 170-171. 
99. Методы практической биохимии / Под ред. В.Уильямсона. 
- М.: Мир, 1978.-268с. 
100.  Мещерякова,  И.С.  Использование  иммуноферментного 
метода Slisa   выявлению возбудителей туляремии / И.С. Мещеряко-
ва, И.С. Умнова, К.А. Шаханина // Актуальные вопросы иммуноди-
агностики  особо  опасных  инфекций – Ставрополь, 1986. – 4.1- 
С.216–218. 
101. Мирясова, Л.В. Метод культивирования коклюшных бак-
терий / Л.В. Мирясова // Лаб.дело. 1999, №10. – С.31–34. 
102. Неймарк, Н.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и 
носители  катализаторов / Н.Е.  Неймарк. – Киев:  Наукова  Думка, 
1982. – 210 с.  

103.  Немцев,  С.В.  Промышленное  производство  хитозана  из 
панциря карапакса охотоморских крабов / С.В. Немцев, В.С. Божко 
// Материалы исследования хитина «хитозана».- М., 1999.- С. 51-52. 
104. Нечипоренко, А.П. Микроскептрофическое исследование 
титанооксидных  слоев,  синтезированных  методом  молекулярного 
наслаивания / А.П.Ненчипоренко,  Г.К.Шевченко,  С.И.Кольцов. 
//Журн.прил.химии.–1981.–т.54.–№1.–С.1260–1264. 
105.  О  применении  твердофазного  иммуноферментного  мето-
да для определения туляремийного антигена /Н. Ф. Василенко, Л.И. 
Заревина, А.И. Мирошниченко, О.Н. Лопаткин, Г.И. Башкова // Ак-
туальные вопросы диагностики особо опасных инфекций: Тез. Докл. 
Всес.- конф.- Ставрополь, 1988.- вып. 4.1. – С. 53-56. 
106. Обнаружение антигенов бруцелл с помощью частиц кол-
лоидных  металлов  в  качестве  маркеров  специфических  антител / 
Т.Ю. Загоскина, Е.Ю. Марков, А.И. Калиновский, Е.П.Голубинский 
// ЖМЭИ. – 2001.–№3.–С.65–69.  
 
107. Оккерс, К. Пористый кремнезем / К. Оккерс // Строение и 
свойства адсорбентов и катализаторов. - М.: Мир, 1973. - С.233-284. 
108. Онищенко, Г.Г. Эпидемическая обстановка в Российской 
Федерации  и  основные  направления  деятельности  по  ее  стабилиза-
ции / Г.Г. Онищенко // Матер. к докладу – Главного государственно-
го санитарного врача Российской Федерации на VIII Всероссийском 
съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва 26-
28 марта 2002).- М.,2002. 
109. Опыт производства комбикормов с хитозаном на Днепро-
петровском  заводе  рыбных  кормов  /Е.А.  Гамызин,  Т.И.  Сазонова, 
Е.Д.  Близнюк.  И.В.  Сушков // Новые  перспективы  в  исследовании 
хитина и хитозана: Материалы V конференции.- М, 1999.-С.124-125.  

110. Павлов, В.В. Химические перегруппировки в поверхност-
ном слое дисперсных кремнеземов / В.В. Павлов, В.А. Тертых, А.А. 
Чуйко. – 1976. - №4. – С.62-69.  
111.  Пак,  В.Н.  Природа  кислотных  центров  поверхности  ти-
тансодержащих  кремнеземов / В.Н.  Пак,  С.И.  Кольцов,  В.Б.  Але-
сковский // Теор. и эксперим. Химия. -1976.-№6.- С.839-843. 
112. Парфит, Т, Адсорбция малых молекул / Т. Парфит, К. Ро-
честер – М.: Мир, 1986.–С.14–63. 
113. Патент РФ №21652553. Способ  лечения онкозаболеваний 
К.А. Трескунов, Б.А. Комаров. Приоритет от  20.01.98. 
114. Патент РФ о заявке 97105499/25. Флокуляционный агент 
радионуклидов  для  дезактивации  жидких  радиоактивных  отходов. 
//Бюл. 1998, №26. 
115.  Перспективы  клинического  применения  иммуномодули-
рующих  препаратов  на  основе  хитозана / А.Д.  Жоголев, 
К.Д.Жоголев, В.Ю.Никитин, В.Н.Цыган, // Медицинская иммуноло-
гия.–2001. -3.–№2.–С.316–317. 
116.  Плаченов,  Т.Г.  Разработка  конструкции  поромеров  для 
изучения структуры пористых тел методом вдавливания ртути. / Т.Г. 
Плаченов // Журн. прил. химии.–1965.–Т.28.–№3.–С.245–253. 
117.  Плиско,  Е.А.  Хитин  и  его    химические  превращения 
/Е.А.Плиско,  Л.А.Нудьга,  С.Н.Данилов //Успехи  химии.–1977.–т. 
46.–Вып.8.–С.1970–1987. 
118. Покровский, В.И. Иммуноферментный анализ: современ-
ное состояние и тенденции развития / В.И. Покровский // Медицин-
ская генетика и иммунология.- М:. 1986.- С. 4-5. 
119.  Поляченко,  В.М.  Обнаружение  антигенов Francisella tu-
larensis ИФА / В.М. Поляченко, С.П. Меринов, Е.П. Голубинский // 
ЖМЭИ. – 1983.–№11.–С.114–115. 

