23440

Строение и химия клеточного ядра. Клеточная биология

Книга

Биология и генетика

Структура и химия хроматина ДНК хроматина Репликация эукариотических ДНК Основные белки хроматина – гистоны Функциональные свойства гистонов Первый уровень компактизации ДНК. Структурная роль нуклеосом Нуклеосомы при репликации и транскрипции Второй уровень компактизации ДНК – 30 нм фибрилла Негистоновые белки Петлевые домены ДНК – третий уровень структурной организации хроматина ГЛАВА 6. Ядерный белковый матрикс Общий состав ядерного матрикса ДНК ядерного белкового матрикса ГЛАВА 7. Клетки увеличиваются в числе путем деления исходной клетки...

Русский

2013-08-05

1.68 MB

35 чел.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие.

ЧАСТЬ I. Введение. Предмет клеточной биологии

ГЛАВА 1. Клеточная теория

Клетка – элементарная единица живого

Клетка – единая система сопряженных функциональных единиц

Гомологичность клеток

Клетка от клетки

Клетка и многоклеточный организм

Тотипотентность клеток

ГЛАВА 2. Методы цитологии

Световая микроскопия

Витальное (прижизненное) изучение клеток

Изучение фиксированных клеток

Электронная микроскопия

  •  конрастирование корпускулярных объектов
  •  ультрамикроскопия
  •  другие специальные методы электронной микроскопии биологических объектов

Фракционирование клеток

ЧАСТЬ II. Строение и химия клеточного ядра

ГЛАВА 3. Центральная догма молекулярной биологии

ГЛАВА 4. Морфология ядерных структур

Роль ядерных структур в жизнедеятельности клетки

Ядерные компоненты прокариот

Ядро эукариотических клеток

Эухроматин и гетерохроматин

Хромосомный цикл

Общая морфология митотических хромосом

Клеточный цикл эукариот

Эндорепродукция и полиплоидия

Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре

ГЛАВА 5. Структура и химия хроматина

ДНК хроматина

Репликация эукариотических ДНК

Основные белки хроматина – гистоны

Функциональные свойства гистонов

Первый уровень компактизации ДНК. Структурная роль нуклеосом

Нуклеосомы при репликации и транскрипции

Второй уровень компактизации ДНК – 30 нм фибрилла

Негистоновые белки

Петлевые домены ДНК – третий уровень структурной организации хроматина

ГЛАВА 6. Ядерный белковый матрикс

Общий состав ядерного матрикса

ДНК ядерного белкового матрикса

ГЛАВА 7. Четвертый – хромонемный уровень упаковки хроматина

Общая организация митотических хромосом

ЧАСТЬ III. Ядерные транскрипты и их транспорт

ГЛАВА 8. Ядрышко – источник рибосом

Строение рибосом

Чем определяется число ядрышек в клетке

Множественность рибосомных генов

Амплифицированные ядрышки

Строение и функционирование генов рРНК

Структура ядрышка

Фибриллярный центр и ядрышковый организатор

Структурные типы ядрышек

Белки ядрышка

Общая схема работы ядрышка как специального локуса синтеза рибосом

Новые, неканонические функции ядрышек

Ядрышко во время митоза: периферический хромосомный материал

ГЛАВА 9. Нерибосомные продукты ядра

Транскрипция нерибосомных генов

Морфология РНП-компонентов ядра

Синтез РНК в пуфах политенных хромосом

Транскрипция на мейотических хромосомах

Морфология транскрипции индивидуальных генов

Синтез транспортных РНК

ГЛАВА 10. Ядерная оболочка

Компоненты ядерной оболочки

Роль ядерной оболочки в ядерно-цитоплазматическом обмене

Импорт кариофильных белков

Экспорт из ядра в цитоплазму

Динамика ядерной оболочки в митозе

ЧАСТЬ IV. Цитоплазма

ГЛАВА 11. Гиалоплазма и органеллы

ГЛАВА 12. Общие свойства биологических мембран

Структурной основой мембран является двойной слой липидов

Мембранные белки встроены в билипидный слой

Липиды и белки мембран обладают латеральной подвижностью

Клеточные мембраны асимметричны

Разные мембраны имеют различные свойства

Мембраны ассоциированы с цитоплазматическими белками

Рост мембран цитоплазмы происходит за счет встраивания готовых мембранных пузырьков

ГЛАВА 13. Плазматическая мембрана

Барьерно-транспортная роль плазмолеммы

Трансмембранный перенос ионов и низкомолекулярных соединений

Везикулярный перенос: эндоцитоз и экзоцитоз

Рецепторная роль плазмолеммы

Межклеточное узнавание

Специальные межклеточные соединения (контакты)

Клеточная стенка (оболочка) растений

Клеточные оболочки бактерий

ГЛАВА 14. Вакуолярная система внутриклеточного транспорта

Общая схема функционирования вакуолярной системы

Гранулярный эндоплазматический ретикулум

Котрансляционный транспорт растворимых белков

Транспорт нерастворимых (мембранных) белков

Синтез клеточных мембран

Транспорт между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи

ГЛАВА 15. Аппарат Гольджи

Тонкое строение аппарата Гольджи

Секреторная функция аппарата Гольджи

Модификации белков в аппарате Гольджи

Сортировка белков в аппарате Гольджи

ГЛАВА 16. Лизосомы

Общие характеристики лизосом

Морфологическая неоднородность лизосом

Лизосомные патологии

ГЛАВА 17. Гладкий ретикулум и другие мембранные вакуоли

Гладкий (агранулярный) эндоплазматический ретикулум

Вакуоли растительных клеток

Сферосомы

Пероксисомы (микротельца)

Секреция белков и образование мембран у бактерий

ЧАСТЬ V. Цитоплазма: системы энергообеспечения клетки

ГЛАВА 18. Митохондрии – строение и функции

Общая морфология

Ультраструктура митохондрий

Функции митохондрий

Окислительное фосфорилирование у бактерий

Увеличение числа митохондрий

Авторепродукция митохондрий

Хондриом

ГЛАВА 19. Пластиды

Хлоропласт

Функции хлоропластов

Онтогенез и функциональные перестройки пластид

Фотосинтезирующие структуры низших эукариотических и прокариотических клеток

Геном пластид

ЧАСТЬ VI. Цитоплазма: опорно-двигательная система (цитоскелет)

ГЛАВА 20. Промежуточные филаменты

ГЛАВА 21. Микрофиламенты

Общие свойства микрофиламентов

Акто-миозиновые компоненты немышечных клеток

Мышечные клетки

ГЛАВА 22. Микротрубочки

Общая характеристика микротрубочек

Центры организации микротрубочек

Динеины и кинезины – моторные белки

ГЛАВА 23. Клеточный центр

Центросомы и центриоли

Центросомный цикл

Базальные тельца, строение и движение ресничек и жгутиков

Двигательный аппарат бактерий

ЧАСТЬ VII. Механизмы клеточного деления

ГЛАВА 24. Митотическое деление клеток

Общая организация митоза

Различные типы митоза эукариот

Морфология митотической фигуры

Центромеры и кинетохор

Динамика митоза

Самоорганизация системы микротрубочек

Митоз растительной клетки

Деление бактериальных клеток

ГЛАВА 25. Мейоз

Особенности профазы I мейотического деления

Стадия профазы I мейотического деления

ГЛАВА 26. Регуляция клеточного цикла

Фактор стимуляции митозов

Циклины

Регуляция клеточного деления у млекопитающих

Контрольные точки клеточного цикла

ГЛАВА 27. Гибель клеток: некроз и апоптоз

Некроз

Апоптоз

  

Ю.С. Ченцов

ВВЕДЕНИЕ В КЛЕТОЧНУЮ БИОЛОГИЮ.

ОБЩАЯ ЦИТОЛОГИЯ.

ПРЕДИСЛОВИЕ

Данный учебник «Введение в клеточную биологию» является продолжением предыдущей книги под названием «Общая цитология», 3е издание 1995 г.

За последние 50 лет произошло значительное развитие биологической науки, как бы ее вторая революция, если за первую считать времена после 1953 года. За это время гигантский шаг вперед сделала молекулярная биология и  молекулярная генетика, клеточная и молекулярная инженерия, что позволило внедрить в практику, в промышленность многие, казалось бы, чисто теоретические разработки в различных областях современной биологии. Резкое расширение интересов исследователей и развитие многих принципиально новых методических подходов привело к накоплению за последние годы множества новых фактов и представлений, касающихся практически всех аспектов биологии клетки, как в изучении ее строения, так и в молекулярной и генетической ее организации. Поэтому чисто структурные, «цитологические» по представлению некоторых авторов, уровни изучения клетки как таковой уже просто невозможны, хотя бы потому, что невозможно оторвать структуру от функции. Следовательно и обучение студентов данному предмету должно также строиться на структурно-функциональном подходе в изучении клетки. Все это вызвало необходимость при новом издании учебника использовать название «Введение в клеточную биологию», ставя на второе место термин «цитология»», как устаревший или архаичный. Хотя сам термин «Клеточная биология» был применен впервые в названии книги Ж-Б. Карнуа еще в 1884 году.

В настоящем издании учебника, которое является кратким изложением курса «Общей цитологии», читаемого автором на биологическом факультете Московского Университета им. М.В. Ломоносова уже более 30 лет, сделаны значительные изменения, как, в первую очередь, в обновлении, дополнении и введении новой информации, так и в последовательности изложения материала. Здесь используется системный подход в анализе различных клеточных компонентов, что позволяет рассматривать их не в отрыве друг от друга, а в целостной совокупности, в элементарной единице живого – в клетке. Значительно расширен и обновлен материал о клеточном ядре, о мембранной вакуолярной системе, о цитоскелете, о клеточном делении, введены новые главы о регуляции клеточного цикла, о формах клеточной гибели (некроз и апоптоз) и многое другое.

Одна из особенностей этого учебника та, что курс «Общая цитология» читается студентам на первом курсе. Такое расположение курса цитологии в учебном плане студентов имеет свои преимущества и свои недостатки. Из недостатков главным, на наш взгляд, является то, что дать в достаточно полной мере сведения о строении клеток и о функциях ее компонентов очень трудно и сложно без привлечения материалов из смежных дисциплин, таких, как биохимия, биофизика, молекулярная биология. Студент же на первых курсах по современным учебным планам изучает сначала «общие» дисциплины: зоологию, ботанику, химию, физику, математику. Конечно было бы легче преподавателю читать курс цитологии после того, как студенты изучат эти общие дисциплины, а в добавок к тому и биохимию, и генетику и др. Но нам представляется невозможным изучение тонких физиологических отправлений организмов и клеток без знаний элементов их организации. Поэтому было решено идти на компромисс, давая в курсе краткие экскурсы в биохимию и молекулярную биологию. Эти вводные ознакомления, как нам представляется, не так трудны для студентов-биологов, так как они в основном укладываются в программу средней школы, и, кроме того, при сдаче конкурсных экзаменов школьники читают достаточно много дополнительной литературы (во всяком случае многие из них поражают обилием и глубиной знаний на вступительных экзаменах).

Другой особенностью курса является то, что он дает сведения о строении и функционировании клеток разного происхождения: бактерии, растения, животные. Это важно, так как будущие зоологи, ботаники, микробиологи и вирусологи, не говоря уже о биохимиках и биофизиках, должны знать клетку во всех ее формах и знать главные закономерности, являющиеся общими для клеток вне зависимости от их органного, тканевого или видового происхождения. Поэтому  и в учебнике постоянно делаются сравнения строения разных клеток, прокариотических и эукариотических.

Представляется важным в курсе клеточной биологии давать не только объем конкретных знаний, но показывать  как эти знания были получены. Поэтому часто в описании клеточных структур и их свойств введены описания экспериментов и методических приемов  современной науки и основных методов современной клеточной биологии. Это делать необходимо потому, что нередко именно новые методические приемы и разработки могут быть основанием для развития новых направлений в изучении клетки.

В материалы этого издания внесен ряд дополнений по сравнению с предыдущим изданием. За  прошедшие годы накопилось множество новых сведений о хроматине и хромосомах, о мембранах клетки, о цитоскелетных структурах и др. Это отражает бурное развитие работ по изучению клетки на самых разных уровнях, начиная с оптического, кончая молекулярным. Введение в учебник последних достижений науки не всегда оправдано, так как часто на основании новых фактов предлагаются гипотезы и теории, которые иногда не оправдываются, а полученные факты приобретают впоследствии иное объяснение. Все же ознакомление студентов с новинками науки крайне необходимо для того, чтобы они знали, чем живет наука в данный момент, какие»горячие точки» в ней привлекают внимание исследователей.

В заключение автор выражает большую благодарность своим коллегам кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ и Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, а также других кафедр и учреждений за помощь в работе над данным изданием, советы и критику: профессорам В.Ю. Полякову, Г.Е. Онищенко, И.А. Воробьеву и докторам биологических наук О.В. Зацепиной, Е.С. Надеждиной

Часть I. Введение. Предмет клеточной биологии

Цитология (от греч. kytos – ячейка, клетка) – наука о клетке, в современном звучании - биологии клетки – наука довольно молодая. Из среды других биологических наук она выделилась почти сто лет назад. Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книге Ж-Б. Карнау «Биология клетки», вышедшей в 1884 г.

За последние 50 лет цитология из описательно-морфологической превратилась в экспериментальную науку, ставящую перед собой задачи изучения физиологии клетки, ее основных жизненных функций и свойств, ее биологии. Другими словами, современная цитология – это физиология клетки. Возможность такого переключения интересов исследователей возникла в связи с тем, что цитология тесно сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генетики. Это послужило основанием для углубленного изучения клетки как таковой, для изучения ее общих свойств и функционирования уже с позиций этих наук, что и дало снование для появления некой синтетической науки о клетке, а именно биологии клетки или, как чаще называют, клеточной биологии. В этой науке плодотворно сочетаются как морфологические, так и молекулярно-биологические подходы, что позволяет в настоящее время считать, что термины цитология и биология клетки совпадают, т.к. их предметом изучения является клетка, имеющая свои собственные закономерности организации и функционирования.

Дисциплина «Биология клетки» относится к фундаментальным разделам биологии, т.к. она исследует и описывает единственную единицу всего живого на Земле – клетку. Познание клетки имеет важнейшее значение для развития множества других биологических наук, таких как физиология, генетика, молекулярная биология и др., т.к. дает им как бы субстрат, материал для изучения отдельных свойств именно клеток: все функциональные отправления организмов имеют клеточную основу. Огромное значение современная цитология или биология клетки, имеет для медицины, так как любые заболевания человеческого организма своей основой имеют патологию конкретных клеток или их групп, что важно для понимания развития болезни, для ее диагностики и для выбора методов лечения и профилактики заболевания. Длительное и пристальное изучение клетки как таковой привело к формулированию важного теоретического обобщения, формулированию так называемой клеточной теории, имеющей огромное общебиологическое значение.

Глава 1. Клеточная теория

Клеточная теория – это обобщенные представления о строении клеток как единиц живого, об их размножении и роли в формировании многоклеточных организмов.

Появлению и формулированию отдельных положений клеточной теории предшествовал довольно длительный (более трехсот лет) период накопления наблюдений над строением различных одноклеточных и многоклеточных организмов растений и животных. Этот период был связан с развитием применения и усовершенствования различных оптических методов исследований.

Роберт Гук (1665) первым наблюдал с помощью увеличительных линз подразделение тканей пробки на «ячейки», или «клетки». Его описания послужили толчком для появления систематических исследований анатомии растений (Мальпиги, 1671; Грю, 1671), которые подтвердили наблюдения Роберта Гука и показали, что разнообразные части растений состоят из тесно расположенных «пузырьков», или «мешочков». Позднее А. Левенгук (1680) открыл мир одноклеточных организмов и впервые увидел клетки животных (эритроциты). Позднее клетки животных были описаны Ф. Фонтана (1781); но эти и другие многочисленные исследования не привели в то время к пониманию универсальности клеточного строения, к четким представлениям о том, что же являет собой клетка. Прогресс в изучении микроанатомии и клетки связан с развитие микроскопирования в XIX в. К этому времени изменились представления о строении клеток: главным в организации клетки стала считаться не клеточная стенка, а собственно ее содержимое, протоплазма (Пуркиня, 1830). В протоплазме был открыт постоянный компонент клетки – ядро (Браун, 1833). Все эти многочисленные наблюдения позволили Т. Шванну в 1838 г. сделать ряд обобщений. Он показал, что клетки растений и животных принципиально сходны между собой (гомологичны). «Заслуга Т. Шванна заключалась не в том, что он открыл клетки как таковые, а в том, что он научил исследователей понимать их значение»(Вальдейер, 1909). Дальнейшее развитие эти представления получили в работах Р. Вирхова (1858). Создание клеточной теории стало важнейшим событием в биологии, одним из решающих доказательств единства всей живой природы. Клеточная теория оказала значительное влияние на развитие биологии, послужили главным фундаментом для развития таких дисциплин, как эмбриология, гистология и физиология. Она дала основы для понимания жизни, для объяснения родственной взаимосвязи организмов, для понимания индивидуального развития.

Основные положения клеточной теории сохранили свое значение и на сегодняшний день, хотя более чем за сто пятьдесят лет были получены новые сведения о структуре, жизнедеятельности и развитии клеток. В настоящее время клеточная теория постулирует:

  1.  Клетка – элементарная единица живого: – вне клетки нет жизни.
  2.   Клетка – единая система, состоящая из множества закономерно связанных друг с другом элементов, представляющих собой определенное целостное образование, состоящее из сопряженных функциональных единиц – органелл или органоидов.
  3.  Клетки сходны – гомологичны – по строению и по основным свойствам.
  4.  Клетки увеличиваются в числе путем деления исходной клетки после удвоения ее генетического материала (ДНК): клетка от клетки.
  5.  Многоклеточный организм представляет собой новую систему, сложный ансамбль из множества клеток, объединенных и интегрированных в системы тканей и органов, связанных друг с другом с помощью химических факторов, гуморальных и нервных (молекулярная регуляция).
  6.  Клетки многоклеточных организмов тотипотентны, т.е. обладают генетическими потенциями всех клеток данного организма, равнозначны по генетической информации, но отличаются друг от друга разной экспрессией (работой) различных генов, что приводит к их морфологическому и функциональному разнообразию – к дифференцировке.

1. Клетка – элементарная единица живого

Представление о клетке как о самостоятельной жизнедеятельной единице было дано еще в работах Т. Шванна. Р. Вирхов также считал, что каждая клетка несет в себе полную характеристику жизни: «Клетка есть последний морфологический элемент всех живых тел, и мы не имеем права искать настоящей жизнедеятельности вне ее» (1858).

Современная наука полностью доказала это положение. В популярной литературе клетку часто называют «атомом жизни», «квантом жизни», подчеркивая тем самым, что клетка – это наименьшая единица живого, вне которой нет жизни.

Такая общая характеристика клетки должна в свою очередь опираться на определение живого – что такое живое, что такое жизнь. Очень трудно дать окончательное определение живого, жизни.

М.В. Волькенштейн (1965) дает следующее определение жизни: «живые организмы представляют собой открытые (т.е. обменивающиеся с окружающей средой веществом и энергией), саморегулирующиеся и самовоспроизводящиеся системы, важнейшими функционирующими веществами которых являются белки и нуклеиновые кислоты». Живому свойствен ряд совокупных признаков, таких, как способность к воспроизведению (репродукции), использование и трансформация энергии, метаболизм, чувствительность, изменчивость. И такую совокупность этих признаков можно обнаружить на клеточном уровне. Нет меньшей единицы живого, чем клетка. Мы можем выделить из клетки отдельные ее компоненты или даже молекулы и убедиться, что многие из них обладают специфическими функциональными особенностями. Так, выделенные актомиозиновые фибриллы могут сокращаться в ответ на добавление АТФ; вне клетки прекрасно «работают» многие ферменты, участвующие в синтезе или распаде сложных биоорганических молекул; выделенные рибосомы в присутствии необходимых факторов могут синтезировать белок, разработаны неклеточные системы ферментативного синтеза нуклеиновых кислот и т.д. Можно ли считать все эти клеточные компоненты, структуры, ферменты, молекулы живыми? Можно ли считать живым актомиозиновый комплекс? Думается, что нет, хотя бы потому, что он обладает лишь частью набора свойств живого. То же относится и к остальным примерам. Только клетка как таковая является наименьшей единицей, обладающей всеми вместе взятыми свойствами, отвечающими определению «живое».

Что же такое клетка, какое ей можно дать общее определение? Из школьного курса известно, что разнообразные клетки имеют совершенно несходную морфологию, их внешний вид и величины значительно расходятся.  Действительно, что общего между звездчатой формой некоторых нервных клеток, шаровидной формой лейкоцита и трубкообразной формой клетки эндотелия. Такое же разнообразие форм встречается и среди микроорганизмов. Поэтому мы должны находить общность живых объектов не в их внешней форме, а в общности их внутренней организации.

Среди живых организмов встречаются два типа организации клеток. К наиболее простому типу строения можно отнести клетки бактерий и синезеленых водорослей, к более высокоорганизованному – клетки всех остальных живых существ, начиная от низших растений и кончая человеком.

Принято называть клетки бактерий и синезеленых водорослей прокариотическими (доядерными клетками), а клетки всех остальных представителей живого – эукариотическими (собственно ядерными), потому что у последних обязательной структурой служит клеточное ядро, отделенное от цитоплазмы ядерной оболочкой.

Содержимое прокариотической клетки одето плазматической мембраной, играющей роль активного барьера между собственно цитоплазмой клетки и внешней средой (рис. 1, 2). Обычно снаружи от плазматической мембраны расположена клеточная стенка или оболочка – продукт клеточной активности. У прокариотических клеток нет морфологически выраженного ядра, но присутствует в виде так называемого нуклеоида зона, заполненная ДНК.

В основном веществе (или матриксе) цитоплазмы прокариотических клеток располагаются многочисленные рибосомы, цитоплазматические же мембраны обычно выражены не так сильно, как у эукариотических клеток, хотя некоторые виды бактерий (например, фототрофные пурпурные бактерии) богаты внутриклеточными мембранными системами. Очень сильно цитоплазматические мембраны развиты у синезеленых водорослей. Обычно все внутриклеточные мембранные системы прокариот развиваются за счет плазматической мембраны.

Но не только присутствие морфологически –выраженного ядра является отличительным признаком эукариотических клеток. У клеток высшего типа (эукариотических) кроме ядра в цитоплазме существует целый набор специальных обязательных структур, органелл, выполняющих отдельные специфические функции (рис. 3, 4). К числу органелл относят мембранные структуры: систему эндоплазматической сети (ретикулума), аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии, пластиды (для клеток растений). Кроме того, для эукариотических клеток характерно наличие мембранных структур, таких как микротрубочки, микрофиламенты, центриоли (для клеток животных) и др.

Эукариотические клетки обычно намного крупнее прокариотических. Так, палочковидные бактерии имеют длину до 5 мкм, а толщину  около 1 мкм, в то время как эукариотические клетки в поперечнике могут достигать десятков мкм.

Несмотря на четкие морфологические отличия, и прокариотические и эукариотические клетки имеют много общего, что и позволяет отнести их к одной, клеточной, системе организации живого. И те и другие одеты плазматической мембраной, обладающей сходной  функцией активного переноса веществ из  клетки и внутрь ее; синтез белка у них происходит на рибосомах; сходны и другие процессы, такие, как синтез РНК и репликация ДНК, похожи и биоэнергетические процессы. Исходя из вышесказанного клетке можно дать общее определение. Клетка – это ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурированная система  биополимеров (белков, нуклеиновых кислот) и их макромолекулярных комплексов, участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом.

Короче: клетка – самоподдерживающаяся и самовоспроизводящаяся система биополимеров. Это определение дает описание основных свойств «живого» – воспроизведение подобного себе из неподобного себе.

У многоклеточных организмов часть клеток утрачивает свойство размножаться, но они остаются клетками до тех пор, пока способны вести  синтетические процессы, регулировать транспорт веществ межу клеткой и средой, использовать для этих процессов энергию. Есть примеры безъядерных  клеток (эритроциты и тромбоциты млекопитающих, некоторые мышечные клетки моллюсков), это скорее не собственно клетки, а их остатки – одетые мембраной участки цитоплазмы с ограниченными функциональными потенциями.

Одно время первый постулат клеточной теории подвергался многочисленным нападкам и критике. Некоторые авторы указывали, что в многоклеточных организмах, особенно у животных, кроме клеток существуют и межклеточные, промежуточные вещества, которые тоже, казалось обладали свойствами живого. Однако было показано, что межклеточные вещества (основное вещество и волокна соединительной ткани) представляют собой не самостоятельные образования, а продукты активности отдельных групп клеток.

Другие возражения касались того, что часто у животных кроме отдельных клеток встречаются так называемые симпласты и синцитии (соклетия), а у растительных клеток – плазмодии. По морфологическому описанию – это крупные цитоплазматические образования со множеством ядер, не разделенные на отдельные клеточные территории. Примерами таких симпластов могут быть мышечные волокна позвоночных или эпидермис у ленточных червей, а также плазмодии у низших грибов миксомицетов. Однако если проследить за развитием таких «неклеточных» форм, то легко убедиться в том, что они возникают вторично за счет слияния отдельных клеток или же в результате деления одних ядер без разделения  цитоплазмы, т.е. без цитотомии.

2. Клетка – единая система сопряженных функциональных единиц

В начале нашего изложения в согласии с клеточной теорией  мы обсуждали первый ее постулат: клетка – наименьшая единица живого. Однако мы  знаем о сложности строения этой «единицы», которая состоит, содержит в себе множество типов внутриклеточных структур, выполняющих разнообразные функции. При этом каждый компонент «специализирован» на выполнение одной собственной группы функций, и другие компоненты не могут работать «по совместительству», не могут принять на себя основные функции других внутриклеточных структур. Важно отметить, что каждая из функций является обязательной, без выполнения которой клетка не может существовать. Все это в значительной степени напоминает многоклеточный организм, который также является особой живой системой, обеспечивающей свое собственное существование и воспроизведение. Все тело организма может быть подразделено на ряд подсистем или систем, обеспечивающих отправление целого ряда организменных функций: пищеварительная, выделительная, мышечная, нервная, половая система и др. И эти функции выполняются отдельными или рядом органов: кишечник, почки, мозг и т.д. И в данном примере эти системы в основном монофункциональны и незаменимы. В общей системе организма как целого, все они играют главные, а не подчиненные роли. Жизнь организма становится невозможной при выключении любой из этих систем.

Формально любую клетку можно «разложить» на ряд как бы  независимых структурных и функциональных компонентов, выполняющих свои специфические функции. Так, например, эукариотические клетки принято разделять на ядра и цитоплазму. В цитоплазме, в свою очередь выделяют гиалоплазму или основную плазму клетки (цитозоль – растворимый компонент цитоплазмы по терминологии биохимиков), а также целый ряд структур – органелл, выполняющих свои отдельные специфические функции. Это мембранные органеллы: одномембранные (вакуолярная система, включающая в себя эндоплазматический  ретикулум, аппарат Гольджи, эндо- и экзоцитозные вакуоли, лизосомы, пероксисомы) и двумембранные (митохондрии и пластиды). К немембранным органеллам нужно отнести рибосомы и систему цитоскелетных фибрилл. Кроме того  вся поверхность клетки  покрыта цитоплазматической  мембраной, тесно функционально связанной как с вакуолярной системой, с элементами цитоскелета, так и с гиалоплазмой.

Но каждая из этих морфологических «отдельностей» представляет собой новую систему или подсистему функционирования. Так клеточное ядро является системой хранения, воспроизведения и реализации генетической информации. Гиалоплазма – система основного промежуточного обмена; рибосомы – элементарные клеточные машины синтеза белка; цитоскелет – опорно-двигательная система клетка; вакуолярная система – система синтеза и внутриклеточного транспорта белковых биополимеров и генезиса многих клеточных мембран; митохондрии – органеллы энергообеспечения клетки за счет синтеза АТФ, пластиды растительных клеток – система синтеза АТФ и фотосинтеза, плазматическая мембрана – барьерно-рецепторно-транспортная система клетки.

Аналоги этих систем есть и у прокариот:  это – плазматическая мембрана, которая кроме пограничной роли участвует в процессах синтеза АТФ и фотосинтеза, цитозоль, рибосомы, и даже элементы цитоскелета.

Важно подчеркнуть, что все эти подсистемы клетки образуют некое сопряженное единство, находятся во взаимозависимости. Так, например, нарушение функций ядра сразу сказывается на синтезе клеточных белков, нарушение работы митохондрий прекращает все синтетические и обменные процессы в клетке, разрушение элементов цитоскелета прекращает внутриклеточный  транспорт и т.д. Как в часовом механизме повреждение любой его части приводит к остановке всей системы  в целом.

3. Гомологичность клеток

Термин гомологичность означает сходство по коренным свойствам и отличие по второстепенным. Так, например, руки человека, крыло птицы, передняя нога лошади гомологичны, сходны не только по плану строения, но и по своему происхождению. Подобно этому можно говорить, что разные клетки организмов растительного или животного происхождения сходны, гомологичны.

Это обобщение, сделанное еще Т. Шванном, нашло свое подтверждение и развитие в современной цитологии, использующей новые достижения техники, такие, как электронный микроскоп. Гомологичность строения клеток наблюдается внутри каждого из типов клеток: прокариотическом и эукариотическом. Хорошо известно разнообразие клеток как бактериальных, так и высших организмов. Такое одновременное сходство строения и разнообразие форм определяются тем, что клеточные функции можно грубо подразделить на две группы: обязательные  и факультативные. Обязательные функции, направленные на поддержание жизнеспособности своих клеток, осуществляются специальными внутриклеточными структурами.

Так, у всех прокариотических клеток плазматическая мембрана не только ограничивает собственно цитоплазму, но и функционирует как структура, обеспечивающая активный транспорт веществ и клеточных продуктов, как система окислительного фосфорилирования, как источник образования клеточных бактериальных стенок. ДНК нуклеоида бактерий и синезеленых водорослей обеспечивает генетические свойства клеток и т.д. Рибосомы цитоплазмы – единственные аппараты синтеза полипептидных цепей , - также обязательный компонент цитоплазмы прокариотической клетки. Разнообразие же прокариотических клеток – это результат приспособленности отдельных бактериальных одноклеточных организмов к условиям среды обитания. Прокариотические клетки могут отличаться друг от друга толщиной и устройством клеточной стенки, ,складчатостью плазматической мембраны, количеством и структурой  цитоплазматических выростов этой мембраны, количеством и свойствами внутриклеточных вакуолей и мембранных скоплений и др. Но «общий план» строения прокариотических клеток остается постоянным.

Та же картина наблюдается и для эукариотических клеток. При изучении клеток растений и животных бросается в глаза разительное сходство не только в микроскопическом строении этих клеток, но и в деталях строения их отдельных компонентов. У эукариот так же, как у прокариот, клетки отделены друг от друга или от внешней среды активной плазматической мембраной, которая может принимать участие в выделении веществ из клетки и построении внеклеточных структур, что особенно выражено у растений. У всех эукариотических клеток от низших грибов до позвоночных всегда имеется ядро., принципиально сходное по построению у разных организмов. Строение и функции внутриклеточных структур также в принципе определяется гомологичностью общеклеточных функций, связанных с поддержанием самой живой системы (синтез нуклеиновых кислот и белков, биоэнергетика клетки и т.д.).

Одновременно мы видим и разнообразие клеток  даже в пределах одного многоклеточного организма.. Так, например, по форме мало похожи друг на друга такие клетки, как мышечная или нервная. Современная цитология показывает, что различие клеток связано со специализацией их функций, с развитием особых функциональных клеточных аппаратов. Так, если рассматривать мышечную клетку, то в ней кроме общеклеточных структур (мембранные системы ретикулума, аппарат Гольджи, рибосомы и др.) встречаются в большом количестве фибриллярные компоненты, обеспечивающие специальную функциональную нагрузку, характерную для этой клетки.

В нервной клетке кроме общеклеточных компонентов можно отметить специфические черты: наличие длинных и разветвленных клеточных отростков, оканчивающихся специальными структурами передачи нервного импульса; своеобразную композицию в цитоплазме из элементов эндоплазматической сети (тигроид), большое количество микротрубочек в клеточных отростках. Вся совокупность этих отличительных черт нервной клетки связана с ее специализацией – передачей нервного импульса. Однако и микротрубочки и микрофиламенты можно обнаружить практически в любых эукариотических клетках, хотя они будут и не так обильны. Например, филаменты, сходные по химизму с актиновыми фибриллами мышечных клеток, имеются в цитоплазме фибробластов. В ней же обнаруживаются и микротрубочки. Следовательно, и микрофиламенты и микротрубочки представляют собой обязательные общеклеточные структуры. Сейчас известно, что микрофиламенты клеток представлены актином, что указывает на их общеклеточное значение – обеспечивать подвижность клеток. В мышечных клетках эта функция стала главной, поэтому так сильно в них выражен сократительный аппарат.

Структурное разнообразие клеток многоклеточного организма можно объяснить отличием их специальных функций, осуществляющихся данной клеткой как бы на фоне общих, обязательных клеточных функций.

Другими словами, гомологичность в строении клеток определяется сходством общеклеточных функций, направленных на поддержание жизни самих клеток и на их размножение. Разнообразие же в строении клеток многоклеточных – результат функциональной специализации.

4. Клетка от клетки

Формулировка положения «Всякая клетка от клетки» (Omnis cellula e cellula) связана с именем знаменитого ученого Р. Вирхова. Т. Шванн в своих обобщениях подчеркивал одинаковость принципа развития клеток как у животных, так и у растений. Это представление базировалось на выводах Шлейдена о том, что клетки могут образовываться  из зернистой массы в недрах клеток заново (теория цитобластемы). Р. Вирхов как противник идеи о самозарождении жизни настаивал на «преемственном размножении клеток». Сегодня сформулированное Р. Вирховым афористическое определение можно считать биологическим законом. Размножение клеток прокариотических и эукариотических происходит только путем деления исходной клетки, которому предшествует воспроизведение ее генетического материала (редупликация ДНК).

У эукариотических клеток единственно полноценным способом деления является митоз (или мейоз при образовании половых клеток). При этом образуется специальный аппарат клеточного деления – клеточное веретено, с помощью которого равномерно и точно по двум дочерним клеткам распределяются хромосомы, до этого удвоившиеся в числе. Этот тип деления наблюдается у всех эукариотических, как растительных, так и животных клеток.

Прокариотические клетки, делящиеся так называемым бинарным образом, также используют специальный аппарат разделения клеток, значительно напоминающий митотический способ деления эукариот (см. ниже).

Современная наука отвергает иные пути образования клеток и увеличение их числа. Появившиеся одно время описания образования клеток из «неклеточного живого вещества» оказались в лучшем случае результатом методических недостатков или даже ошибок, а в худшем – плодом научной недобросовестности.

Одно время считали, что клетки могут размножаться прямым делением, путем так называемого амитоза. Однако прямое разделение клеточного ядра, а затем и цитоплазмы, наблюдается только у некоторых инфузорий. При этом амитотически делится только макронуклеус, в то время как генеративные микронуклеусы делятся исключительно путем митоза, вслед за которым наступает разделение клетки – цитотомия. Часто появление дву- или многоядерных клеток также считали результатом амитотического деления ядер. Однако появление многоядерных клеток является  или результатом слияния друг с другом нескольких клеток (гигантские многоядерные клетки тел воспаления, остеокласты и др.) или результатом нарушения самого процесса цитотомии (см. ниже).

5. Клетки и многоклеточный организм

Роль отдельных клеток во многоклеточном организме подвергалась неоднократному обсуждению и критике и претерпела наибольшие изменения. Т. Шванн представлял себе многогранную деятельность организма как сумму жизнедеятельности отдельных клеток. Это представление было в свое время принято и расширено Р. Вирховым и получило  название теории «клеточного государства». Вирхов писал: «…всякое тело, сколько-нибудь значительного объема, представляет устройство, подобное общественному, где множество отдельных существований поставлено в зависимость друг от друга, но так, однако же, что каждое из них имеет свою собственную деятельность, и если побуждение к этой деятельности оно и получает от других частей, зато самою работу свою оно совершает собственными силами» (Вирхов, 1859).

Действительно, какую бы сторону деятельности целого организма мы ни брали, будь то реакция на раздражение или движение, иммунные реакции, выделение и многое другое, каждая из них осуществляется специализированными клетками. Клетка – это единица функционирования в многоклеточном организме. Но клетки объединены в функциональные системы, в ткани и органы, которые находятся во взаимной связи друг с другом. Поэтому нет смысла в сложных организмах искать главные органы или главные клетки. Многоклеточные организмы представляют собой сложные ансамбли клеток, объединенные в целостные интегрированные системы тканей и органов, подчиненные и связанные межклеточными, гуморальными и нервными формами регуляции. Вот почему мы говорим об организме как о целом. Специализация частей многоклеточного единого организма, расчлененность его функций дают ему большие возможности приспособления для размножения отдельных индивидуумов, для сохранения вида.

В конечном итоге можно сказать, что клетка в многоклеточном организме – это единица функционирования и развития. Кроме того, первоосновой всех нормальных и патологических реакций целостного организма является клетка. Действительно, все многочисленные свойства и функции организма выполняются клетками. Когда в организм попадают чужеродные белки, например бактериальные, то развивается иммунологическая реакция. При этом в крови появляются белки-антитела, которые связываются с чужими белками и их инактивируют. Эти антитела – продукты синтетической активности определенных клеток, плазмацитов. Но, чтобы плазмациты начали вырабатывать специфические антитела, необходима работа и взаимодействие целого ряда специализированных клеток-лимфоцитов и макрофагов. Другой пример, простейший рефлекс – слюноотделение в ответ на предъявление пищи. Здесь проявляется очень сложная цепь клеточных функций: зрительные анализаторы (клетки) передают сигнал в кору головного мозга, где активируется целый ряд клеток, передающих сигналы на нейроны, которые посылают сигналы к разным клеткам слюнной железы, где одни вырабатывают белковый секрет, другие выделяют слизистый секрет, третьи, мышечные, сокращаясь, выдавливают секрет в протоки, а затем в полость рта. Такие цепи последовательных функциональных актов отдельных групп клеток можно проследить на множестве примеров функциональных отправлений организма.

Жизнь нового организма начинается с зиготы – клетки, получившейся в результате слияния женской половой клетки (ооцита) со спермием. При делении зиготы возникает клеточное потомство, которое также делится, увеличивается в числе и приобретает новые  свойства, специализируется, дифференцируется. Рост организма, увеличение его массы есть результат размножения  клеток и результат выработки ими разнообразных продуктов (например, вещества кости или хряща).

И наконец, именно поражение клеток или изменение их свойств является основой для развития всех без исключения заболеваний. Данное положение было впервые сформулировано Р. Вирховым (1858) в его знаменитой книге «Клеточная патология». Классическим примером клеточной обусловленности развития болезни может служить сахарный диабет, широко распространенное заболевание современности. Его причина – недостаточность функционирования лишь одной группы клеток, так называемых В-клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе. Эти клетки вырабатывают гормон инсулин, участвующий в регуляции сахарного обмена организма.

Все эти примеры показывают важность изучения структуры, свойств и функций клеток для самых различных биологических дисциплин и для медицины.

6. Тотипотентность клеток 

Как же возникают разнообразные типы клеток в многоклеточных организмах? Известно, что организм человека, развившийся всего из одной исходной клетки, зиготы, содержит более 200 различных типов клеток. Каким образом возникает это разнообразие, сегодня до конца не ясно, так как еще мало конкретных данных, касающихся путей появления тех или иных клеточных типов.

