1780

Совершенствование экспрессных методов индикации микобактерий туберкулеза

Диссертация

Биология и генетика

Анализ эпидемиологической обстановки по туберкулёзу и современного состояния экспресс-диагностики его возбудителя. Носители иммобилизованных систем твёрдофазного иммуноанализа. Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов. Характеристика реагентов, используемых для получения магноиммуносорбентов. Биотехнология изготовления латексного диагностикума.

Русский

2013-01-06

1.36 MB

30 чел.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ 
 
Ставропольский 
научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы 
по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 
 
ФГУЗ СтавНИПЧИ  Роспотребнадзора 
 
На правах рукописи 
 
 
ЕФРЕМЕНКО Дмитрий Витальевич 
 
Совершенствование экспрессных методов индикации 
микобактерий туберкулеза 
 
 

03.00.23 –  биотехнология 
03.00.07 - микробиология 
 
                   Диссертация на соискание ученой степени  
 кандидата медицинских  наук 
 
 
 
 
 
 
                                                                   Научный  руководитель: 
                                                                   доктор биологических наук,                               
                                                                   И.В. Жарникова  
                                                                   Научный  консультант: 
                                                                   доктор медицинских наук, 
                                                                   Д.А. Будыка             
 

Ставрополь – 2005 

 
2
ОГЛАВЛЕНИЕ 
         Стр. 
                          
 
  ВВЕДЕНИЕ   

 ГЛАВА 1. Анализ  эпидемиологической обстановки по туберкулё-  
 
зу и современного состояния экспресс-диагностики его возбудите-
 
ля (обзор литературы) 
14 
 
1.1. Эпидемиологическая обстановка по туберкулезу в России. 
14 
1.2.  Анализ  современного  состояния  конструирования  диагностиче-
 
 
ских препаратов и  индикации  возбудителя туберкулеза. 
22 
 
1.3. Носители  иммобилизованных систем  твёрдофазного иммуноана-
 
лиза 
39 
  
 
СОБСТВЕННЫЕ  ИССЛЕДОВАНИЯ 
 
 
ГЛАВА 2. Материалы и методы 
48 
2.1.  Штаммы микроорганизмов, взятые в работу 
48 
2.2.  Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов  
48 
 
2.3.  Объекты исследования 
54 
 
2.4. Получение антигенных комплексов микроорганизмов 
54 
2.5.  Лабораторные животные, использованные в экспериментах  
 
54 
2.6.  Методы иммунизации животных 
55 
 
2.7.  Методы контроля антигенов и сывороток                   
55 
 
2.8.  Выделение иммуноглобулинов  
55 
 
2.9. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов 
56 
 
2.10. Получение и контроль липосом 
56 
2.11. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов  
 
56 
2.12. Физико-химические методы 
 
56 
2.13. Иммунохимические методы анализа 
57 
2.14. Лиофилизация биологического материала 
57 

 
3
2.15.  Характеристика  реагентов,  используемых  для  получения  магно-
58 
иммуносорбентов 
 
2.16. Методы математической и статистической обработки материалов 
58 
 
ГЛАВА 3.  Получение  высокоактивного  специфического биологи-
 
 
ческого сырья (антигенов и антител) для конструирования диагно-
 
 
стических препаратов 
59 
 
3.1. Получение антигенных комплексов микобактерий туберкулёза 
59 
3.2. Получение специфической туберкулёзной сыворотки 
 
64 
ГЛАВА 4. Получение  иммуноферментных  препаратов  для 
 
 
экспресс-диагностики туберкулёза    
76 
 
4.1.  Получение иммунопероксидазного конъюгата 
76 
4.2.
 
  Получение  липосом  и  липосомально-иммунопероксидазного 
 
конъюгата 
 
81 
ГЛАВА 5. Получение  туберкулёзных  суспензионных  диагности-
 
 
кумов 
91 
 
5.1. Биотехнология изготовления латексного диагностикума 
91 
 
5.2.  Разработка  биотехнологии  получения  алюмосиликатного  диагно-
 
 
стикума 
94 
 
ГЛАВА 6Конструирование магнитоуправляемых иммуносорбен-
 
тов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза 
 
100 
6.1. Разработка метода  селективного  концентрирования возбудителя 
 
 
туберкулёза  на    магноиммуносорбенте  с  последующей  постановкой 
 
 
иммуноферментного анализа.      
100 
 
6.2. Разработка метода  селективного  концентрирования возбудителя 
 
 
туберкулёза  на  магноиммуносорбенте  с  последующей  постановкой 
 
 
количественного иммунофлуоресцентного анализа  
111 
 
ГЛАВА 7.  Изучение  диагностической  ценности  разработанных 
 
диагностикумов  и  тест-систем  для  выявления  антигена 
 
 
 
 

 
4
возбудителя туберкулеза      
 
 
 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 
118 
 
 ВЫВОДЫ 
128 
 
 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 
148 
 
 
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ  
149 
 
ПРИЛОЖЕНИЯ 
151 
 
 
 
 
 
 

 
5
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, 
СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ 
Аг                 - антиген 
АТ                - антитело 
г                   - грамм 
БСА             -бычий сывороточный альбумин      
ИФА            - иммуноферментный анализ 
КББ              - карбонат-бикарбонатный буфер 
КИФА         - количественный иммунофлуоресцентный анализ 
КМИС         - композиционные магноиммуносорбенты 
к.р.с.            – крупный рогатый скот 
ЛПС            - липополисахарид 
мг                - миллиграмм 
МИБП         - медицинские иммунобиологические препараты 
мин              - минута 
МИС            - магноиммуносорбент 
м.к.               – микробные клетки 
мкг               - микрограмм 
мкл               - микролитр 
мкм              - микрометр 
мл                - миллилитр 
МС               - магносорбент 
МТБ             - микобактерии туберкулёза 
нм                 - нанометр 
НТМ             - нетуберкулёзные микобактерии 
НРИФ          - непрямая реакция иммунофлуоресценции 
ООИ            - особо опасные инфекции 
ПААГ          - полиакриламидный гель 
ПАФ            - полный адъювант Фрейнда 

 
6
ПЦР               - полимеразная цепная реакция 
ПЭГ               - полиэтиленгликоль 
РА                  - реакция агглютинации 
РАЛ               - реакция агглютинации латекса 
РИА               - радиоиммунологический анализ 
РИД               - реакция иммунодиффузии 
РИФ               - реакция иммунофлуоресценции 
рН                   - отрицательный логарифм концентрации водородных ионов   
РНГА              - реакция непрямой гемагглютинации 
РТПГА           - реакция торможения пассивной гемагглютинации 
РСА                - реакция суспензионной агглютинации 
сек                   - секунда 
СтавНИПЧИ - Ставропольский  научно-иследовательский  противочумный             
институт 
сут                    - сутки 
0С                     - градус Цельсия 
ТБ                     - туберкулёз 
ТИФМ              - твердофазный иммуноферментный метод 
тыс.                  - тысяча 
ФИТЦ              - флуоресцеинизотиоцианат 
ФСБ                 - фосфатно-солевой буфер 
ч                       - час 
ЭДТА                  -  этилендиамин-N,N,N,N-тетрауксусной  кислоты  динатриевая             
соль 
 
 
 
 

 
7
ВВЕДЕНИЕ 
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ 
Анализ  сложившейся  эпидемиологической  ситуации  показывает,  что 
заболеваемость  туберкулёзом  в  нашей  стране  носит  характер  эпидемии 
(Онищенко  Г.Г., 2002; Пунга  В.В.,  Капков  Л.П., 1999). По  данным  Всемир-
ной  Организации  Здравоохранения  (ВОЗ)  в  промежутке  времени  с 2000 по 
2020 гг. туберкулёзом в мире заболеют около 200 млн. человек, умрут около 
35  млн.  человек,  будут  инфицированы  приблизительно 1 млрд.  человек 
(WHO Fact Sheet, 2000).  В связи с этим, одной из важных задач мировой ме-
дицины  является  разработка  надёжных  (активных  и  специфических),  про-
стых в использовании и дешёвых средств для быстрого выявления возбуди-
теля в исследуемом материале. 
В нашей стране при диагностике туберкулёза большое внимание уделя-
ется  культуральным  методам, за рубежом – микроскопии мазка. Но оба эти 
метода имеют существенные недостатки. Культивирование с момента посева 
составляет  три  месяца,  причём  положительных  результатов- 0,5-14 % (Кли-
менко  М.Т.  с  соавт, 1985; Клименко  М.Т.  с  соавт., 1987; Литвинов  В.И., 
1996).  При  микроскопии  мазка  (флуоресцентной)  наблюдается  до 14 % по-
ложительных результатов (Канюк А.Н., 1995). Таким образом, данные мето-
ды не могут претендовать на роль основных в лабораторной диагностике ту-
беркулёза.  Известны  способы  диагностики  туберкулёза  с  помощью  эритро-
цитарных диагностикумов  (Архангельский Н.И. с соавт., 1985), реакции аг-
регатагглютинации  (Хоменко  А.Г.  с  соавт,1992),  реакции  агглютинации  ла-
текса, масс-спектроскопии (Маякова Т.И. с соавт., 1995), но данные методы 
трудоёмки и малоактивны. Существуют препараты для ПЦР-диагностики, но 
они отличаются значительной дороговизной и сложностью исполнения и по-
этому распространения ещё не получили. В связи с этим, актуальным являет-
ся  разработка  диагностических  препаратов  и  методов  исследований,  обла-

 
8
дающих  высокой  специфической  активностью,  экспрессностью  и  информа-
тивностью. 
ЦЕЛЬ И ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 
Цель исследования
 совершенствование    биотехнологий    иммунобиологических  препара-
тов для экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза. 
Основные задачи исследования: 
-  отработать  методические  подходы  по  извлечению  полноценных  антиген-
ных комплексов из микробных биомасс возбудителя туберкулёза и получить 
высокоактивные иммунные туберкулёзные сыворотки;  
-  разработать магнитные сорбенты с фиксированными на их поверхности ан-
тигенами  гетерологичных  штаммов  для  удаления  из  туберкулёзных  иммун-
ных сывороток неспецифических антител; 
-  отработать  биотехнологию  изготовления  высокочувствительных  и  ста-
бильных туберкулёзных липосомально-иммунопероксидазных конъюгатов; 
-  разработать  эффективные  способы  получения  суспензионных  диагности-
кумов  на  основе  полиакролеиновой  (латексной)  и  алюмосиликатной  матриц 
для реакций агглютинации; 
-  отработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами 
для  диагностики  туберкулёза  в  экспрессных  методах  (иммуноферментном 
анализе - ИФА, количественном иммунофлуоресцентном  анализе - КИФА); 
-  определить  диагностическую  ценность  применения  разработанных  имму-
нобиологических препаратов на экспериментальном и клиническом материа-
ле. 
Научная новизна работы. 
Полученные  в  результате  исследований  данные  представляют  интерес 
с точки зрения поиска путей извлечения полноценных специфических водо-
растворимых антигенных комплексов из микобактерий туберкулёза. 

 
9
Разработан  и  применён  аффинный  магносорбент  при  проведении  им-
муносорбции гетерологичных антител из иммунных туберкулёзных сыворо-
ток,  позволяющий  получать  специфичный  препарат  с  сохранением  его  пер-
воначальной активности, ускорять и упрощать процесс сорбции.   
Впервые  осуществлена  научно-методическая  разработка  биотехноло-
гии производства  липосомальных туберкулёзных иммуноферментных конъ-
югатов, обладающих высокой чувствительностью и стабильностью. 
Разработаны    приёмы  по  предварительному  селективному  концентри-
рованию микобактерий туберкулёза и их антигенов на магноиммуносорбен-
тах  (МИС)  с  последующим  проведением  экспрессных  методов  (ИФА,  КИ-
ФА),  позволяющие  исследовать  объекты  внешней  среды,  материал  от  боль-
ных людей или животных, в том числе и сильно загрязненные, неограничен-
ного объёма пробы с  низкой концентрацией микобактерий с чувствительно-
стью,  в 1000 и более раз превышающей общепринятые экспрессные методы. 
Приоритетность  ряда  выполненных  исследований  подтверждена 2 па-
тентами РФ на изобретения: № 2192265 «Способ получения комплекса фос-
фолипидов» (2002 г.)  и  № 2195296 «Способ  получения  ганглиозидов»     
(2002 г.).  
Теоретическая  и  практическая  значимость  работы.  Основ-
ная теоретическая значимость проделанной работы заключается в определе-
нии  научно-методических  аспектов  разработки    иммунобиологических  пре-
паратов  для  экспресс-диагностики  микобактерий  туберкулёза,  которые  учи-
тывают  характерные  особенности  антигенной  структуры  микобактерий, 
свойства матриц биотической (липиды) и абиотической (органокремнезёмы, 
латексы)  природы, методы конъюгации лигандов и маркёров, определяя на-
правления последовательных стадий и операций биотехнологии производст-
ва диагностических туберкулёзных препаратов. 
Разработаны научно-методические приёмы по получению полноценно-
го  антигенного  материала  из  бакмасс  микобактерий,  высокоактивных  им-

 
10
мунных  сывороток,  удалению  из  них  перекрёстно  реагирующих  антител  с 
помощью  магнитных  сорбентов.  Оптимизация  параметров  иммобилизации 
антител  обеспечила  конструирование  высокоактивных  и  специфических  ди-
агностических препаратов (иммуноферментных, суспензионных латексных и 
алюмосиликатных для реакции агглютинации, магноиммуносорбентных). 
Разработанные методические подходы по ковалентной фиксации на по-
верхности  мембраны  липосом  ферментов  и  иммуноглобулинов  позволили 
повысить стабильность и увеличить срок годности диагностической системы 
без потери активности с сохранением каталитических свойств. 
Cконструированные туберкулёзные магноиммуносорбенты в сочетании 
с  экспрессными  методами  диагностики  повышают  их  чувствительность  до 
50-100 микробных клеток в пробе, одновременно сокращая время проведения 
анализа до 1-1,5 часов за счёт селективного концентрирования на  своей по-
верхности микобактерий, ускорения манипуляций и исключения ряда этапов 
в ходе анализов.  
Результаты проведённых исследований по сочетанным методам магно-
иммуносорбции с экспрессными анализами и использование липосомальных 
препаратов дополняют новыми научными данными  сведения о возможности 
использования  иммобилизованных  систем,  способствующих  стабильности,  
увеличению чувствительности методов и проведению эффективной детекции 
микобактерий туберкулёза. 
Материалы научных разработок легли в основу двух методических ре-
комендаций:  «Иммобилизация  в  липосомы  веществ  различной  химической 
природы.  Стерилизация  и  стабилизация  липосом»,  утвержденных  Главным 
Государственным санитарным врачом России Г.Г. Онищенко 06.04.2000 г., и 
«Применение магноиммуносорбентов для выявления микобактерий туберку-
лёза»,  утверждённых  директором  СтавНИПЧИ  (протокол  Учёного  Совета 
СтавНИПЧИ №3 от 3.03.2005 г.).  

 
11
На Федеральном уровне утверждены зам. главного санитарного врача 
РФ Е.Н. Беляевым технические условия (ТУ) 9154-00-01897080-2004 на фос-
фолипиды для получения липосом (письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 
г.). На учрежденческом уровне утверждены два регламента: на липосомаль-
ную основу для получения диагностических, лекарственных и косметических 
препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.2004 г.) и на 
тест-систему  липосомально - иммунопероксидазную  магноиммуносорбент-
ную для  выявления антигена туберкулёза  иммуноферментным методом, ут-
верждённую  директором  СтавНИПЧИ  (протокол  Учёного  Совета            
СтавНИПЧИ  №  3 от 3.03.2005 г.). 
Материалы диссертации используются в лекциях и практических заня-
тиях на курсах  первичной  специализации врачей по особо опасным инфек-
циям при СтавНИПЧИ по экспресс-диагностике туберкулёза  и применению 
магноиммуносорбентных препаратов в  мониторинге микобактерий. 
Основные положения, выносимые на защиту. 
1. Научно-методические  подходы  к  получению  высококачественного  биоло-
гического  сырья  (антигенов  и  антител)  для  производства  диагностических 
туберкулёзных  препаратов.  Получены  водорастворимые  антигены  микобак-
терий, содержащие полный набор антигенных комплексов с высокой актив-
ностью (1:32-1:64 в  реакции  иммунодиффузии  (РИД).  Подобрана  производ-
ственная схема для получения иммунных сывороток с высокими титрами ан-
тител,  основанная  на  оптимальной  комбинации  комплекса  специфических 
антигенов и иммуномодуляторов.  
2. Методические приёмы конструирования и применения аффинных сорбен-
тов  с  магнитными  свойствами  при  проведении  иммуносорбции  неспецифи-
ческих антител из иммунных туберкулёзных сывороток.  Разработанные сор-
бенты с иммобилизованными гетерологичными антигенами и метод сорбции 
позволили за один этап получить не только высокоспецифичную сыворотку, 
но и сохранить её первоначальную серологическую активность. 

 
12
3. Научно-методические основы изготовления липосомально - иммуноперок-
сидазного конъюгата для  выявления антигена туберкулёза  иммунофермент-
ным методом. Иммобилизованные на мембране липосом фермент и туберку-
лёзные  иммуноглобулины  повышают  свою  стабильность,  что  приводит  к 
увеличению срока годности диагностической системы. 
4. Биотехнология   производства суспензионных латексных и алюмосиликат-
ных диагностикумов, обеспечивающая высокую эффективность обнаружения 
микобактерий  туберкулёза  в  экспериментальных  и  клинических  условиях. 
Разработанные  препараты  по  чувствительности  аналогичны    традиционным 
методам, но превосходят их по простоте изготовления и экспрессности (по-
становка  и  учёт  результатов  реакции  с  алюмосиликатным  диагностикумом    
1 - 3 мин). 
5. Научно-методические  основы  биотехнологии  изготовления  твёрдофазных 
микрогранулированных  аффинных  магноиммуносорбентов  для  избиратель-
ного концентрирования микобактерий и их использования в экспрессных ме-
тодах  (ИФА, КИФА). Разработанные препараты позволяют повысить чувст-
вительность  более  чем  в 1000 раз  при  увеличении  вероятности  выявления 
микобактерий за счёт селективного концентрирования антигена на антителе, 
находящемся на твёрдой матрице. 
Апробация работы. 
 Основные результаты диссертационной работы были  представлены на 
Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробио-
логия XXI века» (Саратов, 28-30 сентября 2004); 1-й  Всероссийской  конфе-
ренции  «Медицинские  иммунобиологические  препараты  для  профилактики, 
диагностики  и  лечения  актуальных  инфекций» (Москва, 10-11 октября, 
2004); региональном обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитоло-
гов (Ставрополь, 17 февраля 2005); научно-практической конференции «Ак-
туальные  вопросы  эпид.надзора  за  природно-очаговыми    и  особо  опасными 
инфекциями  в  регионе  Северного  Кавказа» (Ставрополь, 14 – 16 апреля 

 
13
2005),  на VI Межгосударственной  научно-практической  конференции  госу-
дарств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участни-
ков содружества независимых государств: проблемы биологической безопас-
ности  и  противодействия  биотерроризму  в  современных  условиях» (Волго-
град, 2005). 
Публикации. 
Основное содержание диссертации отражено в 10 опубликованных на-
учных работах (2 патента на изобретение, 1 депонированная работа и 7 тру-
дов в научных сборниках).  
Структура и объём работы. 
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собствен-
ных  исследований,  заключения,  выводов,  практических  рекомендаций,  спи-
ска использованной литературы и приложений. Она изложена на 178 страни-
цах, содержит  18 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает  178 
отечественных  и 99  зарубежных  литературных источников. 
 

 
14
ГЛАВА 1. Анализ  эпидемиологической обстановки по туберкулёзу и со-
временного  состояния  экспресс-диагностики  его  возбудителя  (обзор  ли-
тературы) 
1.1.  Эпидемиологическая обстановка по туберкулезу в России. 
Правительство РФ утвердило Перечень социально значимых и опасных 
для окружающих заболеваний. К первой группе отнесён туберкулёз наряду с 
такими заболеваниями как гепатит В, С, СПИД и некоторые другие (Алексе-
ев П., 2004). В целях законодательного регулирования мероприятий по борь-
бе с инфекционными заболеваниями в 2001 г. принят Федеральный закон «О 
предупреждении  распространения  туберкулёза  в  РФ».  Эпидемиологическая 
обстановка  по  туберкулёзу  остаётся  напряжённой.  Туберкулёз – одна  из 
главных причин высокой заболеваемости, хронизации и смертности, особен-
но в развивающихся странах (Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В., 
2003; Murray C.J.L, Styblo K, Rouillon A. ,1990; Sudre P, Ten Dam H.G, Kochi 
A.,1992). В соответствии с данными ООН, 1/3 населения инфицирована МТБ 
(микобактериями  туберкулёза),  каждый  год  выявляется 8 млн.  случаев  ак-
тивного  туберкулёзного  (ТБ)  процесса,  ведущего  к  смертности 3 млн.  чело-
век (Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi A. ,1994). В России в 2004 г. зарегистри-
ровано около 102,9 тыс. больных с установленным впервые активным тубер-
кулёзом.  Показатель  заболеваемости – 71,7 на 100 тыс.  населения.  По  срав-
нению с 2003 г. отмечается рост заболеваемости на 3,3 %  (Ильин И.А., 2005).  
Туберкулёз человека вызывается чаще всего МТБ  (более 90 % случаев 
туберкулёзной  инфекции).  Род Mycobacterium включает  более 50 видов  и 
подвидов  микобактерий  –  патогенных   (M. bovis,   M. avium,     M. kansasii   
 (фотохромогенные), М. intracellulare (нефотохромогенные) и некоторые дру-
гие), условно патогенных и сапрофитов, широко распространенных в приро-
де. Не менее 25 из  них играют важную роль в патологии человека, являясь 
возбудителями  туберкулёза,  микобактериозов  (нетуберкулёзных  кислото-
устойчивых    микобактерий),   проказы   (Борисов Л.Б.,   2002). Кроме этого 

 
15
известны кислотоустойчивые сапрофиты, не вызывающие заболевания чело-
века.  К  нетуберкулёзным  микобактериям  (НТМ)  относится  и  язва  Бурули 
(ЯБ), вызываемая M. ulcerans. До сих пор как эпидемиология ЯБ изучена не-
достаточно,  так  и  резервуары  и  способы  передачи  данного  заболевания.  В 
природе  свободно  живущие  фагоцитирующие  простейшие  играют  важную 
роль  как  возможные  естественные  хозяева  и  резервуары  для  микобактерий, 
включая M. ulcerans, что необходимо также  учитывать. В 1999 впервые за-
подозрили водяное насекомое (Hemiptera)  как пассивный резервуар возбуди-
теля ЯБ. Эта находка позволила предполагать возможную роль насекомых в 
передаче НТМ от животных к человеку (Portaels F., 2003). 
Географические  и  климатические  изменения  могут  оказывать  влияние 
на  эпидемиологию  НТМ. F.Portaels (2003) продемонстрировал  положитель-
ную связь между ПЦР(+) образцами из окружающей среды и частотой ЯБ на 
соответствующей  территории.  Пространственно-временные  исследования 
окружающей среды важны и могут иметь ценность при выявлении возбуди-
теля ЯБ и НТМ у человека и животных. Микроскопически они неотличимы 
от Mуcobacterium tuberculosis.  
Патогенность  туберкулёзных  микобактерий  связана  с  прямым  или 
иммунологически  опосредованным  повреждающим  действием  липидов.  Их 
действие выражается в развитии специфических гранулём и поражении тка-
ней.  Для  вирулентных  штаммов  характерно  наличие  так  называемого  корд-
фактора- гликолипида, состоящего из трегалозы и димиколата. Он разрушает 
митохондрии клеток инфицированного организма, тем самым нарушая функ-
цию дыхания. Патогенные для людей возбудители могут вызывать местные и 
генерализованные  туберкулёзоподобные  процессы.  Частота  выделения  и 
этиологическое значение указанных микобактерий зависит от их распростра-
ненности  и  состояния  антиинфекционной  защиты  макроорганизма.  Среди 
клинических  форм  могут  быть:  лёгочные  поражения,  инфицирование  ран, 
поражение кожи, подкожной клетчатки, лимфатических узлов, костей, суста-

 
16
вов, почек, а также системные инфекции (Воробьёв А.А.,  Кривошеин  Ю.С., 
Широбоков В.П., 2003).  Весьма сходными с микобактериями туберкулёза по 
морфологии  и  антигенному  составу  являются  микроорганизмы  рода 
Nocardia. Различные виды нокардий обладают разной степенью патогенности 
для человека и животных. Больные нокардиозом незаразны для окружающих. 
В России описаны единичные случаи заболевания. В основном нокардиоз ре-
гистрируется  в  странах  тропического  и  субтропического  поясов  (Коротяев 
А.И., Бабичев С.А., 2002). Палочки BCG, используемые в качестве вакцины 
при  туберкулёзе,  имеют  сходные  свойства  с  M. bovis, исключая  их  низкую 
патогенность (Dankner WM, Davis C.E. ,2000; Ashford D.A., Whitney E, 
Raghunathan P. et al., 2001). У возбудителей  микобактериозов возможны пе-
рекрёстные  серологические  реакции  с  микобактериями  туберкулёза.  Так,  у 
M. кansasii и M. tuberculosis имеются общие антигены, а у инфицированных  
M.  кansasii  отмечают  положительную  реакцию  Манту.  Схожесть  клиниче-
ской картины и лечения  при проявлении микобактериальных инфекций под-
разумевает,  что  многие  лаборатории  их  не  идентифицируют  в  полной  мере 
(Gangadharam P.R.J., Droubi A.J., 1981; O`Reilly LM, Daborn C.J.,1995). Тем не 
менее, очень важно идентифицировать возбудителей для дальнейших эпиде-
миологических исследований по выявлению резервуаров и правильному ле-
чению больных.  
 До 1978 г.  в  России  отмечалось  снижение  заболеваемости  туберкулё-
зом за счёт улучшений социальных условий и внедрения комплекса лечебно-
профилактических мероприятий. Последующие годы (до 1991) характеризо-
вались  дальнейшим  снижением  заболеваемости  до  порога  эпидемического 
благополучия, определённого ВОЗ - 30 случаев на 100 тыс. населения. Осо-
бенно  быстро  показатели  снижались  среди  детей  и  подростков.  Начиная  с 
1992  г.,  эпидемическая  ситуация  по  туберкулёзу  резко  ухудшилась  во  всём 
мире, наблюдается рост заболеваемости как среди взрослых, так и среди де-
тей (Журавлёв М.В., Арсенина Л.В., Виноградова И.Л. с соавт.,2002; Русако-

 
17
ва Е.В., Иваненко Г.П., Иванова И.Н. с соавт., 2002). В период с 1997 по 1999 
гг. в России заболеваемость, вызываемая МТБ, возросла. В 2000 г. этот пока-
затель увеличился по сравнению с уровнем 1991 г. в 2,7 раза (Шешуков П.Ф., 
Готовский Ю.В., 2002) и  лишь в 2000-2002 гг. стабилизировался на высоком 
уровне. В последние годы резко возрос показатель инфицированности детей, 
который в 2000 г. составил 2,5 %, тогда как при благополучной ситуации он 
не  превышал 0,1-0,3 % (Онищенко  Г.Г., 2003). Наблюдаемое  в  настоящее 
время  в  РФ  прогрессирование  заболеваемости  туберкулёзом  связано  с  оче-
видным снижением уровня жизни человека и сопутствующим дисбалансом в 
питании; многочисленными стрессами и наплывом беженцев из других рес-
публик бывшего СССР (их заболеваемость туберкулёзом  достигает 700 слу-
чаев  на 100 000 населения),  особенно  чеченских  беженцев (Jakubowiak W., 
Komourzaeyev B., Dara M. et. al. 2003); увеличением  количества  эмигрантов 
(A. G. Miranda, 2003); ростом  алкоголизма  и  наркомании;  неудовлетвори-
тельным  условием  содержания  заключённых  (хотя,  несмотря  на  напряжен-
ную  эпидситуацию  в  местах  лишения  свободы,  мероприятия,  направленные 
на предупреждение и раннюю детекцию ТБ, включающие туберкулинодиаг-
ностику, флюорографию 2 раза в год, химиотерапию, позволили уменьшить 
случаи выявления ТБ среди юношей в 6,5 раз (Rakisheva A., Erkenova G., Kas-
senova L.,  2003); скученностью населения в  следственных изоляторах, лаге-
рях беженцев; увеличением  числа лиц “без определённого места  жительст-
ва”; прекращением в 90 –х годах предоставления больным  с открытой фор-
мой туберкулёза изолированной жилой площади (заболеваемость контактных 
в очаге достигает 700 на 100 000 населения); недостаточным количеством со-
временных препаратов для больных; низкой материально- технической базой 
многих противотуберкулёзных учреждений (Онищенко Г.Г., 2003). С другой 
стороны,  усиливается  “активность”  возбудителя,  обусловленная,  очевидно, 
вытеснением  естественных  конкурентов  в  результате  применения  антимик-
робных средств.  

 
18
Во всех странах ежегодно регистрируют  8-10 млн. случаев инфициро-
вания.  Не  меньшее  значение  имеет  увеличение  количества  лиц  с  хрониче-
скими  заболеваниями,  сопровождающимися  нарушениями  иммунитета  (По-
кровский В.И., Позднеева О.И. М.,1998).  
Эпидемический  процесс  при  туберкулёзе  характеризуется    наличием 
двух  форм – антропонозной  и  зоонозной.  В  первом  случае  источником  ин-
фекции служит человек, заболевание вызывается Mycobacterium tuberculosis, 
во  втором  случае – животные  (крупный  рогатый  скот),  птицы,  заболевания 
которых вызываются Mycobacterium bovis  и Mycobacterium avium. В отличие 
от других зоонозных инфекций, при туберкулёзе человек не является эпиде-
мическим  тупиком,  от  него  возможно  дальнейшее  распространение  инфек-
ции  антропонозным  путём  (Коротченко  С.И., 1999; Фролова  Ф.Н.,  Кулаков 
И.М., Зайнутдинова Н.Г., Фатыхова Р.Х., 2002). Особенностью при туберку-
лёзе  является  убиквитарное  распространение  и  широкая  циркуляция  возбу-
дителя  среди  населения,  многообразие  механизмов,  путей  и  факторов  пере-
дачи: при антропонозном - ведущий  аспирационный механизм с воздушно-
капельным  и  воздушно-пылевым  путями  передачи,  возможен  и  контактный 
механизм с контактно-бытовым путём передачи; при зоонозном туберкулёзе 
преобладают  алиментарный  и  контактно-бытовой  пути  заражения.  Эпиде-
миологический  процесс  при  туберкулёзе  характеризуется  высокой  заболе-
ваемостью  у  определённых  групп  населения,  особенно  среди  лиц  с  вторич-
ными  иммунодефицитами,  в  том  числе  ВИЧ-инфицированных  и  больных 
СПИДом,  в  закрытых  коллективах  детей  и  взрослых.  Повышается  уровень 
заболеваемости  среди  медицинских  работников,  особенно  противотуберку-
лёзных учреждений, среди работников неблагополучных по туберкулёзу жи-
вотноводческих  и  птицеводческих  хозяйств,  среди  лиц,  имеющих  профес-
сиональные  вредности  (шахтёры,  работники  предприятий  с  повышенным 
пылеобразованием и др.).  

 
19
Зависимость  заболевания  туберкулёзом  от  социальных  факторов  обу-
словлена усилением миграции с территорий, неблагополучных по туберкулё-
зу, снижением уровня жизни и ухудшением питания населения (в основном 
неработающей части населения), демографическими сдвигами в сторону ста-
рения  населения  (Покровский  В.И.,  Позднеев  О.И.  М.,1998;  Белиловский 
Е.М., Борисов С.Е., Дергачёв А.В. с соавт., 2003). 
Для  возбудителя  туберкулёза  характерны  относительно  быстрое  фор-
мирование лекарственной устойчивости, появление лекарственно-зависимых 
форм, способность к трансформации в L-формы, фильтрующиеся и оскольча-
тые формы, персистирующие внутри макрофагов, а также некультивируемые 
формы с возможностью реверсии всех этих образований микобактерий в ис-
ходное состояние. 
Клинические проявления туберкулёза имеют ряд особенностей, заклю-
чающихся  в  множественной  локализации  патологического  процесса  (лёгоч-
ные  и  внелёгочные  формы)  с  преимущественным  поражением  дыхательной 
системы  (до 90 % и  более),  невозможности  определения  точных  сроков  ин-
кубационного периода (минимальным сроком инкубации считается 2 нед. до 
появления  в  лёгких  специфических  Т-лимфоцитов).  Установить  же  макси-
мальный срок инкубации при инфекции, развивающейся медленно и клини-
ческие  признаки  при  которой  возникают  постепенно,  достаточно  сложно. 
Для туберкулёза характерны хронический характер инфекционного процесса 
при  отсутствии  ранней  диагностики  и  лечения,  преобладание  клинически 
выраженных форм у подростков и лиц молодого возраста, первичное инфи-
цирование преимущественно в детском возрасте, трудность раннего выявле-
ния  заболевания  у  людей  всех  возрастов  из-за  полиморфности  клинической 
симптоматики,  отсутствия  настороженности  медицинских  работников,  а 
также нарушения регулярности профилактических осмотров. 
В  патогенезе  туберкулёза  возможны  эндогенный  и  экзогенный  меха-
низмы развития инфекционного процесса. Экзогенный механизм проявляется 

 
20
чаще  у  взрослых  при  повторном  инфицировании  (суперинфекции),  как  пра-
вило,  лекарственно-устойчивыми  микобактериями.  При  эндогенном  меха-
низме развитие туберкулёза происходит в результате реактивации (реверсии) 
изменённых  форм  микобактерий,  сохранившихся  в  остаточных  очагах  пер-
вичной туберкулёзной инфекции. Активация туберкулёзного процесса может 
происходить в разные сроки, иногда через длительное время от момента пер-
вичного заражения. 
Восприимчивость  человека    к  туберкулёзу  всеобщая,  хотя  и  неабсо-
лютная.  Из  контактировавших  с  бациллярными  больными  инфицируются  в 
течение года 40-50 чел., из которых заболевают 20-40 %. При этом отмечает-
ся  неодинаковая  восприимчивость  к  данной  инфекции  в  разных  возрастных 
группах:  низкая-  у  детей 1-2 лет, 10-11 лет  и  у  взрослых 30-50 лет  (зрелый 
возраст);  высокая-  у  детей  раннего  возраста,  в  препубертатный  и  пубертат-
ный  периоды (12-16 лет),  у  лиц  молодого  возраста  и  пожилых  людей.  Фор-
мирование противотуберкулёзного иммунитета  происходит, как правило, на 
фоне  инфицирования («нестерильный  иммунитет») (Петрухина  М.И.,  Руса-
кова Е.В., Ющенко Г.В., 2003). 
В  структуре  клинических  форм  туберкулёза  стало  больше  пациентов, 
страдающих распространенными, запущенными и осложнёнными формами, а 
также больных, выделяющих лекарственно-устойчивые микобактерии тубер-
кулёза,   снизилась    также  эффективность    лечения больных туберкулёзом  
(Шевченко Ю.Л. Приказ МЗ РФ № 109 от 21.03.2003).  
Появление  остро  прогрессирующих  форм  туберкулёза  способствует 
высокому уровню инфицирования туберкулёзом детского населения и увели-
чению  числа  заболевших  детей,  отмечаемому  с 1990 г. (1989 г. – 7,4 на 
100000 детского населения, 1990 г. - 7,8; 1997 г. - 14,7; 2001 г. - 18,6).  Осо-
бую  тревогу  вызывают  постоянно  сохраняющиеся  в  течение  ряда  лет  высо-
кие показатели заболеваемости детей туберкулёзом в Чеченской, Ингушской, 

 
21
Северо-Осетинской  республиках,  а  также  в  республиках  Алтай,  Дагестан, 
Тыва и Бурятия. 
Показатель  заболеваемости  туберкулёзом  детского  населения  свиде-
тельствует  о  сохранении  неблагополучной  общей  эпидемической  ситуации 
по туберкулёзу в стране. При этом структура впервые выявленного туберку-
лёза у  детей подтверждает в целом удовлетворительное качество работы об-
щей  лечебной  и  противотуберкулёзной  служб  по  активному  выявлению  и 
профилактике заболевания. Несмотря на ухудшение общей эпидемиологиче-
ской  ситуации  в  стране,  структура  фтизиопедиатрической  службы  была  со-
хранена в прежнем объёме в большинстве регионов России. Охват специфи-
ческой вакцинацией БЦЖ детей ежегодно составляет до 95 %, туберкулино-
диагностикой-85 %. Доля  впервые  выявленных  профилактическими  метода-
ми больных детей составляет более 70 %. Эти подходы обеспечивают диаг-
ностику форм заболеваний, требующих проведения коротких курсов химио-
терапии, позволяющих достичь быстрого излечения без остаточных измене-
ний. При росте уровня общей заболеваемости детей в России в течение 10 лет 
встречаются единичные случаи фиброзно-кавернозного туберкулёза. Из 4712 
заболевших  детей 4003 ребёнка  имели  поражения  органов  дыхания.  Умень-
шается число случаев туберкулёзного менингита, его доля в структуре забо-
леваемости  туберкулёзом  составила 0,9 % в 2001 г.  Показатель  смертности 
детей от туберкулёза в России колеблется в последние два десятилетия от 0,6 
до 0,11 % на 100 000 детей.  Наиболее  высока  смертность  у  детей  первых 2 
лет жизни, она в 10 раз превышает общий показатель  (Аксёнова В.А. , 2003). 
С 1996 г.  наблюдался  умеренный  рост  туберкулёза  среди  больных 
ВИЧ-инфекцией. Диагностировали эту сочетанную патологию главным обра-
зом на ранних стадиях ВИЧ – инфекции более чем в 50 % случаев в противо-
туберкулёзных учреждениях. В настоящее время ситуация начала изменять-
ся.  Это  связано  с  тем,  что  у  заразившихся  ВИЧ 5 лет  назад  уже  начинают 
развиваться  поздние  стадии  ВИЧ - инфекции  и,  соответственно,  иммуноде-

 
22
фицит.  Если  проецировать  такое  развитие  ситуации  и  дальше,  то  к 2007 г. 
число больных ВИЧ-инфекцией и туберкулёзом составит более 30 тыс. (Фро-
лова О.П., 2003). 
Государственная система мониторинга туберкулёза  действует в России 
с 1997 г. на основе приказа Минздрава России № 193 от 13.07.97. Базы дан-
ных и программное обеспечение, установленные в более чем 40 администра-
тивных  территориях  РФ,  обеспечивают  в  настоящее  время  эффективный 
эпидемиологический мониторинг и контроль деятельности фтизиатрической 
службы (Белиловский Е.М., 2003). 
В  настоящее  время  НИИ  туберкулёза  и  фтизиопульмонологии    со-
трудничает  с  зарубежными  учреждениями  по  прикладным  и  фундаменталь-
ным исследованиям, по изучению механизмов возникновения лекарственной 
устойчивости и путей распространения туберкулёза, разработке методов ус-
коренного определения чувствительности МТБ к химиопрепаратам, иммуно-
генетике туберкулёза с целью изучения молекулярно-генетических механиз-
мов  резистентности  макроорганизма  туберкулёзной  инфекции  (Ерохин 
В.В.,2003). 
В  связи  со  своеобразием  эпидемиологии,  клиники  и  диагностики  ту-
беркулёза, эпидемиологический надзор должен осуществляться с учётом его 
особенностей  (Петрухина  М.И.,  Русакова  Е.В.,  Ющенко  Г.В., 2003). ВОЗ 
принимает участие во внедрении программы по контролю над туберкулезом 
на территории РФ с 1994 г. Сегодня 27 субъектов РФ используют рекоменда-
ции ВОЗ (Kluge H., Jakubowiak W., Pashkevich D. et.al., 2003). 
 
1.2.  Анализ  современного  состояния  конструирования  диагностиче-
ских препаратов и  индикации возбудителя туберкулеза. 
 