120.  Постнов,  В.Н.  Синтез  неорганических  матриц  на  основе 
силикагеля методом химической сборки / В.Н. Постнов  // Сб. науч. 
тр. ЛГУ. - 1983.-С. 98-99. 
121. Постнова, А.М. Исследование протонной кислотности ти-
тансодержащих  силикагелей,  полученных  методом  молекулярного 
наслаивания / А.М. Постнова, В.Н. Пак, С.И. Кольцов // Журн. физ. 
химии. -1981.-Т.35, №8.- С.2140-2141. 
122.  Практический  курс  химической  и  ферментативной  кине-
тики:  Учеб.  пособие  для  химических  специальностей  ун-тов  
/И.В.Березин, А.А.Клесов.–М.: Из-во Моск.ун-та, 1976.–320с. 
123. Препаративный метод выделения и  очистки капсульного 
антигена чумного микроба при помощи изоэлектрической преципи-
тации / М.М. Титенко, В.И. Вейнблат, М.С. Веренков, А.С. Васенин 
// Диагн. и профил. особо опасн. инфекий-.Саратов.- 1983.- С. 34-39. 
124.  Приказ  №1179  от 10 октября 1983 г.  Об  утверждении 
нормативных  затрат  кормов  для  лабораторных  животных  в  учреж-
дениях здравоохранения.- Москва, 1983. 
125. Пути совершенствования санитарно-эпидемиологической 
охраны  территорий  стран – участниц    Содружества  Независимых 
Государств // Проблемы сан-эпид. охраны территории стран Содру-
жества Независимых  Государств: Тез.докл. Междунар. науч.-практ. 
конф. (15-17 сентября,1998).- Саратов, 1998.- С. 3-6. 
126.  Рабинович, М.И.  Применение хитозана фармакорректора 
содержания  тяжелых  металлов  в  организме    животных  на  Южном 
Урале / М.И. Рабинович, А.Р.  Таирова // Матералы V конференции 
«Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана».- М, 1999.- 
С. 186-188. 
 

127.  Рогожин,  С.В.  Получение  модифицированных  кремнезе-
мов  для  присоединения  биологически  активных  соединений / С.В. 
Рогожин, В.Ю, Варламов, Д.Г. Вальковский // Изв. АН СССР / сер. 
хим. – 1975. - №8. – С.1718-1721.  
  