Современная биология на базе представлений эмбриологии, молекулярной биологии и генетики считает, что индивидуальное развитие от одной клетки до многоклеточного зрелого организма – результат последовательного, избирательного включения работы разных генных участков хромосом в различных  клетках. Это приводит  к появлению клеток со специфическими для них структурами и особыми функциями, т.е. к процессу, называемому дифференцировкой.

Дифференцировка – это результат избирательной активности разных генов в клетках по мере развития многоклеточного организма. Другими словами, дифференцировка – это результат дифференциальной активности генов. Следовательно, можно утверждать, что любая клетка многоклеточного организма обладает одинаковым полным фондом генетического материала, всеми возможными потенциями для проявления этого материала, т.е. все – или тотипотентна, но в разных клетках одни и те же гены могут находиться или в активном или в репрессированном состоянии. Эти представления базируются на большом экспериментальном материале. Стало возможным вырастить зрелое растение из одной его соматической клетки. Многочисленные опыты на лягушках показали, что ядра дифференцированных клеток сохраняют все те потенции, которые есть у ядра в зиготе.

Было найдено, что если после оплодотворения яйцеклетки лягушки у возникшей зиготы микрохирургически удалить ядро, а на место его имплантировать ядро из другой зиготы, то произойдет полное развитие нормальной лягушки. Если же в этом эксперименте ядро зиготы заменить на ядро из специализированной (дифференцированной) клетки взрослого животного, то развитие эмбриона пройдет нормальным путем, вплоть до появления взрослой лягушки (рис. 5).

Аналогичным путем можно в безъядерную зиготу млекопитающих ввести ядро из ткани взрослого животного и получить клонированную особь, имеющую идентичную генетическую информацию с животным-донором. Так была получена (клонирована) овечка Долли.

Из этого вытекает, что клетки многоклеточных организмов обладают полным набором генетической информации, свойственной для данного организма, в этом отношении они равнозначны. Но одновременно клетки отличаются по объему проявления этой информации, что и создает возможность появления специализированных клеток. Однако эти представления не могут быть приняты полностью, так как имеются исключения, показывающие, что при дифференцировке происходит количественное изменение генетического материала. Так, при дроблении яиц аскариды клетки, дающие начало соматическим тканям, теряют часть хромосомного материала (диминуция). Сходный процесс описан у насекомых-галлин. В этом случае при  обособлении соматических ядер происходит значительная редукция хромосомного материала. При этом клетки половых зачатков содержат 40 хромосом, а соматические – всего 8. Следует помнить, что такие различия были обнаружены только между половыми и соматическими клетками; различий в хромосомных наборах между разными соматическими клетками не обнаружено. Однако в последнее время появились данные о том, что плазмациты, в результате специфической дифференцировки при иммунном ответе претерпевают молекулярные перестройки в области генов, ответственных за синтез антител, и тем самым генетически отличаются от остальных клеток.

Общим же законом для многоклеточных растительных и животных организмов является то, что несмотря на структурные и функциональные различия клеток данного организма в генетическом отношении они однородны, тождественны и тотипотентны.

Подводя итог рассмотрению современного состояния клеточной теории, нужно сказать, что именно клетка является единицей развития многоклеточных, единицей их строения, единицей функционирования и единицей патологических изменений организма.

Для того, чтобы понять не только значение структурных особенностей клетки, но и, главное, разобраться в функциональных отправлениях ее отдельных компонентов и всей клетки в целом, чтобы сочетать изучение морфологии клетки с главнейшими биохимическими и генетическими особенностями ее устройства и работы, чтобы изучать клетку именно с позиций современной клеточной биологии, необходимо хотя бы вкратце вспомнить основные молекулярно-биологические закономерности, еще раз кратко обратиться к содержанию центральной догмы молекулярной биологии (см. глава 3).

Глава 2. Методы клеточной биологии

Цитология возникла как ветвь микроанатомии, и поэтому одним из основных методов, который используют цитологи, - это метод световой микроскопии. В настоящее время этот метод нашел целый ряд дополнений и модификаций, что значительно расширило круг задач и вопросов, решаемых цитологией. Революционным моментом в развитии современной цитологии и биологии вообще было применение электронной микроскопии, открывшей необычайно широкие перспективы. С введением электронной микроскопии в ряде случаев уже трудно провести границу между собственно цитологией и биохимией, они объединяются на уровне макромолекулярного изучения объектов (например, микротрубочек, мембран, микрофиламентов и т.д.). Все же главным методическим приемом в цитологии остается визуальное наблюдение объекта. При этом исследователь не просто изучает и описывает морфологию объекта, он может видеть степень его сложности, локализовать отдельные детали, получить сведения о химизме той или иной части клетки, визуально и достаточно точно оценить ее метаболические свойства, выяснить строение этой части на макромолекулярном уровне. Это создает своеобразие цитологии как науки, использующей главным образом методы изучения клетки непосредственно глазом, вооруженным увеличивающими оптическими системами. Кроме того, в цитологии применяются многочисленные приемы препаративной и аналитической биохимии, методы биофизики.

Световая микроскопия

Световой микроскоп, главный прибор биологии, представляет собой оптическую систему, состоящую из конденсатора, объектива. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект (рис. 6). Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например, путем проекции на экран (до 105 раз). Вычислено, что разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, будет равно

                     

d = 0,61  -----------

                  n   sin

где - длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды; - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив. Разрешение микроскопа зависит от длины волны – чем она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть, и от нумерической апертуры объектива (n   sin ) – чем она выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность  около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.

Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод «темного поля», или, как его называли раньше, метод «ультрамикроскопии». Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.

Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, что они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей, чем окружающая среда. Большая же часть клеточных компонентов мало отличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), так и друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны. Для их изучения приходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Один из таких приемов – метод фазово-контрастной микроскопии, широко использующийся для наблюдений за живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной в общем клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит от величины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.

Сходный прием используется в интерференционном микроскопе. Он устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.

С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (например, волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

Витальное (прижизненное) изучение клеток

Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма.

Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучаться в капле плазмы или в специальных синтетических средах.

Для изучения клеток органов и тканей животных используют метод клеточных культур. Более простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой (смесь плазмы крови с эмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением плазмы крови), помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона - версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт. Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего для получения первичных культур из тканей животных использовать эмбриональный материал; культуры из клеток взрослых организмов растут очень плохо.

При культивировании клеток вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру (около 20о для хладнокровных и около 37о для теплокровных). Обязательным условием культивирования клеток является соблюдение стерильности. Существует целый ряд длительно культивируемых клеток; это специальные клеточные штаммы, приспособившиеся десятилетиями к росту вне организма. Большей частью это клетки опухолевого происхождения или значительно измененные клетки, приобретшие свойства опухолевых клеток.

Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.

В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.

Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки можно снимать и на кинопленку. В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д.

Теперь с развитием компьютерных технологий с помощью специальных телекамер возможно получать изображение клеток прямо на мониторе компьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать и получать отпечатки на принтерах цветных или черно-белых. Так же возможно использовать такую компьютерную видеотехнику для цейтраферной съемки подвижных объектов .

При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии, оперативного воздействия на клетки. С помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекция) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях – «микрокузницах». При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. Так, с помощью микроманипулятора удалось пересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именно клеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом. С помощью микроманипулятора удалось инъецировать в клетку амебы коллоидное золото, а затем исследовать распределение его частиц в цитоплазме и ядре.

С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кроме механического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее время широко применяют микропучки ультрафиолетового света или лазерные микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивировать отдельные участки живой клетки. Так, например, можно инактивировать одно из ядрышек и следить за судьбой второго, интактного. В этом случае показано, что второе ядрышко принимает на себя дополнительную нагрузку и «работает за двоих». С помощью микропучков удается поразить часть митотической хромосомы или участок веретена деления. Оказалось, что поражение центромеры хромосомы выводит последнюю из процесса расхождения хромосом к полюсам клетки во время митоза. Недавно стали применять аппараты с лазерным микролучом, что позволяет очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и использовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.

При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1 : 200000), следовательно, влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.

При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Так, например, выделенный хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.

Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В2), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем фоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки – это хлоропласты.

Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества). Этот способ сходен с витальным окрашиванием в том смысле, что здесь также используют очень низкие концентрации красителя  (1 х 10-4–1 х 10-5). Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая их вторичную люминесценцию. Так, например, флуорохром акридиновый оранжевый избирательно связывается с нуклеиновыми кислотами. Причем, связываясь в мономерной форме с ДНК, он флуоресцирует зеленым цветом, а в димерной форме с РНК светится красным цветом. Наблюдая за живыми клетками, окрашенными акридиновым оранжевым, видно, что их ядра имеют зеленый цвет свечения, а цитоплазма и ядрышки святятся красным цветом. Тем самым в живой клетке с помощью этого метода можно видеть локализацию (а в некоторых случаях рассчитывать количество) тех или иных химических веществ. Существуют флуорохромы, избирательно связывающиеся с липидами, слизью, кератином и др.

В живые клетки можно инъецировать также меченые флуорохромами антитела. Так, например, введенные в клетку связанные с флуорохромом антитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые теперь можно наблюдать в живых клетках с помощью флуоресцентного микроскопа.

В последнее время начинает широко использоваться для изучения живых клеток или их компонентов сочетание световой микроскопии (особенно фазовоконтрастной) с электроннно-компьютерной обработкой изображения. При этом используется видеозапись с электронной обработкой изображения, которая как бы «убирает» фоновые уровни и выделяет, контрастирует наблюдаемые структуры. Такая методика позволяет на телеэкране видеть такие структуры как микротрубочки, размер которых (20 нм) намного меньше разрешающей силы светового микроскопа. Применение таких систем не только заменяют цейтраферную киносъемку, вместо которой используется видео-запись, но и позволяет компьютерную обработку изображения: сведения о плотности структур, о их параметрах, числе и трехмерной организации. В сочетании с флуоресцентной микроскопией эти методы открывают огромные перспективы в изучении живых клеток.

Обычные методы световой микроскопии трудно использовать для воспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за небольшой глубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптические разрезы на данной глубине фокуса. Для того, чтобы получить полную трехмерную реконструкцию объекта используют специальный конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.

Изучение фиксированных клеток

Несмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений, большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена на фиксированном материале. Если клетку повредить, она начинает претерпевать ряд изменений, а после смерти клетки в ней активируются автолитические ферменты, что приводит к грубым изменениям клеточной структуры. Следовательно, задачи фиксации – это убить клетку, прекратить активность внутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, а также избежать потери структур и веществ, препятствовать появлению структур, отсутствующих в живой клетке (артефактные структуры). К сожалению, еще не найден такой химический фиксатор, который бы удовлетворял всем этим требованиям.

Часто для фиксации используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты, вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды.

После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительной обработке. Одной из главных таких обработок является окрашивание клеток. Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массу деталей.

Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани можно непосредственно помещать в красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучают такие срезы и отдельных клеток.

Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать.

Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе – микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом, эти препараты можно длительно хранить.

Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различные натуральные и главным образом синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки).

Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основные краски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своем составе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красители образуют солевые связи с кислотными группами в структурах клетки. Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, свяжутся с основными красителями, будут, как их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO2OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и называются ацидо- или оксифильными. Существует множество смесей таких красителей, которые одновременно могут окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Таким образом, используя всевозможные красители, исследователи не только добиваются четкости морфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизме той или иной структуры.

Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических и цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много.

Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества.

Примером такого рода цитохимических реакций может быть широко применяемая реакция на ДНК, реакция Фёльгена (рис. 8). Суть ее в том, что после специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Эти группы могут взаимодействовать со специфическим индикатором , реактивом Шиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание в местах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строго количественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где есть ДНК, но и измерить ее количество. Используя этот же принцип выявления альдегидных групп, можно в клетках видеть расположение полисахаридов после гидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция).

Также специфически можно определить локализацию белков реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жиры обнаруживают в клетках специальными красителями (судан черный), хорошо растворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях.

Целая группа цитохимических реакций связана с обнаружением ферментов. Общий принцип этих реакций в том, что в микроскоп видны не сами белковые ферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются по продуктам их специфической ферментативной активности.

Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить с помощью метода цитофотометрии. Основу его составляет определение количества химических веществ по поглощению ими света определенной длины волны. Было найдено, что интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Следовательно, оценивая степень поглощения света данным веществом, можно узнать его количество. Для такого рода исследований используют приборы – микроскопы-цитофотометры; у них за объективом расположен чувствительный фотометр, регистрирующий интенсивность прошедшего через объект светового потока. Зная площадь или объем измеряемой структуры и значение поглощения, можно определить как концентрацию данного вещества, так и его абсолютное содержание. Широко используется метод цитофотометрии при определении количества ДНК на клетку после реакции Фёльгена. В данном случае фотометрируется не сама ДНК, а содержание красно окрашенного фуксина, количество которого прчямо пропорционально содержанию ДНК. Сравнивая полученные величины поглощения со стандартами, можно получить точные значения количества ДНК, выраженные в граммах. Этот метод позволяет измерять количество ДНК до 10-12 – 10-14 г, в то время как микрохимические методы имеют чувствительность не более 10-6 г. С помощью цитофотометрии содержание ДНК в клетках определяется намного точнее обычных биохимических методов.

Количественную оценку получают не только поглощающие свет объекты и вещества, но и излучающие (светящиеся ). Так, разработаны приемы количественной флурометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.

Для выявления специфически белков применяют иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или  для определения мест локализации РНК-ДНК гибридных молекул. Для этого сначала на белок (например, тубулин) получают специфические сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такие препараты наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Однако для того, чтобы  меченные флуорохромами антитела проникли в клетку, необходимо плазматическую мембрану сделать проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран. Для изучения с помощью этого метода цитоскелетных белков прибегают к растворению клеточных мембран различными детергентами.

Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отельных клеток широко используют метод радиоавтографии – регистрации веществ, меченных изотопами (рис. 9). Принцип этого метода очень прост, он повторяет метод Беккереля, открывшего радиоактивный распад. При радиоавтографическом исследовании клеткам в среду вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. Например, вместо 12С введен атом 14С, вместо водорода – тритий 3Н и др. В процессе синтеза в биополимер включится и меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место в клетке можно с помощью фотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией, то через некоторое время в результате распада изотопа – частицы, разлетающиеся хаотично в разных направлениях, попадут в зону чувствительного фотослоя и активируют в нем зерна бромистого серебра. Чем больше будет время экспозиции, т.е. контакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем больше зерен AgBr будет засвечено. После экспозиции надо проявить препарат, при этом происходит восстановление серебра только в засвеченных гранулах, при фиксации препарата незасвеченные гранулы AgBr  растворяются. В результате из массы гранул, которые покрывали объект, останутся только те, которые были активированы  -излучением. Просматривая в микроскоп такие препараты, поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находит места локализации зерен серебра, которые располагаются напротив мест, где содержится меченое вещество (рис. 9).

Этот метод имеет ограничения: точность его будет зависеть от величины зерна AgBr и от энергии частицы. Чем больше величина зерна, тем с меньшей точностью можно узнать место расположения изотопа. И чем выше энергия частицы и длиннее ее пробег, тем дальше от места распада будет происходить активация зерен AgBr . Поэтому для метода радиоавтографии используют особые мелкозернистые фотоэмульсии (0,2-0,3 мкм) и изотопы с малой энергией -частиц, главным образом изотоп водорода, тритий (3Н). Тритием могут быть мечены любые предшественники биологических макромолекул: нуклеотиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты. Используются также для радиоавтографических исследованных меченые гормоны, антибиотики, ингибиторы и др. Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в воде соединения, так как в процессе обработки клеток водными растворами (фиксация, проявление и т.д.) они могут потеряться. Другим ограничением метода является достаточно высокая концентрация данных веществ, так как при низкой концентрации радиоактивного вещества время экспозиции увеличивается, при этом растет опасность появления фона засвеченных гранул AgBr за счет космического излучения.

Метод радиоавтографии – один из основных методов, позволяющих изучать динамику синтетических процессов, сравнить их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. Так, например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.

Метод радиоавтографии используется также для определения расположения определенных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидных последовательностей в составе клеточных ядер или хромосом – метод молекулярной гибридизации. Для этого раствор с меченной нуклеиновой кислотой (например с рибосомной РНК) или с ее фрагментом (например, с сателитной ДНК) наносят на препарат, предварительно обработанный так, чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в нативной ДНК) в составе хромосом или ядер, что достигается щелочной или температурной обработкой образца,. В процессе ренатурации ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации определяется радиоавтографически. Этот метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот позволяет с большой точностью локализовать на хромосоме места с данной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов.

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется также при окраске их флуорохромами. Например, если выделенную ядрышковую ДНК, ответственную за синтез рибосомных РНК, предварительно связать с каким-либо флуорохромом, то после проведения ренатурации ДНК на препаратах с этой флуоресциирующей рибосомной ДНК, можно видеть, что флуоресценция будет наблюдаться только в ядрышках интерфазных клеток или только в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Таким образом можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и даже расположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод (флуоресцентная in situ гибридизация).

Электронная микроскопия

Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 1 А (0,1 нм). По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку (рис. 7).

Основная часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом и анодом подается высокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа. Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной линзой, которая формирует увеличенное первичное изображение объекта. Так же как в световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показатели. Первичное изображение увеличивается проекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентным слоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегося экрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.

Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и в этом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d ~ 0,5 ). Однако в современных конструкциях электронных микроскопов достигается разрешение около 1 А из-за  недостаточной стабильности напряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повысить разрешение электронного микроскопа в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (вспомним, что величина О-Н связи  в молекуле воды равна 0,99 А): оно сейчас уже в 106 раз выше разрешающей способности глаза!

На экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получить увеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение, так что конечное увеличение, при котором максимально реализуется разрешение, может достигать 106 раз (например, если 1 мм увеличить в 106 раз, то он достигнет длины в 1 км).

В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передается прямо в компьютер, где на экране монитора его можно обрабатывать различным образом (изменять увеличение, контрастность изображения, применять денситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов). Используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.

Максимальное разрешение электронного микроскопа (ЭМ) реализуется сейчас только при исследовании металлов или кристаллических решеток. На биологических объектах такого разрешения получить пока не удается из-за низкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМ помещаются на медные сеточки, покрытые тонкими пленками – подложками (формвар, коллодий, углерод), состоящими в основном из углерода. Биологические объекты также в основном содержат углерод и, следовательно, мало по плотности будут отличаться от фона, будут мало контрастны. Показано, что минимальная толщина биологического объекта с плотностью около 1 г/см3, выявляемого при ускоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ, равна 50 А. Вирусы, расположенные на поддерживающей пленке, будут видны в этом случае в виде бесструктурных пятен, а молекулы нуклеиновых кислот (толщина ДНК равна 20 А ) вообще не видны из-за низкого контраста. Контраст биологических объектов можно повысить, используя тяжелые металлы или их соли.

Контрастирование корпускулярных объектов

Корпускулярными объектами можно назвать частички вирусов, фагов, выделенные клеточные компоненты (рибосомы, мембраны, вакуоли и т.д.), макромолекулы.

Одним из широко распространенных методов контрастирования биологических объектов является оттенение металлами. В этом случае в специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким образом , напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект будет виден. Этот метод широко применяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, но и для достаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Минус этого метода в том, что он приводит к увеличению размеров объекта на толщину напыленного слоя, который в лучшем случае достигает 10-15 А. Другой недостаток его в том, что он дает информацию только о внешнем виде и объеме частиц. Для контрастирования оттенением используется платина, палладий, их сплавы, уран.

При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту  (ФВК) (рис. 10). Если водные растворы таких веществ смешать с биологическими объектами, а затем их нанести на пленки-подложки и высушить, то объекты (например, вирусы или белковые комплексы) окажутся как бы погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокой плотности. В электронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне (как фотонегатив). Преимущества метода в том, что растворенные соли могут проникать в глубь  объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативное контрастирование широко применяется при изучении вирусов, ферментных комплексов мембран. Нитчатые молекулы нуклеиновых кислот этим методом выявляются плохо из-за их малой толщины.

Соли тяжелых металлов можно использовать при так называемом позитивном контрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается со структурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивного контрастирования нуклеиновых кислот используют растворы уранилацетата в спирте или в ацетоне. Уранилацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты, хорошо прокрашивает центральные полости сферических вирусов, значительно повышает контраст рибосом и позволяет видеть тонкие нити выделенных нуклеиновых кислот.

Ультрамикротомия

При изучении объектов в электронном микроскопе возникает еще одно осложнение – это их толщина. Дело в том, что при прохождении  пучка электронов через объект часть электронов поглощается, что приводит к нагреванию объекта и к его деформации. Поэтому необходимо иметь тонкие объекты (не выше 0,1 мкм). Другое ограничение заключается в том, что даже если мы будем рассматривать неизменяющиеся объекты большой толщины (около 0,5-1 мкм), что в принципе возможно (например, в мегавольтном электронном микроскопе, см. ниже), то на конечном изображении будут наслаиваться проекции структур, располагающихся на разных уровнях по толщине объекта. Тем самым изучать в трансмиссионных микроскопах внутреннее строение целых клеток плохо и неудобно. Выход из этого положения аналогичен тому, что было найдено для световой микроскопии, - делать срезы очень малой толщины, ультратонкие срезы (0,05-0,10 мкм).

Процедура их изготовления в принципе сходна стой, что используется в световой микроскопии. Клетки и ткани для этого сначала фиксируют. В качестве фиксаторов используются буферные растворы глутарового альдегида или четырехокиси осмия. Наиболее часто применяется двойная фиксация: сначала глутаровый альдегид, а затем осмий, который как тяжелый металл контрастирует клеточные структуры. Затем, после обезвоживания, ткани пропитываются эпоксидными смолами или другими пластиками в жидкой, мономерной форме. При полимеризации таких пластмасс пропитанный ими объект оказывается заключенным в твердые блоки, которые уже можно резать на тонкие срезы. Здесь возникают две проблемы: где взять идеальные ножи, изъяны которых не сказывались бы при изучении клеток на почти молекулярных уровнях, и как изготовить срезы толщиной в сотые доли микрона. Первая задача была решена таким образом: оказалось, что  идеально острой и без зазубрин режущей поверхностью обладают сколы стекла (рис. 11). Но стеклянные ножи очень недолговечны, их используют только один раз. Применяют алмазные ножи: это специальным образом заточенные мелкие алмазы, они служат в течение нескольких лет.

Проблема изготовления сверхтонкого среза была решена тоже, казалось бы, просто – это термическая подача объекта. Блок с заключенным в пластмассу объектом крепится на металлическом стержне, который нагревается и тем самым продвигает объект вперед на определенную величину за известное время. И если эту термическую подачу согласовать с ритмическими циклами резания, то можно получить серии срезов заданной толщины. Это достигается при использовании специальных приборов – ультрамикротомов. Существуют конструкции ультрамикротомов, где подача объекта осуществляется механически.

Площадь получаемых ультратонких срезов обычно очень мала (0,1-1 мм2), поэтому все операции при ультрамикротомировании идут под микроскопическим контролем. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой, необходимо дополнительно контрастировать – «окрашивать» с помощью солей тяжелых металлов. В этом случае используют также соли свинца и урана, которые связываясь с внутриклеточными структурами на срезе, позитивно их контрастируют.

Техника изготовления ультратонких  срезов открыла огромные возможности для применения электронной микроскопии буквально во всех областях биологии и медицины

Этот метод позволяет применять цитохимические приемы на уровне электронной микроскопии: в данном случае необходимо, чтобы продукты реакции были электронноплотными, отклоняли бы электроны. Кроме того, реакции не должны приводить к появлению артефактных картин уже на ультраструктурном уровне. Число цитохимических методов в электронной микроскопии пока не велико, но это направление интенсивно разрабатывается.

В электронно-микроскопических исследованиях оказалось возможным применить методы радиоавтографии. В этом случае используются сверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм). Недостатком этого метода является очень большое время экспозиции, в некоторых случаях достигающие нескольких месяцев.

Все большее применение получают методы приготовления ультратонких срезов без фиксации и заливки клеток в твердые пластмассы. Это методы криоультрамикротомии, т.е. получение срезов с замороженных тканей, моментально охлажденных до температуры жидкого азота (-196оС). При этом происходит практически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую, ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такие твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие срезы (нож при этом также охлажден). Полученные срезы используют для выявления в них активности ферментов, для проведения на них иммунохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.

Для проведения иммунохимических исследований используют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализация которого  на препаратах и указывает на места расположения искомого антигена.

Изучение срезов, полученных на криоультратомах, показало, что общая структура и композиция клеточных компонентов в данном случае мало отличаются от того, что видно при использовании химической фиксации и обычных приемов получения ультратонких срезов. Следовательно, те структуры, которые имеют одинаковую композицию при разных методах обработки материала, по-видимому, близки к своему прижизненному строению, не являются артефактными.

В пользу этого говорят данные по исследованию клеток с помощью иных приемов электронной микроскопии.

Для изучения структуры различных мембранных компонентов клетки используется  метод замораживания–скалывания. Он заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. Таким образом с замороженного и сохраняющего прижизненную структуру материала получают реплику с его скола (рис. 12). Затем уже в условиях комнатной температуры ткань или клетки растворяют в кислотах, но пленка-реплика при этом остается цела, ее изучают в электронном микроскопе. Этот метод имеет два преимущества: изучают реплики со сколов нативных образцов; исследуют рельеф поверхности мембран клетки, что недостижимо другими методами. Оказалось, что и в этом случае общая организация клетки и ее компонентов сходна с тем, что мы видим при химической фиксации или при криотомии. Этот метод позволил увидеть, что как на поверхности, так и в толщине клеточных мембран располагаются глобулы интегральных белков, что мембраны не однородны по своей структуре.

Метод получения реплик с микрорельефа образца широко применяется при изучении фибриллярных компонентов клетки. Так при изучении цитоскелета клеток культуры ткани или форменных элементов крови клетки обрабатывают детергентами для того, чтобы растворить все мембраны. Это приводит к тому, что из клетки вымываются все компоненты, кроме фибриллярных белковых компонентов цитоскелета и материалы ядра. Такие препараты затем фиксируются, обезвоживаются и специальным образом сушатся. Вслед за этим сухие препараты напыляются углеродом и контрастируются распылением тяжелых металлов, после чего такая реплика снимается со стекла, на котором росли клетки, и просматривается в трансмиссионном электронном микроскопе.

Другие специальные методы электронной микроскопии биологических объектов

В последнее время начинают применять методы высоковольтной (вернее, сверхвысоковольтной) микроскопии. Сконструированы приборы с ускоряющим напряжением 1-3 млн. вольт. Это очень дорогие приборы, что сдерживает их широкое применение. Преимущество этого класса электронных микроскопов не в том, что на них можно получить более высокое разрешение (при более короткой длине волны электронов), а в том, что при высокой энергии электронов, которые меньше поглощаются объектом, можно просматривать образцы большой толщины (1-10 мкм). Дополнительное использование стереоскопической съемки позволяет получить информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким их разрешением (около 0,5 нм).

Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии позволяет изучать трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии тонкий пучок электронов (зонд) пробегает по поверхности объекта и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку. Изображение может быть получено в отраженных или вторичных электронах. При этом методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла (чаще всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительно больше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности. Разрешающая способность этого типа приборов несколько ниже, чем у просвечивающих электронных микроскопов, но уже сейчас выпускаются приборы с разрешением 3-5 нм (рис. 13).

С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках клеток. Так, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами объекта. Для получения такой информации, конечно, объекты не следует покрывать слоем металла, как при обычном методе сканирующей электронной микроскопии. Более того, объект нужно подготовить так, чтобы не было потери или дополнительного внесения элементов. Для этого используют быстро замороженные и высушенные в вакууме объекты.

Фракционирование клеток

В цитологии широко применяют различные методы биохимии, как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно получить в виде отдельных фракций разнообразные компоненты и изучать их химический состав, ультраструктуру и свойства. Так, в настоящее время в виде чистых фракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин, ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли эндоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиалоплазмы, аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы, микротрубочки и т.д., и т.п. В последнее время получены чистые фракции центриолей и ядерных пор.

Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с ее гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структур является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, что время для осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Чтобы ускорить этот процесс оседания, используют ускорения, создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и при небольших (1-3 тыс. g)ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 15-30 тыс. g осядут крупные частицы, макросомы, состоящие из митохондрий, мелких пластид, пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной системы клетки. При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфракций можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной  подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, пероксисомы. При разделении микросом можно получить фракцию мембран аппарата Гольджи, фрагментов плазматической мембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности сахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительно отличающиеся друг от друга по удельной массе.

Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическими способами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронного микроскопа.

Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут синтезировать белок по заданной экспериментатором информационной РНК, выделенные митохондрии в подобранных условиях могут осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине при участии соответствующих ферментов может происходить синтез РНК и т.д.

В последнее время применяются бесклеточные системы для воссоздания клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищенные от гранул желтки, экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту бесклеточную систему чужеродной ДНК (например ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается с белками-гистонами, которые есть в избытке в таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид), который покрывается двойной мембранной оболочкой, несущей даже ядерные поры. Такие модельные системы помогают изучать тонкие, интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в ядро и наоборот. В цитоплазматических экстрактах яиц земноводных и иглокожих такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти модели внесли огромный вклад в расшифровку природы регуляции клеточного цикла.

Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инженерии. Было найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, если специальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можно слить эритроцит курицы и лимфоцит человека. При этом получается двуядерная клетка, гетерокарион, в котором происходит активация ядра куриного эритроцита (рис.14). Если гетерокарион образуется из близкородственных клеток (например, мыши и хомячки), то при вступлении их в митоз хромосомы могут объединиться в одну метафазную пластинку. После разделения такой клетки получится истинно гибридная клетка. Другие приемы позволяют конструировать клетки из разных по происхождению ядер и цитоплазмы (рис. 15). Так, разрушив актиновый компонент цитоскелета и подвергнув клетки центрифугированию можно клетку разделить на две части: ядро с узким ободком цитоплазмы – кариопласт и на оставшуюся часть цитоплазмы – цитопласт. Затем используя разные кариопласты и цитопласты, можно создавать разные комбинации реконструированных клеток.

Методы клеточной инженерии широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологических целях. Например, при получении моноклональных антител используются клеточные гибриды между лимфоцитами иммунизированных животных и интенсивно размножающимися клетками миеломы. Полученные первичные дикарионы  образуют истинные гибридные клетки, которые интенсивно размножаются за счет генома опухолевых миеломных клеток, и одновременно выделяют большое количество антител, за счет работы генома иммунизированных лимфоцитов. Этот прием позволяет получать большое число гибридомных клеток, вырабатывающих большие количества необходимых антител.

Нет необходимости приводить описание всех методов и приемов, используемых в цитологии для изучения строения, химии и функций клеток или их компонентов. Этого краткого обзора достаточно для того, чтобы показать богатство арсенала методов в цитологии, позволяющих давать точный анализ, начиная от формы, общего вида и размера клетки, кончая молекулярной композицией ее отдельных частей.

Часть II. Строение и химия клеточного ядра

Глава 3. Центральная догма молекулярной биологии

Клетка как таковая обладает огромным числом разнообразных функций, как мы уже говорили, часть из них – общеклеточные, часть – специальные, характерные для особых клеточных типов. Главными рабочими механизмами выполнения этих функций являются белки или их комплексы с другими биологическими макромолекулами, такими, как нуклеиновые кислоты, липиды и полисахариды. Так, известно, что процессы транспорта в клетке разнообразных веществ, начиная с ионов, кончая макромолекулами, определяются работой специальных белков или липопротеиновых комплексов в составе плазматической и иных клеточных мембран. Практически все процессы синтеза, распада, перестройки разных белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов происходит в результате активности специфических для каждой отдельной реакции белков-ферментов. Синтезы отдельных биологических мономеров, нуклеотидов, аминокислот, жирных кислот, сахаров и др. также осуществляются огромным числом специфических ферментов – белков. Сокращение, приводящее к подвижности клеток или к перемещение веществ и структур внутри клеток, осуществляется также специальными сократительными белками. Многие реакции клеток в ответ на воздействие внешних факторов (вирусов, гормонов, чужеродных белков и др.) начинается с взаимодействия этих факторов со специальными клеточными белками-рецепторами.

Белки – это основные компоненты практически всех клеточных структур. Множество химических реакций внутри клетки определяется множеством ферментов, каждый из которых ведет одну или несколько отдельных реакций. Структура каждого отдельно взятого белка строго специфична, что выражается в специфичности их первичной структуры – в последовательности аминокислот вдоль полипептидной, белковой цепи. Причем специфичность этой аминокислотной последовательности безошибочно повторена во всех молекулах данного клеточного белка.

Такая правильность в воспроизведении однозначной последовательности аминокислот в белковой цепи детерминируется структурой ДНК того генного участка, который в конечном счете отвечает за структуру и синтез данного белка. Эти представления служат основным постулатом молекулярной биологии, ее «догмой». Информация о будущей молекуле белка передается в места его синтеза (в рибосомы) посредником – информационной РНК (иРНК), нуклеотидный состав которой отражает состав и последовательность нуклеотидов генного участка ДНК. В рибосоме строится полипептидная цепь, последовательность аминокислот в которой определяется последовательностью нуклеотидов в иРНК, последовательностью их триплетов. Тем самым центральная догма молекулярной биологии подчеркивает однонаправленность передачи информации: только от ДНК к белку, с помощью промежуточного звена, иРНК (ДНК иРНК белок). Для некоторых РНК-содержащих вирусов цепь передачи информации может идти по схеме РНК – иРНК – белок. Это не меняет сути дела, так как детерминирующим, определяющим звеном здесь является также нуклеиновая кислота. Обратные пути детерминации от белка к нуклеиновой кислоте, к ДНК или РНК неизвестны.

Для того чтобы в дальнейшем перейти к изучению структур клетки, связанных со всеми этапами синтеза белков, нам необходимо кратко остановиться на основных процессах и компонентах, определяющих это явление.

В настоящее время на основании современных представлений о биосинтезе белков можно дать следующую общую принципиальную схему этого сложного и многоступенчатого процесса (рис. 16).

Главная, «командная», роль в определении специфической структуры белков принадлежит дезоксирибонуклеиновой кислоте – ДНК. Молекула ДНК представляет собой чрезвычайно длинную линейную структуру, состоящую из двух взаимозакрученных полимерных цепей. Составными элементами – мономерами – этих цепей являются четыре сорта дезоксирибонуклеотидов, чередование или последовательность которых вдоль цепи уникальная и специфична для каждой молекулы ДНК и каждого ее участка. Различные достаточно длинные участки молекулы ДНК ответственны за синтез разных белков. Тем самым одна молекула ДНК может определить синтез большого числа функционально и химически различных белков клетки. За синтез каждого одного типа белков ответствен лишь определенный участок молекулы ДНК. Такой участок молекулы ДНК, связанный с синтезом одного какого-либо белка в клетке, часто обозначают термином «цистрон». В настоящее время понятие цистрон рассматривают как эквивалентное понятию ген. В уникальной структуре гена – в определенном последовательном расположении его нуклеотидов вдоль цепи – заключена вся информация о структуре одного соответствующего белка.

Из общей схемы белкового синтеза видно (см. рис. 16), что начальным пунктом, с которого начинается поток информации для биосинтеза белков в клетке, является ДНК. Следовательно, именно ДНК содержит ту первичную запись информации, которая должна сохраняться и воспроизводиться от клетки к клетке, из поколения в поколение.

Кратко касаясь вопроса о месте хранения генетической информации, т.е. о локализации ДНК в клетке, можно сказать следующее. Уже давно известно, что, в отличие от всех прочих компонентов белоксинтезирующего аппарата, ДНК имеет особую, весьма ограниченную локализацию: местом ее нахождения в клетках высших (эукариотических) организмов будет клеточное ядро. У низших (прокариотических)организмов, не имеющих оформленного клеточного ядра, ДНК также отмешана от остальной части протоплазмы в виде одного или нескольких компактных нуклеотидных образований. В полном соответствии с этим ядро эукариот или нуклеоид прокариот издавна рассматривается как вместилище генов, как уникальный клеточный органоид, контролирующий реализацию наследственных признаков организмов и их передачу в поколениях.

Основной принцип, лежащий в основе макромолекулярной структуры ДНК, - это так называемый принцип комплементарности (рис. 17). Как уже упоминалось, молекула ДНК состоит из двух взаимозакрученных цепей. Эти цепи связаны друг с другом посредством взаимодействия их противолежащих нуклеотидов. При этом по структурным соображениям существование такой двутяжной структуры оказывается возможным только в том случае, если противолежащие нуклеотиды обеих цепей будут стерически комплементарны, т.е. будут своей пространственной структурой дополнять друг друга. Такими взаимодополняющими – комплементарными – парами нуклеотидов являются пара А-Т (аденин-тимин) и пара Г-Ц (гуанин-цитозин).

Следовательно, согласно этому принципу комплементарности, если в одной цепи молекулы ДНК мы имеем некую последовательность четырех сортов нуклеотидов, то во второй цепи последовательность нуклеотидов будет однозначно детерминирована, так что каждому А первой цепи будет соответствовать Т во второй цепи, каждому Т первой цепи – А во второй цепи, каждому Г первой цепи – Ц во второй цепи и каждому Ц первой цепи – Г во второй цепи.

Видно, что указанный структурный принцип, лежащий в основе двутяжного строения молекулы ДНК, позволяет легко понять точное воспроизведение исходной структуры, т.е. точное воспроизведение информации, записанной в цепях молекулы в виде определенной последовательности из 4 сортов нуклеотидов. Действительно, синтез новых молекул ДНК в клетке происходит только на базе уже имеющихся молекул ДНК. При этом две цепи исходной молекулы ДНК начинают с одного из концов расходиться, и на каждом из разошедшихся однотяжных участков начинает собираться из присутствующих в среде свободных нуклеотидов вторая цепь в точном соответствии с принципом комплементарности. Процесс расхождения двух цепочек исходной молекулы ДНК продолжается, и соответственно обе цепи дополняются комплементарными цепями. В результате, как видно на схеме, вместо одной возникают две молекулы ДНК, в точности идентичные исходной. В каждой получившейся «дочерней» молекуле ДНК одна цепь, как видно, целиком происходит от исходной, а другая является заново синтезированной.

Главное, что еще раз необходимо подчеркнуть, это то, что потенциальная способность к точному воспроизведению заложена в самой двутяжной комплементарной структуре ДНК как таковой, и открытие этого, безусловно, составляет одно из главных достижений биологии.

Однако проблема воспроизведения (редупликации) ДНК не исчерпывается констатацией потенциальной способности ее структуры к точному воспроизведению своей нуклеотидной последовательности. Дело в том, что ДНК сама по себе вовсе не является самовоспроизводящей молекулой. Для осуществления процесса синтеза – воспроизведения ДНК по описанной выше схеме необходима деятельность специального ферментативного комплекса, носящего название ДНК-полимеразы. По-видимому, именно этот фермент осуществляет последовательно идущий от одного конца молекулы ДНК к другому процесс расхождения двух цепей с одновременной полимеризацией на них свободных нуклеотидов по комплементарному принципу. Таким образом, ДНК, подобно матрице, лишь задает порядок расположения нуклеотидов в синтезирующихся цепях, а сам процесс ведет белок. Работа фермента в ходе редупликации ДНК представляет собой на сегодня одну из наиболее интересных проблем. По-видимому, ДНК-полимераза как бы активно ползет вдоль двутяжной молекулы ДНК от одного ее конца к другому, оставляя позади себя раздвоенный редуплицированный «хвост». Физические принципы такой работы данного белка пока не ясны.

