20829

Анализ изменения экспрессии гена комплексина-2 (Cplx2), вызванных ишемией головного мозга, а также введением регуляторных пептидов семакс и PGP

Дипломная

Медицина и ветеринария

Ключевым механизмом ишемического повреждения является процесс глутамат-кальциевого каскада, когда под влиянием гипоксии усиливаются процессы анаэробного гликолиза, внутриклеточная среда закисляется и нарушается активный ионный транспорт, что приводит к массивному высвобождению возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата, в том числе в составе синаптических везикул.

Русский

2014-11-30

1.07 MB

64 чел.

Введение

Одной из задач медицины и физиологии является исследование возможности целенаправленного влияния на физиологические и биохимические процессы в клетках и тканях при возникновении патологий. Для этого необходимо понимать особенности функционирования генетического аппарата в разных условиях и при разных воздействиях. Ишемический инсульт является повреждающим фактором, заметно нарушающим функционирование мозга и существенно влияющим на экспрессию генов в головном мозге. Нарушения при ишемическом инсульте провоцируются резким ухудшением мозгового кровотока, влекущим за собой кислородную и глюкозную недостаточность, нарушение протекания окислительно-восстановительных процессов в клетке, падение уровня АТФ, нарушение функционирования ионных каналов, изменение внутриклеточной среды, в конечном итоге – гибель нейронов. Почти в половине зарегистрированных случаев ишемический инсульт заканчивается летальным исходом, а из выживших пациентов большинство остаётся инвалидами. Поэтому поиск новых подходов для лечения ишемического инсульта является актуальной научной и медицинской проблемой.

Ключевым механизмом ишемического повреждения является процесс глутамат-кальциевого каскада, когда под влиянием гипоксии усиливаются процессы анаэробного гликолиза, внутриклеточная среда закисляется и нарушается активный ионный транспорт, что приводит к массивному высвобождению возбуждающих аминокислот глутамата и аспартата, в том числе в составе синаптических везикул.

К числу цитозольных белков, специфичных для нервной ткани и регулирующих процесс экзоцитоза, относятся комплексины. Анализ экспрессии генов комплексинов может помочь уточнить их роль в развёртывании глутаматной эксайтотоксичности.

В настоящее время для лечения ишемического инсульта широко используется нейропротекторный препарат семакс, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН. Семакс – синтетический гептапептид (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин). N-конец данного гептапептида содержит фрагмент адренокортикотропного гормона (АКТГ 4-7), а С-конец – трипептид пролил-глицил-пролин (PGP), который препятствует взаимодействию молекулы семакса с эндогенными эндопептидазами. Имеются научные данные о том, что PGP обладает также самостоятельным регуляторным действием. Исследование свойств семакса при церебральной ишемии у крыс, а также исследование эффектов препарата на клеточных культурах in vitro показывают, что применение семакса уменьшает степень выраженности патологии. Однако до конца молекулярный механизм действия этого нейропептида не ясен. Изучение экспрессии генов в условиях экспериментальной ишемии мозга и введения препарата семакс позволяет не только уточнить детали патологического процесса, но и оценить эффективность терапевтических процедур.
Целью данной работы является анализ изменения экспрессии гена комплексина-2 (
Cplx2), вызванных ишемией головного мозга, а также введением регуляторных пептидов семакс и PGP. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать качество препаратов тотальной РНК, выделенных из  мозга экспериментальных животных, ситезировать на их основе препараты кДНК.

2. При помощи метода ОТ-ПЦР оценить изменение относительного содержания альтернативных транскриптов гена Cplx2 в лобных долях коры и в подкорковых структурах головного мозга крыс в результате действия фокальной ишемии, а также введения препаратов семакс и PGP

   Глава 1. Обзор литературы

        1.1.1. Регуляция экспрессии генов

     1.1.1.1. Экспрессия генов и её особенности

Экспрессия генов – биологический процесс, в ходе которого наследственная информация, содержащаяся в ДНК, реализуется в виде функционального продукта – РНК или белка. РНК образуется в результате транскрипции ДНК и в большинстве случаев является конечным функциональным продуктом: рибосомные, транспортные, микроРНК, малые ядерные РНК (мяРНК), малые интерферирующие РНК и другие, которые можно условно объединить под именем некодирующих РНК. Кодирующие (матричные, информационные) РНК служат матрицей для синтеза полипептидной цепи в ходе трансляции.

Экспрессия генов не ограничивается этапами транскрипции и трансляции. Процесс преобразования наследственной информации в конечный продукт включает также посттранскрипционные изменения, а в том случае, если конечным продуктом является белок, нередко также посттрансляционые изменения. В результате этих процессов происходят структурные преобразования РНК (посттранскрипционные изменения) или белка (посттрансляционные изменения), необходимые для адекватного осуществления их функций.

Посттранскрипционные изменения РНК включают в себя альтернативный сплайсинг, удаление интронов, кэпирование мРНК, добавление поли-А конца к ней же, транспортировку РНК в соответствующий компартмент клетки, посттрансляционную деградацию.

Посстрансляционные модификации – это ковалентные модификации белка после завершение синтеза полипептидной цепи. К посттрансляционным изменениям относятся гликозилирование, алкилирование и N-ацилирование, фосфорилирование и др., также ограниченный протеолиз, который происходит при созревании молекулы инсулина [1]. Образование дисульфидных мостиков внутри или между полипептидными цепями тоже относится к посттрансляционным модификациям. Модификации, вероятно, подвергается большинство белков [2], причём один и тот же белок, по всей видимости, может подвергаться разным типам модификации, что влияет на его функции. Существуют заболевания, причиной которых являются нарушения системы посттрансляционной модификации различных белков.

Посттранскрипционные (альтернативный сплайсинг) и посттрансляционные модификации обеспечивают огромное разнообразие белков в пределах клетки, ткани или организма.

Кроме того, сама доступность определённого участка ДНК для транскрипции зависит от множества факторов, таких как: нуклеотидная последовательность участка, распределение метилированных участков, взаимодействие с факторами транскрипции и другими белками, связанными с транскрипционной активностью, а также модификация гистонов (степепь их модификации:  моно-, ди-, триметилирование и др. [3]) и других белковых комплексов, ассоциированных с ДНК [4]. Вообще состояние хроматина весьма лабильно, а изменение его конфигурации влияет  на взаимодействие транскрипционных факторов и активных элементов генома.

В ходе клеточной дифференциации (от тотипотентных к специализированным клеткам) большая часть генома репрессируется. В работе Guelen и соавторов [5] было прослежено взаимодействие между хроматином и беками ядерной мембраны в фибробластах человека, определяющее редуцирование экспрессии значительной области генома. Также была показана роль химической модификации гистонов (в частности ацетилирования) в регуляции состояния хроматина на том или ином этапе клеточного цикла [6].

                 1.1.1.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции

Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции осуществляется с помощью сигнальных последовательностей молекул ДНК и белковых комплексов, в частности транскрипционных факторов. Для разных генов системы контроля экспрессии выглядят по-разному, - с этой точки зрения существуют индуцибельные гены, экспрессирующиеся в ответ на определённые стимулы и преимущественно в определённых типах клеток, и гены «домашнего хозяйства», экспрессирующиеся практически постоянно и в разных типах тканей (например, гены рибосомальных белков; ферментов, участвующих в окислительно-восстановительных процессах и т.п.). Для первых контроль экспрессии выглядит более сложно.

Транскрипция генов эукариот осуществляется тремя РНК-полимеразами, причём промоторы для каждой из них характеризуются различными регуляторными последовательностями нуклеотидов, с которыми взаимодействуют различные факторы транскрипции, влияющие на уровень транскрипции соответствующих генов [7]. Факторы транскрипции у эукариот обладают консервативными доменами, обеспечивающими высокоспецифичные взаимодействия видов «белок – белок» и «белок – нуклеиновая кислота» [8].  При этом может происходить как активация транскрипции (в таком случае факторы называют активаторами, а осуществляемую ими регуляцию - позитивной), так и блокада считывания РНК-полимеразами генетической информации, например, путём создания стерических препятствий для взаимодействия активаторов транскрипции и регуляторных последовательностей ДНК (негативная регуляция). Факторы транскрипции в клетке объединяются вместе с другими регуляторными белками в регуляторные комплексы. Возможны разные сочетания белковых факторов, что придаёт каждому из образующихся функциональных  комплексов уникальные свойства путём изменения специфичности взаимодействия комплекса с регуляторными последовательностями ДНК [9].

Эукариоты способны использовать для регуляции транскрипции изменение структуры хроматина. Это играет существенную роль в процессах дифференцировки клеток и поддержании их функционирования. При этом могут осуществляться как репрессия, так и дерепрессия отдельных генов, их массивов и даже целых хромосом [10], например, дезактивация X-хромосомы и образование тельца Барра.

1.1.1.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов

Посттранскрипционная регуляция осуществляется на уровне мРНК в период после окончания их синтеза и до начала трансляции. Этот этап можно разделить на несколько подэтапов или разновидностей:

- модификации предшественников зрелой мРНК (альтернативный сплайсинг, кэпирование, присоедиение поли-А-конца);

- транспорт и депонирование зрелой мРНК;

- РНК-сайленсинг;

- деградация мРНК.

Эти процессы переходят друг в друга, между ними нет чёткой границы, и кроме того, они зачастую скоординированы и с вышестоящими механизмами контроля над экспрессией.  К примеру, у дрожжей наблюдается определённая корреляция процессов транскрипции, модификации гистонов и РНК-интерференции, в результате чего происходит инактивация генной экспрессии [11]. Инициация сайленсинга с помощью метилирования ДНК зависит от соотношения микро-РНК и её мишени [12].

Актуально на данный момент изучение РНК-интерференции, отвечающей за процессы сайленсинга, деградации мРНК. МикроРНК выступают в качестве регуляторов генной экспрессии на разных этапах функционирования клетки, ткани, органа. Каждая микроРНК может регулировать экспрессию множества различных мРНК [13], [14], [15]. Механизм регуляции экспрессии при помощи микроРНК до конца ещё не выяснен: происходит ли репрессия на уровне трансляции или же мРНК подвергается деградации ещё до начала этого процесса. Вероятно, у животных (в отличие от растений) репрессия с помощью микроРНК может осуществляться несколькими способами и на разных уровнях – инициации, элонгации, с помощью преждевременной терминации трансляции и деградации образующихся пептидов [16], [17], [18], [19], [20].

МикроРНК играет значительную роль в процессах развития, дифференцировки и функционирования нервной ткани организма [21].

1.1.2. Проблемы изучения транскриптома

Транскриптом – это совокупность продуктов транскрипции, т.е. молекул РНК, синтезированных клеткой или группой клеток в определённый период их функционирования. Раздел молекулярной биологии, изучающий транскриптом, называется транскриптомикой. Транскриптомика изучает структуру транскриптов, их пространственное и временное разделение в клетке, определяет уровень их экспрессии. Уровень мРНК гена определяется комбинацией процессов инициации и элонгации транскрипции, процессинга и деградации мРНК, в связи с чем возникает вопрос, какой вклад вносит каждый из этих процессов, как это связано с функцией соответствующего белка, и главное – как уровень мРНК гена коррелирует с уровнем соответствующего белка.

Экспрессия генов обусловлена большим количеством факторов, и эта многофакторность приводит к колебаниям уровня мРНК (и в ряде случаев белка) между клетками одной популяции (изогенными клетками) – транскрипционному шуму [22]. К этим факторам относится в том числе взаимодействие между клетками. Такую изменчивость следует отличать от изменчивости в ответ на целенаправленный стимул (пластичности экспрессии) [23]. Транскрипция генов происходит всплесками – короткий период транскрипционной активности сменяется периодом инактивации. Промежутки между всплесками нерегулярны. Причины этого до конца не ясны: есть предположения, что они кроются в ремоделировании хроматина, приводящем к транскрипционной активности гена [22], [24]; в формировании преинициаторных комплексов в области промотора ДНК, обеспечивающих работу РНК-полимеразы II – они существуют в течение короткого времени, что приводит к пульсирующей транскрипции [25]. Возможны другие причины вариабельности уровня мРНК – например, неравномерное разделение клеточного содержимого в результате митоза [26].

Все эти факты нужно обязательно учитывать при количественных исследованиях мРНК. Разные гены, кроме того, могут характеризоваться разным уровнем транскрипционного шума.

В связи с этим возникает вопрос, как соотносится уровень мРНК гена и уровень кодируемого этим геном белка в клетке. Ситуацию усложняет тот факт, что короткоживущие мРНК могут приводить к синтезу долгоживущих белков и наоборот.