128.  Роуз,  Э.  Химическая  микробиология / Э.  Роуз. – М.: 
1971.–С.45–60. 
129. Рубин, А.Б. Биофизика 1. Теоретическая биофизика / А.Б. 
Рубин. – М.: Высш.школа, 1987.–319с. 
130.  Русин,  Г.Г.  Физико-химические  методы  анализа  в  агро-
химии / Г.Г. Русин. – М.: Агропромиздат, 1990.–С.142–148. 
131.  Самойлова,  Н.А.  Хитозансодержащий  гиполипидемиче-
ский энтеросорбент /Н.А. Самойлова, В.Е. Рыженков, И.Я. Ямчков // 
Материалы V конференции  «Новые  перспективы  в  исследовании 
хитина и хитозана».-М, 1999.- С. 191-193. 
132.  Самошин,  Н.М.  Исследование  свойств  иммобилизацион-
ной кислой протеазы / Н.М. Самошин, Л.Т. Мотина, Л.И. Ерещенко 
// Прикл.биохим. и микробиология. – 1978, №4.- С.554-557. 
133. Санитарные правила СП 1.2.2011.–94. Безопасность рабо-
ты с микроорганизмами I–II групп патогенности Госкомсанэпиднад-
зор России. – М.: 1994.-С.74–78. 
134. Сафронов, Т.М. Хитозан как флокулянт нативного рыбно-
го белка /Т.М. Сафронов, Т.М. Бойцова .- М., 1999.- С. 251-252. 
135. Свидетельство на полезную модель 8608 РФ, №98107798. 
Раневое  покрытие  «Хитоксин» /Б.А.  Никонов,  С.Ф.  Антонов,  А.И. 
Кобальтов и др. //Бюл.1998.-№12. 
136.  Сенюк,  О.Ф.  Использование  хитинового  препарата  «Ми-
котон»  в  качестве  радиопротектора / О.Ф.  Сенюк,  Л.Ф.  Горовой, 
И.А. Трутнева // Материалы  V конференции  «Новые перспективы в 
исследовании хитина и хитозана».- М, 1999.- С. 193-197. 

137.  Симонова,  Л.В.  Хитин  и  хитозан. / Л.В.  Симонова,  Л.К. 
Пашук // Косметика и медицина .- М,1998, №1. – С. 15-19. 
138.  Синицин,  А.П.  Зависимость  стабильности  иммобилизо-
ванной  глюкоамилазы  от  способа  иммобилизации / А.П.  Синицин, 
А.И.  Клибанов // Прикл.  биохим.  и  микробиология.-1978.-№2.-
С.236-242. 
139. Синтез и магнитные свойства наночастиц окислов железа 
в  матрице  поливинилового  спирта / А.В.Волков,  М.А.Москвина, 
А.Л.Волынский и др. //Химия высокоорганизованных  веществ и на-
учные  основы  нанотехнологии:  Автореф.  Докл. // Междунар.конф./ 
СПбГУ – СПб., 2001.–С.185–189. 
140.  Сорбенты  на  основе  силикагеля  в  радиохимии / 
Б.Н.Ласкорин, В.В.Стрелко, Д.Н.Стражеско, В.Н.Денисов. -М.: Атом-
издат, 1977.-304с. 
141. Способ получения фракции – 1 чумного микроба и анализ 
эффективности  отдельных  этапов  ее  приготовления    /Д.А.  Будыка, 
А.И.Тинккер,  Е.Л.  Ракитина,  Т.Н.Фунтикова,  М.Н.  Гончарова.- 
Ставрополь, 1988.- 13с.- Деп.о ВИНИТИ 12.08.88. №6548-888. 
142.  Сравнительное  изучение  методов  подготовки  проб  мате-
риала, содержащего бруцеллы, к проведению ПЦР–анализа /И.А Со-
колова, Г.И. Лямкаин, Я.Ф. Брюханов //Сборник науч. тр..- Саратов.-
2000.- Вып. 80. С. 148-151. 
143. Стрелко, В.В. Классификация реакций с участием поверх-
ности  дисперсных  кремнеземов  и  исследование  процессов, замеще-
ния  водорода,  связанного  с  поверхностными    атомами    кремния / 
В.В.  Стрелко,  В.А.  Каниболицкий    //  Коллоид.  журн.-1971.-Т.ЗЗЮ, 
5.- С. 750-756. 
 
 