Однако ДНК и отдельные ее функциональные участки, несущие информацию о структуре белков, сами непосредственного участия в процессе создания белковых молекул не принимают. Первым этапом на пути к реализации этой информации, записанной в цепях ДНК, является так называемый процесс транскрипции, или «переписывания». В этом процессе на цепи ДНК, как на матрице, происходит синтез химически родственного полимера – рибонуклеиновой кислоты (РНК). Молекула РНК представляет собой одну цепь, мономерами которой являются четыре сорта рибонуклеотидов, которые рассматриваются как небольшая модификация четырех сортов дезоксирибонуклеотидов ДНК. Последовательность расположения четырех сортов рибонуклеотидов в образующейся цепи РНК в точности повторяет последовательность расположения соответствующих дезоксирибонуклеотидов одной из двух цепей ДНК. Таким путем нуклеотидная последовательность генов копируется в виде молекул РНК, т.е. информация, записанная в структуре данного гена, целиком переписывается на РНК. С каждого гена может сниматься большое, теоретически неограниченное количество таких «копий» – молекул РНК. Эти молекулы, переписанные во многих экземплярах как «копии» генов и стало быть несущие ту же информацию, что и гены, расходятся по клетке. Они уже непосредственно входят в связь с белоксинтезирующими частицами клетки и принимают «личное» участие в процессах создания белковых молекул. Другими словами, они переносят информацию от места, где она хранится, в места ее реализации. Соответственно эти РНК обозначают как информационные или матричные РНК, сокращенно мРНК (или иРНК).

Выяснено, что цепь информационной РНК синтезируется, прямо используя соответствующий участок ДНК в качестве матрицы. Синтезируемая цепь мРНК при этом точно копирует по своей нуклеотидной последовательности одну из двух цепей ДНК (принимая, что урацилу (У) в РНК соответствует его производное тимин (Т) в ДНК). Это происходит на основе того же структурного принципа комплементарности, который определяет редупликацию ДНК (рис. 18). Оказалось, что когда происходит синтез мРНК на ДНК в клетке, то в качестве матрицы для образования цепи мРНК используется лишь одна цепь ДНК. Тогда каждому Г этой цепи ДНК будет соответствовать Ц в строящейся цепи РНК, каждому Ц цепи ДНК – Г в цепи РНК, каждому Т цепи ДНК – А в цепи РНК и каждому А цепи ДНК – У в цепи РНК. В итоге получающаяся цепь РНК будет строго комплементарна к матричной цепи ДНК и, следовательно, идентичная по последовательности нуклеотидов (принимая Т = У) второй цепи ДНК. Таким образом происходит «переписывание» информации с ДНК на РНК, т.е. транскрипция. «Переписанные» сочетания нуклеотидов цепи РНК уже непосредственно определяют расстановку соответствующих, кодируемых ими аминокислот в цепи белка.

Здесь, как и при рассмотрении редупликации ДНК, в качестве одного из наиболее существенных моментов процесса транскрипции необходимо указать на его ферментативный характер. ДНК, являющаяся матрицей в этом процессе, целиком определяет расположение нуклеотидов в синтезирующейся цепи мРНК, всю специфичность образуемой РНК, но сам ход процесса осуществляется особым белком – ферментом. Этот фермент называется РНК-полимеразой. Его молекула имеет сложную организацию, позволяющую ему активно продвигаться вдоль молекулы ДНК, одновременно синтезируя цепочку РНК, комплементарную к одной из цепей ДНК. Молекула ДНК, служащая матрицей, при этом не расходуется и не изменяется, сохраняясь в прежнем виде и будучи всегда готова для такого переписывания с нее неограниченного количества «копий» – мРНК. Поток этих мРНК от ДНК к рибосомам и составляет тот поток информации, который обеспечивает программирование белоксинтезирующего аппарата клетки, всей совокупности ее рибосом.

Таким образом, рассмотренная часть схемы описывает поток информации, идущий от ДНК в виде молекул мРНК к внутриклеточным частицам, синтезирующим белки. Теперь мы обратимся к потоку иного рода – к потоку того материала, из которого должен создаваться белок. Элементарными единицами – мономерами – белковой молекулы являются аминокислоты, которых имеется 20 различных сортов. Для создания (синтеза) белковой молекулы свободные аминокислоты, присутствующие в клетке, должны быть вовлечены в соответствующий поток, поступающий в белоксинтезирующую частицу, и уже там расставлены в цепочку определенным уникальным образом, диктуемым информационной РНК. Такое вовлечение аминокислот – строительного материала для создания белка – осуществляется через присоединение свободных аминокислот к особым молекулам РНК относительно небольшого размера. Эти РНК, служащие для присоединения к ним свободных аминокислот, не будут информационными, а несут иную- адапторную – функцию, смысл которой будет виден дальше. Аминокислоты присоединяются к одному из концов небольших цепочек трансферных РНК (тРНК), по одной аминокислоте на одну молекулу РНК.

Для каждого сорта аминокислоты в клетке существуют  свои специфические, присоединяющие только этот сорт аминокислоты молекулы адапторных РНК. В таком навещенном на РНК виде, аминокислоты и поступают в белоксинтезирующие частицы.

Центральным моментом процесса биосинтеза белка является слияние этих двух внутриклеточных  потоков – потока информации и потока материала – в белоксинтезирующих частицах клетки. Эти частицы называются рибосомами. Рибосомы представляют собой ультрамикроскопические биохимические «машины» молекулярных размеров, где из поступающих аминокислотных остатков, согласно плану, заключенному в информационной РНК, собираются специфические белки. Хотя на данной схеме (рис. 19) изображена лишь одна частица, каждая клетка сдержит тысячи рибсом. Количество рибосом определяет общую интенсивность белкового синтеза в клетке. Диаметр одной рибосомной частицы около 20 нм. По своей химической природе рибосома – рибонуклеопротеид: она состоит из особой рибосомной РНК (это третий известный нам класс РНК в дополнение к информационным и адапторным РНК) и молекул структурного рибосомного белка. Вместе это сочетание нескольких десятков макромолекул образует идеально организованную и надежную «машину», обладающую свойством прочитывать информацию, заключенную в цепи мРНК, и реализовать ее в виде готовой белковой молекулы специфического строения. Поскольку существо процесса состоит в том, что линейная расстановка 20 сортов аминокислот в цепи белка однозначно детерминируется расположением четырех сортов нуклеотидов в цепи химически совсем иного полимера – нуклеиновой кислоты (мРНК), то этот процесс, происходящий в рибосоме, принято обозначать термином «трансляция», или «перевод» - перевод как бы с 4-буквенного алфавита цепей нуклеиновых кислот на 20-буквенный алфавит белковых (полипептидных) цепей. Как видно, в процессе трансляции участвуют все три известных класса РНК: информационная РНК, являющаяся объектом трансляции, рибосомная РНК, играющая роль организатора белоксинтезирующей рибонуклеопротеидной частицы – рибосомы, и адапторные РНК, осуществляющие функцию переводчика.

Процесс синтеза белка начинается при образовании соединений аминокислот с молекулами адапторных РНК, или тРНК. При этом сначала происходит энергетическая «активация» аминокислоты за счет ее ферментативной реакции с молекулой аденозинтрифосфата (АТФ), а затем «активированная» аминокислота соединяется с концом относительно недлинной цепочки тРНК, приращение химической энергии активированной аминокислоты запасается при этом в виде энергии химической связи между аминокислотой и тРНК.

Но одновременно с этим решается и вторая задача. Дело в том, что реакцию между аминокислотой и молекулой тРНК ведет фермент, обозначаемый как аминоацил-тРНК-синтетаза. Для каждого из 20 сортов аминокислот существуют свои особые ферменты, осуществляющие реакцию с участием только данной аминокислоты. Таким образом, существует не менее 20 ферментов (аминоацил-тРНК-синтетаза), каждый из которых специфичен для одного сорта аминокислоты. Каждый из этих ферментов может вести реакцию не с любой молекулой тРНК, а лишь с теми, которые несут строго определенное сочетание нуклеотидов в своей цепи. Таким образом, благодаря существованию набора столь специфических ферментов, различающих, с одной стороны, природу аминокислоты и, с другой – нуклеотидную последовательность тРНК, каждый из 20 сортов аминокислот оказывается «приписанным» только определенным тРНК с данным характерным нуклеотидным сочетанием.

Схематически некоторые моменты процесса биосинтеза белка, насколько мы их представляем на сегодняшний день, даны на рис. 19.

Здесь прежде всего видно, что молекула информационной РНК соединена с рибосомой или, как говорят, рибосома «запрограммирована» информационной РНК. В каждый данный момент непосредственно в самой рибосоме находятся лишь относительно короткий отрезок цепи мРНК. Но именно этот отрезок при участии рибосомы может взаимодействовать с молекулами адапторных РНК. И здесь снова главную роль играет уже дважды разбиравшийся выше принцип комплементарности.

В этом и состоит объяснение механизма того, почему данному триплету цепи мРНК соответствует строго определенная аминокислота. Видно, что необходимым промежуточным звеном, или адаптором, при «узнавании» каждой аминокислотой своего триплета на мРНК является адапторная РНК (тРНК).

Далее на схеме (см. рис. 19) видно, что в рибосоме помимо рассмотренной только что молекулы тРНК с навешенной аминокислотой находится еще одна молекула тРНК. Но, в отличие от рассмотренной выше молекулы тРНК, эта молекула тРНК своим концом присоединена к концу находящейся в процессе синтеза белковой (полипептидной) цепочки. Такое положение отражает динамику событий, происходящих в рибосоме в процессе синтеза белковой молекулы. Эту динамику можно представить себе следующим образом. Начнем с некоего промежуточного момента, отраженного на схеме и характеризующегося наличием уже начавшей строиться белковой цепочки, присоединенной к ней тРНК и только что вошедшей в рибосому и связавшейся с триплетом новой молекулы тРНК с соответствующей ей аминокислотой. По-видимому, сам акт присоединения молекулы тРНК к расположенному в данном месте рибосомы триплету мРНК приводит к такой взаимной ориентации и тесному контакту между аминокислотным остатком и строящейся цепью белка, что между ними возникает ковалентная связь. Связь возникает таким образом, что конец строящейся белковой цепи, на схеме присоединенный к тРНК, переносится от этой тРНК на аминокислотный остаток поступившей аминоацил-тРНК. В результате «правая» тРНК, сыграв роль «донора», окажется свободной, а белковая цепь – переброшенной на «акцептор» - «левую» (поступившую) аминоацил-тРНК, в итоге белковая цепь окажется удлиненной на одну аминокислоту и присоединенной к «левой» тРНК. Вслед за этим происходит переброска «левой» тРНК вместе со связанным с ней триплетом нуклеотидов мРНК «вправо», тогда прежняя «донорная» молекула тРНК окажется вытесненной отсюда и уйдет из рибосом, на ее месте появится новая тРНК со строящейся цепью белка, удлиненной на один аминокислотный остаток, а цепь мРНК будет продвинута относительно рибосомы на один триплет вправо. В результате продвижения цепи мРНК на один триплет вправо в рибосоме появится следующий вакантный триплет (УУУ), и к нему немедленно по комплементарному принципу присоединится соответствующая тРНК с аминокислотой (фенилаланил-тРНК). Это опять вызовет образование ковалентной (пептидной) связи между строящейся цепью белка и фенилаланиновым остатком и вслед за этим продвижение цепи мРНК на один триплет вправо со всеми вытекающими отсюда последствиями и т.д. Таким путем осуществляется последовательно, триплет за триплетом, протягивание цепи информационной РНК через рибосому, в результате чего цепь иРНК »прочитывается» рибосомой целиком, от начала до конца. Одновременно и сопряженно с этим происходит последовательное, аминокислота за аминокислотой, наращивание белковой цепочки. Соответственно в рибосому одна за другой поступают молекулы тРНК с аминокислотами и выходят молекулы тРНК без аминокислот. Оказываясь в растворе вне рибосомы, свободные молекулы тРНК снова соединяются с аминокислотами и опять несут их в рибосому, сами же, таким образом, циклично обращаясь без разрушения и изменения.

Глава 4. Морфология ядерных структур

Роль ядерных структур в жизнедеятельности клетки

Приведенный в главе 2 краткий обзор основных процессов, связанных с синтезом белка, в принципе одинаковых у всех форм живого, указывает на особое значение клеточного ядра. Ядро осуществляет две группы общих функций: одну, связанную собственно с хранением генетической информации, другую – с ее реализацией, с обеспечением синтеза белка.

В первую группу входят процессы, связанные с поддержанием наследственной информации в виде неизменной структуры ДНК. Эти процессы связаны с наличием так называемых репарационных ферментов, ликвидирующих спонтанные повреждения молекулы ДНК (разрыв одной из цепей ДНК, часть радиационных повреждений), что сохраняет строение молекул ДНК практически неизменным в ряду поколений клеток или организмов. Далее, в ядре происходит воспроизведение или редупликация и разъединение (сегрегация) молекул ДНК, что дает возможность двум клеткам получить совершенно одинаковые и в качественном и количественном смысле объемы генетической информации. В ядре эукариот происходят процессы изменения и рекомбинации генетического материала, что наблюдается во время мейоза (кроссинговер). Наконец, ядра непосредственно участвуют в процессах распределения молекул ДНК при делении клеток.

Другой группой клеточных процессов, обеспечивающихся активностью ядра, является создание собственного аппарата белкового синтеза. Это не только синтез, транскрипция, на молекулах ДНК разных информационных РНК, но также транскрипция всех видов трансферных РНК и рибосомных РНК. В ядрах эукариотических клеток происходит «созревание» (процессинг, сплайсинг) первичных транскриптов. В ядре эукариот происходит также образование субъединиц рибосом путем комплексирования синтезированных в ядрышке рибосомных РНК с рибосомными белками, которые синтезируются в цитоплазме и переносятся в ядро. Таким образом, ядро представляет собой не только вместилище генетического материала, но и место, где этот материал воспроизводится и функционирует. Поэтому выпадение или нарушение любой из перечисленных выше функций гибельно для клетки в целом. Так, нарушение репарационных процессов будет приводить к изменению первичной структуры ДНК и автоматически к изменению структуры белков, что непременно скажется на их специфической активности, которая может просто исчезнуть или измениться так, что не будет обеспечивать клеточные функции, в результате чего клетка погибает. Нарушения редупликации ДНК приведут к остановке размножения клеток или к появлению клеток с неполноценным набором генетической информации, что тоже гибельно для клеток. К такому же результату приведет нарушение процессов распределения генетического материала (молекул ДНК) при делении клеток. Выпадение в результате поражения ядра или в случае нарушений каких-либо регуляторных процессов синтеза любой формы РНК автоматически приведет к остановке синтеза белка в клетке ли к грубым его нарушениям.

Все это указывает на ведущее значение ядерных структур в процессах, связанных с синтезом нуклеиновых кислот и белков – основных функционеров в жизнедеятельности клетки.

Однако, что необходимо еще раз подчеркнуть, что функционирование ядра как системы хранения и реализации генетической информации сопряжено, неразрывно связано, с другими функциональными системами клетки, которые обеспечивают работу ядра специальными белками, потоком предшественников, энергией и пр.

Ядерные компоненты прокариот

Как уже говорилось клетки царства прокариотических или «доядерных» организмов, не имеют обособленного клеточного ядра. Однако у всех прокариотических клеток есть аналог ядра эукариот, который носит название нуклеоид или нуклеоплазма. Нуклеоид прокариот можно отнести к собственно ядерным структурам из-за того, что он содержит ДНК. Нуклеоид достаточно четко выявляется в световом микроскопе после специфической окраски на ДНК по методу Фёльгена или при окраске флуорохромами. Его можно наблюдать и с помощью фазово-контрастного устройства у крупных бактерий или сине-зеленых водорослей, как темное и более контрастное образование в срединной части клетки. На ультратонких срезах зона нуклеоида представлена тонкими рыхлыми сетями фибрилл толщиной 2-7 нм (рис. 1, 20). Эта зона нуклеоида или нуклеоплазмы на ультратонких срезах свободна от других структур и выглядит более светлой по сравнению с окружающей цитоплазмой, заполненной рибосомами, различными гранулами и мембранами. Иногда на срезах можно наблюдать контакты фибрилл нуклеоида с плазматической мембраной, с ее выростами.

Нуклеоиды бактерий можно выделить, их состав и структура изучены довольно подробно, они на 80% состоят из ДНК, кроме которой обнаруживаются различные белки (20%) и РНК.

Количество ДНК в прокариотических клетках значительно меньше, чем в клетках эукариот. Например, бактерия E. coli содержит 5 х 10-3 пг*  ДНК, которая кодирует около 2000 генов, в то время как в ядре клетки человека содержится около 6 пг ДНК, что соответствует огромному (105) числу генов.

С помощью метода адиоавторграфии меченных молекул ДНК в световом микроскопе было обнаружено, что бактериальные ДНК представляют собою замкнутые циклы. У E. coli периметр такого кольца составляет около 1,6 мм, и считается, что на клетку приходится одна гигантская циклическая молекула ДНК, одна бактериальная хромосома или генофор с молекулярной массой 4 х 109 Д. Самая маленькая бактериальная хромосома обнаружена в клетках

-------

* Единицы измерения ДНК: пг – 1 х 10-12 г; Да – 1,67-24 г; 1 нуклеотидная пара (н.п.) – 1 х 103 Д, величина н.п.  0,34 нм.

микоплазмы – 0,25 мм (для сравнения, длина ДНК на одну хромосому эукариотической дрожжевой клетки составляет около 4,6 мм, а у человека – 40 мм (!) в 1 хромосоме).

У ряда бактерий, например у B. subtilis имеется от 2 до 9 одинаковых молекул ДНК и соответственно несколько нуклеоидов. В других случаях (Azotobacter vinelandii) около 40 хромосом организованы в один нуклеоид.

С помощью авторадиографической методики было также обнаружено, что репликация такой кольцевой хромосомы у E. coli начинается на одной исходной (origin) точке репликации, образуются две репликационные вилки, которые по мере синтеза ДНК движутся вдоль молекулы до терминальной, конечной точки (рис. 21). Тем самым вся такая гигантская молекула ДНК представляет единицу репликации, репликон. Скорость репликации у бактерий составляет около 30 мкм в мин., что согласуется со временем удвоения клеток равным около 40 мин.

Бактериальные хромосомы всегда связаны с плазматической мембраной через специфические мембранные белки, которые взаимодействуют с ДНК в зоне старта ее синтеза (рис. 22). В процессе клеточного деления существенных изменений в компактности нуклеоплазмы не наблюдается, в отличие от эукариотических хромосом.

Такие кольцевые молекулы ДНК бактерий были получены при полном удалении белков (депротеинизация). Если же изучать выделенные целые нуклеоиды бактерий, то они представляют собой тела, состоящие из многочисленных суперспирализованных петель ДНК, отходящих от плотной центральной области (рис. 23). В одну такую петлю или домен входит до 10-15 мкм ДНК, или около 40 000 н.п., а всего таких петель – около 120.

Обработка выделенных нуклеоидов РНК-азой и протеолитическими ферментами приводит к разрыхлению центральной области нуклеоидов, а короткая обработка ДНК-азой – к снятию сверхспирализации петель, и декомпактизации всего нуклеоида. Таким образом было показано, что компактизация нуклеоида связана с наличием связок, содержащих РНК и некоторые белки. Тем самым гигантская кольцевая молекула – хромосома с помощью РНК и белков многократно складывается, образуя многочисленные петли, ДНК которых подвергается сверхспирализации, что приводит к значительной компактизации всего комплекса, который и представляет собой нуклеоид. Степень компактизации ДНК в нуклеоиде бактерий достигает 1000 крат, а концентрация ДНК доходит до 10 мг/мл (!). Необходимо подчеркнуть, что часть ДНК нуклеоида связана с небольшим числом специальных основных белков, отличных от гистонов эукариот. Одна молекула одного из таких белков (H-NS) приходится на 400 н.п. ДНК. С петлями ДНК нуклеоида связано большое число молекул различных синтезируемых РНК и рибосом, которые обнаруживаются по периферии нуклеоплазмы.

Одна из моделей организации нуклеоида предполагает, что центральная его часть представлена неактивной и сверхспирализованной ДНК, тогда как по его периферии расположены деспирализованные петли, на которых происходит синтез различных РНК (рис. 24).

Отличительной чертой ядерных структур прокариот является то, что у них синтез РНК и синтез белка может происходить одновременно: рибосомы связываются с еще не до конца синтезированными молекулами иРНК и производят на них синтез белка. Таким образом возникает тройственный синтетический комплекс: ДНК – синтезирующая цепь РНК – рибосомы с синтезируемой полипептидной цепочкой (рис. 25). Такая ситуация возможна лишь в том случае, когда образующаяся молекула иРНК не подвергается дальнейшей модификации типа процессинга, характерного для эукариотических клеток (см.ниже). У прокариотов, таким образом, процессы транскрипции и трансляции не разобщены территориально, в то время как у эукариотических клеток эти процессы протекают в двух разных компартментах, разделенных специальной ядерной оболочкой.

Отличается поведение ядерного материала прокариотов от такового эукариот при делении клетки, и в течение клеточного цикла.

Клеточный цикл – это время существования клетки от деления до деления. Как уже указывалось, деление всех типов клеток происходит только после удвоения ДНК. У бактерий часто сам процесс разделения тела клетки, цитотомия, не связана с окончанием синтеза ДНК, т.к. до наступления клеточного деления может начаться второй или даже третий раунд репликации ДНК. В результате такого беспрерывного синтеза ДНК в быстро растущих культурах на каждую разделившуюся клетку приходится одна кольцевая хромосома на промежуточных стадиях ее дальнейшего удвоения (рис. 26), т.е. каждая дочерняя клетка сразу после деления уже содержит частично реплицированный геном.

При делении бактериальных клеток не происходит особой конденсации ДНК в составе нуклеоида. По мере роста клетки в длину зона нуклеоида после синтеза ДНК увеличивается, а затем делится с помощью специального механизма. Обособление и разъединение двух дочерних хромосом связано с расхождением мест прикрепления хромосом к плазматической мембране (см. ниже).

Ядро эукариотических клеток

Сам термин «ядро» впервые был применен Брауном в 1833 г. Для обозначения шаровидных постоянных структур в клетках растений. Позднее такую же структуру описали во всех клетках высших организмов.

Ядерный аппарат эукариотических клеток имеет ряд отличий от прокариотических. Во-первых, ДНК-содержащий компонент отделен от цитоплазмы специальной оболочкой (ядерная оболочка), во-вторых, количество ДНК в ядах эукариот в тысячи раз больше, чем в составе нуклеоидов бактерий, в-третьих, ДНК эукариот представляет собой сложный нуклеопротеидный комплекс, образующий специальную структуру – хроматин, из которого и состоят эукариотические хромосомы. Далее – в состав ядер эукариот входят несколько физически не связанных хромосом, каждая из которых содержит одну линейную гигантскую молекулу ДНК. Каждая хромосомная ДНК представляет собой полирепликонную структуру, т.е. содержит множеств автономно реплицирующихся участков. Синтез и образование транскриптов эукариотических клеток сопровождается процессами вторичной их перестройки, «созревания», включающих в себя как фрагментацию (процессинг), так и сращивание отдельных фрагментов ДНК (сплайсинг). Наконец, в ядрах не происходит синтеза белков, т.е. в эукариотических клетках процессы синтеза ДНК и РНК разобщены от процесса синтеза белков.

Клеточное ядро, обычно одно на клетку (есть примеры многоядерных клеток), состоит из ядерной оболочки, отделяющей его от цитоплазмы, хроматина, ядрышка и других продуктов синтетической активности, ядерного белкового остова (матрикса) и кариоплазмы (или ядерного сока) (рис. 27.). Эти основные компоненты встречаются практически во всех неделящихся клетках эукариотических одно- или многоклеточных организмов.

Главный компонент ядер, хроматин, является структурой, выполняющей генетическую функцию клетки, в хроматиновой ДНК заложена практически вся генетическая информация. Ядерная оболочка выполняет сложную барьерно-рецепторную, а также транспортную и каркасную функцию. Нехроматиновый ядерный белковый остов (матрикс) обеспечивает не только пространственное расположение хромосом в ядре, но и участвует в их функциональной активности. Одним из хромосомных участков, определяющих синтез рРНК и образование клеточных рибосом, является ядрышко. Кроме того в ядре в связи с хроматином и матриксом обнаруживаются различные рибонуклеопротеидные структуры, содержащие разные типы РНК. Между всеми этими компонентами заключена жидкая фаза клеточного ядра, кариоплазма, в которой протекают многие процессы, связанные как с ядерным метаболизмом, так и с внутриядерным транспортом белков и РНК.

При наблюдении многих живых клеток, особенно растительных или же клеток после фиксации и окраски, внутри ядра выявляются зоны плотного вещества, которое хорошо воспринимает разные красители, особенно основные. Благодаря такой способности хорошо окрашиваться этот компонент ядра и получил название «хроматин» (Флемминг, 1880). Способность хроматина воспринимать основные (щелочные) красители указывает на его кислотные свойства, которые определяются тем, что в состав хроматина входит ДНК в комплексе с белками. Такими же свойствами окрашиваемости и содержанием ДНК обладают и хромосомы, которые можно наблюдать во время митотического деления клеток.

В отличие от прокариотических клеток, ДНК-содержащий материал хроматина эукариот, может пребывать в двух альтернативных состояниях: деконденсированном в интерфазе и в максимально уплотненном – во время митоза, в составе митотических хромосом.

В неделящихся (интерфазных) клетках хроматин, выявляемый в обычный микроскоп, может равномерно заполнять объем ядра или же располагаться отдельными сгустками (хромоцентры). Часто он особенно четко выявляется на периферии ядра (пристеночный, маргинальный, примембранный хроматин) или образует внутри ядра переплетения довольно толстых (около 0,3 мкм) и длинных тяжей, образующих подобие внутриядерной сети. Такие ядра часто встречаются в клетках растений (рис. 28, 29, 30).

Хроматин интерфазных ядер представляет собой несущие ДНК тельца (хромосомы), которые теряют в это время свою компактную форму, разрыхляются, деконденсируются. Степень такой деконденсации хромосом может быть различной в ядрах разных клеток. Когда хромосома или ее участок полностью деконденсирован, тогда эти зоны называют диффузным хроматином. При неполном разрыхлении хромосом в интерфазном ядре видны участки конденсированного хроматина (иногда называемого гетерохроматин). Показано многочисленными работами, что степень деконденсации хромосомного материала, хроматина, в интерфазе может отражать функциональную нагрузку этой структуры. Чем более дифффузен хроматин интерфазного ядра, тем выше в нем синтетические процессы. Так, в клетках лимфоцитов хроматин образует значительные скопления по периферии клеточного ядра. При стимуляции этих клеток к синтезу ДНК по мере включения предшественника ДНК 3Н-тимидина происходит постепенная деконденсация хроматина. Таким же образом меняется структура хроматина при синтезе РНК. Падение синтеза ДНК и РНК в клетках обычно сопровождается увеличением зон конденсированного хроматина. Так, в эритроцитах низших позвоночных практически весь хроматин ядер находится в конденсированном состоянии, и в этих ядрах не происходит синтеза ни РНК, ни ДНК. Если же ядра этих клеток стимулировать к синтезу РНК, например, в гетерокарионах (см. ниже), то они переходят в диффузное состояние.

Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, когда он обнаруживается в виде телец – хромосом. В этот период хромосомы не несут никаких синтетических нагрузок, в них не происходит включения предшественников ДНК и РНК.

Исходя из этого можно считать, что хромосомы клеток могут находиться в двух структурно-функциональных состояниях: в рабочем, частично или полностью деконденсированном, когда с их участием в интерфазном ядре происходят процессы транскрипции и редупликации, и в неактивном – в состоянии метаболического покоя при максимальной их конденсации, когда они выполняют функцию распределения и переноса генетического материала в дочерние клетки.

Эухроматин и гетерохроматин

Было отмечено многими исследователями, что степень структуризации, конденсации хроматина в интерфазных ядрах может быть выражена в разной мере. Так в интенсивно делящихся и в мало специализированных клетках ядра имеют диффузную структуру, в них кроме узкого периферического ободка конденсированного хроматина встречается небольшое число мелких хромоцентров, основная же часть ядра занята диффузным, деконденсированным хроматином. С другой стороны в клетках высокоспециализированных или в клетках, заканчивающих свой жизненный цикл, хроматин представлен в виде массивного периферического слоя и крупных хромоцентров, блоков конденсированного хроматина. Такую структуру имеют, например, ядра нормобластов (одна из стадий дифференцировки эритроцитов), ядра зрелых лейкоцитов. Эти два примера могут иллюстрировать общее правило: чем больше в ядре доля конденсированного хроматина, тем меньше метаболическая активность ядра. При естественной или экспериментальной инактивации ядер происходит прогрессивная конденсация хроматина, и, наоборот, при активации ядер увеличивается доля диффузного хроматина.

Однако при метаболической активации не всякие участки конденсированного хроматина могут переходить в диффузную форму. Еще в начале 30-х годов было замечено Э. Гейтцем, что в интерфазных ядрах существуют постоянные участки конденсированного хроматина, наличие которого не зависит от степени дифференцированнности ткани или от функциональной активности клеток. Такие участки получили название гетерохроматина, в отличие от остальной массы хроматина – эухроматина (собственно хроматина). По этим представлениям, гетерохроматин – компактные участки хромосом, которые в профазе появляются раньше других частей в составе митотических хромосом, и в телофазе не деконденсируются, переходя в интерфазное ядро в виде интенсивно красящихся плотных структур (хромоцентры). Первоначально понятие гетерохроматина имело сугубо морфологическое значение, потому что, изучая препараты окрашенных ядер, конечно нельзя знать, может ли данный участок конденсированного хроматина, хромоцентр, перейти в будущем в разрыхленное, эухроматическое состояние, или нет. В связи с этим в специальной цитологической литературе часто без всякого основания любой участок конденсированного хроматина стали называть гетерохроматином. Процесс же общей конденсации хроматина, например в ядрах лейкоцитов, называли гетерохроматизацией ядер. На самом же деле в составе ядерного хроматина только лишь некоторые участки практически никогда не теряют особого конденсированного состояния. Такими постоянно конденсированными зонами чаще всего являются центромерные и теломерные участки хромосом. Кроме них постоянно конденсированными могут быть также некоторые участки, входящие в состав плечей хромосом – вставочный или интеркалярный гетерохроматин, который в ядрах также представлен в виде хромоцентров. Такие постоянно конденсированные участки хромосом в интерфазных ядрах сейчас принято называть конститутивным (постоянным) гетерохроматином. Здесь же необходимо отметить, что участки конститутивного гетерохроматина обладают целым рядом особенностей, которые отличают его от остального хроматина. Конститутивный гетерохроматин генетически не активен, он не транскрибируется, реплицируется он позже всего остального хроматина, в его состав входит особая (сателлитная) ДНК, обогащенная высокоповторяющимися последовательностями нуклеотидов (см. ниже); он локализован в центромерных, теломерных и интеркалярных зонах митотических хромосом. Доля конститутивного хроматина может быть неодинаковой у разных объектов. Так у млекопитающих на него приходится 10-15% всего генома, а у некоторых амфибий – даже до 60%. Функциональное значение конститутивного гетерохроматина до конца не выяснено, предполагается, что он несет ряд важных функций, связанных со спариванием гомологов в мейозе, со структуризацией интерфазного ядра, с некоторыми регуляторными функциями.

Вся остальная, основная масса хроматина ядра может менять степень своей компактизации в зависимости от функциональной активности, она относится  к эухроматину. Эухроматические неактивные участки, которые находятся в конденсированном состоянии, стали называть факультативным гетерохроматином, подчеркивая необязательность такого его состояния. Хорошим примером факультативного гетерохроматина может служить X-хромосома в организме человека. В клетках мужской особи X-хромосома деконденсирована, она активна, транскрибируется и морфологически не выявляется из-за своего рыхлого, диффузного состояния. В клетках женского организма, где присутствуют две X-хромосомы, одна из них находится в активном, диффузном состоянии, а вторая – в неактивном, конденсированном, она временно гетерохроматизована. В этом состоянии она может существовать в течение всей жизни организма. Но потомки ее, попадая в клетки мужского организма следующего поколения, снова будут активированы.

В дифференцированных клетках всего лишь около 10% генов находится в активном состоянии, остальные гены инактивированы и, соответственно, находятся в составе конденсированного хроматина (факультативный гетерохроматин). Это обстоятельство объясняет, почему большая часть хроматина ядра структурирована.

В таблице 1. даны сравнительные общие характеристики эухроматических и гетерохроматических районов интерфазных хромосом.

Таблица 1.

Свойства

Эухроматин

Гетерохроматин конститутивный

Активный

Неактивный

(факультативный гетерохроматин)

Структура             диффузный     конденсированный       конденсированный

Синтез РНК                  +                              -                                   -

Синтез ДНК                 +                              +                                  +

                                                                                              поздняя репликация

Тип нуклеотид-   уникальные,         уникальные,           высокоповторяющаяся,

ных последова-   умеренные            умеренные             сателлитная  ДНК

тельностей ДНК  повторы                повторы

Локализация        плечи                     плечи                     центромера, теломера,

                             хромосом              хромосом               интеркалярный гетеро-

                                                                                            хроматин

Хромосомный цикл

Как известно, половые женские и мужские клетки несут одинарный набор хромосом и, следовательно, содержат в 2 раза меньше ДНК, чем все остальные клетки организма. Половые клетки (сперматозоиды и ооциты) с одинарным набором хромосом называют гаплоидными. Плоидность (от греч. ploos –кратность) обозначают буквой n, так, клетки с 1n – гаплоидны, с 2n – диплоидны, с 3n – триплоидны и т.д. Соответственно количество ДНК на клетку (с) зависит от ее плоидности: клетки с 2n числом хромосом содержат 2с количества ДНК. При оплодотворении происходит слияние двух клеток, каждая из которых несет 1n набор хромосом, поэтому образуется исходная диплоидная (2n, 2c) клетка, зигота. В дальнейшем в результате деления диплоидной зиготы и последующего деления диплоидных клеток разовьется организм, клетки которого, кроме половых, будут диплоидными.

Однако мы знаем, что процессу деления клеток предшествует фаза синтеза, редупликации ДНК, что должно приводить к появлению клеток с 4с количеством ДНК, у которых количество хромосом 4n, т.е. в два раза больше, чем у исходной диплоидные клетки. И только после деления такой тетраплоидной (4с) клетки снова возникнут две исходные диплоидные клетки.

В ядрах интерфазных клеток выявить с помощью морфологических методов тела хромосом очень трудно. Собственно хромосомы как четкие, плотные, хорошо видимые в световой микроскоп тела выявляются только незадолго перед клеточным делением. В самой же интерфазе хромосом как плотных тел не видно, так как они находятся в разрыхленном состоянии. В интерфазе происходит удвоение, редупликация хромосом. Этот период характеризуется синтезом ДНК, он называется синтетическим, или s-периодом. Как раз в это время в клетках обнаруживается количество ДНК большее, чем 2с. После окончания s-периода количество ДНК в интерфазном ядре равно 4с, ибо произошло полное удвоение хромосомного материала. Однако морфологически регистрировать удвоение числа хромосом на этой стадии не всегда удается. Собственно хромосомы как нитевидные плотные тела начинают обнаруживаться микроскопически в начале процесса деления клетки, а именно в профазе митотического деления клетки (рис. 31). Если попытаться подсчитать число хромосом в профазе, то их количество будет равно 2n. Но это ложное впечатление, потому что в профазе каждая из хромосом двойная в результате их редупликации. На этой стадии пара хромосом тесно соприкасается друг с другом, взаимно спирализуясь одна относительно другой, поэтому трудно увидеть двойственность всей структуры в целом. Позднее хромосомы в каждой такой паре начинают обосабливаться, раскручиваться. Такая двойственность хромосом в митозе наблюдается даже у живых клеток в конце профазы, когда видно, что общее число хромосом в такой начинающей делиться клетке равно 4n. Следовательно, уже в начале профазы хромосомы состояли из двух сестринских хромосом, или, как их еще называют, хроматид.

И в профазе, и в следующем периоде деления клетки – в метафазе –сестринские хромосомы остаются связанными друг с другом в виде пары. В метафазе происходит выстраивание хромосом в экваториальной плоскости клетки и окончательное их разъединение. И в профазе и в метафазе клетки остаются тетраплоидными.

В анафазе идет расхождение каждой из хромосом данной пары к противоположным полюсам клетки, после чего начинает делиться тело исходной клетки. Затем в телофазе разошедшиеся диплоидные (2n) наборы хромосом начинают деконденсироваться. Отдельные хромосомы теряют свои четкие очертания и теперь уже внутри нового интерфазного диплоидного ядра с 2с ДНК трудно узнать хромосомы, которые мы могли видеть во время митоза. Так заканчивается один хромосомный цикл и начинается следующий.

Общая морфология митотических хромосом

Хромосомы всех эукариотических клеток построены по одному плану. Они включают в себя три основных компонента: собственно тело хромосомы (плечо), теломерный, конечный участок, и центромеру. Наиболее просто устроены хромосомы дрожжевых клеток: палочковидное тело хромосомы на одном конце имеет теломеру, а на другом – центромеру (рис. 32). Хромосомы животных и растений также представляют собой палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной, но обычно имеют два хромосомных плеча, соединенных в зоне центромеры. Эта зона называется первичной перетяжкой. Соответственно оба плеча хромосомы оканчиваются теломерами (рис. 32). Хромосомы с равными или почти равными плечами называют метацентрическими, с плечами неодинаковой длины – субметацентрическими. Палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом – акроцентрические.

В области первичной перетяжки (центромеры)  расположен кинетохор - пластинчатая структура, имеющая форму диска. К нему подходят пучки микротрубочек митотического веретена, идущие в направлении к центриолям. Эти пучки микротрубочек принимают участие в движении хромосом к полюсам клетки при митозе.

Обычно каждая хромосома имеет только одну центромеру (моноцентрические хромосомы), но могут встречаться хромосомы дицентрические и полицентрические, т.е. обладающие множественными кинетохорами.

В зоне первичной перетяжки присутствует особая, центромерная, сателлитная ДНК, отличающаяся высоким уровнем повторенности нуклеотидных последовательностей.

Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку. Последняя обычно расположена вблизи дистального конца хромосомы и отделяет маленький участок, спутник. Вторичные перетяжки называют, кроме того, ядрышковыми организаторами, так как именно на этих участках хромосом в интерфазе происходит образование ядрышка. Здесь же локализована ДНК, ответственная за синтез рРНК. В хромосомах человека ядрышковые организаторы расположены в коротких плечах вблизи центромер.

Плечи хромосом оканчиваются теломерами, конечными участками. Теломерные концы хромосом не способны соединяться с другими хромосомами или их фрагментами, в отличие от концов хромосом, лишенных теломерных участков (в результате разрывов), которые могут присоединяться к таким же разорванным концам других хромосом. В теломерах локализована особая теломерная ДНК, защищающая хромосому от укорачивания в процессе синтеза ДНК.

Размеры хромосом у разных организмов варьируют в широких пределах (рис. 33). Так, длина хромосом может колебаться от 0,2 до 50 мкм. Самые мелкие хромосомы обнаруживаются у некоторых простейших, грибов, водорослей, очень мелкие хромосомы – у льна и морского камыша; они настолько малы, что с трудом видны в световой микроскоп. Наиболее длинные хромосомы обнаружены у некоторых прямокрылых насекомых, у амфибий и у лилейных. Длина хромосом человека находится в пределах 1,5-10 мкм.