Ряд авторов утверждает, что корреляция как таковая между уровнем белка и соответствующей ему мРНК отсутствует [27], [28]. Однако по результатам исследования Schwanhausser с соавторами, основанном на  методе параллельной импульсной маркировки белков радиоактивно-меченными аминокислотами и РНК, меченной 4-тиоуридином (метод позволяет одновременно определять внутриклеточный оборот белков и мРНК), определённая корреляция была найдена. В соответствии с этим гены были разделены на 4 группы:

- стабильные мРНК, стабильные белки (гены ферментов гликолиза, глюконеогенеза, клеточного дыхания);

- нестабильные мРНК, нестабильные белки (гены, продукты которых участвуют в регуляции клеточного цикла, спирализации и деспирализации хроматина, факторы транскрипции);

- нестабильные мРНК, стабильные белки (продукты данных генов участвуют, в частности, в процессинге РНК);

- стабильные мРНК, нестабильные белки (продукты данных генов – секреторные белки; ферменты, участвующие в поддержании гомеостаза, многие гидролазы, белки иммунного ответа) [29].

Иначе говоря, существует определённая (частичная) корреляция уровня белка и уровня соответствующей мРНК, но эта корреляция зависит от функции белка, и она, вероятно, тем выше, чем выше уровень транскрипционной активности гена [30].

Определение уровня мРНК и соответствующих белков – необходимая часть исследований в функциональной геномике, поскольку недостаточно знаний о структуре гена, его транскрипта или транскриптов и специализации соответствующего белка для того, чтобы можно было судить об участии (степени участия) гена в физиологических процессах или в развитии патологий.


               
1.2. Церебральная ишемия

Церебральная ишемия (ишемический инсульт) – это острое нарушение мозгового кровообращения с последующим повреждением ткани мозга и нарушением его функций, а затем и гибелью участка мозга (мозговым инфарктом). Причинами могут быть тромбоз или эмболия (закупорка артерий), приводящие к уменьшению поступления кислорода и глюкозы из кровеносного русла к клеткам нервной ткани, что нарушает протекание окислительно-восстановительных процессов (и как следствие - всех остальных процессов) в них. На это сразу же реагируют клеточные структуры. В свою очередь на изменение внутриклеточных процессов реагирует клеточное ядро, и начинается экспрессия генов, обеспечивающих синтез веществ, участвующих в процессах как разрушения, так и восстановления.

           

             1.2.1. Реакция тканей на снижение уровня кровотока

Оптимальным уровнем кровотока является 50 - 60 мл на 100 г мозгового вещества в минуту. При более низкой скорости наблюдаются следующие нарушения обменных процессов в нервной ткани:                 

- при кровотоке ниже 50 - 55 мл на 100 г/ мин. в условиях снижения скорости окислительно-восстановительных процессов (вследствие недостатка кислорода и глюкозы, поступающих с кровотоком) происходит резкое падение уровня аденозинтрифосфата (АТФ). Вследствие этого, в частности, происходит общее торможение синтеза белков в нейронах. Наблюдается избирательная экспрессия определённых генов [31];

- при снижении кровотока до 35 мл на 100 г/мин. и ниже в условиях недостатка кислорода происходит активация анаэробного гликолиза (образуется всего 2 молекулы АТФ за один оборот фермента), повышение концентрации молочной кислоты (лактат-ацидоз), цитотоксический отёк;

- в условиях снижения уровня АТФ отмечается дисфункция ионных каналов активного транспорта, деполяризация мембран, выброс возбуждающих нейротрансмиттеров, в частности глутаминовой кислоты;

- при прогрессирующем снижении кровотока наблюдается недостаточность нейрональной электрической активности [32];

- в условиях того же дефицита АТФ (вследствие замедления окислительно-восстановительных процессов) проявляется прогрессирующая недостаточность энергетически зависимых ионных насосов, которые сохраняют относительное постоянство внутриклеточной среды;

- в условиях снижения кровотока до 10 - 15 мл на 100 г вещества в минуту начинается неконтролируемое проникновение ионов через клеточную мембрану нейрона; идёт каскад разрушительных внутриклеточных процессов. Через некоторое время происходит гибель нейронов [33]. До запуска этой стадии нейроны остаются жизнеспособными и могут восстановить свои функции в случае восстановления кровоснабжения.

В первые несколько часов ядро ишемии окружено ещё живой тканью (так называемая "ишемической полутень", или "пенумбра"), в которой наблюдаются функциональные изменения, но структурные изменения пока отсутствуют [34], [35]. Кровоснабжение здесь ниже уровня, необходимого для нормального функционирования, но выше критического порога необратимых изменений. Гибель клеток в зоне "полутени" приводит к расширению области инфаркта. Именно эта зона является основной "мишенью" при лечении ишемического инсульта в первые часы заболевания (предпочтительно первые 3 - 6 часов). Длительность существования зоны ишемической полутени индивидуальна и зависит от метаболизма мозга и состояния нейроэндокринной и иммунной систем, в среднем это около 50 часов [36], [37], [38], [39], [40], [41], [42], [43].

Процессы при ишемии сопровождаются развитием отёка мозга. Он развивается через несколько минут после развития локальной ишемии. Причина - нарушение функционирования мембранных белков, неконтролируемое проникновение ионов через мембраны клеток, вслед за которыми проникает и вода. В свою очередь данное состояние возникает вследствие недостатка АТФ и соответственно энергетических возможностей для поддержания гомеостаза. Сначала развивается цитотоксический (внутриклеточный) отёк, а затем, по причине гибели клеток гематоэнцефалического барьера, и внеклеточный, сопровождаемый накоплением в зоне повреждения продуктов анаэробного гликолиза [44], [45], [46], [47]. С повреждением гематоэнцефалического барьера в ткани мозга проникают лейкоциты, вызывающие в том числе гибель здоровых клеток нервной ткани [48], [49]. При этом увеличивается объём мозга, повышается внутричерепное давление. Это может повлечь за собой смещение частей головного мозга друг относительно друга. Смерть больных часто происходит  по причине сдавления нижних отделов продолговатого мозга [50].

           

           1.2.2. Клеточные реакции при ишемии головного мозга

При развитии острой фокальной ишемии происходит запуск патологических биохимических процессов во всех типах клеток нервной ткани, вызывающих нейрональные нарушения, астроцитоз (повышенное содержание астроцитов), микроглиальную активацию, а также изменения нейтрофилов, макрофагов, эндотелиальных клеток [51].

В области ишемической полутени (пенумбры) раньше и в большей степени поражаются глиальные клетки, чем нейроны коры головного мозга [52]. Глиальные клетки количественно значительно преобладают над нервными, занимая объём между сосудами и нейронами, причём нейроны настолько тесно окружены нейроглией, что иногда нелегко отделить одну фракцию от другой. Такая тесная взаимосвязь нейронов и глии является основой для их физиологических взаимодействий. Глия выполняет не только трофическую и защитную функции, но и способна тормозить гиперактивность нейронов, а также участвовать в регуляции энергетического потока при активации нейронов, окисляя глюкозу с выделением лактата. Астроциты способны захватывать и метаболизировать глутаминовую кислоту - медиатор возбуждения, способный при высокой концентрации оказывать цитотоксическое действие на нейроны. Глия участвует в синтезе цитокинов (пептидных молекул, регулирущих межклеточные взаимодействия, стимуляцию и подавление роста клеток, дифференциацию, функциональность, ответ на повреждающие воздействия и апоптоз), цГМФ (циклогуанозинмонофосфата, выступающего в качестве посредника передачи сигнала, в регуляции клеточного цикла), NO (оксида азота (II), обладающего разнообразным биологическим действием). Также глия принимает участие в синтезе глиальных факторов роста нейронов, участвующих в репарации нейронов и их трофике [53].

По результатам исследований на моделях экспериментального ишемического инсульта у крыс была установлена последовательность реакций разных типов клеток мозга на ишемию. Существуют различия в развитии процессов в мозге грызунов и приматов, однако многочисленные общие черты позволяют частично экстраполировать полученные данные на понимание механизма развития ишемии у человека. В первую очередь при ишемии мозга наблюдается изменение глиальных клеток. В случае астроцитов наблюдается их набухание, фрагментация отростков, дезинтеграция. При этом снижается экспрессия астроцитарного маркера - кислого глиального фибриллярного белка GFAP [52], [54]. Однако через 4 - 6 часов наблюдается активация астроцитов и повышение экспрессии GFAP. Примерно через 24 часа вокруг ишемического ядра образуется сеть GFAP-позитивных астроцитов. В конечном итоге это ведёт к образованию глиального рубца через 5 - 10 дней после начала ишемии [55].

Наблюдаются и изменения микроглиальных клеток. Микроглия - представительство иммунокомпетентных клеток, защищающих мозг от вредных факторов [56], [57]. В нормальных условиях микроглиальные клетки имеют ветвистую отростчатую форму [58] и находятся в состоянии функционального покоя. Они способны на короткое время активироваться, выделяя токсичные провоспалительные медиаторы, но быстро возвращаются в состояние покоя [59]. При ишемии и некоторых других патологических состояниях они втягивают отростки, принимая амёбовидную форму, при этом активируясь и не возвращаясь в состояние покоя, а продолжая синтезировать токсичные для клеток нервной ткани соединения. При этом поддерживается воспалительная реакция, происходят гибель нейронов и ухудшение микроциркуляции, повреждается гематоэнцефалический барьер [60], [61]. Особенно сильно эти нарушения выражены в области пенумбры [62], [63]. С течением времени область локализации активированной микроглии расширяется, и к 5-му дню изменённые клетки микроглии наблюдаются в областях, отдалённых от очага ишемии [63], [64], [65].

Первые изменения в нейронах - их сморщивание - наблюдаются через 30 минут после проведения операции по перевязке артерии. Ещё через час наблюдается увеличение количества гетерохроматина (что говорит о затормаживании экспрессии ряда генов), расширение ЭПР, вакуолизация, набухание митохондрий. Эти изменения сохраняются на протяжение примерно 6 часов и являются обратимыми. Через 10 - 12 часов в ядре ишемии обнаруживаются признаки необратимого повреждения нейронов: разрушение мембранных структур, отложение солей кальция на внутренней мембране митохондрий [52], [66], в зоне ишемической полутени изменения сохраняются дольше. Первые погибшие нейроны обнаруживаются в тканях мозга в среднем через 50 часов после инсульта.

Наряду с клетками, подвергшимися некротической гибели, вдоль внутренней границы зоны ишемического ядра обнаруживаются клетки, подвергающиеся запрограммированной клеточной гибели – апоптозу [67], [68], [69], [70], [71]. Максимальное количество таких клеток появляется на вторые сутки после инсульта, затем их количество снижается [72], но тем не менее апоптозные нейроны продолжают появляться в зоне полутени и спустя 4 недели после начала заболевания.

Через 6-8 часов после начала заболевания наблюдаются изменения нейтрофилов в микроциркуляторном русле. Это связано с активацией микроглии и повышением синтеза противовоспалительных факторов и молекул клеточной адгезии: иммуноглобулин-подобных, интегринов, селектинов и т.п. Нейтрофилы прилипают к эндотелию капилляров, проникают через гематоэнцефалический барьер и внедряются в ишемизированную ткань. Максимум инфильтрации нейтрофилов в ткани мозга наблюдается через 48 - 96 часов с момента наступления инсульта, после чего их количество постепенно снижается [73], [74], [75]. Помимо нейтрофилов в ишемизированную ткань проникают макрофаги, но максимум инфильтрации макрофагами наступает несколько позже - на 5-е - 7-е сутки после начала инсульта [76]. С этого момента ишемизированная область уменьшается в размерах за счёт прогрессирующей атрофии.

Изменению подвергаются и клетки эндотелия микроциркуляторного русла, причём это происходит уже с первых минут ишемии. Клетки набухают, проницаемость их мембран увеличивается. Примерно через 6 часов наблюдается некроз отдельных клеток, живые клетки (как эндотелиальные, так и гладкомышечные) пролиферируют, причём максимум происходит на 2-е - 3-и сутки ишемии [77]. С 5-го - 7-го дня наблюдается также ангиогенез, обеспечиваемый ангиогенными факторами роста, молекулами адгезии, в первую очередь интегринами. В целом это благоприятный признак, прогнозирующий улучшение восстановительных процессов в тканях мозга [78], [79].