144.  Сухоруков,  А.М.  Изучение  сорбционных  свойств  поли-
стироловых планшетов, используемых в иммуноферментном анали-
зе / А.М. Сухоруков, А.М.Пономарева // ЖМЭИ.- 1987.- №9.- С. 18-
22. 
145. Терещенко, В.Г. Применение фитохитодеза в кардиологи-
ческой  реанимации  /В.Г.  Терещенко // Материалы  научной  конфе-
ренции «Фитотерапия и лазеротерапия в ХХI веке».- Черноголовка, 
1999.- С.86-88. 
146. Тертых, В.А. Исследование взаимодействия γ - амиинопропил и 
β - цианэтилтриэтоксисиланов  с  поверхностью  аэросилов  методом 
ИК – спектроскопии /  В.А.  Тертых,  А.А.  Чуйко,  И.Е.  Неймарк // 
Теор. и эксперим. химия. – 1965. - №3. – С.400-405.  
147. Тертых, В.А. Синтез и исследование поверхности амино-
органокремнеземов / В.А. Тертых, А.А. Агзамходжаев, А.А. Чуйко // 
Изв. АН СССР  сер. химия. – 1968. №8. – С.1739-1743. 
148.  Тертых,  В.А.  Основные  закономерности  взаимодействия 
силанольных  групп  кремнезема  с  алкилхлорсиланами  ряда 
CInSI(CH3)4-n(0-4) / В.А. Тертых, В.В. Павлов, К.И. Ткаченко //  Теор. 
и экперим. химия. – 1975. – Т.11, №2. – С.174-181.   
149. Тертых, В.А.. О размещении структурных  гидроксильных 
групп    на  поверхности    аэросила / В.А.  Тертых,  В.В.  Павлов,  К.И. 
Тканенко // Теор. и   эксперим. химия.-1975.-Т.11, №3.- С.415-420. 
150. Титенко, М.М. Получения капсульного антигена из куль-
туральной  жидкости  изоэлектрической  преципитацией // М.М.  Ти-
тенко В.И. Вейнблат // Методическое  пособие по биохимии, генети-
ке  и  молекулярной  биологии  возбудителей  чумы,  и  псевдотуберку-
леза, Саратов.- 1985.- С. 8-9. 
151. Тривен, М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. – 
М:. Мир, 1983.– с.23. 

152. Тюменцева, И.С. Усовершенствование производственной 
схемы  иммунизации  животных  моно–  и  поликомпонентными  анти-
телами / И.С. Тюменцева, Е.В. Жданова, Е.Н. Афанасьев // Актуаль-
ные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболева-
ний:  Матер.межгос.научн.практич.конф.,  посвящен. 100-летию  от-
крытия возбуд.чумы.–Ставрополь, 1994.–С. 237–238. 
153. Тюменцева, И.С. Научно-методические основы конструи-
рования и усовершенствования производства диагностических тест-
систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфек-
ций // Автореф.  Дис. … д-ра  мед.  наук  /И.С.  Тюменцева .- Сара-
тов,1996.- 57С. 
154.  Тюменцева,  И.С.  К  вопросу  диагностики  возбудителя 
бруцеллеза / И.С. Тюменцева, Е.Н.Афанасьев, М.Н. Касторная // Эр-
дем   шиншилл бутэлл.- Уланбатор,1999.- №7 .- С. 229-231. 
155. Тюменцева, И.С. Синтез и исследования биосовместимых 
композиционных сорбентов для иммобилизации микроорганизмов / 
И.С.  Тюменцева,  Д.А.  Грядских // Повестка  дня  на  ХХI  век:  про-
грамма  действий  –экологическая  безопасность  и  устойчивое  разви-
тие: Мат.докл. Междунар.конф. - Ставрополь, 2002.- С.191. 
156.  Тюпенко,  Г.И.  Электрофорез  сульфата  хитозана  для  уст-
ранения  дефектов  слизистой  полости  рта  /Г.И.  Тюпенко,  И.Н.  Гор-
бачева, Е.Е. Скорикова // Материалы  VI Международной конферен-
ции  «Новые  перспективы  в  исследовании  хитина  и  хитозана».-  М, 
2001.- С. 238-241. 
157. Тюпенко, Г.М. Электрофорез хитозана при лечении забо-
леваний  пародонта  /Г.М.Тюпенко,  Е.Е.Скорикова,  А.Б.Зезин  // Но-
вые достижения в  исследовании хитина и хитозана: Матер. В Меж-
дунар.конференции.- Москва, 2001.–С.241–247. 
 