Число хромосом у различных объектов также значительно колеблется, но характерно для каждого вида животных и растений. У некоторых радиолярий число хромосом достигает 1000-1600. Рекордсменом среди растений по числу хромосом (около 500) является папоротник ужовник, 308 хромосом у тутового дерева, у речного рака 196 хромосом. Наименьшее количество хромосом (1 хромосома на гаплоидный набор) наблюдается у одной из рас аскариды, у сложноцветного Haplopappus gracilis всего 4 хромосомы (2 пары).

Совокупность числа, величины и морфологии хромосом называется кариотипом данного вида. Кариотип – это как бы лицо вида. Даже у близких видов хромосомные наборы отличаются друг от друга или по числу хромосом, или по величине хотя бы одной или нескольких хромосом, или по форме хромосом и по их структуре. Структура кариотипа данного вида не зависит ни от типа клеток, ни от возраста животного или растения. Все клетки индивидуумов одного вида имеют идентичные наборы хромосом. Простой морфологический  анализ может убедительно показать различия в кариотипах даже у близких видов. Следовательно, структура кариотипа может быть таксономическим (систематическим) признаком, который все чаще используется в систематике животных и растений (рис. 34).

В последние годы в практику хромосомного анализа стали широко входить методы дифференциального окрашивания хромосом. Впервые метод был предложен Касперссоном, который показал, что при обработке препаратов митотических хромосом с помощью флуорохрома акрихиниприта во флуоресцентном микроскопе видна исчерченность по длине хромосом. В хромосомах были видны поперечные светящиеся полосы («бэнды») (Qполосы, Qокраска), расположение которых было характерно для каждой хромосомы.

Затем оказалось, что исчерченность тела хромосомы, ее способность дифференциально окрашиваться по длине, можно выявить с помощью нефлуоресцирующих красителей (например, смесь по Гимза: метилен-азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин). Перед окраской препараты обрабатывают разными способами (короткая обработка трипсином, щелочными или кислыми растворами и др.). В зависимости от метода окраски можно выявить окрашивание прицентромерных участков (C-полосы или перевязки) или различные полосы в плечах и теломерах хромосом (G-полосы). При этом, так же как при окраске акрихинипритом, расположение полос характерно для каждой хромосомы (рис. 35).

Интересно, что получение дифференциальной окраски хромосом связано, скорее всего, с различной способностью к искусственной деконденсации разных участков хромосом. Так, дифференциальную окраску, соответствующую C- и G-полосам, можно получить при окраске обычным гематоксилином или просто наблюдать под фазовым контрастом на нефиксированных хромосомах в процессе их постепенной деконденсации при удалении двухвалентных катионов из окружающих хромосомы растворов, т.е. наблюдать дифференциальную деконденсацию митотических хромосом.

Такая дифференциальная окраска позволила детально изучить строение хромосом человека. При обычных методах окраски весь набор из 46 хромосом человека принято подразделять по их размерам на 7 групп (A, B, C, D, E, F, G). Если при этом легко отличить крупные (1, 2) хромосомы от мелких (19, 20), метацентрические от акроцентрических (13-я), то внутри групп трудно различить одну хромосому от другой. Так, в группе C 6-я и 7-я хромосомы схожи между собой так же, как и с X-хромосомой (рис. 36). Дифференциальное окрашивание позволяет четко отличить эти хромосомы друг от друга (рис. 37). Этот прием цитологического анализа в сочетании с генетическими наблюдениями уже в настоящее время позволил начать составлять хромосомные карты человека, т.е. находить места расположения генов на определенных участках хромосом (рис. 38).

Несмотря на то, что молекулярные механизмы такой специфической окраски до сих пор еще не ясны, многие исследователи такую способность отдельных участков хромосом к окрашиванию связывают с их химическими различиями. Большое число наблюдений говорит о том, что избирательное окрашивание связано с локализацией так называемого гетерохроматина, ДНК которого обогащена A- и T-основаниями.

Клеточный цикл эукариот

В отличие от клеточного цикла прокариот эукариотические клетки удваивают число своих хромосом в результате синтеза ДНК задолго до цитотомии, до разделения исходной клетки на две дочерние. И время протекания клеточного цикла у эукариот значительно больше времени клеточного цикла бактерий. Так, если для бактериальных клеток время от деления до деления клетки составляет 20-30 мин., то у одноклеточных эукариот, таких как инфузория туфелька клеточный цикл занимает уже 10-20 часов, время клеточного цикла у амебы составляет около 1,5 суток. Около суток занимает клеточный цикл и у многоклеточных организмов.

Клетки многоклеточных организмов обладает разной способностью к делению. Если в раннем эмбриогенезе клетки животных организмов делятся часто, то во взрослом организме они большей частью теряют эту способность. У круглых червей и коловраток клетки теряют способность к делению после прохождения эмбрионального развития, и рост организма, например у аскариды, происходит не за счет роста числа клеток, а за счет увеличения их размера.

В организме высших позвоночных клетки различных тканей и органов имеют неодинаковую способность к делению. Здесь встречаются клетки, полностью потерявшие свойство делиться: это большей частью специализированные, дифференцированные клетки (например, клетки центральной нервной системы, кардиомиоциты, клетки хрусталика глаза). В организме есть постоянно обновляющиеся ткани (различные эпителии, кровь, клетки рыхлой и плотной соединительных тканей). В этом случае в таких тканях существует часть клеток, которые постоянно делятся (например, клетки базального слоя покровного эпителия, клетки крипт кишечника, кроветворные клетки костного мозга и селезенки), заменяя отработавшие или погибающие клеточные типы. Многие клетки, не размножающиеся в обычных условиях, приобретают вновь это свойство при процессах репаративной регенерации органов и тканей.

Примерно такие же типы клеток по способности их вступать в деление встречаются и у растительных организмов: Это камбиальные клетки, дающие начало различным органам и тканям, клетки интенсивно делящиеся, это клетки, возобновляющие деление при регенерации, это дифференцированные клетки, потерявшие в естественных условиях способность делиться.

Клетки многоклеточных животных и растений, так же как одноклеточные эукариотические организмы, вступают в процесс деления после ряда подготовительных процессов, важнейшим из которых является синтез ДНК.

Весь смысл клеточного деления заключается в равномерном распределении редуплицированного генетического материала по двум новым клеткам. Следовательно, нужно ожидать, что отделения до деления где-то в течение жизни клетки должен существовать период синтеза ДНК. Это предположение было подтверждено в радиоавтографических экспериментах. Если размножающимся клеткам животных или растений дать на короткое время меченый предшественник ДНК, а затем его убрать (так называемое импульсное мечение), то он будет включаться только в те клетки, в которых во время эксперимента шел синтез ДНК. В гетерогенной популяции клеток, среди которых были как делящиеся, так и неделящиеся клетки, метка включалась только в часть интерфазных клеток. Это наблюдение показывало, что синтез ДНК происходит только в интерфазе, в которой существуют периоды, когда синтез ДНК не происходит; отсутствие метки в некоторых интерфазных клетках могло говорить, что в них синтез ДНК или еще не начинался, или уже закончился.

Это положение было доказано следующим образом. Если клеткам дать импульсную метку (например, меченный тритием предшественник ДНК, тимидин), а затем наблюдать за распределением метки среди клеток, взятых через определенные интервалы времени, то можно наблюдать следующую картину. Через некоторое время в образцах будут встречаться как меченые интерфазные клетки, так и немеченые клетки и делящиеся клетки, не содержащие метку. Делящиеся, но не содержащие метки – это те клетки, которые уже закончили синтез ДНК до начала эксперимента. Позднее в препаратах начинают появляться меченые делящиеся клетки. Это как раз те клетки, которые в момент введения меченого предшественника в интерфазе синтезировали ДНК, были в синтетическом периоде (S-период). Через некоторое время снова появляются немеченые делящиеся клетки, те, которые в момент введения меченого предшественника в интерфазе еще не вступили в S-период. Наконец, снова появляются меченые делящиеся клетки – это те, которые вступили в деление уже второй раз. Если построить график встречаемости меченых митозов (рис. 39), то получится многовершинная кривая: точки между соседними вершинами будут отражать полную длительность времени от деления до деления клетки – длительность клеточного цикла. Время от начала эксперимента до появления первых меченых митозов – это время интерфазы после S-периода, постсинтетический период или, как принято его обозначать, G2период.

Оказалось, что S-периоду предшествует пресинтетический период, G1период, отрезок времени, предшествующий началу синтеза ДНК. Зная длительность клеточного синтеза, по проценту меченых клеток при импульсном введении меченого предшественника можно рассчитать длительность S-периода. Так, например, при времени Т, равным 20 часам, среди клеток встречается до 30% клеток, меченных 3H -тимином, из чего следует, что длительность S-периода занимает около 7 часов. Таким образом, весь клеточный цикл состоит как бы из четырех отрезков времени: собственно митоз (М), пресинтетический (G1), синтетический (S) и постсинтетический (G2) периоды: T = G1 + S = G2 + M.

Как было найдено, общая продолжительность как всего клеточного цикла, так и отдельных его отрезков (периодов) значительно варьируют не только у разных организмов, но и у клеток разных органов одного организма.

Таблица 2.  Длительность митотического цикла и его периодов (в часах)

Вид

Митоти-

Ческий цикл

Митоз

G1

S

G2

Вика посевная (20оС)

Боковые корни                        18,1            1,0           3,7             8,0           5,4

Горох (22о)                              19,3          2,3            6,7             8,0            2,3

Кукуруза

клетки периферии чехлика   22,5         2,2             6,3            6,7             7,3

Мышь

Эпителий тонкой кишки       18,75        1,0             9,5           7,5              0,75

Эпителий роговицы               72,0         0,75             -             8,50            4,0

L-клетки

(опухолевые фибробласты)   20,0         1,0             9-11        6-7               3-4

Кроветворные клетки            24,0          0,5-1         9,0          10                 4,5

Существуют объекты с более коротким клеточным циклом . Так у некоторых дрожжей он занимает 1,5 часа, а при дроблении эмбриональных клеток амфибий – 0,5 часа.

Различные периоды клеточного цикла отличаются друг от друга по общему содержанию в клетках белка, ДНК и РНК и по уровню (интенсивности) их синтеза.

В G1-периоде клетки имеют диплоидное содержание ДНК на ядро (2с), в S-периоде содержание ДНК колеблется от 2с до 4с, в G2-периоде содержание ДНК соответствует тетраплоидному (4с). Следовательно, если мы изучаем однородную популяцию клеток, то простым путем фотометрии ДНК в интерфазных клетках можно определить, в каком из периодов клеточного цикла находится та или иная клетка (рис. 40).

Количество РНК в клетках на разных этапах цикла также может меняться; в интенсивно делящихся клетках содержание РНК в течение интерфазы увеличивается по крайней мере в 2 раза. После деления в период G1 поступают дочерние клетка, по объему и по общему содержанию белков и РНК вдвое меньшие, чем исходная родительская клетка. В это время начинается рост клеток, главным образом за счет накопления клеточных белков, что определяется увеличением количества РНК на клетку. Необходимо вспомнить, что в течение всего митоза (от поздней профазы до средней телофазы) в клетке синтез РНК полностью подавлен, поэтому накопление клеточных белков и РНК связано с возобновлением синтеза РНК в начале нового клеточного цикла. В S-периоде уровень синтеза РНК возрастает соответственно увеличению количества ДНК, достигает своего максимума в середине G2-периода. В конце G2-периода или в профазе синтез РНК резко падает по мере конденсации митотических хромосом и снова полностью прекращается во время митоза.

Синтез белка во время митоза падает до 25% от исходного уровня и затем в последующих периодах достигает своего максимума в G2-периоде, в общем повторяя характер синтеза РНК.

Отдельные периоды интерфазы отличаются друг от друга не только общим содержанием и активностью синтезов ДНК, РНК и белка, но и характером синтезируемых РНК и белков.

Такое регулярное повторение последовательности клеточных циклов легко можно наблюдать во время прогрессивного роста клеток культуры ткани. В естественных условиях в растущих тканях растений и животных всегда есть клетки, которые находятся «вне цикла», не проходят регулярно из G1- в S-, затем в G2- и потом в M-фазу; такие клетки принято называть клетками G0-периода. Именно эти клетки представляют собой так называемые покоящиеся, переставшие размножаться клетки. Под действием специфических белковых ростовых факторов или митогенов они могут снова вступать в клеточный цикл и начать делиться. В некоторых тканях такие клетки G0-фазы могут находиться длительное время, не изменяя особенно своих морфологических свойств: они сохраняют в принципе способность к делению, превращаясь в камбиальные, стволовые клетки (например, в кроветворной ткани). Чаще такая потеря (хотя бы и временная) способности делиться сопровождается специализацией, дифференцировкой клеток. В этом случае дифференцирующиеся клетки выходят из цикла, но в особых условиях могут снова входить в цикл. Так, например, большинство клеток печени находится в G0-периоде; они не участвуют в синтезе ДНК и не делятся. Однако если произвести удаление части печени, то многие клетки начинают подготовку к митозу (G1-период), переходят к синтезу ДНК и могут митотически делиться. В других органах, выходя из клеточного цикла, клетки необратимо дифференцируются и теряют способность к делению навсегда. Так происходит с нейронами: нейробласты, эмбриональные нервные клетки, после нескольких циклов клеточного деления теряют способность размножаться, дифференцируются и остаются в этом состоянии до конца жизни организма.

Следует отметить особо, что у многоклеточных зрелых организмов заведомо большая часть клеток находится в G0-фазе. Прохождение клетками клеточного цикла как в интенсивно размножающихся популяциях, так и в клетках стимулированных к размножению, регулируется целой сложной системой циклирующих белков, от активности которых зависит прохождение каждой из стадий клеточного цикла (см. ниже, глава   ).

Эндорепродукция и полиплоидия

Если делящиеся клетки на некоторое время охладить или обработать их каким-либо веществом, разрушающим микротрубочки веретена (например, колхицином), то деление клеток прекратится. При этом исчезнет веретено, а хромосомы без расхождения к полюсам будут продолжать цикл своих превращений: они начнут набухать, одеваться ядерной оболочкой. Так возникают за счет объединения всех неразошедшихся наборов хромосом крупные новые ядра. Они, естественно будут содержать вначале 4n число хроматид и соответственно 4c количество ДНК. По определению, это уже не диплоидная, а тетраплоидная клетка. Такие полиплоидные клетки могут из стадии G1 переходить в S-период и, если убрать колхицин, снова делиться митотическим путем, давая уже потомков с 4n числом хромосом. В результате можно получить полиплоидные клеточные линии разной величины плоидности (4n, 8n, 16n и т.д.). Этот прием часто используется для получения полиплоидных растений.

Как оказалось, во многих органах и тканях нормальных диплоидных организмов животных и растений встречаются клетки с крупными ядрами, количество ДНК в которых кратно больше 2n. При делении таких клеток видно, что количество хромосом у них также кратно увеличено по сравнению с обычными диплоидными клетками. Эти клетки являются результатом соматической полиплоидии. Часто это явление называют эндорепродукцией - появление клеток с увеличенным содержанием ДНК. Появление подобных клеток происходит в результате отсутствия в целом или незавершенности отдельных этапов митоза. Существует несколько точек в процессе митоза, блокада которых приведет к его остановке и к появлению полиплоидных клеток. Блок может наступить при переходе от G2-периода к собственно митозу, остановка может произойти в профазе и метафазе, в последнем случае часто происходит нарушение целостности веретена деления. Наконец, нарушения цитотомии также могут прекратить деление, что приведет к появлению двуядерных и полиплоидных клеток.

При естественной блокаде митоза в самом его начале, при переходе G2 в профазу, клетки приступают к следующему циклу репликации, который приведет к прогрессивному увеличению количества ДНК в ядре. При этом не наблюдается никаких морфологических особенностей таких ядер, кроме их больших размеров. При увеличении ядер в них не выявляются хромосомы митотического типа.

Часто такой тип эндорепродукции без митотической конденсации хромосом встречается у беспозвоночных животных, обнаруживается он также и у позвоночных животных, и у растений.

У беспозвоночных в результате блока митоза степень полиплоидии может достигать огромных значений. Так, в гигантских нейронах моллюска тритонии, ядра которых достигают величины до 1 мм (!), содержится более 2 х 105 гаплоидных наборов ДНК. У некоторых беспозвоночных гигантские железистые и нервные клетки в результате 18-20 циклов эндоредупликации могут содержать 2097152c ДНК.

Другим примером гигантской полиплоидной клетки, образовавшейся в результате редупликации ДНК без вступления клеток в митоз, может служить клетка шелкоотделительной железы тутового шелкопряда. Ее ядро имеет причудливую ветвистую форму и может содержать огромные количества ДНК. Гигантские клетки железы пищевода аскариды могут содержать до 100000c ДНК.

Особый случай эндорепродукции представляет собой увеличение плоидности путем политении.

При политении в S-периоде при репликации ДНК новые дочерние хромосомы продолжают оставаться в деспирализованном состоянии, но располагаются друг около друга, не расходятся и не претерпевают митотическую конденсацию (рис. 41). В таком истинно интерфазном виде хромосомы снова вступают в следующий цикл репликации, снова удваиваются и не расходятся. Постепенно в результате репликации и нерасхождения хромосомных нитей образуется многонитчатая, политенная структура хромосомы интерфазного ядра. Последнее обстоятельство необходимо подчеркнуть, так как такие гигантские политенные хромосомы никогда не участвуют в митозе, более того - это истинно интерфазные хромосомы, участвующие в синтезе ДНК и РНК.

От митотических хромосом они резко отличаются и по размерам: они в несколько раз тоще митотических хромосом из-за того, что состоят из пучка множественных неразошедшихся хроматид - по объему политенные хромосомы дрозофилы в 1000 раз больше митотических. Они в 70-250 раз длиннее митотических из-за того, что в интерфазном состоянии хромосомы менее конденсированы (спирализованы), чем митотические хромосомы (рис. 42).

Кроме того, у двукрылых их общее число в клетках равно гаплоидному из-за того, что при политенизации происходит объединение, конъюгация гомологичных хромосом. Так, у дрозофилы в диплоидной соматической клетке 8 хромосом, а в гигантской клетке слюнной железы - 4.

Встречаются гигантские полиплоидные ядра с политенными хромосомами у некоторых личинок двукрылых насекомых в клетках слюнных желез, кишечника, мальпигиевых сосудов, жирового тела и т.д. Кроме того, политенные хромосомы встречаются в ядрах синергид некоторых луков, в ядрах антипод аконита и пшеницы. Описаны политенные хромосомы в макронуклеусе инфузории стилонихии.

Лучше всего этот тип эндорепродукции изучен у насекомых. Было подсчитано, что у дрозофилы в клетках слюнных желез может произойти до 6-8 циклов редупликации, что приведет к общей плоидности клетки, равной 1024. У некоторых хирономид (их личинку называют мотылем) плоидность в этих клетках достигает 8000-32 000. В клетках политенные хромосомы начинают быть видны после достижения политении в 64-128n, до этого такие ядра ничем, кроме размера, не отличаются от окружающих диплоидных ядер.

Отличаются политенные хромосомы и своим строением: они структурно неоднородны по длине, состоят из дисков, междисковых участков и пуфов (рис. 43). Рисунок расположения дисков строго характерен для каждой хромосомы и отличается даже у близких видов животных.

Диски представляют собой участки конденсированного хроматина. Если на одной интерфазной хромосоме участки конденсированного хроматина будут выглядеть как глобулярные сгустки (хромомеры), то при латеральном расположении множества одинаковых интерфазных хромосом эти отдельные участки выстроятся в диск, лежащий поперек хромосомы.

Хромомерное строение дисков политенных хромосом отчетливо проявляется при искусственной деконденсации этих хромосом растворами с низким содержанием двухвалентных катионов. При этом диски (особенно мелкие) распадаются на ряд хромомеров (0.2-0,3 мкм), от которых радиально отходят фибриллы ДНП, подобно тому, что наблюдается при такой же деконденсации митотических хромосом и хроматина интерфазных ядер.

Диски могут отличаться друг от друга по толщине. Общее их число у политенных хромосом хирономид достигает 1,5-2,5 тыс. У дрозофилы имеется около 5 тыс. дисков.

Диски разделены междисковыми пространствами, состоящими, так же как и диски, из фибрилл хроматина, только более рыхло упакованных (рис. 30б).

На политенных хромосомах двукрылых часто видны вздутия, пуфы. Оказалось, что пуфы возникают на местах некоторых дисков за счет их деконденсации и разрыхления. В пуфах выявляется РНК, которая там же и синтезируется. Следовательно, пуф является местом транскрипции на этих интерфазных хромосомах, а диски представляют собой экспрессированные хромосомные участки.

Рисунок расположения и чередования дисков на политенных хромосомах постоянен и не зависит ни от органа, ни от возраста животного. Это является хорошей иллюстрацией одинаковости качества генетической информации в каждой клетке организма (рис. 43).

Однако в расположении пуфов такой однозначности нет. Пуфы являются временными образованиями на хромосомах, и в процессе развития организма существует определенная последовательность в их появлении и исчезновении на генетически различных участках хромосомы (рис. 44). Эта последовательность различна для разных тканей. Сейчас доказано, что образование пуфов на политенных хромосомах - это выражение генной активности: в пуфах синтезируются РНК, необходимые для проведения белковых синтезов на разных этапах развития насекомого. Оказалось, что можно вызывать специфическую индукцию активности пуфов. Так, на определенной стадии развития личинки гормон экдизон вызывает активацию специфических пуфов, что предшествует линьке. Если же этот гормон ввести на другой стадии развития, то в этом случае активируется тот же пуф, хотя на этой стадии он в норме не функционирует.

В естественных условиях у двукрылых особенно активны в отношении синтеза РНК два самых крупных пуфа, так называемые кольца Бальбиани, который описал их 100 лет тому назад. Совсем недавно с помощью микроманипулятора удалось выделить кольца в достаточном количестве, чтобы определить тип их РНК. Это оказалась информационная РНК с гигантским мол. весом (70 тыс. нуклеотидов), кодирующая образование секреторных белков слюнных желез. Эта же РНК была выделена из полисом цитоплазмы. Размер гранул РНП, которые образуются в кольцах (пуфах) Бальбиани, достигает 40-60 нм.

Долгое время неясной оставалась природа междисковых участков в политенных хромосомах. Однако была выдвинута гипотеза, что в междисковых участках могут также располагаться гены, которые находятся в деконденсированном состоянии, в отличие от генов в дисках, где они неактивны. Это предположение в последнее время получило ряд подтверждений. Так, в междисковых участках были обнаружены гранулы и фибриллы РНП такой же морфологии, как и в мелких пуфах. В междисковых участках зарегистрировано слабое включение в РНК, там с помощью иммунохимических методов удалось локализовать РНК-полимеразу и ДНК-РНК комплексы, что указывает на участие междисковых зон в синтезе РНК. Характер этой РНК совсем неясен, возможно, что это РНК генов, работа которых в клетке необходима постоянно, генов, которые кодируют белки основного метаболизма клетки, белки "для домашнего хозяйства". Информация же, необходимая для специализации, дифференцировки, в таком случае должна поступать от пуфов.

Так как расположение дисков на хромосомах зависит только от видовой специфики, то удалось с помощью генетических методов локализовать целый ряд генов и нанести их на морфологических картах хромосом. Отдельный диск может быть вместилищем одного или нескольких генов. Однако целый ряд признаков удалось локализовать в определенных участках хромосом.

Как уже указывалось, гигантские хромосомы встречаются в некоторых клетках зародышевых тканей растений. Такие гигантские хромосомы были описаны, например, у фасоли и ячменя. Это толстые короткие хромосомы, во много десятков раз превосходящие по объему митотические хромосомы. В антиподиальных клетках ячменя в огромных ядрах видны 7 (гаплоидное число) хромосом, которые претерпели до 20 циклов репликации. Однако общая их организация резко отлична от таковой у двукрылых насекомых. Во-первых, в данном случае нет разделения тела хромосомы на диски и междисковые участки, во-вторых, нет пуфов. Все РНП-продукты равномерно расположены вдоль хроматиновых участков. Хроматин же этих гигантских хромосом обладает типичной хромонемной организацией, характерной для интерфазных ядер этого объекта (рис. 45).

Итак, мы разобрали два случая, два способа образования полиплоидных клеток, возникающих при блокаде вступления их в митотическое деление.

В других случаях эндорепродукции полиплоидные клетки возникают в результате нарушений аппарата деления - веретена: при этом происходит митотическая конденсация хромосом. Такое явление носит название эндомитоз, потому что конденсация хромосом и их изменения происходят внутри ядра, без исчезновения ядерной оболочки (рис. 46).

Впервые явление эндомитоза было хорошо изучено в клетках различных тканей водяного клопа - геррии. В начале эндомитоза хромосомы конденсируются, благодаря чему становятся хорошо различимы внутри ядра, затем хроматиды обособляются, вытягиваются. Эти стадии по состоянию хромосом могут соответствовать профазе и метафазе обычного митоза. Затем хромосомы в таких ядрах исчезают, и ядро принимает вид обычного интерфазного ядра, но размер его увеличивается в соответствии с увеличением плоидности. После очередной редупликации ДНК такой цикл эндомитоза повторяется. В результате могут возникнуть полиплоидные (32n) и даже гигантские ядра.

Сходный тип эндомитоза описан при развитии макронуклеусов у  некоторых инфузорий, у целого ряда растений. Так, в клетках клубней картофеля хромосомы практически все время находятся в спирализованном состоянии, время собственно интерфазы здесь значительно укорочено.

Следующий вариант появления полиплоидных клеток связан с отсутствием веретена на стадии метафазы: при этом происходит слияние двух хромосомных наборов, как в случае применения колхицина.

Иной процесс появления полиплоидных соматических клеток в результате блокады деления клеточного тела подробно изучен на клетках млекопитающих. Было обнаружено, что в печени взрослых, и особенно стареющих, крыс и мышей встречаются кроме диплоидных тетра- и октоплоидные клетки, а также двуядерные клетки разной степени плоидности. Оказалось, что в этом случае процесс полиплоидизации клеток можно описать следующим образом (рис. 47). После S-периода клетки, обладающие 4c количеством ДНК, вступают в митотическое деление, проходят все его стадии, включая телофазу, но не приступают к цитотомии. Таким образом, образуется двуядерная клетка (2 х 2n). Она может снова пройти S-период, в результате чего оба ядра в такой клетке станут содержать по 4c ДНК и 4n хромосом. Такая двуядерная клетка входит в митоз, на стадии метафазы происходит объединение хромосомных наборов (общее число хромосом равно 8n), а затем нормальное деление, в результате которого образуются две тетраплоидные клетки. Процесс попеременного появления двуядерных и одноядерных клеток может привести к появлению ядер с 8n, 16n и даже 32n количеством хромосом. Таким способом образуются полиплоидные клетки в печени, в эпителии мочевого пузыря, в пигментном эпителии сетчатки, в ацинарных отделах слюнной и поджелудочной желез, на ранних стадиях образования мегакариоцитов и др.

В целом ряде случаев процессы эндорепродукции используются организмом как для построения тканей, так и для их функционирования. В чем же биологический смысл этого явления? Необходимо отметить, что соматическая полиплоидизация встречается на терминальных участках пути развития клеток, тканей и организмов, она большей частью характерна для специализированных, дифференцированных клеток и не встречается при генеративных процессах, таких, как эмбриогенез (исключая провизорные органы) и образование половых клеток, нет полиплоидии среди стволовых клеток. Действительно, гигантские полиплоидные клетки в деление не вступают; клетки с политенными хромосомами также не делятся и в процессе метаморфоза насекомых лизируются. Многоядерные и полиплоидные клетки у млекопитающих встречаются главным образом у стареющих организмов.

По-видимому, главным результатом соматической полиплоидии является увеличение размера клеток и тем самым увеличение их продуктивности.

Пространственное расположение хромосом в интерфазном ядре

Представление о том, что митотические хромосомы после деления клеток превращаются в хроматин интерфазного ядра, не теряют своей целостности (не распадаются на фрагменты), а сохраняют свою физическую индивидуальность, переходя лишь в разрыхленное, деконденсированное состояние, было высказано Т. Бовери еще в 1887 г. Эти представления получили название теории непрерывности хромосом, которая гласит: хромосомы, вошедшие в состав дочернего ядра в телофазе, сохраняются в нем хотя бы и в очень измененном виде в качестве индивидуальных структур и появляются снова в собственном смысле слова в следующей профазе.

Основой для этого вывода послужило наблюдение Е. Бовери за поведением хромосом в дробящихся яйцах одного из видов аскариды (Ascaris megalocephala univaiens), в клетке которой всего две хромосомы. Было обнаружено, что в профазе первых двух делений зиготы хромосомы вновь обнаруживаются в местах бывших телофазных хромосом предыдущего деления, повторяя их форму и локализацию (рис. 48). Конечно эти наблюдения не могут служить прямым доказательством  этой теории, но являются основой для высказывания предположения о судьбе хромосом в клеточном цикле. Однако, кроме этого наблюдения существует целая серия косвенных данных, говорящих в пользу теории непрерывности хромосом. Вот некоторые из них.

Было найдено, что в интерфазных ядрах целого ряда объектов удается регистрировать отдельные специфические участки, аналогичные по своим свойствам теломерам и центромерам митотических хромосом. Так, например, у некоторых луков все хромосомы имеют постоянно конденсированные участки на теломерах (рис. 49). Эти теломеры митотических хромосом обладают свойством окрашиваться как C-сегмент. В интерфазных ядрах этих видов также обнаруживаются C-положительные зоны, в количестве вдвое меньшем, чем число плечей митотических хромосом, вероятно, за счет того, что в интерфазе эти теломерные участки соседних хромосом могут ассоциировать друг с другом. Интересно, что в интерфазном ядре эти участки располагаются на одном из полюсов, как бы повторяя теломерную ориентацию хромосом в митозе.

Подобным же образом можно наблюдать в интерфазных ядрах центромерные участки хромосом. Так у мыши центромеры всех акроцентрических хромосом интенсивно окрашиваются по методике выявления C-сегментов (рис. 50). Таким же свойством обладают связанные с периферией ядра плотные участки интерфазного хроматина - хромоцентры. Показано, что эти участки по своей молекулярной композиции аналогичны центромерным участкам митотических хромосом.

Наконец, в интерфазных клетках можно наблюдать целые отдельные хромосомы; например, одну из X-хромосом самок млекопитающих. Правда, такие целиком конденсированные хромосомы (тельца Барра) не обладают общей морфологией митотических хромосом, но по объему и количеству ДНК полностью соответствуют X-хромосоме в митозе. У пашенной полевки (Microtus agrestis) Х половые хромосомы обладают способностью целиком интенсивно окрашиваться по C-методике. В интерфазных ядрах различных клеток этого животного можно с помощью этой же окраски видеть два больших блока интенсивно окрашенного хроматина в клетках самок.

Каково же пространственное расположение отдельных деконденсированных интерфазных хромосом в трехмерном объеме клеточного ядра? Существует ли какой-либо порядок в размещении хромосом в интерфазном ядре или же они хаотически разбросаны внутри ядра? Первые исследования о порядке расположения хромосом внутри ядра принадлежат К. Раблю (1885), который изучая профазные ядра растений, предположил, что внутри ядра хромосомы повторяют свою анафазную ориентацию (центромеры - на одном полюсе, теломеры на другом) в течение всего клеточного цикла.

В пользу этого говорит расположение в интерфазном ядре центромерных и теломерных участков деконденсированных хромосом. Но особенно демонстративно это положение было показано при изучении пространственной локализации политенных хромосом. С помощью послойных оптических разрезов, используя компьютерную технику воспроизведения изображения, удалось создать объемную стереоскопическую реконструкцию интерфазного ядра и проследить в его трехмерном пространстве каждую из четырех гигантских политенных хромосом (рис. 51). Было обнаружено, что действительно в объеме ядер хромосомы располагаются повторяя ана-телофазную ориентацию (т.н. ориентацию по Раблю). При этом каждое плечо хромосомы занимает определенную зону, объем которой не заходит в объем соседних хромосом, хотя они расположены тесно друг с другом. Каждая из хромосом образует пологую правую спираль (5-7 витков), которая в нескольких местах связана с ядерной оболочкой, как бы фиксируясь на ней. Фиксированы на ядерной оболочке и теломерные участки всех хромосом, которые располагаются на одном из полюсов интерфазного ядра. На противоположном полюсе ядра также в связи с ядерной оболочкой располагаются центромерные районы хромосом, часто объединенные в один хромоцентр - крупный блок интерфазного хроматина.

Прямые наблюдения за локализацией в ядре интерфазных хромосом были сделаны используя метод FISH (флуоресцентная in situ гибридизация нуклеиновых кислот) в сочетании с конфокальной микроскопией. Вначале были выделены индивидуальные митотические хромосомы, из них были получены ДНК, которые метились разными флуорохромами. Такие меченые хромосомные ДНК наносились на препараты интерфазных ядер, ДНК которых была предварительно денатурирована. В результате молекулярной гибридизации флуоресцирующая ДНК ренатурировала только со сходной хромосомой. С помощью конфокального микроскопа просматривалась флуоресцентная метка в трехмерном пространстве интерфазного ядра. Было обнаружено, что интерфазное ядро состоит из тесно расположенных хромосомных территорий, объем которых значительно превосходил объем митотических хромосом. Некоторые особенно крупные хромосомы действительно проявляли ана-телофазную ориентацию.

Суммируя общие представления о формах организации хромосом можно прийти к заключению, что они могут находиться в двух альтернативных состояниях, в двух морфологических выражениях: 1 - максимально конденсированное, компактное, метаболически неактивное, транспортное состояние, предназначенное для того, чтобы в минимальном объеме без структурных нарушений перенести во время клеточного деления огромные по длине молекулы ДНК; 2 - деконденсированное, при котором линейная длина развернутых хромосом увеличивается в десятки, а иногда и в сотни раз, метаболически активное состояние, связанное с синтезом ДНК и РНК (интерфаза).

Отличительной особенностью интерфазной хромосомы от митотической, кроме всего, является то, что по своей длине она может быть деконденсирована, развернута неравномерно - есть участки полной деконденсации и есть участки, находящиеся в плотном, деконденсированном и, соответственно, в неактивном состоянии. Это и придает интерфазному ядру своеобразную структуру, где хромосомы - хроматин - могут быть представлены то плотными блоками, то участками рыхлого, деконденсированного хроматина (рис. 52).

Глава 5. Структура и химия хроматина

Хроматин – основной компонент клеточного ядра – достаточно легко получить из выделенных интерфазных ядер и из выделенных митотических хромосом. Для этого используют его свойство переходить в растворенное состояние при экстракции водными растворами с низкой ионной силой или просто деионизованной водой. При этом участки хроматина набухают и переходят в гель. Чтобы такие препараты перевести в настоящие растворы, необходимы сильные механические воздействия: встряхивание, перемешивание, дополнительная гомогенизация. Это, конечно, приводит к частичному разрушению исходной структуры хроматина, дробит его на мелкие фрагменты, но практически не меняет его химического состава.

Фракции хроматина, полученные из разных объектов, обладают довольно однообразным набором компонентов. Было найдено, что суммарный химический состав хроматина из интерфазных ядер и митотических хромосом мало отличаются друг от друга. Главными компонентами хроматина являются ДНК и белки, среди которых основную массу составляют гистоны и негистоновые белки (см табл. 3).

Таблица 3. Химический состав хроматина. Содержание белков и РНК дано по отношению к ДНК

Источник хроматина

ДНК

Гистоны

Негистоновые белки

РНК

Стебель зародыша гороха

1,0

1,03

0,29

0,26

Печень крысы

1,0

1,16

0,67

0,043

Клетки Hela (опухоль человека)

1,0

1,02

0,71

0,09

Тимус теленка

1,0

1,14

0,33

0,007

Эритроциты курицы

1,0

1,08

0,54

0,02

В среднем в хроматине около 40% приходится на ДНК и около 60 % на белки, среди которых специфические ядерные белки-гистоны, составляют от 40 до 80% от всех белков, входящих в состав выделенного хроматина. Кроме того в состав хроматиновой фракциии входят мембранные компоненты, РНК, углеводы, липиды, гликопротеиды. Вопрос о том, насколько эти минорные компоненты входят в структуру хроматина еще не решен. Так, например, РНК может представлять собой транскрибируемую РНК, которая еще не потеряла связь с матрицей ДНК. Другие же минорные компоненты могут представлять собой вещества соосажденных фрагментов ядерной оболочки.

В структурном отношении хроматин представляет собой нитчатые комплексные молекулы дезоксирибонуклеопротеида (ДНП), которые состоят из ДНК, ассоциированной с гистонами (см. рис. 57). Поэтому укоренилось другое название хроматина – нуклеогистон. Именно за счет ассоциации гистонов с ДНК образуются очень лабильные, изменчивые нуклеиново-гистоновые комплексы, где отношения ДНК : гистон равно примерно единице, т.е. они присутствуют в равных весовых количествах. Эти нитчатые фибриллы ДНП и есть элементарные хромосомные или хроматиновые нити, толщина которых в зависимости от степени упаковки ДНК может колебаться от 10 до 30 нм. Эти фибриллы ДНП могут в свою очередь дополнительно компактизоваться с образованием более высоких уровней структуризации ДНП, вплоть до митотической хромосомы. Роль некоторых негистоновых белков заключается именно в образовании высоких уровней компактизации хроматина.

ДНК хроматина

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу подобно чистой выделенной ДНК в водных растворах. Об этом говорят многие экспериментальные данные. Так, при нагревании растворов хроматина наблюдается повышение оптической плотности раствора, так называемый гиперхромный эффект, связанный с разрывом межнуклеотидных водородных связей между цепями ДНК, подобно тому, что происходит при нагревании (плавлении) чистой ДНК.

Вопрос о размере, длине молекул ДНК в составе хроматина имеет важное значение для понимания структуры хромосомы в целом. При стандартных методах выделения ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9 х 106, что значительно меньше молекулярной массы ДНК из кишечной палочки (2,8 х 109). Такую сравнительно малую молекулярную массу ДНК из препаратов хроматина можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина. Если же выделять ДНК в условиях, исключающих встряхивание, гомогенизацию и другие воздействия, то удается из клеток получить молекулы ДНК очень большой длины. Длина молекул ДНК из ядер и хромосом эукариотических клеток может быть изучена с помощью метода светооптической радиоавтографии, подобно тому как это изучалось на прокариотических клетках.

Было обнаружено, что в составе хромосом длина индивидуальных линейных ( в отличие от прокариотических хромосом) молекул ДНК может достигать сотен микрометров и даже нескольких сантиметров. Так, у разных объектов были получены молекулы ДНК от 0,5 мм до 2 см. Эти результаты показали, что есть близкое совпадение между расчетной длиной ДНК на хромосому и радиоавтографическим наблюдением.

После мягкого лизиса клеток эукариот можно прямо определять молекулярные массы ДНК физико-химическими методами. Было показано, что максимальная молекулярная масса молекулы ДНК дрозофилы равна 41 х 109, что соответствует длине около 2 см. У некоторых дрожжей на хромосому приходится молекула ДНК с молекулярной массой 1 х 108-109, которая имеет размеры около 0,5 мм.

Такие длинные ДНК представляют собой одну молекулу, а не несколько более коротких, сшитых гуськом с помощью белковых связок, как считали некоторые исследователи. К этому заключению пришли после того, как оказалось, что длина молекул ДНК не изменяется после обработки препаратов протеолитическими ферментами.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду, хотя у микроорганизмов количество ДНК на клетку значительно ниже, чем у беспозвоночных, высших растений и животных. Так, у мыши на ядро приходится почти в 600 раз больше ДНК, чем у кишечной палочки. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют такие различные организмы как лен, морской еж, окунь (1,4-1,9 пг) или рыба голец и бык (6,4 и 7 пг).