                    1.2.3. Глутамат-кальциевый каскад

Глутамат-кальциевый каскад - это процесс массивного выброса возбуждающих нейромедиаторов глутамата и аспартата и накопления ионов кальция внутри клетки [80], [81], [82], [83], [84]. Он инициируется энергетическим дефицитом, возникающим при ишемии, а его следствием является повреждение нейронов и глиальных клеток. Условно выделяют три этапа глутамат-кальциевого каскада, соотносящиеся с этапами ишемического инсульта: индукцию, амплификацию и экспрессию.

Индукция. Локальное нарушение кровотока приводит к ограничению вплоть до полного прекращения доставки в мозг необходимых ему субстратов, в частности, кислорода и глюкозы. Это закономерно приводит к падению уровня АТФ, а также ГТФ и др. В свою очередь, это приводит к нарушению энергозависимого транспорта ионов [85], [86], деполяризации мембран нейронов и глиальных клеток, следствием чего является избыточное высвобождение глутамата, являющегося медиатором возбуждения. Глутамат накапливается в межклеточном пространстве, что ведёт к активации NMDA-рецепторов [87]. Вследствие этого открываются ионные каналы и в клетку неконтролируемо проникают ионы натрия и кальция, а также хлорид-анионы и вода [88], [89], [90]. В связи с проникновением воды клетка набухает и в конечном счёте разрушается. Пока этого не произошло, наблюдающееся нарушение функции нейронов является обратимым. Параллельно с обозначенными процессами происходит активация глутаматных рецепторов третьего типа, чувствительных к изменению обмена веществ [91], [92], [93], [94]. При этом происходит стимуляция образования диацилглицерина и инозитол-1,4,5-трифосфата, вступающих в действие на этапе амплификации.

Амплификация. Инозитол-1,4,5-трифосфат стимулирует высвобождение кальция из внутриклеточных депо (гладкого эндоплазматического ретикулума) [95], [96], приводя к увеличению его концентрации внутри клетки. Кроме того, кальций продолжает поступать в клетку через потенциалзависимые кальциевые каналы, открывшиеся в результате изменения мембранного потенциала, и в результате работы трансмембранного натрий-кальциевого переносчика, активирующегося избытком ионов натрия. Избыток ионов кальция и диацилглицерина активирует ферменты, модифицирующие мембранные белки, значительную долю которых составляют рецепторы, в том числе рецепторы глутамата. В результате этого возрастает чувствительность клетки к возбуждающим сигналам, нарастает деполяризация мембран за счёт проникновения в клетку катионов, в том числе Ca2+, в связи с чем высвобождение глутамата продолжается и увеличивается. Возбуждение соседних нейронов усугубляется [97]. Изменения нейронов на этом этапе ещё обратимы.

Экспрессия. Гиперактивация рецепторов глутамата приводит к нарушению ионного гомеостаза, накоплению внутри клетки ионов кальция. В какой-то момент изменения становятся необратимыми и клетка погибает. Кальций связывается с внутриклеточным белком-рецептором кальмодулином, вызывающим активацию ряда ферментов – протеаз, фосфолипаз, циклооксигеназы, NO-синтазы. В результате их работы расщепляются белки, липиды и нуклеиновые кислоты (в первую очередь РНК) [98], [99]. В частности, действие фосфолипазы разрушает плазмалемму и внутриклеточные мембраны. При распаде фосфолипидов может образовываться арахидоновая кислота, вызывающая появление в клетке активного кислорода [100], [101], [102], [103]. Происходит реакция перекисного окисления липидов, что усугубляет процесс распада мембран. Это приводит к образованию фактора активации тромбоцитов [104], итогом работы которого в конечном счете становится нарушение микроциркуляции, ещё более усиливающее ишемический процесс.

                      1.2.4. Реакция генома на ишемию

Ответная реакция организма на острую энергетическую и кислородную (что взаимосвязано) недостаточность представляет собой упорядоченную совокупность срочных и отложенных процессов компенсации разрушительных процессов. В нейронах запускается каскадный механизм поэтапной активации экспрессии генов [105], [106].

На снижение мозгового кровотока нервная ткань в первую очередь отвечает снижением синтеза белка и мРНК (что в конце концов проявляется в компактизации хроматина и изменении формы клеток). После чего включается неспецифическая реакция генома – синтезируются мРНК генов раннего реагирования, продукты которых могут участвовать в регуляции экспрессии генов позднего действия (каскадный механизм). Это происходит уже в первые минуты патологического процесса и является ответом на нарушение процесса активного транспорта ионов, вызванного недостатком АТФ в условиях недостатка кислорода и глюкозы, на изменение мембранного потенциала, вызванного в свою очередь нарушением процесса ионного транспорта, и на выброс глутамата как медиатора возбуждения [107]. Экспрессия генов раннего реагирования чаще всего приводит к синтезу ДНК-связанных белков – транскрипционных факторов, вызывающих экспрессию большого числа генов через активацию промоторных элементов [108]. Ряд генов раннего реагирования кодирует молекулы, вовлечённые в биохимические каскады сигнальных путей: протеинфосфотазы, G-белки, циклооксигеназу и др. [109].  Низкие концентрации кислорода индуцируют активацию специфического транскрипционного фактора HIF-1 [110], выполняющего функцию регуляции гомеостаза кислорода в клетке, для которого идентифицировано более 60 генов-мишеней, продукты которых способствуют улучшению доставки кислорода и метаболической адаптации. Это в частности фактор роста эндотелия сосудов VEGF и эритропоэтин. В результате их работы запускаются процессы ангиогенеза и неоваскуляризации, а также эритропоэз. В результате этого увеличивается поступление кислорода в клетку [111]. Также мишенями HIF-1 являются гены, кодирующие микроРНК miR-210 и miR-373, регулирующие экспрессию генов репарации ДНК [112], и гены гистоновых деметилаз [113]. Таким образом, уже с первых часов гипоксии клеточный ответ является скоординированным и затрагивает разные уровни регуляции экспрессии генов.

Также активируется экспрессия генов белков теплового шока – стресс-белков, или шаперонов, которые ответственны за сворачивание (фолдинг) белка и формирование толерантности к ишемии. Транскрипционные факторы этих генов активируются путём фосфорилирования вследствие увеличения концентрации кальция внутри клетки, свободнорадикальных реакций, активации протеазных ингибиторов и тирозинкиназ. Основная причина запуска синтеза шаперонов – дефицит АТФ, возникающий вследствие недостаточного поступления кислорода и глюкозы в клетку [114], [115].

Следующая волна экспрессии генов, формирующаяся под влиянием ишемии, связана с генами, кодирующими регуляторы процессов, участвующих в механизмах отсроченной гибели клеток. Запускается синтез цитокинов и хемокинов, индукцирующих локальные воспалительные процессы в очаге ишемии, увеличение сосудистой проницаемости и гематоэнцефалического барьера [116]. Также запускаются гены NO-синтетазы и циклооксигеназы-2. Всё это происходит в нейтрофилах, глиальных клетках и клетках эндотелия сосудов и достигает максимума через 12 часов после окклюзии средней мозговой артерии [117], [118]. Кроме того, экспрессируются гены, кодирующие продукты, участвующие в таких процессах, как апоптоз, выживание клеток, нейропластичность.

Итак, церебральная ишемия вызывает серьёзные изменения в экспрессии генома и запускает сложную разветвлённую систему генетических программ, определяющих по какому пути – гибели или выживания – пойдут клетки.

       1.2.5. Комплексины и их возможное участие в глутаматной эксайтотоксичности

Комплексины – это семейство специфических эволюционно консервативных белков цитоплазмы нейронов, связывающихся с рецептором белка а-SNAP – белковым комплексом SNARE, состоящим из синтаксина, синаптобревина и SNAP-25 и обеспечивающим высвобождение медиаторов из синаптических пузырьков в синаптическую щель. Известно, что существует два типа комплексинов – CPLX1 и CPLX2. Первый представлен в тормозящих (ингибирующих) синапсах, второй – в возбуждающих [119], [120]. Это сравнительно небольшие по размеру (молекулярная масса около 19000 Да) белки цитозоля нейронов. Комплексины богаты остатками глутаминовой кислоты и лизина [121]. В основном локализуются в пресинаптических окончаниях нейронов млекопитающих. Белковая молекула состоит из 4 функциональных частей:

- N-концевой домен,

- вспомогательная спираль,

- центральная спираль,

- С-концевой домен [122].

Комплексины выполняют двойную функцию: они могут действовать и как активаторы, и как ингибиторы экзоцитоза в зависимости от физиологического состояния клетки. Ингибирование слияния мембран необходимо для предотвращения самопроизвольного экзоцитоза в синапсе [123], [124]. Последние данные поддерживают версию, что синаптотагмин играет роль в конформационных изменениях SNARE при изменении концентрации кальция [123]. Связывание кальция с синаптотагмином провоцирует изменение конформации и вытеснение комплексина, после чего мембрана везикулы сливается с пресинаптической мембраной и происходит экзоцитоз [125]. При низкой концентрации кальция экзоцитоз-ингибирующий эффект комплексина выражен сильнее. Он снижается посредством синаптотагмина при растущей концентрации кальция с переводом синаптотагмина в активное состояние [123].

Исследования, проведённые Н.М. Раевской и др., обнаружили у человека два варианта транскриптов гена Cplx2, различающиеся 5’- концевыми участками (CPLX_v1 и CPLX_v2). Они имеют высокое сходство с аналогичными транскриптами у крыс (Cplx_v1 и Cplx_v2) [126]. Этот случай не уникальный, он известен для многих генов, причём различные транскрипты одного и того же гена часто являются тканеспецифичными либо появляются в одной и той же ткани и клетке в зависимости от стадии клеточного цикла.

Рисунок 1.1. Структурная организация гена CPLX2 человека и его транскриптов

Факторы, определяющие транскрипцию по одному или по другому типу, до конца не выяснены. Вероятно, роль в «выборе» того или иного продукта играют альтернативные промоторы и взаимодействующие с ними факторы, что определяется потребностью клетки в том или ином продукте.

Исследования экспрессии гена Cplx2 также показали двустороннюю роль комплексинов в механизме экзоцитоза. Так, например, на культуре клеток РС12 было обнаружено, что Cplx2 стимулирует экзоцитоз при низком экспрессионном уровне и ингибирует при более высоком [127]. Изменение экспрессии гена этого белка при ишемии мало изучено, хотя известно, что важнейшие звено в механизме развертывания ишемического повреждения ткани мозга – глутаматная эксайтотоксичность – частично обеспечивается высвобождением глутамата в составе синаптических везикул. Также показано, что Cplx2 активно экспрессируется не только в нейронах, но и в астроцитах, которые принимают важное участие в регуляции оборота глутамата [128]. Таким образом, белок CPLX2 может принимать важное участие в глутаматной эксайтотоксичности. Например, было показано, что увеличение экспрессии Cplx2 приводит к нарушениям высвобождения глутамата с последующими патологическими изменениями [129], [130]. Также следует отметить, что функции комплексинов связаны с регуляцией экзоцитоза не только глутамата, но и других важных медиаторов и трофических факторов.

              1. 3. Нейропротекция при ишемии

Лечение ишемического инсульта включает в себя два основных компонента – улучшение перфузии мозга и нейропротекцию. При этом выделяют первичную нейропротекцию, направленную на прерывание быстрых реакций самых ранних процессов ишемического каскада в пределах «терапевтического окна», и вторичную нейропротекцию, которая направлена на уменьшение выраженности отдалённых последствий ишемии.

Первичная нейропротекция основана на применении препаратов – антагонистов глутаматных NMDA и AMPA рецепторов, в которые встроены агонист-зависимые ионные каналы, играющие значительную роль в повреждении тканей мозга при ишемии. Антагонисты могут быть конкурентными (селфотел, элипродил и др.), блокирующими глутамат-распознающие сайты рецепторов и уменьшающими таким образом поток ионов кальция в клетку, и неконкурентными (фенциклидин, кетамин, дизолципин, декстрометорфан, декстрорфан, церестат, ремацемид, магний).

Также стратегией первичной нейропротекции является торможение синтеза и пресинаптического высвобождения глутамата, приводящее к уменьшению выраженности постсинаптической эксайтотоксичности. Препараты этого ряда – BW-619C89, пропентофиллин, фенитоин, фосфенитоин, лубелузол.

Кроме того, для уменьшения глутаматной эксайтотоксичности проводится устранение нейротрансмиттерного дисбаланса путём активации тормозных систем. В данном случае наиболее часто применяются ГАМК и глицин.

Вторичная нейропротекция направлена на прерывание отсроченных механизмов смерти клеток: избыточного синтеза NO и оксидантного стресса, активации микроглии и дисбаланса цитокинов, иммунных сдвигов, локального воспаления, нарушения микроциркуляции и ГЭБ, трофических нарушений и апоптоза. Важным направлением вторичной нейропротекции является антиоксидантная терапия [131].