 
158.  Тютерев,  С.Л.  Научные  основы  использования  химиче-
ских  активаторов  болезнеустойчивости  в  защите  растений  от  пато-
генов  // Дис. … д-ра биол. наук / С.Л. Тютерев.- Пушкин, 2000.-С-
Пб.-394с. 
160. Умнова, Н.С. Приготовление иммунопероксидазных пре-
паратов  для  диагностики  особо  опасных  инфекций / Н.С.  Умнова, 
И.П. Павлова, Г.В. Михеева // Актуальные вопросы иммунодиагно-
стики  особо  опасных  инфекций:  Тез.  Докл.  Всесоюзной  конф.–
Ставрополь,1986.–4.2.–С.95–98. 
161. Фрайфельдер, Я. Физическая химия. /Я.Фрайфельдер.–М.: 
Мир, 1980. – 418 с. 
162.  Характеристика  препаратов  капсульного  антигена,  выде-
ленных  из  бульонной  культуры  штамма  Y.  pestis  EV  /  В.И.  Вейн-
блат, М.М. Титенко, М.С. Веренков и др., // ЖМЭИ.- 1985.- №4,- С. 
19-24. 
163.  Хитозан peros от  пищевой  добавки – к  лекарственному 
средству / Под ред. Р. Муцарелли.-  Нижний Новгород: Олигофарм, 
2001.- 370с. 
164.  Хлебников,  В.С.  Диагностические  препараты  на  основе 
моноклональных антител для иммуноферментативных тест-систем и 
люминесцентно-серологического  метода  определения  туляремийно-
го микроба / В.С. Хлебников, Г.В. Гречко, С.С. Ветчинин // Состоя-
ние  проблемы  и  перспективы  развития  диагностики  бактериальных 
инфекций: Мат.раб.соавторов. – Оболенск, 1990.–С. 66–67. 
 165. 
Ходж,  Ф.  Органические  реакции  с  использованием  реа-
гентов  или  субстратов,  ковалентно  закрепленных  на  функционали-
зированных неорганических носителях / Ф. Ходж // Журн. Всес. об-
ва им. Д.И.Менделеева. - 1989.- Т.34, №3.-С.ЗЗ 1-339. 

166. Чувствительность и специфичность твердофазного имму-
ноферментного  метода  с  использованием  моноклональных  антител 
для обнаружения фракции 1 чумного микроба / О.Н. Лопаткин, Н.Т. 
Лазарева,  Л.И.  Калмыкова,  О.В.  Малецкая // НИПЧИ,  Ставрополь, 
1985.–Деп.в ВИНИТИ. 19.08.85. –№4385.  
167.  Чуйко,  А.А.  Аминокремнеземы  как  химически  активные 
сорбенты и наполнители полимерных материалов / А.А. Чуйко, В.А. 
Тертых, Г.Е. Павлик // Коллоид. журн. – 1965. – Т.27, №6. – С.903-
907. 
168.  Шаханина,  К.Л.  Выбор  критериев  пригодности  твердо-
фазных  носителей  на  основе  полистирола  для  проведения  иммуно-
ферментного  анализа / К.Л. Шаханина, А.А.  Соколенко, И.П. Пав-
лова // ЖМЭИ.- №9.- 1987.-С. 8-11. 
169.  Эпидемиологическая  обстановка  по  чуме  в  мире,  СНГ  и 
России:  состояние,  тенденции,  прогноз / Г.Г.  Онищенко,  А.М.  Ко-
кушкин, О.И. Кедрова и др. // Проблемы сан-эпид. охраны террито-
рии  стран  Содружества  Независимых    Государств:  Тез.докл.  Меж-
дунар. науч.-практ. конф. (15-17 сентября,1998).- Саратов, 1998.- С. 
54-56. 
170. Янишпольский, В.В. Иммобилизация ферментов на акти-
вированных  аминокремнеземах / В.В.  Янишпольский,  В.А.  Тертых, 
А.А. Чуйко // Тез. 12 Укр. конф. по физ. химии.-Киев, 1977.- С.203. 
171. Anaokar,.S.Solid-phase enzyme immunoassay for serum fer-
reting / S. Anaokar, P.J. Sorry, J.C. Standefer  // Clin. Chem..-1979.-
V.25.-P.1426-1431. 
 
172. Aphanasev, E.N. Tne problems of brucellosis 
/E.N.Aphanasev, I.S. Tyumenzeva, M.N. Kastornaya // ЭРДЭМ  Шин-
жилгээний БYТЭЭЛ, 1999.- №7. -  РЮ229Ю. 