Значительны колебания количества ДНК в больших таксономических группах. Среди высших растений количество ДНК у разных видов может отличаться в сотни раз, так же, как и среди рыб, в десятки раз отличается количество ДНК у амфибий.

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что «избыточное» количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.


Таблица 4
. Содержание ДНК в клетках некоторых объектов (пг, 10-12 г)

Объект

Количество ДНК в пг

Бактериофаги

      Т1

      Т4

Бактерии

      кишечная палочка

Грибы

      дрожжи

      нейроспора

Высшие растения

      лен

      кукуруза

      лилия

Беспозвоночные животные

      дрозофила

      сверчок домашний

Рыбы

      осетр

      протоптерус

Амфибии

      тритон обыкновенный

      амфиума

Пресмыкающиеся

      черепаха зеленая

Птицы

      курица

Млекопитающие

      мышь

      человек

Количество ДНК на частицу

       0,000007

       0,000027

количество ДНК на клетку

       0,009

количество ДНК на гаплоидную клетку

       0,027

       0,017

количество ДНК на диплоидную клетку

       1,4

     15,4

   134,2

       0,2

     12,0

       3,2

   100,0

     73,0

   108,0

       5,0

       2,3

       5,0

       6,0

Разрешить эти вопросы оказалось возможным на основании изучения кинетики реакции ренатурации или гибридизации  ДНК. Если фрагментированные молекулы ДНК в растворах подвергнуть тепловой денатурации, а затем инкубировать их при температуре несколько более низкой, чем та, при которой происходит денатурация, то идет восстановление исходной двуспиральной структуры фрагментов ДНК за счет воссоединения комплементарных цепей – ренатурация. Для ДНК вирусов и прокариотических клеток было показано, что скорость такой ренатурации прямо зависит от величины генома; чем больше геном, чем больше количество ДНК на частицу или клетку, тем больше нужно времени для случайного сближения комплементарных цепей и специфической реассоциации большего числа разных по нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (рис. 53). Характер кривой реассоциации ДНК прокариотических клеток указывает на отсутствие повторяющихся последовательностей оснований в геноме прокариот; все участки их ДНК несут уникальные последовательности, число и разнообразие которых отражает степень сложности генетической композиции объектов и, следовательно, их общей биологической организации.

Совсем другая картина реассоциации ДНК наблюдается у эукариотических организмов. Оказалось, что в состав их ДНК входят фракции, которые ренатурируют с гораздо более высокой скоростью, чем можно было бы предполагать на основании размера их генома, а также фракция ДНК, ренатурирующая медленно, подобно уникальным последовательностям ДНК прокариот. Однако для эукариот требуется значительно большее время для ренатурации этой фракции, что связано с общим большим размером их генома и с большим числом различных уникальных генов.

В той части ДНК эукариотов, которая отличается высокой скоростью ренатурации, различают две подфракции: 1) фракцию с высоко или часто повторяющимися последовательностями, где сходные участки ДНК могут быть повторены 106 раз; 2) фракцию умеренно повторяющихся последовательностей, встречающихся в геноме 102-103 раз. Так, у мыши во фракцию ДНК с часто повторяющимися последовательностями входит 10% от общего количества ДНК на геном и 15% приходится на фракцию с умеренно повторяющимися последовательностями. Остальные 75% от всей ДНК мыши представлены уникальными участками, соответствующими большому числу различных неповторяющихся генов.

Фракции с часто повторяющимися последовательностями могут обладать иной плавучей плотностью, чем основная масса ДНК, и поэтому могут быть выделены в чистом виде, как так называемые фракции сателлитной ДНК. У мыши эта фракция имеет плотность, равную 1,691 г/мл, а основная часть ДНК - 1,700 г/мл. Эти различия плотности определяются различиями в нуклеотидном составе. Например, у мыши в этой фракции имеется 35% Г и Ц пар, а в основном пике ДНК - 42%.

Как оказалось, сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, не участвует в синтезе основных типов РНК в клетке, не связана с процессом синтеза белка. Этот вывод сделан был на основании того, что ни один из типов РНК клетки (тРНК, иРНК, рРНК) не гибридизируется с сателлитными ДНК. Следовательно, на этих ДНК нет последовательностей, отвечающих за синтез клеточных РНК, т.е. сателлитные ДНК не являются матрицами для синтеза РНК, не участвуют в транскрипции.

Существует гипотеза о том, что высокоповторяющиеся последовательности, не участвующие непосредственно в синтезе белков, могут нести информацию, играющую важную структурную роль в сохранении и функционировании хромосом. К ним могут быть отнесены многочисленные участки ДНК, связанные с белками остова интерфазного ядра (см. ниже), участки начала репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.

Методом гибридизации нуклеиновых кислот прямо на хромосомах (in situ) была изучена локализация этой фракции. Для этого на изолированной сателлитной ДНК с помощью бактериальных ферментов синтезировали меченую 3Н-уридином РНК. Затем цитологический препарат с хромосомами подвергали такой обработке, при которой происходит денатурация ДНК (повышенная температура, щелочная среда и др.). После этого на препарат помещали меченную 3Н РНК и добивались гибридизации между ДНК и РНК. Радиоавтографически было обнаружено, что большая часть метки локализуется в зоне первичных перетяжек хромосом, в зоне их центромерных участков. Метка обнаруживалась также и в других участках хромосом, но очень слабо (рис. 54).

За последние 10 лет сделаны большие успехи в изучении центромерных ДНК, особенно у дрожжевых клеток. Так у S. cerevisiae центромерная ДНК состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она состоит из двух консервативных участков (I и III) и центрального элемента (II), обогащенного АТ-парами оснований. Сходное строение ДНК центромеры имеют хромосомы дрозофилы. Центромерная ДНК человека (альфоидная сателлитная ДНК) состоит из тандема мономеров по 170 п.н., организованных в группы димеров или пентамеров, которые в свою очередь образуют большие последовательности по 1-6 х 103 п.н. Такая самая большая единица повторена 100-1000 раз. С этой специфической центромерной ДНК комплексируются особые центромерные белки, участвующие в образовании кинетохора, структуры, обеспечивающей связь хромосом с микротрубочками веретена и в движении хромосом в анафазе (см. ниже).

ДНК с высокоповторяющимися последовательностями обнаружена также в теломерных участках хромосом многих эукариотических организмов (от дрожжей до человека). Здесь чаще всего встречаются повторы, в которые входят 3-4 гуаниновых нуклеотида. У человека теломеры содержат 500-3000 повторов TTAGGG. Эти участки ДНК выполняют особую роль - ограничивать хромосому с концов и предотвращать ее укорачивание в процессе многократной репликации.

Недавно было найдено, что высокоповторяющиеся последовательности ДНК интерфазных хромосом связываются специфически с белками - ламинами, подстилающими ядерную оболочку, и участвуют в заякоревании растянутых деконденсированных интерфазных хромосом, тем самым определяют порядок в локализации хромосом в объеме интерфазного ядра.

Сделано предположение, что сателлитная ДНК может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, участки с часто повторяющимися последовательностями играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК, например между репликонами (см. ниже).

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 102 до 105 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в процессах создания аппарата белкового синтеза. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, которые могут быть повторены у разных видов от 100 до 1000 раз. В эту фракцию входят многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями. Такими являются гены для белков хроматина - гистонов, повторяющихся до 400 раз.

Кроме того, в эту фракцию входят участки ДНК с разными последовательностями (по 100-400 нуклеотидных пар), также многократно повторенными, но рассеянными по всему геному. Их роль еще не до конца ясна. Высказывается предположение, что такие участки ДНК могут представлять собой акцепторные или регуляторные участки разных генов.

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов: часто повторяющиеся последовательности (> 106 раз), входящие во фракцию сателлитной ДНК и не транскрибирующиеся; фракция умеренно повторяющихся последовательностей (102-105), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному; фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

Исходя из этих представлений становятся понятными те различия в количестве ДНК, которые наблюдаются у разных организмов: они могут быть связаны с неодинаковой долей тех или иных классов ДНК в геноме организмов. Так, например, у амфибии Amphiuma (у которой ДНК в 20 раз больше, чем у человека) на долю повторяющихся последовательностей приходится до 80% от всей ДНК, у луков - до 70, у лосося - до 60% и т.п. Истинное же богатство генетической информации должна отображать фракция уникальных последовательностей. Не нужно забывать, что в нативной, нефрагментированной молекуле ДНК хромосомы все участки, включающие уникальные, умеренно и часто повторяющиеся последовательности, связаны в единую гигантскую ковалентную цепь ДНК.

Молекулы ДНК гетерогенны не только по участкам разной нуклеотидной последовательности, но и различны в отношении их синтетической активности.

Репликация эукариотических ДНК

Бактериальная хромосома реплицируется как одна структурная единица, имеющая одну стартовую точку репликации и одну точку терминации. Таким образом бактериальная циклическая ДНК является одним репликоном. От стартовой точки репликация идет в двух противоположных направлениях, так что по мере синтеза ДНК образуется так называемый глазок репликации, ограниченный с двух сторон репликационными вилками, что хорошо видн при электронномикроскопическом изучении вирусных и бактериальных реплицирующихся хромосом.

У эукариотических клеток организация репликации иного характера – полирепликоннная.. Как уже говорилось, при импульсном включении 3НТ множественная метка появляется практически во всехмитотических хромосомах. Это означает, что одновременно в интерфазной хромосоме существует множество мест репликации и множество автономных точек начала репликации. Более подробно это явление было изучено с помощью радиоавтографии меченых молекул, выделенных ДНК (рис. 55).Если клетки были импульсно мечены 3НТ, то в световом микроскопе на автографах выделенных ДНК можно видеть участки восстановленного серебра в виде пунктирных линий. Это небольшие отрезки ДНК, которые успели реплицироваться, а между ними расположены участки нереплицированной ДНК, которая не оставила радиоавтографа и поэтому остается невидимой. По мере увеличения времени контакта 3НТ с клеткой величина таких отрезков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Из этих экспериментв можно точно рассчитать скорость репликации ДНК у эукариотических организмов. Скорость движения репликационной вилки оказалась равной 1-3 т.п.н. в мин у млекопитающих, около 1 т.п.н. в мин у некоторых растений, что намного ниже скорости репликации ДНК у бактерий (50 т.п.н. в мин.). В этих же экспериментах была прямо доказана полирепликонная структура ДНК хромосом эукариот: по длине хромосомной ДНК, вдоль нее, располагается множество независимых участков репликации – репликонов. По расстоянию между средними точками смежных метящихся репликонов, т.е. по расстоянию между двумя соседними стартовыми точками репликации, можно узнать величину отдельных репликонов. В среднем величина репликонову высших животных составляет около 30 мкм или 100 т.п.н. Следовательно, в гаплоидном наборе млекопитающих должно быть 20 000-30 000 репликонов. У низших эукариот величина репликонов меньше, около 40 т.п.н. Так у дрозофилы на геном приходится 3500 репликонов, а у дрожжей – 400. Как говорилось, синтез ДНК в репликоне идет в двух противоположных направлениях. Это легко доказывается радиоавтографически: если клеткам после импульсной метки дать продолжить синтезировать ДНК некоторое время в среде без 3НТ, то произойдет падение включения его в ДНК, будет происходить как бы разбавление метки, и на радиоавтографе можно будет видеть симметричное, с двух сторон реплицируемого участка, уменьшение количества зерен восстановленного серебра.

Реплицирующиеся концы или вилки в репликоне прекращают движение, когда встретятся с вилками соседних репликонов (в терминальной точке, общей для соседних репликонов). В этом месте реплицированные участки соседних репликонов объединяются в единые ковалентные цепи двух новосинтезированных молекул ДНК. Функциональное подразделение ДНК хромосом на репликоны совпадает со структурным подразделением ДНК на домены или петли, основания которых, как уже упоминалось, скреплены белковыми связками.

Таким образом весь синтез ДНК на отдельной хромосоме протекает за счет независимого синтеза на множестве отдельных репликонов, с последующим соединением концов соседних отрезков ДНК. Биологический смысл этого свойства становится ясным при сравнении синтеза ДНК у бактерий и эукариот. Так бактериальная монорепликонная хромосома длиной в 1600 мкм  синтезируется со скоростью около получаса. Если бы сантиметровая молекула ДНК хромосомы млекопитающих реплицировалась тоже как монорепликонная структура, то на это ушло бы около недели (6 суток). Но если в такой хромосоме расположено несколько сот репликонов, то для полной ее репликации понадобится всего около часа. На самом же деле время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6-8 часов. Это связано с тем, что не все репликоны отдельной хромосомы включаются одновременно.

В некоторых случаях наблюдается одновременное включение всех репликонов или же появление дополнительных точек начала репликации, что дает возможность закончить синтез всех хромосом за минимально короткое время. Это явление происходит на ранних этапах эмбриогенеза некоторых животных. Так известно, что при дроблении яиц шпорцевых лягушек Xenopus laevis синтез ДНК занимает всего 20 минут, тогда как в культуре соматических клеток этот процесс продолжается около суток. Аналогичная картина наблюдается у дрозофилы: на ранних эмбриональных стадиях весь синтез ДНК в ядре занимает 3,5 минуты, а в клетках культуры ткани – 600 минут. При этом в клетках культуры величина репликонов оказалась почти в 5 раз больше, чем у эмбрионов.

Синтез ДНК по длине отдельной хромосомы происходит неравномерно. Было обнаружено, что в индивидуальной хромосоме активные репликоны собраны в группы, репликативные единицы, которые включают в себя 20-80 точек начала репликации. Это следовало из анализа радиоавтографов ДНК, где наблюдалась именно такая сблоченность реплицирующихся отрезков. Другим основанием для представления о существовании блоков или кластеров репликонов или репликационных  единиц были эксперименты с включением в ДНК аналога тимидина - 5’-бромдезоксиуридина (BrdU). Включение BrdU в интерфазный хроматин приводит к тому, что во время митоза, участки с BrdU конденсируются в меньшей степени (недостаточная конденсация), чем те участки, где включался тимидин. Поэтому те участки митотических хромосом в которые включился BrdU, будут слабо окрашиваться при дифференциальной окраске. Это позволяет на синхронизированных культурах клеток выяснить последовательность включения BrdU, т.е. последовательность синтеза ДНК по длине одной взятой хромосомы. Оказалось, что происходит включение предшественника в большие участки хромосомы. Включение разных участков происходит строго последовательно в течение  S-периода. Каждая хромосома характеризуется высокой стабильностью порядка репликации по своей длине, имеет свой специфический рисунок репликации.

Кластеры репликонов, объединенные в репликационные единицы, связаны с белками ядерного матрикса (см. ниже), которые вместе с ферментами репликации образуют т.н. кластеросомы – зоны в интерфазном ядре, в которых идет синтез ДНК.

Порядок, в котором активируются репликационные единицы, может, вероятно, определяться структурой хроматина в этих участках. Так, например, зоны конститутивного гетерохроматина (вблизи центромеры) реплицируются обычно в конце S-периода, также в конце S-периода удваивается часть факультативного гетерохроматина (например, X-хромосома самок млекопитающих). Особенно четко во времени последовательность репликации участков хромосом коррелирует с рисунком дифференциальной окраски хромосом: R-сегменты относятся к ранореплицирующимся, G-сегменты соответствуют участкам хромосом с поздней репликацией. C-сегменты (центромера) – места самой поздней репликации.

Так как в разных хромосомах величина и число разных групп дифференциально окрашенных сегментов различно, то это создает картину асинхронного начала и завершения репликации разных хромосом в целом. Во всяком случае, последовательность начала и окончания репликации отдельных хромосом в наборе не беспорядочная. Существует строгая последовательность репродукции хромосом относительно других хромосом в наборе.

Длительность процесса репликации отдельных хромосом прямо не зависит от их размеров. Так крупные хромосомы человека группы А (1-3) оказываются мечеными в течение всего S-периода, так же как и более короткие хромосомы группы В (4-5).

Таким образом, синтез ДНК в геноме эукариот начинается почти одновременно на всех хромосомах ядра в начале S-периода. Но при этом происходит последовательное и асинхронное включение разных репликонов как в разных участках хромосом, так и в разных хромосомах. Последовательность репликации того или иного участка генома строго детерминирована генетически. Это последнее утверждение доказывается не только картиной включения метки в разные отрезки S-периода, но также тем, что существует строгая последовательность появления в ходе S-периода пиков чувствительности определенных генов к мутагенам.

Основные белки хроматина - гистоны

Роль ДНК в составе как интерфазных хромосом (хроматин интерфазного ядра), так и митотических хромосом достаточно ясна: хранение и реализация генетической информации. Однако для выполнения этих функций в составе интерфазных ядер необходимо иметь четкую структурную основу, которая позволила бы расположить огромные по длине молекулы ДНК в строгом порядке, чтобы с определенной временной последовательностью протекали процессы как синтеза РНК, так и редупликации ДНК В интерфазном ядре концентрация ДНК достигает 100 мг/мл (!). В среднем на интерфазное ядро млекопитающих приходится около 2 м ДНК, которая локализуется в сферическом ядре со средним диаметром около 10 мкм. Это значит, что такая огромная масса ДНК должна как-то быть уложена с коэффициентом упаковки 1 х 103--1 х 104. И при этом в ядре должен сохраниться определенный порядок в расположении частично или полностью деконденсированных хромосом. И кроме того, должны быть реализованы условия для упорядоченного функционирования хромосом. Ясно, что все эти требования не могут быть осуществлены в бесструктурной, хаотической системе.

В клеточном ядре ведущую роль в организации расположения ДНК, в ее компактизации и в регулировании функциональных нагрузок принадлежит ядерным белкам. Как уже указывалось, хроматин представляет собой сложный комплекс ДНК с белками, дезоксирибонуклеопротеин (ДНП), где на долю белков приходится около 60% от сухого веса. Белки в составе хроматина очень разнообразны, но их можно разделить на две группы: гистоны и негистоновые белки. На долю гистонов приходится до 80% от всех белков хроматина. Их взаимодействие с ДНК происходит за счет солевых или ионных связей и неспецифично в отношении состава или последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК. Несмотря на преобладание в общем количестве, гистоны представлены небольшим разнообразием белков: эукариотические клетки содержат всего 5-7 типов молекул гистонов. В отличие от гистонов, т.н. негистоновые белки большей частью специфически взаимодействуют с определенными последовательностями молекул ДНК, очень велико разнообразие типов белков, входящих в эту группу (несколько сот), велико разнообразие функций, которые они выполняют.

Гистоны связаны с ДНК в виде молекулярного комплекса, в виде субъединиц или нуклеосом. До этого считалось, что ДНК равномерно покрыта этими белками, связь которых с ДНК определяется свойствами гистонов.

Гистоны – белки характерные только для хроматина, обладают рядом особых качеств. Это основные или щелочные белки, свойства которых определяются относительно высоким содержанием таких основных аминокислот как лизин и аргинин. Именно положительные заряды на аминогруппах лизина и аргинина обусловливают солевую или электростатическую связь этих белков с отрицательными зарядами на фосфатных группах ДНК. Эта связь достаточно лабильна, легко нарушается, в этом случае может происходить диссоциация ДНП на ДНК и гистоны. Поэтому хроматин, дезоксирибонуклеопротеин или ще как называли раньше, нуклеогистон, является сложным нуклеиново-белковым комплексом, в который входят линейные высокополимерные молекулы ДНК и огромное множество молекул гистонов (до 60 млн. копий каждого типа гистонов на ядро).

Гистоны – наиболее хорошо биохимически изученные белки (см. табл. 5).

Таблица 5. Общие свойства гистонов млекопитающих

Гистон

Мол. вес

Основные аминокислоты, %

Кислые аминокислоты, %

Отношение основных аминокислот к кислым

Лизин

Аргинин

H1

H2A

H2B

H3

H4

23 000

13 960

13 770

15 340

11 280

29

11

16

10

11

1

9

6

13

14

5

15

13

13

10

5,4

1,4

1,7

1,8

2,5

Гистоны – относительно небольшие по молекулярной массе белки. Эти белки практически у всех эукариот обладают сходными свойствами, обнаруживаются одни и те же классы гистонов. Классы гистонов отличаются друг от друга по содержанию разных основных аминокислот. Так гистоны H3 и H4 относят к аргинин-богатым, из-за относительно высокого содержания в них этой аминокислоты. Эти гистоны являются наиболее консервативными из всех исследованных белков: их аминокислотные последовательности практически одинаковы даже у таких отдаленных видов как корова и горох (всего две аминокислотных замены).

Два других гистона H2A и H2B относятся к умеренно обогащенным лизином белкам. У различных объектов внутри этих групп гистонов обнаруживаются межвидовые вариации в их первичной структуре, в последовательности аминокислот.

Гистон H1, представляет собой не уникальную молекулу, а класс белков, состоящих из нескольких достаточно близкородственных белков с перекрывающимися последовательностями аминокислот. У этих гистонов обнаружены значительные межвидовые и межтканевые вариации. Однако их общим свойством является обогащенность лизином, что делает их самыми основными белками, которые легко отделяются от хроматина в солевых (0,5 М) растворах. В растворах с высокой ионной силой (1-2 М NaCI) все гистоны полностью отделяются от ДНК и переходят в раствор.

Для гистонов всех классов (особенно для H1) характерно кластерное распределение основных аминокислот, лизина и аргинина, на N- и C-концах молекул. Срединные участки молекул гистонов образуют несколько (3-4) -спиральных участка, которые компактизуются в глобулярную структуру в изотонических условиях (рис. 56). По-видимому, богатые положительными зарядами неспирализованные концы белковых молекул гистонов и осуществляют их связь друг с другом и с ДНК.

У гистона H1 наиболее вариабельным является N-конец, осуществляющий связь с другими гистонами, а C-конец, богатый лизином, взаимодействует с ДНК.

В процессе жизнедеятельности клеток могут происходить посттрансляционные изменения (модификации) гистонов: ацетилирование и метилирование некоторых остатков лизина, что приводит к потере числа положительных зарядов, и фосфорилирование сериновых остатков, приводящее к появлению отрицательного заряда. Ацетилирование и фосфорилирование гистонов может быть обратимым. Эти модификации значительно меняют свойства гистонов, их способность связываться с ДНК. Так повышенное ацетилирование гистонов предшествует активации генов, а фосфорилирование и дефосфорилирование связаны соответственно с конденсацией и деконденсацией хроматина.

Гистоны синтезируются в цитоплазме, транспортируются в ядро и связываются с ДНК во время ее репликации в S-периоде, т.е. синтез гистонов и ДНК синхронизированы. При прекращении клеткой синтеза ДНК гистоновые информационные РНК за несколько минут распадаются и синтез гисонов останавливается. Включившиеся в хроматин гистоны очень стабильны, имеют низкую скорость замены.

Подразделение гистоноы на пять групп и достаточное сходство их внутри каждой группы в целом характерно для эукариот. Однако целый ряд отличий в составе гистонов наблюдается как у высших, так и у низших эукариотических организмов. Так у низших позвоночных вместо H1, характерного для всех тканей этих организмов, в эритроцитах находят гистон H5, который содержит больше аргинина и серина. С другой стороны, наблюдается отсутствие некоторых групп гистонов у ряда эукариот, и в целом ряде случаев полная замена этих белков на другие.

Гистоноподобные белки были обнаружены в составе вирусов, бактерий, митохондрий. Так, например, у E. coli в клетке в большом количестве обнаруживаются белки (HU и H-NS), по аминокислотному составу напоминающие гистоны.

Функциональные свойства гистонов

Широкое распространение гистонов, их сходство даже у очень отдаленных видов, обязательность вхождения их в состав хромосом, все это говорит об их чрезвычайно важной роли в процессе жизнедеятельности клеток. Еще до открытия нуклеосом существовало две взаимодополняющие друг друга группы гипотез о функциональной роли гистонов, о регуляторной и структурной их роли.

Было обнаружено, что выделенный хроматин при добавлении к нему РНК-полимеразы может быть матрицей для транскрипции, однако активность его составляет всего лишь около 10% от активности, соответствующей активности выделенной чистой ДНК. Эта активность прогрессивно возрастает по мере удаления групп гистонов и может достичь 100% при полном удалении гистонов. Отсюда можно было сделать вывод, что общее содержание гистонов может регулировать уровень транскрипции. Это наблюдение совпадает с тем, что по мере удаления гистонов, особенно H1, происходит прогрессивная деконденсация, разворачивание фибрилл ДНП, что возможно облегчает взаимодействие РНК-полимеразы с матричной ДНК. Так же было обнаружено, что модификация гистонов приводит к усилению транскрипции и одновременной декомпактизации хроматина. Следовательно, напрашивается вывод о том, что количественное и качественное состояние гистонов влияет на степень компактности и активности хроматина. Однако оставался открытым вопрос о специфичности регуляторных свойств гистонов: какова роль гистонов при синтезе специфических иРНК в различно дифференцированных клетках. Этот вопрос до сих пор еще не решен, хотя можно сделать некоторые обобщения: на эту роль могут претендовать те группы гистонов, которые наименее консервативны, такие как H1 или как H2A и H2B, которые могут в значительной мере модифицироваться и тем самым изменять свои свойства в определенных участках генома.

Была очевидна и структурная, компактизирующая, роль гистонов в организации хроматина. Так постепенное добавление фракции гистонов к растворам чистой ДНК приводит к выпадению в осадок комплекса ДНП, и наоборот, частичное удаление гистонов из препаратов хроматина, ведет к его переходу в растворимое состояние. С другой стороны, в цитоплазматических экстрактах ооцитов земноводных или яиц морских ежей, содержащих свободные гистоны, добавление любой ДНК (включая фаговую) привводит к образованию хроматиновых фибрилл (ДНП), длина которых в несколько раз короче исходных ДНК. Эти данные говорят о структурной, компактизирующей роли гистонов. Для того, чтобы огромные сантиметровые молекулы ДНК уложить по длине хромосомы, имеющей размер всего несколько микрометров, молекула ДНК должна быть как-то скручена, компактизована с плотностью упаковки равной 1 : 10000. Оказалось, что в процессе компактизации ДНК существуют несколько уровней упаковки, первые из которых прямо определяются взаимодействием гистонов с ДНК.

Первый уровень компактизации ДНК: структурная роль нуклеосом

В ранних биохимических и электронномикроскопических работах было показано, что препараты ДНП содержат нитчатые структуры с диаметром от 5 до 50 нм. Постепенно стало ясно, что диаметр фибрилл хроматина зависит от способа выделения препарата.

На ультратонких срезах интерфазных ядер и митотических хромосом после фиксации глутаровым альдегидом обнаруживались хроматированные фибриллы толщиной 30 нм. Такие же размеры имели фибриллы хроматина при физической фиксации ядер - при быстром замораживании ядер, скалывании объекта и получении реплик с таких препаратов. В последнем случае исключалось воздействие на хроматин переменных химических условий. Но все эти методы и приемы не давали никакой информации о характере локализации ДНК и гистонов в хроматиновых фибриллах.

Крупным событием в изучении хроматина было открытие двумя разными способами нуклеосом - дискретных частиц хроматина. Так при осаждении на подложку для электронной микроскопии препаратов хроматина в щелочных условиях при низкой ионной силе, можно было видеть, что нити хроматина представляли собой что-то, напоминающее “бусы на нитке”: небольшие, около 10 нм, глобулы, связанные друг с другом отрезками ДНК длиной около 20 нм (рис. 57, 58). Эти наблюдения совпадали с результатами фракционирования хроматина после частичного нуклеазного переваривания.

Было найдено, что если подвергнуть действию нуклеазы микрококков выделенный хроматин, то он подвергается распаду на регулярно повторяющиеся структуры. Так ДНК, полученная из хроматина, обработанного нуклеазой, состояла из серии отрезков, кратных 200 парам оснований; встречались отрезки в 200, 400, 600, 800 и больше пар нуклеотидов (п.н.). Это говорит о том, что нуклеазной атаке в составе хроматина подвергаются участки ДНК, расположенные примерно через каждые 200 п.н. При этом в кислоторастворимую фракцию (низкополимерная) ДНК уходит всего 2% ядерной ДНК. Кроме того после такой нуклеазной обработки из хроматина путем центрифугирования удается выделить фракцию частиц со скоростью седиментации 11S (S - единица Сведберга, определяющая скорость седиментации частиц, равна 1 х 10-13 с), а также частицы кратного этой величине размера: димеры, тримеры, тетрамеры и т.д. Оказалось, что частицы 11S содержат ДНК около 200 п.н. и восемь гистонов (октамер) по две копии гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и одну копию гистона H1. Такая сложная нуклеопротеидная частица получила название нуклеосомы. Более подробный анализ этой фракции показал, что нуклеосома устроена следующим образом: октамер гистонов образует белковую основу-сердцевину (от англ. core, часто в нашей литературе этот термин используется без перевода: кор, коровая частица), по поверхности которой располагается ДНК величиной в 146 п.н., образующая 1,75 оборота; остальные 54 п.н. ДНК образуют участок, несвязанный с белками сердцевины - линкер, который, соединяя две соседние нуклеосомы, переходит в ДНК следующей нуклеосомы. Гистон H1 связывается частично с основной, сердцевиной и с участком линкера (около 30 п.н.). Следовательно, полная нуклеосома содержит около 200 п.н. ДНК (146 п.н.- сердцевина, 30 п.н. - участок линкера в комплексе с гистоном H1, 30 п.н. - свободная ДНК), октамер сердцевинных (коровых) гистонов и одну молекулу гистона H1 (рис. 59). Молекулярная масса полной нуклеосомы - 262000 Да. Рассчитано, что на весь гаплоидный геном человека (3 х 109 пар оснований) приходится 1,5 х 107 нуклеосом.

Сердцевина или коровая частица (или минимальная нуклеосома) очень консервативны по своей структуре: они всегда содержат 146 п.н. ДНК и октамер гистонов. Линкерный участок может значительно варьировать (от 8 до 114 п.н. на нуклеосому).

Используя метод рассеяния нейтронов удалось установить форму и точные размеры нуклеосом. При грубом приближении – это плоский цилиндр или шайба диаметром 11 нм и высотой 6 нм. Располагаясь на подложке для электронного микроскопирования они образуют «бусины», глобулярные образования около 10 нм, гуськом, тандемно сидящие на вытянутых молекулах ДНК. На самом же деле вытянутыми являются только линкерные участки, остальные три четверти длины ДНК спирально уложены по периферии гистонового октамера. Сам гистоновый октамер, как считают, имеет форму, напоминающую мяч для игры в рэгби, в состав которого входит тетрамер (H3 H4)2 и два независимых димера H2A H2B. На рис. 60 представлена схема расположения гистонов в сердцевинной части нуклеосомы.

В фибриллах хроматина линкерный участок не линеен, а продолжая спираль ДНК на поверхности нуклеосомной частицы,связывает соседние нуклеосомы так, что образуется как бы сплошная нить, толщиной около 10 нм, состоящая из тесно расположенных нуклеосом (рис. 61). При этом за счет дополнительной спирализации ДНК (1 отрицательный супервиток ДНК на 1 нуклеосому) происходит первичная компактизация ДНК, с плотностью упаковки равной 6-7 (200 п.н. длиной 68 нм, уложены в глобулу диаметром 10 нм). Укладка почти двух витков ДНК по периферии сердцевин нуклеосомы происходит, как считается, за счет взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков на поверхности октамера гистонов с фосфатами ДНК. N- и C-концевые участки сердцевинных гистонов, обогащенные положительными зарядами, вероятно, служат для дополнительной стабилизации структуры нуклеосомы.

Ведущая роль сердцевинных (коровых) белков в компактизации ДНК показана при самосборке нуклеосом. Регулируя последовательность добавления гистонов и ДНК, удалось получить полную реконструкцию нуклеосом. В этом процессе не играет никакой роли источник, откуда была взята ДНК: это может быть ДНК бактерии и даже циклическая ДНК вирусов. Оказалось, что для образования нуклеосом гистон H1 не требуется, он участвует в связывании уже готовых нуклеосом друг с другом и в образовании более высоких уровней компактизации ДНК. Ключевыми в построении нуклеосом оказались гистоны H3 и H4. При этом вначале ДНК связывается с тетрамером (H3 H4)2 к которому позжеприсоединяются два димера H2A H2B. Вероятно, высокая консервативность в строении гистонов H3 и H4 отражает их ведущую структурную роль на первых этапах компактизации ДНК при образовании нуклеосом.

Нуклеосомы при репликации и транскрипции

Как же происходит образование нуклеосом при репликации ДНК, какова судьба нуклеосом в вилке репликации, как распределяются новые и старые нуклеосомы или их белки – все эти вопросы еще до конца не разрешены.

При электронномикроскопическом исследовании реплицирующегося хроматина было обнаружено, что обе новообразованные фибриллы содержат нуклеосомы.

Если учесть скорость синтеза ДНК эукариот (20 нм в секунду),то новые нуклеосомы при удвоении хромосомных фибрилл должны возникать со скоростью 3-4 сек. Такая высокая скорость образования нуклеосом связана с тем, что в момент синтеза ДНК существует уже пул синтезированных гистонов всех классов, готовых войти в состав нуклеосом. Гистоновые гены, относящиеся к фракции умеренно повторяющихся последовательностей  ДНК, представлены в виде множественных копий для каждого гистона. Они активируются вместе с началом синтеза ДНК, поэтому по мере продвижения репликационной вилки, новые участки ДНК могут сразу взаимодействовать с новосинтезированными гистонами. Новосинтезированные гистоны и старые гистоны в составе предшествующих нуклеосом не смешиваются при образовании нуклеосом во время репликации ДНК. Вместо этого октамеры гистонов, присутствующие до репликации остаются интактными и переходят на дочерний дуплекс ДНК, в то время как новые гистоны собираются в совершенно новые кор-частицы на свободных от нуклеосом участках ДНК. Старые и новые октамеры гистонов распределяются между дочерними дуплексами ДНК случайным образом.

Что происходит со старыми нуклеосомами в вилке репликациии ДНК до конца не ясно. Согласно одной из гипотез, каждая из нуклеосом при подходе к ней репликативной вилки как бы расщепляется на две  «полунуклеосомы», а нуклеосомная ДНК разворачивается, чтобы дать пройти этот участок ДНК-полимеразе. После этого новосинтезированная цепь ДНК связывается со свободными гистонами, которые есть в избытке в ядре, и образуются новые нуклеосомы на второй цепи ДНК.

Как уже упоминалось, для активно функционирующих зон хроматина характерно деконденсированное, диффузное,состояние. На этом свойстве хроматина основан один из методов получения фракций активного хроматина, когда с помощью центрифугирования удается осадить конденсированный хроматин из гомогенатов ядер, отделив его тем самым от диффузного хроматина, обладающего высокой транскрипционной активностью. Фракции активного хроматина обладают рядом характерных свойств: повышенной чувствительностью к нуклеазам, повышенным уровнем модификации гистонов (особенно ацетилированием гистона H1), повышенным содержанием некоторых негистоновых белков.

Биохимические данные показывают, что во время транскрипции часть нуклеосомнвх белков остается связанной с ДНК. Нуклеосомы как частицы видны на хроматиновых фибриллах как до места отхождения транскрипта, так и после него при редкой посадке РНК-полимеразы, фермента вдвое большего, чем нуклеосома. При частой посадке этого фермента (например при транскрипции рибосомных генов, или генов в других активных локусах), частицы РНК-полимеразы располагаются тесно друг к другу и между ними нуклеосомы не видны (рис. 101). Вероятнее всего нуклеосомные белки при прохождении РНК-полимеразы не теряют связи с ДНК, а сама ДНК в составе нуклеосомы разворачивается. Предлагаются два варианта изменения структуры нуклеосом при синтезе РНК. При одном их них нуклеосома «расщепляется» на две полу-нуклеосомы, а ДНК разворачивается; при другом – нуклеосома частично декомпактизируясь, сохраняет тетрамер H3-H4, а два димера H2A-H2B временно отходят, а затем, после прохождения РНК-полимеразы, возвращаются, при этом восстанавливается исходная нуклеосома.

Второй уровень компактизациии – 30 нм фибрилла

Таким образом первый, нуклеосомный, уровень компактизации хроматина играет как регуляторную, так и структурную роль, обеспечивая плотность упаковки ДНК приблизительно в 6-7 раз.

Однако во многих электронномикроскопических исследованиях было показано, что как в митотических хромосомах, так и в интерфазных ядрах выявляются фибриллы хроматина с диаметром 30 нм (рис. 57в, 62). Хроматиновые фибриллы такого диаметра были видны как на ультратонких срезах после фиксации глутаровым альдегидом, так и на препаратах выделенного хроматина и выделенных хромосом в растворах, содержащих хотя бы низкие концентрации двухвалентных катионов. Было показано, что 30 нм фибрилла хроматина может обратно менять свой диаметр, становится фибриллой с толщиной 10 нм, если препараты хроматина переводить в деионизованную воду или в растворы, содержащие хелатон ЭДТА. С другой стороны, даже частичная экстракция гистона H1 переводит исходные 30 нм фибриллы хроматина в 10 нм нити, имеющие типичный нуклеосомный уровень организации. При добавлении к ним гистона H1восстанавливается первоначальный диаметр фибрилл.

Все это говорило о том, что нуклеосомные цепочки хроматина каким-то специфическим образом уложены так, что возникает не хаотическая агрегация нуклеосом, а правильная нитчатая структура с диаметром 30 нм.

Относительно характера упаковки нуклеосом в составе 30 нм фибриллы хроматина существует, по крайней мере, две точки зрения.

Одна из них защищает, т.н. соленоидный тип укладки нуклеосом. Согласно этой модели, нить плотно упакованных нуклеосом диаметром 10 нм образует в свою очередь спиральные витки с шагом спирали около 10 нм. На один виток такой суперспирали приходится 6 нуклеосом (рис. 62). В результате такой упаковки возникает фибрилла спирального типа с центральной полостью, которая иногда на негативно окрашенных препаратах бывает видна как узкий «канал» в центре фибриллы. При частичном разворачивании, декомпактизации такой фибриллы и нанесении ее на подложку хорошо видно «зигзагообразное» расположение нуклеосом вдоль фибриллы. Считается, что гистон H1 обеспечивает взаимодействие между соседними нуклеосомами, не только сближая и связывая их друг с другом, но и обеспечивая кооперативную связь нуклеосом так, что образуется довольно плотная спираль из 10 нм фибриллы. Удаление, даже частичное, гистона H1 вызывает переход 30 нм фибриллы в 10 нм фибриллу, а полное удаление его вызывает разворачивание последней в структуру типа «бусин-на-нити». Такой соленоидный тип упаковки ДНК приводит к плотности упаковки равной приблизительно 40 (т.е. на каждый мкм нити приходится 40 мкм ДНК). Эти представления получили подтверждение при анализе структуры хроматина с помощью дифракции рентгеновских лучей и нейтронов. Здесь необходимо отметить, что представление о соленоидном типе укладки получены из анализа вторично конденсированного хроматина. Вначале были получены препараты хроматина в присутствии ЭДТА или выделялись в растворах низкой ионной силы в присутствии ионов магния. Во всех этих случаях первоначально хроматин деконденсировался до уровня «бусин на нити», где отсутствует или дестабилизируется контакт между нуклеосомами.