На  приоритетном  месте  медицинской  биотехнологии  стоят  вопросы 
разработки  и  совершенствования  технологий  изготовления  биопрепаратов  с 

 
23
целью  повышения  их  активности,  чувствительности,  специфичности,  экс-
прессности при диагностике туберкулёза у больных  людей и выявлении воз-
будителя в объектах внешней среды.  
Для  конструирования  высокоактивных  диагностических  препаратов 
необходимо  получить  качественный  антигенный  и  антительный  материал. 
При  изолировании  антигенного  материала  микобактерий,  представляющего 
собой  сложные  комплексы,  содержащие  протеины,  полисахариды,  липиды, 
фосфатиды,  необходимо более полное извлечение интересующих  специфи-
ческих компонентов с сохранением их биологических и антигенных свойств. 
Для  перевода  антигенов  в  растворимое  состояние    применяют  экстракцию 
трихлоруксусной кислотой, солевыми растворами, фенолом,  эфиром, хлоро-
формом, ацетоном и т.д. Получаемые при этом экстракты  имеют  различные  
физико-химические,  иммунохимические  свойства  и  спектр  антигенов.  При 
анализе литературных данных по методам выделения  антигенных комплек-
сов    из  микробных  клеток  привлекли  внимание  сообщения  Н.А.Бельской  с 
соавт. (1972), В.И.Вейнблата с соавт. (1972), в которых показано,  что наибо-
лее  сложным  макромолекулярным  составом  обладали  водно-солевые  экс-
тракты. Многими исследователями для извлечения антигенных компонентов 
из    микробной    клетки    использовались  различные  методы  её  разрушения: 
физический, химический, механический и др. Эффективными методами раз-
рушения  микробной  клетки  является  ультразвуковая  и  механическая  дезин-
теграция (Фихте Б.А., 1972; Афанасьев Е.Н., 1986), так как под  их воздейст-
вием  наступает,  прежде  всего,  разрушение  структуры  клеток  микробов,  а 
изменения  химических  веществ,  находящихся  в  них,  происходят  гораздо 
медленнее,  что обеспечивает возможность получения различных  нативных 
антигенных комплексов (Благовещенский В.А.с соавт.,  1961).  
 Специфичность иммунологических реакций находится в прямой зави-
симости от активности и специфичности антитела, используемого для приго-
товления диагностического препарата (Скачек Д.В., 1984; Алексеев В.В. с со-

 
24
авт. 1987). Для  получения  сывороток  описаны  различные  схемы  иммуниза-
ции  животных  (Шаханина К.Л., 1977; Чибисова В.А.,  1975; Тюменцева И.С. 
с соавт., 1994 г; Rowe D.S., 1970; Lachman P.J., 1970 и др.). Антисыворотки, 
приготовляемые к различным антигенам,  испытывают на активность и спе-
цифичность  методами  кольцепреципитации,  электрофореза  и  иммуноэлек-
трофореза,  преципитацией в  агаре по Оухтерлони, реакциями агглютинации 
(РА),  непрямой  гемагглютинации  (РНГА),  иммуноферментного  анализа 
(ИФА) и т.д.. При наличии  перекрестных  реакций  антисыворотки  истоща-
ют (Шаханина К.Л., 1981;  Смирнов В.В.,  1980;  Кузовлева А.А., Шаханина 
К.Л., 1982; Beuntner E.H. et al., 1970; Ansari A.A. et al.,1981). Лучшие резуль-
таты получают при удалении нежелательных антител  нерастворимыми   им-
муносорбентами.  Применяют иммуносорбенты,  полученные путем  присое-
динения  специфического антигена к носителю (целлюлозе,  агарозе,  сефаро-
зе и др.), либо "сшивкой" специфического антигена. Такие иммуносорбенты 
обладают  прочной  ковалентной  связью  антигена  с  матрицей  и  получаются 
при  взаимодействии  реакционноспособных  функциональных  групп  биопо-
лимеров со специально подобранными бифункциональными соединениями. 
Попытки  истощения  сывороток  при  использовании  в  качестве  адсор-
бентов микробных клеток, широко применяемых  в сывороточном производ-
стве  (Карпов  С.П.  с  соавт.,1976;  Смирнов  В.В.  с  соавт., 1980; Пекшев  А.В., 
Елагин Г.Д., Пятков В.А., 1998), приводят к существенной потере  специфи-
ческой активности нативных сывороток, при их частичном насыщении анти-
генным материалом. При этом процесс адсорбции иммунной сыворотки кор-
пускулярными антигенами  очень трудоемок и требует приготовления боль-
шого  количества  биомассы.  Значительные  преимущества  перед  названными 
сорбентами  имеют  твердофазные  иммуносорбенты.  При  их  приготовлении  
отпадает  необходимость  получения  большого  количества  биомассы  микро-
организмов  штаммов-адсорбентов,  существует  возможность  длительного  их 
использования после проведения регенерации и, что самое главное, в процес-

 
25
се адсорбции происходит незначительное снижение специфической активно-
сти сывороток при упрощении манипуляций (Лопаткин О.Н. с соавт., 1983).  
Тем не менее, метод иммуносорбции имеет и недостатки, связанные со слож-
ностью  подготовки иммуносорбентов, с использованием канцерогенных, до-
рогостоящих импортных реактивов, с недостаточной сорбционной емкостью 
сорбентов.  
          Чувствительность  иммунометодов  зависит,  прежде  всего,  от  активно-
сти  антител,  на  основе  которых  они  изготовлены.  Чаще  всего  используют 
иммуноглобулины класса G, для выделения которых из сыворотки существу-
ет много способов: аффинная хроматография, высаливание сернокислым ам-
монием (Таран И.Ф., Лопаткин О.Н., 1985;.O,Berry P.A., 1964; Lenis V.J. с со-
авт., 1964), осаждение каприловой кислотой (Steibuch, Andran,  1969), поли-
этиленгликолем (Polson A. с соавт., 1964), риванолом (по Корн, 1977), этило-
вым спиртом (Табаков П.К с  соавт., 1962; Носков Ф.С., 1969) и т.д. Освобо-
ждение  иммуноглобулинов  от  основного  количества  балластных  белков 
(главным  образом  от  альбумина)  позволяет  снизить  неспецифические  реак-
ции.   
Каждый  из  методов  выделения  иммуноглобулинов  имеет  свои  пре-
имущества и недостатки. Удаление солей,  используемых при фракциониро-
вании  белков, необходимо проводить  полностью,  так как загрязнения вы-
деленных  глобулинов  даже  небольшим  количеством  сульфата  аммония  ме-
шают  точному определению количества белка и дальнейшей его конъюгации 
с  красителем  или  ферментом.  Сульфатно-риваноловый  метод  обеспечивает 
эффективное  удаление балластных веществ при очистке иммуноглобулинов 
(Водолазова А.М.,  Никитина Л.Н., 1981). Метод их выделения с помощью 
полиэтиленгликоля (ПЭГ) является эффективным, так как ПЭГ хорошо оса-
ждает белки, обладает  селективностью,  более  специфичен  при осаждении 
белков  различной  природы,  чем  сульфат  аммония.  При  фракционировании 

 
26
иммуноглобулинов  каприловой  кислотой  выделяется  наиболее  чистая  фрак-
ция иммуноглобулинов класса G. 
         Только  при  чётко  подобранном  антигенном  материале,  эффективной 
схеме  иммунизации,  отработанном  для  каждого  конкретного  случая  методе 
выделения  иммуноглобулинов,  возможно  получение  высокоактивных  диаг-
ностических препаратов. 
В настоящее время диагностика ТБ недостаточно эффективна. Так, на-
пример,  основными  методами  диагностики  ТБ  медиастинальных  лимфоуз-
лов, сопровождающегося интоксикационным синдромом в сочетании с каль-
цинацией  лимфоузлов  и  продуктивным  кашлем,  являются  рентгенологиче-
ский и бронхоскопический (Nikolayeva O., Shpak O., 2003). 
При диагностике туберкулёза до сих пор на приоритетном месте  нахо-
дятся  бактериоскопия  и  культуральный  метод.  Каждый  из  них  имеет  свои 
преимущества и недостатки. Бактериоскопия позволяет быстро получить ре-
зультаты анализа, однако недостаточно чувствительна, а результаты культу-
рального  метода  из-за  длительности  сроков  культивирования  микобактерий 
не  отражают  настоящую  ситуацию  по  бактериовыделению  (Ларионова  Е.Е., 
Кузьмин  А.В.,  Васильева  И.А.  с  соавт., 2004). Идентификация  комплекса 
МТБ  биохимическими  тестами  требует  большого  количества  времени  и  на-
личия  достаточного  количества  выросших  колоний.  На  основании  наличия 
внутривидовых различий результаты тестов  могут разниться, поэтому необ-
ходимо проводить их в комплексе. Например, для идентификации МТБ необ-
ходимы, по меньшей мере, 4 биохимических теста - аккумулирование ниаци-
на, редукция нитратов, каталазы и толерантность к  парааминобензойной ки-
слоте (Kent P.T., Kubica G.P., 1985). Стоимость этих анализов выше стоимо-
сти ПЦР в два раза, а время, необходимое для их проведения, составляет око-
ло 28 дней. 
Газо-жидкостная  хроматография  является  быстрым  и  действенным 
методом  идентификации  МТБ,  для  которого  необходима  чистая  культура  и 

 
27
определённое количество бактерий, формирующихся при трёх неделях роста  
(Butler W.R., Jost K.C., Kilburn J.O., 1991; Thibert L., Lapierre S., 1993; Duffey 
P.S., Guthertz L.S., Evans G.C., 1996; Zerbini E., Cardoso M.M., Sequeira M.D. et 
al., 1999).  
Стремительное  развитие  биотехнологии  в  последние  годы    привело  к 
появлению  многочисленных  новых  методов  исследования,  однако,  продол-
жает  широко  применяться  хорошо  известная  реакция  непрямой  (пассивной) 
гемагглютинации  (РНГА),  заключающаяся  в  том,  что  эритроциты,  связав-
шие серологически активный компонент,  приобретают свойства агглютини-
роваться  гомологичным серологически активным анти-компонентом. Такой 
метод  выявления    первичного    взаимодействия    антиген-антитело  обладает  
весьма  высокой чувствительностью.  Эти реакции находят все большее при-
менение в диагностике различных заболеваний, изучении иммунологической 
прослойки    населения,  исследовании    антигенной    структуры  различных  
микроорганизмов  и т.д. Эритроцитарные диагностикумы до сих пор привле-
кательны  по  себестоимости,  доступности  сырья,  простоте  производства  и 
применения.  
В  качестве  антигена  для  РНГА  применяют  экстракт  туберкулиновых 
микобактерий  или  очищенный  туберкулин,  которыми  сенсибилизируют 
эритроциты.  Диагностическое  значение  имеет  положительная  реакция  с  сы-
воротками больных 1:8 и выше. Положительные результаты регистрируются 
у 70-90 % больных  туберкулёзом  (Воробьёв  А.А.,  Кривошеин  Ю.С.,  Широ-
боков В.П., 2003). 
Суспензии - распространённые  микрогетерогенные  системы,  которые 
могут быть получены различными способами, например, конденсационными, 
дисперсными  и  т.д. (Хмельницкий  Р.А., 1988). Адсорбция  лигандов  на  дан-
ных  системах  зависит  от  химического  строения  сорбентов  и  соотношения  
фракций  лиганда  (Адамов  А.К., 1965; Адамов  А.К.,  Агафонов  В.И., 1969). 
При  изучении  закономерностей  адсорбции  иммунных  антител  установлено, 

 
28
что  они  адсорбируются  органическими  соединениями,  содержащими  гидро-
ксильные, хинонные, карбоксильные, альдегидо -, сульфо - и нитро-группы, 
органическими веществами, в состав которых входят атомы металлов, а так-
же  пористыми  образованиями - активированным  углём,  каолином  и  т.д. 
(Адамов  А.К,  Бердиков  В.Т., 1964). Иммуносорбенты  могут  быть  получены 
из  любых  частиц,  на  которых  фиксированные  антитела  сохраняют  иммуно-
логическую  активность  и  специфичность.  Суспензионные  диагностикумы 
применяют  в  реакции  суспензионной  агглютинации  (РСА),  которую  осуще-
ствляют  на  стекле  или  в U-образных  иммунологических  планшетах (Rama-
dass P., Samuel B.,Nachimuthu K., 1999; Maruyama S., Boonmar S., Morita Y., 
2000), обнаруживая невооруженным глазом склеивание или выпадение в оса-
док микробных тел при взаимодействии их со специфическими антителами, 
сорбированными на суспензии.  Благодаря специфичности и простоте, реак-
ция получила широкое распространение в микробиологической практике.  
        Среди  матриц для суспензионных диагностикумов хорошо себя зареко-
мендовали  латексы - полистирол,  полиакролеин  и  др. (Лукин  Ю.В.  с  соавт,  
1985; Ерохин Е.П. 1991; Дячина М.Н. с соавт., 1995; Лазовская А.Л., Воробь-
ёва З.Г., 2002). Латексы – водные эмульсии каучукоподобных полимеров, по-
лучаемые  полимеризацией  или  сополимеризацией  различных  органических 
непредельных  соединений  (Бусеев  А.И.,  Ефимов  И.П., 1971). Реакции  с  ис-
пользованием в качестве твёрдой основы латекса  называются реакцией агг-
лютинации латекса (РАЛ). Слининой С.А. (2001) выявлены микобактериаль-
ные антигены в моче больных с помощью РАЛ и показана перспективность 
использования данной реакции.  
Особое  распространение    получили  методы,  основанные  на  примене-
нии  антител, меченных специальными маркерами-флуорохромами, которые 
позволяют  с  помощью люминесцентного микроскопа проводить высокочув-
ствительные  определения  исследуемого  вещества  в  реакции  иммунофлуо-
ресценции (РИФ) (Coons A.H. et al., 1942.). При диагностике туберкулёза ши-

 
29
роко  используется  люминесцентная  микроскопия,  основанная  на  том,  что 
объекты  (клетки),  окрашенные  специальными  красителями  (флуорохрома-
ми),  дают  излучение  в  видимом  спектре  света  под  действием  облучения  их 
ультрафиолетом. При обработке микобактерий флуоресцентными красителя-
ми (аурамин, родамин и др.) они связываются с воскоподобными структура-
ми  микробной  клетки.  По  чувствительности  люминесцентная  микроскопия, 
особенно  в  сочетании  с  методом  обогащения  диагностического  материала, 
незначительно  уступает  методу  посева.  Этим  методом  можно  исследовать 
любой материал кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируе-
мые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ СССР № 558, 1978).  
Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии 
является  способность  обнаруживать  изменённые  микобактерии,  утратившие 
под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свой-
ство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по      
Цилю-Нильсену  (Методические  указания  МЗ  РФ  «Микробиологические  ис-
следования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001). 
При  окраске  микобактерий  аурамином  возможны  ложноположитель-
ные  результаты  в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что мо-
жет привести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранже-
вого  свечения.  Микроскопические  исследования  с  использованием  окрасок 
по  Цилю-Нильсену  и  аурамином  не  позволяют  дифференцировать  микобак-
терии комплекса Mуcobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных 
микобактерий) - возбудителей  микобактериозов.  На  основе  этих  методов 
можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустой-
чивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003). 
В связи с этим, желательно использовать более специфические методы 
диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, в ча-
стности - метод  иммунофлуоресценции.  Он  достаточно  прост,  экономичен, 
может использоваться в экспресс - диагностике инфекционных заболеваний и 

 
30
вместе с тем удобен для работы (Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В., 1982; Green-
lee M.T. et al., 1994; Gall D. еt al., 2000; Nielsen K. еt al., 2000).  
Данный  метод    основан  на  использовании  специфичности  иммуноло-
гических реакций и  чувствительности  флуоресцентной микроскопии. Один  
из    компонентов  иммунной    реакции  (специфические  иммуноглобулины)  
коньюгируется  с  флуоресцирующим  красителем  (меткой).  После  возбужде-
ния флуоресцирующего агента ультрафиолетовым излучением визуализация 
антигена  становится  возможной  непосредственно  наблюдателю  вследствие 
развития  флуоресценции.  В  качестве  флуорохрома  применяют  изоцианаты, 
изотиоцианаты и сульфохлорид флуоресцеинов, которые связываются с бел-
ковыми молекулами. Метка белка ФИТЦ проводится в щелочной среде. Ин-
тенсивность свечения уменьшается в 2-3 раза после присоединения ФИТЦ к 
белку,  но  остается  достаточно  высокой  при  просмотре  в  люминесцентном 
микроскопе. В  реакции конъюгации в основном участвуют аминогруппы ли-
зина и N-концевые аминогруппы белковой молекулы. Известно, что конъю-
гация  белка  с  ФИТЦ    является    химической  реакцией,  зависящей  от  ряда 
факторов: чистоты и активности красителя, его количества при метке,  кон-
центрации белка, взятого в конъюгацию, количества и степени его очистки, 
состава буфера, величины рН, времени конъюгации и температуры реакции.   
В  настоящее  время  разработаны  методы  экспресс-диагностики  тубер-
кулёза,  основанные  на  использовании  РИФ  с  моноклональными  видоспеци-
фическими  флуоресцирующими  сыворотками  (Воробьёв  А.А.,  Кривошеин 
Ю.С., Широбоков В.П., 2003). 
Большое  внимание  уделяется  развитию  методов  флуоресцентного  им-
муноанализа с временным разрешением, что значительно повышает чувстви-
тельность  анализа  (Жердева  В.В.,  Чудинов  А.В.,  Савицкий  А.П., 2002). В  
диссационно-усиленном  лантаноидном флуоресцентном иммуноанализе ис-
пользуются ионы европия, тяжелого металла группы лантаноидов. Для обра-
зования  прочной  связи  белка с ионом лантоноида применяют бифункцио-

 
31
нальные производные карбоновых кислот. На стадии детекции ионы европия 
диссоциируют  из  меченого  антитела  с  поверхности  твердой  фазы  в  специ-
альный  раствор,  образуя  новый  флуоресцирующий  комплекс  (Иванов  Ю.В., 
Коровкин  С.А., 1997).  
          Анализ данных литературы (Шаханина К.Л.,  Манько М.И., 1969; Ша-
ханина К.Л.,  Походзей И.В., 1978; Стоев К.Г. с соавт., 1981; Пушкарь В.Г., 
Трофимов Е.Н., 1986; Ефременко В.И. с соавт, 1989; Moldey R.S.,  Jen S.P.S.,  
Rembaum A., 1977) свидетельствует  о  перспективности  разработки  твёрдо-
фазного иммуноанализа на основе РИФ с использованием иммуносорбентов, 
позволяющих  выявлять  не  только  корпускулярные,  но  и  водорастворимые 
антигены.  
Для  избирательной  сорбции  некоторых  бактерий    и    риккетсий  с  це-
лью последующего выявления микроорганизмов в РИФ К.Л.Шаханина с  со-
авт.  (1969)  применяли иммуносорбенты на основе целлюлозного носителя, 
при этом   повышалась чувствительность метода в 10-15  раз, хотя он и не по-
зволял проводить количественный учет свечения гранул. 
          Некоторые авторы работ  считают,  что синтетические диагностикумы 
на основе сефарозы, агарозы  выгодно отличаются  от эритроцитарных  и  ла-
тексных тем,  что их качество не зависит от типа носителя, к которому при-
соединение антитела или антигена происходит  ковалентно.  Результаты  ис-
следований  сыворотки больных хроническим бронхитом позволили сделать 
вывод, что приготовленные сефарозные антительные  и  антигенные диагно-
стикумы достаточно специфичны и более чувствительны, чем РСК (Шахани-
на К.Л.,  Походзей И.В., 1978). 
           К.Г. Стоевым с  соавт.(1981) разработан количественный метод РИФ с 
использованием  специфического  сефарозного  иммуносорбента  и  люминес-
центного  микроскопа (DASS-система),  что  позволяет  измерить  концентра-
цию Ig Е человека в пределах  5-2500 м.е./мл. Метод  обладает  рядом пре-

 
32
имуществ, отличается малой затратой времени, доступен практическим лабо-
раториям. 
        В настоящее время  появились сведения об усовершенствовании РИФ с  
использованием    иммуносорбентов,  обладающих  магнитными  свойствами. 
Описано использование магнитных  полиакриламидных сорбентов  (Пушкарь 
В.Г., Трофимов Е.Н., 1986; Ефременко В.И. с соавт., 1989; Подзолкова Г.Г. с 
соавт., 1989);  магнитных  органокремнезёмных  сорбентов  (Жарникова  И.В., 
1995;  Афанасьев  Е.Н., 2000, Базиков  И.А., 2000); магнитных  железоокисно-
декстрановых частиц (Molday R.S.et al., 1977). К недостаткам последнего ме-
тода следует отнести необходимость применения мощных магнитных полей 
для сепарации этих частиц. 
На  основе  твердофазных  иммуносорбентов  различной    природы  Г.Г. 
Подзолковой с соавт. (1989) предложен метод  количественной иммунофлуо-
ресценции, позволяющий выявлять с высокой чувствительностью различные 
антигены. Таким образом,  РИФ с использованием иммуносорбентов  может  
успешно  применяться  для  выявления  возбудителей  инфекций.  Однако  со-
вершенствование метода иммунофлуоресценции  на твердой матрице во мно-
гом определяется качеством  сорбентов, лиганда, техникой постановки реак-
ции. 
На  основании  того,  что  диагностика  МТБ  с  помощью  традиционных 
методов  требует  длительного  времени  и  в  условиях  широкого  применения 
разнообразных противотуберкулёзных препаратов изменилась биология воз-
будителя  туберкулёза  (морфология,  ферментативная  активность  и  биологи-
ческие свойства) (Приказ МЗ РФ № 558., 1978), в микобактериологии на про-
тяжении  последних  лет  используются  молекулярные  технологии - методы 
генодиагностики, а именно полимеразная цепная реакция  (ПЦР), что позво-
лило  разработать  методы  генотипирования  и  дифференцирования  штаммов 
микобактерий  туберкулёза  на  уровне  хромосомной  ДНК (Goto M., Oka S., 
Okuzumi K. еt al.,  1991; Lebrun L., Espinasse F., Povenda J. еt al., 1992; Badak 

 
33
F.Z., Goksel S., Sertoz B. et al., 1999). В основе ПЦР лежит амплификация уча-
стка  генома  путем  многократного  копирования  специфической  для  данного 
микроорганизма нуклеотидной последовательности. Реакция осуществляется 
при помощи термостабильной ДНК-полимеразы и комплиментарных ДНК – 
мишени  олигонуклеотидных  праймеров.  Образование  в  результате  реакции 
фрагментов  ДНК  определённого  размера  оценивается  как  факт  наличия  в 
пробе клеток искомого микроба и позволяет идентифицировать исследуемую 
ДНК. 
Визуализация  результатов  ПЦР  достигается  различными  способами  в 
зависимости  от  используемого  формата  реакции.  При  использовании  элек-
трофоретического  разделения  продуктов  амплификации  для  обнаружения 
ампликонов используется окрашивание ДНК. Самый распространенный спо-
соб – окраска  бромистым  этидием  с  последующим  просвечиванием  геля  на 
ультрафиолетовом  трансиллюминаторе.  Этот  метод  высокочувствителен,  но 
бромистый  этидий  является  мутагеном  и  требует  осторожного  обращения. 
Еще  один  подход  основан  на  использовании  флуорохромов,  которые  излу-
чают  свет  разных  цветов. Deng Shaoli, Yang Yuan (2002) провели  детекцию 
Муcobacterium tuberculosis в  образцах  слизи  туберкулёзных  и  нетуберкулёз-
ных  больных  с  помощью  культурального  метода,  рутинной  ПЦР  и  новой 
техники  ПЦР  с  использованием  гибридизации  с Tagman флуоресцентным 
зондом. Было установлено,  что «Tagman – техника» является высоко чувст-
вительной,  специфичной  и  может  использоваться  для  диагностики  туберку-
лёза.  
Известны различные варианты гибридизационно-ферментной детекции 
продуктов ПЦР. После амплификации ампликоны с включенными биотини-
лированными  праймерами  вносят  в  лунки  микропланшета  с  иммобилизиро-
ванными  одноцепочечными зондами к этим фрагментам, проводят гибриди-
зацию и после отмывки добавляют авидин с конъюгированной пероксидазой 

 
34
или с фосфатазой, субстрат для фермента и выявляют окрашенный продукт с 
помощью фотометра. 
Открытие генетических механизмов развития лекарственной устойчи-
вости  к  противотуберкулёзным  препаратам  позволило  разработать  и  вне-
дрить в практику методы ПЦР, позволяющие определять вид мутаций, кото-
рые  обуславливают  снижение  чувствительности  к  противотуберкулёзным 
препаратам (Рекомендации для национальных программ ВОЗ, 1978; Севасть-
янова Э.В., Ларионова Е.Е., 1999; Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Денисова 
Т.С.  с  соавт., 2000; Ларионова  Е.Е.,  Кузьмин  А.В., 2001; Тунгусова  О.С., 
Марьяндышев  А.О., 2003; Small P., van Embden J.D.A., 1994;WHO Geneva, 
1998).  
Использование ПЦР позволяет быстро (за 8-27 часов) выявить МТБ как 
при туберкулёзе органов дыхания, так и при внелёгочных формах (туберку-
лёзный менингит, туберкулёз кожи, кишечника и др.), в том числе у больных 
СПИДом.  При  высокой  чувствительности  метода (10-1000 клеток  в  пробе) 
имеется возможность выявлять штаммы  M. tuberculosis с множественной ле-
карственной  устойчивостью.  Методом  ПЦР  можно  также  контролировать 
эффективность лечения больных туберкулёзом. При использовании несколь-
ких  образцов  исследуемого  материала  от  каждого  пациента  специфичность 
ПЦР достигает – 99,8-100 % при высокой чувствительности (Воробьёв А.А., 
Кривошеин  Ю.С.,  Широбоков  В.П., 2003). Быстрота  выполнения,  возмож-
ность прямой детекции атипичных и некультивируемых форм микробов, вы-
сокая  чувствительность  метода  указывают  на  перспективность  ПЦР  для  де-
текции  различных  микроорганизмов  (Куличенко  А.Н.  с  соавт., 1996; Гинз-
бург  А.Л., 1998; Вишневская  Е.Б.  с  соавт., 2001; Самсонова  С.А.  с  соавт. 
2002; Ruiz-Bravo A., Jimemez- Valera M., , 1996; Burt F.J. et al, 1998; Eremenko 
E.I. et al., 1999; Tcherneva E. et al., 2000; Bricker B.J. et al., 2000). Генетические 
методы позволили  повысить  оперативность и информативность исследова-
ний  (Бударина  Н.А.  с  соавт., 2002; Drosten C., Gottig S., Schilling S. et al. 

 
35
2002). W.Tan, N.Xia, Y. Cong (1998) для выявления низкой концентрации па-
тогена разработали гнездовую ПЦР в одной пробирке, тем самым, исключая 
контаминацию исследуемой пробы. 
И.В.  Раковская  с  соавт. (2002) использовали  оригинальную    схему 
ПЦР-анализа, которая даёт возможность обнаружить персистирующие мико-
плазмозы,  не  выявляемые  рутинными  методами,  что  весьма  актуально  для 
эффективной диагностики хронических форм инфекции.  
Чувствительность ПЦР составляет величину порядка 100-1000 м.к./мл. 
(Куличенко А.Н., Попов Ю.А., Наумов А.В., 1995) и имеет преимущества над 
другими реакциями (Кулаков Ю. К. с соавт, 1992), но стоимость этого анали-
за  пробы  на  порядок  выше,  чем  при    применении  серологических  методов, 
что  существенно  при  проведении  массовых  анализов,  в  том  числе  монито-
ринговых.  Недостатками  ПЦР,  кроме  дорогостоящего  оборудования  и  реа-
гентов,  являются  ложноположительные  результаты,  выявляемые  при  обна-
ружении некоторых микобактерий из-за содержащихся в пробах веществ, ин-
гибирующих  реакции  и  обуславливающих  ложные  результаты (Ford E.G., 
Snead S.J., Todd J., 1993; Butler W.R., O`Connor S.P., Yakrus M.A. et al., 1994; 
Somoskоvi A., Hotaling J.E., Fitzgerrald M.,  2000). Хотя определение последо-
вательности  ДНК  микроорганизмов–  один  из  самых  точных  молекулярных 
методов, но он очень трудоёмок для клинических лабораторий.   
Применение  магноиммуносорбентов  на  предварительном  этапе  под-
готовки проб к проведению  ПЦР позволило осуществить  концентрирование 
антигена в пробах с низкой концентрацией микробов, очистить пробы от по-
сторонней  микрофлоры  и  других  агентов,  мешающих  постановке  ПЦР,  ис-
пользовать  метод  кипячения  для  выделения  ДНК,  исключив  метод  лизиса 
бактерий  гуанидин-тиоцианатом  с  нуклеосорбцией,  одновременно  достигая 
стерилизации  исследуемого  материала,  что  упрощает  анализ  и  сокращает 
время обнаружения возбудителя (Жилченко Е.Б., ЕфременкоВ.И., 2002).  

 
36
Изучение возможности создания оптимального алгоритма для диагно-
стики  туберкулёза  по  методу  вегетативного  резонансного  теста  (ВРТ) 
“ИМЕДИС-ТЕСТ”  с  использованием  аппарата  “МИНИ-ЭКСПЕРТ-ПК”  и 
специально разработанных кассет для тестирования в экспериментальной ра-
боте,  в  клинической  и  практической  медицине  представлено  в  работе  П.Ф. 
Шешукова, Ю.В. Готовского (2002). Метод основан на записи нозодов в по-
тенциях D3-D200 лиофилизированных штаммов микобактерий туберкулёза и 
12 основных антибактериальных препаратов, применяемых в фтизиатрии. Из 
107 обследованных методом ВРТ у 90 были выявлены типичные и у 17 паци-
ентов атипичные микобактерии, а также проведено определение поражённых 
органов, стадии процесса, устойчивости МБТ к антибактериальным препара-
там. В работе П.Ф. Шешукова, Ю.В. Готовского (2002) представлена сравни-
тельная характеристика различных методов диагностики туберкулёза по чув-
ствительности,  специфичности,  времени  детекции  и  установлено,  что  ВРТ 
превосходит остальные методы по всем показателям. 
Для обнаружения возбудителей различных инфекционных заболеваний 
широко применяются методы с использованием антител (антигенов), мечен-
ных ферментами - иммуноферментный анализ (ИФА), принципы и особенно-
сти которого описаны во многих работах: (Нго Т. Т., Ленхофф Г. М,  1988; 
Яковлев  А.Т., 1992; Подоляко  М.П.  с  соавт., 1995; Engvall E., Perlmann P., 
1971; Van Weemen B.K., Schuurs A.N., 1972; Guesdon J.L., Avrameas S., 1981; 
Sting R., Ortmann G., 2000 и т.д.).  
Метод ИФА заключается в том, что  на нерастворимую основу  иммо-
билизуют    антитела    (антигены),   вносят  испытуемый  материал,  и  образо-
вавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью конъюгата анти-
тел  (антигена) с ферментом, активность которого регистрируют по измене-
нию цвета субстрата  фотометрически  (Гаврилова Е.М., Дзантиев Б.В., Его-
ров А.М., 1980; Ficapal A.  et al., 1995).  

 
37
Ферментами - маркерами,  используемыми  в  ИФА,  могут  быть  щелоч-
ная фосфатаза, галактозидаза, глюкооксидаза, глюкоамилаза, пенициллиназа, 
но чаще применяют пероксидазу (Harding N., 1982). 
Для приготовления иммуноферментных коньюгатов обычно использу-
ют  перйодатный,  глутаральдегидный  методы  (Умнова  Н.С.  с  соавт.,  1986;   
Nakane P.K., Kawaoi A., 1974; O'Sullivan M.J., Marks V., 1981), иногда приме-
няют  малеимидный  метод (Kato K. et  al., 1975; Weston P.D., Devries G.A., 
Wriggleworth R., 1980), но  наиболее  перспективным  считается  перйодатный 
метод  конъюгации  иммуноглобулина  с  ферментом (Anaokar S., Garry P.J., 
Standefer J.C., 1979).  
Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степе-
нью  чистоты  и  активности  используемых  ингредиентов,  но  и  свойствами 
твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунохимические свойства и ста-
бильность  фиксированных  веществ,  обладать  минимальной  способностью 
неспецифически  связывать  компоненты  анализируемой  системы  и  быть 
удобной  при  разделении  фаз  (Щедрин  В.И.,  Сбойчинов  В.Б.,  Волков  В.И, 
1994; Дмитриев Г.А., Киселёва Т.А., 1997). В качестве твердой фазы исполь-
зуется поливинил, дакрил и другие синтетические полимеры, из которых из-
готавливают пробирки (Bushway R.J. et al., 1992) и микропланшеты из опти-
чески  прозрачного  полистирола (Voller A. еt al., 1976). Микропланшеты  об-
ладают не одинаковыми сорбционными свойствами, что существенно влияет 
на достоверность и воспроизводимость полученных результатов (Сухоруков 
А.М.,  Пономарёва  А.М., 1987; Шаханина  К.Л.,  Соколенко  А.А.,  Павлова 
И.П., 1987). Количество антител (антигенов), используемое для образования 
иммунного  комплекса,  ограничено  возможностями  твёрдой  фазы  (Ометов 
В.К.  с  соавт., 1997). Недостаточная  концентрация  антител  (антигенов)  огра-
ничивает чувствительность ИФА. Качество адсорбции фиксируемых на твёр-
дой фазе веществ зависит от температуры, рН, ионной силы, времени инку-
бации.  Процесс  сорбции  обратим  и,  следовательно,  сенсибилизированные 

 
38
планшеты,  полученные  сорбционным  путём,  не  подлежат  длительному  хра-
нению (срок хранения 20 дней на холоде при герметизации) (Калинина О.А., 
Емельянова И.В., Локтионова М.А., 1997). 
Е.В.Гучетль,  Л.П.Пономарёва (2002) представили  опыт  определения 
противотуберкулёзных антител  у больных урогинекологического отделения 
в иммуноферментном анализе и показали, что применение указанного теста в 
комплексе с клинико-лабораторным обследованием больных позволяет с вы-
сокой  степенью  достоверности  диагностировать  туберкулёз  гениталий  у 
женщин (88,5 %). 
Известно  применение  магнитных  частиц  (Ефременко  В.И.,  Климова 
И.М.,  Трофимов  Е.Н., 1989; Тюменцева  И.С.,  1996), магнитных  бус  
(Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E., 1984.) в качестве твёрдой фазы при по-
становке различных иммунобиологических реакций.             
В ряде работ (Климова И.М. с соавт., 1986; Ефременко В.И., Тюменце-
ва И.С.,  1995; Ефременко В.И. с соавт., 1996; Жарникова И.В., 2005)  пред-
ставлены  данные  об  использовании  магнитных  сорбентов  (МС)  в  тест-
системе  ИФА.  Установлены  оптимальные  параметры    анализа:  зависимость 
адсорбирующей  способности  МС  от  его  содержания  в  пробе,  динамика  ад-
сорбции антигена при инкубации его с твёрдофазным носителем. Результаты 
исследований показали, что   чувствительность  метода   в  случае обнаруже-
ния бактериальных клеток  составляла  10 2-10 4 м.к./мл. 
Известны работы О.В. Борисенко с соавт. (2001) по разработке и при-
менению магнитоуправляемых диагностикумов в иммуноферментном анали-
зе  при  выявлении  возбудителя  туберкулёза.  Данные  разработки  актуальны, 
но имеют недостатки, связанные с использованием в качестве лигандов неад-
сорбированных сывороток, что приводит к неспецифической реакции.  
Таким образом, ИФА является экспрессным, чувствительным, перспек-
тивным методом для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. 
Учитывая  недостатки  ИФА,  необходимо  вести  поиск  новых  методов  сохра-

 
39
нения  активности  сорбированных  лигандов  и  инертных  носителей,  на  по-
верхности которых протекают все процессы реакции ИФА.  
          Анализ  достоинств  и  недостатков  методов  экспресс-диагностики  по-
зволил  приступить  к  разработке  эффективных  диагностических  препаратов, 
выявляющих возбудителя туберкулёза у больных и в объектах внешней сре-
ды, обладающих надёжностью, информативностью при высокой их специфи-
ческой активности. 
1.3. Носители  иммобилизованных систем  твёрдофазного иммуноанализа 
 
           Развитие и использование твёрдофазных методов анализа предъявляет 
высокие  требования  к  качеству  иммуносорбентов.  Согласно  гипотезе  
В.Б.Алесковского  (1976),  любое твердое тело имеет остов и облегающие его 
атомы и группы атомов. С химической  точки зрения, остов- ненасыщенное 
высокомолекулярное  образование,  представляющее  собой  макрорадикал,  
вокруг которого расположены функциональные группы высокомолекулярно-
го  соединения.  Именно  наличие  этих  групп  определяет    возможность    ис-
пользования    поверхностных  реакций  для  синтеза  новых  твердых  веществ. 
Иммобилизация  на  твёрдых  носителях  различных  биомолекул  приводит  к 
значительному  повышению  их  термической  устойчивости  и  стабильности 
(Абелян В.А., Африкян Э.Г., 1992; Масько А.А. c cоавт.,  1992).  
В качестве сорбентов  широко используются агарозные матрицы, ак-
тивированные BrCN (Lowe C.R., Dean D.G., 1974.). Однако, наряду со всеми 
положительными сторонами данной матрицы, следует отметить недостаточ-
ную стабильность  связи между лигандом и BrCN- активированной агарозой 
(Turkova J., 1978), низкую механическую стабильность сорбентов, что огра-
ничивает возможности их практического использования. 
В качестве природных твёрдофазных носителей используют целлюло-
зу, крахмал, агарозу (Аленкина Т.В.,  Данилина И.В., 2002)  и т.д.  Известны 
исследования по использованию в качестве матрицы сорбентов полисахарида 

 
40
-  хитина  (Бендекене  В.Г.  с  соавт., 1981); биосорбентов,  состоящих  из  фрак-
ции молочных белков - казеина, который обладает термостабильностью, спо-
собностью  связывать  воду,  коагулировать,  желировать;  микрокристалличе-
ской целлюлозы, являющейся неионогенным, гидрофильным полисахаридом 
(Кунижев  С.М. c cоавт.,  2002); полиакриламидного  геля,  обладающего  хи-
мической  стабильностью  и  инертностью,  прозрачностью,  лабильностью 
структуры,  устойчивостью  к  изменениям  рН  и  температуры,  нерастворимо-
стью в большинстве растворителей (Гавенский С. Д. с соавт., 1990, 1991; Га-
венский С.Д., Пушкарь В.Г., 1995; Подзолкова Г.Г. с соавт., 1988). Но данные 
препараты  имеют  недостатки,  связанные  с  длительностью,  многостадийно-
стью  их  получения  и  использованием  дорогостоящих  импортных  реактивов 
(Тюменцева И.С., 1996). В настоящее время широко применяются сорбенты 
на основе кремнезёма (Киселёв А.В., Кустова Т.Л.,  1976; Хохлова Т.Д., Гар-
кавенко Л.Г., Никитин Ю.С., 1991; Брыкалов А.В., 1991; Темишевская Л.Я., 
1995; Taylor D., 1972;  Marshall K., Ridgewee N., Simpson J.,1974; Snyder L.R., 
Kirkland J.J., 1979). Это связано с тем, что их матрица по своей геометриче-
ской  структуре  и  химическим  свойствам  хорошо  подходит  для  адсорбции 
биополимеров.  
           В настоящее время созданы различные иммобилизованные структуры: 
биоаффинные  адсорбенты  (Гайда  А.В.,  Староверов  С.М., 1989; Лисичкин 
Г.В., 1989; Гонтарь И.П. с соавт., 1996); иммобилизованные ферменты (Бры-
калов А.В. с соавт, 1982; Брыкалов А.В.,1993; Коваленко Г.А. с соавт., 2002); 
иммобилизованные лекарственные средства (Брыкалов А.В., Кобанкова А.Н., 
2002;  Герстунбергер  М.Р.  с  соавт, 2002; Кунижев  С.М.,  Аполохова  С.Ф., 
2002).  В  практической  деятельности  человека  находят  применение  иммоби-
лизованные клетки и антитела (Кузовлева А.А., Шаханина К.Л., 1982; Гавен-
ский С. Д. с соавт., 1991; Ефременко В.И., 1997; Лавриненко И.А., Костров-
ский  В.Г., 1997; Кислицын  Ю.В.,  Мешандин  А.Г., 2001; Lea T. et al., 1985; 
Cunliffe D. et al., 2000). При постановке иммуноанализов (Kriz K., Gerhrke J., 

 
41
Kriz D., 1998; Yu H., 1998; Tanaka T., Matsunaga T., 2001; Richardson J. et al., 
2001);  культивировании  микроорганизмов  (Владимцева  И.В., 2002; Hornung 
M., Ludwic M, Schmauder H.P., 2002) в  ряде  случаев  также  применяют  раз-
личные иммобилизованные системы. 
В качестве твёрдофазных носителей широкое распространение получи-
ли  кремнезёмы. Реакционную способность их можно существенно повысить, 
обрабатывая поверхность различными неорганическими и металлоорганиче-
скими  соединениями  (Рогожина  С.В.,  Варламов    В.П.,  Вальковский  Д.Г., 
1975;  Алесковский  В.В.,  Юффа  А.Я., 1989; Ходж  Ф., 1989; Ходж  Ф., 1989; 
Березин  В.Б.,  Лахтин  В.М.,  Ямсков  И.А., 1995; Chim C., Wold F.,  1974; 
Weetall H.H., Detor C.C., 1975), путём молекулярного наслаивания (Алесков-
ский  В.В.,  Юффа  А.Я., 1989), либо  подвергая  механическому  воздействию 
(растирание, дробление в среде модификатора) или облучению (γ и УФ). Ме-
тод  химического    модифицирования  кремнезёмов  с  целью  получения  функ-
циональных  органокремнезёмов  хорошо  изучен  и  позволяет  получать  сор-
бенты  с  требуемыми  свойствами.  Им  присущи  гидрофильность,  жесткость 
остова, химическая (Постнова А.М.,  Пак В.Н., Кольцов С.И., 1981) и микро-
биологическая устойчивость, каталитическая активность (Кольцов С.И., Але-
сковский В.Б., 1973), ненабухаемость в растворах, значительная адсорбцион-
ная емкость, отсутствие токсичности. Поверхность кремнеземных сорбентов 
содержит  большое  число  силанольных (SiOH) и  силоксановых  групп (Si-O-
Si) (Черкасов А.Н., Пасечник В.А., 1991).   
          Носители,  обладающие  магнитными  свойствами  и  предназначенные 
для  фиксации  на  них  биополимеров,  имеют  значительные  преимущества  по 
сравнению  с  немагнитными.  При  их  использовании  не  требуется  предвари-
тельного  концентрирования  исследуемых  проб  с  отделением  выявляемых 
микроорганизмов  от  контаминирующей  микрофлоры  и  других  примесей, 
возможность проведения индикации на качественно более высоком уровне. В 
результате использования магносорбентов,  способных осуществлять на себе 

 
42
селективное  концентрирование  микроорганизмов,  появляется  возможность 
исследования  проб  с  высокой  степенью  загрязненности,  неограниченных 
объемов, с  низкой  концентрацией  микроорганизмов  при высокой чувстви-
тельности  и  специфичности  метода  исследования  (Ефременко  В.И., 1997; 
Weimer B.C. et al., 2001). 
В качестве магнитных материалов в МС  обычно используются окис-
лы металлов Fe, Ni, Co (Пушкарь В.Г. с соавт.,  1984),  порошки этих окислов 
заключаются в микросферы, плёнки полимеров, гранулы. А.М. Тишин, Ю.И. 
Спичкин (2004) предлагают использовать магнитный сорбент, состоящий из 
гидрофобного полимерного связывающего компонента, состоящего из моче-
вино-формальдегидной  смеси  с  порофором  и  отвердителем,  алюмосиликат-
ного магнитного наполнителя и минерального масла. Г.Д. Елистратов, М.И. 
Волчанова, И.В. Малыгин с соавт. (2004)  предлагают способ получения сор-
бента из измельчённого углеродсодержащего сырья, представляющего собой 
древесные частицы или отходы переработки однолетних растений.  
            Специалисты Литовского института химии и химической технологии 
установили  возможность  иммобилизации  трипсина  на  магнитном  хитине. 
Сравнительное  изучение  свойств  нативного  и  магнитного  производных  хи-
тина показало, что "намагничивание" матрицы способствовало уменьшению 
набухаемости,  сохранению  адсорбционных  свойств  и  упрощению  процесса 
выделения и регенерации иммобилизованных препаратов трипсина в резуль-
тате применения внешнего магнитного поля (Бендикене В.Г. с соавт., 1995). 
          В связи с этим, МИС находят все большее применение в диагностике и 
обнаружении  возбудителей  различных заболеваний (Тюменцева  И.С., Еф-
ременко  В.И., Афанасьев Е.Н. с соавт., 1995; Ефременко В.И., 1997; Жарни-
кова  И.В., 2004), а  также  при  конструировании  специфических  сорбентов, 
используемых  при  лечении  некоторых  заболеваний  (Гонтарь  И.П.  с  соавт., 
1998; Базиков И.А., 2000). 

 
43
Расширение  областей применения магнитных носителей, с одной сто-
роны, способствует более детальному их изучению, с другой - предопределя-
ет  увеличение  числа  всевозможных  методов  их  получения  и  конструирова-
ние на их основе новых диагностических препаратов для детекции возбуди-
телей инфекционных заболеваний, обладающих высокой специфичностью и 
чувствительностью.   
Способность  отдельных  фосфолипидов  формировать  в  водной  среде 
при встряхивании  «пузырьки жира», представляющие собой жидкокристал-
лическую  мембрану,  в  полости  которой  и  снаружи  находится  водная  фаза, 
впервые  была описана в 1965 году А.Бенхемом с соавторами. Эти «пузырь-
ки»,  напоминающие  под  электронным  микроскопом  клетки,  получили  в 
дальнейшем название липосомы (бислойные липидные везикулы).  
К  настоящему  времени  разработаны  несколько  десятков  методов  по-
лучения липосом с включением в их внутренний объем или структуру мем-
браны  различных  по  природе  и  физико-химическим  параметрам  веществ, 
обеспечивающих при необходимости высокий процент их иммобилизации, а 
также  эффективные  способы  отделения  липосом  от  несвязавшихся  компо-
нентов,  методы  их  стерилизации  и  стабилизации,  позволяющие  сохранять 
целостность  мембран  липидных  везикул  относительно  длительное  время  в 
различных реакционных средах и биологических системах. При этом, гидро-
фильные  вещества  фиксируются  во  внутренний  объем  липидных  везикул,  а 
гидрофобные – в их мембрану. 
Возрастающий интерес к липосомам обусловлен совокупностью их фи-
зико-химических и биологических свойств. Их химическая инертность, уни-
версальность,  отсутствие  токсичных,  антигенных  свойств,  доступность  сы-
рья, простота включения лигандов и т.д. открывают возможности получения 
диагностических  препаратов  нового  поколения  с  сохранением    физико-
химических и иммунологических свойств включаемых в липосомы веществ.  

 
44
В качестве маркера, включаемого во внутренний объём бислойных ли-
пидных  везикул,  используют  красители,  флуорохромы,  ферменты,  радиоак-
тивные  вещества,  углеводы  и  т.д.,  которые  регистрируют  соответствующим 
методом по мере появления их в анализируемой смеси после выхода из липо-
сом  (Власова  Г.С.,  Салов  В.Ф.,  Торчилин  В.П.  с  соавт., 1982; Закревский 
В.И.,  Подзолков  В.В.,  Мельников  В.А., 1983; Закревский  В.И., 1985; Остро 
М.Д., 1987; Сюнамото  Дзюдзо,  Акиёси  Кадзунари,  Сато  Тосинори, 1989; 
Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И. с соавт., 1990; Ревенко Л. 
Г., Ротов К.А., Васильев В.П. с соавт., 1990; Ротов К.А., Климова И.М., Ва-
сильев  В.П.  с  соавт., 1992; Литчфилд  У.Д.,  Фрейтаг  Д.У., 1998; Ефременко 
В.И.,1999; McDougall I.R., Dunnick J.K., McNamee M.G. et al., 1974; Leserman 
L.D.et al., 1984; Sunamato J. et al., 1987; Flechtner M.D. et al., 1990). 
Иммобилизованный в липосомы материал  оказывается защищённым 
липидной мембранной от действия неблагоприятных факторов внешней сре-
ды,  благодаря  чему  увеличивается  срок  его  годности (Mарголис  Л.Б.,  Бер-
гельсон Л.Д., 1986; Mарголис Л.Б., 1987; Liposomes, 1980; Liposomes, 1988). 
При этом в липосомы возможно включение маркёров, которые в своей 
молекуле не содержат функциональные группы, необходимые для ковалент-
ного присоединения к различным биополимерам, что зачастую является обя-
зательным  при  использовании  других  диагностических  методов  исследова-
ния.  Благодаря  этому  чрезвычайно  расширяется  круг  используемых  маркё-
ров, включаемых в липосомальные диагностические препараты.  Высокая же 
чувствительность  липосомальных  диагностических  систем  достигается  тем, 
что  в  липидные  везикулы  удаётся  фиксировать  значительное  количество 
маркёра. 
Способность  липосом  с  иммобилизованным  на  их  поверхности  одним 
из  фрагментов  реакции  «антиген-антитело»  специфически  фиксировать  не-
достающий компонент и в присутствии сывороточного комплемента, подоб-
но  некоторым  клеткам  микроорганизма,  нарушать  целостность  своей  мем-

 
45
браны с высвобождением заключённого во внутренний объём везикул маркё-
ра используется при разработке высокочувствительных диагностических ме-
тодов  комплемент-зависимого  иммунного  лизиса  липосом.  Данная  реакция 
позволяет  обнаруживать  в  исследуемых  объектах  специфические  гаптены, 
антигены, антитела или комплемент. 
Реакция на основе иммуноанализа липосом (LILA-liposome immune ly-
sis assay), получившая название липосомальный анализ (ЛИА), может осуще-
ствляться как в прямом, так и в конкурентном вариантах. По простоте реги-
страции и возможности автоматизации она не уступает традиционным мето-
дам, а по чувствительности и быстроте ответа превосходит обычные радио-
иммунный  и  иммуноферментный  анализы  (Ясуда  Такудзи, 1986; Литчфилд 
У.Д., Фрейтаг Д.У., 1998; Сюнамото Дзюдзо, Акиёси Кадзунари, Сато Тоси-
нори, 1989;  Ефременко  В.И.,1999; Vistnes A.I., 1984; Connor J. et al., 1985; 
Monrroe D., 1986 a; 1986 б; Jou Yi-Her et al., 1990). 
В  ряде  случаев  маркёры  иммобилизируют  на  поверхности  мембраны 
липосом. Иммобилизация ингредиентов иммунологической реакции (антиге-
нов и антител) с липидной мембранной липосом представляет определённую 
трудность  в  связи  с  её  гидрофобной  природой.  Описаны  различные  методы 
ковалентного связывания белковых молекул с наружной поверхностью липо-
сомальной мембраны: посредством глутарового альдегида, перйодата натрия, 
галактозидазы (Chua M.M. et al., 1987; Yu B.S. et al., 1987). Образующиеся 
альдегидные группы связывали с поверхностью липосом посредством пред-
варительно  введённых  гидразидных  групп.  Такой  способ  позволяет  связы-
вать до 60 % добавленного в реакцию модифицированного белка (Владимце-
ва И.В., 2002). 
        Иммобилизация рецепторных молекул гидрофобной природы, например, 
ганглиозидов, не представляется методически трудной, поскольку включение 
осуществляется  путём  совместного  озвучивания  в  процессе  приготовления 
липосом (Moss J., Fishman P.H.,Richards R.L. et al.,1976 Masserini M., Sonnino 

 
46
S., Giuliani A., Tettamanti G. et al., 1984; Umeda M., Kanda S., Nojina S. et al., 
1984).  
       В качестве твёрдой фазы при проведении липосомального иммуноанали-
за  используют  наносимые  на  твёрдую  поверхность  мазки  из  зева,  содержа-
щие  β-гемолитический  стрептококк  группы  А (Gerber M.A. et al., 1990), а 
также  пластиковые  пробирки,  полимерные  микроплаты,  диски  нитроцеллю-
лозной  бумаги,  стеклянные  бусы,  покрытые  различными  специфическими 
иммуноглобулинами. 
Дополнительные  преимущества  данный  метод  приобретает  при  ис-
пользовании  твёрдофазных  магнитных  сорбентов,  позволяющих  легко  сепа-
рировать компоненты реакционной системы в магнитном поле и эффективно 
регистрировать анализируемые вещества. С помощью данного метода выяв-
ляют различные микроорганизмы и их антигены. В этом случае на магнитные 
сорбенты вначале фиксируют исследуемый материал за счёт специфической 
реакции  «антиген-антитело»,  а  затем  липосомы.  Освобождение  маркёра, 
включённого в бислойные липидные везикулы, с последующей его количест-
венной регистрацией осуществляют в присутствии органических растворите-
лей,  поверхностно-активных  и  других  веществ,  воздействием  повышенной 
температуры, приводящих к лизису липидных мембран, после того, как  не-
связавшиеся с твёрдой фазой компоненты реакции удаляются, а липосомы за 
счёт специфических реакций остаются фиксированными на твёрдой поверх-
ности (Ефременко В.И., 1999). 
К.А. Ротовым с соавт. (1992)  продемонстрирован метод обнаружения 
чумного микроба с использованием магнитных полиакриламидных гранул и 
радиоактивной  метки,  включённой  в  липосомы,  на  поверхности  которых 
фиксировали  иммуноглобулины.  Метод  позволил  выявлять  возбудитель  чу-
мы в концентрации 10 3 м.к./мл и 10 пг/мл фракции I чумного микроба. 
И.В.  Владимцевой (2002) разработаны  биотехнологические  аспекты 
конструирования  диагностических  тест-систем  на  основе  МИС  и  люминес-

 
47
цируюших липосом, позволяющих выявлять 0,6+0,014 мкг чумных иммуног-
лобулинов и 15 нг/мл холерного энтеротоксина.    
Из проведённого анализа литературных данных следует, что в настоя-
щее  время  используется  небольшое  количество  экспресс-методов,  позво-
ляющих выявлять микобактерии туберкулёза. Для достоверной диагностики 
туберкулёза рекомендовано  проводить комплексное обследование больных с 
использованием нескольких методов, так как ни один из существующих ана-
лизов не может подтвердить диагноз  во всех случаях болезни. Многие реак-
ции  громоздкие  и  сложные,  а  методы  их  постановки  малорезультативны.  В 
связи с этим продолжается поиск универсальных методов выявления тубер-
кулезных  антигенов  и  антител,  замена  существующих  рутинных  тестов  на 
современные, высокоэффективные способы.  