 173. Austin , P.R. Chitin: New Facts of Research / P.R. Austin, 
C.I.Brine, I.E. Castle, I.P.Zikakis // Science.-1981.-212.- Р. 719. 
174. Bascom, W.D. Hudrolisis of triethulethocsilans at the silica 
carbon tetrachloride interface / W.D. Bascom, R.V. Timols // I. Phus. 
chem.. – 1972.- V.76.- P.320 
 175. Boorsma D.M., Strefkert J.G. Peroxides on qlutaraldehyde 
for prospering peroxides conjugates / D. M. Boorma, J. G. Strefkert // J. 
immuonol. Methods.- 1979.- №30.- P. 245-255. 
176. Brine, C.G. Utilization of chitin a cellulose derivative from 
crab and shrimp waste / C.G. Brine, P.R. Austin // Delaware university 
project Report,1974.-№19.- Р. 12. 
 177. Burwell R.L. Modified silica gels adsorbents and cater list 
//Chem. Techkol.-1974.-V.15, №1.-P.370-377. 
 178. Carlsson, E. Enzyme linked immunosorbent assay for immu-
nological diagnosis of human tularemia  / E. Carlsson, A. Lindberg // J. 
Clin. Microbiol. – 1979.- v.10, №5.- P. 615-621. 
 179. Cavanaught, D.C. Fortier M.K., Robinson D.M. Application 
of the ELISA technique to problem in the serologic diagnosis plaque  / 
D.C. Cavanaught, M.K. Fortier, D.M. Robinson // Bull. Penam. Health. 
Org., 1979.-v.13, №4.- P. 399-402. 
180.Chomel, B.V. Chanqibq trends in the epidemiology of human 
brucellosis in California from 1973 to 1992: a shift toward food borne 
transmission B.V. Chomel, E.E. De Bess, D.M Mabqiameie // J.Infect. 
Dis.-1994. – V.170 (5).-P.1216-1223. 
181. Clark M.F.  Characteristics of the micro plate method of en-
zyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus / M. F. 
Clark, A.N. Adams //J.Qen. Virol. – 1977/-V.36, №3.- P.475-483.  
182. Comparison of an enzyme -  linked immunosorben assay 
ELISA with a radioimmunoassay (RIA) for the measurement of ratiusulin   

/ H. Webster, L.Bone Adrian, A. Katherine  Webster, J.Terence Wilkin // 
J. Jmmunal. Method.- 1990.-v.134, 1.- P.25-100.  
183. Dion, Le Doan. Research on Using Chitosan for Storage of 
Oranges in Vietnam / Le Doan  Dien, Tran Quang Binh //Second Asia  
Pacific Chitin Symposium.- Bangkok, 1996.- P. 200-203. 
184. Domard, A. Some Physicochemical and Structure Basis  for  
Applicability of chitin and chitosan /A. Domard // Second Aside Pacific 
chitin Symposium.- Bangkok, 1966.- P. 1-12. 
 185. Ernst, E. Chitosan as treatment for body weight reduction. A 
meta-analysis / E. Ernst, M.H. Pittler // Perfusion.- 1998, №11.-  З.-  Р. 
461-465. 
 186. Felit, O. Chitosan: A unique Polysaccharide for Drug Deliv-
ery / O. Felit, P. Buri, R. Gumy // Drug Development and Industrial 
pharmacy.- 1998, №24.-P. 979-993. 
187. Filar, Y. Bulk and Solution Properties of chitin Specific en-
zyme-linked immunosorbent / Y. Filar, M.C. Winick, A. Freeman // 
I.Biotechnol. Biunq.- 1981, V.23.- Р.31-33. 
 188.  Hertl, W. Mechanism of Gaseous Silo sane Reaction willies 
/  W. Hertl // I.Rhus.Chem. – 1968. – V. 72. – P. 3993-3997.  
 189. Jirgensons, B. Organic Coloids / B. Jirgensons.- Austin: Uni-
versity of Texas. Princeton: Elsevier publishing company, 1958, 422 p. 
190. Kato K., Hamguchi Y., Fukui H. Enzyme - linked immuno-
assay, 1. Novel method for synthesis of the insulin-D-glycosidase conju-
gate and its applicability for insulin assay // J.Biochem.-1975.-V.78.-
P.235-237. 
 191. Konig H.J., Voв H. Vertahren zur Herstelling con mecha-
nisch stobilen enzymhaltigen Immobilisation. Pat. 282923. GDR, MKU 
540.-P.12.-N 11/04 /Tschistowkaya/. Martin – Luther-Univer-sitet Halle 
– Wittenbery. – N3281731. – 1990. 