Если же исследовать хроматин в составе ядер или в виде выделенных препаратов, но при поддержании определенной концентрации двухвалентных катионов (не ниже 1мМ), то можно видеть дискретность в составе 30 нм фибрилл хроматина: она состоит как бы из сближенных глобул того же размера, из нуклеомеров. В зарубежной литературе такие 30 нм глобулы или нуклеомеры получили название сверхбусин («супербиды») (рис. 57в, 62). Было обнаружено, что если в условиях, когда нуклеомерная структура фибрилл хроматина сохраняется, препараты хроматина подвергнуть нуклеазной обработке, то часть хроматина растворяется. При этом в раствор выходят частицы, имеющие размер около 30 нм с коэффициентом седиментации равным 45S в растворах, содержащих 1 мМ магния. Если такие выделенные нуклеомеры обработать ЭДТА, удалить ионы магния, то они разворачиваются в нуклеосомные цепочки, содержащие 6-8 нуклеосом. Таким образом, в состав одного нуклеомера входит отрезок ДНК, соответствующий 1600 парам оснований или 8 нуклеосомам.

Компактность нуклеомера зависит от концентрации ионов магния и наличия гистона H1. Негистоновые белки в конформационных превращениях нуклеомеров не участвуют.

Таким образом основная 30 нм фибрилла хроматина представляет собой линейное чередование нуклеомеров вдоль компактизованной молекулы ДНК (рис. 62). Вероятно, что гистоны H1, находясь в центральной зоне этой крупной частицы, взаимодействуя друг с другом, поддерживают ее целостность. В пользу этого говорят данные о кооперативном связывании гистонов H1 в группе по 6-8 молекул.

Противоречие между соленоидной и нуклеомерной моделью упаковки нуклеосом в составе фибрилл хроматина может быть снято, если принять модель нерегулярного соленоида: число нуклеосом на виток спирали не является строго постоянной величиной, что может привести к чередованию участков с большим или меньшим числом нуклеосом на виток.

Нуклеомерный уровень укладки хроматина обеспечивает 40 кратное уплотнение ДНК, что важно не только для достижения целей компактизации гигантских молекул ДНК. Компактизация ДНК в составе 30 нм фибрилл хроматина может налагать дополнительные функциональные ограничения. Так было обнаружено, что в составе 30 нм фибриллы хроматина ДНК становится практически недоступной для взаимодействия с таким ферментом как метилаза ДНК. Кроме того резко падает способность хроматина связываться с РНК-полимеразой и рядом регуляторных белков. Таким образом второй уровень компактизации ДНК может играть роль фактора, инактивирующего гены.

В заключении необходимо еще раз напомнить, что как нуклеосомный, так и нуклеомерный (супербидный) уровни компактизации ДНК хроматина осуществляются за счет гистоновых белков, которые участвуют не только в образовании нуклеосом, но и в их кооперативном объединении в виде фибрилл ДНП, где ДНК претерпевает дополнительную сверхспирализацию. Все остальные уровни компактизации связаны с дальнейшим характером укладки 30 нм фибрилл в новые компактизационные уровни, где ведущую роль играют негистоновые белки.

Негистоновые белки

Негистоновые белки составляют около 20% от всех белков хроматина. По определению, негистоновые белки – это все белки хроматина, кроме гистонов, выделяющиеся с хроматином или хромосомами. Это сборная группа белков, отличающихся  друг от друга как по общим свойствам, так и по функциональной значимости. Около 80% из негистоновых белков относится к белкам ядерного матрикса, обнаруживаемых как в составе интерфазных ядер, так и митотических хромосом. Эта группа белков будет отдельно рассмотрена в разделе, посвященном комплексу структур, входящих в состав ядерного матрикса: фиброзный слой или ламина ядерной оболочки и внутренний ядерный матрикс, интерхроматиновая сеть, матрикс ядрышка.

Во фракцию негистоновых белков может входить около 450 индивидуальных белков с различной молекулярной массой (5-200 кД). Часть этих белков водорастворима, часть растворима в кислых растворах, часть непрочно связана с хроматином и диссоциирует при 0,35 М концентрации солей (3 М NaCI) в присутствии денатурирующих агентов ( 5 М мочевина). Поэтому характеристика и классификация этих белков затруднена, а сами белки еще недостаточно изучены.

Среди негистоновых белков обнаруживается целый ряд регуляторных белков как стимулирующих инициацию транскрипции, так и ингибирующих ее, обнаружены белки специфически связывающиеся с определенными последовательностями на ДНК. К негистоновым белкам относят также ферменты, участвующие в метаболизме нуклеиновых кислот (ДНК-полимеразы, ДНК-топоизомеразы, метилазы ДНК и РНК, РНК-полимеразы, РНКазы и ДНКазы и т.д.), белков хроматина (протеинкиназы, метилазы, ацетилазы, протеазы и др.) и многие другие.

Наиболее подробно изучены неистоновые белки т.н. группы с высокой подвижностью (HMG – high mobility group, или «белки Джонса»). Они хорошо экстрагируются в 0,35 М NaCI и 5% HCIO4 и обладают высокой электрофоретической подвижностью (отсюда их название). Основных HMG-белков четыре: HMG-1 (м.в. = 25500), HMG-2 (м.в. = 26000), HMG-14 (м.в. = 100000. HMG-17 (м.в. = 9247). Эта группа наиболее богата представлена среди негистоновых белков: в клетке их около 5% от всего числа гистонов. Особенно часто эти белки встречаются в активном хроматине (примерно 1 молекула HMG-белка на 10 нуклеосом). Белки HMG-1 и HMG-2 не входят в состав нуклеосом, а связываются, видимо с линкерными участками ДНК. Белки HMG-14 и HMG-17 связываются с сердцевинными белками нуклеосом, что обеспечивает, вероятно, изменение уровня компактизации фибрилл ДНП, которые становятся более доступными для взаимодействия с РНК-полимеразой. В этом случае HMG-белки выступают в качестве регуляторов транскрипционной активности. Было обнаружено, что фракция хроматина, обладающая повышенной чувствительностью к ДНКазе I, обогащена HMG-белками.

Петлевые домены ДНК – третий уровень структурной организации хроматина

Расшифровка принципа строения элементарных хромосомных компонентов – нуклеосом и 30 нм фибрилл – еще мало что дает для понимания основ трехмерной организации хромосом, как в интерфазе, так и в митозе. Сорокакратное уплотнение ДНК, которое достигается при сверхспиральном характере ее компактизации, совершенно еще недостаточно для получения реального (1 х 104) уровня уплотнения ДНК. Следовательно должны существовать более высокие уровни компактизации ДНК, которые в конечном счете должны определять размеры и общие характеристики хромосом. Такие высшие уровни организации хроматина были обнаружены при искусственной его деконденсации, когда было найдено, что поддержание их связано с негистоновыми белками. В этом случае специфические белки связываются с особыми участками ДНК, которые в местах связывания образуют большие петли или домены. Таким образом следующие более высокие уровни компактизации ДНК связаны не с ее дополнительной спирализацией, а с образованием поперечной петлистой структуры, идущей вдоль интерфазной или митотической хромосомы.

Как уже указывалось, сложная структура ядра или нуклеоида прокариот организована в виде иерархии петлевых доменов ДНК, связанных с небольшим количеством специальных белков.

Петлевой принцип упаковки ДНК обнаруживается также и у эукариотических клеток. Так если выделенные ядра обработать 2 М NaCI, т.е. удалить все гистоны, то целостность ядра сохраняется, за исключением того, что вокруг ядра возникнет т.н. «гало», состоящее из огромного числа петель ДНК. Такая структура ядер получила название «нуклеоида» (это только терминологическое сходство с ядерным аппаратом прокариот). Гало (или периферия такого нуклеоида) состоит из огромного (до 50000) количества замкнутых на периферии петель ДНК, со средним размером петель около 60 т.п.н., основание которых закреплено где-то внутри ядра, на участках негистоновых белков. Тем самым считается, что после удаления гистонов основания петлевых доменов ДНК, связаны с т.н. «матриксом» или «скэффолдом» - негистоновым белковым остовом интерфазного ядра. Оказалось, что участки ДНК, связанные с этим остовом, имеют особое сродство к негистоновым белкам, их состав изучен, они получили название MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachment region) участков.

Оказалось, что петлевые домены ДНК интерфазных ядер можно выделить. В выделенных ядрах в присутствии двухвалентных катионов (2 мМ Ca++ ) в хроматине ядра выявляются небольшие сгустки величиной около 100 нм, т.н. хромомеры. Если такие хромомеры препаративно выделить, а затем экстрагировать из них гистоны, то под электронным микроскопом можно видеть розетковидные петлистые структуры, где отдельные петли отходят от центрального плотного участка. Количество петель в такой розетке может составлять 15-80, а общая величина ДНК может достигать 200 т.п.н., с суммарной длиной ДНК до 50 мкм. Обработка таких розеток протеиназами приводит к исчезновению плотной центральной области розетки и к разворачиванию петель ДНК.

Признаки петлевой доменной организации хроматина можно наблюдать с помощью электронного микроскопа после помещения ядер или хромосом в солевые растворы низкой ионной силы (0,01 М NaCI) в присутствии низких концентраций двухвалентных катионов ( 1 мМ). В этих условиях не происходит депротеинизации хроматина, он сохраняет свою нормальную химическую композицию, но значительно разрыхляется и представлен стандартными фибриллами толщиной 30 нм. При этом в некоторых местах можно видеть, что отдельные сгустки конденсированного хроматина выявляют особую структуру. Это – розетковидные образования, состоящие из многих петель30 нм фибрилл, соединяющихся в общем плотном центре. Средний размер таких петлистых розеток достигает 100-150 нм. Подобные розетки фибрилл хроматина – хромомеры – можно видеть в ядрах самых разнообразных объектов, животных, растений, простейших (рис. 63).

Особенно демонстративно такие хромомеры выявляются на тотальных препаратах хроматина из макронуклеусов инфузории Bursaria. В этом случае можно видеть, что каждый хромомер состоит из нескольких содержащих нуклеосомы петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина, так что в целом видна цепочка розетковилных структур (рис. 64).

Сходные картины можно наблюдать при разрыхлении политенных хромосом. Здесь хромомеры в виде розеток хроматина выявляются в зонах хроматиновых дисков, в то время как междисковые участки их не содержат (рис. 65). При деконденсации хроматина ядер некоторых растений (Allium, Haemantnus, Vicia), для которых характерна особая структура интерфазных ядер, хромомеры видны в составе хромонемных нитей.

Подобные розетковидные петлистые структуры, хромомеры, можно видеть также при разрыхлении и митотических хромосом как животных, так и растений. Следовательно, хромосомные 30 нм фибриллы, состоящие из ДНК и гистонов, упаковываются в виде петлистых розетковидных структур, претерпевая еще дополнительную компактизацию. Это третий уровень структурной организации хроматина, как считается, может приводить уже к 600-кратной компактизации ДНК (рис. 66).

Важно отметить, что размер отдельных петлевых доменов совпадает с размером средних репликонов и может соответствовать одному или нескольким генам. В своих основаниях петли ДНК связаны негистоновыми белками ядерного матрикса, в состав которых могут входить как ферменты репликации ДНК, так и транскрипции. Такая петельно-доменная структура хроматина обеспечивает не только структурную компактизацию хроматина, но и организует функциональные единицы хромосом – репликоны и транскрибируемые гены. Комплекс белков, участвующих в такой структурно-функциональной организации хроматина, относится к белкам ядерного матрикса.

Глава 6. Ядерный белковый матрикс

Общий состав ядерного матрикса

Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый ядерный остов или матрикс. Необходимо сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще «ядерным скелетом».

Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка, связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие «ершика для чистки бутылок» (см. рис. 67).

Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные липопротеидные мембраны.

Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. табл. 6).

Таблица 6. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения ядерного белкового матрикса

Обработка

Фракция

Белок

ДНК

РНК

Фосфолипиды

1.Изолированные

  ядра

2. 0,2 мМ MgCl2

3. 2 M NaCl

4. 1% Тритон Х-

   100

5.ДНКаза+РНКаза

N

LS

HS

NM

NPM

0

52

83

90

90

0

75

97

97

99

0

19

66

71

98

0

2,5

6,4

97,8

98

Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-HCI буфера и 5 мМ MgCI2помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2 М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков. Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1% фосфолипидов.

Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у различных объектов (см. табл. 7).

Таблица 7. Состав ядерного белкового матрикса

Объект

Белок

ДНК

РНК

Фосфолипиды

Крыса, печень                 97                    0,1                    1,2                         1,1

Клетки HeLa                   92,3                  1,2                    0,05                       6,9

Тетрахимена                   97                     0,1                    1,2                         0,5

По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный) слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (рис. 68).

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL – “pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.

Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер. Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.

Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы РНП-природы.

Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из плотно уложенных фибрилл.

Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса, так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.

Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс представлен только комплексом  PCL. Если же использовать тетратионат натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные ядрышки.

Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены отчетливо.

Как было видно из табл. 7, основной компонент остаточных структур ядра – белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый состав ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов. Кроме этих основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.

Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.

Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым), входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также препараты ядерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра даже после удаления ядерных мембран.

В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки, могут разбираться при фосфорилировании ламинов, и вновь полимеризоваться при их дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки.

Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или «скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за поддержание петлевой организации ДНК.

ДНК ядерного белкового матрикса

Рассматривая особенности ДНК, входящей в состав ядерного матрикса, необходимо еще раз подчеркнуть, что эта остаточная ДНК представлена в минимальном количестве (0,1-1% от сухого веса фракции) составляет лишь менее 1% от всей ДНК ядра. Эта ДНК оказалась устойчивой к действию нуклеаз, вероятно за счет ее существования в виде прочных ДНК-белковых комплексов.

Большой интерес представляет изучение фрагментов ДНК, входящих в состав ядерного матрикса. Расчеты показали, что в ядрах существует от 60000 до 125000 участков ДНК, защищенных от действия нуклеаз и эти участки могут быть расположены на всех трех компонентах ядерного матркса.

Подробно изучена ДНК ядерного матрикса клеток асцитной карциномы Эрлиха мышей. Так были обнаружены две размерные группы фрагментов ДНК в составе ядерного матрикса. В первую группу входили высокомолекулярные фрагменты размером около 10 т.п.н., они составляли всего 0,02% от исходного количества ДНК. Их число составляло примерно 100 на гаплоидный набор хромосом, т.е. всего2-3 участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу на хромосому. Эти фрагменты были обогащены сателлитной ДНК и были связаны с ламиной. Функциональное значение этих участков может состоять в обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине.

Вторая группа фрагментов, связанных с матриксом, состояла из небольших участков ДНК (120-140 п.н.), гетерогенных по последовательности. Они встречаются между участками ДНК длиной около 50 т.п.н., представляющих собой, вероятно петли основной массы хроматина (рис. 69). Функциональное значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том, что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розеткоподобных структур хроматина или в основании развернутых петель ДНК хроматина при его активации.

Сходные результаты были получены на многих объектах. Было обнаружено, что зоны (районы) связывания ДНК с матриксом (MAR – matrix attachment regions или SAR – scaffold attachment regions) содержат приблизительно 200 п.н. и располагаются друг от друга на расстоянии 5-112 т.п.н. У дрозофилы на ядро приходится по крайней мере 10 000 таких MAR (или SAR) областей.

Места расположения последовательностей SAR (MAR) очень сходны или даже идентичны с местами связывания ДНК с топоизомеразой II, которая играет основную структурную и ферментативную роль в образовании петель хроматина. Более того один из белков матрикса («скэффолда») митотических хромосом, белок Scl оказался просто топоизомеразой II. С помощью иммунофлуоресценции было показано, что на интерфазных хромосомах Scl локализуется в основании петель ДНК.

При изучении кинетики гидролиза вновь синтезированной ДНК нуклеазами было обнаружено, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК. Было обнаружено, что большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку, связана с матриксом: свыше 70% новосинтезированной ДНК было локализовано в зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание считать, что на ядерном матриксе происходит инициация и собственно репликация ДНК. Фракция ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом, оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса обнаружена ДНК-полимераза , основной фермент репликации ДНК. Кроме него с ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного комплекса (реплисомы): ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II. Высказана гипотеза о том, что репликация ДНК осуществляется таким образом, что петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе репликационные комплексы (рис. 70). Было обнаружено, что участки начала репликации ДНК располагаются вблизи (или совпадают с ними) участков постоянного прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

В состав ядерного матрикса входит около 1% РНК, включающей в себя как гетерогенную высокомолекулярную РНК, так и рибосомную РНК, и РНК ядерных малых РНП. На возможность связи элементов матрикса с процессами транскрипции указывали данные о том, что при коротком мечении матрикс обогащался быстро меченной гетерогенной РНК. Было обнаружено, что в состав белков внутреннего ядерного матрикса входит РНК-полимераза II, ответственная за синтез информационных РНК. С ядерным матриксом клеток яйцеводов кур оказалась связанной большая часть (95%) новосинтезированных пре-мРНК овальбумина и пре-рРНК. Эти наблюдения привели к заключению, что ядерный матрикс может выполнять структурную роль в синтезе, процессинге и транспорте РНК в ядре.

С ядерным матриксом связаны собственно транскрибирующиеся гены. Транскрипционные комплексы закреплены на ядерном матриксе, а сама транскрипция осуществляется одновременно с перемещением матричной ДНК относительно закрепленных транскрипционных комплексов, содержащих РНК-полимеразу II. Кроме тРНК и ее предшественников в составе ядерного белкового матрикса обнаруживаются малые ядерные рибонуклеопротеиды (мя РНП), которые участвуют в созревании информационных РНК, в процессе сплайсинга (см. ниже). Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые сплайсосомами, собраны в группы или кластеры, связанные с белками ядерного матрикса.

Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции транскрипции. Так участки MAR обычно связаны с такими регуляторными последовательностями на ДНК как энхансеры и сайленсеры, определяющими интенсивность транскрипционных процессов. На ядерном матриксе локализованы белки-рецепторы для ряда стероидных гормонов.

Относительно связи ДНК с элементами ядерного матикса на сегодня сложились представления о том, что эта связь может отражать различные функциональные особенности. Так связь ДНК с ламиной может отражать структурную, постоянную ассоциацию ДНК, а связь с внутренними элементами – функциональную, связанную как с синтезом ДНК, так и РНК,

Поведение белков ядерного матрикса во время митоза изучено еще далеко недостаточно. О судьбе ламины при митозе уже было сказано: ее компоненты разбираются, частично переходя в цитоплазму, частично (ламин В) оставаясь в связи с мембранами. Относительно компонентов внутриядерного матрикса сведений меньше: известно, что часть этих белков входит в состав матрикса («скэффолда») митотических хромосом.

Четвертый – хромонемный уровень упаковки хроматина

Исследуя структурную организацию хроматина и хромосом можно определенно говорить о нескольких уровнях компактизации ДНК. Первый – нуклеосомный, дающий 7-кратное уплотнение ДНК в составе фибрилл ДНП, второй – 30 н.м. фибрилла или нуклеомерный уровень с40--70-кратной степенью упаковки, третий – доменно-петлевой или хромомерный приводящий к 600-700-кратному уплотнению ДНК в составе этих структур. Для поддержания первых двух уровней компактизации было достаточно участие только гистоновых белков, тогда как петлевые и розетко-подобные доменные структуры уже требовали участия негистоновых белков, и перехода от спирального или соленоидного типа укладки ДНК к образованию компактных глобулярных структур, состоящих из петель хроматиновых 30-нм фибрилл, к структурам типа хромомеров, имеющих уже размеры 0,1-0,2 мкм.

Однако еще в классических работах цитологов начала ХХ века как в интерфазных ядрах, так и, особенно, в митотических хромосомах описывались нитчатые структуры – хромонемы, имеющие толщину 0,1-0,2 мкм. Их удавалось наблюдать как на фиксированных объектах, так и в живых клетках. Подробные исследования ультраструктуры митотических хромосом на разных этапах митоза с помощью электронной микроскопии полностью подтвердило наличие этого четвертого уровня компактизации хроматина (рис. 71).

При изучении ультраструктурных основ строения митотических хромсом необходимо учитывать хромонемный уровень компактизации хроматина. Хромонему – нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0,1-0,2 мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной конденсации хромосом в профазе митоза и при деконденсации хромосом в телофазе. Причем такие хромонемы выявляются как в клетках растений, так и животных (рис. 72, 73).

Изучение профазных хромосом как животных, так и растений показывает, что процесс конденсации хромосомного материала включает в себя промежуточный этап – образование из фибрилл ДНП нитчатых хромонемных структур, являющихся единицей последующей хромосомной структуризации.

В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромонемные элементы на ультратонких срезах не выявляются. Но по мере деконденсации митотических хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе снова можно видеть признаки хромонемной организации хромосом. В поздней анафазе, когда хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре снова выявляются хроматиновые нитчатые образования с толщиной 0,2 мкм. При этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает начало общей деконденсации митотических хромосом. Эта начальная стадия деконденсации связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутри хромонем, а с расхождением, обособлением участков хромонемы друг от друга. Особенно заметным и выраженным этот процесс становится в телофазе. В это время хромосомы начинают увеличиваться в объеме, при этом расстояние между отдельными участками хромонемы также возрастает. В расположении отдельных нитей хромонемы, так же как и в профазных хромосомах, улавливаются признаки спиральности в их укладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые участки, иногда располагающиеся параллельно друг другу. Спиральность хромонемы в составе митотических хромосом удается наблюдать в ряде случаев при частичной искусственной деконденсации выделенных митотических хромосом (рис. 74). В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены ядерной оболочкой. Хромонемные элементы расходятся на значительные расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются. В это время некоторые участки хромонем начинают разрыхляться, их толщина взрастает. Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и расположением хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть картину, обратную той, что наблюдалась в профазе: разрыхление хромосом за счет первоначального расхождения участков хромонемы и последующего их разрыхления, деконденсации самих хромонем.

Ультраструктурная организация хромонемного уровня упаковки ДНП хорошо выявляется при постепенном экспериментальном разрыхлении хромосом при понижении концентрации двухвалентных катионов. Оказалось, что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется так, что выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы представлены сечениями толстых (0,1-0,2 мкм) хромосомных нитей, хромонем (рис. 73). Затем, при последующем снижении концентрации двухвалентных катионов, происходит как бы распад хромонемных элементов на множество линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с диаметром около 0,1-0,2 мкм. В дальнейшем эти блоки (хромомеры) начинают деконденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП, а в центре остается тело хромомера. Возникает розеткоподобная структура. Важно отметить, что расположение зон с розеткоподобными хромомерами совпадает с рисунком G-бэндирования хромосом. По мере дальнейшей деконденсации петли увеличиваются в длину, а центральные участки хромомеров прогрессивно уменьшаются. При полной деконденсации все тело хромосомы представлено на срезах равномерно расположенным фибриллами ДНП.

Надо отметить, что в современных молекулярно биологических исследованиях строения хромосом хромонемный уровень, как один из высших уровней упаковки ДНП, совершенно выпадает из поля зрения исследователей. Лишь в последнее время некоторые исследователи на основании косвенных данных приходят к выводам о наличии в интерфазных ядрах хромонемо-подобных структур.

Глава 7. Общая организация митотических хромосом

Интенсивное изучение ультраструктуры хромосом началось в середине 50-х гг., что было связано с внедрением в цитологию метода электронной микроскопии. Однако вклад электронной микрскопии в изучение структуры интерфазных и митотических хромосом оказался неизмеримо ниже того, что дал этот метод для изучения структуры цитоплазмы. Наши представления о структурной организации даже элементарных компонентов ядра и о структуре хромосом очень скудны и противоречивы. Разрыв между успехами в биохимическом изучении процессов биосинтеза ДНК и РНК, с одной стороны, и чрезвычайно медленным прогрессом в исследовании тонкой организации клеточного ядра – с другой, объясняется многими причинами. Одна из основных причин та, что современные методы не позволяют изучать ядро и хромосомы в целостной совокупности составляющих их элементов. Хромосома оказалась слишком мала для детального анализа с помощью светового микроскопа и слишком велика и плотна для изучения в электронном микроскопе. На выделенных хромосомах в электронном микроскопе не удается выявить все детали из-за наложений проекций разных уровней и можно наблюдать лишь характер формы или же тонкую структуру в ограниченных участках. Исследование ультратонких срезов хромосом ограничивается характеристикой отдельны элементов без возможности получить объемное представление о всей структуре. Это происходит из-за того, чтобы в данном случае мы можем исследовать лишь плоские сечения, составляющие только 0,05-0,025 часть общего объема ядра. Так как для ядра и хромосом характерно преобладание тонких и длинных спутанных фибриллярных структур, которые на ультратонких срезах будут иметь вид беспорядочно разбросанных коротких отрезков, то по таким сечениям воссоздать трехмерную картину взаимосвязи этих элементов друг с другом практически невозможно.

При изучении ультраструктуры хромосом исследователи сталкиваются с парадоксальной ситуацией: чем ближе подходим к высшим структурным уровням организации хромосом, тем меньшей по объему и более низкой по надежности становится информация об этой важнейшей клеточной структуре (рис. 75).

Действительно, получена полная информация о генетическом коде человека, хорошо изучен нуклеосомный уровень компактизации ДНК, определен общий петлевой доменный характер дальнейшей укладки ДНК, подтверждаются представления о хромонемном уровне, но все же, на сегодня мы до конца не знаем как построена митотическая хромосома (рис. 76).

Трудности изучения хромосом связаны кроме всего прочего, что это очень лабильная структура, легко меняющая свою морфологию в зависимости от условий эксперимента.

Так обращает на себя внимание свойство митотических хромосом обратимо изменять свой объем при изменении ионного окружения. Как уже указывалось, применение гипотонических растворов приводит к набуханию хромосом, но при возвращении их в изотонические условия, они вновь приобретают исходную морфологию. Из этого следует, что существует какой-то механизм, стабилизирующий общую организацию хромосомы. В хромосоме существует какой-то структурный порядок, алгоритм взаимодействия компонентов, который инвариантно приводит интерфазную развернутую, деконденсированную хромосому в состояние плотного тела (митотическая хромосома), не меняющего ни своей толщины, ни длины, ни особенностей структуры в бесчисленном ряду клеточных поколений.

Как уже говорилось, для изучения ультраструктуры хромосом широко применяется метод получения целых выделенных митотических хромосом. На таких препаратах видно, что в состав хромосом входят 25-30 нм элементарные фибриллы. Однако уловить характер их укладки, какой-либо порядок в их расположении не удается. Хромосомы в этом случае имеют вид тел, состоящих как бы из перепутанных изгибающихся фибрилл, или, по образному выражению одного из цитологов, напоминают результат аварии на макаронной фабрике.

На препаратах таких выделенных и распластанных хромосом нет реальной  возможности выяснить, из какого числа нитей состоит хромосома, тем более проследить путь и порядок укладки одной нити от начала до конца, если бы она была основой хромосомы. Более того, процесс выделения хромосом приводит к изменению их структуры. Легко видеть в световом микроскопе, что перенос живых делящихся клеток в гипотонические растворы приводит к резкому набуханию их хромосом. Хромосомы при этом плохо различимы, они увеличиваются в объеме, становятся менее оптически плотными. В целом митотические хромосомы в этих условиях ведут себя так же, как препараты выделенного хроматина, - набухают, переходят в менее конденсированное состояние. Такое воздействие на них гипотонической среды приводит к потере субструктуризации хромосомы.

Однако на то, что такая субструктуризация существует, говорит масса фактов не только электронномикроскопических, но и полученных с помощью светового микроскопа. Вся совокупность морфологических и биохимических данных должна быть учтена при воссоздании трехмерной организации митотических хромосом.

В 70-х годах удалось уловить общий принцип структурной организации митотической хромосомы.

Было обнаружено, что хромосомы не теряют своей морфологической целостности, не распадаются даже при резком набухании, вызванном удалением всех гистонов. Это достигается обработкой выделенных хромосом растворами полианионов, декстрансульфата и гепарина. В этом случае хромосомы настолько деконденсируются, что перестают быть видны в фазово-контрастном микроскопе. При добавлении же флуорохрома, связывающегося с ДНК (этидиум бромид), было видно, что сильно набухшие хромосомы не разваливались, а значительно (до 4 раз) увеличивались в длину и ширину. Такие сильно набухшие, лишенные гистонов хромосомы помещали на подложку и рассматривали в электронный микроскоп.

Оказалось, что набухшие хромосомы состоят из двух компонентов: из рыхлой сети плотных фибрилл в центральных участках (хромосомный остов – скэффолд), повторяющих контуры метафазных хромосом (осевые компоненты), и из многочисленных длинных тонких петель, отходящих от них в поперечном направлении (рис. 77). Была показана белковая природа осевых компонентов и ДНК в составе петель. Средний размер боковых петель составлял около 30 мкм. Если такие препараты обработать ДНКазой, то можно получить белковые остовы и анализировать их состав. Оказалось, что в них присутствует около 20 белков негистоновой природы, сходных с белками ядерного матрикса. Исходя из этого, была предложена модель структурной организации митотических хромосом. В ее основе лежит принцип поперечного расположения петель ДНК вдоль белковой осевой структуры. В принцип этот тип организации митотической хромосомы очень напоминает хромосомы типа «ламповых щеток», встречающихся в процессе мейоза.

Петлевое расположение ДНК вдоль хромосомы получило в дальнейшем целый ряд подтверждений. Однако при разных способах депротеинизации кроме петель в периферии набухших хромосом можно было выявить и розеткоподобные структуры, состоящие из ДНК.

В последнее время получены данные, говорящие о том, что осевые структуры могут представлять собой артефакт, получившийся в результате монтажа и высушивания дегистонизированных хромосом на подложке. На самом же деле в теле хромосомы существуют негистоновые белковые связки (скрепки), сшивающие основания боковых петель ДНК, но эти связки разбросанные рыхло по объему хромосомы (рис. 78). Как бы то ни было, принцип петлевой поперечной укладки ДНК в теле хромосомы очень важен для понимания ее общей ультраструктурной организации.

Необходимо подчеркнуть, что на поперечных и продольных сечениях митотических хромосом, фиксированных в нативном состоянии внутри клеток никаких центральных или осевых элементов не обнаружено. Они выявляются только после удаления из выделенных хромосом всего набора гистонов, чему предшествует изоляция хромосом в гипотонической среде.

На основании этих наблюдений широкое распространение нашла христоматийная схема, объясняющая общую структуру митотической хромосомы (рис. 79). По этой схеме первым уровнем компактизации ДНК является нуклеосомная фибрилла, толщиной 10 нм, где вокруг одной нуклеосомы, оборачивается 146 п.н. ДНК с коэффициентом компактности равным 6-7 (к.к. 6-7); второй уровень – 30 нм фибрилла-соленоид (к.к. 40); третий уровень – петлевой домен, 60 т.п.н. на петле в 0,2-0,3 мкм  (к.к. 680). Далее отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образуют вокруг осевого элемента хромосомы один виток диаметром 0,7-0,8 мкм (толщина хроматиды) с коэффициентом компактизации 12 х 104. Такой виток из петлевых доменов может представлять собой минимального размера бэнд, а набор из нескольких витков – средний бэнд.

По другим представлениям можно предположить, что петле ДНК, выявляемой на хромосомах, лишенных гистонов, соответствует хромомер, промежуточным этапом деконденсации которого является розеткоподобная структура ДНП.

Важно отметить, что хромомерные участки ДНП встречаются и в интерфазных ядрах (там они называются хромоцентрами). Оказалось, что порядок их деконденсации такой же, что и в митотической хромосоме: из хромоцентров возникают розеткоподобные структуры с петлями ДНП по их периферии.

Итак, можно несколько иначе оценить некоторые этапы компактизации ДНК, которые приводят в конце концов к построению плотного тела митотической хромосомы (рис. 80).

Первый уровень – нуклеосомный – образует сверхскручивание ДНК по поверхности гистоновой сердцевины. Второй – нуклеомерный (сверхбусина), где идет объединение 8-10 нуклеосом в виде глобулы. Так как все эти уровни компактизации происходят на огромных линейных молекулах ДНК, то ряд сближенных нуклеомеров и образует 20-30-нанометровую фибриллу ДНП. Третий уровень – хромомерный:: петли фибрилл ДНП, объединенные скрепками из негистоновых белков, образуют компактные тела, которые при искусственной деконденсации дадут розетковидные структуры. Расположение петлевых доменов, хромомеров, может быть неравномерным; участки тела митотической хромосомы, обогащенные ими, могут соответствовать «бэндам» или сегментам при дифференциальной окраске хромосом. Четвертый уровень – хромонемный: сближенные в линейном порядке хромомеры образуют толстые (0,1-0,2 мкм) хромосомные нитчатые структуры, которые можно уже наблюдать  и в световом микроскопе. Характер упаковки этой нити в теле хроматиды еще недостаточно выяснен; возможна спиральная укладка хромонемы, но не исключено образование ею и еще одного уровня петлистых структур.

Конечно, такая общая схема организации митотических хромосом очень неполно отражает особенности строения их специализированных участков таких как ядрышковый организатор, теломеры и центромеры.

Часть III

Ядерные транскрипты и их транспорт

Одна из важнейших функций клеточного ядра является реализация генетической информации в виде синтеза целого ряда РНК или служащих матрицами для синтеза белка, или образующих аппарат белкового синтеза. Синтез разного типа РНК на матрицах ДНК хроматина, транскрипция, включает в себя образование нескольких типов РНК, синтезируемых с помощью различных РНК-полимераз, ферментов синтезирующих РНК по одной из цепей матричной ДНК. Всего в эукариотических клетках встречается 5 типов РНК (см. табл. 8).

Таблица 8. Типы РНК, их количество, стабильность и ферменты, участвующие в их синтезе.

№№

пп

Тип РНК

Количество в %

% синтезированных молекул за ед времени

Фермент

1

2

3

4

5

иРНК

рРНК

тРНК

мяРНК

митРНК

10

50-70

25

5

15

58

39

3

РНК-полимераза II

РНК-полимераза I

РНК-полимераза II

РНК-полимераза II

Информационные РНК, самые разнообразные по величине и по строению нуклеотидных последовательностей являются самыми нестабильными по времени их жизни: они синтезируются в большом количестве и быстро деградируют, что обеспечивает смену функциональных активностей клетки. В связи с их быстрой заменой общее число их относительно невелико, 10% от массы всех РНК в клетке. Эти иРНК синтезируются при участии фермента РНК-полимеразы II, которая может образовывать первичную копию РНК с любого гена, кодирующего структуру белка. Дальнейшее созревание этих первичных транскриптов, их значительное укорочение и перестройка (сплайсинг – см. ниже) происходит с помощью особых рибонуклеопротеидных частиц, содержащих малые ядерные РНК (мяРНК). Эти мяРНК сннтезируются также с помощью этого фермента, их количество в клетке невелико (5%), но они более стабильны и долгоживущие. К мяРНК относится целая гетерогенная группа РНК, входящая в состав малых РНП-частиц, таких как SRP, теломераза, сплайсосомы и др. (см. ниже). Все остальные клеточные РНК необходимы для создания аппарата белкового синтеза. Рибосомные РНК синтезируются  с помощью РНК-полимеразы I, они представляют основную массу клеточных РНК и относительно стабильны. Одна из рибосомных РНК, 5S РНК, а также 20 трансферных РНК, тоже стабильных, синтезируются с помощью РНК-полимеразы III. Митохондриальные РНК синтезируются в самих митохондриях независимо от синтеза РНК в ядре.

Реализация генетической информации, выражающаяся в синтезе разнообразных молекул РНК должна быть связана с изменением морфологии ядерных компонентов. На светооптическом уровне активация ядерной транскрипции всегда связана с деконденсацией хроматина, с увеличением объема ядрышек, с повышением их базофилии, т.е. с увеличением в них количества РНК. Эти общие признаки увеличения ядерной активности мало что дают для понимания хода молекулярных процессов на уровне реальных ядерных компонентов. Что происходит с участками хроматина, заключающими индивидуальный ген, кодирующий определенный белок, изучать очень трудно, т.к. эти гены в подавляющем большинстве случаев существуют в единичных копиях и проследить в гигантском клубке деконденсированных интерфазных хромосом за работой индивидуального гена чрезвычайно трудно (хотя и возможно).

Относительно более просто эту же задачу можно решить на генах многократно повторенных в геноме, таких как гены рибосомных РНК, входящих в состав интерфазных ядрышек, основной функцией которых является образование рибосом. Изучая ультраструктуру ядрышек и особенности морфологии синтеза рибосомных РНК впервые удалось с помощью электронного микроскопа визуализировать работающий ген.

Глава 8. Ядрышко – источник рибосом

Внутри интерфазных ядер как при витальных наблюдениях, так и на фиксированных и окрашенных препаратах видны мелкие, обычно шаровидные тельца – ядрышки. Впервые ядрышки были описаны Фонтана в 1774 г. В живых клетках они выделяются на фоне диффузной организации хроматина из-за своей светопреломляемости. Последнее свойство связано с тем, что ядрышки являются наиболее плотными структурами в клетке. Ядрышки обнаруживаются практически во всех ядрах эукариотических клеток за редким исключением. Это говорит об обязательном присутствии этого компонента в клеточном ядре.

В клеточном цикле ядрышко присутствует в течение всей интерфазы: в профазе по мере компактизации хромосом во время митоза оно постепенно исчезает, и отсутствует в мета- и анафазе, и вновь появляется в середине телофазы, чтобы сохраняться вплоть до следующего митоза, или до гибели клетки.

Долгое время функциональное значение ядрышка было непонятно. Вплоть до 50- годов исследователи считали, что вещество ядрышка представляет собой своего рода запас, который используется и исчезает в момент деления ядра.

Однако еще в 30-х годах рядом исследователей (МакКлинток, Хейтц, Навашин) было показано, что возникновение ядрышек связано топографически с определенными зонами на особых, ядрышкообразующих хромосомах. Эти зоны были названы ядрышковыми организаторами, а сами ядрышки представлялись как структурное выражение хромосомной активности. Позднее в 40-х годах, когда было найдено, что ядрышки содержат РНК, стала понятна их «базофилия», сродство к основным (щелочным) красителям, из-за кислой природы РНК. По данным цитохимических и биохимических исследований основным компонентом ядрышка является белок: на его долю приходится до 70-80% от сухого веса. Такое большое содержание белка и определяет высокую плотность ядрышек. Кроме белка в составе ядрышка обнаружены были нуклеиновые кислоты: РНК (5-14%) и ДНК (2-12%).

Уже в 50-х годах при изучении ультраструктуры ядрышек в их составе были обнаружены гранулы, сходные по своим свойствам с цитоплазматическими гранулами рибонуклеопротеидной природы, с рибосомами. Следующим этапом в изучении ядрышка было открытие принципиального факта – «ядрышковый организатор» является вместилищем генов рибосомных РНК.

Строение рибосом

Рибосома представляет собой элементарную клеточную машину синтеза любых белков клетки. Все они построены в клетке одинаково, имеют одинаковую молекулярную композицию, выполняют одинаковую функцию – синтез белка – поэтому их можно так же считать клеточными органоидами. В отличие от других органоидов цитоплазмы (пластид, митохондрий, клеточного центра, мембранной вакуолярной системы и др.) они представлены в клетке огромным числом: за клеточный цикл их образуется 1 х 107 штук. Поэтому основная масса клеточной РНК представляет собой именно рибосомную РНК. РНК рибосом относительно стабильна, рибосомы могут существовать в клетках культуры ткани в течение нескольких клеточных циклов. В печеночных клетках время полужизни рибосом составляет 50-120 часов.