                         1.3.1 Семакс и PGP

Последствия церебральной ишемии являются основанием для применения модулирующих веществ, способных устранять нарушения как локального, так и системного характера на молекулярном уровне - способных к нейропротекции, а также восстанавливающих микроциркуляцию в тканях мозга, стимулирующих репаративные процессы, предотвращающих вторичные повреждения.

При вторичной нейропротекции исключительно важную роль могут играть нейропептиды – регуляторы деятельности ЦНС. В последнее время большое внимание исследователей направлено на изучение фармакологических свойств меланокортинов – большого семейства нейропептидов, образованных из общего предшественника – молекулы проопиомеланокортина и включающего в себя группу меланоцитстимулирующих гормонов, АКТГ, а также их фрагменты. Примером такого нейропептида является семакс – синтетический пептид (метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин), обладающий нейрозащитными, психостимулирующими и антигипоксическими свойствами. Он представляет собой модифицированный фрагмент АКТГ(4-7), Met-Glu-His-Phe). С конца 1970-х годов Институтом молекулярной генетики совместно с МГУ им. Ломоносова производились разработки препарата, способного оказывать вышеуказанный эффект. Поскольку большинство экзо- и эндопептидаз не расщепляют последовательности, обогащённые пролиновыми остатками, был синтезирован ряд аналогов АКТГ с участками, обогащёнными пролиновыми остатками с C-конца пептида. В результате аналог, содержащий концевой мотив PGP, наиболее устойчив, что приводит к значительному усилению эффекта и его пролонгированию [132].

Препарат «Семакс» оказывает многофакторное нейропротекторное действие: в частности, он активирует синтез нейротрофинов – регуляторов роста и дифференцировки нервной ткани, усиливает внимание, улучшает память, способствует адаптации организма к гипоксии, церебральной ишемии, наркозу и т.д. [133], [134]. Препарат вводится в низких дозах, интраназально, в незначительном количестве проникает через гематоэнцефалический барьер [135], при попадании в ткани распадается до отдельных аминокислот. Концевой трипептид PGP несколько задерживает этот процесс во времени, продлевая эффект препарата. При отщеплении метионина образуется довольно стабильный фрагмент Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro [136], который, тем не менее, через некоторое время деградирует до аминокислот. Наиболее стабилен С-концевой трипептид PGP.

Опыты на культуре нервной ткани показали выраженное трофотропное действие семакса на нейроны холинергической группы, в том числе в условиях недостатка кислорода и глюкозы.

Установлено, что при использовании препарата баланс пептидэргических систем мозга сдвигается в сторону преобладания противовоспалительных и защитных факторов над факторами, поддерживающему воспалительные реакции. Семакс влияет на процессы синтеза оксида азота (в сторону его уменьшения), состояние рецепторов глутамата и баланс нейротрансмиттеров.

PGP (пролил-глицил-пролин), образующийся при деградации семакса, обнаруживается в плазме крови спустя 3-5 часов после введения препарата в концентрации не выше 2 – 5% от количества введённого  гептапептида. В дальнейшем он ферментативно распадается с образованием дипептидов PG и GP [137]. Пролин-содержащие пептиды воздействуют на ряд процессов в организме, в частности, они обладают протекторным действием на слизистую оболочку желудка. К сожалению, молекулярные механизмы действия семакса остаются до конца не выясненными. Ранее было высказано предположение, что нейропротекторные эффекты семакса связаны с увеличением экспрессии нейротрофинов [138]. Кроме того, в ряде работ были показаны и другие аспекты действия семакса: иммуномодуляция, торможение воспалительных реакций, торможение синтеза оксида азота и реакций оксидативного стресса [139], [140].

Глава 2. Материалы и методы исследования

                      2. 1. Объект исследования

Исследования выполнены на крысах-самцах линии Wistar 2-х месячного возраста, массой 250 – 350 г, содержащихся в виварии при естественном освещении и имеющих свободный доступ к пище и воде. Все крысы (n=60) были разделены на 4 группы: 1-я – ложнооперированные животные, которым вводили физиологический раствор, 2-я – животные после окклюзии левой средней мозговой артерии, которым вводили физиологический раствор (n=15); 3-я – животные, которых подвергали окклюзии левой средней мозговой артерии и вводили препарат семакс (n=15); 4-я – животные, которых подвергали окклюзии левой средней мозговой артерии и вводили препарат PGP (n=15); Экспериментальные группы были разделены на 3 подгруппы в зависимости от временной точки (3, 24 и 72 часа) и состояли не менее чем из четырех животных.

      

Дистальная окклюзия средней мозговой артерии у крыс

 

Рисунок 2.1. Схема эксперимента

Использованная нами экспериментальная модель фокальной ишемии мозга крыс была отработана и выполнена в совместной работе с сотрудником кафедры фармакологии Факультета Фундаментальной Медицины МГУ О. В. Поваровой [141].

Фокальную ишемию мозга у экспериментальных животных вызывали с помощью коагуляционной окклюзии дистального участка (выше места ответвления a. lenticulostriatis) левой средней мозговой артерии. Операцию проводили под хлоралгидратным наркозом (300 мг/кг, внутрибрюшинно). Для каждой временной точки (3, 24 и 72 часа) в качестве положительного контроля использовали группу ложнооперированных крыс. Таких животных под наркозом подвергали аналогичной процедуре подготовки операционного поля с левой стороны, но не производили коагуляцию артерии. Через 15 мин, 1 час, 4 часа и далее через каждые 4 часа крысам внутрибрюшинно вводили один из препаратов: семакс, PGP или физиологический раствор. Семакс использовали из расчета 10 мкг/100 г веса крысы; PGP – 3.75 мкг/100 г. Через 3, 24 и 72 часа крыс декапитировали под действием эфирного наркоза.

Из мозга крыс выделяли лобно-теменную долю коры и соответствующие ей подкорковые структуры (Рис. 5). Ткани замораживали в жидком азоте, а затем хранили при –70°С.

Коронарный срез мозга крысы через 3 часа после окклюзии левой средней мозговой артерии на уровне брегмы

               2.2. Методы исследования

                 2.2.1. Электрофоретическое разделение РНК

Материалы: для приготовления 1,5% агарозного геля требуется 1,5 г агарозы на 100 мл 1х ТАЕ (трис-ацетатного буфера).

Для приготовления 100 мл трис-ацетатного буфера (50х ТАЕ): 24,22 г триса (трис(гидроксиметил)аминометана (HOCH2)3CNH2 ), 1,862 г ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), 8,96 мл ледяной уксусной кислоты и 73,3 г деионизированной воды.

Для приготовления денатурирующего буфера для нанесения РНК: 50% деионизированный формамид, 6% формальдегид, 1х ТАЕ, 0,03% краситель бромфеноловый синий.

Важным условием для получения адекватных данных при оценке количества мРНК в биологических образцах является качество полученных из них препаратов суммарной РНК [142].

Для подтверждения нативности полученных нами препаратов суммарной РНК проводили их электрофоретическое фракционирование в агарозном геле в денатурирующих условиях (Рис. 6). Осадок РНК (1 – 2.5 мкг) растворяли в денатурирующем буфере для нанесения РНК. Фракционирование РНК проводили в горизонтальном 1.5% агарозном геле. Для приготовления геля необходимое количество агарозы растворяли с нагреванием в 1х ТАЕ. Образцы перед нанесением на гель прогревали при 65°С в течение 15 минут в термостате «Гном» (ДНК-технология, Россия), охлаждали во льду 5 минут и наносили на гель.

Рисунок 2.2. Электрофореграмма суммарной РНК лобно-теменной доли коры крыс в денатурирующем 1,5% агарозном геле. 28S, 18S, 5S – субъединицы рибосомной РНК.                    1, 2, 3 – препараты РНК коры мозга крыс.

Электрофорез проводили в течение 30 минут в камере для горизонтального электрофореза (BioRad, США) при напряжении 120В, источник питания «Эльф-8» (ДНК-технология).

                         2.2.2. Синтез одноцепочечной кДНК

Препараты суммарной РНК использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием реактивов RevertAid First Strand cDNA Sinthesis (MBI Fermentas, Латвия) в реакционной смеси объёмом 20 мкл. Спиртовую смесь, содержащую 5 мкг РНК, в течение 15 минут центрифугировали при 10000 оборотов в минуту, затем промывали 75% этанолом (100 мкл) и центрифугировали 5 минут в том же режиме. Остаток высушивали в концентраторе и растворяли в 12 мкл деионизированной воды, добавляли 1 мкл праймера олиго(dT)18  и в течение 5 минут инкубировали при 70оС, а затем помещали в лёд. Далее добавляли 4 мкл 5х буфера для обратной транскрипции, 1 мкл (20 ед.) ингибитора РНКаз, 2 мкл 10мМ смеси трифосфатов и выдерживали 5 минут при 37оС. Затем в пробу добавляли 200 единиц ревертазы и инкубировали в течение часа при 42оС. Реакцию останавливали 10-минутной инкубацией при 70оС. Пробы одноцепочечной кДНК хранили при -20оС.

                                      2.2.3. Подбор праймеров

Специфичные праймеры к референсным генам Gapdh, Lhda, Rpl3 и двум транскриптам были подобраны с помощью пакета программ OLIGO Primer Analysis Software 6.31 и синтезированы фирмой ЗАО «Евроген».

     Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных в ПЦР.

Праймер 

Последовательность праймера 

GeneBank acc. no.

Позиция нуклеотидов 

Длина

ПЦР-продукта

Gapdh (F)

5’-TGCCATCAACGACCCCTTCA-3’

NM_017008

117 - 136

188 п.н.

Gapdh (R)

5’-ACTCAGCACCAGCATCACCC-3’

285 – 304

Rpl3 (F)

5’-ATGGGTCCTTGGGCTTCTTG-3’

NM_1987532

58 - 77

239 п.н.

Rpl3 (R)

5’-CACAATACCCACAACCACCA-3’

277 - 296

Ldha (F)

5’-GCGTCTCCCTGAAGTCTCTGA-3’

NM_017025

726 - 746

232 п.н.

Ldha (R)

5’-TCCTTGATTCCATAGAGACCCT-3’

936 - 957

Cplx2_v1 (F)

5’-GGAGGAGTGAGGAGGACGGG-3’

     U35099

24 - 43

132 п.н.

Cplx2_v1 (R)

5’-CACCAAGCAGGGTAGATAGCAT-3’

134 - 155

Cplx2_v2 (F)

5’-CTGGCTGAGGGGCGTGATT-3’

  NM_053878

25 - 43

172 п.н.

Cplx2_v2 (R)

5’-CAGCAACCGTCTAAGCCACTG-3’

176 - 196

  2.2.4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time PCR)

Реакционная смесь для ПЦР объёмом 25 мкл содержала 0,02 мкл пробы реакции обратной транскрипции, по 5 пкмоль прямого и обратного праймеров, 5x реакционной смеси («Евроген»), включающей буфер, Taq ДНК-полимеразу, набор дНТФ и интеркалирующий краситель SYBR Green I. Амплификация кДНК в присутствии праймеров к генам  Cplx2 и ряда генов домашнего хозяйства (housekeeping genes), используемых в качестве референсных - Rpl3 (ген одного из рибосомальных белков), Gapdh (ген глицеральдегидфосфатдегидрогеназы), Ldha (ген лактатдегидрогеназы) - проводилась на приборе  Step One Plus (Applied Biosystems).

Каждый образец кДНК анализировался трижды. На графиках зависимости уровня флуоресценции от температуры плавления продуктов амплификации для каждой пары праймеров обнаружен один максимум, соответствующий температуре плавления продукта ПЦР.

Амплификация проводилась в следующем режиме: нагревание до 95оС (10 минут),  далее шло 40 циклов следующего состава: денатурация при 95оС - 10 секунд, отжиг праймера при 65оС в течение 15 секунд, элонгация цепи при 72оС  - 20 секунд.

Работы по подготовке ПЦР (приготовление растворов, дозирование кДНК и реакционных смесей) проводились в ламинарном боксе. Носики для автоматических пипеток, вода и пипетки предварительно выдерживались под УФ-излучением в течение 15 минут.