 192. Kumar, G. Enzymatic Grafting of a Natural Product to chito-
san to confer water solubility under basis conditions / G. Kumar, P. 
Smith, G.F. Payne//Biotechnology and Bioengineering, 1999.- v.63, №2.-
P. 154-164. 
193. Lim, L.Y. Effects of dry heft and saturated steam on the 
phased properties chitosan / L.Y. Lim, Khor, C.E. Ling // Journal Bio-
medical Materialists Research, 1999.- v. 48. №2.- P. 111-116. 
 194. Methods in enzymology / P.Z. Masson, C.Z. Cambiaso, D. 
Collet-Cassat,C.G. Magmisson   et al  //Academix Press Ing.New-York., 
USA.-1981.-V.74.-P.106-139. 
 195. Mayer, S.P. Chitosan as Prolog in the waste water treatment / 
S.P. Mayer // Agriculture, Food, Chemistry.- 1989, №5. 
  196. Monson, P. Optimization of glutaraedehude activation of a 
support for enzyme   immobilization / P. Monson // I.Mol. Catal. – 1978.-
V.З, №5.-Р.371-384. 
 197. Naitu, J. Industrial applications of immobilized microbial 
cells / J. Naitu // World Biotech. Rept.,Proc. Conf.-London, New –York, 
1987.-v.1,Pt.3.-P.93-101. 
198. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody – a new method of 
conjugation /P.K. Nakane, A. Kawaoi // J.Histochem. Cytochem.-1974.-
V.22. №4-P.506-506. 
199.Ouchterlony,  О. Antiqen-antiboqy reactions in qtb./ 
O.Onchterlony //  Aktiv. For. Kemi. Mineral o Qeol.- 1949.-v.261.-№14.-
P.1-9. 
 200. Oqawa K. X-Rjy diffraction study of sulfuric, nitric and 
halogen and salts of chitosan /K.Oqawa, 8. Ibukai // Carbohyar. Res.-
1987.-V.160.- P. 425-433. 

201. Patent 4241176 (USA)-23/12. Avrameas S.M., Gutsdon J.L. 
Magnetic del suitable to immunoenzimatic determination  / S.M 
Avrameas., J.L Gutsdon //In.CL. C 1201/66, CO7 G7/00 – 1980 
202. Patent E.P. №460774. Manufacture of wound dressings from 
microfungal fibers / B. Sagan, P. Mamlyn, D. Wales.-1991. 
203. Polson, A. The fractionation of protein mixtures hay linear 
polymers of bight molecular weight /A. Polson, O.M. Potgieter, I.E. Lar-
gier //Biochem. Biopsies. Acta.-1984.-V.82. 
204. Qold, P. Demonstration of tumor-specific antigens in human 
colonic carcinoma by immunological / P. Qold, S.O. Freedmmam // 
I.Exp.Ved.-1965.V.121.- P.439. 
 205. Rees D.A., Morris E.A. In: The Polysaccharides. / D.A. Rees, 
E.A. Morris Academies Press, New- York and London, 1982.-v.1.-221p. 
  206. Robinson, P.I. Porous glass a solid support for immobiliza-
tion of finite chromatography of inhumes, Biochim, et biochips / P.I. 
Robinson,  P. Dunmill, M.D. Lillu // Acta. – 1971. – V. 242. – Р.659-661.  
 207. Soto-Peralta, N.V. Effects of Treatments on the clarity and 
colon of Apple Juice / N.V. Soto-Peralta  // Journal of Food Science, 
1989.- v. 54, №2.- З.- P. 495-496. 
 208. Stahe, S.P. Diagnosis of human brucellosis with ELISA / S.P. 
Stahe, A. Marmonior, M.I. Micoud //Lancet.-1982.V.11, N8299.-P.669. 
 209. Stavitsky,A.B. Haemagglutination and haemagglutination in-
hibition reactions with tannic acid – and vis-diazotired benzidin-
hroteiconjugated erythrocytes // IN: Immunological methods.- ED.Acrord 
J.F.- Oxford.- 1964. 
210. Sting R., Ortmann G. Erfahrungen mitt einfachen ELISA – 
Test-systemes  fur die Brucellose – Serologie bei Rind, Schaf und Ziege 
//Berlin. Und munch. Wochenschr.-2000.-Vol.113.-N1.P.22-28. 