Рибосомы – это сложные рибонуклеопротеидные частицы, в состав которых входит множество молекул индивидуальных (неповторенных) белков и несколько молекул РНК, Рибосомы прокариот и эукариот по своим размерам и молекулярным характеристикам отличаются, хотя и обладают общими принципами организации и функционирования. К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения полностью расшифрована структура рибосом.

Полная, работающая рибосома, состоит из двух неравных субъединиц, которые легко обратимо диссоциируют на большую субъединицу и малую. Размер полной прокариотической рибосомы составляет 20 х 17 х 17 нм, эукариотической – 25 х 20 х 20. Полная прокариотическая рибосома имеет коэффициент седиментации 70S и диссоциирует на две субъединицы: 50S и 30S. Полная эукариотическая рибосома, 80S рибосома, диссоциирует на 60S и 40S субъединицы. Форма и детальные очертания рибосом из разнообразных организмов и клеток, включая как прокариотические, так и эукариотические, поразительно похожи, хотя и отличаются рядом деталей. Малая рибосомная субъединица имеет палочковидную форму с несколькими небольшими выступами (см. рис. 81), ее длина составляет около 23 нм, а ширина – 12 нм. Большая субъединица похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При ассоциации в полную 70S рибосому малая субчастица ложится одним концом на один из выступов 50S частицы, а другим в ее желобок. В состав малых субъединиц входит по одной молекуле РНК, а в состав большой – несколько: у прокариот – две, а у эукариот – 3 молекулы. Характеристики молекулярной композиции рибосом даны в таблице 9.

Таблица 9. Молекулярная характеристика рибосом

Объект

Коэффициент седиментации полной рибосомы и ее субъединиц

Кол-во молекул РНК на субъеди-ницу

Молеку-лярный вес РНК

Коэффи-циент седиментации РНК

Кол-во белковых молекул на субъединицу

                                      30S                1            0,56 х 106        16S                  21

Рибосомы          70S

Прокариот                     50S                2            1,2 х 106          23S                 34

                                                                           4,0 х 104            5S

                                      40S                1             0,6 х 106          18S

Рибосомы          80S

Эукариот                        60S                3             1,6 х 106          28S             Всего

                                                                            4,0 х 104            5S            около

                                                                            4,5 х 104          5,8S              80

Таким образом в состав эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины: 28S РНК содержит 5000 нуклеотидов, 18SРНК – 2000, 5,8S РНК – 160, 5SРНК – 120.Рибосомные РНК обладают сложной вторичной и третичной структурой, образуя сложные петли и шпильки на комплементарных участках, что приводит к самоупаковке, самоорганизации этих молекул в сложное по форме тело. Так, например, сама по себе молекула 18S РНК в физиологических ионных условиях образует палочковидную частицу, определяющую форму малой субъединицы рибосом.

Под действием низких ионных сил, особенно при удалении ионов магния, плотные рибосомные субъединицы могут разворачиваться в рыхлые рибонуклеопротеидные тяжи, где можно наблюдать кластеры отдельных белков, но правильных структур, типа нуклеосом, нет, т.к. нет групп из сходных белков: в рибосоме все 80 белков разные.

Для того, чтобы образовались рибосомы необходимо наличие четырех типов рибосомных РНК в эквимолярных отношениях и наличие всех рибосомных белков. Сборка рибосом может происходить спонтанно in vitro, если последовательно добавлять к РНК белки в определенной последовательности.

Следовательно для биосинтеза рибосом необходим синтез множества специальных рибосомных белков и 4-х типов рибосомной РНК. Где эта РНК синтезируется, на каком количестве генов, где эти гены локализованы, как они организованы в составе ДНК хромосом – все эти вопросы в последние десятилетия были успешно разрешены при изучении строения и функции ядрышек.

Чем определяется число ядрышек в клетке

Как уже говорилось, все клетки имеют обязательные внутриядерные структуры – ядрышки. Это правило имеет небольшое число исключений, которые, как будет видно, только подчеркивают важность и необходимость участия ядрышка в жизненных отправлениях клетки. К таким исключениям относятся клетки дробящихся яиц, где ядрышки отсутствуют на ранних этапах эмбриогенеза, или клетки, закончившие развитие и необратимо специализировавшиеся как, например, некоторые клетки крови.

В остальных случаях в клетках наблюдается 1-5 ядрышек, причем их количество не строго постоянно даже у одного и того же типа клеток. Более того в некоторых половых клетках (растущие ооциты) число ядрышек может достигать нескольких сот, т.е. на два порядка выше, чем в соседних соматических клетках. Это - т.н. амплификация ядрышек.

Еще в 30-х годах было сделано предположение, что число ядрышек зависит от числа "ядрышковых организаторов" - особых участков, на которых в телофазе происходит новообразование ядрышек интерфазного ядра. Часто ядрышковые организаторы локализованы во вторичных перетяжках хромосом (образуют вторичные перетяжки хромосом). Так у человека ядрышковые организаторы расположены в коротких плечах 13, 14, 15, 21 и 22 хромосом (10 на диплоидный набор) (рис. 82). У млекопитающих обычно имеется несколько ядрышкообразующих хромосом на диплоидный набор: у кошки - 2; у свиньи - 2; у мыши - 4; у коровы - 8. У хладнокровных позвоночных и у птиц обычно имеется только по одной паре ядрышкообразующих хромосом.

Таким образом максимальное число ядрышек в разных клетках определяется числом ядрышковых организаторов и увеличивается согласно плоидности ядра: в крупных полиплоидных ядрах всегда количество ядрышек больше.

Это правило подтверждается прямыми наблюдениями над мутантными особями с разным числом ядрышковых организаторов. Так у шпорцевой лягушки в норме в диплоидной клетке есть две ядрышкообразующих хромосомы и соответственно 1-2 ядрышка. У гетерозиготной особи с одной ядрышкообразующей хромосомой - 1, у гомозиготных мутантных личинок, у которых нет ядрышковых организаторов, ядрышки не возникают и не происходит синтеза рРНК. Сходные наблюдения были получены на дрозофилах с разным числом ядрышкообразующих хромосом от 0 до 4.

Локализация ядрышковых организаторов определяется довольно точно на митотических хромосомах с помощью окраски солями серебра, которые имеют специфическое сродство к некоторым ядрышковым белкам. Более точным является определение ядрышковых организаторов с помощью метода молекулярной гибридизации in situ. Так меченная тритием рРНК при контакте с денатурированной ДНК на препарате митотических хромосом образует ДНК-рРНК гибрид только в тех местах, где есть последовательности ДНК, комплементарные рРНК.

Чаще всего в клетках количество ядрышек меньше, чем число ядрышковых организаторов. Это связано с тем, что при новообразовании ядрышек они могут сливаться друг с другом в одну общую структуру, т.е. могут объединяться в пространстве интерфазного ядра отдельные ядрышковые организаторы разных хромосом. Так в тканях человека могут встречаться клетки с одним ядрышком. Это значит, что десять ядрышкообразующих участков, локусов, диплоидного набора хромосом входят в состав одного ядрышка. Слияние ядрышек друг с другом хорошо показано на живых клетках культуры ткани при цейтраферной киносъемке.

Множественность рибосомных генов

При изучении числа ядрышек при различных хромосомных абберациях было найдено, что при разрыве хромосомы на месте вторичной перетяжки ядрышки могут возникать на каждом из фрагментов хромосом. Так при обмене участками между двумя хромосомами в микроспороцитах кукурузы, в том случае когда разрыв одной из хромосом происходил через ядрышковый организатор, возникали две хромосомы, каждая из которых несла часть исходного ядрышкового организатора. В этом случае обе хромосомы обладали способностью образовывать ядрышки, хотя и в неодинаковой степени. Из этих наблюдений был сделан очень важный вывод (который полностью подтвердился в 60-х годах на молекулярно-биологическом уровне) о том, что ядрышковый организатор представляет собой не точечный локус хромосомы, а является множественным по своей структуре, содержит несколько одинаковых генных участков, каждый из которых отвечает за образование ядрышка.

Методом молекулярной гибридизации было показано, что в составе геномов эукариот рибосомные гены представлены сотнями и тысячами единиц; они принадлежат к фракции умеренно повторяющихся последовательностей ДНК. Даже у бактерий в геноме может быть несколько (6-7) рассеянных по геному идентичных последовательностей, ответственных за синтез рРНК. Общее количество этой фракции ДНК (рДНК) у E. coli составляет около 1% от всей ДНК. У эукариотических организмов этот процент может составлять 0,18 для X. laevis, 0,4 - для человека, 1,3 для дрозофилы, 5,5 для пекарских дрожжей. Число же рибосомных генов у эукариот намного больше, чем у прокариотических клеток. В табл. 10 приведены некоторые примеры числа генов рРНК у различных представителей эукариот.

Таблица 10. Количество рибосомных генов на гаплоидный набор хромосом

Хордовые

Млекопитающие:

Птицы:

Амфибии:

Рыбы:

Беспозвоночные

Иглокожие:

Насекомые:

Моллюски:

Нематоды:

Простейшие

Высшие растения:

Грибы:

Водоросли:

Слизневики:

Человек       - 200

Мышь         - 100

Кошка         - 1000

Курица         - 200

Тритон

гребенчатый  - 4100

Амфиума       - 19600

Линь             - 120

Лосось           - 730

Неоцератод     - 4800

Морской еж    - 260

Сверчок

домашний       - 170

Шелкопряд

тутовый          - 240

Устрица           - 220

Аскарида         - 300

Эвглена           - 800

Тетрахимена     - 290

Фасоль             - 2000

Кукуруза          - 8500

Дрожжи

пекарские         - 140

Хламидомонада  - 150

Ацетабулария    - 1900

Диктиостелиум  - 200

Физарум           - 80

С помощью метода молекулярной гибридизации было проанализировано не только число рибосомных генов, но и их локализация. Из этих экспериментов следовало, что именно зоны ядрышковых организаторов во вторичных перетяжках хромосом Xenopus содержат рибосомные гены и что в каждом из этих организаторов содержится примерно по 300 генов, т.е. ядрышковые организаторы представляют собой полицистронные участки, содержащие множество одинаковых генов (полиизогенные участки). Следовательно, рибосомные гены собраны вместе в группы или кластеры.

Наблюдать непосредственно порядок расположения рибосомных генов на ДНК выделенных ядрышек с помощью электронного микроскопа удалось на дополнительных ядрышках ооцитов амфибий.

Амплифицированные ядрышки 

Обычно число генов рибосомных РНК постоянно на геном, оно не меняется в зависимости от уровня транскрипции этих генов. Так у клеток с высоким уровнем метаболизма число генов рРНК точно такое же как и число у клеток, полностью прекративших синтез рибосом. При репликации ДНК в S-периоде происходит и удвоение числа генов рРНК, поэтому их количество коррелирует с плоидностью клетки.

Однако существуют случаи, когда гены рРНК подвергаются избыточной репликации. При этом дополнительная репликация генов рРНК происходит в целях обеспечения продукции большого количества рибосом. В результате такого сверхсинтеза генов рРНК их копии могут становиться свободными, экстрахромосомными. Эти внехромосомные копии генов рРНК могут функционировать независимо, в результате чего возникает масса свободных дополнительных ядрышек, но уже не связанных структурно с ядрышкообразующими хромосомами. Это явление получило название амплификации генов рРНК. Особенно подробно это явление изучено на растущих ооцитах амфибий, хотя оно встречается как у животных, так и у растений.

Так у X. laevis, наиболее подробно изученный и популярный объект, амплификация рДНК, происходит в профазе I деления созревания, когда синтез хромосомной ДНК давно закончен. В этом случае количество амплифицированной рДНК (или генов рРНК) становится в 3000 раз больше того, что приходится на гаплоидное количество рДНК, и соответствует 1,5 х 106 генов рРНК. Эти сверхчисленные внехромосомные копии и образуют сотни дополнительных ядрышек в растущих ооцитах. В среднем же на одно дополнительное ядрышко приходится несколько сот или тысяч генов рРНК.

Амплифицированные ядрышки встречаются также в ооцитах насекомых. Так у окаймленного плавунца в ооцитах обнаружено 3 х 106 экстрахромосомных копий генов рРНК.

Биологический смысл появления сверхчисленных экстрахромосомных ядрышек при росте ооцитов совершенно понятен: для синтеза огромного количества запасных продуктов, которые будут использованы на ранних стадиях эмбриогенеза, необходимо соответственно огромное количество рибосом, которые могут быть в клетке синтезированы на дополнительных матрицах этих многочисленных амплифицированных ядрышек. После периода созревания ооцита при его двух последовательных делениях эти дополнительные ядрышки в состав митотических хромосом не входят, они отделяются от новых ядер и деградируют. Следовательно, амплификация рДНК в ооците представляет собой временное явление, не сказывающееся на постоянстве генома.

У низших эукариотических организмов наблюдаются также экстрахромосомные ядрышки. Так у Tetrachymena pyriformis в составе гаплоидного генома микронуклеуса имеется только единственный ген рРНК. В макронуклеусе же этого организма содержится около 200 гаплоидных эквивалентов в виде экстрахромосомных копий. У дрожжевых клеток также обнаружены экстрахромосомные копии генов рРНК в виде циклических молекул ДНК длиной около 3 мкм, содержащих один ген рРНК.

Строение и функционирование генов рРНК

Итак, в ядрышковых организаторах определенных хромосом локализованы места множественных сгруппированных вместе генов рибосомной РНК. Но как уже говорилось, существует 4 типа молекул рибосоной РНК, каждый из которых в полной эукариотической рибосоме представлен один раз. Значит ли это, что для каждой из этих РНК (28S рРНК, 18S рРНК, 5,8S рРНК, 5S рРНК) должен существовать отдельный ген, было долгое время неясным. Не понятным было также, как осуществляется в клетках одновременное сбалансированное образование этих разных рРНК. Этот вопрос был решен при исследовании динамики синтеза рибосомных РНК. Было обнаружено, что при использовании импульсной короткой метки среди клеточных РНК обнаруживается быстро синтезирующая РНК с высокой скоростью седиментации, тяжелая 45S РНК. Если после появления этой 45S РНК продолжать наблюдать за распределением метки во фракциях РНК, но уже в отсутствие меченных предшественников, то можно видеть, что по мере убывания метки в зоне 45S РНК, она начинает появляться и стабильно накапливаться в зонах 28S, 18S и 5,8S рибосомных РНК. Эти данные говорили о том, что при синтезе рибосомных РНК сначала образуется гигантская молекула-предшественник (45S РНК), которая затем дает начало основным молекулам рибосомной РНК. Было найдено, что молекула 45S РНК содержит около 13 х 103 оснований, имеет массу около 4,6 х 106, и может быть длиной 2-5 мкм. Явление распада молекулы 45S рРНК на фрагменты, соответствующие размерам 28S, 18S и 5,8S РНК, получил название "процессинг" или созревание. Во время процессинга происходит разрыв предшественника на три фрагмента и кроме того наблюдается значительная деградация РНК (около 50%, т.е. 6000 нуклеотидов). Кроме этих данных было вычислено, что молекула 5S РНК синтезируется независимо от 45S РНК и локализация гена 5S рРНК не связана с ядрышковым организатором.

Почти одновременно с получением этих биохимических данных О. Миллеру (1969) удалось с помощью электронного микроскопа увидеть работающие рибосомные гены. Для этого были под световым микроскопом вручную выделены ядра из средних ооцитов тритона, микроиглами была разорвана ядерная оболочка и в микропипетку были втянуты многочисленные амплифицированные ядрышки. Такая капля, содержащая ядрышки и кариоплазму, была перенесена в раствор низкой ионной силы со щелочным значением среды. Этот раствор наслаивался на раствор сахарозы с формалином, находящийся в микроячейке центрифужной пробирки, на дне микроячейки помещалась сеточка с формваром для электронной микроскопии. Действие низкой ионной силы в щелочной среде приводило к набуханию и диспергированию выделенных ядрышек, они разрыхлялись настолько, что становились плохо различимыми в световом микроскопе. При центрифугировании такие набухшие ядрышки проходили через слой сахарозы, еще больше расправлялись и фиксировались в формалине. Наконец они достигали дна микроячейки и распластывались на формваровой подложке. После этого сеточки вынимались, обезвоживались, оттенялись металлом и просматривались в электронном микроскопе (рис. 83, 97а).

На таком препарате были видны сложно изогнутые и перепутанные длинные осевые молекулы ДНК, на которых через равные промежутки располагались фибриллярные зоны, имеющие вид "елочек". Длина фрагмента ДНК, занятого такой "елочкой" была постоянной и равнялась 5 мкм. На этом отрезке располагалось около 100 плотных гранул величиной около 20 нм, от каждой из которых отходила в сторону тонкая изогнутая нить. Величина такой нити была минимальной на одном конце такого отрезка и максимальной на другом. Эти извитые латеральные нити и образовывали структуру типа "елочки". Было доказано, что крупные гранулы на нити ДНК представляют собой молекулы РНК-полимеразы I, ответственной за синтез рРНК, а боковые изогнутые нити - транскрипты, состоящие из синтезируемых молекул РНК. Самые длинные транскрипты находились на одном конце "елочки", соответствовали 45S предшественнику рРНК. Следовательно, синтез рРНК начинался на конце отрезка с короткими боковыми нитями, и заканчивался на участке с длинными нитями РНК. Такой участок ДНК, на котором были видны молекулы рРНК в процессе их удлинения, получил название транскрипционной единицы. Между транскрипционными единицами располагались участки ДНК, лишенные гранул РНК-полимеразы I и транскриптов. Это - зоны т.н. спейсеров, которые не транскрибируются, и, более того, на таких препаратах они имеют нуклеосомное строение, тогда как транскрипционные единицы свободны от нуклеосом. Величина таких спейсерных участков может варьировать не только в данной клетке, но быть различной у разных видов. Длина боковых фибрилл была в 5-10 раз короче, чем 45S РНК, из-за того, что эта новосинтезированная РНК связана с белками, образуя рибонуклеопротеидный тяж, предшественник рибосом.

Исходя из этих работ стало ясно, что рибосомный ген состоит из двух участков: нетранскрибируемая последовательность ДНК (nts) - спейсер и транскрипционная единица. В состав транскрипционной единицы входят участки, соответствующие 28S, 18S и 5,8S рРНК, разделенные вставками, которые деградируют при процессинге 45S РНК.

Расшифровка структуры рибосомных генов различных эукариотических объектов показала удивительно универсальный тип их строения:

3' nts - промотор- tse - 18S рРНК - tsi1 - 5,8S рРНК - tsi2 - 28S рРНК 5'

где nts - нетранскрибируемые последовательности ДНК спейсерного участка, ts - транскрибируемые последовательности ДНК (внешняя и две внутренние), и участки, соответствующие зрелым рибосомным РНК. В состав транскрипционной единицы входит весь ген за исключением спейсерного участка. Такая структура рибосомного гена практически одинакова для всех эукариотических организмов (рис. 84). Вариабельными являются как нетранскрибируемые (спейсерные) участки, так и транскрибируемые вставки (ts), которые не входят в состав зрелых рРНК.

Итак три основные молекулы рРНК синтезируются на одной транскрипционной единице. Что же касается молекулы 5S рРНК, то она к этому гену никакого отношения не имеет: 5S рРНК синтезируется на отдельных генах, локализованных не в зонах ядрышковых организаторов, даже на совсем иных хромосомах при участии РНК-полимеразы III. Так у человека основная масса генов 5S рРНК находится на I хромосоме, более мелкие кластеры - на 9 и 16 хромосомах. У ксенопуса гены 5S рРНК расположены в теломерных участках большинства хромосом. Гены 5S рРНК, тоже множественные, также собраны в кластеры, но их число выше, чем у остальных генов рРНК. Так у человека их насчитывается до 2000, у ксенопуса - 24000, у гребенчатого тритона - 32000. Есть объекты и с меньшим их числом: Drosophila - 320; крыса - 830. У нейроспоры и дрожжей число генов 5S рРНК одинаковое с числом других рибосомных генов, т.к. участок 5S рРНК включен и транскрибируется в спейсерной зоне.

Транскрипция рРНК идет с помощью двух ферментов: РНК-полимеразы I, которая участвует в синтезе 45S предшественника рРНК и РНК-полимеразы III, ответственной за синтез 5S рРНК. Матрицей для синтеза рРНК по определению должна быть ядрышковая ДНК.

В изолированном р-хроматине обнаружены гистоны, негистоновые белки и белки рибосом. Так в р-хроматине обнаружены основные сердцевинные (коровые) гистоны, но их количество составляет только 40% по сравнению с таковым в тотальном хроматине.

Первичные транскрипты (морфологически представлены в виде латеральных филаментов на “елочках”, образующихся на активных транскрипционных единицах) прогрессивно увеличиваются в длину по мере прохождения РНК-полимеразы I вдоль всего транскрипционного участка гена, начиная с точки начала репликации до терминального участка. Скорость роста цепи пре-рРНК составляет около 20-30 нуклеотидов/сек., т.е. весь синтез 45S рРНК занимает около  5-10 минут.

На каждой транскрипционной единице располагается множество (50-100) молекул РНК-полимеразы I, тем самым на каждом гене одновременно происходит синтез множества молекул пре-рРНК, которые находятся на разных стадиях роста полинуклеотидной цепи (рис. 85). Максимальной величины пре-рРНК достигает вблизи терминального участка, где ее молекулярный вес достигает 4,5 х 106 Д (для млекопитающих), а длина должна соответствовать 5,2 мкм. На самом же деле длина латерального транскрипта в 5-10 раз короче этой величины. Это связано с тем, что по мере роста транскрипта он связывается сразу же с белками, образуя в конечном участке транскрипции рибонуклеопротеид с коэффициентом седиментации 80S. Такие 80S рРНП составляют до 20% от всех РНП ядрышка. Большая часть белков, которые связываются с 45S РНК являются белками, входящими в состав малой и большой субъединиц зрелых рибосом. Таким образом уже на уровне незрелой гигантской молекулы пре-рРНК происходит специфическое связывание с рибосомными белками: около 50% белков большой субъединицы и около 30% малой субъединицы связываются с пре-рРНК во время ее синтеза или вскоре после него. Такая связь 45S РНК с белками и приводит к тому, что латеральные транскрипты имеют толщину около 10 нм (после оттеснения металлами), на их свободном конце часто наблюдается крупная гранула (30 нм), что может указывать на высокую степень компактизации РНК и белка на 5’-конце цепи РНК.

Распад 45S РНК на более короткие отрезки, явление созревания рРНК или процессинг, происходит после завершения транскрипции. Ферментативный механизм этого явления еще до конца не ясен, в нем принимает участие эндо- и экзонуклеазы. При этом происходит последовательное расщепление пре-рРНК на фрагменты и частичная деградация участков РНК на этих фрагментах. В результате процессинга пре-рРНК примерно 50% нуклеотидов первично синтезированной молекулы отщепляется (мол. вес 45S РНК составляет 4,6 х 106, а суммарный мол. вес зрелых рРНК около 2,2 х 106) (рис. 86).

Таким образом, в ядрышке локализуются следующие основные предшественники рибосом: 1. Транскрипты рРНК в процессе их роста; 2. 80S РНП, содержащие 45S РНК, они могут составлять до 10-20% всех РНП ядрышка; 3. 55S РНП, предшественники большой субъединицы, могут составлять до 70-80% всех РНП ядрышка; время созревания большой рибосомной субъединицы занимает около одного часа; 4. Незрелые малые (40S РНП) субъединицы рибосом, быстро (за 15-30 мин) покидающие ядрышко.

В интенсивно функционирующих ядрышках происходит синтез огромного числа рибосом: 1500-3000 штук в минуту. Поэтому в ядрышке насчитывается около 5 х 104 предшественников рибосом.

Структура ядрышка 

О тонком строении ядрышка сведения были получены главным образом методом электронной микроскопии. Световая микроскопия давала ограниченный набор сведений о структуре ядрышка из-за их малого размера (1-5 мкм) и недостаточной разрешающей способности данного метода. Из прижизненных наблюдений было видно, что ядрышки обладают высокой плотностью и высоким светопреломлением. В их структуре даже прижизненно видна некоторая неоднородность: описывались нитчатые (нуклеолонемы), гранулярные компоненты (нуклеолини), а также светлые зоны - “вакуоли”. Гистохимически в ядрышках выявлялась РНК, но не ДНК. ДНК в ядрышках выявлялась лишь в периферической их зоне в виде т.н. околоядрышкового хроматина, который мог прилежать к одной из сторон ядрышка, окружать его кольцом, или вообще отсутствовать. Считалось, что околоядрышковый хроматин представляет собой гетерохроматиновые зоны. Кроме того было найдено, что ядрышки имеют некоторое сродство к солям серебра, обладают аргентофилией, могут восстанавливать серебро из различных растворов (нитрат серебра, “аммиачное серебро”, протеинаты серебра). При этом происходит отложение темных осадков исключительно в ядрышках интерфазных клеток, а также в ядрышковых организаторах на митотических хромосомах при делении клетки.

Первые электронномикроскопические работы показали, что ядрышки самых различных объектов несмотря на их разнообразие, построены из одинаковых компонентов: гранулярного и фибриллярного (рис. 87). При этом гранулы в составе ядрышек имели размеры 15-20 нм и были несоизмеримо меньше тех “гранул”, что были видны в световом микроскопе. Кроме гранул в составе ядрышек обнаружили зоны скопления тонких (3-5 нм) фибрилл - диффузная часть ядрышек. Взаимное расположение гранулярных и фибриллярных зон в ядрышке может быть различным. Так, в некоторых случаях, фибриллярный компонент занимает центральную часть ядрышка в виде однородного образования (печень аксолотля, многие ядрышки растительных меристем) или в виде нескольких (3-5) отдельных зон (рис. 88).

Обычно гранулярный компонент (ГК) расположен на периферии ядрышка, но встречаются случаи, когда фибриллярный и гранулярный компонент распределены в ядрышке равномерно. Часто в структуре ядрышек фибриллярно-гранулярные компоненты образуют нитчатые структуры, нуклеолонемы (ядрышковые нити), толщиной около 100-200 нм. Эти нуклеолонемы при достаточном контрастировании могут быть видны даже в световом микроскопе. Ядрышковые нити или нкулеолонемы также неоднородны по своему строению: в них кроме гранул 15 нм, входит множество тонких фибрилл, которые могут образовывать в нуклеолонемах отдельные сгущения.

Неоднородной оказалась структура и диффузного, фибриллярного компонента. Было найдено, что практически во всех типах ядрышек как животных, так и растительных объектов встречаются т.н. фибриллярные центры (ФЦ), участки скопления фибрилл с низкой электронной плотностью, окруженные зоной фибрилл более высокой электронной плотности - плотный фибриллярный компонент (ПФК).

Кроме гранул и фибриллярных участков в структуре ядрышка обнаруживаются хроматиновые компоненты: такие как околоядрышковый хроматин, который может примыкать к ядрышку и даже окружать его. Часто 30 нм фибриллы хроматина по периферии ядрышка заходят в лакуны, между нуклеолонемными участками.

Наконец, в составе ядрышка выявляется белковый остов, матрикс. На ультратонких срезах необработанных ядрышек матрикс не выявляется в виде отдельного компонента, но если экстрагировать из ядрышек РНК, ДНК и белки, связанные с ними, то можно видеть, что ядрышко как таковое, не распадается, не теряет своей общей формы. После таких обработок структура ядрышка представлена рыхлой фибриллярной сетью, заполняющей объем ядрышка.

Таким образом, в структуре ядрышек можно различить следующие пять компонентов: гранулярный, фибриллярные центры, плотный фибриллярный компонент, хроматин, белковый сетчатый матрикс.

Каким же образом распределены внутри ядрышек рДНК, рРНК и белки, где располагаются матрицы для синтеза рРНК, где первичные транскрипты, где предшественники рибосом, зрелые рибосомы - все эти вопросы были решены с применением самых разнообразных молекулярно-биологических и цитологических методов. Один из этих методов, - метод регрессивного окрашивания нуклеиновых кислот, основан на том, что ионы уранила, связанные с ДНК, более легко вымываются со срезов при обработке их хелатоном ЭДТА, чем ионы, связанные с РНК. Это позволяет различить в ядре плотные окрашенные структуры, содержащие РНК и структуры потерявшие окраску, те что содержат ДНК. Так в разнообразных ядрах участки хроматина как конденсированного, так и диффузного теряют окраску, а компоненты, содержащие РНК - сохраняют. В ядре при этом контрастно выделяются разнообразные РНП, содержащиеся в основном объеме ядра и ядрышка. При этом в ядрышках интенсивно окрашены многочисленные гранулы, они окрашены так же, как рибосомы цитоплазмы. Окрашенным является плотный фибриллярный компонент, фибриллярные центры окрашены слабее, а внутриядрышковый и околоядрышковый хроматин выглядят светлыми. Следовательно можно предположить, что как гранулярный компонент, который скорее всего представляет субъединицы рибосом, так и плотный фибриллярный компонент содержат РНК.

Так при короткой пульсовой метке тритированным уридином (3H-уридин), первые следы мечения обнаруживались сначала (через 1-15 мин) в плотном фибриллярном компоненте (ПФК), а затем (до 30 мин) меченым оказывался гранулярный компонент (ГК). Важно отметить, что в фибриллярных центрах (ФЦ) метка не обнаруживалась. Из этого наблюдения был сделан вывод, что 45S пре-рРНК синтезируется в области плотного фибриллярного компонента, а гранулярный компонент ядрышка соответствует прерибосомным частицам (55S-, 40S РНП).

Оставался открытым вопрос о природе фибриллярных центров, окруженных плотными РНК-содержащими фибриллами. Было обнаружено с помощью различных методов (специфическое окрашивание с помощью осмий-амина, ДНКазы, меченной золотом, связыванием меченого актиномицина, прямой молекулярной гибридизацией с меченой рДНК), что в составе фибриллярных центров находится ДНК, ответственная за синтез рРНК. Зоны фибриллярных центров отличаются от остального хроматина тем, что состоят из тонких хроматиновых фибрилл, значительно обедненных гистоном HI (что показано с помощью меченных коллоидным золотом антител).

Эти исследования позволили связать друг с другом данные молекулярной организации транскрибируемых рибосомных генов с данными морфологии ядрышек и выяснить топологию в объеме ядрышка процесса синтеза рибосомной РНК и образования рибосом.

По модели, предложенной Жоссеном (1984), в фибриллярных центрах расположены неактивные рибосомные гены и, возможно, спейсерные участки. Транскрипция пре-рРНК происходит по периферии фибриллярных центров, где плотный фибриллярный компонент и представляет собой 45S пре-рРНК, располагающиеся в виде “елочек” на деконденсированных участках рДНК (рис. 89). После завершения транскрипции 45S РНК теряет связь с транскрипционной единицей на ДНК в зоне плотного фибриллярного компонента, каким-то еще непонятным образом переходит в гранулярную зону, где и происходит процессинг рРНК, образование и созревание рибосомных субъединиц.

Фибриллярный центр и ядрышковый организатор 

Строение и химические характеристики ФЦ оказались практически одинаковыми с таковыми ядрышковых организаторов митотических хромосом. И те и другие построены из тесно ассоциированных фибрилл, толщиной 6-10 нм; и те и другие обладают характерной особенностью - окрашиваться солями серебра, что зависит от наличия особых ядрышковых белков, содержат РНК-полимеразу I.

Однако число ФЦ в интерфазных ядрышках, не соответствует числу ядрышковых организаторов в митозе. Так в клетках культуры СПЭВ число ФЦ может быть в 2-4 раза выше, чем число ядрышковых организаторов (см. табл. 11).

Таблица 11. Количество ядрышек (ЯК), фибриллярных центров (ФЦ) в G0- и G2-периодах и во время митоза

Среднее число ЯК

Среднее число ФЦ

Общий объем ЯК, мкм3

Общий объем ФЦ, мкм3

Средний объем одного ФЦ, мкм3

G0-период

2,3

7

8,05

0,212

0,033

G2-период

2,3

33,7

23,43

0,430

0,014

Митоз

-

6-8

-

0,2

0,025

Более того, количество ФЦ возрастает по мере увеличения плоидности клетки (G2, 4n) и транскрипционной ее активности. При этом уменьшается величина каждого отдельного фибриллярного центра. Однако суммарные объемы ФЦ при пересчете на гаплоидный хромосомный набор остаются постоянными в интерфазе, но превышают это число вдвое по сравнению метафазой. Другими словами при активации синтеза рРНК наблюдается такое изменение числа ФЦ и их размеров, которое может говорить о какой-то фрагментации исходных ФЦ в относительно мало активных ядрышках.

Противоположная картина наблюдается при затухании синтетических процессов в дифференцирующихся клетках эритроидного ряда мышей (табл. 12). При этом видно, что в размножающихся и активно синтезирующих гемоглобин проэритробластах количество фибриллярных центров зависит от плоидности клетки (88 в G1-фазе, 118 в G2-фазе клеточного цикла), размер индивидуальных ФЦ изменяется мало. После прекращения размножения этих клеток и падении их синтетической активности резко меняются параметры ядрышка. Их объем, уже начиная со стадии базофильного эритробласта уменьшается в 4-5 раз, а на конечной стадии дифференцировки (нормобласт) - в сотню раз. При этом резко падает число ФЦ (10-40 раз) и возрастает объем почти в 10 раз величины отдельного фибриллярного центра.

Таблица 12. Количество фибриллярных центров (ФЦ) и значения их размеров при эритропоэзе в печени зародышей мыши

Стадия дифферен-цировки

Средний объем ядрышек, мкм3

Среднее кол-во ФЦ

Средний диаметр ФЦ, мкм3

Средний объем ФЦ, мкм3

Суммарный объем ФЦ, мкм3

Проэритробласт (2 с ДНК)

17,7

88

0,2

0,0042

0,369

Проэритробласт (4 с ДНК)

29,4

118

0,23

0,0064

0,749

Базофильный эритробласт

(2 с ДНК)

4,5

8

0,35

0,0248

0,170

Полихромато-фильный эритробласт

(2 с ДНК)

0,5

4,3

0,4

0,0259

0,110

Нормобласт

(2 с ДНК)

0,102

2,7

0,42

0,04

0,102

Исходя из этих наблюдений можно так представить общую схему активации и инактивации ядрышка (рис. 90) на примере одного ядрышкового организатора.

В неактивной форме ядрышковый организатор представлен в виде одного крупного фибриллярного центра, включающего в себя компактно уложенную часть цепи хромосомной ДНК, несущей тандемно расположенные рибосомные гены (транскрипционные единицы). В начале активации ядрышка происходит деконденсация р-генов на периферии такого фибриллярного центра, эти р-гены начинают транскрибироваться, на них образуются РНП-транскрипты, которые при созревании дают начало появлению гранул - предшественников рибосом по периферии активированного ядрышка. По мере усиления транскрипции единый фибриллярный центр как бы распадается на ряд более мелких фибриллярных центров, связанных друг с другом полностью декомпактизованными участками рДНК. Чем выше транскрипционная активность ядрышка, тем больше число мелких, связанных друг с другом фибриллярных центров, окруженных плотным фибриллярным компонентом (ПФК), содержащим 45S рРНК. При полной активации ядрышка все мелкие фибриллярные центры деконденсируются; в этом случае зоны плотного фибриллярного компонента содержат всю рДНК, находящуюся в активном состоянии. Такая структура наблюдается у амплифицированных ядрышек растущих ооцитов. В случае инактивации ядрышка происходит постепенная конденсация рДНК, снова образуются фибриллярные центры, они объединяются друг с другом, величина их растет параллельно уменьшению доли ПФК. При полной инактивации, как в случае нормобластов, ядрышко представлено одним крупным (4-5 мкм) сферическим ФЦ, без сопутствующего транскрипции ПФК: оно окружено зоной конденсированного хроматина. Такое инактивированное ядрышко сходно по своим структурным особенностям с ядрышковым организатором в составе митотических хромосом.

Структурные типы ядрышек 

Приведенные выше описания дают основу для понимания разнообразия строения ядрышек в клетках с соответствующим уровнем синтеза рРНК. Однако кроме различной степени выраженности гранулярного и фибриллярных компонентов существуют и иные варианты структурной организации ядрышек. Обычно различают несколько структурных типов ядрышек: ретикулярный или нуклеолонемный, компактный, кольцевидный, остаточный (покоящийся), сегрегированный (рис. 91).

Ретикулярный тип ядрышка наиболее характерен для большинства клеток, для него свойственно нуклеолонемное строение, обилие гранул и фибриллярного плотного материала. Во многих случаях фибриллярные центры выявляются плохо, вероятно из-за высокого уровня транскрипции. Этот тип ядрышек встречается в клетках животных и растений. Так, например, ретикулярный тип ядрышка, свойственный гигантским политенным хромосомам двукрылых насекомых, очень сходен с таковым на гигантских хромосомах антиподиальных клеток ячменя.

Компактный тип ядрышка отличается от предыдущего меньшей выраженностью нуклеолонемы, большей частотой встречаемости фибриллярных центров. Такие ядрышки характерны для активно размножающихся клеток (клетки растительных меристем, клетки культуры ткани и др.). Вероятно, что оба эти типа могут переходить друг в друга, во всяком случае, они чаще всего встречаются в клетках с высоким уровнем синтеза РНК и белка.

Кольцевидные ядрышки встречаются в клетках животных. В световом микроскопе они имеют форму кольца с оптически светлой центральной зоной - это фибриллярный центр, окруженный РНП-фибриллами и гранулами. Размер этих ядрышек составляет около 1 мкм. Типичные кольцевидные ядрышки характерны для лимфоцитов, эндотелиоцитов,т.е. для клеток с относительно низким уровнем транскрипции.

Остаточные ядрышки характерны для клеток полностью потерявших способность к синтезу рРНК (нормобласты, дифференцированные энтероциты, клетки шиповатого слоя кожного эпителия и др.). Часто они настолько малы и так окружены конденсированным хроматином, что с трудом обнаруживаются в световом микроскопе. В ряде случаев они могут снова активироваться и переходить в компактную или ретикулярную форму.

Сегрегированные ядрышки характерны для клеток, обработанных различными антибиотиками или химическими веществами, вызывающими прекращение синтеза рРНК (актиномицин Д, амфотерицин и др.), а также антибиотиками, влияющими на синтез ДНК и белков (митомицин, пуромицин, многие канцерогены и т.д.). Термин “сегрегация” используется в данном случае в связи с тем, что происходит как бы разделение, обособление разных компонентов ядрышек, сопровождающиеся прогрессивным уменьшением его объема. При этом обособляются друг от друга крупные фибриллярные центры и гранулярно-фибриллярный компонент.

Белки ядрышек

До 60% сухого веса выделенных ядрышек приходится на белки, число которых может составлять несколько сот разных видов. Помимо белков ассоциированного с ядрышками хроматина в состав ядрышек входят белки рибосом и специфические ядрышковые белки, связанные с транскрипцией рибосомных генов, с процессингом 45S рРНК, такие как РНК-полимераза I, факторы транскрипции, топоизомеразы, метилазы, нуклеазы, протеинкиназы, фосфатазы. Часть ядрышковых белков имеет сродство к серебру, - аргентофильные белки: РНК-полимераза I, фактор транскрипциии UBF, нуклеолин (С-23), нуклеофозмин (ньюматрин или В-23).

Аргентофилия характерна для белков, обогащенных сульфгидрильными, дисульфидными связями. Как уже указывалось, четкой аргентофилией обладают интерфазные ядрышки и зоны ядрышковых организаторов на митотических хромосомах.

Собственно ядрышковые белки расположены в специфических местах их активности. Так РНК-полимераза I и фактор транскрипции рРНК UBF располагаются в фибриллярных центрах (ФЦ) и/или в плотном фибриллярном компоненте (ПФК).