           2.2.5.  Анализ уровня экспрессии генов методом ОТ-ПЦР

Сравнение уровня мРНК исследуемого гена и референсных генов в коре и подкорковых структурах крыс в условиях экспериментальной ишемии проводили с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени [143], [144], [145]. Определение относительного уровня мРНК исследуемого гена проводилось с помощью программы REST (Relative Expression Software Tool) [146], позволяющей сравнивать относительный уровень экспрессии гена в контрольной и опытной группах с учётом нормализации к контрольному гену и поправкой на эффективность ПЦР. В качестве контрольных генов использовали ген Gapdh (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, один из ферментов гликолиза), ген Rpl3 (этот ген кодирует белок L3, который входит в состав 60S субъединицы рибосомы.) и Ldha (ген кодирующий лактатдегидрогеназу). По отношению к мРНК этих генов нормировалось содержание исследуемых транскриптов. Гены Gapdh, Rpl3 и Ldha, будучи генами «домашнего хозяйства», характеризуются достаточно постоянным уровнем экспрессии в тканях мозга в том числе и в условиях экспериментальной ишемии, поэтому они могут быть использованы в количественных исследованиях мРНК в нервной ткани как референсные гены. В то же время использование нескольких референсных генов в количественном анализе ОТ-ПЦР позволяет проводить более точный анализ содержания транскриптов.

Математическая модель программы REST вычисляет относительный уровень экспрессии (R) исследуемого гена. Особенности работы модели состоят в следующем: рост сигнала флуоресценции связан с увеличением количества циклов ПЦР и прямо пропорционален накоплению продуктов амплификации:

Cn = C0 (E)n = k rn =k r0(E)n  ,     

                                       

где Cn – концентрация после цикла n, С0 – исходная концентрация кДНК, Е – эффективность амплификации, r0 и rn – соответствующие измерения флуоресценции, k – постоянная величина.

Прибор регистрирует номер цикла Сt, при котором уровень флуоресценции значительно отличается от фонового. Эта величина измеряется для всех образцов. Уровень экспрессии (R) гена вычисляется по следующей формуле:

          R = C0 sample/ C0 cont = E(Ct cont – Ct sample)                                                  

Уровень экспрессии исследуемого гена относительно контрольного:

             Rrel.= Rtarget / Rreference ,

где Rtarget – уровень экспрессии исследуемого гена,

Rreference – уровень экспрессии референсного гена.

Итоговое выражение для вычисления относительного уровня экспрессии опытного гена (Rrel) имеет вид:

Rrel. = Etarget(Ct cont –Ct sample)/Eref(Ct cont –Ct sample)  ,

 где Etarget – эффективность ПЦР для исследуемого гена,

Eref – эффективность ПЦР для контрольного гена,

Ct cont – уровень экспрессии гена контрольной группы,

Ct sample – уровень экспрессии того же гена опытной группы.

Эффективность ПЦР определяется методом серии разведений одного из образцов и вычисляется по формуле для каждого гена и каждой структуры мозга:

E = 10(-1/slope)         

                                               

где slope – это наклон калибровочной прямой, отображающей зависимость Ct от концентрации кДНК.

Стандартная ошибка для значения эффективности рассчитывается следующим образом:

SE(E)= [(Е ln10) / slope2] s.e.(slope)                     

где SE(E) – стандартная ошибка (standard error) значения эффективности,

SE(slope) – стандартная ошибка наклона прямой.

Матрицей для ПЦР служила одноцепочечная кДНК, полученная с помощью обратной транскрипции мРНК, выделенных из тканей головного мозга крыс. Амплификация продуктов гена-мишени и гена-референса проводилась в разных пробирках при оптимальных условиях для каждого гена.

Для определения эффективности амплификации кДНК в тканях головного мозга крыс в присутствии каждой пары праймеров исследуемых генов проводили ПЦР серии разведений кДНК образцов для каждой исследуемой ткани. Используя данные пороговой флуоресценции Сt для разных количеств кДНК, рассчитывали эффективность амплификации для каждой пары праймеров, значения которой затем использовали для определения относительного уровня экспрессии исследуемых генов.

Статистическую обработку полученных данных экспрессии мРНК контрольного и исследуемых генов проводили в программе REST, позволяющей определять достоверность различий между группами с помощью статистического теста «Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test».

Нулевой гипотезой данного теста является предположение, что различия в относительных уровнях мРНК между опытными и контрольными группами отсутствуют. Данный тест неоднократно и случайно перераспределяет наблюдаемые значения Сt для опытных и контрольных животных и каждый раз отмечает влияние эффекта перестановки на разницу среднего значения Сt между опытными и референсными группами. Доля таких эффектов, где разница больше, чем реально наблюдаемая в эксперименте, относительно всех распределений дает значение «критерия рандомизации» – р. Статистически значимыми считаются различия со значением р ≤ 0,05.

                      Глава 3.  Результаты

   3.1. Влияние ишемии на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс

Сначала исследовалось влияние фокальной ишемии на экспрессию транскриптов гена Cplx2 в лобной коре (повреждённый ишемией участок) и подкорке (часть мозга, которая находится под повреждённым участком коры) животных. Результаты анализа представлены в таблицах 2 и 3. Контрольными в данном случае считались данные ложнооперированных животных. В качестве препарата обе группы получали физраствор.

Анализ полученных данных показал следующее: через 3 часа количество обоих транскриптов как в коре, так и в подкорке, по сравнению с контрольной группой было незначительно сниженным. Через 24 часа фиксировалось довольно значительное снижение содержания обоих транскриптов (более чем в 2 раза) по сравнению с контрольной группой в коре головного мозга ишемизированных животных, что является статистически значимым результатом. В подкорке же снижение оставалось незначительным (в 0,7 раз) по сравнению с контрольной группой. Через 72 часа после окклюзии количество транскриптов Cplx2 в коре было выше в 2,3 – 2,6 раз по сравнению с контрольной группой. Однако значительное варьирование результатов в группе ложнооперированных крыс через 72 часа не позволяет считать различие между этими группами статистически достоверными. При этом серьёзных изменений экспрессии транскриптов Cplx2 в подкорке не было обнаружено (0,9 от уровня у ложнооперированных животных). Иначе говоря, исследование показало, что колебания уровня экспрессии гена Cplx2 (в двух вариантах транскриптов) при ишемии выражены в лобной коре головного мозга крыс и слабо выражены в подкорковых структурах. Что, по-видимому, отражает степень повреждения этих областей. Кроме того, важно отметить: исследуемый в данном случае фактор (ишемия) одинаково влияет на характер изменений экспрессии обоих транскриптов: уровень экспрессии снижался и повышался почти в одинаковое количество раз по сравнению с контрольными особями, хотя абсолютное количество двух разных транскриптов в зонах головного мозга различалось.

Таблица 2. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 (2 варианта транскриптов данного гена) в лобных долях головного мозга крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших физраствор.

Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у ишемизированных животных, получавших физраствор, от уровня мРНК этого гена у ложнооперированных животных. Жирным шрифтом выделены статистически значимые результаты. Данные представлены в виде R + SE, * – p < 0.05.

Кора

24ч

72ч

Ишемия

Cplx2_v1

0.8 ± 0.10

0.5 ± 0.12*

2.3 ± 1.36

Cplx2_v2

0.9 ± 0.14

0.5 ± 0.11*

2.6 ± 1.56

Таблица 3. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 в подкорковых областях головного мозга крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших физраствор. Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у ишемизированных животных, получавших физраствор, от уровня мРНК этого гена у ложнооперированных животных. Данные представлены в виде R + SE.

Подкорка

24ч

72ч

Ишемия

Cplx2_v1

0.7 ± 0.28

0.7 ± 0.15

0.9 ± 0.19

Cplx2_v2

0.7 ± 0.27

0.7 ± 0.13

0.9 ± 0.23

  3.2. Влияние семакса на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс

Исследование влияния семакса проводились в структурах лобных долей (левая сторона) и в подкорке отдельно для каждого из двух транскриптов гена Cplx2. В таблицах 4 и 5 представлены результаты анализа экспрессии двух типов мРНК гена Cplx2 в мозге ишемизированных крыс, получавших семакс, в разное время после окклюзии сонных артерий: через 3 часа, через 24 часа и через 72 часа. В качестве контроля использовались данные, полученные от ишемизированных животных, которым вводился физраствор.

При этом статистически значимые результаты в лобной коре не были получены. Можно отметить лишь незначительное снижение экспрессии по сравнению с контрольным вариантом. В наибольшей степени по сравнению с остальными группами снижение уровня экспрессии отмечается через 72 часа после окклюзии сонных артерий (отношение уровня экспрессии гена у исследуемой группы к таковому у контрольной группы – 0,6). В подкорке значимого влияния семакса на экспрессию транскриптов Cplx2 не обнаружено. Наблюдается небольшое повышение количества транскриптов гена (в 1,3 раз) у 24-часовой группы, далее уровень экспрессии вновь снижается, почти сравниваясь с таковым у контрольной группы. При этом снова обнаруживается одинаковое влияние фактора (в данном случае семакса) на содержание обоих транскриптов гена Cplx2.

Таблица 4. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 в лобных долях коры головного мозга крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших семакс и PGP. Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у животных, получавших семакс или PGP, от уровня мРНК этого гена у ишемизированных животных, получавших физраствор. Данные представлены в виде R + SE, * – p < 0.05. Статистически значимые результаты дополнительно выделены жирным шрифтом.

Кора

24ч

72ч

Семакс

Cplx2_v1

0.9 ± 0.20

0.8 ± 0.36

0.6 ± 0.37

Cplx2_v2

0.9 ± 0.21

0.8 ± 0.28

0.6 ± 0.38

PGP

Cplx2_v1

1.0 ± 0.15

0.7 ± 0.25

0.2 ± 0.12*

Cplx2_v2

1.1 ± 0.16

0.6 ± 0.20

0.2 ± 0.12*


Таблица 5. Динамика изменений относительного содержания транскриптов гена Cplx2 в подкорке крыс, подвергнутых фокальной ишемии, получавших семакс и PGP. Числовое значение показывает, во сколько раз отличается уровень транскриптов гена у животных, получавших семакс или PGP, от уровня мРНК этого гена у ишемизированных животных, получавших физраствор. Данные представлены в виде R + SE.

Подкорка

3 ч

24 ч

72 ч

Семакс

Сplx2_v1

1.0 ± 0.47

1.3 ± 0.3

1.1 ± 0.18

Cplx2_v2

1.0 ± 0.43

1.3 ± 0.29

0.9 ± 0.24

PGP

Cplx2_v1

1.7 ± 0.62

1.4 ± 0.38

1.1 ± 0.25

Cplx2_v2

1.7 ± 0.58

1.3 ± 0.38

1.3 ± 0.34

     3.3. Влияние PGP на экспрессию гена Cplx2 в коре и подкорковых структурах головного мозга крыс   

Исследование влияния семакса проводились в структурах лобных долей (левая сторона) и в подкорке отдельно для каждого из двух транскриптов гена Cplx2. В таблицах 5 и 6 представлены результаты анализа экспрессии двух вариантов мРНК гена Cplx2 в мозге ишемизированных крыс, получавших PGP, в разное время после окклюзии сонных артерий: через 3, 24 и 72 часа. В качестве контроля использовались данные, полученные от ишемизированных животных, которым вводился физраствор.

При анализе результатов в коре отмечено постепенное снижение уровня содержания транскриптов гена Cplx2: через 3 часа каких-либо существенных изменений по сравнению с контрольным вариантом не обнаруживалось, но через сутки отношение количества мРНК гена Cplx2 у животных, получавших PGP, к таковому у ишемизированных животных, получавших физраствор, составляло 0,6 – 0,7. Через трое суток аналогичное соотношение составляло 0,2, что является статистически значимым результатом. При этом, как и в рассмотренных выше случаях, препарат одинаково влияет на характер изменений экспрессии изученных транскриптов: количество транскриптов Cplx2_v1 и Cplx2_v2 уменьшается примерно в одинаковое количество раз, хотя абсолютное количество транскриптов неодинаково.

В подкорковой области, напротив, количество транскриптов гена Cplx2 в условиях введения PGP увеличивается по сравнению с контрольной группой (и вновь относительное содержание обоих транскриптов изменяется приблизительно одинаково): через 3 часа после операции уровень содержания транскриптов гена Cplx2 у ишемизированных крыс, получавших PGP, составлял 1,7 относительно уровня содержания этих транскриптов у контрольных животных, через 24 часа – 1,4 и 1,3, а через 72 часа – 1,1 и 1,3 (для транскриптов Cplx2_v1 и Cplx2_v2 соответственно).