 
48
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 
          2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу 
В  работе  использованы  штаммы  микроорганизмов,  характеристики  которых 
представлены в таблице 1.  
          2.2. Питательные среды, условия культивирования микроорганизмов  
Выращивание туберкулёзных  и близкородственных микобактерий M. tu-
berculosis humanus, M. вovis, M. аvium, M. кansasii, М. intracellulare проводили  
при  температуре 37  0С  в  течение 30 дней  на  яичной  среде  Лёвенштайна-
Йенсена. Выращивание гетерологичных культур Nocardia brasiliensis проводи-
ли  при температуре 37  0С в течение 3 дней на мясопептонном агаре; Brucella 
melitensis, Brucella abortus и Brucella suis - при температуре 37  0С в течение 3 
дней на печёночном агаре, Salmonella typhi -   при температуре 37  0С в течение 
2 дней на   среде Эндо; Streptococcus, Staphylococcus - на кровяном агаре  при 
температуре 37  0С в течение 2 дней; Listeria monocytogenes -  при температуре 
37  0С в течение 3 дней на глюко-глицериновой среде. 
 Штаммы  микобактерий туберкулёза, полученные из ГИСК им. Л.А. Та-
расевича, засевали на среду Лёвенштайна-Йенсена и выращивали при темпера-
туре 37 0С в  течение  1 месяца, контролируя посевы каждые 10 дней (визуаль-
ный контроль и микроскопия c окраской по методу Циля-Нильсена и флуоро-
хромом - аурамином). Из биохимических тестов применяли ниациновую пробу 
Конно  (по  методике,  описанной  в  работе  Воробьёва  А.А.,  Кривошеина  Ю.С., 
Широбокова В.П., (2003), основанную на способности МТБ в отличие от дру-
гих микобактерий индуцировать ниацин).  Для посева в широкие пробирки ис-
пользовали культуру, смытую 0,9 % раствором хлорида натрия,  которую  ин-
кубировали  в  течение 1 месяца при температуре 37 0С, смывали 0,9 % раство-
ром натрия хлорида и обеззараживали холодным (минус 20 0 С) ацетоном.  
У МТБ отсутствует наружная мембрана, как у Грам «+» бактерий.  
 
 

Таблица 1. Характеристика штаммов микроорганизмов, использованных в работе 
 
№№  Наименование микроор-
Характеристика штаммов 
пп 
ганизмов и обозначение  морфологические и 
культуральные свойства 
Биохимические свойства 
штамма 
тинкториальные 
свойства 
1 2 



1. 
M. tuberculosis humanus 
Полиморфные  тонкие   На  плотной  яичной  среде,  со- Восстанавливают  нитраты.  Спо-
Н 37 RA 
спирто- 
и 
кислото- держащий  глицерин,  при  тем- собны  к  образованию    кислой 
устойчивые 
палочки,  пературе 37-38 0С  дают  пыш- фосфотазы,  β-эстеразы,  уреазы, 
изогнутые, 
лежащие  ный  рост  колоний  через 10-20  пиразимидазы. 
Аккумулируют 
под углом друг к другу  сут  в  виде    шероховатых R- ниацин.  
и  образующие  скопле- колоний,  но  могут  быть  глад-  
ния. Неподвижны, спор  кие,  сливающиеся  между собой 
не  образуют,  лишены  (S  вариант),  имеют  кремовый 
капсулы. 
оттенок.  На  жидкой  питатель-
ной среде растут в виде морщи-
нистой грубой плёнки, а иногда 
наблюдается  придонный  крош-
коватый рост. 
2. 
  BCG 
Полиморфные  тонкие   На  плотной  яичной  среде,  со- Не 
восстанавливают 
нитраты. 
спирто- 
и 
кислото- держащий  глицерин,  при  тем- Способны  к  образованию    кислой 
устойчивые 
палочки,  пературе 37-38 0С  дают  менее  фосфотазы,  β-эстеразы,  уреазы. 
изогнутые, 
лежащие  пышный  рост  колоний,  чем  M.  Пиразимидазу  и  ниацин  не  акку-
под углом друг к другу  tuberculosis humanus. Через 10- мулируют. 
и  образующие  скопле- 20  сут   вырастают  в  виде   мел-  
ния. Неподвижны, спор  ких гладких, влажных колоний, 
не  образуют,  лишены  имеющих белый или сероватый 
капсулы. 
цвет.  На  жидкой  питательной 
среде  образуют  более  тонкую 
плёнку,  чем  M. tuberculosis hu-
manus


Продолжение таблицы 1 
 
 
1 2 




M. аvium  D4 ER 
Тонкие  кислотоупор- Колонии  в  виде  приподнимающихся  над  Не  восстанавливают  нитраты. 
ные  палочки,  более  поверхностью  среды  "лепёшечек",  или  в  Способны  к  образованию  β-
длинные  и  полиморф- виде "бубликов". Рост появляется к концу  эстеразы, пиразимидазы. Не об-
ные 
в 
мазках- 1-го месяца, иногда позднее; при пересе- разуют 
кислую 
фосфотазу, 
отпечатках из органов  вах - к  концу 7-10 дня.  В  субкультурах  уреазу.  Ниацин  не  аккумули-
заражённых  кур,  мы- растут  гладким,  влажным  налётом.  В  руют. 
шей  или  кроликов.  жидкой  среде  дают  помутнение.  Культу-  
Неподвижны,  спор  не  ры  лучше  растут  при 43-450С.  Пассиро-
образуют, 
лишены  ванные культуры могут давать также хо-
капсулы. 
роший  рост  при 370С,  иногда-  при 220С. 
Колонии кремоватого цвета, но возможно 
и  более  интенсивное  окрашивание  их  в 
жёлтый цвет.  
 
4. 
M. кansasii Yoss 
Фотохромогенные 
На яичной среде растут в виде шерохова- Восстанавливают 
нитраты. 
 
микобактерии 
уме- тых  или  гладких  колоний,  температур- Способны  к  образованию    ки-
ренной длины. Непод- ный оптимум роста 370С.   
слой  фосфотазы,  уреазы,  пира-
вижны,  спор  не  обра-
зимидазы.  Не  образуют  β-
зуют,  лишены  капсу-
эстеразы.  Не  аккумулируют 
лы. 
ниацин.  
 
5. 
М. intracellulare #23 
Нефотохроматоген-
Дают  рост    на  среде  Левенштейна- Не  восстанавливают  нитраты. 
ные  палочки  средней  Йенсена  в  виде  непигментированных  ко- Способны  к  образованию  β-
длины.  Неподвижны,  лоний при 370С и 450С. 
эстеразы, пиразимидазы. Не об-
спор  не  образуют, 
разуют 
кислую 
фосфотазу, 
лишены капсулы. 
уреазу.  Ниацин  не  аккумули-
руют. 
 
 

Продолжение таблицы 1 
 
1 2 



6. 
Nocardia brasiliensis 
Клетки  кислотоустой- Хорошо  растут  на  мясопептонном  агаре,  Ферментируют  с  образованием 
чивые,  прямые  или  мясопептонном  бульоне  с  глюкозой,  ага- кислоты  без  газа  глюкозу, 
изогнутые  с  частым  ре  Сабуро  при  температуре 370С.  На  мальтозу.  Не  образуют  индола. 
ветвлением.  Диаметр  твёрдых средах на 2-3 сут образуют мел- Белки  ферментируют  с  образо-
нитей – 0,3-1,3 мкм.  
кие гладкие влажные колонии тестоватой  ванием  сероводорода.  Разлага-
Грамположительные в  консистенции, через 72  ч их поверхность  ют  казеин,  тестостерон,  эску-
патологическом  мате- становится исчерченной  и петлистой. На  лин.  Способны  к  образованию  
риале, 
Грам- жидких средах первоначально появляется  кислой фосфотазы, β-эстеразы и 
отрицательные  в  ста- тонкая  прозрачная  плёнка,  постепенно  уреазы. 
рых культурах. 
плёнка  становится  кремово-жёлтого  цве-
та и достигает краёв пробирки. 
 7-9 
Brucella melitensis 565,  Мелкие  коккобакте- Строгие  аэробы.  Наилучшая  питательная  Не  разжижают  желатину,  не 
16-М, Rev-1 (вакцинный)  рии, величиной 0,3-0,5  среда –печёночный  бульон или агар. Для  расщепляют  белков,  не  образу-
мкм.  Неподвижны,  не  бруцелл характерен медленный рост пер- ют  сероводород.  Тионин  и  ос-
образуют  спор.  Кра- вых генераций от 20 до 30-35 дней. Лабо- новной фуксин 1:25 000 не ока-
сятся  всеми  анилино- раторные  культуры  вырастают  через 2  зывают  бактериостатического 
выми  красками,  грам- сут. На агаре при рН среды 6,6-7,4 и тем- действия.  Окисляют  аланин, 
отрицательные. 
пературе 37 0С  образуют  круглые,  вы- аспарагин,  глутаминовую  ки-
пуклые,  гладкие,  блестящие,  гомогенные  слоту, глюкозу, эритрит. 
или  нежнозернистые  колонии.  На  бульо-
не  формируют  помутнение.  Не  лизиру-
ются бактериофагом «ТБ». 
 10-12  Brucella abortus 544, 345,  Мелкие  коккобакте- Первые генерации требуют повышенного  Не  разжижают  желатину,  не 
19-BA (вакцинный) 
рии, величиной 0,3-0,5  содержания в атмосфере СО2. При после- образуют  индола,  не  свертыва-
 
мкм.  Неподвижны,  не  дующих  пересевах  СО2  –зависимость  те- ют  молоко,  не  расщепляют  уг-
 
образуют  спор.  Кра- ряется. В остальном культуральные свой- леводов, ферментируют белки с 
сятся  всеми  анилино- ства аналогичны B.melitensis. Лизируются   образованием  аммиака  и  серо-
выми  красками,  грам- бактериофагом “ТБ”.  
водорода.  Основной  фуксин 
отрицательные. 
1:25 000 не  задерживает  роста; 
тионин 1:25 000 действует  

Продолжение таблицы 1 
 
1 2 



 
 
 
 
бактериостатически. Окисляют 
аланин, аспарагин, глутамино-
вую кислоту, арабинозу, галак-
тозу, рибозу, глюкозу,  эритрит. 
13-15  Brucella suis 1330, 508, 6  
Мелкие  коккобакте- Строгие  аэробы.  На  агаре  и  бульоне  на  Биохимическая активность не-
рии, величиной 0,3-0,5  2-3  сут  дают  типичный  для  бруцелл  значительна. Не образуют ин-
мкм.  Неподвижны,  не  рост.  Не  лизируются  бактериофагом  дола, не разжижают желатину, 
образуют  спор.  Кра- «ТБ». 
не свёртывают молоко. Тионин 
сятся  всеми  анилино-
1:25 000 не оказывает влияния 
выми  красками,  гра-
на рост м.к., основной фуксин 
мотрицательные. 
1:25 000 действует бактерио-
статически. Окисляют глутами-
новую кислоту, рибозу, глюко-
зу, эритрит, ксилозу, аргинин. 
16-17  Salmonella typhi 818, 4446 
Небольшие  грамотри- Факультативные  анаэробы.  Хорошо  Желатин не разжижают, индол 
цательные 
палочки.  растут  на  средах  с  мясным  экстрактом  не образуют, продуцируют се-
Подвижны,  имеют  пе- при температуре 37 0С (рН 7,2). На сре- роводород. Молоко не свёрты-
ритрихиальные  жгу- дах Плоскирева, Левина и Эндо – коло- вают. Ферментируют с образо-
тики.  Кислотолабиль- нии  прозрачные,  бесцветные  или  голу- ванием кислоты  глюкозу, ман-
ные. Спор и капсул не  боватые;  на  висмут-сульфитной  среде-  нит, мальтозу, левулезу, галак-
образуют. 
колонии чёрные или чёрные со светлым  тозу, раффинозу, декстрин, 
ободком, блестящие. 
глицерин, сорбит. Восстанавли-
вают нитраты в нитриты. 
18 
Streptococcus faecalis 
Грамположительные 
Растут  на  сывороточных  средах  и  на  Разлагают  с  образованием  ки-
 
кокки.  Расположены  кровяном  агаре.  Образуют  округлые,  слоты    лактозу,  маннит,  глице-
 
цепочками,  спор  не  мелкие,  блестящие  с  ровным  краем  ко- рин, салицин. 
образуют. 
лонии,  окружённые  зоной  гемолиза. 
 
При  росте  на  жидких  питательных  сре-
дах  культуральная  среда  остаётся  про-
зрачной, на дне формируется осадок. 

Продолжение таблицы 1 
1 2 



19-20  Staphylococcus epidermidis, Грамположительные 
Факультативные  анаэробы,  лучше  раз- Ферментируют  углеводы  с  об-
Staphylococcus aureus 
кокки. При размноже-
виваются  в  аэробных  условиях.  На  по- разованием  кислоты.  Расщеп-
АССТ 25923 
нии образуют скопле-
верхности  плотных  питательных  сред  ляют  маннит,  образуют  H2S,  не 
ния в виде гроздьев 
образуют  круглые,  выпуклые,  пигмен- образуют  индол,  медленно  раз-
винограда. 
тированные колонии с ровными краями;  жижают желатину. 
в жидкой среде формируется равномер-
ное помутнение. 
21-27  Listeria monocytogenes  1 –
Небольшие 
грампо- Аэробы. Растут при температурах от 4 до  Желатину,  казеин  и  молоко  не 
7 серотип 
ложительные  кокко- 38 0С, оптимальные показатели рН среды   гидролизуют. Не ферментируют 
видные  палочки.  Об- 7,0-7,4. На агаре – мелкие, 1-1,5 мм коло- маннит,  дульцит,  арабинозу. 
разуют цепочки из 3-5  ни  в  виде  колечек.  Колонии  круглые,   Сбраживают  с  образованием 
и более клеток. В маз- имеют  перламутровый  оттенок,  полупро- кислоты  без  газа  глюкозу  сали-
ках  из 18-24-часовых   зрачные.  Имеются  также  колонии  пере- цин,  маннозу.  Редуцируют  ме-
колоний  обнаружива- ходные, шероховатые, с неровными края- тиленовую синьку. Не образуют 
ется  типичная  дифте- ми  и  бугристой  поверхностью.  На  печё- индол, сероводород, аммиак. Не 
роидно-палисадное 
ночных,  глюкозных,  глицериновых  сре- восстанавливают нитриты 
расположение  с  не- дах формируют пышный рост. При росте 
большим  количеством  на  мясо-пептонном  бульоне  образуют 
V  и  Y-образных  равномерную муть, переливающуюся при 
легком  встряхивании  в  виде  муаровых 
форм.  Подвижные,  с  волн. На 5-7 день появляется на дне сли-
перитрихиальными 
зистый осадок.  
жгутиками,  если  вы-
ращены  при  темпера-
туре 20-25 0С.  При 
выращивании 
при 
температуре 37 0С 
имеют один полярный 
жгутик.  Не  кислото-
устойчивы.  Не  обра-
зуют спор и капсул. 
 

 
54
Основными структурными компонентами клеточной стенки туберкулёз-
ных микобактерий являются пептидогликан,  полимер N-ацетилглюкозамин и N 
–ацетилмурамовая кислота. ЛПС представлены арабиногалактаном. Миколовая 
кислота  играет  важную  роль  в  кислотоустойчивости  бактерий,  определяя  пер-
вую  линию  защиты  от  неблагоприятных  условий (Heifets L.B, Jenkins P.A. 
1998).   
  2.3. Объекты исследования 
Для работы использовался материал  (моча и мокрота) от больных тубер-
кулёзом  лёгких,  почек,  мужских  половых  органов,  глаз,  предоставленный  со-
трудниками  Краевого  клинического  противотуберкулёзного  диспансера 
(ККПТД). 
  2.4.  Получение антигенных комплексов микроорганизмов 
  Водорастворимые  антигены  изолировали  комплексным  методом:  водно-
солевой экстракцией и дезинтеграцией микроорганизмов  (Афанасьев Е.Н.,  Та-
ран И.Ф.,  Тюменцева И.С., 1986; Василенко Н.Ф. с соавт., 1988). Экстракцию 
проводили 2,5 % раствором NaCl. Дезинтегрирование  осуществляли  разруше-
нием под высоким давлением в Х-прессе (Швеция) и ультразвуковым методом 
на аппарате УЗДН - 2Т (Россия) при частоте колебаний 22 и 44 кГц в течение 20 
мин при температуре 0-4 0С. О степени разрушения микробных клеток судили  
по  изменению оптической плотности,  которую регистрировали фотоэлектро-
колориметрически (ФЭК-4,  зеленый светофильтр) по количеству белка в надо-
садочных жидкостях,  полученных центрифугированием при 20000 g в течение 
30 мин, и микроскопически. 
2.5.  Лабораторные животные, использованные в экспериментах  
В опытах были  использованы: 
1.  34 кролика обоего пола породы «Шиншилла»,  массой 3-3,5 кг; 
2.  30  беспородных белых мышей, массой 18-20 г; 
3.  15 морских свинок, массой 250-300 г; 

 
55
Кроликов,  мышей  получали  из  питомника  Ставропольского  научно-
исследовательского  противочумного  института  и  после  карантинизации  ис-
пользовали  в  опытах.  В  процессе  содержания  животных  поддерживали    реко-
мендуемый режим питания согласно приказу МЗ РФ № 1179 (М.,1983). 
 Все  процедуры  на  экспериментальных  животных  проводили  согласно 
рекомендациям В.В. Карпенко, В.И. Сачков (1985).  
2.6.  Методы иммунизации животных 
       Иммунизацию проводили по схеме,  разработанной И.С.Тюменцевой (1994) 
и Е.Н.Афанасьева (2000). В качестве иммуномодуляторов использовали ферак-
рил, тималин, циклофосфан.  
2.7. Методы контроля антигенов и сывороток                   
Постановку  реакции  радиальной иммунодиффузии проводили по О.Оух-
терлони (1949) на предметных стёклах или в чашках Петри в 1% агаровом геле. 
Анализ антигенного состава туберкулёзного микроба проводили согласно 
методикам, описанным в книге Г.Фримеля (1987).  
        Контроль титра специфических антител в сыворотках определяли в НРИФ 
по T.H.Weller, A.H.Coons (1954).  Микроскопию  препаратов  осуществляли  в 
падающем  отраженном свете в люминесцентном микроскопе серии "Люмам", 
используя  соответствующие  фильтры  согласно    инструкции  по  эксплуатации 
прибора.  За положительный результат принимали яркую (4+,3+) флуоресцен-
цию периферии  микробных  клеток.   
2.8.  Выделение иммуноглобулинов  
Для осаждения иммуноглобулинов применяли сульфатный метод  (Руса-
нов  В.М.,  Скобелев  Л.И., 1980), метод  фракционирования  белковых  смесей  с 
использованием  высоко-молекулярного,  незаряженного, линейного  полимера - 
полиэтиленгликоля  (ПЭГ-6000)  по A.Polson и  др. (1964), а  также  каприловой 
кислоты (Steibuch G., Andran R.,  1969).  
 
 

 
56
2.9.  Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов 
         Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кисло-
той (Steibuch G., Andran R., 1969),  с ФИТЦ (C21H11NO5S) фирмы «Sigma» про-
водили по X.Шторц (Stortz, 1987). Прямой метод окраски препаратов осущест-
вляли по A.H.Coons, M.H. Kaplan (1950).  
2.10. Получение и контроль липосом 
       Фосфолипиды,  из  которых  конструировали  липосомы,  выделяли  из  мозга 
к.р.с. и свиней путём экстракции  смесью хлороформ-этанол в соотношении 2:1. 
После фильтрации раствора фосфолипиды осаждали добавлением 1,5-2,0 объё-
мов ацетона. Состав липидов определяли по методике, описанной в книге  М. 
Кейтс (1975)  с  помощью  тонкослойной  хроматографии  на  пластинах  «Силу-
фол». Формирование липосом  и определение их размеров контролировали  на 
электронном микроскопе Hol (Япония) JEM – 100SX.   
2.11. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов  
         Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окис-
ления  по  Р.К.Nakane,  А.Kawaоi (1974) в  модификации  Е.А.Ткаченко    с  соавт.  
(1982).   
Рабочий  титр  и  специфическую  активность  конъюгатов  определяли  по 
методике M.Clark и A. Adams (1977) в “сэндвич”-варианте ИФА. 
2.12. Физико-химические методы 
Количественное  определение  белка  проводили  по  методу O.Warburg  и  
W.Christian (1941) сравнением спектра  поглощения белков при длине волн 280 
и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989). 
Спектр  поглощения  микробных  антигенов  определяли  на  спектрофото-
метре «Specord» (ГДР) при длине волн λ 210-300 нм. 
Очистку  конъюгатов  от  непрореагировавшего  флуорохрома  осуществля-
ли методом восходящей хроматографии на бумаге (Носков Ф.С., 1985). 

 
57
           Определение  растворимости,  цветности,  прозрачности  проводили  визу-
ально  в  соответствии  с  методикой,  описанной  в  ГФ  СССР,  ХI 
изд.,т.1,стр.194,195 и МУК 4.4/1.2.588-96,с.118.  
Контроль  потери  в  массе  при  высушивании  проводили  в  соответствии  с  
методикой, описанной в МУК 4.1/4.2.588-96, с.116. 
Микроструктуру поверхности магносорбентов (МС) определяли по мето-
ду, описанному в работе Д.Фрайфелдера (1980). Удельная поверхность МС оп-
ределялась  по    методу    А.А.Клячко-Гурвича  (1961),  основанному  на  низко-
температурной адсорбции азота.  Суммарный объем  и  радиус пор МС опреде-
лен по  методу Н.В.Кельцева (1984). 
2.13. Иммунохимические методы анализа 
Анализ  антигенного  состава  микроорганизмов  и  качества  полученных 
иммунных  сывороток  проводили  в  реакции  иммунодиффузии  в 1 % агаровом 
геле (Difco, USA) по O. Ouchterlony (1949). 
Очистку  иммунопероксидазных  конъюгатов  от  несвязавшихся  иммуног-
лобулинов и фермента проводили на хроматографической колонке фирмы LKB, 
используя сефадекс G-100. 
Для  иммуноэлектрофореза  использовали 1 % агар  Дифко  на  веронал-
мединаловом буфере, рН 8,6, ионная сила 0,05. Для проведения электрофореза 
использовали  комплектную  систему  для  горизонтального  электрофореза 
«Мультифор» LKB. Электрофорез  проводили  в  течение 100-120 мин  и  напря-
женности электрического поля 6 вт/см2. 
2.14. Лиофилизация биологического материала 
 Лиофилизацию    препаратов  проводили  в  камере LZ-9c (Чехословакия). 
Готовые препараты разливали в ампулы, замораживали  в  низкотемпературном  
столе   LZ-28О/75   при температуре минус (45 ± 5) 0С не менее 18 ч и высуши-
вали в сушильной  камере под  вакуумом.  
 
 

 
58
2.15.  Характеристика  реагентов,  используемых  для  получения      магноим-
муносорбентов 
             В    качестве  основной  матрицы  при  конструировании  МС  использовали   
алюмосиликат  (ТУ 6-09-01-356-76), представляющий  собой  тонкодисперсный 
продукт, содержащий в своем составе двуокись кремния, алюминия (насыпная 
плотность – 320 кг/м3; влажность при температуре 110 0С (массовая доля) – 3,5 
%; содержание SiO2 - 85-90 %; содержание Cl в пересчёте на NaСl- 0,2 %, со-
держание SO  3–0,6 %).   
        Модификаторами  сорбентов      являлись      декстран      (полиглюкин)-
полисахарид,  состоящий    из    остатков  глюкозы,  соединенных 1,6-гликозид-
гликозными  связями.  Молекулярная    масса    декстрана 0,5х10 9.  В  работе  ис-
пользован  препарат  декстрана,  выпускаемый  комбинатом  медпрепаратов 
"Красноярск";  магнитный порошок-III окись  железа ГОСТ 4173-77 ч.д.а. с со-
держанием  основного  вещества 98,7 %; натрий  перхлорат-  ТУ 6-09-3582-74 с 
содержанием  основного  вещества 98,0 %, вторичный  алкилсульфат    натрия - 
ТУ 38-10719-77. 
2.16. Методы математической и статистической обработки материалов 
          Для подтверждения воспроизводимости и достоверности результатов, по-
лученных  при  исследовании,  применяли  статистические  методы  (Тамбовцев 
Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П., 1969; Скуч Д.,  Уэст Д.,  1979).  
         Математическую  обработку  результатов  экспериментов    проводили    на 
компьютере  (программа EXCEL).  Расчет  значения  средней  квадратичной 
ошибки  отдельного  измерения (S), выборочной  дисперсии (S2),  вероятного 
квадратичного  среднеарифметического  отклонения  (Е 0,95),  проводили  по  фор-
мулам: 
            i=n                                i=n 
           ∑                             ∑ 
 S = √  i=1  (Ci - C) 2   ;  S 2 = i=1 (Ci - C)2     ;   E =   t x s 
                 n - 1                               n - 1                        √ n   ,   где 
Ci –  измерение опыта; (Ci - C) – разность между измерениями; 
t - 4,3 при двух степенях свободы с  доверительной  вероятностью 0,95. 

 
59
ГЛАВА 3. Получение высокоактивного специфического биологического 
сырья (антигенов и антител) для конструирования диагностических 
препаратов 
3.1. Получение антигенных комплексов микобактерий туберкулёза 
Для получения качественных иммунных сывороток, применяемых при 
производстве  туберкулёзных  диагностических  препаратов,  необходимы  ак-
тивные  антигенные  комплексы,  используемые  при  иммунизации.  Характер-
ным для МТБ является наличие большого количества липидов в цитоплазме. 
Липиды микобактерий подразделяются на свободные и гликолипиды. Проч-
но  связанные  липиды  обуславливают  кислотоустойчивость  микобактерий, 
при удалении их из клетки микобактерии теряют возможность вызывать ги-
перчувствительность замедленного типа и резистентность к туберкулёзу (Ги-
затулина  Н.М., 1996). Миколовые  кислоты  микобактерий  характеризуются 
содержанием  значительно  большего  числа  атомов  углерода  в  цепи  (С60-90), 
чем у нокардий (С32-60), и при пиролизе освобождают жирные кислоты с  чис-
лом атомов С22-26. Установлено, что вирулентные виды микобактерий содер-
жат  значительное  количество  фтиеновых  кислот  и  воска  фтиоцеролдимико-
церозата, что не характерно для нокардоподобных бактерий. Только у мико-
бактерий  обнаружен  необычный  тип  липополисахарида,  состоящий  из  Д-
глюкозы, 6-0- метилглюкозы и 3-0-метилглюкозы. На содержание и структу-
ру  тех  или  иных  химических  компонентов  в  клетках  могут  оказывать  влия-
ние  состав  питательной  среды,  на  которой  выращивается  микроорганизм,  и 
температура  его  культивирования.  Известны  данные  о  том,  что  содержание 
фосфолипидов зависит от возраста и условий культивирования МТБ, от ме-
тодов, используемых для их обнаружения (Андреев Л.В., 1997).    
Нами  проведены  исследования  по  подбору  эффективных  способов  из-
влечения  специфических  антигенов  из  бактериальных  масс  МТБ,  обладаю-
щих необходимыми физико-химическими и иммунологическими свойствами. 
Для этого использовали штаммы, представленные в таблице 1.  

 
60
        Водорастворимые  туберкулёзные  антигены  изолировали  комплексным 
методом: последовательно водно-солевой экстракцией, механической и ульт-
развуковой дезинтеграцией. О степени разрушения микробных клеток суди-
ли    по    изменению  оптической  плотности,  которую  регистрировали  фото-
электроколориметрически и по количеству белка в надосадочных жидкостях,  
полученных  центрифугированием  при 20000 g в  течение 30 мин,  а  также 
микроскопически с помощью биологического микроскопа.  
Кроме водно-солевой экстракции нами использован дополнительно ме-
тод дезинтеграции в связи с тем, что в основе широко используемых физиче-
ских  методов  дезинтеграции  лежит  механизм  высокоградиентных  течений 
жидкости.  Под    воздействием    ультразвуковых    волн  наступает  разрушение 
клеток  микробов,  а  изменения  в  структуре  химических  веществ,  находя-
щихся в них, происходят гораздо медленнее,  что обеспечивает возможность 
получения различных  активных комплексов,  близких  к  нативным.  
Технология получения водорастворимых  антигенов: 
     I стадия. Экстрагирование раствором хлорида натрия и фракционирование 
сернокислым аммонием. 
Бакмассы  микобактерий,  обеззараженные  и  высушенные  ацетоном,  
экстрагировали  в 5-10 объёмах 2,5 % раствора  хлорида  натрия.  После  цен-
трифугирования  при 20 000 g в  течение 30 мин    супернатант  отделяли  от 
осадка.  Для  фракционирования  антигенов  в  супернатант  добавляли  сульфат 
аммония до 80 % насыщения и  перемешивали на магнитной мешалке в тече-
ние 30 мин.  Полученный  раствор  оставляли  на 16-18 часов  при 4 0С  для    
формирования   осадка, после чего смесь центрифугировали при 20 000 g в 
течение 30 мин, супернатант удаляли, а осадок растворяли в  0,9  %  растворе 
хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1 и проводили диализ против водо-
проводной, а затем дистиллированной воды до отсутствия ионов NH +
2 ,  опре-
деляемых реактивом Несслера. 
II стадия. Механическая дезинтеграция 

 
61
        Осадок, полученный  после  центрифугирования  бактериальной массы и  
взвешенный  в 0,9 %  растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, в 
объеме 30 мл  помещали  в  камеру  Х-пресс  дезинтегратора,  предварительно 
охлажденного в течение 2 часов при температуре минус 40 0C.  Микробные 
клетки в дезинтеграторе замораживали  при  той же температуре в течение 8 
часов. После этого проводили разрушение клеток на гидравлическом прессе, 
четырехкратно    продавливая    бакмассу  через  калиброванное  отверстие  па-
трона  дезинтегратора.  Далее  биомассу  размораживали  и  центрифугировали 
при 20 000 g в течение 30 минут.  
     III стадия. Ультразвуковая дезинтеграция 
Осадок,  полученный    после    предыдущей  стадии,  суспендировали  в 
0,9 % растворе хлорида натрия рН 7,2 в соотношении 1:1, добавляли детер-
гент твин-80 до конечной концентрации 0,1 %  для улучшения солюбилиза-
ции  белковых  компонентов  структур  рибосом  и    мембран    клеточных  эле-
ментов.  Твин-80  снижает  поверхностное  натяжение  бактериальной  стенки, 
ограничивает  её  способность  противостоять  внутриклеточному  давлению, 
что облегчает разрыв стенки с выходом клеточного содержимого в раствор. 
Полученную суспензию микробных клеток в объеме 30 мл помещали  в де-
зинтегратор УЗДН-2Т. Используя ультразвуковые колебания различной  час-
тоты (22  и 44 кГц),  интенсивности  и варьируя длительностью воздействия 
на микобактерии (от 5 до 30 мин) при температуре 0-4 0С, мы получили раз-
ный  эффект:  от  слабо  выраженных  изменений  до  полного  разрушения  мик-
робных клеток. Следует учитывать, что при жёстких режимах ультразвуково-
го воздействия в ультраозвученной водной среде вследствие возникновения в 
кавитационных  областях  электрического  напряжения  образуются  продукты 
расщепления ионизированных молекул воды- свободные гидроксильные ра-
дикалы и атомарный кислород. Эти продукты инициируют деградацию неко-
торых биологически активных веществ. В результате было установлено, что 

 
62
наиболее эффективными параметрами являются:   время воздействия 20 мин 
при частоте  22 кГц.  
На заключительном этапе приготовления антигенного комплекса     все 
полученные   антигенные   фракции микобактерий туберкулёза   смешивали 
(рисунок 1).  
Выход  отдельных  антигенов  туберкулёзного  микроба  из 100 мг  бак-
массы  и их специфическая активность представлены в таблице 2. Качество 
полученных антигенов контролировали  измерением концентрации белка на 
спектрофотометре СФ-26 при длинах волн 260 и 280 нм, в реакции преципи-
тации в геле по О.Оухтерлони с туберкулёзной сывороткой, полученной на-
ми (СтавНИПЧИ).  
 
         Таблица 2. Характеристика антигенов туберкулёзного микроба 
 

Фракции  антигена  Объём  АГ,  Концентрация 
Титр АГ в 
(АГ) 
мл  
белка, мг/мл 
РИД 
1 2 


Ф-1 34 
28 
1:32 
Ф-2 32 
23 
1:32 
Ф-3  
43 
13 
1:64 
 
Как  видно  из  таблицы 2, полученные  из  МТБ  различными  методами 
препараты содержали антигены, выявляемые в РИД. 
Использование  данного  метода  позволяет  получать  наиболее  полный 
антигенный  комплекс  из  бакмасс  микобактерий  туберкулёза  с  сохранением 
активности, снизить  потери на стадиях выделения.  Активность полученных 
антигенов    в  РИД    с  туберкулёзной  иммунной  сывороткой  составляла 1:32-
1:64 (рисунок 2).  
В дальнейшем водорастворимый туберкулёзный антиген использовали 
для иммунизации животных и в качестве положительного контроля при кон-
струировании диагностических тест-систем. 
 

 
63
 
 
 
Обеззараженная 
бакмасса   
микобактерий 
 
 
 
Экстракция хлоридом натрия 
 
 
Центрифугирование при 
 
20 000 g, 30 мин 
 
 
 
Супернатант 
Осадок 
 
Ресуспендирование в  
 
0,9 % растворе натрия 
  Фракционирование сульфатом 
хлориде 
  аммония до 80 % насыщения 
 
Разрушение в x-пресс-
  Инкубация 16-18 ч  при  4 0С
дезинтеграторе 
  Центрифугирование при  
Центрифугирование при  
     20 000 g, 30 мин 
   20 000 g, 30 мин 
 
     
Супернатант 
Осадок
Супернатант 
      Осадок 
     удалить 
Ресуспенди- 
                                                                   Фракция -2 
рование в  
Ресуспендирование в  
                                                              
0,9 % раст-
0,9 % растворе NaCl 
                                                             
воре NaCl 
                                                                                       
 
Диализ 
Добавление твин- 80 и  
 
разрушение на УЗДН- 
                              Фракция-1 
2Т, 20 мин, при 22 кГц 
 
 
Центрифугирование при 
                                                                                           20000g 20 мин 
                                                                         
  
Супернатант 
Осадок   
                                                                                      
удалить
                                                                     
Объединение 
                 
фракций 
Фракция -3 
 
Рисунок 1. Схема получения водорастворимых антигенных комплексов     
микобактерий туберкулёза 
 



 
64
 




               
 
 
     Рисунок 2. Реакция преципитации в агаровом геле   
Обозначения: 1- Аг M. tuberculosis humanus Н 37 RA в разведении 1: 2 – 1: 64; 2 -  сы-
воротка против M. tuberculosis humanus; 3- Aг M. bovis   в разведении 1: 2 – 1: 64; 4 – 
cыворотка против M. bovis 
 
Таким  образом,  нами  подобран  эффективный  комплекс  последова-
тельных манипуляций, позволяющий изолировать в достаточном количестве 
полноценные антигенные фракции МТБ при сохранении их нативности.  
Известные  из  данных  литературы  другие  методы  получения  из  МТБ 
антигенного материала путём  ацетоновой и спиртовой экстракции не позво-
ляют получить высокоактивный антигенный комплекс (Драбкина Р. Д. 1963).  
3.2. Получение специфической туберкулёзной сыворотки 
Для  получения  туберкулёзных    иммунных  сывороток  нами  апробиро-
ваны    различные  схемы  иммунизации,  которые  отличались  количеством  и 
способом, кратностью вводимого антигена, а также адъювантами и иммуно-
корректорами  (полный  адъювант  Фрейнда,  феракрил,  тималин,  циклофос-
фан).   
Общими недостатками схем иммунизации с применением адъювантов 
являются  трудность  создания  стойкой  эмульсии  «вода  в  масле»,  длитель-
ность  цикла  иммунизации,  травматичность  для  животных,  связанная  с  воз-
никновением у них адъювантной болезни. 
Как  показали  результаты  опытов,  для  получения  гипериммунных  ту-
беркулёзных  сывороток,  наиболее  приемлемой  оказалась    схема 
И.С.Тюменцевой (1994) с использованием феракрила в сочетании с комплек-
сом антиген-антитело (Аг-Ат), который инъецировали животным на опреде-

 
65
лённом этапе: грундиммунизация включала пять последовательных паренте-
ральных  введений  смеси  туберкулёзного  антигена    с 3 % водно-спиртовым 
раствором феракрила с интервалами в 3-7 дней. Через 30 суток после послед-
ней инъекции антигена у животных брали из краевой вены уха кровь и полу-
чали не менее 4 мл иммунной сыворотки, в которую добавляли антиген с це-
лью  получения  комплекса  Аг-Ат.  Основной  цикл  иммунизации  состоял  из 
четырёх внутривенных инъекций комплекса Аг-Ат через каждые 3-4 дня то-
му же  животному, от которого была получена иммунная сыворотка. Специ-
фические  титры  антител  в этих сыворотках достигали в  РИД - 1:32 - 1:64, 
что вполне удовлетворяло требованиям оценки сырья для дальнейшего полу-
чения различных диагностических препаратов. 
При    получении  туберкулёзных  агглютинирующих  сывороток  опти-
мальной  оказалась  схема  Е.Н.  Афанасьева (2000), в  которой  использованы  
вещества  с  иммунотропной  активностью  (тималин  и  циклофосфан).  Анти-
генный  материал  пятикратно  вводили  внутривенно,  одновременно  внутри-
мышечно инъецировали тималин, в третью инъекцию дополнительно вводи-
ли  внутримышечно  циклофосфан.  Агглютинирующие  сыворотки,  получен-
ные  таким  способом,  с  успехом  были  использованы  при  конструировании 
МИБП. 
Из  литературных  данных  следует,  что  возбудитель  туберкулёза  даёт 
перекрёстные серологические реакции с Nocardia, Brucella, Listeria и некото-
рыми    нетуберкулёзными  микобактериями.  В  связи  с  этим,  идентификация 
МТБ  и дифференциация с нетуберкулёзными  микобактериями крайне важна 
для практического здравоохранения и проведения подходящей антибактери-
альной  терапии.  Для  этого  необходимо  получить    специфические  туберку-
лёзные диагностические препараты, качество которых зависит от специфич-
ности  антител.  Как  правило,  сыворотки,  полученные  иммунизацией  живот-
ных, недостаточно специфичны, поэтому необходима сорбция антител, даю-
щих  перекрестные  реакции  с  гетерологичными  антигенами.  Для  этих  целей 
наилучшим способом является использование  аффинного сорбента, который 
представляет  собой  гетерологичные  антигены,  закреплённые  на  твёрдой 

 
66
матрице. Очистка сыворотки происходит за счёт биоспецифического взаимо-
действия между антигенами, закрепленными на матрице, и антителами, под-
лежащими удалению. 
Известны методы сорбции сывороток путём внесения в  неё  корпуску-
лярных гетерологичных антигенов (Карпов С.П. с соавт, 1976; Смирнов В.В. 
с  соавт, 1980) и  использование  полиакриламидного  антигенного  аффинного 
сорбента  (Лопаткин  О.Н.,  Кронгауз  И.В., 1983). В  первом  случае  сорбция 
корпускулярными  антигенами  существенно  понижает  специфические  титры 
антител, зачастую приводя к полной непригодности сырья из-за появления в 
нём экстрагируемого из бактериальных клеток материала. Во втором же слу-
чае, при приготовлении  полиакриламидных сорбентов, используются  высо-
котоксичные импортные реактивы, а специфическая ёмкость сорбента оказы-
вается невысокой. В связи с этим мы поставили перед собой задачу получить 
и  испытать  аффинный  сорбент  из  экологически  чистых  компонентов,  упро-
стить и ускорить все этапы сорбции при максимальной очистке сыворотки от 
гетерологичных антител.  
Проведен  контроль  специфичности  туберкулёзных  сывороток    на 
штаммах  особо    опасных  инфекций,  нетуберкулёзных  микобактерий  и  но-
кардий. Так, например, на долю Mycobacterium intracellulare приходится око-
ло 90% микобактериозов лёгких ( заболевания, сходные по клинической кар-
тине с туберкулёзом). Лечение при микобактериозах и туберкулёзе различа-
ется,  что  объясняется  природной  устойчивостью  условно-патогенных  мико-
бактерий к основным средствам противотуберкулёзной терапии. Данные ви-
ды являются близкородственными по отношению к M.tuberculosis.  Nocardia 
brasiliensis – патогенный  представитель  рода  Nocardia,  семейства  Nocardi-
aceae, порядка Actinomycetales, общего с M.tuberculosis. В литературе встре-
чаются данные о наличии у него общих антигенных детерминант с MТБ. Из-
вестно  серологическое  сходство  полисахаридов Brucella и  возбудителя  ту-
беркулёза,  хотя  по  соотношению  и  набору  моносахаридов  и    физико-

 
67
химическим  свойствам  эти  полисахариды  весьма  различны  (Домарадский 
И.В., 1994). 
При контроле специфичности  в НРИФ установлено, что наблюдаются 
перекрёстные реакции с Brucella abortus, M. кansasii Yoss, Nocardia brasilien-
sis, M. intracellulare. Из данных культур получали бакмассы, выделяли водо-
растворимые антигены по описанной схеме и использовали в качестве лиган-
дов при получении аффинных сорбентов. 
При  конструировании  аффинного  сорбента  мы  исходили  из  того,  что 
необходимо  выбрать  матрицу,  обладающую  химической  и  микробиологиче-
ской  устойчивостью,  жёсткостью,  высокой  специфической  адсорбционной 
способностью, найти способ щадящего и вместе с тем надёжного (ковалент-
ного) закрепления на ней соответствующих лигандов. 
Для этих целей нами применен аффинный сорбент с магнитными свой-
ствами, где в качестве твердой фазы выступает кремнезем-алюмосиликат, ко-
торый  является  мелкодисперсным  наполнителем,  представляющим  собой 
комплексные анионы алюминия и кремния с избыточным отрицательным за-
рядом,  компенсированным  щелочноземельными  металлами.  Носитель  обла-
дает  повышенными  адгезионными  свойствами  по  сравнению  с  полиакрила-
мидом и силохромами. Кроме того, алюминирование кремнезёма существен-
но  увеличивает  адсорбционную  активность  в  отношении  белков  (Хохлова 
Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С., 1991). 
Процесс получения сорбента заключался в следующем: к 1 г алюмоси-
ликатного  наполнителя  добавляли 40 мл   3 %  водного раствора полиглю-
кина и магнитный порошок (Fe2O3) от 1 до 5 г,   перемешивали и проводили 
гелеобразование при температуре   (22±4)  оС от 1 до 24 ч. Полученный сор-
бент  высушивали  при 100-110 0С  в  течение 30 мин,  измельчали  и  методом 
рассева выделяли фракции с размером частиц 80- 120 мкм. 
Процесс  получения сорбента состоял из следующих стадий: образова-
ние золя, переход его в гидрогель и обезвоживание, приводящее к получению 

 
68
ксерогеля.  В  золе  мицеллы  вещества  свободно  двигаются  по  законам  бро-
уновского движения. Сольватные оболочки мицелл, а так же  поверхностный 
заряд препятствуют их слиянию, образованию прочных связей при столкно-
вении и обеспечивают устойчивость золя. При повышении температуры про-
исходит  потеря  гидратной  оболочки  мицелл,  они  связываются  между  собой 
силами  сцепления  в  жёсткий  каркас.  Частицы  укрупняются,  контакты  сра-
стаются, что приводит к упрочнению скелета геля и уменьшению дисперсно-
сти частиц, в результате чего образуется ксерогель.  
Удельную  поверхность  МС  определяли  по    методу    А.А.Клячко-  Гур-
вича (1961), а  суммарный  объем    и    радиус  пор - по    методу  Н.В.Кельцева 
(1984). 
Для оптимизации  структурных  характеристик   магносорбентов про-
ведены  исследования  по  варьированию состава компонентов синтеза (дек-
стран,  Fe2O3, алюмосиликат), а также изучение влияния времени гелеобразо-
вания    и  рН  среды  на  величину  удельной  поверхности  сорбентов,  объем  и 
размер  пор.  Увеличение  продолжительности  времени    гелеобразования  при  
синтезе      МС  приводит  к  увеличению  значений  удельной    поверхности  и 
уменьшению  размера  пор.  Стабилизирующий  эффект  действия  декстрана  
объясняется  образованием   вокруг частиц   геля сольватных  оболочек в свя-
зи с  возникновением  комплексов между электронодонорными атомами ки-
слорода  молекул  органического  вещества  и  силанольными    группами  крем-
неземных  корпускул.  
На  наш  взгляд,  оптимальным  значением  времени  гелеобразования 
при  синтезе  сорбентов  является 1-2 часа,  так  как  при  увеличении  времени  
синтеза  магносорбента  уменьшается  радиус  его пор,  что приводит  к  сниже-
нию  степени  иммобилизации  лиганда  при  ковалентном  связывании  в  порах 
сорбента,  стерическим    препятствиям    образования  специфического  ком-
плекса антиген-антитело. 