  
211. Studies on immunization against plague. The isolation and 
characterization of the Soluble antigen of Pasteur Ella pestis / E.E.Baker, 
Y. Sommer, L.E. Foster., et al //I.Immunl.- 1952.- v.68, №2.- P. 131-145. 
 212. Tabatabai, L.B. Specific enzyme-linked immunosorbent as-
say for detection of bovine antibody to Brucella abortus / L.B.Tabatabai, 
B.L. Deyoe //J.Clin. Microbiol.-1984.-V.20, №2.-P.209-213. 
213. Wand H.Y. Hettwer D.I. Methods in enzymoloqu. / H.Y. 
Wand, D.I.Hettwer //.Biotehnol. Bioenq,1982.- V.24.—P.45-48. 
 214. Warburg, O. Isolierung and Krystallization des Garugster-
ments Enlase / O. Warburg, W.I. Christian // Biochem. J. – 1941.- v.310.- 
P. 1120-1122. 
215. Weller, T.H. Fluorescent antibody studies with agents of vari-
cella and herpes zoster propagated in vitro / T.H. Weller, A.H. Coons // 
Proc. Soc. Exp. Biol.-1954.-. v.86. – P. 789-794. 
216. Werblin, T.P. Studies on the control of antibody synthesis III. 
Changes is heterogeneity of antibody affinity during the congress of the 
immune response / T.P. Werblin, Tai Kim Young, G.W. Siskind 
//I.Immunoboqy.–1973.-v.24.-P.477. 
 
217. Yackman, R. Light-scattering and infrared spectro-
pha.tometric studies of chitin and   chitin derivatives / R. Yackman, M. 
Goldberg // Carbohyd. Res.-№38.-1974.-P. 35-45. 
 218. Yamamoto A. Conformational behavior of chitosan in the 
acetate salt: A varies study /A.Yomamoto. I.Kawada, T. Yui K. Oqawa // 
Biopsies. Biotech. Biochem.–1997. V.61.-P.1230-1232. 
 




 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

50382. Диск Максвелла. Учебно-методическая разработка 358 KB
  Диск Максвелла представляет собой достаточно массивный диск, насаженный на ось небольшого радиуса . На ось симметрично наматываются две нити. Если диск отпустить он начнет попеременно двигаться вверх-вниз, совершая своеобразные колебания — отсюда и его второе название: маятник Максвелла.
50384. Алжирская Народная Демократическая Республика — АНДР 219.5 KB
  Каменные орудия эпохи нижнего и среднего палеолита, найденные на территории Алжира, свидетельствуют о жизни здесь первобытных людей 300—400 тыс. лет назад.
50385. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СКОРОСТИ ПУЛИ ПРИ ПОМОЩИ КРУТИЛЬНОГО БАЛЛИСТИЧЕСКОГО МАЯТНИКА 196 KB
  Цель работы: Изучение основ теории погрешностей и методов обработки экспериментальных результатов. Определение кинематических характеристик по стробоскопическим фото. Приборы и принадлежности: стробоскопические фотографии, линейка, карандаш.
50388. Изучение теории погрешностей и кинематики материальной точки 188.5 KB
  Изучение теории погрешностей и кинематики материальной точки. Определение кинематических характеристик точки по стробоскопическим фотографиям. Ход работы: Задание 1: Найти кинематический закон движения точки. Спроецируем точки на координатные оси с учётом масштаба и запишем координаты точки в таблицу считая что фотографирование началось в момент времени t=0.
50390. Изучение основ теории погрешностей и методов обработки экспериментальных результатов. Определение кинематических характеристик по стробоскопическим фотографиям 1.07 MB
  Экспериментальные точки не должны сливаться друг с другом; Масштабы вдоль всей оси следует выбирать так чтобы основная часть графика имела наклон близкий к углу 45 и лежала в средней части между осями. Построение графиков: на график наносятся все полученные точки через точки проводится наилучшая плавная кривая. Найти модуль скорости точки в середине интервала наблюдения и углы составляемые вектором скорости с осями координат в этот момент времени. Найти ускорение точки в тот же момент времени Изобразить вектор ускорения.