Если учесть, что при ишемии в коре головного мозга через 24 часа отмечалось значительное снижение, а через 72 часа – значительное повышение содержания транскриптов гена Cplx2 по сравнению с ложнооперированными животными, то влияние семакса и PGP, которые у исследуемых групп сначала очень незначительно  снижают уровень экспрессии гена Cplx2, а затем снижают его более резко по сравнению с уровнем экспрессии того же гена у ишемизированных животных, получавших физраствор (у них как раз содержание транскриптов гена по сравнению с нормой увеличивается), то влияние препаратов можно считать нормализующим.

В подкорке колебания уровня экспрессии гена не столь выражены как под влиянием ишемии, так и под влиянием препаратов. Однако и здесь прослеживается нормализующий эффект препаратов: если при ишемии в подкорке содержание транскриптов гена Cplx2 незначительно снижалось по сравнению с ложнооперированной группой, то при введении семакса и PGP оно несколько повышается по сравнению с группой животных с ишемией, получавших физраствор.
                Глава 4.
Обсуждение результатов

Церебральная ишемия является серьёзным повреждающим фактором, воздействующим на головной мозг. В тканях мозга немедленно нарушается нормальное протекание клеточных реакций из-за недостатка притока кислорода и глюкозы. Изменения на молекулярном и клеточном уровнях, такие как модификация клеточных рецепторов в результате реакций глутамат-кальциевого каскада, являются сигналом к экспрессии генов, обеспечивающих синтез веществ, которые участвуют как в деструктивных, так и в репарационных процессах. Эти сигналы передаются к ядру клетки при помощи вторичных мессенджеров. Анализ экспрессии генов в условиях экспериментальной церебральной ишемии помогает, с одной стороны, оценить, как работает генетический аппарат в условиях нарушения нормального протекания внутриклеточных процессов, а с другой стороны, выяснить, какую роль играет генетический аппарат в процессах деструкции и репарации. Изучение экспрессии генов при введении нейропротекторных препаратов ишемизированным животным позволяет исследовать реакцию генома животных на действие препаратов и оценивать их эффективность.

Для исследования процессов, происходящих в ишемизированной нервной ткани, используются экспериментальные модели ишемии. Существует несколько моделей экспериментальной ишемии мозга. Фокальная ишемия возникает при окклюзии отдельных сосудов мозга крысы (классический модельный объект для подобных исследований) и приводит к локальным нарушениям в определённых участках мозга. Глобальная церебральная ишемия вызывается окклюзией двух общих сонных и двух позвоночных артерий и приводит к обширным, тяжёлым и необратимым изменениям в головном мозге.

Нами была использована экспериментальная модель фокальной ишемии мозга крыс, поскольку окклюзия левой средней мозговой артерии более точно воспроизводит патологические процессы при инсульте [141]. Область ишемического повреждения в этом случае находилась в лобном участке коры (левая сторона). Для оценки влияния ишемии на экспрессию гена Cplx2 в качестве контроля использовались ложнооперированные животные. Это было сделано с целью исключения влияния оперативного вмешательства (повреждение тканей, наркоз, введение препаратов) на экспрессию.

Анализ относительного уровня содержания транскриптов гена Cplx2 проводился через 3 часа, 24 часа и 72 часа. По литературным данным [147], [148], уже через 3 часа после окклюзии в зоне ишемического повреждения появляются участки различной степени поражения. Клетки зоны повреждения находятся в состоянии ишемического шока: можно наблюдать характерное сморщивание нейронов и уплотнение ядер. Кроме того обнаруживаются первые признаки отёка. В это время включаются в работу гены раннего реагирования, к которым, вероятно, не относится Cplx2, о чём свидетельствует отсутствие значительных изменений содержания мРНК как в коре, так и в подкорке. Через 24 часа после операции (время максимального ответа) ядро ишемии окружено пенумброй, в области ядра наблюдаются некроз клеток, вакуолизация и отёк нейропиля (область локализации отростков нервных клеток), иначе говоря, вследствие ухудшения кровотока начинаются и прогрессируют серьёзные изменения на клеточном и тканевом уровнях. Через 72 часа в условиях данной модели в повреждённых тканях наблюдаются репарационные процессы.

Поскольку в развитии ишемического повреждения весьма существенную роль играет глутаматная эксайтотоксичность, обусловленная, в частности, избыточным высвобождением глутамата в составе синаптических пузырьков, а в процессе экзоцитоза непосредственное участие принимают комплексины, можно использовать анализ экспрессии гена Cplx2 в качестве одной из характеристик повреждающего воздействия ишемии на головной мозг, и эффективности лекарственной терапии.

При анализе результатов эксперимента было обнаружено, что через 24 часа после операции количество транскриптов гена в коре ишемизированных крыс резко снижалось: по отношению к контрольной группе (ложнооперированные животные) оно составляло менее чем 0,5 для обоих вариантов транскриптов, что является статистически значимым результатом. Через 72 часа аналогичное соотношение составляло 2,3 – 2,6, что свидетельствует о значительном повышении количества соответствующей мРНК по сравнению с контрольной группой. В подкорке колебания уровня мРНК гена Cplx2 по сравнению с контрольной группой были незначительными для обоих транскриптов, что, по-видимому, связано с тем, что подкорковая область в значительно меньшей степени поражена ишемией (областью поражения в данном эксперименте является левая лобная доля коры).

Семакс в коре головного мозга во всех трёх временных точках незначительно понижал уровень содержания транскриптов гена Cplx2 для обоих транскриптов, но для 3 и 24 часов это понижение не может считаться достоверным. Через 72 часа количество обоих транскриптов в коре у ишемизированных животных, которым вводился семакс, по отношению к контролькой группе (ишемизированные животные, которым вводился физраствор) составляло 0.6, что говорит о том, что препарат, вероятно, может в некоторой степени отсроченно смещать уровень экспрессии гена в коре головного мозга в сторону нормализации (учитывая повышение содержания транскриптов в 2.3 – 2.6 раз в коре ишемизированных животных по сравнению с ложнооперированными). Влияние семакса на экспрессию гена Cplx2 в подкорке оказалось ещё менее выраженным, чем в коре, что также согласуется с локализацией зоны ишемии.

PGP в целом понижает уровень мРНК гена Cplx2 в коре головного мозга ишемизированных крыс. Через 72 часа отношение содержания мРНК у ишемизированных крыс, которым вводился PGP, к содержанию мРНК у контрольной группы (крыс с ишемией, которым вводился физраствор) составляет 0.2, что является статистически значимым результатом. В подкорке PGP, напротив, несколько повышает содержание транскриптов гена Cplx2, особенно через 3 часа, когда отношение содержания транскриптов гена у исследуемой группы к содержанию транскриптов у контрольной группы составляет 1.7. В других временных точках это отношение уменьшается, через 72 часа оно минимально (1.1 – 1.3).

Следует подчеркнуть, что корреляция между количеством мРНК в клетке в какой-либо момент и уровнем экспрессии белка не всегда является прямой. Более низкий уровень содержания мРНК по сравнению с контролем может свидетельствовать как о снижении синтеза мРНК этого гена, так и о более значительной деградации мРНК, например, связанной с высокой скоростью трансляции и последующими процессами посттрансляционной деградации мРНК. В совокупности с неоднозначностью функций комплексинов делать глобальные и однозначные выводы о влиянии ишемии и препаратов на его экспрессию, ограничившись всего лишь сопоставлением уровня мРНК гена Cplx2 у исследуемой группы, с уровнем мРНК того же гена у контрольной группы, вряд ли корректно. Для этого необходимо знать не только колебания уровней мРНК, но и динамику изменений содержания белка. Также ещё предстоит узнать скорость оборота (turnover) как мРНК, так и белка CPLX2. Эти данные помогут правильно интерпретировать полученные результаты.

Эффектом применения препаратов может являться некоторое усиление экзоцитоза у клеток нервной ткани, которое сопровождается снижением мРНК гена Cplx2. Причём это может быть выброс как нейротрансмиттеров (не обязательно возбуждающих), так и других активных молекул, например, факторов роста. Положительное влияние семакса и PGP на экспрессию генов нейротрофинов подтверждено рядом исследований [149], [150]. В любом случае на отметке 72ч под влиянием препаратов очевидно смещение количества транскриптов гена Cplx2 в сторону сближения с контрольной группой. Особенно это заметно в коре и сильнее выражено при действии PGP, нежели семакса.

Как уже говорилось выше, ишемия, семакс и PGP одинаково влияют на характер изменений экспрессии обоих изученных транскриптов гена Cplx2. В нашем эксперименте оба альтернативных варианта ведут себя одинаково, таким образом, ишемия не влияет на предпочтительный выбор экспрессии того или иного транскрипта. Опираясь на полученные результаты, можно сделать предположение, позволяющее объяснить схожее поведение альтернативных транскриптов при существующем у них различии в абсолютном количестве. Клетка продуцент синтезирует оба транскрипта, в определенном соотношении. Например, на две молекулы Cplx2_v1 всегда приходится приблизительно одна молекулы Cplx2_v2. При этом любые изменения в экспрессии Cplx2 одинаково затрагивают оба варианта, с сохранением соотношения.
Так или иначе, одинаковый профиль экспрессии обоих транскриптов в рамках эксперимента указывает на их значительное функциональное сходство. В настоящее время неизвестно, какова функциональная значимость двух вариантов транскриптов гена
Cplx2. Можно лишь предположить, что как в некоторых известных случаях, такой механизм регуляции экспрессии генов может быть использован, прежде всего, для временного и пространственного контроля над синтезом белка.

Эффекты семакса и PGP при схожей направленности количественно существенно отличаются. В целом влияние PGP на экспрессию гена Cplx2 выражено сильнее, чем влияние семакса. Однако поскольку семакс деградирует с образованием PGP (в том числе и его метаболитов), эффекты семакса могут быть обусловлены эффектами концевого трипептида PGP.

        Выводы

1. Подготовлена панель образцов кДНК для анализа экспрессии генов в условиях экспериментальной ишемии головного мозга крыс и воздействия пептидов семакс и PGP.

2. Под воздействием ишемии относительное содержание транскриптов гена Cplx2 в коре головного мозга спустя сутки после окклюзии снижается в 2 раза. При этом влияния ишемии на содержание мРНК гена Cplx2 в подкорковых структурах не обнаружено.

3. В условиях фокальной ишемии оба исследуемых пептида вызывают снижение содержания мРНК гена Cplx2 в коре головного мозга крыс спустя 72 часа после окклюзии. Эффект PGP оказывается более выраженным, чем эффект семакса. Влияния препаратов в подкорке не наблюдается.

4. Не обнаружено различий в характере изменений экспрессии альтернативных транскриптов гена Cplx2 в условиях эксперимента.

                         Список литературы

1. Walsh G., Jefferis R. 2006. Post-translational modifications in the context of therapeutic proteins // Nat Biotechnol 24: 1241—1252.

2. Jensen O.N. 2006. Interpreting the protein language using proteomics // Nat Rev Mol Cell Biol 7: 391—403.

3. Ernst J., Kellis M. 2010. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome // Nat Biotechnol. 28(8):817-25.

4. Zhou V.W., Goren A., Bernstein B.E. 2011. Charting histone modifications and the functional organization of mammalian genomes // Nat Rev Genet. 12(1):7-18.

5. Guelen L., Pagie L., Brasset E., Meuleman W., Faza M.B., Talhout W., Eussen B.H., de Klein A., Wessels L., de Laat W., van Steensel B. 2008. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions // Nature. 453(7197):948-51.

6. Ryba T., Hiratani I., Lu J., Itoh M., Kulik M., Zhang J., Schulz T.C., Robins A.J., Dalton S., Gilbert D.M. 2010. Evolutionarily conserved replication timing profiles predict long-range chromatin interactions and distinguish closely related cell types // Genome Res. 20(6):761-70.

7. Прошкина Г.М, Шпаковский Г.В. 2003. Структура и функции транскрипционного аппарата эукариотической РНК-полимеразы III //

Успехи биологической химии, т. 43, с. 139—162

8. Патрушев Л.И., Минкевич И.Г. Проблема размера геномов эукариот. – Успехи  биологической химии, т. 47, 2007, с. 293–370.

9. http://humbio.ru/humbio/transcription/0003381d.htm

10. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. – М.: Наука, 2000. Глава 1, с. 25 – 58.

11. Guo H., Ingolia N.T., Weissman J.S., Bartel D.P. 2010. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels // Nature. 466(7308):835-40.

12. Khraiwesh B., Arif M.A., Seumel G.I., Ossowski S., Weigel D., Reski R., Frank W. 2010. Transcriptional control of gene expression by microRNAs // Cell. 140(1):111-22.