 
69
           На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оп-
тимальные условия  получения алюмосиликатных МС: соотношение компо-
нентов синтеза Fe2O3, декстран, алюмосиликат 2:2:1, время гелеобразования 
2 - час при рН - 7,0. 
На  рисунке 3 представлена  фотография микроструктуры алюмосили-
катного магносорбента, из которой следует, что у образца  магносорбента на-
блюдается ярко выраженная губчатая структура.  
Исследование  удельной    поверхности    по  методу      А.А.Клячко-
Гурвича  (1961) показало, что введение магнитного порошка (Fe2O3) в струк-
туру  кремнеземного  сорбента    изменяет  его  структурные  характеристики: 
удельная    поверхность    в  данном  случае  достигает 18 м2/г,  объем  пор 1,19 
см3/г, радиус пор 132,2 нм, тогда как сорбент, не содержащий в своём составе 
Fe2O3, имеет  удельную поверхность -  58 м2/г,  объем пор- 1,70 см3/г,   радиус  
пор – 42,5 нм.  
 
 
Рисунок  3.  Электронная микроскопия  МС. Увеличение х 10 000. 
 
Магносорбенты  были использованы  далее для химического модифи-
цирования активными группами, применяемыми для ковалентной иммобили-
зации лигандов, которая должна проводиться за счет функциональных групп, 
не влияющих на специфическую активность лиганда и в условиях, не допус-

 
70
кающих  структурных    изменений    в    белке  (Шаханина  К.Л.  с  соавт., 1978; 
Пушкарь В.Г. с соавт.,1984). 
         Для химического  активирования данных магносорбентов нами исполь-
зован  метод    модифицирования  твердофазных  носителей    окислением  (рис. 
4). 
    Al- Si             NaClO4      AI-Si             O 
                   -OH  ---------                  -C 
   (Fe2 O3)                       (Fe2 O3)                H 
                                                 
 
Рисунок 4. Схема получения магносорбента методом окисления  
 
       Концентрация  альдегидных  групп  активированных сорбентов состави-
ла 0,57 мг-экв/г. Достоверность  и воспроизводимость аналитического  мето-
да определения альдегидных групп представлена в таблице 3
 
Таблица 3.Воспроизводимость  экспериментальных  данных  при  опреде-
лении   альдегидных групп в составе активированных магносорбентов
 
Об- Сi  мг- Ci-C (Ci-C)2    S2  
S  Е0,95 
Е0,95 
С 
мг-
ра-
экв/г 
100 % С  экв/г 
зец 
 
 
0,57  
+0,01    
 
 
 
   
 
 
0,56  

2,0х10-4 
0,5х10-4 
0,7х10-2 
1,74х10-2 
  3 
0,57+0,1 
МИС  0,57 
+0,01 
1,70 
+0,02 
        
Далее  проводили  иммобилизацию  гетерологичных  водорастворимых 
антигенов (Brucella abortus 19, Nocardia brasiliensis, M. intracellulare, M. кan-
sasii Yoss) на сорбенты, для чего исследовали ряд параметров:  концентрацию 
белка в антигенах, время  и температуру инкубации,  влияние рН на иммоби-
лизацию лигандов.  
 Иммобилизацию  лигандов  на  поверхности  магносорбента  проводили 
следующим образом:  к 0,4 мл 10 % взвеси МС приливали 1 мл водораство-
римых антигенов, варьируя количеством белка от 0,5 до 10 мг/мл, инкубацию    

 
71
проводили     в     течение   1-24 часов,  при  температуре 4-5 0С; (22 + 4)  0С и 
(37±1) 0С. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель промывали 0,9 
%  раствором хлорида натрия до полного удаления белка, наличие которого в 
промывной жидкости контролировали спектрофотометрически.  
Для иммобилизации использовали различную концентрацию белка во-
дорастворимых  антигенов (0,5-10 мг/мл).  Исследования  показали,  что  кон-
центрация белка 2,5 мг/мл является оптимальной для полного насыщения ан-
тигенами сорбента, находящегося в 10 % взвеси. При  использовании лиганда  
с  концентрацией  белка  больше 2,5 мг/мл  адсорбционная  емкость  МИС  сни-
жалась.  Вероятно,  зависимость адсорбционной емкости сорбента от количе-
ства иммобилизуемого белка объясняется факторами стерического характера 
(Муромец В.И., Наградова Н.К,  1984).  
Изучена  кинетика процесса иммобилизации и оценка связывания  вы-
деленных  антигенов  с  сорбентом.  Из  полученных  данных  следует  (рис. 5),  
что 2 ч достаточно, чтобы произошло полное насыщение МС антигенами.  
  
Концентрация 
белка, мг/мл
2,5
2,4
2,3

C-2
2,2
2,1

C-1
2
1
2
4
24
Время, ч
Рисунок 5. Зависимость количества иммобилизованного белка от  
времени иммобилизации            С- 1-серия 1, С-2- серия 2 

Схема  получения    иммобилизованных  антигенов  на  МС  представлена  
на рис. 6.  
 

 
72
       AI-Si              О                        AI- Si  
                   - С         +Н 2N  -Аг                      СН=N-Aг 
   (Fe2 O3)                                      -Н 2О 
                             Н                       (Fe2 O3)           
 
 
Рисунок 6. Схема получения МИС на декстраноалюмосиликагеле 
 
Ковалентное связывание водорастворимых антигенов с твердой матри-
цей осуществляется через альдегидную группу с образованием азометиновой 
связи. 
При  определении  зависимости  рН  раствора  водорастворимых  антиге-
нов на процесс иммобилизации установлено, что изменение рН от 5 до  9,5 не  
сказывается на специфической активности и чувствительности МИС.                           
        Определена  максимальная  адсорбционная  емкость  сорбента,  которая   
наблюдалась  при температуре (22 + 4)  0С и (37±1) 0С.   
        Таким  образом,  оптимальными  факторами,  способствующими  получе-
нию  МИС,  являются:  время  иммобилизации  лигандов  на  сорбенте - 2 часа 
при значении рН  раствора  водорастворимых антигенов 6-7 и температуры в 
интервале 24 – 37 оС.     
Методы  получения  иммуносорбентов  просты  и  технологичны,  исклю-
чающие  применение токсичных веществ. Полученные магноиммуносорбен-
ты  характеризуются  стандартностью  структурных  характеристик,  механиче-
ской, химической и микробиологической устойчивостью, не подвержены на-
буханию, равновесие  между  антигенами  и сорбентом наступает в течение 2 
часов.  Использование  отечественных  экологически  чистых  компонентов,  их 
дешевизна, простота технологии изготовления свидетельствуют  о  достоин-
ствах алюмосиликатных МИС.  
Иммуносорбцию проводили дважды, соединяя 10 мл иммунной тубер-
кулёзной сыворотки с 1 г магноиммуносорбента. Смесь инкубировали при 37 
0С в течение 6 часов или при температуре 4 0С – 16 часов на шуттель - аппа-

 
73
рате. После инкубации, используя постоянный магнит (при этом отпадает не-
обходимость  центрифугирования  или  фильтрования)  для  фиксации  МИС, 
сыворотку  сливали. Сорбент  регенерировали 3 М раствором калия родани-
стого  и  отмывали 0,1 М  фосфатно-солевым  буфером  рН (7,3 ± 0,1). Такой 
сорбент  после  процедур  регенерации  можно  использовать  до 10 - 15 раз. 
Магнитные свойства иммуносорбента позволили осуществлять отделение его 
от  жидкой  фазы  в  магнитном  поле  и  исключить  процесс  длительного  цен-
трифугирования.  
Титр  антител  и  специфичность  туберкулёзных  сывороток,  определяе-
мые в НРИФ в мазках гомологичных и гетерологичных штаммов микроорга-
низмов,  окрашенных  иммуноглобулинами  флуоресцирующими  антикро-
личьими,  представлен в таблице 4.  
Из таблицы видно, что до сорбции туберкулёзной сыворотки наблюда-
лась перекрестная реакция  со штаммами B.abortus, М. intracellulare,  Nocar-
dia  brasiliensis, M. кansasii Yoss  при её активности 1:400 в реакции НРИФ. 
При сорбции иммунной сыворотки использование данного иммунносорбента 
позволило  не  только  освободить  препарат  от  неспецифических  антител  на 
одном  этапе,  но  и  сохранить  первоначальную    специфическую  активность 
нативных  сывороток.  
Проведённые исследования дают основание утверждать, что  примене-
ние алюмосиликатных антигенных магноиммуносорбентов позволяет прово-
дить  качественную  иммуносорбцию.  Преимуществами  её  являлось  то,  что 
при сорбции не происходило попадания в сыворотку антигенного материала 
и  в  ней  отсутствовал  комплекс  «антиген-антитело»,  мешающий  в  дальней-
шем созданию специфических диагностических систем. 
Такая  иммуносорбция  приводила  к  повышению  специфичности 
cывороток. Титры специфических антител не снижались и конечный продукт 
оставался качественным сырьем для дальнейшей работы.  
 

 
74
Таблица 4. Контроль специфичности и активности  туберкулёзной  им-
мунной сыворотки в НРИФ 
 
Мазки  со  взвесями  Визуальная оценка специфической люминесценции (по 4-х кре-
культур 
стовой)  в мазках, окрашенных иммуноглобулинами флуоресци-
рующими антикроличьими 
                     До сорбции 
После сорбции 
1:200 
  1:400 
1:600 
      1:200 
   1:400 
1:600 
M. tuberculosis hu-
44  
44  33 
44  44  33 
manus Н 37 RA    
M. bovis BCG     
44  
44  32 
44  44  32 
М. intracellulare # 23 
44  
32  22 
22 
--  -- 
M. кansasii Yoss 
44 23  22 
22  --  -- 
Nocardia brasiliensis 
33  
32  22 
22 
--  -- 
B.abortus 544, 19-BA 
44 
 
32 --  22  -- -- 
B. abortus  345 
33 
 
22 --  --  -- -- 
B. melitensis 
-- --  -- 
--  --  -- 
16M,565, Rev-1 
B. suis 1330, 508, 6 

--  
--  -- 
--  --  -- 
Salmonella typhi 818, 
-- --  -- 
--  --  -- 
4446 
Streptococcus faecalis 

-- --  -- 
--  --  -- 
Staphylococcus epi-
-- --  -- 
--  --  -- 
dermidis, aureus 
АССТ 25923 
Listeria monocyto-

-- --  -- 
--  --  -- 
genes  1  -7серотип 
Обозначения: - -  - отрицательный результат, 2, 3, 4 -  интенсивность свечения по 4-х кре-
стовой шкале; 22, 32 - и т.д. - интенсивность свечения в двух повторных опытах. 
 
Таким образом, нами разработана биотехнология получения аффинно-
го  сорбента  с  магнитными  свойствами.  В  качестве  матрицы  использовали 
алюмосиликат - химически чистый сорбент, имеющий жёсткий остов, обла-
дающий значительной адсорбционной ёмкостью, микробиологической и хи-
мической  устойчивостью,  механической  прочностью.  Для  придания  сорбен-
там биоспецифических свойств в структуру или на их поверхность иммоби-
лизовали антигены путём ковалентной сшивки, т.е. образования химической 
связи при участии неспаренных электронов, принадлежащим обоим партнё-
рам  по  реакции  (наиболее  прочная  связь).  Для  её  осуществления  нами  ис-

 
75
пользован перхлорат натрия. В результате варьирования соотношением ком-
понентов  синтеза,  отработки  всех  параметров:  рН,  температуры,  времени,  
способов  иммобилизации  лигандов    получены  магноиммуносорбенты,  по-
ристая  структура  которых  наиболее  эффективна    для  образования  иммуно-
химического комплекса «антиген –антитело». Наличие магнитного материала 
обеспечивает  упрощение,  ускорение  манипуляций  с  сорбентами.  Данные 
сорбенты  отличаются  простотой  технологии  изготовления,  экологической 
чистотой, доступностью сырья и низкой стоимостью. 
 

 
76
ГЛАВА 4. Получение иммуноферментных препаратов для экспресс-
диагностики туберкулёза 
4.1.  Получение иммунопероксидазного конъюгата 
Иммуноферментный  анализ  является  наиболее  перспективным    при 
иммунодиагностике возбудителя туберкулёза у человека и животных. Однако 
внедрение его в широкую практику сдерживается значительным количеством 
ложноположительных  результатов,  обусловленных  атипичными  сапрофит-
ными  микобактериями  и  низкой  чувствительностью  при  использовании  ту-
беркулиновых антигенов (Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В., 1993).  
Нами  проведены  исследования  по  получению  высококачественных 
иммунопероксидазных  конъюгатов  для  выявления  микобактерий  туберкулё-
за.  
Для  конструирования  иммуноферментных  диагностикумов  использо-
ваны  водорастворимые  антигены  микобактерий  туберкулёза  и  гипериммун-
ные  сыворотки,  полученные  на  их  основе.  Так  как  наблюдались  перекрёст-
ные реакции туберкулёзных сывороток с нетуберкулёзными микобактериями 
и сапрофитами, проведена их сорбция по технологии, представленной в главе 
3.  Иммуноглобулины  из  гипериммунных  сывороток  выделяли    с  помощью 
каприловой кислоты (Steibuch G., Andran R.,  1969).  
Для  ковалентного  связывания  фермента - пероксидазы  хрена      («Сиг-
ма»  США)  с  иммуноглобулинами    выбран  метод  перйодатного  окисления 
(Nakane P.K., Kawaoi A., 1974). Конъюгацию пероксидазы хрена с иммуног-
лобулинами  осуществляли  в  два  этапа:  сначала  получали  активированное 
производное пероксидазы, содержащее альдегидные группы, далее проводи-
ли диализ. На втором этапе альдегидная группа пероксидазы, взаимодействуя 
с  аминогруппой  антител,  образовывала  конъюгат,  формируя  азометиновую 
связь.  
Краткое  изложение  биотехнологии  получения  конъюгата  выглядит 
следующим образом: пероксидазу в количестве 5 мг растворяли в 1 мл 0,3 М 

 
77
раствора натрия углекислого.  Добавляли 0,025 мл 0,32 %  раствора форма-
лина, перемешивали на  магнитной мешалке в течение 30 минут, затем вно-
сили 1 мл 0,04 М раствора перйодата натрия и перемешивали. По истечении  
времени  инкубации  добавляли 1 мл 0,16 М  раствора  этиленгликоля  и  пере-
мешивали  1  час.  Все   перечисленные   операции   проводили    при   темпе-
ратуре (22+4)  0С. Затем раствор диализовали против 0,01 М КББ раствора рH 
9,5 при 4 0С в течение 18 часов. Раствор переносили во флакон, добавляли 1 
мл  туберкулёзных  иммуноглобулинов  с  концентрацией  от 2,5 до 10 мг/мл,  
перемешивали 2 часа при температуре (22+4)  0С и вносили 5 мг боргидрида 
натрия,  оставляя  без перемешивания на  2  часа   при 4 0С.  Раствор диализо-
вали против 0,1 М ФСБ рН 7,2 в течение  18 часов при 4 0С.   
Очистку  конъюгата  от  несвязавшегося  фермента  осуществляли  мето-
дом гель-фильтрации с использованием сефадекса G-100 на установке LKB-
2137 (Швеция). В качестве элюата применяли 0,1 М ФСБ рН 7,2-7,4.  Фрак-
ции собирали в объеме 3,0 мл и исследовали светопоглощение каждой из них 
при длинах волн 280 нм и 403 нм. Фракции, имеющие Rz (соотношение экс-
тинций при длинах волн  403 и  280 нм – области максимального поглощения 
пероксидазы хрена и белка), равное 0,4 - 0,6, объединяли. Во фракции добав-
ляли бычий сывороточный альбумин из расчета 10 мг на 1 мл.  Фракции раз-
ливали в ампулы по 0,1 мл и лиофилизировали. В результате контроля актив-
ности  установлено,  что  для  иммобилизации  достаточной  является  концен-
трация белка 5 мг/мл,  так как при использовании 10 мг/мл показатель соот-
ношения экстинции пероксидазы хрена и белка, а также  активность препара-
та оставались на том же уровне при большем расходе белка (таблица 5). 
Конъюгат лиофилизировали на лиофильной установке  LZ-9C. Препа-
рат  был  стабилен  без  потери  активности  в  течение 1 года  и  соответствовал 
всем необходимым медико-биологическим требованиям.  
 

 
78
Таблица 5. Результаты  взаимодействия  белка  с  ферментом  в  зависимо-
сти от концентрации белка  
 
Серии  пре- Показатели 
Концентрация белка, мг/мл 
парата 
2,5 5  10 
С-1 
Rz 0,19 
0,52 
0,50 
Активность 1:25 
1:600 
1:6 
00 
С-2 
Rz 0,28 
0,39 
0,38 
Активность 1:50 
1:400 
1:400 
С-3 
Rz 0,22 
0,50 
0,50 
Активность 1:25 
1:800 
1:800 
 
Примечание: Rz - показатель соотношения экстинции  при спектрофотомет-
рии пероксидазы хрена при длине волны 403  нм и белка при 280 нм.  
 
Полученные  конъюгаты  исследовали  на  активность,  специфичность  и 
чувствительность.  Рабочий  титр  и  специфическую  активность  конъюгатов 
определяли  по  методике M.Clark и A.Adams (1977) в  “сэндвич”-варианте 
ИФА,  оптимизируя  некоторые  параметры.  В  работе  использовали  полисти-
роловые планшеты для иммунологических реакций Красноярского завода. 
Планшеты  сенсибилизировали  туберкулёзными  иммуноглобулинами  в 
концентрации 100 мкг/мл в объеме 0,1 мл КББ рН 9,5, инкубировали 3 часа 
при температуре 37 0C.  Несорбированные иммуноглобулины удаляли, в лун-
ки вносили по 0,1 мл туберкулёзного водорастворимого  антигена с концен-
трацией белка 0,1 мг/мл, инкубировали 1 час при температуре 37 0С.   
Несвязавшиеся антигены удаляли, планшеты промывали 5-кратно по 3-
4 мин 0,05 %  раствором твин-20 в ФСБ и просушивали. Затем вносили по 0,1 
мл разведенного пероксидазного конъюгата от 1:100 до 1:800, инкубировали 
1  час  при температуре 37 0С.  После промывки добавляли по 0,1 мл свеже-
приготовленного субстрат-индикаторного  раствора  (0,1  М раствор лимон-
ной кислоты с 0,2 М раствором  натрия  фосфорнокислого  однозамещенного 
рН 5,0 в присутствии 0,006 % перекиси водорода и ортофенилендиамина  в   
концентрации   0,4   мг/л)   и   инкубировали   10   мин      при      температуре 

 
79
 (22 +4) 0С без доступа света.  Для остановки реакции использовали 2 М рас-
твор серной кислоты.  Результаты реакции учитывали визуально и на фото-
метре  ПЭО  ФЭК  при  длине  волны 492 нм  путем  определения  оптической 
плотности (ОП) проб,  находящихся  в лунках планшета. Результаты считали 
положительными,  если  ОП  исследуемого  образца  в 2 и  более  раз  превосхо-
дила среднее значение  ОП отрицательных контролей. 
Рабочий  титр  разработанных  нами  иммунопероксидазных  туберкулёз-
ных  конъюгатов всех изготовленных серий составил 1:400–1:800 с соответ-
ствующими  штаммами.  Чувствительность  конъюгатов  по  водорастворимым 
антигенам – 50 – 100 нг/мл. 
Все серии  полученных конъюгатов для ИФА дали отрицательные ре-
зультаты  с  гетерологичными  штаммами  (таблица 6), что  свидетельствовало 
об их специфичности. 
Кроме  того, для оценки чувствительности и специфичности конъюга-
тов  в  качестве  тест-объектов  использовали  взвеси  клеток  туберкулёзных 
штаммов.  За  рабочее  разведение  конъюгата  принимали  такое  максимальное 
разведение последнего,  при котором в ИФА выявлялось минимальное коли-
чество клеток возбудителя при отсутствии окрашивания контроля. Чувстви-
тельность    иммунопероксидазных    конъюгатов  по  корпускулярным  антиге-
нам составила 5х10 4 – 1х10 5 м.к./мл (таблица 6).  
Лабораторные  испытания  экспериментальных  серий    иммуноперокси-
дазных конъюгатов показали, что они отвечают ОМБТ, предъявляемым к та-
ким препаратам (таблица 7).  
На  основе  полученных  препаратов  были  сконструированы  тест-
системы для экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, состоящие из 1 
ампулы иммуноферментного конъюгата, 1 ампулы положительного контроля 
(взвесь туберкулёзного микроба)- 10 9 м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобулинов 
туберкулёзных  и  необходимых  ингредиентов  для  постановки  ИФА  (ФСБ, 

 
80
твин-20, БСА, 2 М раствора серной кислоты, ортофенилендиамина, таблетки 
гидроперита (перекись водорода).  
Таблица 6. Результаты по определению активности, чувствительности  и 
специфичности иммунопероксидазных конъюгатов 
 
 
 
Серии иммунопероксидазных конъюгатов 
№№  Наименование 
С-1 
С-2 
С-3 
пп 
штаммов  микроор- рабо- чувстви- рабочий  чувстви- рабо-
чувст-
ганизмов 
чий 
тель-
титр 
тель-
чий 
витель-
титр 
ность 
ность 
титр 
ность 
м.к./мл 
м.к./мл 
м.к./мл 
1. 
M. tuberculosis hu- 1/600 5х10 4 
1/800 1х10 5 
1/600 5х10 4 
manus Н 37 RA 
2. 
 BCG 
1/600 1х10 5 
1/400 5х10 4 
1/600 1х105 
3. 
M. кansasii Yoss 
 
Отр.  
Отр.  
Отр. 
4. 
М. intracellulare #
 
Отр.  
Отр.  
Отр. 
5. 
Nocardia brasiliensis 
 
Отр.  
Отр.  
Отр. 
6-16 
Br. melitensis 16-M,   
Отр.  
Отр.  
Отр. 
565, Rev-1, Br. abor-
tus  544;
 19-BA,345, 
Br. suis 1330; 
508, 6  
17-18 Salmonella 
typhi 
818,  
Отр.  
Отр.  
Отр. 
4446 
19. 
Streptococcus faecalis   
Отр.  
Отр.  
Отр. 
 20 
Staphylococcus epi-  
Отр.  
Отр.  
Отр. 
dermidis 
21-27  Listeria monocyto-
 
Отр.  
Отр.  
Отр. 
genes  1 –7 серотип 
 
Таблица 7. Характеристика иммунопероксидазных конъюгатов 
 
Критерии оценки 
Серии 
         1 


 
Внешний вид 
компактная пористая таблетка белого  цвета 
Растворимость 
в 1 мл дистиллированной воды в течение 1 мин. 
Прозрачность 
раствор прозрачен 
Цветность раствора 
бесцветный или слегка желтоватого цвета 
 рН 7,2 
7,1 
7,4 
Потеря  в  массе  при  высу-
2,2 2,3 
2,1 
шивании 
Rz – количественное  соот-
0,52 0,48 
0,43 
ношение фермент /белок 
Активность 1:600 
1:800 
1:800 
Чувствительность 
5х10 4 
1х10 5 
1х105 
 

 
81
На    первом  этапе  конструирования  иммуноферментного  конъюгата 
провели  подбор  оптимальных  условий  получения  препарата,  в  качестве  ли-
ганда используя иммуноглобулины  туберкулёзные, полученные из адсорби-
рованной сыворотки. Второй этап работы - оптимизация постановки анализа. 
Третий этап  - конструирование тест-систем для экспресс-диагностики. 
Одной  ампулы  с  препаратом  в  объеме  0,1 мл с активностью-1:600  
достаточно для проведения 300 иммуноферментных анализов с дубликатом. 
Таким образом, в результате проведённых исследований получены вы-
сокоактивные (до 1:800), специфичные (отсутствуют перекрёстные реакции с 
гетерологичными  штаммами)  иммуноферментные  конъюгаты,  позволяющие 
выявлять МТБ от  5х10 4 -  1х10 5 м.к./мл.  
4.2.  Получение липосом и липосомально-иммунопероксидазного конъ-
югата 
Липосомы получали из фосфолипидов и ганглиозидов, выделенных из 
мозга  к.р.с.,  а  в  последнее  время  из  мозга  свиньи  (ТУ 9154-00-01897080-
2004),  не  являющегося потенциально опасным при губчатой энцефалопатии 
животных  (коровье  бешенство).  Разработанная  биотехнология  выделения 
сырья для приготовления липосом включала следующие этапы: 
1.  Головной  мозг  животного  в количестве 1000 г  гомогенизировали  в 4000 
мл  охлаждённого до минус 20 0С  ацетона, периодически перемешивая в те-
чение 12  ч. Суспензию фильтровали на воронке Бюхнера, осадок вновь сус-
пендировали в 2000 мл охлаждённого ацетона в течение 4 часов и повторно 
фильтровали на воронке Бюхнера. 
2.  Для  извлечения  фосфолипидов  и  ганглиозидов полученный  осадок  экст-
рагировали 2000 мл  смеси  хлороформ - этанол (1:1) при  встряхивании  на 
шуттеле  в течение 1 ч при температуре 20 0С. На этом этапе мы использова-
ли  указанную  экстрагирующую  смесь  в  отличие  от  традиционной,  высоко-
токсичной смеси, включающей хлороформ и метанол. 

 
82
        Если  традиционный  метод  выделения  фосфолипидов  требует  удаления 
экстрагирующего  раствора  на  роторном  испарителе,  то  нами  фосфолипиды 
осаждались  из  него    при  добавлении 1,5-2 объёмов  охлаждённого (-20 0С) 
ацетона. При этом осаждался и холестерин, необходимый для стабилизации 
липосом в процессе их приготовления. Данный способ выделения фосфоли-
пидов защищён патентом РФ   № 2192265 от 10.10.2002.   
3.  Осадок  фосфолипидов,  собранный  при  фильтровании,  высушивали  при 
комнатной    температуре  до  постоянного    веса.  Выход    препарата  составил  
1,4 % от массы исходного сырья. В дальнейшем препарат растворяли в хло-
роформе (50 мг/мл) и хранили в сосуде с притёртой пробкой в темноте под 
подушкой инертного газа (азота) при температуре 4 0С.  
    Для  предотвращения  перекисного  окисления  липидов  в  процессе  приго-
товления липосом в их хлороформный раствор вносили 0,05 % α-токоферола. 
4. 
При внесении в надосадочную жидкость, образующуюся после изоля-
ции  из  органической  смеси  фосфолипидов,  дополнительно  охлаждённого 
ацетона до 5 объёмного соотношения,  в осадок выпадала фракция ганглио-
зидов, также используемая нами при конструировании липосом. Способ по-
лучения ганглиозидов защищён патентом РФ № 2195296 от 27.12.2002. 
    Высушенный осадок ганглиозидов растворяли в хлороформе (50 мг/мл) и 
хранили  в  условиях,  аналогичных  хранению  фосфолипидов.  Разработанная 
биотехнология  выделения  фосфолипидов  и    ганглиозидов  представлена  на 
рис. 7. 
        Хроматографическое  изучение  полученного  препарата  фосфолипидов  
методом  тонкослойной  хроматографии  на  пластинах  «Силуфол»  в  системе 
растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4) с использованием в качест-
ве свидетелей тест-наборов стандартов фосфолипидов и холестерина показа-
ло наличие в нём преимущественно фосфотидилхлолина, фосфотидилсерина, 
фосфотидилинозита и холестерина, которые выявлялись при прокрашивании 
парами йода (Кейтс М., 1975). 

 
83
 
Головной мозг животного 
                                                                     Гомогенизация 
                                                                             +ацетон             
   Гомогенат 
Обезвоживание и уда-
 
ление растворимых в 
                                                                +Хлороформ-   
ацетоне липидов 
                                                                 этанол (2:1) 
 
 
  Осадок удаляется 
Экстракт 
                                                                                           +1,5-2 объёма ацетона   
 
 
Надосадок (ганглио-
Осадок (фосфолипи-
зиды, растворимые в 
ды, холестерин) 
 
ацетоне липиды) 
                                                       +ацетон до 5 объёмов                  растворение  
                                                       к хлороформо-этанольному        в хлорофор-             
                                                       экстракту                                       ме                        
 
Осадок 
Раствор фосфолипидов 
 
(ганглиозиды) 
(50 мг/мл) 
                                                       растворение в  
                                                       хлороформе 
 
Раствор ганглиози-
Суммарный раствор 
 
дов (50 мг/мл) 
фосфолипидов и ганглио-
зидов (20:1), стабилизи-

 
рованный добавлением 
0,05 % α-токоферола 

 
Рисунок 7. Биотехнологическая  схема  выделения  фосфолипидов  и  ганглио-
зидов из головного мозга животных 
 
Липосомы  получали  методом  «выпаривания  в  обращённой  фазе»  со-
гласно методическим рекомендациям «Иммобилизация в липосомы веществ 
различной  химической  природы.  Стерилизация  и  стабилизация  липосом» 
(2000  г.),  используя  в  качестве  сырья  для  их  приготовления  хлороформные 
растворы фосфолипидов и ганглиозидов в соотношении 20:1.  

 
84
С этой целью в хлороформную смесь указанных липидов дополнитель-
но вносили хлороформ до достижения липидной концентрации 30 мг/мл. К 3 
мл  этого  раствора  добавляли 1 мл  водной  фазы  в  виде 0,01 М  ФСБ  рН 7,2, 
содержащего 0,01 % хлористого кальция. Для исключения негативного влия-
ния ультразвука на липиды, которые при этом интенсивно окисляются, полу-
ченную смесь перемешивали в течение 10-12  мин на скоростной мешалке до 
образования стойкой эмульсии типа «вода в масле». Затем эмульсию упари-
вали в вакууме на роторном испарителе при температуре нагревающей жид-
кости 45 0С, не допуская кипения и вспенивания смеси, до полного удаления 
органической  фазы.  В  дальнейшем  колбу  снимали  с  испарителя,  к  образо-
вавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М ФСБ рН 7,2 и интенсивно встряхива-
ли в присутствии стеклянных бус до образования гомогенной структуры ли-
посом. Контроль образования и размеров липосом осуществляли с помощью 
электронного  микроскопа  при  инструментальном  увеличении  х 5000-50000. 
Для  этого  на  сетку-подложку,  покрытой  формваровой  плёнкой,  с  помощью 
бактериологической петли наносили взвесь полученных липосом, предвари-
тельно разводя их 0,01 М ФСБ рН 7,2 до получения суспензии, хорошо про-
сматривающейся при электронной микроскопии. После нанесения взвеси на 
сетку избыток удаляли фильтровальной бумагой. Липосомы, находящиеся на 
сетке, контрастировали 1 % водным раствором уранилацетата, который нано-
сили бактериологической петлёй. 
В результате изучения полученных препаратов на электронном микро-
скопе  были  обнаружены  липосомы  со  средним  размером 150-300 нм,  кото-
рый  рассчитывали по формуле: D = (∑ n · DV / ∑ n )1/3 · К-1, где D – средний 
диаметр липосом в препарате (мкм); DV – средний размер липосом в каждой 
группе (мкм); n – число липосом в каждой группе; К – коэффициент увели-
чения, включая инструментальное увеличение микрофотографий.  
Полученные липосомы были использованы в качестве «твёрдой» фазы 
при получении иммуноферментного препарата для диагностики МТБ. Кова-

 
85
лентно фиксируясь на поверхности мембраны липосом, фермент и иммуног-
лобулин  резко  снижают  способность  к  конформационным  изменениям 
структуры  своих  молекул  под  воздействием  повышенной  температуры,  из-
менениях рН среды и т.д. Всё это способствует повышению стабильности и 
увеличению срока годности диагностической системы. 
Для  получения  диагностикума  мы  предварительно  активировали  пе-
роксидазу хрена. С этой целью  (5 ±0,1)  мг  пероксидазы  хрена   растворяли  
в  1 мл раствора натрия углекислого кислого в концентрации 0,3 моль/л, до-
бавляли 0,025 мл 0,32 % раствора  формалина.  Смесь  перемешивали  на  ме-
шалке в течение (30±5) мин при температуре (22 ±4)   0С и добавляли  1  мл 
раствора перйодата натрия в концентрации 0,04  моль/л, продолжая  переме-
шивать   в   течение (30±5) мин  при  температуре  (22 ±4)   0С.  Далее  вноси-
ли 1,0 мл раствора этиленгликоля в концентрации 0,16 моль/л (для снижения 
поверхностного  натяжения),  осторожно    перемешивая    в    течение  (60±5)  
мин при температуре  (22 ±4)0С. В конце процедуры  препарат активирован-
ной пероксидазы должен быть жидким, прозрачным, без запаха, зеленовато-
коричневой окраски. Активированную пероксидазу переносили в  диализный  
мешок  и      диализовали    против 1 л 0,01 М  КББ  рН (9,55 ±0,05), в    течение  
(19±1)  ч  на мешалке при температуре 2-8  0С в холодильной камере. Данная 
процедура приводила к образованию альдегидных групп в углеводной части 
фермента пероксидазы. 
В  дальнейшем  на  наружной  мембране  липосом  последовательно  фик-
сировали пероксидазу хрена и туберкулёзные иммуноглобулины класса G. С 
этой целью к 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы добавляли 
1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ рН 9,5, содержащей 18 мг липидов.* 
      Суспензию подвергали в течение 1 мин ультразвуковой обработке, обес-
печивающей эффективный контакт поверхности  липидной   мембраны липо- 
* Работа выполнялась совместно со с.н.с. СтавНИПЧИ  Зайцевым А.А. , 
гл.спец. Диковой С.П. и гл.спец. Головченко Т.В. 


 
86
сом с ферментом, после чего смесь инкубировали при комнатной температу-
ре 1 ч.  Ковалентное  связывание  липосом  с  ферментом  осуществлялось  за 
счёт части активированных групп пероксидазы и аминогрупп, присутствую-
щих в молекулах ганглиозидов, встроенных в мембрану липосом при их при-
готовлении. 
Несвязавшуюся  пероксидазу  удаляли  хроматографически,  используя 
колонку 100х12 мм с сефадексом G-100, уравновешенную 0,01 М КББ рН 9,5. 
В  первом  пике  экстрагировались  активированные  ферментом  липосомы,  во 
втором – несвязавшийся фермент. Фракции первого пика объединяли и к ним 
добавляли  туберкулёзные иммуноглобулины Ig G  в количестве от 2,5 до 10 
мг/мл.  Фиксацию  иммуноглобулинов  на  поверхности  липосом  с  иммобили-
зированной  пероксидазой  хрена  проводили  при  температуре (22+4)  0С,  по-
мешивая на шуттеле в течение 1-24 ч и стабилизировали 5 мг боргидрида в 
холодильнике при температуре (4-6) 0С.  При этом иммуноглобулины за счёт 
свободных  аминогрупп  связывались  с  оставшимися  свободными  альдегид-
ными  группами  углеводной  части  пероксидазы.  Для  очистки  конъюгата  от 
несвязавшихся  иммуноглобулинов  использовали  гель-хроматографию. 
Коньюгат  наносили  на  колонку    100х12  мм  с  сефадексом G-100, уравнове-
шенную ФСБ в концентрации 0,1 моль/л, рН (7,2+0,1). В результате происхо-
дило фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от 
их  размеров.  Поэтому  в  первом  пике  (свободном  объёме  колонки)  выходил 
конъюгат,  далее  несвязавшиеся  иммуноглобулины.  Элюцию  проводили  тем 
же буферным раствором, фракции собирали по 2,0 мл и исследовали погло-
щение  каждой  фракции  визуально  по  мутности  раствора  и  на  спектрофото-
метре при двух длинах волн – 280 и 403 нм. Фракции, имеющие отношение  
А403/А280,  равное 0,4-0,5, объединяли  и  к  готовому  препарату  добавляли  до    
1 % БСА.  
Установлено,  что  наиболее  высокочувствительный  липосомальный 
иммуноферментный диагностикум был получен при концентрации белка им-

 
87
муноглобулинов 5 мг/мл  и  времени  их  инкубации  с  липосомальным  фер-
ментным конъюгатом 2 ч (рис.8).  
           Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, замора-
живали  и  лиофилизировали в течение (18 ±2)  ч до конечной температуры 
25  0С.  В  готовом  препарате  контролировали  физико-химические  (раствори-
мость, цветность, прозрачность, потерю в массе при высушивании) и имму-
нологические свойства (активность, специфичность, чувствительность) после 
лиофилизации  и  в  процессе  хранения  в  течение 2 лет    (срок  наблюдения). 
Чувствительность и специфичность конъюгата определяли в ИФА аналогич-
но  способу,  описанному  выше,  с  гомологичными  и  гетерологичными  штам-
мами.  
Чувствитель-
ность, м.к/мл
  2,5
104 
2,4
105 
2,
10 3

2,
10 2

2,
108 1
Н
109 
А
2
1
2
4
24
Время, ч
Рисунок 8. Зависимость чувствительности липосомального иммуно-
ферментного диагностикума от времени иммобилизации туберкулёз-

 ных иммуноглобулинов 
 
Биотехнологическая  схема  получения  липосомального  иммунофер-
ментного диагностикума представлена на рисунке 9. 
 
 
 
 

 
88
 
Пероксидаза хрена 
        0,32 % формалин 
 
 
Инкубация 30 мин 
на мешалке 
 
 
Инкубация 30 мин 
0,04  М  раствор 
 
при встряхивании 
перйодата натрия 
 
Инкубация 60 мин 
0,16  М  раствор 
 
при встряхивании 
этиленгликоля 
 
Диализ против 0,01 М 
 
КББ, рН 9,5 
 
Активированный рас-
 
Липосомы 
твор пероксидазы 
хрена 
 
 
УЗДН  обработка 1 
 
мин при 22 кГц 
 
Гель-фильтрация 
 
 
Иммуноглобулины 
Инкубация 2 ч  при 
 
встряхивании 
 
Стабилизация  путём 
 
добавления  боргид-
 
рида 
 
Гель-фильтрация 
 
 
Контроль Rz, активно-
сти, специфичности 
 
 
Добавление БСА до 
1 % и  лиофилизация 
Рисунок 9. Биотехнологическая схема получения липосомального имму-
ноферментного диагностикума 

 
89
В  таблице  8  представлены  результаты  анализов  физико-химических 
свойств и чувствительности препарата. Разработанные препараты удовлетво-
ряют требованиям нормативных документов, а их стабильность превосходи-
ла традиционные иммуноферментные конъюгаты. 
Таблица 8. Свойства лиофилизированного липосомального иммунофер-
ментного диагностикума в процессе хранения 
 
Серия   Поте- 
Срок наблюдения  
препа-  ря в 
          1 год 
        1,5 года 2 
года (срок наблюде- 
рата 
массе  
ния) 
при 
Раствори- 
Чувст- 
Раствори- 
Чувст- 
Раствори- 
Чувст- 
высу- 
мость и  
витель 
мость  и  
витель 
мость 
витель 
шива- 
внешний 
ность 
и внешний 
ность 
и внешний  ность 
нии 
вид 
вид 
 
вид 
    
 
1 мин 
 1х105  1 мин 
 1х105 
1 мин 
 1х105 
   1 
2,6 
 
Раствор бе- 
Раствор бе- 
Раствор бе- 
 лого цвета 
лого цвета 
лого цвета 
 
 
1 мин 
5х104  1 мин 
5х104 
1 мин 
5х104 
   2 
2,6 
Раствор бе- 
Раствор бе- 
Раствор бе- 
лого цвета 
 лого цвета 
лого цвета 
   
 
1 мин 
1х105  1 мин 
1х105 
1 мин 
1х105 
    3 
2,5 
Раствор бе- 
Раствор бе- 
Раствор бе- 
 
лого цвета 
 лого цвета 
лого цвета 
   
Таким  образом,  в  результате  проведённых  исследований  разработана 
биотехнология  изготовления  иммобилизованного  ферментного  препарата,  
значительно увеличивающая его стабильность.  
Материалы  научных  разработок  легли  в  основу  методических  реко-
мендаций:  «Иммобилизация  в  липосомы  веществ  различной  химической 
природы.  Стерилизация  и  стабилизация  липосом»,  утвержденных  Первым 
зам. министра здравоохранения РФ, Главным Государственным санитарным 
врачом России Г.Г. Онищенко 06.04.2000 г.  
На Федеральном уровне утвержден нормативный документ (НД): тех-
нические условия (ТУ) 9154-00-01897080-2004 на фосфолипиды для получе-
ния липосом. Утверждены зам. Главного Государственного санитарного вра-
ча РФ Е.Н. Беляевым (Письмо № 12 ФЦ/ 2514 А от 19. 08. 2004 г).  

 
90
На  учрежденческом  уровне  утвержден  регламент  на  липосомальную 
основу  для  получения  диагностических,  лекарственных  и  косметических 
препаратов (протокол Учёного Совета СтавНИПЧИ № 4 от 20.04.04).  

 
91 
 
ГЛАВА 5. Получение туберкулёзных суспензионных диагностикумов
5.1. Биотехнология изготовления латексного диагностикума 
Реакция  агглютинации  латекса  (РАЛ)  известна  давно.  Данная  реакция 
по  своему  механизму  аналогична  реакции  непрямой  гемагглютинации 
(РНГА),  но    химические  свойства  латексных  микроносителей  относительно 
постоянны и поддаются более легкой и точной характеристике по сравнению 
с  поверхностными  структурами  наружной  мембраны  эритроцитов,  которые 
широко варьируют в зависимости от многих условий, таких как пол, возраст, 
гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови, источника 
выделения  и  методов  предварительной  обработки.  Поэтому  латексные  мик-
роносители обеспечивают более воспроизводимые результаты по сравнению 
с эритроцитами и могут с успехом их дополнять или заменять в методах им-
муноанализа.  Преимущество  латексных  (полиакролеиновых)  систем  перед 
другими  микросферами  обеспечивается  наличием  альдегидных  групп  на  по-
верхности латексных частиц, легко образующих ковалентную связь с амино-
группами белков. 
При  выполнении  настоящего  раздела  работы  перед  нами  стояли  сле-
дующие задачи: оптимизировать условия иммобилизации лигандов на синте-
тический  носитель  (использовав  иммуноглобулины  из  адсорбированных  ту-
беркулёзных  сывороток,  подобрав  количественные,  температурные,  времен-
ные  параметры  и  рН  при  сенсибилизации);  разработать    условия  стабилиза-
ции, подобрать рН и разводящую жидкость, необходимую при постановке ре-
акции агглютинации латекса (РАЛ). 
Для  приготовления  иммуноглобулиновых  диагностикумов  использова-
ли агглютинирующие туберкулёзные кроличьи сыворотки, адсорбировали их 
иммобилизованными  на  магноиммуносорбентах  гетерологичными  водорас-
творимыми антигенами, как описано ранее,  и  фракционировали иммуногло-
булины каприловым методом.  