13. Bartel D.P. 2009. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions// Cell. 136(2):215-33.

14. Voinnet O. 2009. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs // Cell. 136(4):669-87.

15. Krol J., Loedige I., Filipowicz W. 2010. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay // Nat Rev Genet. (9):597-610.

16. Carthew R.W., Sontheimer E.J. 2009. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs// Cell.136(4):642-55.

17. Wu L., Belasco J.G. 2008. Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs // Mol Cell. 29(1):1-7.

18. Eulalio A., Huntzinger E., Izaurralde E. 2008. Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing // Cell.132(1):9-14.

19. Filipowicz W., Bhattacharyya S.N., Sonenberg N. 2008. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? // Nat Rev Genet. (2):102-14.

20. Huntzinger E., Izaurralde E. 2011. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay // Nat Rev Genet. 12(2):99-110.

21. Martin K.C., Kosik K.S. 2002. Synaptic tagging- who's it? // Nat Rev Neurosci. (10):813-20.

22. Raj A., van Oudenaarden A. 2008. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences // Cell. 135(2):216-26.

23. Lehner B. 2010. Conflict between noise and plasticity in yeast // PLoS Genet. 6(11):e1001185.

24. Raser J.M., O'Shea E.K. 2005. Noise in gene expression: origins, consequences, and control // Science. 309(5743):2010-3.

25. Blake W.J., Balázsi G., Kohanski M.A., Isaacs F.J., Murphy K.F., Kuang Y., Cantor C.R., Walt D.R., Collins J.J. 2006. Phenotypic consequences of promoter-mediated transcriptional noise// Mol Cell. 24(6):853-65.

26. Huh D., Paulsson J. 2011. Non-genetic heterogeneity from stochastic partitioning at cell division // Nat Genet. 43(2):95-100.

27. Maier T., Güell M., Serrano L. 2009. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples // FEBS Lett. 583(24):3966-73.

28. de Sousa Abreu R., Penalva L.O., Marcotte E.M., Vogel C. 2009. Global signatures of protein and mRNA expression levels // Mol Biosyst.(12):1512-26.

29. Schwanhäusser B., Busse D., Li N., Dittmar G., Schuchhardt J., Wolf J., Chen W., Selbach M. 2011. Global quantification of mammalian gene expression control // Nature. 473(7347):337-42.

30. Greenbaum D., Colangelo C., Williams K., Gerstein M. 2003. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale // Genome Biol. 4(9):117.

31. Jacewicz M., Kiessling ., Pulsinelli W.A. J Cereb Blood Flow Metab 1986; 6: 263 – 272.

32. Гусев Е.И., Скворцова В.И., «Ишемия головного мозга», Москва, «Медицина» 2001, Глава 1: стр. 18 – 23.

33. Fisher M., Takano K. In: Ballierie’s clinical neurology, cerebrovascular disease (Hachinski V. ed.), London 1995; 279 – 296.

34. Astrup J., Siesji B.K., Symon L. Stroke 1981; 12: 723 – 725.

35. Symon L., Bronston N.M., Strong A.J. et al. J Clin Pathol 1977; 30: 149 – 154.

36. Ginsberg M.D., Pulsinelli W.A. Ann Neurol 1994; 36: 553 – 554.

37. Heiss W.D., Rosner G. Ann Neurol 1983; 14; 294 – 301.

38. Kirino T., Sano K. Acta Neuropathol 1984; 62: 209 – 218.

39. Kirino T., Tamura A., Sano K. Acta Neuropathol 1984; 64: 139 – 147.

40. Pulsinelli W.A., Brierley J., Plum F. Ann Neurol 1982; 491 – 498.

41. Butcher S.P., Bullock R., Graham D.I. et al. Stroke 1990; 21: 1727 – 1733.

42. Heiss W.D., Graf R. Curr Opin Neurobiol 1994; 1: 11 – 19.

43. Ozyurt E. J Cereb Blood Flow Metab 1988; 8: 138 – 143.

44. Dirnagl U., Iadecola C., Moskowitz M. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view // Trends Neurosci. — 1999. — № 22. — С. 391-397.

45. Квитницкий-Рыжов Ю.Н. Современное учение об отёке и набухании головного мозга. — К.:: Здоров’я, 1988.

46. Мчедлишвили Г.И. Отёк головного мозга. — Тбилиси: «Мецниереба», 1986.

47. Черний В.И., Кардаш А.М., Городник Г.А., Дроботько В.Г. Диагностика и лечение отёка и набухания головного мозга. — К.:: Здоров’я, 1997. — С. 228.

48. Kuroda S., Siesjö B.K. Reperfusion damage following focal ischemia: pathophysiology and therapeutic windows  // Clin Neurosci. — 1997. — № 4. — С. 199-212.

49. Planas A.M., Gorina R., Chamorro A. Signalling pathways mediating inflammatory responses in brain ischaemia  // Biochem Soc Trans. — 2006. — № 34. — С. 1267-1270.

50. Евзельман М.А. Ишемический инсульт. Орёл, 2003.

51. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. 2001.

52. Garcia J.H., Yoshida Y., Chen H. et al. Am J Pathol 1993; 142: 623 – 635.

53. Клигуненко Е.Н., Дзяк Л.А., Площенко Ю.А., Емельянова Е.А., Зозуля О.А. Нейропротекция в анестезиологии и интенсивной терапии // Международный неврологический журнал, 2008, 2 (18).

54. Chen H., Chopp M., Chultz L. et al. J Neurol Sci 1993; 118: 106 – 109.

55. Clark R.K., Lee E.V., Fish C.J. et al. Brain Res Bull 1993; 31: 565 – 572.

56. Graeber M.D., Streit W.J. Brain Pathol 1990; 1: 2 – 5.

57. Wood P.L. Life Sci 1994; 55(9): 666 – 668.

58. Giulian D. Reactive microglia and ischemic injury. In: Primer on Cerebrovascular Dis eases (Welsh M., Caplan L., Siesjo В., Weir B. Reis D.J. eds.). San Diego, CA, Academic 1997; 117 – 124.

59. Banati R.B., Gehrmann S., Schubert P., Kreutzberg G.W. Glia 1993; 7: 111 – 118.

60. McGeer E.G., McGeer P.L. Neurodegeneration and the immune system. In: Neurodegenerative Diseases (Calne D.B. ed.). Philadelphia, Saunders, Harcourt, Brace & World 1994; 277 – 299.

61. McGeer P.L., Kawamala Т., Walker D.G. et al. Glia 1993; 7: 84 – 92.

62. Giulian D., Corpuz M., Chapman S. et al. J Neurosci Res 1993; 36: 681 – 693.

63. Morioka Т., Kalehua A.N., Streit W.J. J Comp Neurol 1993; 327: 123 – 132.

64. Боголепов Н.Н., Бурд Г.С. Материалы VII Всесоюзного съезда невропатологов и психиатров. - М., 1981; 2: 32 – 35.

65. Бурд Г.С. Дыхательная недостаточность у больных с острыми нарушениями мозгового кровообращения: Дисс. д-ра мед. наук. - М., 1983.

66. Garcia J.H., Liu K.F., Ho K.L. Stroke 1995; 26: 636 – 642.

67. Charriaut-Marlangue C., Margaill I., Plotkine M., Ben-Ari Y. J Cereb Blood Flow Metab 1995; 15: 385 – 388.

68. Charriaut-Marlangue C., Margaill I., Represa A. J Cereb Blood Flow Metab 1996; 16: 186 – 194.

69. Li Y., Chopp M., Jiang N. et al. J Cereb Blood Flow Metab 1995; 15: 389 – 397.

70. Linnik M.D., Zobrist R.H., Hatfield M.D. Stroke 1993; 24: 2002 – 2008.

71. Sadoul R., Dubois-Dauphin M., Fernandel P.A. et al. Adv Neurol 1996; 71: 419 – 424.

72. Chopp M., Li Y. Acta Neurochir 1996; 66: 21 – 26.

73. Garcia J.H., Liu K.F., Yoshida Y. Et al. Am J Pathol 1994; 145: 728 – 740.

74. Zhang F., White J.G., Iadecola C. J Cereb Blood Flow Metab 1994; 14: 217 – 226.

75. Zhang R.L., Chopp M., Chen H. et al. J Neural Sci 1994; 125: 3 – 10.

76. http://humbio.ru/humbio/ishemia/00068913.htm

77. Iadecola C. Mechanisms of cerebral Ischemic damage. In: Cerebral Ischemia (Wolfgang Walz ed.). New Jersey, Totowa, Humana Press 1999; 3 – 33.

78. Krupinski J., Kaluza J., Kumar P. et al. Lancet 1993; 342: 742.

79. Krupinski J., Kaluza J., Kumar P. et al. .KrupinskiJ., Kaluza J., Kumar P. et al. Stroke 1994; 25: 1794 – 1798.

80. Липская Л.А. Цитология 1994; 36 (3): 303 – 309.

81. Bennett M.R., Huxlin K.R. Gen Pharmacol 1996; 27: 407 – 419.

82. Morley P., Tauskela J.S., Hakim A.M. Cerebral Ischemia (Wolfgang Walz ed.). New Jersey, Totowa, Humana Press 1999; 69 – 105.

83. Nicotera P., Zhivotovsky B., Orrenius S. Cell Calcium 1994; 16: 279 – 288.

84. Siesjo B.-K. Eur Neurol 1986; 25 (1): 45 – 56.

85. Choi D.W. J Neurosci 1990; 10: 2493 – 2501.

86. Hansen A.J. Physiol Rev 1985; 65: 101 – 148.

87. Fujisawa F.F., Dawson D., Browne S.E. at al. Brain Res 1993; 629: 73 – 78.

88. Lazarewitcz J.W. Acta Neurobiol Exp (Warsz) 1996; 56 (1): 299 – 311.

89. Morley P., Hogan M.J., Hakim A.M. Brain Pathol 1994; 4: 37 – 47.

90. Schousboe A., Frandsen A., Wayl P. et al. Neurotoxicology 1994; 15: 477 – 481.

91. Carmell J., Curtis A.R., Kemp J.A. et al. Neurosci Lett 1993; 153: 107 – 110.

92. Littman L., Glati B.S., Robinson M.B. Neurochem 1993; 61: 586 – 593.

93. Schoepp D.D., Conn P.J. Trends Pharmacol Sci 1993; 14: 13 – 20.

94. Sheardown M.J., Suzdak P.D., Nordholm E. Eur J Pharmacol 1993; 236: 347 – 353.

95. Scheinberg P. Neurology 1991; 41: 1867 – 1873.

96. Mitani A., Yanase H., Sakai K. Et al. Brain Res 1993; 601: 103 – 110.

97. Siesjo B.-K., Bengrsson F. J Cereb Blood Flow Metab 1989; 9: 127 – 140.

98. Berridge M.J. Triangi 1985; 3 (4): 79 – 90.

99. Orrenius S., McCabe M.S., Nicotera P. Toxicol Lett 1992; 64: 357 – 364.

100. Abe K., Kogure K., Yamamoto H. et al. J Neurochem 1987; 48: 503 – 509.

101. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Журнал «Невропатология и психиатрия» 1996; 2: 111 – 114.

102. Суслина З.А. Ишемические нарушения мозгового кровообращения и система простаноидов (клинико-биохимические исследования): Дисс. д.м.н. – М., 1991; 331.

103. Packer L.L., Packer L., Prilipko Y., Cyirsten Y. Free radicals in the brain. Berlin 1992; 1 – 20.

104. Choi D.W. Proc nati Acad Sci USA 1993; 90: 9741.

105. Steng M., Greenberg M.E. 1990. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system // Neuron. 4: 477–85.

106. Koistinaho J., Hökfelt T. 1997. Altered gene expression in brain ischemia // Neuroreport. V.8(2):1–8.

107. Honkaniemi J., Sharp F.R. 1996. Global ischemia induces immediate-early genes encoding zinc finger transcription factors // J Cereb Blood Flow Metab. V.16(4):557–565.

108. Akins P.T., Liu P.H., Hsu C.Y. 1996. Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia. Friend or foe?// Stroke. V.27(9) :1682–1687.

109. Kinouchi H., Sharp F.R., Chan P.H., Koistinaho J., Sagar S.M., Yoshimoto T. 1994. Induction of c-fos, junB, c-jun, and hsp70 mRNA in cortex, thalamus, basal ganglia, and hippocampus following middle cerebral artery occlusion // J Cereb Blood Flow Metab. V.14(5).

110. Bergeron M., Yu A.Y., Solway K.E., Semenza G.L., Sharp F.R. 1999. Induction of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and its target genes following focal ischaemiain rat brain// Eur J Neurosci. (12):4159-70.