 
92 
 
Латексную  основу – акролар  К  (ТУ 6-69-10-1824-88) получали  из  ин-
ститута  биоорганической  химии  им.  Шемякина.  Латекс    окрашен  в  малино-
вый  цвет,  со  средним  диаметром  частиц (1,2±0,1)  мкм.  Для  сенсибилизации 
матрицы  использовали  иммуноглобулины  туберкулёзные  с  концентрацией 
белка от 100 до 1000 мкг/мл. Лиганд  соединяли с 2 мл 2% полимерного носи-
теля. К этим смесям добавляли  2 мл  забуференного физиологического рас-
твора рН (7,2±0,1). Сенсибилизацию проводили в течение 1, 3, 6, 9, 12  часов 
при температуре (24±4) 0С, 37 0С и 50 0С на магнитной мешалке *.  
Далее  суспензию  осаждали  центрифугированием    при 5 000 g в те- 
чение 4-5 минут  и  дважды  отмывали  от  несвязавшегося  лиганда  забуферен-
ным физиологическим раствором рН (7,2±0,1). Осадок суспендировали в бел-
ковом  стабилизаторе  (растворённом 1:50) до  концентрации 0,2 % с 0,1 % 
формалина. Оптимальная нагрузка иммуноглобулинов составляла 400 мкг/мл 
(при  увеличении  нагрузки  белка  отсутствовал  отрицательный  контроль,  при 
уменьшении - снижалась чувствительность), время сенсибилизации 6 ч, тем-
пература – 50 0С (рис. 10). 
 
140
./
мл

 109 
.
к

120

м

 108 
100
 107 
37 C
370C 
80
 106 
50 C
500C 
60
 105 
24 C
240C 
40
 104 
Чувствительность
 
20
 103 
 
0
   102 
 102 
Время, ч
1
3
6
9
Рисунок 10. Зависимость чувствительности латексного диагности-
кума от времени и температуры сенсибилизации лиганда

________________________________________________________________ 
*Работа выполнялась совместно со с.н.с. СтавНИПЧИ  Зайцевым А.А.  

 
93 
 
Диагностическую ценность препаратов оценивали в реакции агглюти-
нации латекса (РАЛ) в U- образных микропланшетах. В качестве разводящей 
жидкости  использовали  белковый стабилизатор (состоящий из 1 части белка 
куриного яйца, 4 частей  раствора натрия двууглекислого, нейтрализованного 
1  Н  раствором  соляной  кислоты)  с  твин-80.  Перед  употреблением  белковый 
стабилизатор  разводили  в 50 раз  на 0,9 % растворе  хлорида  натрия,  рН 
(7,2±0,1)   и     смешивали   с твин-80     до конечного разведения последнего 
1:80 000. Подбор концентрации детергента (твин –80)  очень важен, так  как 
при  его  увеличении  чувствительность  диагностикума  снижалась,  а  при 
уменьшении  концентрации  твин- 80 отсутствовал  отрицательный  контроль. 
На  постановку  реакции  влияние  оказывал  рН  разводящей  жидкости.  При 
уменьшении рН до 5,0 уменьшалась активность препаратов, при увеличении 
рН до 9,0 отсутствовал отрицательный контроль. 
Постановку РАЛ микрометодом проводили следующим образом: в 8 ря-
дов  полистироловой  пластины    дозаторами  вносили  по 0,05 мл  разводящей 
жидкости.  Дозатором или иглой микротитратора, имеющей головку объемом 
0,05 мл, в первые лунки 7 рядов добавляли исследуемый материал, а в первую  
лунку 8 ряда – взвесь микробных клеток в концентрации 5х10 7  м.к./мл. Де-
лали последовательные двукратные разведения переносом по   0,05 мл из од-
ной лунки в другую   по  7-ю  лунку  включительно.  Из  последних  лунок по  
0,05 мл удаляли. 8-е лунки   использовали для контроля диагностикума. Затем 
во все лунки  добавляли по  0,025 мл диагностикума полиакролеинового (ла-
тексного) иммуноглобулинового 0,2 % концентрации. Содержимое пластины 
осторожно встряхивали до получения гомогенной суспензии и оставляли при 
комнатной температуре на (2,5+ 0,5) ч.                                          
Учет  результатов  (по  феноменам  "зонтик", "пуговка")  предварительно 
учитывали  через (2,5 + 0,5) ч,  а  окончательно  -  через 16 - 18 ч.  Результат  
РАЛ считали положительным, когда полиакролеиновые микросферы выпада-
ли на дно лунок равномерным слоем в виде «зонтика», занимая не менее 2/3 

 
94 
 
диаметра сферической поверхности дна лунки. При отрицательном результа-
те  полиакролеиновые микросферы выпадали на дно лунки в виде "пуговки" 
или узкого колечка с ровным краем. В контрольных лунках результат должен 
быть отрицательным. 
При контроле чувствительности  диагностикумов иммуноглобулиновых 
в планшетах использовали взвеси микобактерий туберкулёза  в концентраци-
ях от  5х107  до  1,95х105  м.к./мл. В результате постановки реакции      уста-
новлено,   что   чувствительность  разработанных    диагностикумов    соста-
вила  3,9х105 -  7,8х105 м.к./мл. При изучении специфичности в РАЛ на гете-
рологичных штаммах (в концентрации 1х107  и ниже) перекрёстных реакций 
не выявлено. 
Проведенные  исследования  показали,  что  по  чувствительности  и  спе-
цифичности полученные препараты в реакции агглютинации латекса удовле-
творяют требованиям нормативных документов. 
Изготовлено 5 серий  диагностикумов  туберкулёзных  полиакролеино-
вых  (латексных)  иммуноглобулиновых.  При  проведении  статистической  об-
работки по методу Е.П. Тамбовцева с соавт.(1969), в серии опытов титр РАЛ 
⎯t равен 5,2 х105 м.к./мл  (+14,1 %;-12,3 %).  
Таким образом, проанализировав литературные данные  и проведя экс-
периментальные  исследования  биотехнологии  изготовления  туберкулёзных 
латексных  иммуноглобулиновых  диагностикумов,  нами  отработаны  опти-
мальные условия, включающие использование иммуноглобулинов для сенси-
билизации  из  адсорбированных  туберкулёзных  сывороток,  нагрузку  имму-
ноглобулинов -400 мкг/мл; время сенсибилизации 6 часов при температуре - 
50 0С и рН раствора при сенсибилизации и постановке анализа - 7,2±0,1.  
5.2. Разработка биотехнологии получения алюмосиликатного диагности-
кума 
В последние годы медицина обогатилась новыми методами исследова-
ний, в которых используются новейшие достижения биотехнологии, одним из 

 
95 
 
которых  является  разработка  и  внедрение  иммобилизованных    биосистем. 
Приобретение последними биоспецифических качеств достигается путём им-
мобилизации в структуре  или на поверхности матрицы различных лигандов 
(иммуноглобулинов,  бактериальных  клеток  или  их  антигенов  и  т.д.).  Ад-
сорбция лигандов на данных системах зависит от химического строения сор-
бентов и условий иммобилизации, которая, осуществляясь на твёрдых носи-
телях,  приводит  к  значительному  повышению  термической  устойчивости  и 
стабильности лигандов.  
       Для  получения  иммуносорбентного  препарата  для  экспресс-диагностики    
микобактерий  туберкулёза  изучены  условия  сенсибилизации  матрицы  анти-
телами, стабилизации сенсибилизированных суспензий и стандартизации по-
лученных диагностикумов. В работе использовали типичные штаммы возбу-
дителя туберкулёза, из биомассы которых извлекали  антигенные комплексы, 
используя их для получения иммунных сывороток (по схеме Е.Н. Афанасье-
ва, 2000 г.) и постановки реакций как описано ранее.  
Первостепенной  задачей  при  разработке  иммунносорбентных    диагно-
стикумов является выбор матрицы с оптимальными характеристиками по от-
ношению  к  фиксируемым  биомолекулам.  Нами  выбран  алюмосиликат,  так 
как  для  данного  кремнезема  характерна  высокая  реакционная  способность 
поверхностных групп при взаимодействии со многими веществами.  
Введение  в  матрицу  красителя  обуславливает  цветовой  эффект,  в  ре-
зультате  чего  повышается  наглядность  серологического  теста.  В  качестве 
красителя использовали  аурамин.  
Следующей  задачей  был  выбор  способа  активирования  матрицы    для 
иммобилизации лиганда и достижения агрегативной устойчивости суспензии. 
Для  данной  цели  нами  использовано  поверхностно-активное  вещество  (ион-
ный  детергент)-  вторичный  алкилсульфат  натрия,  благодаря  которому  пре-
дотвращается сближение частиц, их агрегирование.  

 
96 
 
Нами  сконструированы  иммуносорбентные  диагностикумы,  представ-
ляющие собой  активированную вторичным алкилсульфатом натрия матрицу, 
состоящую из алюмосиликата и аурамина. Лигандом служили иммуноглобу-
лины, выделенные из агглютинирующих иммунных туберкулёзных адсорби-
рованных    сывороток.  В  результате  получены  иммобилизованные  системы, 
которым  присущи  положительные  свойства  неорганических  матриц:  гидро-
фильность,  жесткость  остова,  химическая  и  микробиологическая  устойчи-
вость, отсутствие набухаемости в растворах, значительная адсорбционная ем-
кость,  отсутствие  токсичности.  Нами  изучены  закономерности  иммобилиза-
ции  антител  и  условия,  при  которых  они  проявляют  иммунологическую  ак-
тивность в суспензиях.   
        Технология приготовления диагностикума состояла в следующем: к 100 
мг алюмосиликата добавляли 50 мг аурамина и готовили 2 % суспензию в 0,1 
М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ), рН (7,2+0,2).   Далее прово-
дили активирование матрицы, добавляя  0,1 мл вторичного алкилсульфата на-
трия, инкубировали 30, 60, 120, 240 мин при температуре 24 0С, 37 0С, 50 0С. 
Для  иммобилизации  использовали  иммуноглобулины  туберкулёзные  в  кон-
центрации от 1 до 10 мг/мл, в объёме 5 мл, которые инкубировали от 2 до 18 
часов, отмывали от несвязавшихся антител и красителя  0,1 М ФСБ, рН  (7,2+ 
0,2), центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяли в 0,9 
% растворе натрия хлорида с 1 % бычьего сывороточного альбумина до 1 % 
взвеси  диагностикума  и  добавляли  формалин  до 1 %. Количественное  соот-
ношение  красителя  и  алюмосиликата (1:2) оптимально.  При  исследовании 
влияния  рН  буферного  раствора  во  время  иммобилизации,  установлено,  что 
при увеличении кислотности снижается процент связывания сенситина.  Уве-
личение  рН  реакционного  раствора  до 10  приводит  к  ложноположительной 
агглютинации. В результате подбора параметров установлено, что для опти-
мальной иммобилизации достаточной является концентрация белка 1,5 мг/мл, 
время иммобилизации - 2 час при температуре (26 + 4) 0С, рН при сенсибили-

 
97 
 
зации  матрицы и постановки РСА - 7,0. Зависимость чувствительности пре-
парата от времени и рН представлена на рис.11. 
Постановку  реакции  суспензионной  агглютинации  (РСА)  осуществляли 
на  стекле.  В  качестве  положительного  контроля  использовали  взвесь  тубер-
кулёзного микроба  в концентрациях:     5х107;     2,5х107; 1,25х107; 6,25х106; 
3,125х106; 1,56х106;  7,8х105; 3,9х105 м.к./мл. В качестве отрицательного кон-
троля использовали 0,9 % раствор натрия хлорида.  
Чувстви-
тельность, 
м.к./мл   100
   104 
80
   105 
60
   106 
40
   107 
20
   108 
рН
5
   1090 
30
60
120
240
7
Время, мин
Рисунок 11. Влияние температурного, временного факторов и рН на чув-
ствительность  суспензионного диагностикума при его изготовлении 
 
На предметное стекло с отрицательным  контролем  наносили 2  капли 
(0,05  мл) 0,9 % раствора  натрия  хлорида,  рН (6,8+0,2)  и 1 каплю (0,025 мл) 
диагностикума  суспензионного  туберкулёзного  иммуноглобулинового.  На 
предметные  стёкла  с  положительным  контролем  наносили  по 2 капли  мик-
робной  взвеси  и  по 1 капле  соответствующего  диагностикума.  Капли  тща-
тельно перемешивали и при лёгком покачивании предметного стекла наблю-
дали  в  течение 1-5 мин  в  косопроходящем  свете  за  изменением  структуры 
суспензии. В отрицательном контроле агглютинация отсутствовала (рис. 12а), 
в то время как на стёклах со взвесями туберкулёзного микроба наблюдалось 
полное  просветление  жидкости  с  крупнозернистыми  хлопьями,  т.е.  чёткая 
агглютинация  (рис. 12б).  Чувствительность  суспензионных    диагностикумов 


 
98 
 
составила 7,8 х 105  -1,56х106  м.к./мл  по  корпускулярным  антигенам,  при  от-
сутствии агглютинации с гетерологичными штаммами. 
Лиофилизация  препаратов  осуществлена  на  лиофильной  установке LZ-
9С в течение 18 часов, вакууме 10 Па, конечной температуре продукта 25 0С. 
В результате установлено, что препарат стабилен в течение 1 года (срок на-
блюдения) без потери специфической активности.  
Разработанная  биотехнология  получения  туберкулёзного  алюмосили-
катного диагностикума обеспечивает получение сорбентов заданного состава, 
строения и эффективное выявление возбудителя туберкулёза.  
 
               а                                                               б 
Рисунок 12. Реакция  суспензионной  агглютинации  на  стекле           
(а – отрицательная, без контакта с антигеном; б – резко положительная, с 
взвесью туберкулёзного микроба)  

 
Испытано 5 серий  туберкулёзного  диагностикума  в 5 повторностях. 
Диагностикумы  проверены  в  РСА  на  стекле  с  гомо-  и  гетерологичными 
штаммами (таблица 9). При проведении статистической обработки по методу 
Е.П.  Тамбовцева  с  соавт.(1969),  в  серии  опытов  титр  РСА  ⎯t  равен 0,92х106 
м.к./мл  (+7,2 %;-6,7 %) . 
Чувствительность разработанных диагностикумов соответствует чувст-
вительности  диагностикумов  латексных    иммуноглобулиновых  в  реакции 
агглютинации латекса (РАЛ). При этом учет результатов РСА на стекле воз-
можен через 1-3 мин, а окончательный результат РАЛ  через 16 - 18 ч.  

 
99 
 
 
Таблица 9. Результаты сравнительной характеристики чувствительно-
сти диагностикумов туберкулёзных латексного и алюмосиликатного  
 
Штаммы микро-
Реакции 
организмов 
Чувствительность РАЛ, 
Чувствительность РСА, 
 
м.к./мл 
м.к./мл 
 
Серия-1 
Серия-2 
Серия-1 
Серия-2 
1 2 



M. tuberculosis hu-
3,9 х 105 3,9 
х 105 7,8 
х 105 7,8 
х 105 
manus Н 37 RA 
 BCG
 
3,9 х 105 7,8 
х 105 7,8 
х 105 7,8 
х 105 
М. intracellulare, M. 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
кansasii Yoss 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 
Nocardia brasiliensis 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
B.abortus 544, 19-
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
BA, 345; B. meliten-
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
sis 16M, 565, Rev-1, 
B. suis 1330, 508, 6 
Salmonella typhi 818, 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
4446 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
Streptococcus faecalis 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
Staphylococcus epi-
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
dermidis, aureus 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
АССТ 25923 
Listeria monocyto-
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
О т р и ц а- 
genes  1  -7серотип 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 т е л ь н ы й 
 
Таким  образом,  преимущество  алюмосиликатного  туберкулёзного  ди-
агностикума заключается в простоте постановки РСА и быстроте получения 
результатов. 
 
 

 
100
ГЛАВА  6.  Конструирование  магнитоуправляемых  иммуносорбентов  для 
экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза 
 
6.1.  Разработка  метода    селективного    концентрирования  возбудителя  ту-
беркулёза  на    магноиммуносорбенте  с  последующей  постановкой  иммуно-
ферментного анализа.   
 
           Основное  требование,  предъявляемое  к  современным  методам  экспресс-
анализа - выявление  низких  концентраций  патогенного  агента  в  максимально 
короткие сроки с высокой  специфичностью. В последнее время актуальным яв-
ляется  разработка  и  применение  магносорбентов,  благодаря  которым  упроща-
ются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительности пре-
паратов и возможности автоматизации учёта реакций. 
Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью 
чистоты  и  активности  используемых  ингредиентов,  но  и  свойствами  твёрдой 
фазы,  которая  должна  сохранять  иммунологические  свойства  и  стабильность, 
обладать  минимальной  активностью  неспецифически  связывать  компоненты 
анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз. 
 Целью наших исследований было конструирование тест-системы диагно-
стической  магноиммуносорбентной  (МИС)  туберкулёзной  для  иммунофер-
ментного  анализа (ИФА)  
В работе использовали изготовленные нами (глава 4) иммунопероксидаз-
ные конъюгаты туберкулёзные с активностью 1:400-1:800,  аффинные туберку-
лёзные магноиммуносорбенты, полученые по способу И.В. Жарниковой с соавт. 
(1999), оптимизируя параметры, применительно к данной инфекции. 
Нами  разработана  биотехнология  приготовления  органокремнезёмного 
магносорбента  на  основе  окиси  железа (III) и  алюмосиликата.  Модифицирова-
ние поверхности  осуществляли в присутствии полимера - декстрана и поверх-
ностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия.  
На  основе  проведенных  исследований  рекомендованы  следующие  опти-
мальные условия  получения алюмосиликатных магносорбентов: весовое соот-

 
101
ношение  компонентов  синтеза  окиси  железа,  декстрана,  алюмосиликата 2:2:1; 
время  гелеобразования 2 часа  (при  увеличении  времени  удлиняется  процесс 
синтеза магносорбента, уменьшается размер его пор, что приводит к снижению 
степени иммобилизации лиганда в порах сорбента), значение рН гелеобразова-
ния -7,0.  
         При возрастании  количества окиси железа в композиционной смеси про-
исходит увеличение размера радиуса пор сорбента и  уменьшение  удельной по-
верхности    МС.  Декстран  оказывает  стабилизирующий  эффект  за  счёт  образо-
вания   вокруг частиц   геля сольватных  оболочек в связи с   возникновением  
комплексов между электронодонорными атомами кислорода молекул органиче-
ского вещества и силанольными  группами кремнеземных  корпускул.  Алюмо-
силикат – пористый  кремнезёмный носитель обладает активной поверхностью 
в отношении белков, проявляя  механическую,  микробиологическую и химиче-
скую устойчивость. 
Далее  проводили  иммобилизацию  специфических  туберкулёзных  имму-
ноглобулинов на МС (данные препараты  без потери специфической активности 
хранятся в течение 3 лет (срок наблюдения). В качестве «сшивающего» агента 
нами  использовано  поверхностно-активное  вещество  (ПАВ)-вторичный  алкил-
сульфат натрия,  при этом прочность связи антител с магносорбентом повыша-
ется  за  счёт  создания  дополнительных  связей,  которые  образуются  между  ак-
тивными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсульфа-
та натрия (рис.13).  
     R2                                                                                                                                     R1 
                                             HOH  
R1-C-OSO3Na + NН 2 -АТ            АТ-NH3 –O-SO3 -CH_       + NaOH 
             
     H                                                                                      R2 
Рисунок 13. Схема получения МИС  с помощью вторичного алкилсульфата 
натрия 

 
 

 
102
Для иммобилизации использовали различную концентрацию белка имму-
ноглобулинов (0,5-10 мг/мл).  Исследования  показали,  что  концентрация  белка 
иммуноглобулинов 2,0 мг/мл является оптимальной для полного насыщения ан-
тителами сорбента  в  объеме 0,4 мл 10 % взвеси. При увеличении концентрации 
белка адсорбционная емкость МИС снижалась.  Вероятно, это объясняется фак-
торами стерического характера.  
Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являют-
ся:  время иммобилизации 2 часа при значении рН  раствора  иммуноглобули-
нов (6,0 - 7,0) и температуры в интервалах (22 + 4) оС и (37 + 1) оС.     
Методы  получения  МИС  просты  и  технологичны,  исключают    примене-
ние  токсичных  веществ,  изготовлены  из  отечественных  экологически  чистых 
компонентов. Полученные МИС характеризуются стандартностью структурных 
характеристик,  механической,  химической  и  микробиологической  устойчиво-
стью.  
Сконструированные  МИС  были  использованы  при  экспресс-диагностике 
возбудителя туберкулёза. 
          Эксперименты  проводили  с  чистыми  культурами  туберкулёзного  микро-
ба.  Из  культур    микобактерий  готовили  взвеси  с    концентрациями  от  1х101  до 
1х109 м.к. в 1мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концен-
трации микобактерий и по 0,2 мл 10 % суспензии туберкулёзного магноимму-
носорбента,  инкубировали  в  течение 30 – 60 мин  при  комнатной  температуре, 
затем тщательно отмывали забуференным физиологическим раствором, вноси-
ли по 200 мкл  рабочего разведения  пероксидазного коньюгата и инкубировали  
при  температуре  (22+4) 0С или (37±1) 0С  в течение 15, 30 и 60 мин. Промыва-
ли 0,1 М фосфатно –солевым буфером с твин-20 не менее 6 раз, используя по-
стоянный магнит, поднося его к стенке флакона, в результате чего МИС оказы-
вались фиксированными магнитным полем. После чего во флаконы вносили по 
200  мкл  хромогенной  смеси.  Через 1 – 2 мин  (когда  надосадочная  жидкость 
слегка желтела в отрицательном контроле) содержимое флаконов переносили в 

 
103
микропланшеты и останавливали реакцию 50 мкл стоп-реагента (2М раствором 
серной  кислоты).  Для  учета  результатов  производили  измерение  оптической 
плотности  на  приборе  "Мультискан"  при  длине  волны 492 нм.  Ответ  считали 
положительным  при  превышении    оптической    плотности    опытного  раствора 
над контрольным (без контакта с антигеном) в 2 и более раза.  
Аналогично проводили  иммуноферментный анализ и  в модельных опы-
тах  на  нестерильной  воде  в  объёме 500 мл,  контаминированной  различными 
концентрациями  туберкулёзных  микобактерий.  Суспензии  пропускали  через 
устройство,  удерживающее  МИС  магнитным  полем.  МИС  после  контакта  с 
пробой тщательно промывали, снимали с ловушки, помещали во флакон и  про-
водили ИФА по вышеописанному методу. Отрицательным контролем служили 
МИС, не контактировавшие с антигеном.  
В  обоих  опытах  получены    положительные  результаты  при  наличии  в 
объеме пробы (1 мл и 500 мл) 0,5х102-1х102 м.к. и выше.  
Результаты  проведённых  исследований  показали,  что  чувствительность 
ИФА    одинакова  при    исследуемых    температурных   режимах  -      (22+4)  0С    и 
(37±1) 0С. Другим важным параметром являлся временной режим. Установлено, 
что  равновесный  процесс  между    антигеном  и  МИС  наступал  через 30 мин,  а 
между образовавшимся комплексом сорбент- антитело - антиген с конъюгатом - 
через 15 мин. Важным являлось количество отмывок после контакта с конъюга-
том, так как при отмывке меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т.е. 
наблюдались  фоновые  значения  оптической  плотности  в  отрицательном  кон-
троле.  
Для сравнения полученного диагностикума с традиционным методом по-
становки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные 
туберкулёзными  иммуноглобулинами  в  течение 18 ч,  после  чего  проводили 
анализ  в  соответствии  с  методикой M.Clark и A. Adams (1977) в  "сэндвич"-
варианте ИФА. Чувствительность ИФА в данном случае составила 5х104 - 1х10 5  
м.к./мл. При этом время постановки ИФА с применением МИС составило 1-1,5 

 
104
ч,  а  традиционным  методом,  учитывая 18 часовую  сенсибилизацию  планшет, 
около 20 ч.  Если  объём  исследуемой  пробы  при  использовании  стандартных 
планшет не превышает 0,2 мл, то при применении МИС он неограничен (в на-
шем случае он равнялся 500 мл).  
Результаты контроля специфической активности и специфичности тубер-
кулёзного  МИС  представлены  в  таблице 10. Для  контроля  специфичности  ис-
пользовали штаммы культур гетерологичных микроорганизмов, из которых го-
товили взвеси с концентрацией от 1х106 до 1х10 2м. к. в пробе.  
Разработанная диагностическая система отличалась высокой специфично-
стью,  не  давая  положительных  результатов  с  гетерологичными  микроорганиз-
мами (таблица 10). 
Таблица 10. Результаты контроля специфической активности и специфич-
ности туберкулёзного МИС в ИФА в сравнении с традиционным методом 
ИФА 
 
Вид  микроорга-

МИС в ИФА 
Традиционный метод  
низма 
ИФА 
Концентрация м.к. в пробе 
106  105  104  103  102  106  105  104  103  102 
Показатель оптической плотности: опыт/отрицательный 
контроль 
M. tuberculosis hu-
5,9 4,9 4,8 4,9 4,8 4,1 2,4 1,5 1,1 0,1 
manus Н 37 RA 
 BCG 
4,6 4,5 4,4 4,3 4,2 2,3 2,2 1,4 1,0 0,07 
М. intracellulare 
1,0 0,2 0,16 0,15 0,1 1,2 1,1 1,0 0,9 0,7 
Nocardia brasiliensis 
0,7 0,3 0,25 0,12 0,1 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 
B.abortus 544, 19-BA, 
0,5  0,21 0,16 0,12 0,09  1,3  1,2  1,1  1,0  0,9 
345 
B. melitensis 16M, 565,  
0,7 0,32 0,24 0,11 0,1  1,2  1,1  1,0  0,9  0,9 
Rev-1 
B. suis 1330, 508, 6 

0,7 0,3 0,25 0,12 0,1 1,1 1,1 0,9 0,8 0,8 
Listeria monocytogenes   0,5  0,21 0,16 0,12 0,09  1,3  1,2  1,1  1,0  0,9 
1  -7серотип 
 
При  использовании  стандартного  иммуноферментного  метода  имеются 
следующие  недостатки,  которые  отсутствуют  в  предложенной  тест-системе  в 
связи  с  использованием  магнитоуправляемого  магносорбента  с  включёнными 

 
105
антителами: 1) для исследования берётся ограниченный 0,2 мл объём исследуе-
мого материала (т.к. объём лунки – 0,4 мл), в то время как при использовании 
магноиммуносорбента  объём  неограничен; 2) время  постановки  иммунофер-
ментного  анализа  около 20 часов,  включая 18-ти  часовую  сенсибилизацию,  а 
время проведения анализа с магноиммуносорбентами – 1-1,5 ч, 3) чувствитель-
ность иммуноферментного метода 5х104  - 1х10 5   м.к./мл по корпускулярному 
антигену,  а  чувствительность  представленной  тест-системы  составляет 1x102 
м.к./мл.  
Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадала необходимость 
в  полистироловых  планшетах,  становилось  возможным  проведение  анализа 
проб неограниченного объёма, сокращалось время сенсибилизации твёрдой фа-
зы в 15 раз, значительно увеличивался срок её хранения. Время проведения не-
посредственно анализа сокращалось в 1,5 раза, а чувствительность  повышалась 
на несколько порядков по сравнению с общепринятым ИФА.  
Нами проведены исследования по определению активности иммуногло-
булиновых МИС жидких в ИФА в процессе их хранения.  При закладке опыта  
активность  МИС  составляла 100 м.к.  в  пробе,  опыт  превышал  отрицательный  
контроль  (без    контакта  с  антигеном)  в 3 и  более  раз.  Через 12 месяцев  после 
проведения повторного контроля диагностикумов были получены аналогичные 
результаты.  Такие  исследования  проводили  каждый  год  в  течение 3 лет  (срок 
наблюдения).  Препараты  сохраняли  свои    физико-химические  свойства  и  спе-
цифическую активность в течение всего срока наблюдения и оставались меха-
нически прочными, химически стабильными, устойчивыми к действию микро-
организмов (таблица 11).     
При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с 
соавт. (1969), в  серии  опытов  титр  ИФА  ⎯t  равен 0,8х10  2  м.к./мл    (+8,7 %;-8,0 
%).  
Нами  приготовлено 5 серий  тест – систем  магноиммуносорбентных  для 
диагностики возбудителя туберкулёза в иммуноферментном анализе (ИФА), в  

 
106
Таблица  11. Показатели качества туберкулёзных  МИС в зависимости от 
срока  хранения 
Номер  серии  Дата 
Показатели качества                                      
и 
кон-
Прозрач-
Цветность 
Специфическая активность 
наименование  троля 
ность    при  при  взбалты- Штаммы 
Чувстви-
препарата 
 
стоянии 
вании 
микроорганиз-
тельность  в 
 
 
мов 
ИФА,  м.к. в 
 
пробе 
1 3 4 



       С-1 
2002 
Бесцветная  
Взвесь  чёрно- M. tuberculosis   
2003 
прозрачная 
го    цвета  с  humanus  Н 37 
 
МИС  тубер- 2004 
надосадоч-
магнитными 
RA 
 
кулёзные 
2005 
ная 
жид- включениями,   
0,5-1х102 
 
кость,  оса- без 
приз-  BCG 
док  чёрного  наков 
кон-  
цвета 
гломерации  
 
 
которые  входят: туберкулёзные магноиммуносорбенты -10 % взвесь, 3 ампулы 
по 2 мл; положительный контроль - обеззараженные  клетки микобактерий ту-
беркулёза 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула -1 мл; иммунопероксидазный конъюгат с ак-
тивностью 1:400-1:800 и  все  ингредиенты,  необходимые  для  постановки  ИФА 
(ФСБ, БСА, твин –20, цитратный буфер, хромоген, гидроперит, стоп-реагент).  
Кроме стандартного метода ИФА, нами разработан и  модифицированный 
способ его постановки, обеспечивающий упрощение, сокращение времени ана-
лиза при высокой чувствительности метода. 
Сущность модификации при постановке анализа заключалась в том, что в 
качестве твёрдой фазы используются магносорбенты с иммобилизованными ан-
тителами (эту операцию можно провести заранее и хранить данные препараты  
без потери специфической активности в течение 3 лет (срок наблюдения). По-
становку  ИФА  осуществляют  в  наконечниках  от  дозаторов,  шприцах  или  ма-
леньких колонках, внося туда 2 мл 10 % взвеси аффинных МИС. В дальнейшем 
через  МИС  пропускают  исследуемый  материал,  а  через  сорбент  с  отрицатель-
ным контролем - фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) с твин-20. За 2 – 5 
мин через МИС, взаимодействуя с антителом, прикреплённым к магносорбенту, 
проходит антиген, находящийся в исследуемом материале, формируя комплекс 

 
107
антитело-антиген  (АТ-Аг).  МИС  промывают 1 мл  ФСБ-твин    и  вносят 0,2 мл 
рабочего  разведения  туберкулёзного  иммунопероксидазного  конъюгата,  кото-
рый, проходя через МИС,  взаимодействует с комплексом АТ-Аг. Далее колон-
ку  промывают 5 мл  ФСБ-твин.  Для  визуализации  реакции  через  сорбент  про-
пускают 0,2 мл субстрат-индикаторного раствора и учитывают результаты через 
1-2  мин  на  сканирующем  приборе  «Мультискан»  при 492 нм,  добавив  в  окра-
шенный  раствор  стоп-реагент.  Ответ    считают    положительным,  если  оптиче-
ская  плотность  опытного  раствора  превосходит  оптическую  плотность    кон-
трольного  в 2 и более раза.  В результате проведённых опытов было установле-
но, что показания оптической плотности опытных образцов превышали показа-
ния отрицательного контроля более чем в 5 раз, что говорит о положительном 
результате реакции. Данный метод позволяет обнаружить микобактерии  в пре-
делах 1х102 - 1х10 3 м.к. в пробе, при отсутствии перекрёстных реакций с гете-
рологичными штаммами, что свидетельствует о специфичности метода.  
Таким образом,  при использовании МИС в модифицированном ИФА от-
падает  необходимость  в  полистироловых  планшетах.  Пористая  структура  маг-
носорбента  оптимальна  для  образования  иммунохимического  комплекса  анти-
ген-антитело,  исключает  внутридиффузионное  торможение  при  проведении 
анализа. 
Высокую чувствительность ИФА с применением МИС можно объяснить  
тем, что для такого фермента как пероксидаза, используемого при изготовлении 
иммуноферментного конъюгата, металл, входящий в структуру МИС, повышает 
каталитическую функцию энзима (Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1982).  
В  качестве  иммунопероксидазного  конъюгата  для  выявления  МТБ  ис-
пользовали  также  его  липосомальную  форму,  получение  и  свойства  которой 
описано  в  главе 4. Данный  препарат  применен  при  постановке  ИФА  с  МИС. 
Схема постановки анализа представлена на рис. 14. 
После контакта МИС с антигеном во флаконы вносили по 0,2 мл туберку-
лёзного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата  в его рабочем разве-

 
108
дении, инкубировали при  температуре (22 ±4)   0C в течение 15-20 мин и про-
мывали 5-6 раз 0,1 М  ФСБ  с  твин-20.  Во  все  флаконы  вносили  хромогенную 
смесь. Через 1-2 мин надосадочную  жидкость  из флаконов дозатором перено-
сили в планшет по 0,10-0,15 мл и останавливали реакцию, внося по 0,05 мл рас-
твора серной кислоты в концентрации 4  моль/л.  Визуально  регистрацию  ре-
зультатов  оценивали  по изменению интенсивности окраски смеси от оранже-
во-желтого цвета (опытные) до слабо желтого   (контрольные). При  инструмен-
тальном учете на фотометре оптическую плотность хромогенной смеси измеря-
ли при длине волны 492  нм. 
 
 
Взаимодействие МИС с Аг 
         
30- 60 мин при температуре (22+4) 0С 
                            Отмывка от несвязавшегося  Аг 0,1 М  ФСБ 
         
с твин-20 
 
  
Адсорбция  липосомально-иммуноперокси-
 
дазного конъюгата 15 мин при температуре 
 
(22+4) 0С 
 
 
Отмывка от несвязавшегося  конъюгата 0,1 
 
М ФСБ с твин-20
 
 
Выявление активности после  контакта с 
 
субстратной смесью в течение 1-2 мин 
 
 
Количественный учёт ферментативной ре-
 
акции 
 
 
Рисунок 14. Схема  постановки  ИФА  с  использованием  МИС  и  липосо-
мально-иммунопероксидазного  конъюгата
 
 
Чувствительность препарата при выявлении МТБ была не ниже 1х10 2 м.к. 
в  пробе,  при  отсутствии  перекрёстных  реакций  с  гетерологичными  штаммами 
бактерий. Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, замо-
раживали  и лиофилизировали в течение (18 ±2)  ч до конечной температуры 25 
0С. В готовом препарате контролировали физико-химические свойства (раство-

 
109
римость,  цветность, прозрачность, потерю в массе при  высушивании), а также   
иммунологическую  активность,  специфичность,  чувствительность  после  лио-
филизации и в процессе хранения в течение 3 лет  (срок наблюдения). Данные 
представлены в таблице 12. 
Таблица 12. Результаты наблюдения за липосомально-иммунопероксидазным 
конъюгатом после  лиофилизации в процессе хранения 
 
Серия  Поте- 
Срок наблюдения  
препа- ря в 
          1 год 
        1,5 года 3 
года (срок наблюде- 
рата 
массе  
ния) 
при 
Раствори-  Чувстви- 
Раствори- 
Чувстви- 
Раствори- 
Чувстви- 
высу-  мость и  
тельность  мость  и  
тельность  мость 
тельность 
шива-  внешний 
в ИФА с  
и внешний 
в ИФА с  
и внешний 
в ИФА с  
нии 
вид 
МИС 
вид 
МИС 
вид 
МИС 
 
 
    
 
1 мин 
 1х102 
1 мин 
 1х102 
1 мин 
1х102 
   1 
2,6 
Раствор бе-
Раствор бе-
Раствор бе-
лого цвета 
 лого цвета
лого цвета 
 
 
1 мин 
5х101 
1 мин 
5х101 
1 мин 
5х101 
   2 
2,6 
Раствор бе-
Раствор бе-
Раствор бе-
лого цвета 
 лого цвета
лого цвета 
   
 
1 мин 
1х102 1 
мин 
1х102 1 
мин 
1х102 
    3 
2,5 
Раствор бе-
Раствор бе-
Раствор бе-
 
лого цвета 
 лого цвета
лого цвета 
 
 
 
Учитывая,  что  липосомальный  туберкулёзный  иммуноферментный  диаг-
ностикум  при  использовании  в  качестве  твёрдой  фазы  МИС  позволял  в  ИФА 
обнаруживать МТБ в гораздо меньшем количестве, чем при постановке тради-
ционной  реакции  в  полистироловых  микропланшетах,  т.е.  обладал  большей 
чувствительностью,  нами  было  получено  5 серий  этих  диагностических  тест-
систем.  В  полученный  набор  входят:  лиофильно  высушенный  липосомально- 
иммуноперооксидазный конъюгат, 0,1 мл в ампуле; взвесь туберкулёзного мик-
роба 109 м.к./мл (положительный контроль); туберкулёзный МИС (10 % взвесь)-
2 ампулы по 2 мл, необходимые ингредиенты для постановки ИФА (ФСБ, БСА, 
твин-20,  стоп-реагент-  по 1 флакону, 0-фенилендиамин-2  флакона  и  таблетка 
гидроперита).  

 
110
Таким образом, нами  разработана  биотехнология  изготовления магноим-
муносорбентных  диагностикумов  и  на  их  основе  сконструированы  диагностиче-
ские тест – системы для проведения сочетанного метода детекции микроорганиз-
мов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постановки ИФА с МИС. 
Установлено, что  туберкулёзные магноиммуносорбенты в жидком виде стабиль-
ны  без  потери  физико-химических  и  иммунологических  свойств  в  течение 3 лет 
(срок наблюдения). ИФА с применением МИС характеризуется высокой чувстви-
тельностью (1х102 м.к. в пробе), специфичностью, быстротой постановки реакции 
(1-1,5 ч), стоимостью в 1,5 раза ниже традиционного ИФА (таблица 13). При этом 
отпадает  необходимость  применения  сенсибилизированных  микропланшет.  При 
использовании  разработанной  липосомально-иммунопроксидазной  тест-системы 
повышается  срок  годности  препарата  в 2 раза  при  сохранении  его  физико-
химических и каталитичесих свойств. 
                     Таблица 13. Технико-экономическое  обоснование    применения  сочетанных      
методов МИС с ИФА 
Анализы 
Коли Время
Статьи затрат 
Стои-
 
чест- по- 
Зара-  Начис- Сы- Обо- Наклад мость 
 
во 
ста-  бот-  ления  рьё  ирудо-  ные 
10 
 
ана- нов-  ная 
на  зар.  мате-вание  расхо-
ана-
 
ли- ки, ч  плата  плату 
риа-  
ды 
лизов, 
зов 
(35,8%)  лы   
руб 
п 
(90%) 
  
тради-
     3*  1135,8  
48,62   45,0 19,2  223,76  423,58
 
ционный 
 
 ИФА 
10 
 
       соче-
     1 
 78,6    28,14 
42,0 19,2  151,15  319,09
танный  
 
Примечание: * Время постановки традиционных анализов ИФА  без     учёта 18 ча-
совой сенсибилизации планшет. 
На основании сконструированных препаратов и проведённых исследований 
разработаны  методические  рекомендации  «Применение  магноиммуносорбентов 
для  выявления  микобактерий  туберкулёза»,  одобренные  Ученым  Советом  Ста 
НИПЧИ  (протокол  № 3 от 3.03.05) и  утвержденные    директором  института.  Со-

 
111
ставлены    нормативные  документы:  регламент  производства  и  инструкция  по 
применению  на  тест-систему  диагностическую  липосомально-  иммунопероокси-
дазную  для    выявления  антигена  возбудителя  туберкулёза    иммуноферментным 
методом, рассмотренные на Учёном Совете СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05 
г) и  утвержденные  директором института.  
 
6.2. Разработка метода  селективного  концентрирования возбудителя туберкулёза 
на            магноиммуносорбенте  с  последующей  постановкой  количественного 
иммунофлуоресцентного анализа 

 
В  последние  годы    при  выявлении  МТБ  широко  применяют  люминесцент-
ную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффек-
тивность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения МТБ, простота 
флюорохромирования делает его доступным для практических лабораторий. Пре-
имущество метода люминесцентной микроскопии состоит в том, что она позволя-
ет просматривать в короткий срок больше полей зрения, чем при обычной  микро-
скопии с иммерсионной системой, при этом удаётся быстрее и в большем количе-
стве  выявлять  МТБ.  Люминесцентная  микроскопия  с  применением  аурамина 
позволяет увеличить процент находок  на 8 % по сравнению с методом флотации 
и на 17 % по сравнению с прямой бактериоскопией мазка (Приказ МЗ РФ № 558, 
1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люминесцентными красителями, в 
частности аурамином, основан на способности липидов микобактерий восприни-
мать люминесцентные красители  и затем светиться при облучении их ультрафио-
летовыми  лучами.  Этим  методом  можно  исследовать  любой  материал,  кроме 
мочи,  в  котором  могут  присутствовать  трудно    дифференцируемые    при    такой   
окраске   сапрофиты   (Приказ  МЗ  РФ № 558, 1978).  
Другим  важным  преимуществом  метода  люминесцентной  микроскопии  яв-
ляется  способность  обнаруживать  изменённые  микобактерии,  утратившие  под 
влиянием  ряда  факторов,  в  частности  интенсивной  химиотерапии,  свойство  ки-
слотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Ци-

 
112
ля-Нильсена (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования 
при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001). 
При  окраске  микобактерий  аурамином  возможны  ложноположительные  
результаты    в  результате  некачественного  обесцвечивания  мазка  с  сохранением 
некоторыми  сапрофитными  бактериями  оранжевой  окраски.  Микроскопические 
исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не позволяют дифферен-
цировать микобактерии комплекса Mуcobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных 
(атипичных микобактерий) микобактериозов. Используя эти методы, можно толь-
ко сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобакте-
рий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение №11, 2003). 
При  внутривидовой  дифференциации  бактерий  наиболее  перспективными 
являются  методы  диагностики,  основанные  на  образовании  комплекса  антиген-
антитело, особенно в связи с возможностью использования в иммунофлуоресцен-
ции твёрдых носителей  (Стоев К.Г. с соавт., 1981; Подзолкова Г.Г. с соавт., 1989 и 
т.д.).  
Нами  апробирован  данный  метод  с  применением  магноиммуносорбентов 
для обнаружения антигенов возбудителя туберкулёза и определены оптимальные 
параметры постановки КИФА, чувствительность и специфичность метода.  
Эксперименты  проводили  с  чистыми  культурами  туберкулёзного  микроба. 
Из культур готовили взвеси с  концентрациями от 1х101 до 1х109 м.к/мл. Во фла-
коны вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации микобактерий и по 
0,2 мл 10 % суспензии туберкулёзного магноиммуносорбента. Смесь инкубирова-
ли в течение 15, 30, 60 мин при температурах (22±4) 0С  и (37±1) °С,  затем грану-
лы МИС отмывали 0,9 %  раствором хлорида натрия рН 7,2, используя для сепа-
рации постоянный магнит, удерживающий МИС на внутренней стенке флаконов. 
В дальнейшем к МИС добавляли 200 мкл раствора иммуноглобулинов G туберку-
лёзных флуоресцирующих (полученных нами при конъюгации иммуноглобулинов 
из  адсорбированной  туберкулёзной  сыворотки  путём  фракционированния  капри-
ловой  кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969) с  ФИТЦ (C21H11NO5S)  по  методу 


 
113
X.Шторц (Stortz, 1987) и инкубировали   15, 30, 60  мин  при  (22±4) 0С  и (37±1) 
0С. Сорбент отмывали вышеуказанным способом 2-3 раза забуференным физиоло-
гическим раствором и 1 раз дистиллированной водой. Контролем служили грану-
лы  МИС,  не  контактировавшие  с  исследуемым  материалом  и  окрашенные  флуо-
ресцирующими иммуноглобулинами. Исследуемые опытные и контрольные взве-
си в объеме 20 мкл наносили на предметное стекло и микроскопировали. Прибо-
ром,  регистрирующим  уровень  свечения  магнитных  гранул,  служил  люминес-
центный  микроскоп  ЛЮМАМ  Р-8,  оборудованный  фотометрической  насадкой 
ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой 
универсальный  В7-76.  Рабочее  напряжение  составляло 800 – 900 В,  увеличение 
объектива х40 и окуляра х10. Применялись  возбуждающие светофильтры БС-8-2, 
СЗС-7-2, ФС-1-6. Диаметр зонда фотометрической насадки составил 0,5 мм. После 
обнаружения  в  поле  зрения  гранул  сорбента  закрывали  полевую  диафрагму  и 
снимали цифровые показания уровня свечения 10-15 гранул на вольтметре. Опре-
деляли среднеарифметические значения величины флуоресценции опытных (рис. 
15), контрольных гранул и пространства между ними – фона. 
 
Рисунок 15. Люминесцентная  микроскопия  магноиммуносорбента  с  фик-
сированными на нём МТБ.  Увеличение х400 
 
 

 
114
Интенсивность  флуоресценции  магноиммуносорбента  (М)  представляла 
собой  разницу  между  среднеарифметическими  показателями  уровня  свечения 
гранул  и  фона: (М)=  М  гранул – М  фона.  За  положительные  принимались  ре-
зультаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в 2 и более раз 
превышал    аналогичный      показатель    контрольных (Владимцева И.В. с со-
авт, 1989).  
Для  оценки  способности  туберкулёзных  МИС  концентрировать  на  своей 
поверхности специфический антиген приготавливали пробы водопроводной во-
ды объёмом 500 мл, куда вносили МТБ в количестве 101, 102, 103, 104, 105 м.к. В 
дальнейшем  эти  пробы  пропускали  через  МИС,  находящиеся  в  специальной 
«ловушке» и удерживающиеся в ней магнитным полем.  
Общая схема постановки КИФА представлена на рисунке 16. 
 
 
Взаимодействие 
МИС 
с   
                        антигеном  30 мин  при  темпе-
 
ратуре (22+4)  оС 
 
 
Отмывка МИС от несвязавше-
гося  антигена  забуференным 

 
физиологическим 
раствором 
 
рН 7,2  
 
Взаимодействие    комплекса 
МИС-антиген  с  туберкулёз-

 
ными 
иммуноглобулинами 
 
флуоресцирующими 15 мин 
 
при  температуре   (22+4)  0С   
 
 
Отмывка МИС от несвязавше-
 
гося       компонента 
 
Количественный учет КИФА  
 
Рисунок 16. Схема  постановки  количественного  иммунофлуоресцентного 
анализа с использованием в качестве твёрдой фазы МИС. 

 
МИС  после  контакта  с  пробой  промывали 100 мл  забуференного  физио-
логического раствора рН 7,2, помещали во флакон и  проводили КИФА по вы-

 
115
шеописанному  методу.  Контролем  служили  туберкулёзные  МИС,  неконтакти-
ровавшие с антигеном.  
МТБ во всех случаях были выявлены при наличии в пробах 1х102 м.к. и 
выше.  Аналогично  контролировали  специфичность  диагностической  системы, 
используя гетерологичные штаммы (таблица 14). В результате установлено от-
сутствие перекрёстных реакций.  
В процессе отработки различных условий проведения анализа установле-
но, что чувствительность КИФА была одинаковой при  исследуемых  темпера-
турных  режимах сорбции антигена на МИС- (22+4) 0С  и (37±1) 0С, а для кон-
такта  сорбента  с  антигеном  и  окрашивания  образовавшегося  комплекса  флуо-
ресцирующими иммуноглобулинами было достаточно 15-30 мин инкубации.   
 
Таблица 14. Результаты изучения специфической активности и специфич-
ности туберкулёзных МИС в   КИФА  
 
 
1 серия 2 
серия 3 
серия 
Штаммы 
Концентрация м.к. в пробе 
 
105 
102 
101 
105 
102 
101 
105 
102 
101 
 
Отношение уровня флюоресценции опытных гранул к  
 
контрольным 
M. tuberculosis hu-
4,5  4,0 1,7  3,6  3,9 1,5 3,9 4,1 1,2 
manus Н 37 RA 
 BCG
 
 
3,8  4,3 1,5  4,3  4,1 1,7 3,6 3,7 1,9 
M. аvium  D4 ER 
4,7  4,3 1,6  4,8  4,3 1,5 4,7 4,2 1,9 
М. intracellulare 
0,9  0,6 0,6  0,7  0,7 0,6 0,9 0,6 0,8 
Nocardia brasiliensis 
0,6  0,9 0,7  0,6  0,9 0,9 0,8 0,9 0,7 
B.abortus 544, 19-BA, 
0,7  0,8 0,7  0,7  0,8 0,7 0,8 0,7 0,8 
345* 
B. melitensis 16M, 565, 

0,9  0,8 0,9  0,8  0,9 0,8 0,9 0,6 0,8 
Rev-1* 
B. suis 1330, 508, 6*
 
0,8  0,9 0,8  0,9  0,8 0,9 0,7 0,9 0,7 
Listeria monocyto-
0,9  0,9 0,9  0,8  0,6 0,9 0,7 0,8 0,7 
genes  1  -7серотип* 
Отрицательный 

0,9  0,8 0,6  0,9  0,6 0,8 0,6 0,8 0,7 
контроль 
Примечание  *-  представлены средние данные для  возбудителей инфекций 
 
Из  таблицы  следует,  что  отношение  уровней  флюоресценции  опытных 
МИС в 2 раза выше по сравнению с контрольными, не контактирующими с ан-

 
116
тигеном,  а  также  с  сорбентами,  обработанными  гетерологичными  штаммами. 
Данная диагностическая система позволяет выявлять возбудитель туберкулёза в 
концентрации 0,5х102 - 1х102 м.к./пробе. 
При проведении статистической обработки по методу Е.П. Тамбовцева с 
соавт.(1969)  в  серии  опытов  чувствительность  КИФА⎯t  равна 0,82х102  м.к./мл  
(+7,9 %;-7,3 %). 
Нами приготовлено 5 серий тест – систем МИС для диагностики возбуди-
теля  туберкулёза  в  КИФА,  в  которые  входят 3 амп.  по 2 мл.  туберкулёзных 
МИС  -10 % взвесь; положительный контроль - обеззараженные  клетки мико-
бактерий туберкулёза, 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула - 1 мл; иммуноглобулины тубер-
кулёзные флуоресцирующие сухие – рабочее разведение 1:16 – 1:64 – 1 амп-0,5 
мл.   
При проведении технико-экономического обоснования применения соче-
танных  методов  МИС  с  КИФА  установлены  явные  преимущества  данного  ме-
тода перед традиционной иммунофлюоресцентной реакцией (таблица 15). 
Таблица 15. Технико-экономическое обоснование  применения сочетанных     
методов МИС с КИФА 
 
      Анализы 
К 
Статьи затрат 
Стои-
 
Коли- Вре- Зара- Начис- Сы- 
Обо- На-
мость 
 
чество  мя 
 бот- 
ления  рьё  и рудо- клад-
10 
 
ана-
поста ная 
на  зар.  мате-  вание  ные 
анали-
 
лизов  нов- плата плату 
риалы 
расхо-
зов, 
ки, ч
(35,8%)
ды 
руб 
(90 %) 
 

  тради- 
 

109,2   39,09   28,1 
 21,3   177,92  375,61
РИФ  ционный 
 
 
 
сочетан-  10 

78,6    28,14   19,9 
 24,8   136,29  287,63
КИФА  ный 
Таким образом,  нами  разработана  биотехнология  изготовления тубер-
кулёзных МИС, на их основе сконструированы диагностические тест – системы 
для проведения сочетанного метода детекции возбудителя туберкулёза в КИФА  
и оптимизированы параметры постановки этой реакции. Данный метод обеспе-

 
117
чивает селективное концентрирование МТБ на сорбенте, обладает высокой чув-
ствительностью (0,5х102 - 1х102 м.к./в пробе), в 1000 раз превышающую чувст-
вительность общепринятой РИФ, специфичностью и отличается быстротой по-
становки реакции (1-1,5 ч). При этом реакция учитывается не только визуально, 
но и инструментально в условных единицах по показаниям вольтметра. 
 
 

 
118
ГЛАВА 7.  Изучение  диагностической  ценности  разработанных  диагности-
кумов и тест-систем для выявления антигена возбудителя  туберкулеза
  
 
Для  получения  положительных  результатов  клинического  применения 
разработанных диагностических препаратов и тест-систем при выявлении МТБ  
необходимо иметь чёткое представление о специфике выявляемого заболевания, 
его  локализации  в  организме  человека, о свойствах возбудителя микобактерий 
туберкулёза, методах подготовки исследуемых материалов, так как от совокуп-
ности знаний этих составляющих зависит качество диагностики.  
Существует  многообразие  форм  туберкулёзной  инфекции,  наиболее  рас-
пространёнными  являются:  туберкулёз  внутригрудных  лимфатических  узлов; 
диссеминированный;  милиарный;  кавернозный  туберкулёз;  туберкулёз  медиа-
стинальных лимфоузлов.  
Туберкулёз внутренних лимфатических узлов - вариант первичного ту-
беркулёза.  Процесс у человека развивается на фоне нарушения иммунной сис-
темы.  Поражаются  прикорневые  лимфатические  узлы  преимущественно  сред-
ней доли правого лёгкого, язычкового сегмента, а также бронхопульмональные 
лимфатичесие  узлы  верхних  долей  лёгких.  Патологоанатомическая  характери-
стика процесса сходна с казеозным лимфаденитом в первичном туберкулёзном 
комплексе.   
Дисcеминированный  туберкулёз  характеризуется  лимфогематогенным 
распространением  инфекции, начинается с поражения лимфатического сосуда и 
завершается в стенке кровеносного сосуда. Данный вид туберкулёза отличается 
хроническим течением и развивается на базе скрытого течения инфекции. При 
данной  форме  очаги  в  лёгких  имеют  различную  величину  и  возраст,  часть  из 
них прогрессирует, часть рубцуется или кальцинируется, что свидетельствует о 
длительном  волнообразном  течении  процесса.  Очаги  инфекции  отличаются 
кортикоплевральной  локализацией,  симметричностью  поражений,  продуктив-
ной тканевой реакцией, могут быть мелкими, средними и крупными. Наблюда-

 
119
ется  развитие  сетчатого  пневмосклероза,  эмфиземы,  лёгочного  сердца.  Нерас-
познанные  и  нелеченные  формы  диссеминированного  туберкулёза  через  фазу 
инфильтративной  вспышки  с  распадом  могут  трансформироваться  в  деструк-
тивные формы туберкулёза. 
Кавернозный туберкулёз характеризуется наличием изолированно сфор-
мированной каверны со слабо развитым фиброзным слоем и отсутствием в ок-
ружающей ткани выраженного склероза и очагов-отсевов. Его исходной формой 
может быть инфильтративный, очаговый, диссеминированный туберкулёз и ту-
беркулёма.  Каверна  располагается  обычно  в  более  глубоких  отделах  лёгкого. 
Большое значение в прогрессировании каверны имеет состояние дренирующих 
бронхов,  в  стенках  которых  формируется  казеозный  эндомезо-  и  панбронхит. 
Больные данной формой туберкулёза могут умереть от лёгочного кровотечения 
или других осложнений.  
Фиброзно-кавернозный  туберкулёз  лёгких  является  результатом  про-
грессирования большинства форм первичного или вторичного периодов болез-
ни, характеризуясь формированием в органе одной или несколько каверн с ши-
роким фиброзным слоем на фоне распространённого очагового склероза и оча-
гов-отсевов  различного  генеза.  При  длительном  хроническом  течении  фиброз-
но-кавернозного туберкулёза возрастают процессы фиброзирования и очаговой 
эмфиземы лёгких. 
Туберкулёз  медиастинальных  лимфоузлов - интоксикационный  син-
дром в сочетании с кальцинацией лимфоузлов, продуктивным кашлем, выделе-
нием микобактерий. Основные методы диагностики в настоящее время- рентге-
нологический и бронхоскопический. 
У больных  с тяжёлым течением лёгочного туберкулёза первично наруша-
ется  функция  соединительной  ткани  лёгкого,  развивается  мезенхимопатия,  со-
провождающаяся  повышением  проницаемости  гистогематического    барьера, 
поражением терминальных бронхиол. 

 
120
В связи с этим, при туберкулёзе перспективны медико-биологические ис-
следования  соединительной  ткани  и  микроциркуляторного  русла  лёгких  в  не-
благоприятных условиях биосферы для жизни, при нейроэндокринных стреccах, 
иммуносупрессивном лечении и т.д. (Ерохин В.В. с соавт., 1996). 
Данные, представленные Чутаевым Ю.П. с соавт. (1996) показывают, что 
положительная  реакция  на  пробу  Манту  среди  больных  туберкулёзом  лёгких 
составляет 67,7 %, кониотуберкулёзом – 52,4 %, силикотуберкулёзом –38,7, не-
специфическими  заболеваниями  органов  дыхания  (пневмония,  хронический 
бронхит, абсцесс лёгкого)- 50 %, здоровых людей- 33,3 %. Как видно из пред-
ставленных  данных,  проба  Манту  не  в  полной  мере  выявляет  заболевание  ту-
беркулёзом при наличии ложноположительных результатов у здоровых людей.  
Выявление  антигенов  возбудителя  туберкулёза  крайне  затруднительно. 
Известны случаи, когда в группе больных фиброзно-кавернозным туберкулёзом 
только  в  фазе  распада  впервые  выявлялся  антиген  (Хоменко  А.Г., 1992). Для 
внелёгочного  туберкулёза  на  фоне  широчайшего  полиморфизма  бактерий  ха-
рактерны малая частота обнаружения возбудителя в патологическом материале 
и  невозможность  воспользоваться  данными  рентгенологической  картины  на 
ранних  этапах  заболевания. L. K. Surkova et.al. (2003) представлены  исследо-
вания по изучению поражённых туберкулёзом очагов и установлено, что поло-
жительный ответ при исследовании секционного материала на МТБ был в 25 % 
случаев, при которых отмечался отрицательный результат  изучения мокроты.  
Длительный латентный период и поздняя манифестация симптомов вызы-
вают трудности диагностики. Таким образом, контроль над туберкулезом среди 
населения требует хорошо организованных программ по скринингу и лечению 
(Miranda A.G., 2003). 
Целью наших исследований являлось максимально возможное лаборатор-
ное  выявление  возбудителя  МТБ  у  наиболее  эпидемически  опасной  категории  
пациентов  среди  лиц,  обратившихся  в  Краевой  клинический  противотуберку-

 
121
лёзный  диспансер  г.Ставрополя  с  подозрительным  в  отношении  туберкулёза 
клиническими или рентгенологическими симптомами. С этой целью были скон-
струированы  принципиально  новые  тест-системы,  которые  позволяют  значи-
тельно  повысить  эффективность  выявления  возбудителя  туберкулёза,  по  срав-
нению с существующими методами, что было подтверждено клиническими ис-
пытаниями. 
Обследование    людей  проводили,  оценивая  следующие  основные  пара-
метры, по которым  больных подразделяли на группы: 
-  лица, имеющие соответствующую симптоматику со стороны органов дыхания 
(наличие в течение 3 нед. и более продуктивного кашля с выделениями слизи-
стой, слизисто-гнойной мокроты или мокроты с прожилками крови); 
-  лица, имеющие выявленные лучевыми методами изменения в лёгких, подоз-
рительные на туберкулёз; 
- лица  из  контакта  с  больными  туберкулёзом,  выделяющие  микобактерии  и  
имеющие соответствующие симптомы заболевания; 
- лица с подозрением на внелёгочные формы туберкулёза; 
Особенно важны выделение и идентификация возбудителя при наблюде-
нии  за  больными  туберкулёзом  с  неудовлетворительными  результатами  стан-
дартного  курса  химиотерапии,  у  которых  возбудителями  заболевания  могут 
быть лекарственно-устойчивые формы микобактерий или нетуберкулёзные ми-
кобактерии (возбудители микобактериозов). 
Изучив  формы  туберкулёза,  место  локализации  антигенов  и  истории  бо-
лезни больных туберкулёзом, мы подошли к решению задачи подготовки проб 
исследуемого материала. 
Сбор, хранение, транспортировку и работу с диагностическим материалом 
(моча, мокрота)  проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение № 10 
от 21.03.2003. Постановку РАЛ, РСА, ИФА проводили аналогично описанному 
в  соответствующих  главах  диссертации.  Селективное  концентрирование  анти-

 
122
гена  возбудителя  туберкулёза  на  МИС  с  последующей  постановкой  экспресс-
анализов (ИФА и КИФА) осуществляли в два этапа (рис. 17): 
1 этап- селективное концентрирование. В каждый флакон с исследуемым 
материалом  (мокрота, ресуспендированная в 10 кратном объёме забуференного 
физиологического раствора рН 7,2; моча, объёмом 1-10 мл) вносили по  0,5 мл 
10% ресуспендированного МИС и инкубировали  при комнатной температуре в 
течение 30-40 мин. Далее, удерживая МИС при помощи постоянного магнита на 
дне  флакона,  выливали  жидкость,  к  осадку  МИС  добавляли 10 мл  фосфатно-
солевого буферного раствора (ФСБ), перемешивали встряхиванием и переноси-
ли  в  бактериологическую  пробирку  или  флакон.  Таким  образом  промывали 
МИС 5-6 раз, удаляя отмывочный раствор, удерживая МИС при помощи магни-
та; 2  этап- исследование МИС в ИФА и КИФА (методика описана в главе 6). 
 
 
                                               

     
 

 
 
 2      
ИФА
 
 
 
  
3
                                                                                             
КИФА
Исследуе-
   Отмывка           
                                                                                                                               
мый  ма-
                   
    МИС     
 
териал  
Рисунок 3. Схема проведения экспресс-анализов  при выявлении 
антигенов МТБ с применением МИС 
Обозначения: 1 – гранулы МИС туберкулёзные; 2- туберкулезный антиген; 3 –  по-
стоянный магнит
 
Для обеспечения селективного концентрирования антигенов МТБ из проб 
больных большого объёма  (мокрота, разведённая забуференным физиологиче-
ским раствором рН 7,2; моча)  использовали туберкулёзные МИС, помещённые 
в  проточную  магнитную  ловушку,  через  которую  пропускали  исследуемые 


 
123
жидкости, регулируя скорость их протекания зажимом (рис.18). Меняя  местами 
колбы,  можно  многократно    пропускать    через  ловушку  исследуемую  пробу, 
достигая  максимального  концентрирования  микобактерий    и  их  антигенов  на 
МИС. После этого систему промывали 100 мл забуференного физиологического 
раствора рН 7,2, тем самым обеспечивая отмывание МИС от посторонних при-
месей  и  несвязавшихся  компонентов.  В  дальнейшем  из  ловушки  извлекали 
МИС,  на  поверхности  которого  за  счёт  реакции  антиген-  антитело  фиксирова-
лись микобактерии туберкулёза и его антигены, и помещали  в колбу или про-
бирку для проведения исследований в ИФА и КИФА. 



 

 
 

 
Рис. 18.  Исследование  проб  с  использованием  проточной  магнитной  ло-
вушки с МИС 

Обозначения: 1 - колба с иследуемой пробой; 2 - зажим; 3 - проточная магнитная 
ловушка с МИС;  4 -  соединительные трубки; 5 – колба для приема пробы. 
         Тестирование  микобактерий  осуществлено  методами:  РАЛ,  РСА,  ИФА, 
МИС с ИФА и КИФА.   
Было  исследовано 286 проб  клинического  материала  (моча,  мокрота)  от 
больных различными формами туберкулёза из  краевого клинического противо-
туберкулёзного диспансера, 12 проб материала от больных с нетуберкулёзными 

 
124
заболеваниями    и 11 проб  от  здоровых  людей,  у  которых  исследовали  мочу  и 
слюну (табл.16).  
Таблица 16. Результаты исследования клинического материала (моча, 
мокрота) на наличие в нём МТБ и его антигенов 
МИС+
МИС + 
Кол- РСА  РАЛ  ИФА  ИФА  КИФА 
Клиническая форма 
во 
проб  Количество положительных  результатов 
 
Диссеминированный  ТБ  лёгких 
(мокрота) 24 
15 
14 
17 
23 
23 
Фиброзно-кавернозный  ТБ  лёг-
ких (мокрота) 25 
18 
18 
20 
25 
24 
Инфильтративный  ТБ  лёгких 
(мокрота) 33 
18 
17 
18 
23 
22 
Очаговый ТБ лёгких (мокрота) 48 35  34  39  45  47 
Кавернозный ТБ почек (моча) 21 13 14 14  20  21 
Туб.коксит (моча) 22 
12 
14 
16 
20 
20 
Туб.спондилит (моча) 21 
14 
15 
18 
20 
20 
Туб.иридоцикл. (моча) 24 
17 
18 
21 
22 
21 
Инфильтративный  ТБ  почек 
(моча) 26 
15 
16 
20 
23 
23 
ТБ муж. пол. органов (моча) 26 
17 
17 
20 24 24 
ТБ увеит (моча) 16 
12 
12 
14 
15 
15 
Неспецифические 
заболевания 
(онкология, пиелонефрит и т.д.) 12  2 




Здоровые люди 
11 -  -  - -  - 
Всего больных ТБ 
186  
189  
217 
260 
260  
286 
(65 %) 
(66 %) 
(76 %) 
(91 %) 
(91 %) 
Примечание.  В  скобках  указано    количество  положительных  проб  на  наличие 
специфических антигенов у больных туберкулёзом в процентах 
        Методики  постановки  этих  реакций  и  система  учёта  положительных  ре-
зультатов приведены в главах 5 и 6. 
Как видно из таблицы, используя комплекс разработанных препаратов  и 
методов (РСА, РАЛ, ИФА, ИФА с МИС, КИФА с МИС), можно проводить ка-
чественную  диагностику  туберкулёза,  обнаруживая  у  больных  специфические 

 
125
туберкулёзные  антигены.  Максимальный  процент  выявления  этих  антигенов 
при исследовании больных достигнут с помощью сочетанных методов, исполь-
зующих МИС с ИФА и КИФА.  
Анализ  полученных  данных  позволил  установить,  что  использование  ад-
сорбированной  туберкулёзной  сыворотки  при  конструировании  диагностиче-
ских  препаратов  даёт  возможность  диагностировать  заболевание  туберкулёзом 
у людей, дифференцируя его от другой патологии. 
С  помощью  ИФА  и  КИФА,  где  в  качестве  твёрдой  фазы  используются 
МИС  с  иммобилизованными    антителами    против  антигенов  Муcobacterium 
tuberculosis,  показано,  что  антиген  возбудителя  туберкулёза  выявляется  в  мок-
роте, моче туберкулёзных больных в  91 % случаев и не обнаруживается у здо-
ровых людей.  
Указанные методы превосходят по информативности РСА, РАЛ и тради-
ционный  ИФА,  проводимый  в  полистироловых  планшетах.  Это  связано  с  тем, 
что при использовании МИС с ИФА и КИФА специфический антигенный мате-
риал концентрируется на сорбенте из проб большого объёма. 
Недостаточная  чувствительность  традиционного  ИФА (5х104-1  х 105 
м.к./мл),  как  отмечают  некоторые  исследователи,  связана  с  нестандартностью 
адсорбционной  поверхности  планшет  из  полистирола,  что  приводит  к  непроч-
ному связыванию АТ и их адсорбции на этапах иммуноферментного анализа.  
Отсутствие 100 % специфичности разработанных диагностических систем 
объясняется  тем,  что,  хотя  при  их  изготовлении  использована  туберкулёзная 
сыворотка,  адсорбированая  гетерологичными  антигенами  на  твёрдом  носителе 
(это  несомненно  повысило  специфичность  анализа),  однако  полного  удаления 
из  неё  гетерологичных  иммуноглобулинов,  вероятно,  не  произошло,  так  как, 
род  микобактерий    составляет  более 100 видов  (Методические  рекомендации 
МЗ РФ, 1992), которые содержат общие антигены с большим количеством нету-
беркулёзных  микобактерий  и  других  микроорганизмов,  например, с  Nocardia, 
Brucella, Listeria и т.д.  

 
126
В  настоящее  время  усложнилась  также  микробиологическая  и  серологи-
ческая  диагностика туберкулёза из-за часто встречаемых атипичных микобак-
терий,  изменившейся биологии возбудителя (морфология, ферментативная ак-
тивность,  биологические  свойства)  вследствии  широкого  применения  разнооб-
разных противотуберкулёзных препаратов.  
Обобщая преимущества данных тест-систем, следует отметить, что разра-
ботанные новые диагностические средства для выявления возбудителя туберку-
лёза на основе МИС позволяют обнаруживать корпускулярные и растворимые 
антигены  возбудителя  при  их  низкой  концентрации  в  материале (50-100 мик-
робных клеток в пробе), проводить исследования с пробами большого объёма. 
Эти системы относятся к средствам экспресс-диагностики туберкулёза, т.к. по-
зволяют получить результат через 1-1,5 ч  после начала исследования. Немало-
важным является и тот факт, что туберкулёзный МИС не теряет своих физико-
химических  и  иммунологических  свойств  при  хранении  на  протяжении    3  лет 
(срок наблюдения).  
В табл. 17 представлены сравнительные данные методов диагностики ту-
беркулёза, используемые в настоящее время в клинической практике и разрабо-
танные нами.  
Таблица 17. Сравнение методов диагностики туберкулёза 
№ 
Метод 
Время  де- Выявляе-
Литературный 
п/п 
текции 
мость 
источник 
1.    Туберкулинодиагностика 72 
ч 
67  % 
Чутаев Ю.П. с со-
авт, 1996 
2.    Культивирование МТБ 1-3 
мес. 0,5-14 

Клименко М.Т. с 
соавт, 1987 
3.    Микроскопия  (флуоресцент-
2,5 ч 14 

Канюк А.Н., 1995 
ная с аурамином) 
4.    РСА 5 
мин 65 
% Собственные 
5.    РАЛ 2 
ч 66 
%  данные 
6.    ИФА 3 
ч* 76 

7.    ИФА с МИС 1-1,5 
ч 91 

8.    КИФА с МИС 1-1,5 
ч 91 

*- без учёта 18 часовой сенсибилизации планшет 
         Как видно из таблицы, наиболее эффективными методами  для диагности-
ки возбудителя туберкулёза являются ИФА и КИФА с МИС, которые отличают-

 
127
ся  высокой  чувствительностью,  специфичностью  и  непродолжительным  сро-
ком проведения анализа. При этом обнаружение туберкулёзных антигенов воз-
можно у больных с различной локализацией патологического процесса при взя-
тии материала на исследование у них бесконтактным способом (моча, мокрота). 
 

 
128
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 
 
Каждую минуту в мире от туберкулёза умирают  четыре человека. В Рос-
сии  в 2004 г.  зарегистрировано  около 102,9 тыс.  больных  с  установленным 
впервые активным туберкулёзом, а показатель  по сравнению с 2003 г. увели-
чился  на 3,3 %, достигнув 71,7 на 100 тыс.  населения.  Среди  детей  до 14 лет 
также выросла заболеваемость на 3,8 %. Больные туберкулёзом органов дыха-
ния составляют 95,6 % из числа всех зарегистрированных случаев заболевания 
туберкулёзом  (Ильин  И.А., 2005). В  связи  с  неблагоприятной  обстановкой  по 
туберкулёзу в Российской Федерации в последние годы (Онищенко Г.Г. 2003) и 
недостаточным качеством диагностических препаратов, основные направления 
медицинской  биотехнологии  предусматривают  расширение  возможностей  ди-
агностики  микобактерий  туберкулёза  за  счёт    появления  новых  экспрессных 
высокоспецифичных,  чувствительных,  доступных  методов  и  препаратов,  что 
способствует  оперативному  эпидемиологическому  анализу  и  формированию 
целенаправленных  противоэпидемических  и  медицинских  противотуберкулёз-
ных мероприятий. 
Увеличение  заболеваемости  туберкулёзом,  вызванным  МТБ  и  нетуберку-
лёзными  микобактериями, повышает  значимость их индикации и идентифика-
ции,  что  крайне  важно    для  проведения  подходящей  антибактериальной  тера-
пии.  
В настоящей работе представлены  результаты  научно-методических раз-
работок    биотехнологии  медицинских  иммунобиологических  препаратов  для 
экспресс-диагностики микобактерий туберкулёза. 
Производство  диагностических  препаратов  представляет  собой  единую 
биотехнологическую систему, которая складывается из последовательных ста-
дий  и  операций,  количество  и  особенности  которых  зависят  от  вида  произво-
димой продукции. 
 

 
129
При  получении  качественных  диагностических  препаратов  необходимо 
выделить из микробных биомасс высокоочищенные активные и специфические 
антигенные комплексы, применяемые при иммунизации животных и в качестве 
положительного контроля в тест-системах, подобрать схему иммунизации жи-
вотных, получить специфические иммунные сыворотки, отработать параметры 
биотехнологии изготовления диагностических систем.  
При  всём  многообразии  способов  извлечения  специфических  антигенов 
из микробных клеток необходимо было подобрать комплекс  биотехнологиче-
ских  операций,  который  бы  позволил  изолировать  в  достаточном  количестве 
для  производственных  целей  полноценные  в  антигенном  отношении  фракции 
из МТБ. Для этого была использована  водно-солевая экстракция МТБ и других 
бактерий.  По  данным  ряда  исследователей    (Вейнблат  В.И., 1971; Афанасьев 
Е.Н., 1986 и др.), такие экстракты обладают сложным макромолекулярным со-
ставом и в них обнаруживаются в тех или иных количествах большинство при-
сутствующих у бактерий антигенов. Водорастворимые туберкулёзные антигены 
изолировали комплексным методом:  водно-солевой экстракцией, ультразвуко-
вой  и  механической  дезинтеграцией,  осаждением  антигенов  сульфатом  аммо-
ния. Полученный препарат содержал не менее 20 мг/мл белка и формировал зо-
ны преципитации в РИД с иммунной сывороткой в разведении 1:32 – 1:64.  
Для получения туберкулёзных иммунных сывороток нами апробированы  
различные схемы иммунизации.  При получении агглютинирующих сывороток, 
в которых в основном присутствуют иммуноглобулины класса М, использовали 
«короткую» схему иммунизации (Афанасьев Е.Н., 2000) с иммунокорректорами 
- тималином и циклофосфаном; при получении преципитирующих сывороток, в 
которых  превалируют  иммуноглобулины  класса G, - применяли  «длинную» 
схему (Тюменцева И.С., 1994) с иммунокорректором феракрилом. Использова-
ние иммунокорректоров позволило повысить эффективность иммунизации при 
незначительном  расходе  антигенного  материала  и    существенном  повышении 
титров специфических антител (до 1:600 в РНИФ и 1:64 в РИД). 

 
130
В  связи  с  тем,  что  антигенный  спектр  микобактерий  туберкулёза  имеет 
много  общего  с  представителями  родов    Nocardia, Brucella, Listeria  и  некото-
рыми  нетуберкулёзными микобактериями, идентификация МТБ  и его диффе-
ренциация  крайне  важна  для  практического  здравоохранения  и  проведения 
подходящей  антибактериальной  терапии.  Для  конструирования  эффективных 
туберкулёзных  диагностических  препаратов  необходимы  высокоспецифиче-
ские иммунные сыворотки, нуждающиеся в удалении из них перекрёстно реа-
гирующих антител. Для этих целей наилучшим способом является использова-
ние    аффинного  сорбента,  представляющего  собой  гетерологичные  антигены, 
ковалентно  закреплённые  на    твёрдой  матрице.  Очистка  иммунной  сыворотки 
происходит за счёт биоспецифического взаимодействия между антигенами, за-
крепленными на матрице, и антителами, подлежащими удалению. 
Результаты предыдущих исследователей и наш собственный  опыт пока-
зали, что сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специ-
фические титры антител и делает непригодным сырьё для дальнейшего исполь-
зования из-за появления в нём экстрагируемого из бактериальных клеток мате-
риала, применение же для этих целей полиакриламидных сорбентов базируется 
на  применении  высокотоксичных импортных реактивов и довольно трудоём-
ка. В связи с этим, мы впервые для данных целей использовали разработанный 
аффинный сорбент с магнитными свойствами, где в качестве твердой фазы вы-
ступает кремнезем-алюмосиликат. МС готовили при соотношении компонентов 
(Fe2O3, декстран, алюмосиликат) - 2:2:1 соответственно; время гелеобразования 
- 2 ч, значение рН гелеобразования - 7,0. 
Активирование  сорбента  производили  методом  окисления,  используя 
перхлорат  натрия.  Для  придания  магносорбенту  аффинных  свойств  на  его  по-
верхность  иммобилизовали  лиганды - водорастворимые  антигены (2,5 мл  с 
концентрацией белка  2 мг/мл), полученные из гетерогенных штаммов  микро-
организмов (Brucella abortus 19, Nocardia brasiliensis, M. intracellulare # 23, M. 
кansasii Yoss), дающих перекрёстные реакции с иммунными сыворотками. Оп-

 
131
тимальными факторами, способствующими получению МИС, являются: время 
иммобилизации  антигенов  на  МС – 2 ч  при  значении  рН 6 - 7 и  температура    
24 - 37  0С.     
Методы  получения  иммуносорбентов  просты  и  технологичны,  исклю-
чающие    применение  токсичных  веществ.  Полученные  МИС  характеризуются 
стандартностью структурных характеристик, механической, химической и мик-
робиологической  устойчивостью,  не  подвержены  набуханию.  Использование 
отечественных экологически чистых компонентов, их дешевизна, простота тех-
нологии  изготовления  свидетельствуют    о    достоинствах  алюмосиликатных 
МИС.  
При  сорбции  туберкулёзной  иммунной  сыворотки  данный  антигенный 
МС,  взаимодействуя  с  соответствующими  иммуноглобулинами,  освобождал 
сыворотку от неспецифических антител на одном этапе, сохраняя первоначаль-
ную  специфическую  активность  нативных  иммунных  сывороток.  Магнитные 
свойства иммуносорбента позволяли значительно упростить процесс отделения 
его от жидкой фазы в магнитном поле и исключить процесс длительного цен-
трифугирования. 
Проведённые исследования дают основание утверждать, что  применение 
алюмосиликатных антигенных МИС позволяет проводить качественную имму-
носорбцию,  сохраняя  активность  и  специфичность  иммунных  сывороток.  При 
этом  не  происходит  попадания  в  сыворотку  антигенного  материала,  в  ней  от-
сутствуют  комплексы  «антиген-антитело»,  появляющиеся  в  материале  при 
сорбции  корпускулярными  антигенами  и  мешающие  в  дальнейшем  созданию 
специфических  диагностических  систем,  титры  специфических  антител  не 
снижаются  и  конечный  продукт  является  качественным  сырьем  для  дальней-
шей работы. Данный сорбент можно регенерировать и  многократно использо-
вать.  
Из сорбированной туберкулёзной сыворотки иммуноглобулины выделяли 
с помощью каприловой кислоты по методу G. Steibuch, R. Andran (1969). 

 
132
Варьируя количеством используемых компонентов, рН растворов, темпе-
ратурой и временем проведения реакций, выделенные туберкулёзные иммуног-
лобулины    конъюгировали  с  ферментом  пероксидазой,  липосомами,  латексом, 
алюмосиликатом,  органокремнезёмной  матрицей,  содержащей  оксид  железа, 
получая соответственно иммунопероксидазный конъюгат для ИФА, диагности-
кумы  для РАЛ, РСА и МИС. 
Для  ковалентного  связывания  пероксидазы  с  туберкулёзными  иммуног-
лобулинами  использовали  метод  перйодатного  окисления  углеводной  части  
фермента  (Р.К.Nakane,  А.Kawaоi, 1974). Сформировавшиеся  при  этом  альде-
гидные  группы  образовывали  ковалентную  связь  с  аминогруппами  антител. 
Очистку  конъюгата  от  непрореагирующих  компонентов  осуществляли  на  ко-
лонке с сефадексом G-100, после чего его лиофилизировали. Полученный пре-
парат  был  стабилен  без  потери  активности  в  течение 1 г.  Рабочий  титр  полу-
ченных  иммунопероксидазных  туберкулёзных  конъюгатов  составил 1:400-
1:800. 
В  иммуноферментной  реакции,  в  которой  в  качестве  твёрдой  фазы  при-
меняли стандартные планшеты, чувствительность конъюгата по водораствори-
мым антигенам составила 50-100 мкг/мл, по возбудителю туберкулёза – (5х104-
1х105 м.к./мл). С гетерологичными штаммами диагностикум не взаимодейство-
вал, что говорит о его специфичности. 
В  результате  проведённой  сорбции  сыворотки  крови  от  гетерологичных 
антител  и  чётко  отработанных  параметров  конъюгации  лиганда  и  маркёра  по-
лучены  высокоэффективные (1:600), специфичные  (отсутствуют  перекрёстные 
реакции с гетерологичными штаммами) иммуноферментные конъюгаты.  
На основе полученных препаратов была сконструирована тест-система для 
экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза,  состоящая из 1 ампулы имму-
ноферментного  конъюгата, 1 ампулы  положительного  контроля  (обеззаражен-
ная взвесь туберкулёзного микроба)- 1х109 м.к./мл, 1 ампулы иммуноглобули-
нов  туберкулёзных  и  необходимых  ингредиентов  для  постановки  ИФА  (ФСБ, 

 
133
твин-20, БСА, стоп-реагента - 4 М раствора серной кислоты, хромогена - орто-
фенидендиамина,  таблетки  гидроперита).  Одной    ампулы    с    препаратом    в  
объеме  0,1 мл, с активностью-1:600  достаточно для исследования 300 проб в 
ИФА. 
Ферменты с лабильной структурой молекулы даже в охлаждённом состоя-
нии при 4 0С имеют ограниченный срок хранения, который удаётся увеличить 
при придании им определённой жёсткости в процессе иммобилизации энзимов 
на твёрдофазные носители. 
В качестве такого носителя использовали липосомы, которые получали 
из  фосфолипидов  и  ганглиозидов,  выделенных  из  мозга  к.р.с.,  а  в  последнее 
время  из  мозга  свиней,  не  являющегося  потенциально  опасным  при  губчатой 
энцефалопатии  животных  (коровье  бешенство).  Разработанная  биотехнология 
выделения  сырья  для  приготовления  липосом  (ТУ 9154-00-01897080-2004) 
включала  измельчение  и  обезвоживание  мозга  животных  ацетоном,  экстраги-
рование из него фосфолипидов и ганглиозидов смесью хлороформ-этанол (1:1) 
и дробное осаждение указанных липидсодержащих фракций ацетоном. Данные 
способы выделения фосфолипидов и ганглиозидов защищены патентами РФ № 
2192265 от 10.10.2002  и № 2195296  от 27.12.2002.  
Методом  тонкослойной  хроматографии  в  препарате  фосфолипидов  об-
наружены  в  основном  фосфатидилхолин,  фосфатидилсерин,  фосфотидилино-
зит, а также холестерин. 
Полученные  препараты  растворяли  в  хлороформе  в  конечной  концентра-
ции 50 мг/мл  и  смешивали  фосфолипиды  и  ганглиозиды  в  соотношении 20:1, 
добавляя  туда  антиоксидант – 0,5 % α-токоферол.  Этот  липидный раствор  ис-
пользовали  для  приготовления  липосом  методом  «выпаривания  в  обращённой 
фазе»  в  соответствии  с  методическими  рекомендациями    «Иммобилизация  в 
липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилиза-
ция липосом», утвержденными Главным Государственным санитарным врачом 

 
134
России  Г.Г.  Онищенко. 06.04.2000 г.  В  результате  получены  липосомы,  иден-
тифицированные при электронной микроскопии, размером 150-300 нм.  
При получении липосомального иммуноферментного диагностикума пред-
варительно  активировали (5+0,1)  мг  пероксидазы  хрена  по  методике,  описан-
ной выше. В результате в углеводной части молекулы пероксидазы формирова-
лись  альдегидные  группы,  обеспечивающие  фиксацию  фермента  к  мембране 
липосом за счёт аминогрупп ганглиозидов и последующую за этим иммобили-
зацию  туберкулёзных  иммуноглобулинов  на  сформировавшемся  комплексе  с 
участием оставшихся свободных альдегидных групп фермента. 
С  этой  целью  к 5 мг  окисленной  пероксидазы  добавляли 1 мл  суспензии 
липосом  в 0,01 М  КББ  рН 9,5, содержащей 18 мг  липидов,  смесь  подвергали 
кратковременной ультразвуковой обработке. После удаления несвязавшейся на 
липосомах пероксидазы путём хроматографии на колонке с сефадексом G-100, 
уравновешенной 0,01 М КББ рН 9,5, к препарату добавляли туберкулёзные им-
муноглобулины G в оптимальном количестве (5 мг/мл). Смесь инкубировали 2 
ч  при  температуре (22+4)  0С  и  несвязавшиеся  иммуноглобулины  отделяли  от 
липосомального конъюгата хроматографически на колонке с сефадексом G-100, 
уравновешенной 0,1 М ФСБ рН (7,2+0,1). 
В лиофилизированном состоянии туберкулёзный липосомальный иммуно-
ферментный  препарат  по  чувствительности  и  специфичности  не  отличался  от 
туберкулёзного иммуноферментного конъюгата и сохранял все свои свойства в 
течение 2 лет    (срок  наблюдения),  в 2 раза  превышая  срок  хранения  туберку-
лёзного иммуноферментного диагностикума.  
Нами  осуществлена  разработка  биотехнологии  изготовления  латексных 
(полиакролеиновых)  диагностикумов  для  выявления  возбудителя  туберкулёза. 
Латексы выбраны в качестве носителей, так как их химические свойства отно-
сительно  постоянны  и  поддаются  точной  характеристике.  Наличие  альдегид-
ных групп на их поверхности позволяет легко образовывать ковалентную связь 
с  аминогруппами  белков.  Таким  образом,  проанализировав  литературные  дан-

 
135
ные и проведя экспериментальные исследования,  направленные на повышение 
технологичности производства латексных диагностикумов, нами были отрабо-
таны оптимальные условия их изготовления. Для сенсибилизации использовали 
иммуноглобулины  класса  М  из  адсорбированных  туберкулёзных  сывороток 
при  их  оптимальной  нагрузке -400 мкг/мл  (при  увеличении  количества  иммо-
билизованного лиганда отсутствовал отрицательный контроль, а при уменьше-
нии – снижалась чувствительность диагностикума). Время сенсибилизации со-
ставило 6 ч при температуре - 50 0С и рН среды – (7,2+0,1). При уменьшении 
времени  сенсибилизации,  температуры  и  рН  среды  до 5 снижалась  чувстви-
тельность препарата, при увеличении рН до 9,0 - отсутствовал отрицательный 
контроль. 
Чувствительность разработанных диагностикумов в РАЛ с возбудителем 
туберкулёза составила 3,9х105-7,8х105 м.к./мл при отсутствии перекрёстных ре-
акций с гетерологичными штаммами. 
С  целью  получения  диагностикума,  обнаруживающего  возбудитель  ту-
беркулёза  в  течение  нескольких  минут,  была  использована  алюмосиликатная 
кремнезёмная матрица с пористой структурой, обладающая высокой сорбцион-
ной  активностью.  Твёрдофазный  краситель  окрашивали  аурамином  в  весовом 
соотношении 2:1 и активировали вторичным алкилсульфатом натрия. Были по-
добраны  оптимальные  параметры  биотехнологии  подготовки  твёрдофазного 
носителя  и  иммобилизации  на  него  туберкулёзных  иммуноглобулинов  класса 
М,  выделенных  из  адсорбированной  сыворотки.  Оптимальными  параметрами 
при этом были следующие: концентрация белка иммуноглобулинов -1,5 мг/мл, 
время иммобилизации - 2 ч  при температуре (26+4) 0С. 
При  исследовании  влияния  кислотности  буферного  раствора  во  время 
сенсибилизации, установлено, что при увеличении кислотности снижается про-
цент связывания сенситина.  Увеличение рН реакционного раствора до 10  при-
водит к ложноположительной агглютинации. Оптимальный рН при сенсибили-
зации  матрицы и постановки РСА - 7,0. 