111. Bergeron M., Gidday J.M., Yu A.Y., Semenza G.L, Ferriero D.M., Sharp F.R. 2000. Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxia-induced ischemic tolerance in neonatal rat brain// Ann Neurol. 48(3):285-96.

112. Crosby M.E., Kulshreshtha R., Ivan M., Glazer P.M. 2009. MicroRNA regulation of DNA repair gene expression in hypoxic stress // Cancer Res. 69(3):1221-9. Erratum in: Cancer Res. 69(7):3240.

113. Xia X., Lemieux M.E., Li W., Carroll J.S., Brown M., Liu X.S., Kung A.L. 2009. Integrative analysis of HIF binding and transactivation reveals its role in maintaininghistone methylation homeostasis // Proc Natl Acad Sci USA. 106(11):4260-5.

114. Benjamin I.J., Horie S., Greenberg M.L., Alpern R.J., Williams R.S. 1992. Induction of stress proteins in cultured myogenic cells. Molecular signals for the activation of heat shock transcription factor during ischemia// The journal of clinical investigation. V.89(5):1685–1689.

115. Obrenovitch T.P. 2008. Molecular physiology of preconditioning-induced brain tolerance to ischemia // Physiol Rev. (1): 211-47.

116. Iadecola C., Zhang F., Xu X. 1995. Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates cerebral ischemic damage // Am J Physiol. V.268(2): 286–292.

117. Iadecola C. 1999. Mechanisms of cerebral ischemic damage. in Cerebral ischemia by Walz W. // Humana Press Totowa, New Jersey.

118. Moskowitz M.A., Lo E.H., Iadecola C. 2010. The science of stroke: mechanisms in search of treatments // Neuron. 67(2):181-98. Erratum in: Neuron. 2010 Oct 6;68(1):161.

119. Pabst S., Hazzard J.W., Antonin W., Südhof T.C., Jahn R., Rizo J., Fasshauer D. 2000. Selective interaction of complexin with the neuronal SNARE complex. Determinationof the binding regions // J Biol Chem. Jun 275(26):19808–19818.

120. Südhof T.C, Rothman J.E. 2009. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins // Science. 323(5913): 474–477.

121. Ishizuka T., Saisu H., Odani S., Abe T. 1995. Synaphin: a protein associated with the docking/fusion complex in presynaptic terminals // Biochem Biophys Res Commun 213 (3): 1107–1114.

122. Weninger K.R. 2011. Complexin arrests a neighbor // Nat Struct Mol Biol. 18(8):861–863.

123. Jorquera R.A., Huntwork-Rodriguez S., Akbergenova Y., Cho R.W., Littleton J.T. 2012. Complexin controls spontaneous and evoked neurotransmitter release by regulating and timing and properties of synaptotagmin activity // Journal of Neuroscience 32 (50): 18234–18245.

124. Hobson R.J., Liu Q., Watanabe S., Jorgensen E.M. 2011. Complexin maintains vesicles in the primed state in C. Elegans // Current Biology; 21 (2): 106–113.

125. Maximov A., Tang J., Yang X., Pang Z.P., Sudhof T.C. 2009. Complexin controls the force transfer from SNARE complexes to membranes in fusion // Science; 323 (5913): 516–521.

126. Raevskaya N.M., Dergunova L.V., Vladychenskaya I.P., Stavchansky V.V., Oborina M.V., Poltaraus A.B., Limborska S.A. 2005. Structural organization of the human complexin 2 gene(CPLX2) and aspects of its functional activity // Gene. 359:127–137.

127. An S.J., Grabner C.P., Zenisek D. 2010. Real-time visualization of complexin during single exocytic events// Nat Neurosci. V.13(5):577–83.

128. Hazell A.S., Wang D. 2011. Identification of complexin II in astrocytes: a possible regulator of glutamate release in these cells // Biochem Biophys Res Commun. 404(1):228–32

129. Hazell A.S. 2007. Excitotoxic mechanisms in stroke: an update of concepts andtreatment strategies. // Neurochem Int. 50(7–8):941–53.

130. Farooqui A.A., Ong W.Y., Horrocks L.A. 2008. Neurochemical Aspects of Excitotoxicity // Springer, New York, NY, USA, p168.

131. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. - М.: Медицина, 2001. - 328 с.

132. Ashmarin I.P., Nezavibat'ko V.N., Levitskaya N.G., Kamensky A.A. 1995. Desing and investigation of ACTH(4-10) analog deprived of D-aminoacids and hydrophobic radicals// Neurosci. Res. Commun. V.16:105–112.

133. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Чуканова Е.И. Семакс в профилактике прогрессирования и развития обострений у больных с дисциркуляторной энцефалопатией//Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2005, № 2.

134. Ашмарин И.П., Незавибатьков Н.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А. и др. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10 — Семакс (15-летний опыт разработки и изучения) //Журнал высшей нервной деятельности. 1997, т.47, с.419-425.

135. Hershkowitz M., Zwiers H., Gispen W.H. The effect of ACTH on rat brain

Synaptic plasma membrane lipid fluidity. Biochem Biophys Acta. 1982 Nov. 22; 692 (3): 495 – 497.

136. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH (4 – 10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study. Peptides. 1993. V. 14. №3. p. 491 – 495.

137. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. Регуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов PG, GP, PGP и GPGG и возможные источники их биосинтеза // Биохимия, 1998. т.63, вып.2, стр. 149 – 155.

138. Grivennikov I.A., Dolotov O.V., Gol'dina Iu.I. 1999. Peptide factors in processes of proliferation, differentiation, and extended viability of mammalian nervous system cells // Mol Biol (Mosk). V.33(1):120-126.

139. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Мясоедов Н.Ф. 2000. Изучение влияния семакса на Са2+-ответы нейтрофилов человека // Доклады академии наук. 374(3):401–403.

140. Bashkatova V.G., Koshelev V.B., Fadyukova O.E., Alexeev A.A., Vanin A.F., Rayevsky K.S., Ashmarin I.P., Armstrong D.M. 2001. Novel synthetic analogue of ACTH 4-10 (Semax) but not glycine prevents the enhanced nitric oxide generation in cerebral cortex of rats with incomplete global ischemia// Brain. Res. 894:145–149.

141. Povarova O.V., Garibova T.L., Kalenikova E.I., Galaeva I.P., Kraineva V.A., Medvedev O.S., Voronina T.A. Effect of phenyl-tert-butylnitrone, mexidol and nooglutil on the ischemic lesion zone and  memory in rats following middle cerebral artery occlusion // Eksp Klin Farmakol. 2004. V. 67(1). P. 3 – 6.

142. Hugget J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations // Genes Immun. 2005. V. 6(4). P. 279 – 284.

143. Bustin S. Absolute quantification of mRNA using real-time-reverse-transcription polymerase chain reaction assays. Journal of molecular endocrinology. 2000 V.25. P. 169 – 193.

144. Bustin S., Nolan T. Pitfalls of quantitative Real-Time-Reverse-transcription polymerase chain reaction. Journal of biomolecular techniques. 2004 V. 15. P. 155 – 166.

145. Pffafl M.W. A new mathematical model for relative quantitation in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001. V.29. N.9 P. 2002 – 2007.

146. Pffafl M., Horgan G., Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression result in real-time PCR. Nucleic Acids Research. 2002. V.30 N.9 P. 1 – 10.

147. Garcia J.H., Yoshida Y., Chen H., Li Y., Zhang Z.G., Lian J., Chen S., Chopp M. Progression from ishemic injury to infarct following middle cerebral arteryocclusion in the rat // Am J. Pathol. 1993. V. 142(2). P. 623 – 635.

148. Wishcamper C.A., Brooks D.M., Coffin J.D., Lurie D.I. Focal cerebral ischemia upregulates SHP-1 in reactive astrocytes in juvenile mic e// Brain Research. 2003. V. 974 P. 88 – 98.

149. Дмитриева В.Г., Дергунова Л.В., Поварова О.В., Скворцова В.И., Лимборская С.А., Мясоедов Н.Ф. 2008. Действие семакса и его С-концевого трипептида PGP на экспрессию генов факторов роста и их рецепторов в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс // Доклады академии наук. Т.422(2):258–261.

150. Stavchansky V.V., Yuzhakov V.V., Botsina A.Y., Skvortsova V.I., Bondurko L.N., Tsyganova M.G., Limborska S.A., Myasoedov N.F., Dergunova L.V. 2011. The еffect of Semax and its C-end peptide PGP on the morphology and proliferative activity of rat brain cells during experimental ischemia: a pilot study // J Mol Neurosci 45:177–185

PAGE  1


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

46183. Гимнастика женщин во второй половине беременности. Лечебная физкультура при язвенной болезни. Упражнения при остеохондрозе 70 KB
  Исходное положение: основная стойка руки на поясе. Исходное положение: основная стойка руки на поясе. Исходное положение: основная стойка руки на поясе. Исходное положение: стоя ноги на ширине плеч руки у груди согнуты в локтях.
46184. Социальная педагогика как наука и общественная практика 62 KB
  Вывод: Закономерности развития социальной педагогики как науки лежат в сфере гуманитарных и социальных наук а также в реальной практике общественной и культурной жизни что и можно назвать истоками развития. Нужно отметить что социальная педагогика возникает в недрах экономиче ской культурной идеологической сфер жизни. Вывод: Источниками дальнейшего развития социальной педагогики можно назвать определённые сферы практической жизни и области знаний. В практике социальной жизни т.
46185. Автоматизация холодильных компрессорных станций 222.5 KB
  По уровню автоматизации компрессорные холодильные установки занимает одно из ведущих мест среди других отраслей промышленности. Холодильные установки характеризуются непрерывностью протекающих в них процессов. При этом выработка холода в любой момент времени должна соответствовать потреблению (нагрузке).
46186. МОДЕЛИРОВАНИЕ СИСТЕМ 667.5 KB
  Формализуемые решения Литература Основы моделирования систем Модели и моделирование Модель и моделирование универсальные понятия атрибуты одного из наиболее мощных методов познания в любой профессиональной области познания системы процесса явления.
46187. Изучение явления сухого трения 51.5 KB
  Цель работы: Экспериментальное изучение закономерностей сухого трения; Научиться измерять и вычислять коэффициент трения скольжения и покоя различными способами. Определение коэффициента трения скольжения. Вид вещества Сила упругости F Н Масса бруска mкг Деформация пружины x м Перемещение бруска м Коэффициент трения S1 S2 S3 S4 Экс.
46188. Автострахование в России. Основные проблемы 178.5 KB
  Основные проблемы История страхования в России Досоветский период Эпоха великих реформ Александра II 60е-70е гг. Часть страхового поля включавшая в себя надежные в пожарном отношении объекты застрахования была в значительной мере уже освоена 1м 2м обществами и Саламандрой . Перспективы страхования новых фабрик и их складских помещений были неясны. Было решено подыскать специалиста досконально знакомого с тонкостями огневого страхования и способного предложить программу выхода из нелегкого положения.
46189. ОРГАНИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА НА ПРЕДПРИЯТИЯХ МАШИНОСТРОЕНИЯ 129.5 KB
  Показатели Вариант 9 Обработка резанием Расход металла кг 26 Стоимость 1 кг металла 60 Основная заработная плата рабочих руб. 112 Дополнительная заработная плата 10 Единый социальный налог 26 Расходы по работе оборудования руб. год 1200 Прочие постоянные расходы руб год 1000 Штамповка Расход металла кг 5 Стоимость 1 кг металла 66 Основная заработная плата рабочих руб. шт 4 Дополнительная заработная плата 10 Единый социальный налог 26 Расходы по работе оборудования руб.
46190. Особенности механизма образования цен в строительстве 250 KB
  Капитальный ремонт зданий и сооружений – работы по восстановлению или замене отдельных частей зданий сооружений или целых конструкций деталей и инженерно технического оборудования в связи с их техническим износом и разрушением на более долговечные и экономичные улучшающие их эксплуатационные показатели. Действующая методическая и сметнонормативная база позволяет определить стоимость строительства на всех стадиях разработки предпроектной и проектносметной документации. время работы строительных машин и механизмов маш. Главной функцией...
46191. Решение систем линейных дифференциальных уравнений матричным методом 78 KB
  Часто в физике при решении определенных задач приходится сталкиваться с системами из 3 или 4 линейных дифференциальных уравнений. При решений таких систем удобно использовать матричный метод решения систем линейных дифференциальных уравнений. Часто матрица коэффициентов этих систем уравнений имеет симметричный вид.