 
136
Данный диагностикум в РСА на стекле, взаимодействуя с туберкулёзным 
антигеном, формировал крупнозернистые хлопья с просветлением жидкости. С 
гетерологичными штаммами бактерий агглютинации диагностикума не наблю-
далось. 
Чувствительность  сконструированных  диагностикумов  суспензионных   
иммуноглобулиновых  туберкулёзных  в  РСА  на  стекле  составила 7,8 х 105  -
1,56х106  м.к./мл,  что  соответствует  чувствительности  диагностикумов  латекс-
ных    иммуноглобулиновых  в  реакции  агглютинации  латекса  (РАЛ).  При  этом 
предварительный  учет    РСА  на  стекле  возможен  через 1-3 мин,  а  окончатель-
ный результат РАЛ (макрометод)- 16- 18 ч. Таким образом, преимущество этого 
метода  заключается в простоте постановки реакции и быстроте получения  ре-
зультатов. 
           Основные требования, предъявляемые к современным методам экспресс-
анализа, заключаются в выявлении низких концентраций патогенного агента в 
максимально  короткие  сроки  с  высокой  специфичностью.  В  последнее  время 
для этих целей нашли применение  магноиммуносорбенты, благодаря которым 
упрощаются, ускоряются все этапы исследований при высокой чувствительно-
сти  диагностических  препаратов  и  наличия  возможности  автоматизации  учёта 
реакций. 
Цель наших исследований – конструирование тест-системы диагностиче-
ской магноиммуносорбентной  туберкулёзной для иммуноферментного  анали-
за.  
Чувствительность  и  специфичность  ИФА  обусловлена  не  только  степе-
нью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёр-
дой  фазы,  которая  должна  сохранять  иммунологические  свойства  и  стабиль-
ность  в  иммобилизованном  состоянии,  обладать  минимальной  неспецифиче-
ской адсорбцией и быть удобной при разделении фаз. 
Нами  разработана  биотехнология  изготовления  органокремнезёмного 
магносорбента на основе алюмосиликата и окиси железа (III). Модифицирова-

 
137
ние его поверхности  осуществляли в присутствии полимера - декстрана и по-
верхностно-активного вещества - вторичного алкилсульфата натрия.  
На  основе  проведенных  исследований  рекомендованы  следующие  опти-
мальные условия  получения алюмосиликатных магносорбентов: весовые соот-
ношение  компонентов  синтеза  окиси  железа,  декстрана,  алюмосиликата 2:2:1, 
время гелеобразования 2 ч (при увеличении времени удлиняется процесс синте-
за магносорбента, уменьшается размер его пор, что приводит к снижению сте-
пени иммобилизации лиганда в порах сорбента), значение рН гелеобразования -
7,0.  
Далее  проводили  иммобилизацию  специфических  туберкулёзных  имму-
ноглобулинов G на МС (данные препараты  без потери специфической актив-
ности  хранятся  в  течение 3 лет  (срок  наблюдения).  В  качестве  сшивающего 
агента  нами  использовано  поверхностно-активное  вещество - вторичный  ал-
килсульфат натрия, при этом прочность связи антител с магносорбентом повы-
шается  за  счёт  создания  дополнительных  связей,  которые  образуются  между 
активными группами белка, полиглюкина (декстрана) и вторичного алкилсуль-
фата натрия.  
Исследования  показали,  что  концентрация  белка  иммуноглобулинов 2,5 
мг/мл  является  оптимальной  для  полного  насыщения  антителами  сорбента    в  
объеме 0,4 мл 10 % взвеси. При увеличении концентрации белка адсорбционная 
емкость МИС снижалась.  
Оптимальными факторами, способствующими получению МИС, являют-
ся:  время иммобилизации 2 часа при значении рН  раствора  иммуноглобули-
нов 6-7 и температуры  (22 + 4) 0С и (37 + 1)  0С.     
Методы  получения  МИС  просты  и  технологичны,  исключают    примене-
ние токсичных веществ, диагностикумы изготовлены из отечественных эколо-
гически чистых компонентов. Полученные МИС характеризуются стандартно-
стью  структурных  характеристик,  механической,  химической,  микробиологи-

 
138
ческой устойчивостью и сохраняют специфическую активность в течение 3 лет 
(срок наблюдения).  
МИС сохраняли способность концентрировать на своей поверхности бак-
териальные  клетки  возбудителя  туберкулёза,  которые  затем  выявляли  с  помо-
щью ИФА. 
В опытах на чистых культурах возбудителя туберкулёза получены  поло-
жительные результаты при наличии в объеме пробы 0,5х102 - 1х102 м.к. и выше. 
При этом данное количество микробных тел могло присутствовать в 1 или 500 
мл исследуемых проб. Если объём этих проб был большим (500 мл), то данную 
пробу пропускали через МИС, удерживаемый в специальной ловушке магнит-
ным полем, что обеспечивало концентрацию МТБ на МИС. В дальнейшем сор-
бент обрабатывали туберкулёзным иммуноферментным конъюгатом, отмывали 
от  несвязавшихся  компонентов  реакции,  вносили  субстрат-индикаторный  рас-
твор, по изменению цвета которого проводили учёт реакции. 
Результаты  проведённых  исследований  показали,  что  чувствительность 
ИФА  одинакова при  исследуемых  температурных  режимах -   (22+4) 0С  и 
(37±1)  0С.  Другим  важным  параметром  являлся  временной  режим.  Установле-
но, что равновесный процесс между туберкулёзным  антигеном и МИС насту-
пал через 30 мин, а между образовавшимся комплексом и конъюгатом - через 
15 мин. Важным являлось количество отмывок МИС после контакта с конъюга-
том. При отмывке МИС меньше 6 раз ухудшалась специфичность реакции, т.е. 
наблюдались  фоновые  значения  оптической  плотности  в  отрицательном  кон-
троле.  
Разработанная  диагностическая  система  отличалась  высокой  специфич-
ностью, не давая положительных реакций с гетерологичными микроорганизма-
ми с концентрацией 1х102-1х106 м.к. в исследуемой пробе. 
Для сравнения полученного диагностикума с традиционным методом по-
становки ИФА использовали полистироловые планшеты, сенсибилизированные 
туберкулёзными иммуноглобулинами в течение 18 ч, далее проводили анализ в 

 
139
соответствии  с  традиционной  методикой.  Чувствительность  ИФА  в  данном 
случае  составила  5х104  - 1х10 5  м.к./мл.  При  этом  время  постановки  ИФА  с 
применением МИС - 1-1,5 ч, а традиционным методом, учитывая 18 ч сенсиби-
лизацию планшет, около 20 ч. Если объём исследуемых проб при использова-
нии стандартных плашек не превышает 0,2 мл, то при использовании МИС он 
не ограничен. 
В  качестве  иммунопероксидазного  конъюгата  для  выявления  МТБ  ис-
пользовали также его липосомальную форму. Данный диагностикум обнаружи-
вал  фиксированные  на  МИС  за  счёт  специфической  реакции  «антиген-
антитело» МТБ в количестве 1х10 2 м.к. в пробе при отсутствии реакций с гете-
рологичными штаммами бактерий. 
Таким образом, при использовании МИС в ИФА отпадала необходимость 
в полистироловых планшетах, сокращалось время сенсибилизации твёрдой фа-
зы  в 15 раз,  значительно  увеличивался  срок  хранения  сенсибилизированной 
твёрдой  фазы;  время  проведения  непосредственно  анализа  сокращалось  в 1,5 
раза,  а  чувствительность    повышалась  на  несколько  порядков  по  сравнению  с 
общепринятым ИФА.  
Учитывая, что липосомальный туберкулёзный иммуноферментный диаг-
ностикум  при  использовании  в  качестве  твёрдой  фазы  МИС  позволял  в  ИФА 
обнаруживать МТБ в гораздо меньшем количестве, чем при постановке тради-
ционной  реакции  в  полистироловых  микропланшетах,  т.е.  обладал  большей 
чувствительностью, нами было получено 5 серий этих диагностических систем. 
В  полученный  набор  входят:  лиофильно  высушенный  липосомально-
иммуноперооксидазный  конъюгат-0,1мл -1 ампула;  обеззараженная  взвесь  ту-
беркулёзного  микроба  1х109  (положительный  контроль)- 0,5 мл-1  ампула;  ту-
беркулёзный МИС (10 % взвесь)-по 2мл-2 ампулы и все необходимые ингреди-
енты  для  постановки  ИФА  (ФСБ,  БСА,  твин-20,  стоп-реагент  –по 1 флакону, 
хромоген-ортофенилендиамин-2 флакона и таблетка гидроперита).  

 
140
Таким  образом,  нами  разработана  технология  изготовления  туберкулёз-
ных магноиммуносорбентных диагностикумов и на их основе сконструированы 
диагностические тест – системы для проведения сочетанного метода детекции 
микроорганизмов в иммуноферментном анализе, подобраны условия постанов-
ки  ИФА  с  МИС.  Установлено,  что    туберкулёзные  магноиммуносорбенты  в 
жидком  виде  стабильны  без  потери  физико-химических  и  иммунологических 
свойств в течение 3 лет (срок наблюдения). ИФА с применением МИС обладает 
высокой  чувствительностью (1х102  м.к.  в  пробе),  быстротой  постановки  реак-
ции (1-1,5 ч),  что    подтверждено    многочисленными  испытаниями.  При  этом 
отпадает  необходимость  использования  сенсибилизированных  микропланшет. 
При  использовании  разработанной  липосомально-иммунопроксидазной  тест-
системы повышается срок годности препарата в 2 раза. 
На основе полученных экспериментальных данных разработаны методиче-
ские рекомендации «Применение магноиммуносорбентов для выявления мико-
бактерий  туберкулёза»,  одобренные  Ученым  Советом  СтавНИПЧИ  (протокол 
№ 3 от 3.03.05) и  утвержденные    директором  института.  Составлены    норма-
тивные  документы:  регламент  производства  и  инструкция  по  применению  на 
тест-систему диагностическую липосомально- иммуноперооксидазную для  вы-
явления антигена возбудителя туберкулёза  иммуноферментным методом, рас-
смотренные на Учёном Совете СтавНИПЧИ (протокол № 3 от 3.03.05 г) и  ут-
вержденные  директором института.  
В последние годы  при выявлении микобактерий туберкулёза широко при-
меняют  люминесцентную  микроскопию.  Этот  метод  значительно  увеличивает 
диагностическую  эффективность  микроскопических  исследований.  Быстрота 
обнаружения микобактерий, простота флуорохромирования делает его доступ-
ным для практических лабораторий. Люминесцентная микроскопия с примене-
нием аурамина позволяет увеличить процент находок  на 8 % по сравнению с 
методом  флотации  и  на 17 % по  сравнению  с  прямой  бактериоскопией  мазка 
(Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люми-

 
141
несцентными  красителями,  в  частности  аурамином,  основан  на  способности 
липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители  и затем све-
титься  при  облучении  их  ультрафиолетовыми  лучами.  Этим  методом  можно 
исследовать  любой  материал,  кроме  мочи,  в  котором  могут  быть  трудно  диф-
ференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ РФ № 558, 1978).  
Другим  важным  преимуществом  метода  люминесцентной  микроскопии 
является  способность  обнаруживать  изменённые  микобактерии,  утратившие 
под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство 
кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу 
Циля-Нильсена  (Методические  указания  МЗ  РФ  «Микробиологические  иссле-
дования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001). 
При  окраске  микобактерий  аурамином  возможны  ложноположительные  
результаты  в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что может при-
вести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранжевого цвета. 
Микроскопические исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не 
позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tubercu-
losis  от  нетуберкулёзных  (атипичных  микобактерий)  микобактериозов.  На  ос-
нове этих методов можно только сделать заключение о наличии или отсутствии 
кислотоустойчивых  микобактерий  (приказ  МЗ  РФ  № 109. Приложение  №11, 
2003). 
Наиболее  перспективными  являются  методы  диагностики,  основанные  на 
образовании  комплекса  антиген-антитело,  особенно  в  связи  с  возможностью 
использования  в  иммунофлуоресценции  твёрдых  носителей    (Стоев  К.Г.  с  со-
авт., 1981; Подзолкова  Г.Г.  с  соавт., 1989 и  т.д.).  С  этой  целью  из  адсорбиро-
ванной туберкулёзной сыворотки путём фракционирования каприловой кисло-
той  были  выделены  иммуноглобулины,  которые  метили  флуоресцирующим 
маркером (ФИТЦ) по общепринятой методике. Они использованы в сочетании 
с магноиммуносорбентами для обнаружения антигенов возбудителя туберкулё-
за,  были  определены  также  оптимальные  параметры  постановки  количествен-

 
142
ного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА), чувствительность и специфич-
ность метода.  
В опытах на чистых культурах и в модельных опытах на воде, контами-
нированной  различными  концентрациями  туберкулёзных  микроорганизмов, 
получены  положительные результаты при наличии в объеме пробы 1х102 м.к. и 
выше,  при  отсутствии  перекрёстных  реакций  с  гетерологичными  штаммами. 
Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил лю-
минесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической на-
садкой  типа  ФМЭЛ-14.  К  насадке  подсоединяли  источник  тока  УБПВ-1  и 
вольтметр цифровой универсальный типа В7-76.  
В процессе отработки различных условий проведения анализа установле-
но, что чувствительность КИФА  была одинаковой при  исследуемых  темпера-
турных  режимах сорбции антигена на МИС-  (22+4) 0С  и (37±1) 0С, а для кон-
такта  сорбента  с  антигеном  и  окрашивания  образовавшегося  комплекса  анти-
ген-антитело  флуоресцирующими иммуноглобулинами было достаточно 15-30 
мин инкубации.   
Нами приготовлено 5 серий тест – систем МИС для диагностики возбуди-
теля туберкулёза в КИФА, в которые входят 3 ампулы по 2 мл туберкулёзных 
МИС-10 % взвесь;  положительный  контроль - обеззараженные    клетки  мико-
бактерий туберкулёза, 1х10 9 м.к./мл, 1 ампула -1 мл; иммуноглобулины тубер-
кулёзные флуоресцирующие  сухие – рабочее разведение 1:16 – 1:64 – 1 амп –
0,5 мл.   
Таким образом,  нами  разработана  биотехнология  изготовления магно-
иммуносорбентных  диагностикумов  и  на  их  основе  сконструированы  диагно-
стические тест – системы для проведения сочетанного метода детекции возбу-
дителя  туберкулёза  в  количественном  иммунофлуоресцентном  анализе,  опти-
мизированы параметры постановки КИФА. Данный метод позволяет осуществ-
лять селективное концентрирование МТБ на сорбенте, обладает, высокой чув-
ствительностью (0,5х102 - 1х102 м.к./пробе), значительно превышающую чувст-

 
143
вительность общепринятой РИФ, возможностью быстро, в течение 1-1,5 ч учи-
тывать реакцию не только визуально, но и инструментально  (в условных еди-
ницах по показаниям вольтметра). 
Разработанные диагностические препараты и тест-системы для выявления 
микобактерий туберкулёза  испытаны  не только в лабораторных условиях, но и 
в  условиях  клиники.  Для  получения  положительных  результатов  клинических 
испытаний диагностических препаратов необходимо иметь чёткое представле-
ние о специфике выявляемого заболевания, его локализации в организме чело-
века, о свойствах возбудителя микобактерий туберкулёза, методах подготовки 
исследуемых  материалов,  так  как  от  совокупности  знаний  этих  составляющих 
зависит качество диагностики.  
Выявление  антигенов  возбудителя  туберкулёза  крайне  затруднительно. 
Известны случаи, когда в группе больных фиброзно-кавернозным туберкулёзом 
только  в  фазе  распада  впервые  выявлялся  антиген  (Хоменко  А.Г., 1992). Для 
внелёгочного  туберкулёза  на  фоне  широчайшего  полиморфизма  бактерий  ха-
рактерны малая частота обнаружения возбудителя в патологическом материале 
и  невозможность  воспользоваться  данными  рентгенологической  картины  на 
ранних этапах заболевания.  
Целью наших исследований являлось максимально возможное выявление 
антигенов МТБ у наиболее эпидемически опасной категории  пациентов, обра-
тившихся в Краевой клинический противотуберкулёзный диспансер г. Ставро-
поля  с  подозрительными  в  отношении  туберкулёза  клиническими  или  рентге-
нологическими симптомами.  
Сбор,  хранение,  транспортировку  и  работу  с  диагностическим  материа-
лом (моча, мокрота)  проводили согласно приказу МЗ РФ № 109, приложение 
№ 10 от 21.03.2003.  
Проведено  тестирование  микобактерий  и  их  антигенов  в  материале  от 
больных разными методами: РАЛ, РСА, ИФА, МИС с ИФА и КИФА.   

 
144
Было исследовано 11 проб от здоровых людей (контроль) и 286 проб кли-
нического  материала  (моча,  мокрота)  от  больных  из    краевого  клинического 
противотуберкулёзного диспансера, у которых диагноз туберкулёз (диссемини-
рованный ТБ лёгких, фиброзно-кавернозный ТБ, очаговый ТБ, ТБ мужских по-
ловых органов и т.д.) дифференцировался с неспецифическими заболеваниями 
(онкологическими, пневмонией, хроническим бронхитом, и т.д - всего 12 чело-
век).  При  постановке  РСА,  РАЛ,  ИФА  (традиционным  методом  на  плашках) 
выявляемость туберкулёзных антигенов в моче и мокроте больных составила 65 
%, 66%; 76 % соответственно, при постановке ИФА и КИФА с МИС - 91 %. Все 
разработанные  диагностикумы  дали  отрицательный  результат  при  исследова-
нии мочи и мокроты здоровых людей. 
Таким  образом,  используя  комплекс  разработанных  препаратов    и  мето-
дов (РСА, РАЛ, ИФА, ИФА с МИС, КИФА с МИС), можно проводить качест-
венную диагностику туберкулёза. Максимальный процент выявления микобак-
терий  туберкулёза  при  исследовании  больных  был  получен  с  помощью  соче-
танных методов ИФА и КИФА с МИС. 
При сравнении результатов иммуноферментных анализов  традиционного 
с использованием полистироловых плашек и сочетанного с применением МИС 
установлено,  что  результаты  исследований  значительно  различаются.  За  счёт 
селективного  концентрирования  на  своей  поверхности  туберкулёзных  антиге-
нов,  присутствующих  в  моче    и  мокроте  больных,  возможности  концентриро-
вания этих антигенов из проб большого объёма и более высокой чувствитель-
ности  МИС  с  ИФА  и  КИФА  обнаруживал  положительные  результаты  в 91% 
случаев, в отличие от традиционного ИФА, при использование которого в этих 
же пробах туберкулезный антиген выявлялся в 76% случаях.  
В  таблице 18 приведены  сравнительные  данные  по  времени  постановки 
реакции,  сроках  сохранности  твердой  фазы  с  иммобилизированными  туберку-
лёзными  иммуноглобулинами,  чувствительности  традиционного  ИФА  и  соче-
танного использования ИФА и КИФА с МИС. 

 
145
Таблица 18. Сравнительная 
характеристика 
традиционных 
и         
сочетанных   экспресс-анализов 
 
Традиционные  
Экспресс-анализы с МИС  
экспресс-анализы 
(сочетанные) 
Анали- Вре-
Срок 
Исследуемые 
Анали- Вре- Срок 
Исследуемые объек-
зы 
мя 
год-
объекты 
зы 
мя 
годнос-
ты 
пос-
ности  Чис-
За-
пос-
ти  сен- Чистая 
Загряз-
та-
сен-
тая 
грязнё
та-
сибил.  куль-
нённые 
нов-
си-
куль- 
нные 
нов- твёрдой  тура 
объекты 
ки, ч  бил.  тура 
объек-
ки, ч фазы 
внешней 
твёр-
ты 
среды  
дой 
внеш-
фазы 
ней 
 
среды
Чувствитель-  
Чувствительность,  
ность, м.к.  в 
м.к. в объёме пробы
мл. 
ИФА 
21 20 
дн. 5х10 4 
1х10 5 
ИФА 1  3 
г 
0,5х102- 
1х10 2 
 
(срок 
1х10 2 
 
 
наблю-
 
дения) 
РИФ 2  
5х10 4 
1х10 5 
КИФА 1  3 
г 
0,5х102- 
1х10 2 
(срок 
1х10 2 
 
наблю-
дения) 
 
Обобщая  преимущества  данных  тест-систем  следует  отметить,  что  нами 
получены  принципиально  новые  диагностические  препараты  для  выявления 
возбудителя  туберкулёза,  позволяющие  обнаруживать  с  высокой  чувствитель-
ностью (1х10 2 м.к. в пробе) антигены возбудителя при их низкой концентрации 
в материале, проводить исследования проб большого объёма, освобождаться от 
неспецифических компонентов реакции за счёт тщательного промывания МИС, 
фиксированных в магнитном поле. Данные системы относятся к средствам экс-
пресс-диагностики туберкулёза, т.к. позволяют получить результат через 1-1,5 ч  
после  начала  исследования.  Немаловажным  является  и  то,  что  туберкулёзный 
МИС не теряет своих физико-химических и иммунологических свойств (чувст-
вительность  и  специфичность)  при  хранении  на  протяжении    3  лет  (срок  на-
блюдения).  
 

 
146
Анализ полученных данных позволил установить, что использование ад-
сорбированной  туберкулёзной  сыворотки  при  конструировании  диагностиче-
ских  препаратов  по  разработанной  биотехнологии  даёт  возможность  получать 
различные  специфические  и  чувствительные  диагностикумы  для  выявления 
возбудителя туберкулёза в модельных объектах и у больных людей. 
В итоге проведённых исследований подтверждены основные методологи-
ческие  подходы  к  разработке,  изучению  и  производству  различных  иммуно-
препаратов  для  диагностики  возбудителя  туберкулёза.  Составлена  блок-схема 
производства и исследования данных препаратов (рис. 19).  
 
1 этап  

Анализ и обобщение литературных данных, исследование 
выбранных сырьевых объектов 
 
Выбор и анализ сырья для 
 
конструирования диагностических пре-
2 этап 
паратов: 1. Разработка методов извлечения полноценных бактери-
 
альных антигенов. 2. Отработка схем иммунизации и иммуносорб-
 
ции туберкулёзной сыворотки крови. 
 
Выбор  и  анализ  конъюгирую  щих компонентов (ферментов, краси-
телей, матриц). Изучение их свойств (чистоты, активности, сорбци-
3 этап 
онной ёмкости, структурных характеристик) 
 
 

Выбор оптимальных технологий конъюгирования лигандов (анти-
 
генов и иммуноглобулинов), маркёров (отработка временных, тем-
 
пературных параметров, величины рН, концентрации белка, состава 
4 этап 
и свойств буфера, количественных соотношений компонентов) и 
 
производство диагностических препаратов, а также тест-систем для 
 
выявления возбудителя туберкулёза 
 
5 этап 

Стандартизация  препаратов по физико-химическим  (прозрачность, 
цветность)  и  имму
 
нологическим  показателям  (активность,  специ-
 
фичность, чувствительность)  
 
Рисунок 19. Блок-схема  производства  и  исследования    туберкулёзных  ди-
агностических препаратов 
 

В  процессе  научно-методических  разработок  созданы  новые  латексные 
(для  РАЛ),  иммуноферментные  (для  ИФА)  диагностикумы,  сконструированы 

 
147
новые  препараты  алюмосиликатные  (суспензионные  для  РСА),  липосомально-
иммуноферментные   (для ИФА),  магноиммуносорбентные  (для ИФА, КИФА),  
позволяющие  выявлять  возбудитель  туберкулёза,  его  антигены  в  объектах 
внешней среды и в клиническом материале. Использование селективного кон-
центрирования  возбудителя  на  МИС  с  последующим  проведением  экспресс-
анализа  расширяет  возможности  индикации  возбудителя  туберкулёза  за  счёт 
высокой чувствительности (1х102 - 5х101 м.к./в пробе, объём которой практиче-
ски не ограничен), позволяет получать результаты анализа в короткие сроки (1-
1,5  ч),  даёт  возможность  проведения  и  завершения  анализов  без  выделения 
культуры,  при  использовании  только  нативного  материала,  что  способствует 
оперативному эпидемиологическому анализу и формированию целенаправлен-
ных противотуберкулёзных медицинских  мероприятий. 

 
148
ВЫВОДЫ 
 
1.  Сочетанное использование водно-солевой экстракции, механической и 
ультразвуковой  дезинтеграции  позволило  выделять  из  обеззараженных 
ацетоном микобактерий туберкулёза полноценные антигенные комплексы 
с  серологической  активностью  1:32-1:64 в  реакции  иммунодиффузии  с 
туберкулёзной  сывороткой.  Данная  биотехнология  оказалась  пригодной 
для изолирования антигенов из близкородственных возбудителю туберку-
лёза в серологическом отношении микроорганизмов. 
2.  При  получении  высокоактивных  туберкулёзных  иммунных  сывороток 
для иммунизации кроликов применяли выделенные антигенные комплек-
сы  с  иммуномодуляторами  феракрилом,  тималином  и  циклофосфаном. 
Специфическая  активность  полученных  сывороток  в  непрямой  реакции 
иммунофлуоресценции  достигала 1:400 –1:600, а  в  реакции  иммунодиф-
фузии –1:32-1:64. 
3.  Удаление  из  туберкулёзных  иммунных  сывороток  перекрёстно  реаги-
рующих антител с помощью магнитных сорбентов с ковалентно фиксиро-
ванными на их поверхности антигенами гетерологичных штаммов обеспе-
чило получение сырья, пригодного для конструирования различных диаг-
ностических препаратов. 
4.  Разработанная  биотехнология  изготовления  липосомальных  туберку-
лёзных иммунопероксидазных конъюгатов обеспечила получение высоко-
чувствительного,  специфического  диагностикума,  отличающегося  повы-
шенной стабильностью при хранении по сравнению с традиционным им-
мунопероксидазным конъюгатом. 
5.  Впервые осуществлена научная разработка биотехнологии производст-
ва серии высокоспецифических диагностических препаратов и иммобили-
зованных систем для выявления возбудителя туберкулёза и его антигенов 

 
149
в искусственно контаминированных пробах и в клиническом материале от 
больных (моча, мокрота). 
6.  Чувствительность  разработанного  туберкулёзного  латексного  диагно-
стикума в реакции агглютинации латекса (РАЛ) составила 3,9х10 5-7,8х105 
м.к./мл,  а  алюмосиликатного  туберкулёзного  диагностикума  в  реакции 
суспензионной агглютинации (РСА) на стекле- 7,8х105-1,56х106 при учёте 
результатов РАЛ через 16-18 ч, а РСА – через 1-3 мин. В клиническом ма-
териале (моча, мокрота) у больных туберкулёзом специфические антигены 
микобактерий выявлены в РАЛ в 66 % случаев, в РСА- в 65 %. 
7.  Туберкулёзные  магнитные  иммуносорбенты,  полученные  по  разрабо-
танной  биотехнологии,  способны  селективно  концентрировать  на  своей 
поверхности  микобактерии  туберкулёза,  его  антигены  из  исследуемых 
проб большого объёма, включая клинический материал от больных тубер-
кулёзом, и выступать в качестве твёрдой фазы при осуществлении имму-
ноферментного  и  количественного  иммунофлуоресцентного  анализов, 
обеспечивающих  с  высокой  специфичностью  выявление  туберкулёзного 
микроба в течение 1-1,5 ч с чувствительностью 1х102 м.к./пробе. 
8.   В  клиническом  материале  (моча,  мокрота)  у  больных  различными 
формами туберкулёза специфические антигены микобактерий при исполь-
зовании туберкулёзных магнитных иммуносорбентов в сочетании с имму-
ноферментным и количественным иммунофлуоресцентным методами вы-
явлены в 91 %, что подчёркивает высокую диагностическую ценность раз-
работанных препаратов. 
 
 
 
 
 

 
150
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 
1.  Проводить  извлечение  антигенного  материала  путём  водно-солевой 
экстракции, механической и ультразвуковой дезинтеграции для получения 
активных антигенных  комплексов микобактерий туберкулёза. 
2.  Для  повышения    специфичности  сыворотки  проводить  их  иммуно-
сорбцию от гетерологичных антител с помощью аффинных магноиммуно-
сорбентов,  полученных  иммобилизацией  с  гетерологичными  антигенами, 
что упрощает и ускоряет процесс очистки. 
3.  При  конструировании  суспензионных  латексных  и  алюмосиликатных 
диагностикумов необходимо опытным путём подбирать нагрузку лиганда, 
временные и температурные параметры. 
4.  При  получении  магноиммуносорбентов  для  ИФА  и  КИФА  использо-
вать  в  качестве  носителя - алюмосиликат,  модификатора - полиглюкин, 
активатора - вторичный алкилсульфат натрия. 
5.  Проводить  селективное    концентрирование  на    магноиммуносорбенте 
туберкулёзных антигенов из объектов внешней среды и клинического ма-
териала, используя постоянный магнит, магнитные ловушки, с последую-
щей постановкой ИФА, КИФА. Для постановки анализов следует исполь-
зовать флаконы, пробирки, планшеты.  
6.  Для  получения  положительных  результатов  клинических  испытаний 
препаратов  необходимо  иметь  чёткое  представление  о  специфике  выяв-
ляемого заболевания, его локализации в организме человека, о свойствах 
возбудителя микобактерий туберкулёза, правильно проводить подготовку 
и сбор исследуемых материалов, так как от совокупности знаний этих со-
ставляющих зависит качество диагностики. 
 
 

 
151
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 
 
 
1. 
Абелян  В.А.,  Африкян  Э.Г.  Иммобилизация  циклодекстрин-гликозил-
трансферозы  и  характеристика  полученного  биокатализатора // Журн.  при-
кладная биохимия и микробиол. - 1992. - Том 28 №2. - С. 205-209.  
2. 
Адамов А.К. Свойства антител, фиксированных на частицах, и перспек-
тивы применения их в микробиологии. Сообщение VI // Журн. микробиол.   – 
1965. - № 2. - С. 100-105. 
3. 
Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антитела и иммуносорбен-
ты. – М. - 1969. - 175 с. 
4. 
Аксёнова  В.А.  Эпидемическая  ситуация  по  туберкулёзу  у  детей  в 
России// Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - №8. - С. 57.  
5. 
Алексеев В.В., Быкова О.И., Голосеев Ю.А. и др. Обоснование требова-
ний  к  люминесцирующим  иммуноглобулиновым  препаратам,  предназначен-
ным  для количественного иммунофлуоресцентного анализа // Особо опасные 
инфекции на Кавказе.  - Ставрополь, 1987. - С.12-14. 
6. 
Алексеев  П.  Названы  социально  значимые  заболевания/  Мед.  газета. - 
№100. - 17.12. 2004 
7. 
Аленкина  Т.В.,  Данилина  И.В.  Применение  иммуносорбентов  для     
повышения  специфичности  диагностических  сывороток // Эпидемиологиче-
ская  безопасность.  Итоги      и  перспективы:  Материалы  юбилейной  науч.-
практ.конф., посвящённой 50-летию СтавНИПЧИ.- Ставрополь, 2002. - С.8-10.    
8. 
Алесковский  В.В.,  Юффа  А.Я.  Модифицирование  поверхности  неорга-
ническими  соединениями // Журнал  Всес.  Хим.  общ.  Им.  Д.И.Менделеева.-
1989.- № 3.- С.317-324.  
9. 
Андреев  Л.В.,  Склифас  А.К.  Биохимия  и  биофизика  микроорганизмов.- 
Горький, 1997.- №5.- С.3-9. 
10.  Архангельский Н.И., Сихарулидзе А.И. Способ диагностики туберкулё-
за. А. с. №1171038. Бюл.№29 от 07.08.85.  

 
152
11.  Афанасьев  Е.Н.  Научно-методические  аспекты  экспресс-диагностики 
возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская 
язва): Автореф. дис. … докт. мед. наук. – Ростов, 2000. – 45 с. 
12.  Афанасьев  Е.Н.,  Таран  И.Ф.,  Тюменцева  И.С.  Антигенная  структура 
бруцелл.  Сообщ. I. Сравнительная  оценка  методов  выделения  водораствори-
мых    антигенов  бруцелл.–  Ставрополь, 1986. – 16с. –  Деп.  в  ВИНИТИ,  № 
6635-В86. 
13.  Базиков И.А. Разработка новых препаратов для экспрессных методов ди-
агностики сифилиса: Дис. …докт. мед. наук. – Ставрополь, 2000. – 200 с. 
14.  Белиловский  Е.М.  Развитие  государственной  системы  мониторинга 
туберкулёза, // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - №8. - С. 58.  
15.  Белиловский Е.М., Борисов С.Е., Дергачёв А.В., Гордина А.В., Марьина 
Н.С.,  Матвеева  М.Б.  Заболеваемость  туберкулёзом  в  России:  её  структура  и 
динамика // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - №7. - С. 4-11.  
16.  Бельская  Н.А.,  Митина  В.С.,  Вейнблат  В.И.  Микрометод  фракциониро-
вания и идентификация белков // Лаб. дело. – 1972. - № 10. – С.514-616. 
17.  Бендикене  В.Г.,  Песлякас  И.Г.,  Веса  В.С.  Хроматография  сериновых 
протеаз на хитине и его производных // Прикладная биохимия и микробиол. - 
1981. –Т. 17, №3. - С. 441-447.  
18.  Березин  В.Б.,  Лахтин  В.М.,  Ямсков  И.А.  Аффинный 
хроматографический  сорбент,  содержащий  группировки    конканавалина    А, 
иммобили-зованного    комплексообразованием  с  кобальтом // Прикладная 
биохимия и микробиол.  -  1995.  - Т.31,  N 4.  - С.400-404. 
19.  Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М., 1982. – С.92.  
20.  Борисенко  О.В.,  Жарникова  И.В.,  Макрушникова  А.И.,  Таран  В.И. 
Разработка  новой  магнитоуправляемой  твёрдофазной  иммуноферментной 
системы  для  диагностики  туберкулёза  у  людей // X итоговая  научная 
конференция  молодых  учёных  и  студентов.  Ставрополь.Изд.:  СГМА, 2002, 
С.62 

 
153
21.  Борисов  Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. 
М.- 2002.- С.437- 441. 
22.  Брыкалов А.В.  Получение биопрепаратов на основе методов аффинной 
сорбции  и  иммобилизации:  Дисс. ... докт.  химич.  наук. - Санкт-Петербург, 
1993. - 330 с. 
23.  Брыкалов  А.В.  Сорбенты  на  основе  кремнеземов  и  активированных 
углей    в    биотехнологии    и    медицине // Материалы  конф.  химиков 
Сев.Кавказа.- Нальчик, 1991.- С.185-186. 
24.  Брыкалов А.В., Кобанкова А.Н. Синтез и исследование компазиционных 
хитозанкремнезёмных сорбентов биомедицинского назначения // Современные 
достижения биотехнологии: Материалы 2-ой Всеросс.науч.-техн.конф. - Став-
рополь, 12-13 сентября 2002 г. – Т1. - С.135-136.   
25.  Брыкалов  А.В.,  Ковальков  В.И.,  Тельбух  В.П.  и  др.  Способ  получения 
иммобилизованных протеолитических ферментов. Патент № 1084300 А  С 12 
№11/14 от 27.08.1982. 
26.  Бусеев  А.И.,  Ефимов  И.П.  Словарь  химических  терминов.-М.,1971.-  С. 
92.  
27.  Василенко Н.Ф., Кронгауз И.В., Лопаткин О.Н. и др. Способ получения 
туляремийного антигена / А. с. № 1425910 от 22.05.1988. 
28.  Вейнблат В.И., Каминский В.В., Орлова Л.С. Иммунодискэлектрофорез 
антигенов чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 
1971. – Вып. 4(26). – С.196-200. 
29.  Вишневская Е.Б., Бобченок А.П., Мельникова Н.Н. и др. Идентификация 
L-  форм  микобактерий  туберкулёзного  комплекса  с  применением  полимераз-
ной цепной реакции (ПЦР) // Проблемы туберкулёза.-2001. - №3. - С.38-39. 
30.  Владимцева  И.В.  Научно-методические  аспекты  приготовления  и  ис-
пользования  магнитоуправляемых  иммобилизованных  микробиологических  
систем: Автор. ... докт. биол. наук. - Ставрополь, 2002. - 39 с. 

 
154
31.  Владимцева И.В., Плеханова Н.Г., Смирнова В.И., Закревский В.И. Кон-
струирование  диагностической  тест-системы  на  основе  магносорбентов  и  ли-
посом // ЖМЭИ. – 1990. - №10. – С.103-106. 
32.  Власов Г.С., Салов В.Ф., Торчилин В.П., Бердичевский В.Р. Липисомы и 
перспективы их использования в прикладной иммунологии // ЖМЭИ. – 1982. 
№8. – С.12-19. 
33.  Водолазова А.М.,  Никитина Л.Н. Электрофоретическая характеристика 
стадии  риванолового   осаждения   иммуноглобулинов // Биологические пре-
параты  и иммунологическая реактивность организма. - Томск, 1981. - С.14-15. 
34.  Гавенский  С.  Д. , Ефременко  В.  И.,  Климова  И.  М.  и  др.  Применение 
магнитных сорбентов для  концентрирования и выделения чумного микроба из 
объектов внешней среды (нестерильная почва) // Современ. методы диагност. 
ООИ и способы их  применения. - Методич. пособие Саратов, 1991. - С.35-40. 
35.  Гавенский  С.Д.,  Пушкарь  В.Г.  Жизнеспособность  микроорганизмов  в 
магнитных  иммуносорбентах //Актуальные  вопросы  профилактики  особо 
опасных и других инфекционных заболеваний: Тез.докл.науч.-практ. конф. 60 
лет противочумной службы Кавказа. -  Ставрополь, 1995. -  С. 116-118. 
36.  Гаврилова  Е.М.,  Дзантиев  Б.В.,  Егоров  А.М.  Иммуноферментный 
анализ:  Тез.докл.3-го  Всес.науч.симпоз. "Получение  иммобилизованных 
ферментов в научных исследованиях, промышленности и медицине"-Л., 1980. 
- С.37-38. 
37.  Гайда  А.В.,  Староверов  С.М.  Модифицироранные  кремнезёмные 
носители  в  биотехнологии // Журн.  Всесоюзного  хим.  общества 
им.Менделеева.- 1989. - Т34. № 3. - С. 356-363. 
38.  Герстунбергер  М.Р.,  Сухоруков  Г.Б.,  Радченко  И.Л.  и  др.  Новый  метод 
получения биополимерных микрокапсул для создания лекарственных средств 
//  Биотехнология-  состояние  и  перспективы  развития:  Материалы 1-го  Меж-
дун.  Конгресса. - М, 2002. - С.54. 

 
155
39.  Гинзбург  А.Л.  Генодиагностика  инфекционных  заболеваний // Журн. 
микробиол. - 1998. - №3. - С.86-95. 
40.  Гонтарь И.П., Зборовский И.А., Александров А.В и  др. Иммуномодули-
рующий  эффект  магносорбентов  в  терапии  реавматических  заболеваний // Y 
Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”: Тез. докл. – 1998. 
– С.35. 
41.  Гучетль 
Е.В., 
Пономарёва 
Л.П. 
Опыт 
определения 
противотуберкулёзных  антител  в  краевом  противотуберкулёзном  диспансере 
Краснодара // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - №9. - С.36 
42.  Дмитриев  Г.А.,  Киселёва  Т.А.  Применение  ИФА  для  серодиагностики 
сифилиса // Актуальные вопросы дерм. и венер.: Сб.тр. юбил конф., посвящ. 5-
летию созд.кож. и вен. болезней педиатр. фак.РГМУ -  М., 1997. - С.36-37. 
43.  Домарадский И.В. Проблемы перекрёстного иммунитета// Проблемы ту-
беркулёза.-1994. - №1. - С.13-17. 
44. Драбкина Р. Микробиология туберкулёза.М., 1963.-255с. 
45. Дюга Г., Пенни К. Биоорганическая химия. – М.,1983. -  С. 348, 352. 
46. Дячина  М.Н.,  Лукин  Ю.В.,  Зубов  В.П.  и  др.  Микротитрационный  вариант 
реакции  латекс-агглютинации  в  диагностике  лепры // Клин.лабат.диагн. - 
1995. - №2. - С.24-26. 
47.  Елистратов  Г.Д.,  Волчанова  М.И.,  Малыгин  И.В.,  Гирда  Т.В.  Способ 
получения сорбента // БИПМ.-№ 3. –2004.- С. 629. 
48.  Елистратов  Г.Д.,  Волчанова  М.И.,  Малыгин  И.В.,  Шолошов  А.П., 
Стрелков  В.П.,  Гнутов  В.Г.,  Григорьев  Г.А.,  Гаськов  Д.Г.  Способ  получения 
сорбента // БИПМ.-№ 3. –2004.- С. 629. 
49.  Ерохин 
В.В. 
Сотрудничество 
Российских 
фтизиаторов 
с 
международными организациями // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 
2003. - №8. - С. 57.  
50.  Ерохин  В.В.,  Земекова  В.С.,  Уварова  О.А.,  Казак  Т.И.,  Суркова  Л.К., 
Ариэль  Б.М.,  Краснов  С.А.  Паталогоанатомическая  диагностика  прогресси-

 
156
рующих форм туберкулёза лёгких в связи с новой клинической классификаци-
ей // Проблемы туберкулёза.- 1996. - №4. - С. 32-36. 
51.  Ерохин Е.П. Метод пассивной агглютинации полимерных дисперсий для 
диагностики легионеллеза // Журн. микробиол. – 1991. - № 11.- С. 41-43. 
52. Ефременко В.И. Липосомы. Монография.- Ставрополь, 1999.-236.  
53.  Ефременко  В.И.  Магнитоуправляемые  иммобилизованные  системы  в 
микробиологическом  мониторинге  природных  очагов  и  объектов  внешней 
среды  на  наличие  возбудителей  опасных  инфекционных  болезней // Журн. 
микробиол. – 1997. - №2. - С.102-106.  
54.  Ефременко В.И., Брыкалов А.В., Жарникова И.В. Новые препараты для 
диагностики и  ветеринарно-санитарного мониторинга // Пища. Экология. Че-
ловек : Тез.докл. междун. научн.-технич. конф. - Москва,  1995. - С. 206. 
55.  Ефременко  В.И.,  Климова  И.М.,  Трофимов  Е.Н..  Магнитный  иммуно-
ферментный анализ антигенов чумного микроба // Журн. микробиол.  - 1989. - 
№ 7. -  С.62-66. 
56. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Василенко Н.Ф. и др. Разработка техно-
логической  линии  производства  в  методах  иммуноанализа  микроорганизмов: 
Заключительный отчет о НИР, инв. № 02.9.70001181.– Ставрополь,1996. – 96 с. 
57. Жарникова  И.  В.,  Брыкалов  А.  В.,  Тюменцева  И.  С.  и  др.  И.  Разработка  
твердофазной  реакции   иммунофлюоресценции (PИФ) на основе композици-
онных магноиммуносорбентов // Соврем. достиж.  биотехнол.: Тез.докл. Пер-
вой  конф. Северо-Кавказ. региона. - Ставрополь, 1995.- С. 87- 88 
58.  Жарникова  И.В.  Методологические  подходы  и  разработка  биотехноло-
гии  иммунобиологических        препаратов      для        диагностики  инфекционных  
особо  опасных  заболеваний  и детекции их возбудителей Авт. док. дис…2005. 
59.  Жарникова И.В. Структурированный       керамический носитель  с маг-
нитным    материалом  для  иммобилизации  антител // Биотехнология.- 2004. - 
№1.- С.71-79.  

 
157
60.  Жарникова  И.В.,  Тюменцева  И.С.,  Афанасьев  Е.Н,  Ефременко  В.И., 
Жданова  Е.В.,  Борисенко  О.В.  Биотехнология  иммуносорбентных  диагности-
кумов для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций.// Мате-
риалы 2-ой  Всероссийссой  научно-технической  конференции.  Современные 
достижения биотехнологии.  - Ставрополь, 12-13 сентября  2002. -  С.162-164. 
61.  Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н., Би-
натова В.В. Способ получения иммуносорбента (варианты) / Патент на изобре-
тение № 2138813   6 G 01 N 33/543, A 61 K 39/385, C 12 N 11/14. Зарегистр. в 
Гос. реестре изобретений РФ  27.09.99 г. Бюл.№ 27. 
62.  Жердева  В.В.,  Чудинов  А.В.,  Савицкий  А.П.  Разработка  иммунофлуо-
ресцентного анализа с временным разрешением для определения гормона ти-
роксина  в  сухих  пятнах  крови // Биотехнология - состояние  и  перспективы 
развития: Тез.докл. 1-го Междун.  Конгресса. – М., 2002. - С.56. 
63.  Жилченко Е.Б., Ефременко В.И. Подготовка проб воды открытых водо-
источников для выявления токсигенных штаммов возбудителя холеры // Эпи-
демиологическая  безопасность.  Итоги      и  перспективы:  Тез.докл.  юбилейной 
науч.-практ.конф. - Ставрополь, 2002. - С.105-106.    
64.  Журавлёв  М.В.,  Арсенина  Л.В.,  Виноградова  И.Л.,  Проваторова 
Л.В.Эпидемиология и некоторые аспекты  лабораторной диагностики туберку-
лёза// Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М.- 2002. 
– Вып.4.- С.194-197.  
65.  Закревский В.И. Некоторые аспекты применения липосом в диагностике, 
профилактике и лечении инфекционных заболеваний // Молек. генетика, мик-
робиол. и вирусол. – 1985. - №1. – С.3-8. 
66.  Закревский  В.И.,  Подзолков  В.В.,  Мельников  В.А.  Способ  включения 
веществ в липосомы: А.с. № 1005791, СССР, 1983. 
67.  Иванов Ю.В., Коровкин  С.А. Флюоресценция с временным разрешени-
ем  и  ее  применение  для  диагностики  ООИ // Материалы VII съезда  Всеросс. 
общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. – М., 1997. - Т. 1. - С. 442. 

 
158
68.   Инструкция  по  унифицированным  методам  микробиологических 
исследований  при  выявлении,  диагностике  и  лечении  туберкулёза. 
Приложение № 11 к приказу №109.М., 2003. 
69.   Инструкция  по  унифицированным  методам  микроскопических 
исследований  для  выявления  кислотоустойчивых  микобактерий  в  клинико-
диагностических  лабораториях  лечебно-профилактических  учреждений. 
Приложение № 10 к приказу №109.М., 2003. 
70.  Калинина О.А., Емельянова И.В., Локтионова М.А. ИФА в серодиагно-
стике  сифилиса // Совр.  вопр.  дермато-венерологии:  Сб.  юбил  науч.  Тр.,  по-
свящ.70-летию обл.кож.- вен.дисп.г. Курска. – Курск.- 1997.- С.65-67. 
71.  Канюк  А.Н.  Комплексные  бактериологические  исследования  в  диагно-
стики туберкулёза // Туберкулёз и экология.- 1995. - №3.-С.31-33.  
72.  Карпенко  В.В.,  Сачков  В.И.  Обезболивание  животных  в  эксперименте:  
Метод. рек. – М., 1985. – 53 с. 
73.  Карпов  С.П.,  Прегер  С.М.,  Синельников  Г.Е.  и  др.  Гипериммунные 
сыворотки. – Томск, 1976. – 378 с. 
74.  Кейтс М.Техника липидологии. М. Мир, 1975.-С.68-82. 
75.  Кельцев  Н.В.  Основы  адсорбционной  техники .-М:  Химия,1984. - С. 
280. 
76.  Киселев А.В., Кустова Т.Л. Способ приготовления аэросилогелей // А.с. 
N 264369 . -1976. 
77.  Кислицын Ю.В., Мешандин А.Г. Способ определения наличия противо-
мозговых антител в ликворе. Заявка № 2000127007/14, Бюл № 20.- 20.06. 2002. 
78.   Клименко М.Т., Гинзбург Т.С., Сокало С.В. Результативность биологи-
ческого и культурального методов исследования при диагностике туберкулёза 
// Проблемы туберкулёза - 1987.- №8.-С.70-73.  
79.  Клименко  М.Т.,  Гинзбург  Т.С.,  Сокало  С.В.,  Бочко  И.В.,  Крикун  А.И. 
Микробиологическая  диагностика  туберкулёза  почек // Проблемы  туберкулё-
за- 1985.- №8.-С.37-40.  

 
159
80.   Клячко-Гурвич А.А.  Методы определения удельной поверхности  //Из-
во  АН СССР. – 1964. - № 10. – С.1885. 
81.   Коваленко  Г.А,  Комова  О.В.  Симаков  А.В.  и  др.  Углеродсодержащие 
макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммоби-
лизации ферментов и микроорганизмов //Биотехнология.-2002. - №3. - С.55-66. 
82.  Кольцов  С.И.,  Алесковский  В.Б.  Силикагель,  его  строение  и  физико-
химические свойства. - Л: Госхимиздат, 1973. - С.96. 
83.  Коротченко С.И. Состояние и перспективы борьбы с туберкулёзом// Ак-
туальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней.М.- 1999. – Вып.3.- 
С.139-142.  
84.  Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология 
и вирусология. СПб, 2002.- С.480-481. 
85.  Кузовлева  А.А.,  Шаханина  К.Л.  Сравнение  различных  способов  иммо-
билизации препаратов чистых антител и  неспецифических иммуноглобулинов 
// Лаб.дело. - 1982. - N 3. - С.9-12. 
86.  Кузовлева  А.А.,  Шаханина  К.Л.  Сравнение  различных  способов  иммо-
билизации препаратов чистых антител и  неспецифических иммуноглобулинов 
// Лаб.дело. - 1982. - N 3. - С.9-12. 
87.  Кулаков  Ю. К., Горелов В. Н., Мотин  В. Л. и др. Высокочувствительная 
неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР) 
для идентификации бруцелл // Молекуляр. генетика, микробиол. и  вирусол. – 
М., 1992. - №  7 - 8.  -  С. 23. 
88.  Куличенко  А.Н.,  Попов  Ю.А.,  Наумов  А.В.  Детекция  возбудителей 
особо  опасных  инфекций  в  биологическом  материале  и  объектах  внешней 
среды с помощью полимеразной цепной реакции. // Актуал. вопр. профилакт. 
Особо  опас.  и  других  инфекционных  заболеваний:  Материалы    науч.-
практ.конф. - Ставрополь, 1995. - С.175-176. 
89.  Куличенко  А.Н.,  Попов  Ю.А.,Опочинский  Э.Ф.  и  др.  Методические 
указания  по  детекции  патогенной  микрофлоры  в  клиническом  материале, 

 
160
пищевых  продуктах,  объектах  внешне  среды  и  выполнению  генетической 
идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции.- М.,1996. - 
11с. 
90.  Кунижев С.М., Воробьёва О.В., Денисова Е.В. и др. Разработка способа 
получения универсальной матрицы для энтеросорбентов // Биотехнология- со-
стояние  и  перспективы  развития:  Материалы 1-го  Международного  
Конгресса. - М., 2002. - С.75. 
91.  Лавриненко  И.А.,  Костровский  В.Г.  Использование  высокоёмких 
иммуноносителей  при  определении  антител  к  вирусу  иммунодефицита 
человека // Журнал микробиол. –1997. -№1. - С.18-22. 
92.  Лазовская А.Л., Воробьёва З.Г., Слинина К.Н.  Способ выявления мико-
бактериальных антигенов. Патент № 2188428,  Бюл.№24. -  27.08.2002.  
93.  Лазовская А.Л., Воробьёва З.Г., Слинина К.Н.  Способ выявления мико-
бактериальных антигенов. Патент № 2188428,  Бюл.№24. -  27.08.2002.  
94.  Ларионова  Е.Е.,  Кузьмин  А.В.  Актуальные  вопросы  туберкулёза  и  дру-
гих  гранулематозных  заболеваний//  Сборник  материалов  науч.-практ.  конфе-
ренции молодых учёных.- М., 2001.- С.28-29., 2001  
95.  Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В., Васильева И.А., Сравнительная характе-
ристика  молекулярных  и  микробиологических  методов  контроля  химиотера-
пии у впервые выявленных больных туберкулёзом лёгких// Проблемы туберк-
лёза и болезней лёгких.- 2004. - №6. - С. 31-34. 
96.  Лисичкин  Г.В.  Достижения,  проблемы  и  перспективы  химического 
модифицирования поверхности минеральных веществ // Журн. Всесоюз. хим. 
общества им.Менделеева. –1989.-Т.34, № 3. - С. 291-297. 
97.  Литвинов В.И. Иммунодиагностика туберкулёза // Проблемы туберкулё-
за- 1996.- №1.-С.56-59.  
98.  Литчфилд  У.Д.,  Фрейтаг  Д.У.  Иммуноанализ  с  помощью  ферментов, 
заключенных в липосомы // М., 1998. – С.122-129. 

 
161
99.  Лопаткин О.Н.,  Кронгауз  И.В.  Оптимизация  параметров метки имму-
ноглобулинов    изотиоцианатом    флуоресцеина // Болезни  с  природной очаго-
востью на Кавказе: Тез. докл. - Ставрополь, 1982.- С.173-175. 
100.  Лопаткин  О.Н.,  Кронгауз  И.В.  Повыщение  специфичности  сывороток 
при  использовании  метода  твёрдофазной  адсорбции//  Профилактика  чумы  и 
других природно-очаговых инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. – Став-
рополь, 1983. – Т.2. – С.81-82. 
101.  Лопаткин О.Н., Кронгауз И.В. Усовершенствование иммуноферментного 
метода  для  диагностики  туберкулёза  у  людей  и  крупного  рогатого  ско-
та//Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилак-
тики о.о.и. заболеваний:Тез. докл.научной конф. В Омске- Ставрополь, 1993.-
С.229-230. 
102.  Лопаткин  О.Н.,  Фунтикова  Т.Н.,  Буравцева  Н.П.  и  др.  Эффективность 
различных  схем  иммунизации  кроликов  при  получении  диагностических  си-
биреязвенных  капсульно-соматических  сывороток // Профилактика  чумы  и 
других природно-очаговых инфекций: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. – Став-
рополь, 1983. – Т.2. – С.91-92. 
103.  Лукин  Ю.В.,  Трифонов  В.Д.,  Туркин  С.И.  и  др.  Полиакролеиновые 
латесы в качестве иммунореагентов // Тр. МХТИ.- 1985. - Вып. 185. - С. 88-92. 
104.  Марголис  Л.Б.  Механизмы  взаимодействия  липосом  с  клетками:  пер-
спективы и ограничения применения липосом в науке и практике //Биол. мем-
браны. – 1987.-Т.4, №5. – С.453-467. 
105.  Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клет-
ками // М.:Наука, 1986. – 240 с. 
106.  Масько А.А., Морозова А.А., Лыга Л.К. и др. Иммобилизация трипсина 
на  углеволокнистых  носителях,  различающихся  структурой,  пористостью  и 
химией  поверхности // Прикладная  биохимия  и  микробиология. -М.,  Наука, 
1992. -Том 28, №2. - С. 211-216.    

 
162
107.  Маякова  Т.И.,  Кузнецова  Э.Э.,  Ковалёва  М.Г. , Плюснин  С.А.,  Соколь-
никова  Н.А.,  Мазутова  М.С.  Быстрое  выявление  микобактерий  туберкулёза 
методом  хромато-масс-спектрометрического  селективного  ионного  монито-
ринга// Проблемы туберкулёза.- 1995. - №6. - С. 16-20.  
108.  Медицинская  и  санитарная  микробиология.  Под  ред.  Воробьёва  А.А., 
Кривошеина Ю.С., Широбокова В.П.-М., 2003.-С.213-217. 
109.  Медицинская  микробиология.  Под  ред.  Покровского  В.И.,  Позднеева 
О.И. М.,1998.-С.499-509. 
110.  Методические указания  «Микробиологические исследования при выяв-
лении, диагностике и лечении туберкулёза». М, 2001. 
111.  Милютина  Л.Н.,  Скопинская  С.Н.,  Ярков  С.П.  Липосомальный  имму-
ноанализ в диагностике сальмонеллеза у детей //Эпидемиол. и инф. болез-
ни. – 1996. – № 3. – С.48-52. 
112.  Муромец  В.И.,  Наградова  Н.К.  Иммобилизованные  олигомерные  фер-
менты. - М: Наука, 1984. - С.10. 
113.  Носков Ф.С. Очистка конъюгатов от непрореагировавшего флюорохрома 
// Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В.Перадзе, 
П.Халонена. - М.,1985.-С. 254. 
114.  Носков Ф.С. Флуоресцирующие антитела и их применение в  вирусоло-
гии.-  В  кн.:  Респираторные вирусные инфекции.  - Л.,1969. - С.217-242. 
115.  Ометов В.К., Моргуль М.П., Уразовская Е.В. и др. О применении имму-
ноферментного анализа в диагностике сифилиса // Вестн. дермат.- 1997.- №3.-
С.24-35. 
116.  Онищенко Г.Г. (Материалы к докладу) – Главного государственного са-
нитарного врача РФ на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробио-
логов и паразитологов// М., 26-28 марта 2002. 
117.  Онищенко Г.Г. Эпидемиологическая  ситуация  в Российской Федерации 
и меры по её стабилизации// Проблемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - 
№11. - С. 4-9.  

 
163
118.  Остро М.Д. Липосомы // В мире науки. – 1987. Т3. – С.71-79. 
119.  Пекшев А.В., Елагин Г.Д., Пятков В.А.  Разработка  эритроцитарного ди-
агностикума для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии // Ди-
агностика,  лечение  и  профилактика  опасных    инфекционных  заболеваний. 
Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбил. науч. конф., посвящ. 70-летию 
НИИ микробиологии МО РФ (30 ноября - 1 декабря 1998). - Киров, 1998.- С. 
185. 
120.  Петров Р.В. Иммунология. М.,Медицина.-1983.-С.5-16. 
121.   Петрухина М.И., Русакова Е.В., Ющенко Г.В. Эпидемиологический над-
зор за туберкулёзом в современных условиях// ЖМЭИ. – 2003.-№5.-С.93-96. 
122.  Подзолкова  Г.Г.,  Климова  И.М,  Ефременко  В.И.  и  др.   Применение 
количественной  иммунофлуоресценции  для  определения  адсорбционной 
способности магнитных иммуносорбентов // Журн. микробиол. – 1988. - № 5. – 
С.56-58. 
123.  Подзолкова Г.Г., Климова И.М., Ефременко В.И. и др. Количественный 
иммунофлуоресцентный скрипинг твердофазных носителей различной приро-
ды  как  основа  для  магноиммуносорбентов // ООИ  заболев.:диагност.,  профи-
лакт. и биологич. свойства возбудит: Сборн. научн. работ. – Волгоград, 1989. – 
Вып. 4. – С.63-69. 
124.  Подоляко  М.П.,  Баташев  В.В.,  Уралева  В.С.  и  др.  Иммуноферментный 
метод  обнаружения  бруцеллезных  антител    и    антигена  в  сыворотках  крови 
животноводов  из  неблагополучных  по  бруцеллезу  хозяйств // Журн.  микро-
биол. - 1995. - № 6. - С. 53 – 54. 
125.  Постнова  А.М.,  Пак  В.Н.,  Кольцов  С.И.  Исследование  протонной 
кислотности 
титаносодержащих 
силикагелей, 
полученных 
методом 
молекулярного  наслаивания // Журн.  физ.химии. - 1981. - Т.35, N8. - С.2140-
2142. 
126.  Приказ  № 109. О  совершенствовании  противотуберкулёзных 
мероприятий в Российской федерации. М., 2003. 

 
164
127.  Приказ  № 558. Об  унификации  микробиологических  методов  
исследования при туберкулёзе. М., 1978. 
128.  Пунга В.В., Капков Л.П. Туберкулёз в России // Проблемы туберкулёза-
1999.-№1.- С.14-16. 
129.  Пушкарь  В.Г.,  Климова  И.М.,  Ефременко  В.И.  и  др.  Приготовление  и 
применение магнитных сорбентов  для  изучения  антигенов   микроорганиз-
мов // Метод. рекоменд. - Волгоград, 1984.- 15 с. 
130.  Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н. Иммунофлуоресцентный анализ антиген-
ного материала,  фиксированного  на магнитных полиакриламидных сорбентах 
//Актуальные    вопросы    иммунодиагностики    особо  опасных  инфекций:   
Тез.докл.   Всесоюз.  науч.-практич.   конф.(26-27  мая, 1986). - Ставрополь, 
1986. - Ч.II. - С.50-53. 
131.  Ревенко  Л.Г.,  Ротов  К.А.,  Васильев  В.П.,  Ефременко  В.И.  Иммобилиза-
ция иммуноглобулинов на поверхности липосом методом ковалентного связы-
вания // Сб. научных работ "Особо опасные инфекционные заболевания: диаг-
ностика,  профилактика  и  биологические  свойства  возбудителей. – Волгоград, 
1990. – В. 4. – С. 70-73. 
132.  Рекомендации для национальных программ ВОЗ, 1978; 
133.  Рогожина С.В., Варламов  В.П., Вальковский Д.Г. Получение модифици-
рованных  кремнеземов  для  присоединения  биологически  активных  соедине-
ний // Изв. АН СССР. – 1975. - № 8. –  С.1718-1721.  
134.  Ротов К.А., Климова И.М., Васильев В.П. с соавт. Выявление антигенов 
в применением липосом в радиоиммуноанлизе // Матер. Рос. научн. конф. Тез. 
докл. (Волгоград, 21-22 окт., 1992). – Волгоград. – 1992. – С.168. 
135.  Русакова Е.В., Иваненко Г.П., Иванова И.Н. и др. Состояние и перспек-
тивы борьбы с туберкулёзом //Актуальные вопросы эпидемиологии инфекци-
онных болезней.М.- 2002. – Вып.4.- С.186-190.  
136.  Самсонова  С.А.,  Самсонов  В.В.,  Гудима  М.Ю.  и  др.  Методы  ПЦР  для 
паспортизации  и  классификации  микроорганизмов // Биотехнология- 

 
165
состояние  и  перспективы  развития:  Материалы 1-го  Междунар.  Конгресса.- 
М.,  (14-18 октября) 2002. -  С.176. 
137.  Севастьянова  Э.В.,  Ларионова  Е.Е. //Материалы 9-го  Национального 
конгресса по болезням органов дыхания.- М., 1999.- С.122.  
138.  Скачек Д.В.  Научно-методические основы  стандартизации люминесци-
рующих иммуноглобулинов   для  диагностики  возбудителей особо опасных 
инфекций. - Автореф. дисс. ... канд.мед.наук. - Саратов, 1984. - 173. 
139.  Скуч Д.,  Уэст Д.  Основы аналитической  химии.  -  М: Мир, 1979. - Т.1. 
- С.71-73. 
140.  Смирнов В.В.,  Чаплинский В.Я., Андреева З.М. и др. Научные  основы 
производства  диагностических  препаратов  (Сыворотки  для  идентификации 
энтеробактерий). – Киев: Наукова Думка, 1980. – 195с. 
141.  Стоев  К.Г.,  Чибисова В.А.,  Шаханина К.А. и др. Новый количествен-
ный  иммунофлуоресцентный  метод  определения IgE с  помощью  специфиче-
ского сефарозного иммуносорбента и  люминесцентного микроскопа // Журн. 
иммунология. - М,1981. - N1. - С.85-88. 
142.  Сухоруков  А.М.,  Пономарёва  А.М.  Изучение  сорбционных  свойств  по-
листироловых  планшетов,  используемых  в  иммуноферментном  анализе // 
Журн. микробиол.- 1987.- №9.-С.18-22. 
143.  Сюнамото Дзюндзо, Акиёси Кадзунари, Сато Тосинори. Роль липосом в 
биологических дисциплинах // Biosci. and Ind.-1989. V.47, N 5. – P. 475-485. 
144.  Табаков  П.К,  Чибрикова Е.В.,  Шуркина И.И.  и др. Быстрый способ по-
лучения меченых флуоресцентными красителями  антител // Журн. микробиол. 
- 1962. - Т 10. - С.26-30. 
145.  Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистиче-
ской  обработки  результатов  серологических  реакций // Журн.  микробиол. - 
1969.- №10.-С.26-31. 
146.  Таран И.Ф., Лопаткин О.Н. Итоги изучения и перспективы усовершенст-
вования  диагностических  иммуноглобулиновых  препаратов  в  научно-

 
166
исследовательском  противочумном  институте  Кавказа  и  Закавказья //Особо 
опасные инфекции на Кавказе:  Тез. докл. Y краев. науч.-практич.  конф.,  по-
священ. 50-летию образов. противочум. службы Кавказа (17-19 сентября 1985). 
- Ставрополь, 1985. -В.11. - С.15-21. 
147.  Темишевская  Л.Я.  Использование  техники  иммобилизации  клеток  для 
непрерывного  культивирования  токсинообразующих  анаэробов // Журн.  мик-
робиол.- 1995.- №6. - С.21-22. 
148.  Тишин А.М., Спичкин Ю.И. Пористый магнитный сорбент // БИПМ.-№ 
9. –2004.- С. 643. 
149.  Ткаченко  Е.А.  Применение  твердофазных  иммуносорбентных  методов 
(энзимного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагности-
ки    аренавирусных  инфекций,  крымской  геморрагической    лихорадки  и  ге-
моррагической лихорадки с почечным синдромом //Методические рекоменда-
ции. - М.,1982. - 21 с. 
150.  Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М:Мир, 1983. - С.23. 
151.  Тунгусова О.С., Марьяндышев А.О. Молекулярная генетика микобакте-
рий туберкулёза //Проблемы туберкулёза.-№2.- 2003.- С.43-45. 
152.  Тюменцева    И.С.,  Ефременко    В.И.,  Афанасьев  Е.Н.  и  др.  Индикация 
возбудителей  ООИ  с  помощью  композиционных    магноиммуносорбентов 
//Актуал.  вопр. профилакт. чумы и  др.  инфекц.  заболев: Материалы межгос. 
науч. – практ. конф., посвящ. 100-летию открытия возбуд. чумы.- Деп. в ВИ-
НИТИ 25.01.95 г.- N 221- В 95.-  С. 72-77 
153.  Тюменцева  И.С.  Научно-методические  основы  конструирования  и  усо-
вершенствования  производства  диагностических  тест-систем  для  выявления 
возбудителей  ОО  и  других  инфекций:  Автореф.  дис. … доктор.  мед.  наук. –
Саратов, 1996. –57 с. 
154.  Тюменцева  И.С.,  Жданова  Е.В.,  Афанасьев  Е.Н.  Усовершенствование 
производственной схемы  иммунизации животных моно- и поликомпонентны-

 
167
ми  антигенами    -  Ставрополь, 1994 г. –  15 с. -Деп.  в  ВИНИТИ 04.11.94, № 
2507-В94. 
155.  Умнова  Н.С.,  Павлова  И.П.,  Михеева  Г.В.  и  др.  Приготовление 
иммунопероксидазных  препаратов  для  диагностики  особо  опасных  инфекций 
//  Актуальные  вопросы  иммунодиагностики  особо  опасных  инфекций: 
Тез.докл. Всесоюз.конф. (26-27 мая 1986).- Ставрополь, 1986.- Ч.2.- С. 95-98. 
156.  Фихте Б.А.  Дезинтеграция  микроорганизмов.  Задачи  и перспективы // 
В сб.:  Дезинтеграция микроорганизмов: Матер. Всесоюзн. конф.  по дезинте-
грации микроорганизмов (25-27 окт., 1972 г.) - Пущино-на-Оке, 1972. - С.5-14. 
157.  Фрайфелдер Д.  Физическая биохимия. - М:  Мир,  1980. - С.73. 
158.  Фримель Г. Иммунологические иетоды. М., 1987.-С.110-112.  
159.  Фролова О.П.Проблемы туберкулёза у больных ВИЧ-инфекцией // Про-
блемы туберкулёза и болезней лёгких.- 2003. - №8. - С. 58.  
160.  Фролова  Ф.Н.,  Кулаков  И.М.,  Зайнутдинова  Н.Г.,  Фатыхова  Р.Х.  О 
заболеваемости  туберкулёзом  в  г.  Казань//  Актуальные  вопросы  эпидемиоло-
гии инфекционных болезней.М.- 2002. – Вып.5.- С.144-146.  
161.  Хмельницкий Р.А. Физическая и коллоидная химия. Изд. Высшая школа. 
– М., 1988. - С. 342-343. 
162.  Ходж  Ф.  Органические  реакции  с  использованием  реагентов  или 
субстратов, 
ковалентно 
закрепленных 
на 
функционализированных 
неорганических носителях // Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева. - 
1989. - Т.34, N3. - С.331-339. 
163.  Хоменко  А.Г.,  Авербах  М.М.,  Романова  Р.Ю.,  Горина  Л.Г.,  Литвинов 
В.И. Способ определения микобактерий туберкулёза в крови  больных тубер-
кулёзом. А. с. № 1123128. Бюл.№3 от 23.01.92.  
164.  Хоменко  В.А.,  Александров  М.Т.,  Брагина  М.Н.,  Смирнова  В.В.,  Лизу-
нова И.А. Применение метода ЛФД для диагностики и оценки  эффективности  
лечения    внелёгочного  туберкулёза/  Клиническая  лабораторная  диагностика.- 
9.- 2004.- С. 37. 

 
168
165.  Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С. Адсорбция белков и ДНК 
на  дегидроксилированных  и  алюминированных  силохромах//  Прикладная 
биохимия и микробиология.- М., Наука. 1991. – Т. 27, №5. - С. 720-724. 
166.  Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. - 
Л., 1991. - 239 с. 
167.  Черноусова Л.Н., Ларионова Е.Е., Денисова Т.С. и др. Генодиагностика в 
современной  медицине//  Материалы  Всероссийской  науч.-практ.  конферен-
ции.- М.2000.- С.291-292. 
168.  Чибисова В.А.  Приготовление и стандартизация люминесцирующих сы-
вороток для непрямого метода  иммунофлуоресценции: Автореф. дисс. ... канд. 
мед наук. - М., 1975. - 25 с. 
169.  Чутаев  Ю.П.,  Падерин  В.Ф.,  Теряева  М.В.  Диагностические  возможно-
сти метода внутрикожного введения денатурированного гамма-глобулина при 
кониотуберкулёзе  внутригрудных  лимфатических  узлов//  Проблемы  туберку-
лёза.- 1996. - №4. - С. 16-17. 
170.  Шаханина    К.Л.  Иммуносорбенты    и  их  использование  для  выделения 
чистых антител // Биохим.  и биофиз. микроорганизмов. -1981. - В.9. - С.15-23. 
171.  Шаханина    К.Л.  Приготовление    люминесцирующих  антител. -В  кн.:  
Иммунофлуоресценция в медицине. - М.:Медицина, 1977. -С.23-46. 
172.  Шаханина К.Л.,  Манько  М.И. Избирательное концентрирование бакте-
рий и риккетсий при помощи поликонденсационных иммуносорбентов //Журн. 
микробиол.  - 1969. - N9 -С.140-144. 
173.  Шаханина К.Л.,  Походзей И.В. Приготовление сефарозных пневмокок-
ковых диагностикумов и их использование в  клинике  легочных заболеваний 
// Журн. микробиол. - 1978. - N3. - С.75-79. 
174.  Шаханина  К.Л.,  Соколенко  А.А.,  Павлова  И.П.  Выбор  критериев  при-
годности твёрдофазных носителей на основе полистирола для проведения им-
муноферментного анализа // Журн. микробиол.  - 1987. - N9 -С.86-89. 

 
169
175.  Шевченко  Ю.Л.  Приказ  № 109 от 21.03.2003. О  совершенствовании 
противотуберкулёзных мероприятий в РФ // Проблемы туберкулёза и болезней 
лёгких.- 2003. - №11. - С. 57.  
176.  Шешуков  П.Ф.,  Готовский  Ю.В.Некоторые  аспекты  современной  диаг-
ностики  туберкулёза // Материалы 8-й  международной  конференции  «Теоре-
тические  и  клинические    аспекты  применения  биорезонансной  и  мультирезо-
нансной терапии».М., 2002.- Ч.1.-С.167-169. 
177.  Щедрин В.И., Сбойчинов В.Б., Волков В.И. Сравнительная оценка двух 
иммуноферментных тест-систем для серодиагностики сифилиса // Актуальные 
вопросы  дерматологии:  Сб.тез.докл.науч.-практ.конф.,  посвящ. 125-летию 
созд.кож. и вен. болезней.- С-Пб., 1994.- С.81-82. 
178.  Яковлев    А.Т.  ИФА  в  лабораторной  диагностике  бактериальных  особо 
опасных инфекций: Автореф. дисс. ... доктора мед. наук.- Саратов, 1992.-  43 с. 
179.  Anaokar S., Garry P.J., Standefer J.C. Solid-phase enzyme immunoassay for 
serum ferritin //Clin.Chem.- 1979. - V.25. - P. 1426-1431. 
180.  Ansari A.A. et. al., Purification antigemoglobin antibody using cross-einked 
immunoadsorbent //S. immunol. Methods. -1981. - V. 42. - N 1,  P. 45-51. 
181.  Ashford DA, Whitney E, Raghunathan P, Cosivi O. Epidemiology of selected 
mycobacteria that infect humans and other animals. Rev Sci  Tech 2001; 20: 325-37. 
182.  Badak FZ, Goksel S, Sertoz B, Ermertcan S, Cavusoglu C, Bilgic A. Use of 
nucleic acid probes for identification Mycobacterium tuberculosis directly from 
MB/BacT bottles. J Clin Microbiol 1999; 37: 1602-5. 
183.  Beuntner E.H.,  et al.  A reveas immunodiffusion assay for  antibody protein 
concentration in antisera or conjugates to human IgG //Standartization  in  
immunofluorescence.  -  Oxford. Blackwell Scientific Publ, 1970. - Pat.2. - P.165-
169. 
184.  Bricker B.J., Ewalt D.R., MacMillan A.P. et al. Molecular Characterization of 
Brucella Strains Isolated from Marine Mammals //J. Clin Microbiol.- 2000.- 
Vol.38(3).- P.1258-1262. 

 
170
185.  Burt F.J., Leman P.A., Smith J.F., Swanepoel R. The use of a reverse tran-
scription – polymerase chain reaction for the detection of viral nucleic acid in the di-
agnosis of Crimean – Congo hemorrhagic fever //J.Virol. Methods. – 1998. – 
Vol.70, N2. – P. 129-137. 
186.  Bushway R.J., Perkins L.B., Hurst H.L., Ferguson B.S. //Food chemistry.- 
1992. - V.43. - P. 283. 
187.   Butler WR, Jost KC, Kilburn JO. Identification of mycobacteria by high-
performance liquid chromatography. J Clin Microbiol 1991; 29:      2468-72. 
188.  Butler WR, O`Connor SP, Yakrus MA, Gross WM. Cross-reactivity of 
genetic probe for detection of Mycobacterium tuberculosis with newly described 
species Mycobacterium celatum. J Clin Microbiol 1994; 32: 536-8. 
189.  Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E. Magnetic enzyme-linked 
immunosorbent assay (Melisa) for determination of specific IgG in 
paracoccidiodomycosis //Sabouraudia.- 1984. - V.22, N 4. - P.291-299 
190.  Chim C., Wold F. The preparation of matrix - bound proteases and their use in 
the hydrolisis of  proteins //  Anal.Biochem. - 1974. - V. 61., N 2. - P. 379-391. 
191.  Choleragen – mediated release of trapped glucose from liposomes containing 
ganglioside Gm1 /Moss J., Fishman P.H.,Richards R.L. et al. //Proc.Nat. Acad. Sci 
USA. – 1976. – V.73, № 10. – P.3480-3483. 
192.  Chua M.-M., Fan S.-T., Karush F. Attachment of immunoglobulin to 
liposomal membrane via protein carbohydrate //Biochim. et biophys. аcta: Gen. 
Subj. – 1984. - № 3. – P.291-300. 
193.  Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-
linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. – 1977. 
– V.36, №3. – P.475-483. 
194.  Coons A.H.,  Greech H.G.,  Gones A.N. et al. The demonstration  of 
pneumococcal antigens in tissue for the use of fluorescent antibody // J.Immunol.-
1942.-V. 45, N 3.- P. 159-170 

 
171
195.  Coons A.H., Kaplan M.H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. 
Med. – 1950. – V.91, N 1. – P.81-89. 
196.  Cunliffe D, Smart C.A., Tsibouklis J. et al. Bacterial adsorption to termore-
sponsive polimer surfaces // Biotechnol. Lett.- 2000.-22. N 2.-Р.141-145 
197.  Dankner WM, Davis CE. Mycobacterium bovis as a significant cause of 
tuberculosis in children residing along the United States-Mexico border in the Baja 
California region. Pediatrics 2000; 105: E79. 
198.  Dankner WM, Waecker NJ, Essey ME, Moser K, Thompson M, Davis CE. 
Mycobacterium bovis infection in San Diego: a clinicoepidemiologic stady of 73 pa-
tients and a historical review of a forgotten pathogen. Medicine (Baltimore) 1993; 
72: 11-37. 
199.  Deng Shaoli, Yang Yuan.  Zhongguo xiandai yixue zazhi. // J. Mod. Med. 
China – 2002. – 12.№18. – C. 37-41. 
200.  Dolin PJ, Raviglione MC, Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortal-
ity during 1990-2000. Bull WHO 1994; 72:213-20. 
201.  Drosten C., Gottig S., Schilling S. et al. Rapid detection and quantification of 
RNA of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Cremean-Congo hemorrhagic fever 
virus, Rift Valey fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time re-
verst transcription- PCR //J.Clin. Microbiol.-2002.-Vol.40,N7.-P.517-523. 
202.   Duffey PS, Guthertz LS, Evans GC. Improved rapid identification of  
mycobacteria by combinding solid-phase extraction with high-performance liquid 
chromatography analysis of BACTEC cultures. J Clin Microbiol 1996; 34: 1939-43. 
203.  Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). 
Quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry. - 1971. - V.8., N 9. - 
P. 871-879. 
204.  Eremenko E.I., Buravtseva N.P., Tsygancova O.I. et al. Scheme for solation 
and identification of Bacilus anthracis // Proceds of the Ist European Conference on 
Dangerous Pathogeus. - Wiuchester (England), 1999. – P.43.  

 
172
205.  Ficapal A, Alonso-Urmeneta B, Velasco J. et al. Diagnosis of Brucella ovis 
infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate //Vet. Rec. – 1995. – 
V. 5137, N 6. – P. 145-147.  
206.  Flechtner M.D., Bieniaz C., Shipchandier M., Adamczyk  M.  Fluorophores 
for encapsulation into liposomes: Pat. N  4912208, USA, 1990. 
207.  Ford EG, Snead SJ, Todd J, Warren NG. Strains of Mycobacterium terrae 
complex which react with DNA probes for M. tuberculosis complex. J Clin 
Microbiol 1993; 31: 2805-6. 
208.  Frieden Thomas R., Driver Cynthin R. Tuberculosis control: Past 10 years and 
future progress // Tuberculosis – 2003.-№1-3.- С.82-85. 
209.  Gall D., Nielsen K., Forbes L. et al. Alidation of the fluorescence polarization 
assay and comparison to other serological assays for the detection of serum 
antibodies to Brucella abortus in bison // J. Wildl. Dis. – 2000. – Vol.36(3). – P.76- 
469. 
210.  Gangadharam PRJ, Droubi AJ. Identification of mycobacteria by smear 
examination of the culture. Tubercle 1981; 62: 123-7. 
        Ged. – 1949. – V.261, N 14. – P.1-9. 
211.  Goto M, Oka S, Okuzumi K, Kimur S, Shimada K. Evaluation of acridinium-
ester labeled DNA probes for identification of Mycobacterium tuberculosis and 
Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex in culture. J Clin 
Microbiol 1991; 29: 2473-6. 
212.  Greenlee M.T., Farrar .J.A., Hird D.W. et al. Comparison of particle 
concentration fluorescence immunoassay to card and complement fixation tests 
using isolation of Brucella abortus as the standard // J. Vet. Diagn. Invest. – 1994. – 
V. 6 (2). – P.182-187.  
213.  Guesdon J.L., Avrameas S. Solid-phase enzyme immunoassay //Appl. Bio-
chem. and Bioeng. - 1981. - V. 3. - P.207-232. 
214.  Harding  N.  Laboratory  equipment   digest   // J.immunol. Meth.  -  1982.  -  
V.20,-  N 4.- P. 89-93. 

 
173
215.  Heifets LB, Jenkins PA. Specication of mycobacteria in clinical laboratories. 
In: Gangadharam PRJ, Jenkins PA, editors. Mycobacteria I basic aspects. USA: 
Chapman&Hall; 1998 p 308-50. 
216.  Hornung M., Ludwic M, Schmauder H.P. A New Technology for an opti-
mised supply of emerged microbial cultures // 1-st International congress. Biotech-
nology- state of the art and prospects of development/ Russia. Moscow, (14-18 
октября) 2002. - С.202. 
217.  Interaction between glycophorin and ganglioside Gm1 on liposomal 
membranes. Effect of the interaction on the susceptibility of membranes to HVI 
/Umeda M., Kanda S., Nojina S. et al. //J. Biochem. – 1984. – V. 96, № 1. – P.229-
236. 
218.  Jakubowiak W, Komourzaeyev B, Dara M, Punga V, Ausheva E, Testov 
VWHO TB Control Programme in North Caucasus, a model for TB control in con-
flict zones // 34TH World Conference on Lung Health of the International Union 
Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Atlanta,  GA, USA.-V. 7, № 11, 
2003.- Р. 290. 
219.  Kato K., Hamguchi Y., Fukui H. et al.  Enzyme-linked immunoassay. Novel 
method for synthesis of the insulin – D - galactosidase conjugate and its applicability 
for  insulin assay  // J.Biochem.- 1975. - V. 78. - P. 235-237. 
220.  Kent PT, Kubica GP, editors. Public health mycobacteriology, a   guide book 
for the level III laboratory. Center for disease control.    Atlanta, Geogia, 1985; 71- 
221.  Kent PT, Kubica GP, editors. Public health mycobacteriology, a  guide book 
for the level III laboratory. Center for disease control.  Atlanta, Geogia, 1985; 71-
125. 
222.  Kluge H, Jakubowiak W, Pashkevich D, Danilova I, Ruybka L, Dara M, 
Lebrun L, Espinasse F, Povenda J, Vincent V. Evaluation of nonradioactive DNA 
probes for identification of mycobacteria. J Clin Microbiol 1992; 30: 2476-8. 
223.  Kriz K., Gerhrke J., Kriz D. Advancementstoward magneto immunoassays. 
Biosens Biolectron. – 1998. - V. 13 (7-8). -Р.817-823. 

 
174
224.  Lachman P.J.  The production of antibodies specific to nunor 
immunoglobulins by the immunization  of  rabbit  paralysed with IgG // In.  
Standartization in immunofluorescence. - Oxford,1970. - P. 225-234. 
225.  Laser-light seattering studies on mixed phosphatidylcholine + GM1 
ganglioside monolamellar vesicles /Masserini M., Sonnino S., Giuliani A., 
Tettamanti G. et al. //Ital. J. Biochem. – 1984. – V. 33, № 3. – P.179-181. 
226.  Lea T., Vartdal F., Davies C., Ugelstad J. Magnetic monosired polymer pasti-
cles for fast and specific fractionation of human mononuclear cells //Scand. J. 
Immunol. - 1985. - V.22 , № 2. - P.207-216. 
227.  Leserman L.D., Aranol D., Barbet J. Et al. Antibody-bearing liposomes as 
probes of receptor-mediated endocytosis // Receptor-Mediated Target. Drugs. Proc. 
NATO Adv. Studi Inst., Cape Sounion, June 1, 1983. – New York; London, 1984. P. 
393-405. 
228.  Liposomes // Appl. Genet. News. – 1988. – V.8, N10. P.14-15. 
229.  Liposomes and immunology / Eds. B.N.Tom, H.P. Six Elsevier. – 1980. – P. 
345. 
230.  Lowe C.R., Dean D.G. Affinity Chromatography. London- New-York-
Toronto: Wiley- Intersci. Publ., 1974. - Р.135. 
231.  Marshall K., Ridgewee N, Simpson J. The acidity of surface groups of silicf // 
Chem. And Ind. 1974. - V. 19. - Р.775-776. 
232.  Maruyama S., Boonmar S., Morita Y. Seroprevalence of Bartonella henselae 
and Toxoplasma gondii amond healthy individuals in Thailand // J. Vet.Med.Ski.-
2000.-Vol 62, N 6.- P.635-637.  
233.  McDougall I.R., Dunnick J.K., McNamee M.G., Kriss J.P. Distribution and 
fate synthetic vesicles in the mouse. A combined radionuclide and spin label study // 
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1974, V.71. – P.3487-3491. 
234.  Miranda A .G.  Crisis-driven migrants and the tuberculosis experience // 34TH 
World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis 
and Lung Disease (IUATLD), Atlanta,  GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.- Р. 113. 

 
175
235.  Molday R.S.,  Jen S.P.S.,  Rembaum A.  Application  of magnetic 
microspheres in labelind and separation of cells // Nature. - 1977. - V.268. - P.437-
438. 
236.  Murray CJL, Styblo K, Rouillon A. Tuberculosis in the developing countries: 
burden, invention and cost. Tuber Lung Dis 1990; 65: 6-24. 
237.  Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody-a new method  of 
conjugation // J.Histochem. Cytochem. -1974.- V. 22, N 4. - P. 506-508; 1084-1091. 
238.  Nielsen K., Lin M., Gall D. et al. Fluorescence Polarization Immunoassay: 
Detection of Antibody to Brucella abortus // Methods. – 2000.- Vol. 22(1). P- 71-76.  
239.  Nikolayeva O,  Shpak O. Diagnosis of mediastinal lymph node tuberculosis // 
34TH World onference on Lung Health of the International Union Against 
Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Atlanta,  GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.- 
Р. 314. 
240.  O`Reilly LM, Daborn CJ. The epidemiology of Mycobacterium bovis 
infections in animals and man: a review. Tubercle Lung Dis 1995; 76: 1. 
241.  O'Berry P.A.  A comprasion of 3 methods of serum fractionation in the 
preparation of vibrio fetus fluorescent antibody conjugates // J. Vet. Res. - 1964. - 
V.25. - P.1669-1672. 
242.  O'Sullivan M.J., Marks V. Method of preparation of enzymatibody conjugates 
for use in enzyme immunoassay // Meth.  In Enzymol.- New.York, 1981. - V. 73. - 
P.147- 166. 
243.  Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gel. // Arkiv for Kemi. Mineral.  
244.  Polson A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures 
by linear polymers of  higth molecular weigh // Biochem. Biophis. Acta. – 1964. – 
V.82. – P.463-475. 
245.  Portaels  F. Epidemiology of non-tuberculosis Mycobacteria// 34TH World 
Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and 
Lung Disease (IUATLD), Atlanta,  GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.- Р. 123. 

 
176
246.  Rakisheva A, Erkenova G, Kassenova L. TB prevention among adolescents 
held in prison conditions // 34TH World onference on Lung Health of the 
International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), Atlanta,  
GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.- Р.309. 
247.  Ramadass P., Samuel B.,Nachimuthu K. A rapid latex agglutination test for 
detection of leprospiral antibodis // Vet.Microbiol.1999.-V. 70, N 1-2.- P.137-139. 
248.  Recommendations of the Russian Ministry of Health to expand the World 
Health Organization (WHO) TB control strategy in the Russian Federation based on 
the experience gained from the TB pilot project implementation // 34TH World 
onference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung 
Disease (IUATLD), Atlanta,  GA, USA.-V. 7, № 11, 2003.- Р. 29 
249.  Richardson J., Hill A., Luxton R et al. A novel measuring system for the de-
termination of paramagnttic particles labels for use in magetj-immunossays. Biosens 
Bioelectron.- 2001. - V.16. – Р. 1127.  
250.  Rowe D.S. Production of specific antisera // In.: Standartization in 
immunofluorescebce. - Oxford, 1970. - P.27-38. 
251.  Ruiz- Bravo A., Jimemez- Valera M. Perspectivas de la microbiologia: El 
fufuro immediato //Ars pharm. – 1996. – V. 37. - N 2. – P.171-181. 
252.  Small P., van Embden J.D.A.//Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and 
Control / Ed. B.R.Bloom.- Washington. 1994.- P. 569-581; 
253.  Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to modern liguid chromatography. 
N.Y.- Wiley, 1979. -  863 p. 
254.  Somoskövi A, Hotaling JE, Fitzgerrald M, Jonas V, Stasik D, Parsons LM, 
Salfinger M. False-positive results for Mycobacterium celatum with the AccuProbe 
Mycobacterium tuberculosis complex assay. J Clin Microbiol 2000; 38: 2743-5. 
255.  Steibuch G., Andran R. The isolation of IgG from imanalion serra with the 
acid of caprilic // Arch. Of Biochem. Stray and Biophys. – 1969. – V.139. – P. 279-
284. 

 
177
256.  Sting R., Ortmann G. Erfahrungen mit einfachen ELISA-Testsystemes fur die 
Brucellose – Serologie bei Rind, Schaf und Ziege //Berlin. Und munch. Wo-
chenschr.- 2000. – Vol.113.- N 1. – P. 22-28. 
257.  Stortz H. (Шторц  Х.)  Иммунофлуоресценция //Иммунологические  мето-
ды. – М.: Медицина, 1987. – С.128-148. 
258.  Sudre P, Ten Dam HG, Kochi A. Tuberculosis: a global overviev of the situa-
tion today. Bull WHO 1992; 70: 149-59. 
259.  Sunamoto J. Funtionalized liposomes as biocompatible materials // Abstr. 
Pap: 194 th ACS Nat. Meet. (Amer. Chem. Soc.), New Orleans, La, Aug. 30. – Sept. 
4, 1987. – Washington, D.C., 1987. – P.301. 
260.  Surkova L K, Dyusmikeeva M I., Zalutskaya A M. Гистобактериологиче-
ские особенности ТБ легких в случаях неэффективности лечения // 34TH World 
Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and 
Lung Disease (IUATLD).-2003.- V. 7. - № 11.-С.312 
261.  Tan W, Xia N, Cong Y. // Zhonghun Shi Yan  He Lin Chuang Bing Du Xue 
Zazhi. –1998.-Vol.12, №2.-Р.176-178 
262.  Tanaka T., Matsunaga T. Detection of HbA (Ic) by boronate affinity 
immunoassay using bacterial magnetic particles // Biosens Bioelectron.- 2001. – Р. 
1089. 
263.  Taylor D. The thermal expansion behaviour of the framework silicates // 
Mineral.Mag. – 1972. - V.38, N297. – Р.593-604. 
264.  Tcherneva E., Rijpens N., Jersek B. et al. Differentiation of Brucella species 
by random amplified polymorphic DNA analysis //J.- Appl. – Microbiol. – 2000. – 
Vol. 88 (1).- P. 69-80. 
265.  Thibert L, Lapierre S. Routine application of high-performance liquid 
chromatography for identification of mycobacteria. J Clin Microbiol 1993; 31: 1759-
63. 
266.  Turkova J. Leakage of the coupled affinant // J. Chromatogr. – 1978. - V. 12. - 
Р.189. 

 
178
267.  Van Weemen B.K., Schuurs A.N.W.M. immunoassays using hapten- enzyme 
conjugates // FEBS Lett.-1972.-Vol 24,N1.-P. 77-81. 
268.  Waddell RD, Lishimpi K, von Reyn CF, Chintu C, Baboo KS, Kreiswirth B, 
Talbot EA, Karagas MR. Bacteremia due to Mycobacterium tuberculosis or M. bo-
vis, Bacille Calmette-Guerin (BCG) among HIV-positive children and adults in 
Zambia. AIDS 2001; 15: 55-60. 
269.  Weetall H.H., Detor C.C. Covalent attachmend of proteins to inorganik 
supports directional  activation cyanogen bromide  // J. Biotechnol. and Biogen. - 
1975. - V.17. - P.295-297. 
270.  Weimer B.C., Walsh M.K., Beer C. et al. // Appl. And Environ. Microbiol. – 
2001. - №3. – Р. 1300-1307.  
271.  Weller T.H., Coons A.H. Fluorescent antibody studies with agents of varicella 
and herpes zoster propagated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. – 1954. – V.86. – 
P.789-794. 
272.  Weston P.D., Devries G.A., Wriggleworth R.. Conjugation of enzyme to 
immunoglobulins using dimallimids //J. Bioch. Biophys. Acta. - 1980. - V. 612. - 
P.40-49. 
273.  WHO Fact Sheet / Tuberculogia // №104.- April, 2000. 
274.  WHO Geneva/ IUATL Paris. Guidelines for Surveilance of Drug Resistance 
in Tuberculosis // Int/ J. Tuberc. Lung Dis.- 1998.- Vol.-2.- P. 72-89.  
275. Yu B.S., Chol Y.K., Chung H. Development of immunoassay methods by use 
of liposomes //Biotechnol. Appl. Biochem. – 1987. – V.9, № 3. – P.209-216. 
276. Yu H.  Comparative studies of magnetic particle-based solid phase fluorogenic 
and electrochemiluminescent immunoassay // J. Immunol. Methods.- 1998.- V.218 
(1-2).- P.1-8. 
277.  Zerbini E, Cardoso MM, Sequeira MD, Santi MN, Taher H, Larpin D, Latini 
O, Tonarelli G. Utility of gas chromatography for the identification of mycobacterial 
species. Medicina (B Aires) 1999; 59: 453-8. 
 


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

60083. Как празднуют Новый год во всем мире? 54 KB
  Новый год 2.До начала правления Юлия Цезаря новый год в Риме начинался 1 марта. В Индонезии тоже 2 празднования Нового года: один 1 января другой исламский новый год дата которого меняется из года в год.
60084. Позакласний захід з української літератури 63 KB
  Мета: перевірити опанування навчального м матеріалу; розвивати логічне мислення та усне мовлення; прищеплювати любов до української літератури. м любіть Україну свою і вічні ми будемо з нею...
60086. Сценарій позакласного заходу (гра «Who is the best at English?») 39.5 KB
  Good morning, my dear friends. I am glad to see you here today. I know that all of you are very hardworking, smart and clever pupils, who are fond of English. Today we shall have an interesting quiz and see who is the best at English.
60087. Свято Стрітення 61 KB
  Саме тому з лютим міцно повязані і природні передбачення погоди якими будуть весна і літо чи щедрим буде врожай. Ведучий Звернення до народних прикмет у лютому явище закономірне адже не за горами веснакрасна.
60088. Позакласний захід: Презентація Марійської дружини 84.5 KB
  Мета. Навчати жити за Божими Законами,прославляти Марію та служити її. Підвищувати духовний рівень та формувати потребу ведення здорового способу життя. Виховувати любов до Пречистої Діви Марії, милосердя до ближнього.
60089. Ми створені на добрі діла 52.5 KB
  Ведучий: Ольга Хто вона Якого родуплемені Чи знатного боярського чи дочка перевізника що волею долі стає київською княгинею Може саме так в переддень Купала Ольга познайомилася із князем Ігорем який був в її місцевості на мисливських ловах.
60090. Сценарий литературного праздника по творчеству С. Я. Маршака 97.5 KB
  Цель: в игровой форме вспомнить и повторить произведения С.Я. Маршака; пробудить интерес к его творчеству; учить воспринимать содержание произведений; прививать интерес к чтению книг; развивать воображение...
60091. Срібна ниточка поміж берегами 77.5 KB
  В народі говорять: Яка мама така і доня. Отже доня це маленька мама яка запам’ятовує всі накази дорослої мами. Під ясними вітрилами любові і добра У подорож далеку запрошую вас я На океанських крилах донести хочем ми Одвічну шану матері заступниці рідні...