Ag-фильным  является также белок с мол. весом 195 кДа, представляющий собой большую субъединицу РНК-полимеразы I, участвующую в синтезе рРНК. Этот белок локализуется в зоне фибриллярных центров, по их периферии. На плоскостных препаратах ядрышек аргентофилией обладают участки над осевой частью «елочек», непосредственно над расположением гранул РНК-полимеразы I. Кроме того, с помощью иммуноморфологических методов РНК-полимераза I обнаруживается в зоне ядрышковых организаторов митотических хромосом. Это обстоятельство не противоречит данным о том, что во время митоза транскрипция полностью прекращается. Вероятно, что во время митоза гены, нагруженные неактивной РНК-полимеразой I, переносятся весте с нею в области ядрышковых организаторов из одной клеточной генерации в другую.

Специфический для ядрышек белок фибрилларин (В-36, м.в. 34 кДа) располагается в ПФК, где он осуществляет процессинг пре-рРНК в комплексе другими РНП, в состав которых входит U3 мяРНК, необходимая для начального этапа процессинга 45S рРНК. Фибрилларин обнаруживается также в остаточных ядрышках – в «ядрышковом матриксе».

Белок С23 (110 кДа) или «нуклеолин» локализуется в зоне плотного фибриллярного компонента и в фибриллярных центрах ядрышек, но также и в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Следовательно он обнаруживается как на транскрибируемых, так и на неактивных участках рибосомных генов. В препаратах распластанных ядрышек он обнаруживается над транскрипционными единицами («елочками»), он обнаружен во фракциях, содержащих предшественники рибосом. Функции его до конца не ясны, хотя стало известно, что белок С23 может играть важную структурную роль в процессе транскрипции: он своим N-концом, на котором находятся лизиновые группы, связывается с ядрышковым хроматином, а C-концом с транскрибируемым спейсером (tsi) на 45S рРНК.

Обнаружено, что этот белок связывается не с ДНК транскрипционной единицы, а с ДНК, имеющей нуклеосомное строение (вероятно со спейсерными участками).

Белок В-23 (нуклеофозин, м.в. 37 кДа) с помощью иммуноцитохимических методов локализован в области ПФК и, главным образом, в зоне гранулярного компонента. Считается, что В-23 участвует в промежуточных и терминальных стадиях биогенеза рибосом, и в транспорте пре-рибосом.

Общая схема работы ядрышка как специального локуса синтеза рибосом

При становлении синтеза рРНК  в ядрышках на поверхности ФЦ происходит активация транскрипционных единиц, - связывание с факторами транскрипции и РНК_полимеразой I, которая начинает считывать первичный транскрипт рРНК. По мере прохождения первой РНК-полимеразы I, на освобождающемся участке транскрипционной единицы садится следующая РНК-полимераза и начинается синтез новой рРНК. Одновременно и последовательно на одном р-гене могут находиться до сотни РНК-полимераз I, от которых отходят транскрипты разной степени завершенности. Конечным продуктом является пре-рРНК или 45S рРНК. По мере синтеза растущие цепи рРНК одеваются рибосомными белками, поступающими в ядро из цитоплазмы, так что сразу образуются цепи РНП-предшественников. Совокупность продуктов транскрипции нескольких транскрипционных единиц образует вокруг ФЦ зону ПФК. Конечным продуктом такого синтеза является рибонуклеопротеидный тяж, или глобула, имеющая константу седиментации около 80S, содержащая одну молекулу 45S рРНК. После отделения 45S рРНК в терминальной точке транскрипционной единицы происходит расщепление – процессинг 45S рРНК, в конце которого образуются 40S и 60S рибосомные субъединицы. Синтез малых субъединиц в ядрышке занимает примерно 30 мин, а больших – около 1 ч. В ядрышке незрелая 60S рибосомная субъединица, коме двух фрагментов рРНК (28S и 5,8S) связывается с третьим (5S), который синтезировался независимо от хромосом с ядрышковыми организаторами на других хромосомах. Такие новообразованные рибосомные субъединицы особым образом выходят из ядра в цитоплазму через ядерные поры. В цитоплазме такие незрелые рибосомы могут связаться с дополнительными белками. 40S субъединица сначала связывается с иРНК, и только затем с большой 60S субъединицей, образуя полную 80S функционирующую рибосому (рис. 92).

Новые, неканонические функции ядрышек

Последние данные показывают, что кроме синтеза рРНК, ядрышко участвует во многих других аспектах экспрессии генов.

Первые намеки (1965) на признаки полифункциональности ядрышек были получены при изучении гетерокарионов. Так при слиянии человеческих клеток HeLa с эритроцитами кур были получены гетерокарионы с первоначально совершенно разными ядрами. Ядра клеток HeLa были функционально активны, в них шел синтез разнообразных РНК. Исходные ядра эритроцитов кур содержали сверхконденсированный хроматин, не содержали ядрышек и не транскрибировались. В гетерокарионе после слияния с HeLa клетками в ядрах эритроцитов кур хроматин начинал деконденсироваться, активировалась транскрипция, появлялись ядрышки. Иммуноцитохимическими методами изучалось появление в гетерокарионах белков, характерных для куриных клеток. Несмотря на то, что в клетках HeLa была готовая система функционирования рибосом и были сформированы ядрышки, появление куриных белков было отложено до тех пор пока не возникнут ядрышки в ядрах эритроцитов. Это означало, что ядрышко куриного эритроцита как-то должно вовлекаться в образование куриных иРНК, т.е. ядрышко должно играть какую-то роль в продукции куриных иРНК.

Позднее были накоплены данные в поддержку этой возможности. Было обнаружено, что созревание (сплайсирование, см. ниже) c-myc иРНК в клетках млекопитающих происходит в ядрышках. В ядрышках обнаружены сплайсосомные малые РНК (sn РНК), факторы сплайсинга пре-иРНК.

Далее в ядрышках обнаруживаются РНК, входящие в SRP-частицы, участвующие в синтезе белков в эндоплазматическом ретикулуме. С ядрышком оказалась ассоциирована РНК теломеразы – рибонуклеопротеида (обратная транскриптаза). Много есть данных о локализации в ядрышках прцессинга малых ядерных РНК, входящих в состав сплайсосом, и даже о процессинге тРНК.

Ядрышко во время митоза: периферический хромосомный материал

В световом микроскопе ядрышко выявляется во время интерфазы, в митотических клетках оно исчезает. При использовании цейтраферной микрокиносъемки можно наблюдать в живых клетках как по мере конденсации хромосом в интерфазе происходит исчезновение ядрышка. Сначала оно слегка уплотняется, но затем ко времени разрыва ядерной оболочки начинает быстро терять плотность, становится рыхлым и на глазах быстро исчезает, как бы тает. При этом видно, что часть ядрышкового материала растекается между хромосомами. В метафазе и анафазе ядрышки как таковые отсутствуют. Первые признаки новых ядрышек появляются после средней телофазы, когда уже достаточно разрыхлились хромосомы дочерних ядер, имеющие новую ядерную оболочку. В это время вблизи деконденсирующихся хромосом появляются плотные тельца – предъядрышки. Обычно их число выше, чем число ядрышка в интерфазе. Позднее уже в G1-периоде клеточного цикла предъядрышки растут, начинают объединяться друг с другом, их общее число падает, но суммарный объем возрастает. Общий объем ядрышка удваивается в S-G2-фазах. В некоторых случаях в профазе (культуры клеток человека) при конденсации хромосом крупные ядрышки распадаются на более мелкие, которые в митозе исчезают.

На самом деле никакого полного исчезновения, или «растворения» ядрышка нет: происходит изменение его структуры, редукция одной части его компонентов при сохранении другой. Так было показано, что аргентофильные гранулы в интерфазных ядрышках, обнаруживаемые в световом микроскопе начинают в профазе сливаться друг с другом, одновременно уменьшаясь в объеме, минимальный размер они занимают в метафазе, локализуясь в зонах ядрышковых организаторов хромосом. В таком виде они существуют до средней телофазы, когда выявляются в виде отдельных множественных «предъядрышек», разбросанных среди деконденсированных хромосом. Уже в конце телофазы такие аргентофильные предъядрышки начинают расти. Таким образом можно видеть, что во время митоза исчезновению подвергается только часть ядрышкового компонента, в то время как аргентофильный компонент сохраняется, постоянно существует во время митоза и переносится на хромосомах в дочерние ядра.

Радиоавтографическими исследованиями было показано, что исчезновение ядрышек совпадает с прекращением синтеза клеточной (в основном рибосомной) РНК, который возобновляется в поздней телофазе, совпадая по времени с появлением новых ядрышек.

Кроме того было обнаружено, что активность РНК-полимеразы I также исчезает на средних стадиях митоза. Это давало основание считать, что новообразование ядрышек связано с восстановление синтеза рРНК в дочерних клетках.

Но с другой стороны существуют факты, указывающие на перманентное, постоянное присутствие ядрышковых компонентов течение всего клеточного цикла. Это относится к Ag-фильному материалу ядрышек в первую очередь.

Цитологи начала ХХ века часто наблюдали во время митоза появление какого-то нехроматинового материала, окружающего каждую хромосому. Этот материал или «матрикс» митотических хромосом, как считали, мог иметь ядрышковое происхождение и его роль могла заключаться в том, что он может служить источником новых ядрышек в дочерних ядрах после митоза.

Электронная микроскопия показала, что «матрикс» – нехроматиновый компонент митотических хромосом, состоящий из скопления рыхло расположенных фибрилл и гранул, имеющих рибонуклеопротеидную природу, морфологически сходных с компонентами, входящими в состав интерфазных ядрышек, выявляется в условиях конденсации митотических хромосом как растительного, так и животного происхождения. При этом некоторые компоненты ядрышек диссоциируют и уходят в цитоплазму (большая часть РНП-частиц), в то время как другие тесно связываются с поверхностью хромосом, образуя основу «матрикса» или, как этот компонент теперь называют, основу периферического хромосомного материала (ПХМ) (рис. 93). Этот фибриллярно-гранулярный материал, синтезированный до митоза, переносится хромосомами в дочерние клетки. В ранней телофазе еще в отсутствие синтеза РНК по мере деконденсации хромосом происходит структурное перераспределение компонентов ПХМ. Его фибриллярные компоненты начинают собираться в мелкие ассоциаты – предъядрышки, которые могут сливаться друг с другом, собираться в зоне ядрышкового организатора хромосом в поздней телофазе, где возобновляется транскрипция рРНК.

Новый этап в изучении периферического материала митотических хромосом связан с использованием иммуноцитохимических методов выявления ядрышковых белков. Было показано, что митотические хромосомы действительно участвуют в переносе в дочерние клетки белков ядрышек, белков ядерного остова, так и различных РНП. Так было установлено, что ядрышковые белки, участвующие в транскрипции рРНК (РНК-полимераза I, топоизомераза I, фактор инициации транскрипции UBFи др.), аккумулируются в зоне ядрышкового организатора, в то время как белки, связанные с процессингом пре=рРНК (фибрилларин, нуклеолин, В-23), а также некоторая часть пре-рРНК и малые ядрышковые РНП переносятся поверхностью хромосом в составе периферического хромосомного материала (рис. 94).

Кроме того в состав ПХМ могут входить некоторые негистоновые белки из состава ядерного интерфазного остова (рис.95).

Следовательно митотические хромосомы участвуют не только в их главной функции – перенос генетического материала в виде ДНК – но, кроме того, участвуют в переносе целого ряда белков и РНК (рис. 96).

Биологический смысл появления ПХМ на поверхности митотических хромосом может заключаться в том, что переносимые хромосомами белки не являются случайными «пассажирами», а представляют собой комплекс белков разного происхождения: ферменты и факторы ядрышковой транскрипции, процессинга рРНК, сборки рибосом, незрелые предшественники рибосом и, кроме того, белки ядерного и ядрышкового матрикса, также содержащие малые ядерные РНП и все компоненты, связанные с образованием нерибосомных РНК, с их сплайсингом и др. Другими словами, ПХМ переносит в новые ядра многие белковые компоненты и ферменты, что создает условия, необходимые для форсированного возобновления синтеза и созревания как рибосом, так и синтеза информационных РНК. Митотическая хромосома переносит в новое ядро не только генетическую информацию в виде ДНК хроматина, но и необходимые компоненты синтетического аппарата, готового к активации транскрипции в новом клеточном цикле. Хромосома при клеточном делении»все свое несет с собой» – как гласит латинская поговорка.

Глава 9. Нерибосомные продукты клеточного ядра

Транскрипция нерибосмных генов

Информационные РНК образуются при участии РНК-полимеразы II,

начинающей синтез со стартовой точки транскрипционной единицы, и кончая его в точке терминации. При этом образуется одна молекула РНК, транскрипт – предшественник информационной РНК. Размер транскрипционных единиц разных генов может значительно варьировать от 6 тыс. до 200 тыс. нуклеотидов. Поэтому суммарная фракция РНК, синтезированная на разных генах содержит молекулы различной длины. Эта первично синтезированная РНК или т.н. гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), встречается только в ядре и не обнаруживается в цитоплазме. В цитоплазму попадает уже информационная РНК, образующаяся в результате изменений в ядре первичных транскриптов РНК (гяРНК).

Величина гяРНК в несколько раз больше той, которая требуется для синтеза белков: для синтеза «среднего белка», состоящего из 400 аминокислот, необходима матричная РНК в 1200 нуклеотидов. На самом деле величины информационных РНК в составе синтезирующих белок полисом в несколько раз короче первичных транскриптов. Это укорочение является результатом «созревания» гяРНК, процессинга, но иного характера, чем процессинг рибосомных РНК. Структура гена эукариотов оказалась состоящей из чередующихся последовательностей нуклеотидов, т.н. экзонов и интронов. Экзоны – участки ДНК, которые обладают кодирующей информацией и входят в состав информационных РНК, а интроны содержат последовательности, не входящие в информационную РНК. Первичный транскрипт РНК содержит полную копию гена, включает в себя все последовательности и экзоны и интроны. Интроны впоследствии вырезаются из первичного транскрипта, концы же фрагментов РНК сшиваются ковалентно, что приводит к общему укорачиванию образовавшейся молекулы информационной РНК. Этот процесс получил название сплайсинга. Так как большинство генов млекопитающих содержит большее число интронов, чем экзонов, процесс сплайсинга РНК приводит к тому, что очень длинные молекулы гяРНК (первичных транскриптов, содержащих более чем 50 000 нуклеотидов) укорачиваются до длины цитоплазматических иРНК (обычно от 500 до 3000 нуклеотидов длиной) (рис. 97).

По мере синтеза и роста гяРНК, она связывается с рядом ядерных белков, образуя гяРНП-частицы (гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиновые частицы). При этом высокомолекулярная гяРНК в ядрах наматывается на глобулярные белковые частицы, информоферы. На каждый информафер приходится отрезок РНК длиной около 500-600 нуклеотидов. Такой комплекс информофера и РНК образует мономер или 30S частицу. В состав каждого информофера входит более 30 белковых молекул информатина. Таким образом первичный транскрипт структурного гена, отвечающего за образование информационной РНК, представляет собой гигантскую молекулу гяРНК, связанную со множеством белковых частиц, информофер. Считается, что участки гяРНК, между информоферами, могут быть использованы для сплайсинга с помощью специальных белковых комплексов – сплайсосом. В состав сплайсосом входит 5-7 малых ядерных рибонуклеопротеидов (snRNP).Эти особые малые ядерные РНП (мяРНП) представляют собой РНП-частицы (U1, U2, U5, U4, U6 snRNP) с константой седиментации около 10S. В каждой частице содержится одна малая молекула РНК (90-400 нуклеотидов) и около семи молекул белка. Так что сплайсосома представляет собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс  величиной, сравнимой с рибосомой (константа седиментации около 60S).

При синтезе гяРНК и после него сплайсосомы связываются с цепью РНК в местах на границе между экзонами и интронами, специфически узнавая эти места, производят разрыв в основании петлиинтрона, сшивают свободные концы (рис. 98). Таким способом участки интронных последовательностей вычленяются из состава первичного транскрипта, а затем быстро деградируют в ядре. В результате этого процесса длина результирующей молекулы РНК может укорачиваться в несколько раз. Так, например, размер гена белка тироглобулина включает 300 тыс. нуклеотитов, размер же иРНК для этого белка составляет всего 8,7 тыс. нуклеотидов из-за того, что в составе гена включены 36 интронных последовательностей, т.е. происходит укорочение молекул РНК более чем в 30 раз. Размер гена каталазы равен 34 т.п.н., а размер иРНК – 1,6 т.п.н. Величина овальбуминового гена у птиц составляет 7,5 т.п.н., а соответствующая этому гену зрелая иРНК – всего 1,8 т.п.н. Обычно иРНК в 2,5-10 раз короче первичного транскрипта, гяРНК.

Считается, что после созревания иРНК, при переходе ее из ядра в цитоплазму теряет белки, входящие в состав информофера, «переодевается» в ядерной поре, а белки информофер остаются в ядре. В цитоплазме иРНК снова одеваются новыми белками,образуя «информосомы» – форму хранения иРНК в неактивном состоянии, или связываются с белками, необходимыми для трансляции.

Морфология РНП-компонентов в ядре

Вся информация, полученная о морфологии транскриптов рРНК и иРНК, об информоферах и сплайсосомах получена на изучении выделенных из ядер этих компонентов, подвергнутых специальной обработке для распластывания их на препаратах для электронной микроскопии.

Что же касается морфологии РНП-продуктов in situ, в объеме интактных ядер, то здесь информация неполная и противоречивая.

Кроме хорошо выраженного ядрышка, другие продукты ядерной активности при изучении клеток на ультратонких срезах не бросаются в глаза: их трудно отличить от различных фибрилл (ДНП, матрикс)и каких-то гранул, казалось бы без особого порядка разбросанных в ядре. Все же, используя метод избирательного контрастирования солями урана структур, содержащих РНК, удается выделить ряд компонентов, которые можно отнести к неядрышковым продуктам транскрипции. Это – перихроматиновые фибриллы, перихроматиновые гранулы и интерхроматиновые гранулы (рис. 99б, 100).

Перихроматиновые фибриллы обнаруживаются по периферии участков конденсированного хроматина (околомембранного или любого другого). Они имеют толщину около 3-5 нм, часто образуют рыхлую неправильную сеть. Оказалось, что этот компонент ядра сильно изменяется при стимуляции синтеза РНК. Так, при возрастании синтеза РНК в клетках печени крыс после голодания и последующего питания или после введения кортизона адреналэктомированным животным зоны перихроматиновых фибрилл значительно увеличиваются. Эти зоны оказались наиболее активными по включению меченых предшественников в РНК, что было показано радиоавтографически с помощью электронного микроскопа. Такие фибриллы могут представлять новосинтезированную гяРНК.

Другой тип РНК-содержащих структур интерфазного ядра - перихроматиновые гранулы. Они имеют диаметр около 45 нм и окружены светлым ореолом. Эти гранулы встречаются только на периферии конденсированного хроматина, в диффузном хроматине их нет. Считается, что между этими гранулами и перихроматированными фибриллами существует структурная связь. При больших увеличениях внутри гранул можно видеть тонкие извитые фибриллы 3-5 нм толщиной.

Крупные гранулы типа перихроматиновых встречаются в специфических активных в отношении синтеза РНК участках политенных хромосом, в пуффах (см. ниже). Сходные гранулы обнаружены в боковых петлях функционирующих мейотических хромосом. Исходя из этого, некоторые исследователи делают предположение, что такие рибонуклеопротеидные гранулы могут представлять собой зрелые комплексы из нескольких информофер, рибонуклеопротеидные частицы, содержащие информационную РНК. Однако это предположение нуждается в проверке.

Интерхроматиновые гранулы - третий тип РНК-содержащих структур. Они имеют размер 20-25 нм и группируются всегда в форме скоплений между участками хроматина. Эти гранулы не стандартны по величине и переплетены тонкими фибриллами.

В последнее время были получены антитела к мяРНП. Оказалось, что среди них есть и различные сплайсосомы, гранулы размером 20-30 нм. Эти мяРНП располагались в зонах свободных от конденсированного хроматина и по своей локализации совпадали с зонами, где располагались скопления интерхроматиновых гранул. Они могут представлять собой скопление сплайсосом, участвующих в конечных стадиях созревания гяРНК.

В таком случае всю картину динамики синтеза гяРНК можно представить себе следующим образом. Деконденсирующиеся участки хроматина (эухроматин) по периферии конденсированных зон хроматина, связываясь с РНК-полимеразой II, транскрибируют гяРНК в виде начальных перихроматированных фибрилл, связывающихся с белками информофер, которые затем подвергаясь созреванию с участием сплайсосом (интерхроматиновые гранулы), дают начало зрелым формам иРНК - комплексам информофер, или перихроматиновым гранулам. Вероятно, не все зрелые иРНК могут переходить в крупные (45-60 нм) перихроматиновые гранулы, а последние, вероятно, характерны для РНК с высоким молекулярным весом.

Иную топографию в интерфазных ядрах имеют РНП-продукты растительных клеток. Так, в ядрах с хромонемной организацией интерфазного хроматина, РНП в виде крупных гранул (20-30 нм) и тонких фибрилл (6-8 нм) располагается по периферии такого конденсированного хроматина и в межхроматиновых зонах; создается впечатление, что вся периферия хромонемных участков хроматина вовлечена в синтез РНК (рис. 100б).

Были сделаны попытки изучить морфологию транскрипции нерибосомных генов на тотальных плоскостных препаратах. Для этого из гомогенатов ядер осаждали фракцию диффузного хроматина, обогащенного включенными мечеными предшественниками РНК. Активный хроматин на таких препаратах имел вид типичных нуклеосомных фибрилл с редко сидящими одиночными гранулами РНК-полимеразы, от которых отходили транскрипты РНК разной длины и конфигурации (рис. 101). Обычно это были изогнутые фибриллы, иногда имеющие на свободном конце глобулярные образования. Чаще всего расстояние между одиночными гранулами РНК-полимеразы доходило до 0,1-0,3 мкм, так что представлялось, что с гена транскрибируется лишь одна копия, в отличие от множественных копий, получаемых с генов рРНК. Но однако, в редких случаях обнаруживались участки хроматина с тесно расположенными РНК-полимеразами, от которых отходили в сторону транскрипты разной длины, образуя “елочко”-подобные структуры.

Попытки наблюдать морфологию транскрипции на определенных генах были сделаны на целом ряде объектов, включая политенные хромосомы двукрылых насекомых и мейотические профазные хромосомы.

Синтез РНК в пуфах политенных хромосом

Более полные представления о морфологии синтеза и образования конечных продуктов транскрипции определенных генных участков интерфазных хромосом были получены при изучении политенных хромосом.

Светооптическое изучение строения политенных хромосом двукрылых обнаружило, что кроме дисков и междисковых участков встречаются локальные расширения хромосом, т.н. пуфы. В этих участках ДНК не располагается в виде дисков, они имеют аморфную структуру, часто содержат РНК, базофильны. В пуфах происходит основное включение 3Н-уридина, что однозначно показывает, что они являются активными участками этих своеобразных интерфазных хромосом.

Количество пуфов и их локализация не являются постоянной характеристикой той или иной политенной хромосомы. Более того, рисунок пуфирования (т.е. расположение пуфов на хромосомах) разный на одной и той же хромосоме в зависимости от стадии развития личинки, или от типа клеток, взятых для исследования.

Так как возникновение пуфов прямо связывается с активацией синтеза РНК, то было показано, что развитие определенного пуфа отражает собой активацию отдельного или группы генов, детерминирующих функционально-метаболические особенности клеток на данном этапе развития. Поэтому в различных дифференцированных клетках картина пуффинирования не должна совпадать, что и наблюдается на самом деле (рис. 102).

При затухании синтеза РНК пуф начинает спадаться, уменьшаться в размерах, терять базофилию и в конце концов на его месте можно видеть диск, из которого он развился. Особенно демонстративно это видно на особо крупных пуфах 4-ой хромосомы Chironomus, которые носят название колец Бальбиани (КБ). Так на личиночной стадии можно видеть на 4-ой хромосоме вблизи от ядрышка два постоянных базофильных пуфа, КБ1 и КБ2.

В электронном микроскопе было обнаружено, что зона этих крупных пуфов содержит большое количество гранул рибонуклеопротеидной природы, размером 50-60 нм. Эти гранулы, предположительно содержащие информационную РНК и соответствующие информосомам в составе кольца Бальбиани 2 (КБ2), располагаются особым образом. На ультратонких срезах можно наблюдать, что они располагаются рядами вдоль осевых элементов. Каждая гранула оказалась связанной с осевой структурой с помощью ножки-фибриллы толщиной 14-16 нм (рис. 103). Эта картина соответствует предположению, что 50-60 нм гранулы представляют собой РНП-продукты данного хромосомного локуса, находящиеся в процессе их синтеза. На плоскостных препаратах по Миллеру такие участки КБ2 были представлены многочисленными “елочко”-подобными структурами, состоящими из осевых компонентов и отходящих от них многочисленных гигантских траснкриптов, имеющих длину до 7,7 мкм. От участка транскрипции в данном случае отходит в среднем 123 гигантских транскрипта, связанных с комплексами РНК-полимеразы.

Расшифровка этих морфологических наблюдений стала возможной при анализе индивидуальных РНК, выделенных из КБ2. Для этого с помощью микроманипулятора выделяли ядра, затем отделяли от других 4-ую хромосому, и с помощью микродиссекции вырезали и накапливали зоны, содержащие КБ2. Затем из этих пуфов выделялась РНК, которая исследовалась с помощью гель-электрофореза. Выделенная РНК оказалась огромных размеров, она имела мол. вес 15-35 х 106 Д, и коэффициент седиментации 75S. Соответственно гены этой 75S РНК содержат 37 т.п.н., вероятно не имеют интронов, т.к. 75S РНК не подвергается процессингу и служит матрицей для синтеза гигантских молекул секреторных белков. Гены 75S РНК оказались построены наподобие сателлитных ДНК: в их составе наблюдается иерархия внутренних повторов.

После завершения синтеза 75S РНК, ее молекулы в виде крупных (50-60 нм) РНП-гранул транспортируются в цитоплазму. Однако значительная их часть разрушается: только 4-7% этой РНК обнаруживается в цитоплазме. Эти гигантские молекулы РНК образуют в цитоплазме особо крупные полисомы (700S), в состав которых входит 55-65 рибосом, на которых синтезируются длинные цепочки гликопротеидов клеток слюнной железы мотыля. (На самом деле эта железа не участвует в пищеварении, она не содержит ферментов; ее функция заключается в синтезе белка, необходимого личинке для построения домика и ловчих сетей).

Транскрипция на мейотических хромосомах

Мейотические хромосомы типа “ламповых щеток” (см. ниже) встречаются главным образом на стадии диплотены мейоза, как у самцов, так и у самок. По сравнению с митотическими хромосомами мейотические хромосомы типа ламповых щеток намного длиннее и хорошо видны в световом микроскопе по двум причинам: она представляют собой спаренные и удвоенные хроматиды, так что в их состав входит четыре продольных субъединицы. Но отличительной особенностью этих хромосом является наличие боковых петель, отходящих от множества хромомеров, попарно-симметрично располагающихся вдоль каждого гомолога (рис. 104). Именно в петлях хромосом типа ламповых щеток происходит синтез РНК во время длительной мейотической профазы.

Следовательно, хромосомы типа ламповых щеток занимают как бы промежуточное положение между инактивированными максимально конденсированными хромосомами и активными интерфазными хромосомами: конденсированные участки хромомеров соответствуют участкам митотических хромосом, а боковые петли - участкам активных интерфазных хромосомных районов. Считается, что число боковых петель соответствует числу хромомеров, за исключением того, что хромомеры, представляющие центромерные участки, петель не несут. Так у гребенчатого тритона, чьи хромосомы типа ламповых щеток особенно подробно изучены, насчитывается около 5000 хромомеров на гаплоидный набор и соответственно 20 000 боковых петель на диплотенную митотическую хромосому (напомним, что в профазе мейоза клетки содержат тетраплоидное количество хроматид).

Латеральные или боковые петли в составе хромосом типа ламповых щеток неоднородны по своей структуре. Преобладают ординарные или нормальные петли длиной около 10 мкм. Они асимметричны по своей толщине: в световом микроскопе видно, что один из концов петли тонкий, а другой толстый; развернутая петля имеет клиновидную форму. В составе ординарных петель в световом микроскопе видно, что каждая петля покрыта как бы чехлом или матриксом, имеющим неясную гранулярно-фибриллярную структуру.

ДНК входит в состав осевого элемента петель и представляет собой основную хромосомную ДНК. Это доказывалось тем, что как боковые петли, так и осевые компоненты диплотенных хромосом рвутся при обработке ДНКазой.

Боковые петли способны к синтезу РНК: включение 3H-уридина происходит практически во всех петлях по всей их длине. Новосинтезированная РНК в петлях быстро ассциирует с белками, заранее синтезированными в цитоплазме.

При изучении ординарных петель на ультратонких срезах было найдено в их составе большое количество гранул 25-40 нм величиной, сходных с интер- и перихроматиновыми гранулами интерфазного ядра и с гранулами в пуфах политенных хромосом.

Более подробно структура боковых петель была изучена в электронном микроскопе на препаратах распластанных диплотенных хромосом.

Оказалось, что общая морфология транскрипции на боковых петлях хромосом типа ламповых щеток удивительно напоминает таковую на рибосомных цистронах (рис. 104). Большинство ординарных боковых петель представляет собой одну транскрипционную единицу, начало транскрипции которой расположено на одном конце петли, а терминальный участок - на другом. Таким образом такая транскрипционная единица тоже имеет форму “елочки”, только изогнутой в виде петли. Здесь также наблюдается линейный градиент транскриптов: короткие в начале, и максимально длинные (до нескольких десятков нм) на концах транскрипционных единиц.

Транскрипты здесь представлены в виде рибонуклеопротеидов. В результате воздействия низких ионных сил они из глобул величиной 25-40 нм превращаются в вытянутые, изогнутые фибриллы, часто на конце имеющие утолщение. Морфология транскриптов на разных петлях неодинаковая. Встречаются расправленные, линейные фибриллы, а также кустистые фибриллы, многократно сложенные сами на себя, вероятно, в результате образования дуплексных структур РНК.

В некоторых петлях может располагаться несколько транскрипционных единиц разной длины, могущих иметь как идентичную, так и оппозитную ориентацию транскрипции (рис. 105). Интенсивность транскрипции также неодинакова на различных петлях: встречаются петли с 30 транскриптами на 1 мкм и с 3-5.

При падении транскрипционной активности в естественных условиях или при экспериментальном подавлении синтеза РНК длина петель уменьшается, они приобретают нуклеосомное строение.

Морфология транскрипции индивидуальных генов

Недавно был предложен более прогрессивный подход для исследования морфологии транскрипции индивидуальных структурных (кодирующих полипептидные цепи) генов. Для этого были использованы ооциты X. laevis, в ядрах которых с помощью микроинъекций можно вводить любые молекулы, в том числе и ДНК. Если же для такого введения взять клонированные гены, то получая препараты по Миллеру, можно обнаружить отдельные от ядрышек и хромосом молекулы ДНК, которые в условиях высокой транскрипционной активности в ядрах ооцитов, в свою очередь вовлекаются в процесс транскрипции. Это и дает возможность наблюдать за транскрипционной активностью индивидуального гена.

Так в ядра ооцитов были инъецированы небольшие циклические молекулы клонированных генов овальбумина кур. Инъекция большого количества этих генов (2-5 нг на ядро) приводили к тому, что в ядре образовывались кластеры из нескольких сот циклических молекул, хорошо отличающихся от элементов собственного хроматина ооцитов. Оказалось, что 80-90% инъецированного материала неактивны. В этом случае индивидуальные циклические молекулы генов были сплошь покрыты нуклеосомами и не содержали транскрипционных комплексов (РНК-полимераза вместе с цепочкой синтезированной РНК).

Небольшая часть инъецированных генов, однако, обладала типичными транскрипционными комплексами. Среди таких активированных генов встречается, по крайней мере, три морфологических класса. В первом случае это были циркулярные молекулы со слабой транскрипцией (3-10 транскриптов на 1 мкм длины хроматина), транскрипты были разной длины и не обладали линейным градиентом. В другом случае наблюдали интенсивно транскрибируемые циклические участки хроматина, покрытые транскрипционными комплексами по всей длине молекулы ДНК (30-50 транскриптов на 1 мкм хроматина). Здесь транскрипты достигали длины до 1,2 мкм. РНК на интенсивно транскрибируемых участках всегда была расположена по градиенту длины, образуя участки, напоминающие “елочки” на транскрипционных единицах ядрышковых ДНК. Первичный транскрипт с клонированного гена овальбумина кур содержит участки кодирующих последовательностей (экзоны) и интроны. На подобных препаратах в тесной ассоциации с нитчатыми транскриптами бывают видны также глобулярные сплайсосомы.

Таким образом, удается наблюдать за работой любых индивидуальных генов.

Синтез транспортных РНК

Гены транспортных РНК относятся к умеренно повторяющимся (10-100) последовательностям в геноме. Они также как р-гены, располагаются тандемно. Длина разных (31 шт.) тРНК колеблется от 74 до 95 нуклеотидов (примерно 30 нм), уложенных в сложную трехмерную фигуру. Отдельный ген тРНК состоит из двух крайних экзонов и одного центрального интрона. Во время процессинга интрон удаляется, а два экзона с помощью фермента лигазы соединяются в зрелую молекулу.

Глава 10. Ядерная оболочка

Структура, ограничивающая параметр клеточного ядра, ядерная оболочка, характерна для эукариотических клеток. Она разделяет два внутриклеточных компартмента друг от друга, цитоплазму от ядра. Значение такого разделения структур в пространстве очень важно: это приводит к обособлению процессов синтеза белка и процессов синтеза нуклеиновых кислот, что создает дополнительные, по сравнению с прокариотами, возможности для регуляции генной активности и ее реализации в виде синтеза специфических белков. Активная регуляция транспорта из цитоплазмы в ядро и из ядра в цитоплазму, через специальные комплексы пор создает систему избирательного транспорта веществ, делая ядерную оболочку “генными воротами” со специальными “превратниками” (контрольными пунктами), регулирующими потоки ядерного импорта и экспорта. Кроме того, как уже описывалось, ядерная оболочка играет большую роль в организации трехмерной структуры интерфазного ядра, элементы ядерной оболочки являются частью ядерного белкового матрикса.

Ядерная оболочка состоит из двух мембран, внешней и внутренней, между которыми располагается перинуклеарное пространство (рис. 106). Внутренняя мембрана ядерной оболочки структурно связана с ламиной - фиброзным периферическим слоем ядерного белкового матрикса. В общем виде ядерная оболочка может быть представлена как двухслойный мешок, отделяющий содержимое ядра от цитоплазмы. Однако ядерная оболочка имеет характерную особенность, отличающую ее от других двухмембранных структур клетки (митохондрии и пластиды). Это наличие особых ядерных пор, которые образуются за счет многочисленных зон слияния двух ядерных мембран и представляют собой как бы округлые, сквозные перфорации всей ядерной оболочки.

Компоненты ядерной оболочки

Внешняя мембрана ядерной оболочки, непосредственно контактирующая с цитоплазмой клетки, имеет ряд структурных особенностей, позволяющих отнести ее к собственно мембранной системе эндоплазматического ретикулума (ЭПР). Так, на внешней ядерной мембране обычно располагается большое количество рибосом, как и на мембранах эргастоплазмы. Существуют многочисленные наблюдения о непосредственном переходе внешней ядерной мембраны в систему каналов эндоплазматического ретикулума, что особенно подчеркивает структурную идентичность этих мембран (рис. 106).

Так у клеток, бедных эндоплазматическим ретикулумом, внешняя ядерная мембрана может представлять собой “минимальный” объем эндоплазматического ретикулума, который может участвовать в синтезе белкового и липидного компонентов мембран. Описаны случаи, когда от внешней ядерной мембраны отщепляются мембранные вакуоли, направляющиеся в проксимальный отдел аппарата Гольджи. Состав липидов и белков внешней ядерной мембраны очень схож с таковым ретикулума, что, возможно, и определяет их общие биохимические функции, что особенно подчеркивается наличием рибосом на поверхности мембран, обращенной в гиалоплазму. Эти рибосомы синтезируют, как мембранные, так и секретируемые белки, которые могут транспортироваться в перинуклеарное пространство, а оттуда в полости цистерн ЭПР. Так, например, при стимуляции образования -глобулинов в плазмоцитах первые продукты клеточной активности локализуются в перинуклеарном пространстве, а потом начинают появляться в полостях ЭПР. У большинства животных и растительных клеток внешняя мембрана ядерной оболочки не представляет собой идеально ровную поверхность - она может образовывать различной величины выпячивания или выросты в сторону цитоплазмы.

Внутренняя мембрана ядерной оболочки рибосом на своей поверхности не имеет, но связана с фиброзным слоем, ядерной ламиной (Lamina nucleum limitans), которая, в свою очередь, заякоревает хроматин на ядерной оболочке. Связь хроматина с внутренней мембраной оболочки является ее характерной особенностью, хотя существуют примеры, когда эти связи нарушаются при сохранении целостности ядерной оболочки. Так, например, в ооцитах амфибий на стадии диплотены все хромосомы собираются в центре ядра и полностью теряют связь с ядерной оболочкой. С другой стороны, при делении клеток с т.н. закрытым типом митоза большая часть внутренней ядерной мембраны теряет связь с хроматином.

О специфичности белков ламины уже говорилось в разделе “Ядерный белковый матрикс”, здесь же необходимо еще раз подчеркнуть, что эти фибриллярные белки не образуют неизменную структуру. Фиброзный слой ламины все время перестраивается, особенно в связи с ростом поверхности ядра, во время клеточного цикла. Характерные для внутренней ядерной мембраны белки ламины A, C и B относятся к фибриллярным белкам V типа промежуточных филаментов (см. ниже), их фибриллярные мономеры могут образовывать димеры, тетрамеры, а последние образуют фибриллы толщиной около 10 нм. Со стороны кариоплазмы под внутренней ядерной мембраной такие фибриллы образуют ортогональные структуры, чередующиеся с рыхло расположенной сетью этих же фибрилл.

Белки ламины с мембраной связаны двояким образом. Так ламин B после синтеза модифицируется добавлением гидрофобной изопентильной группы вблизи C-конца. Эта липофильная группа встраивается в слой мембраны и как бы заякоревает ламину на мембране. Кроме того целый ряд интегральных белков внутренней ядерной мембраны (LBR, LAR, эмерин и др.) также закрепляют ламины посредством дополнительных белков, входящих в состав этого фиброзного слоя. Эти же белки участвуют в связывании ядерной мембраны с хроматином.

Наиболее характерной и бросающейся в глаза структурой в составе ядерной оболочки является ядерная пора. Поры в оболочке образуются за счет двух ядерных мембран в виде округлых сквозных отверстий или перфораций с диаметром около 100 нм. При альдегидной фиксации или при использовании метода замораживания и скалывания в электронном микроскопе видно, что округлое сквозное отверстие в ядерной оболочке заполнено сложно организованными глобулярными и фибриллярными структурами (рис. 107). Совокупность мембранных перфораций и этих структур называют комплексом пор ядра. Тем самым подчеркивается, что ядерная пора не просто сквозная дыра в ядерной оболочке, через которую непосредственно вещества ядра и цитоплазмы могут сообщаться. Компоненты комплекса пор имеют белковую природу.

Ядерный поровый комплекс (ЯПК или NPC - nuclear pore complex) представляет собой супрамолекулярную структуру с м.в. более 125 х 106 Да, состоящую из более 1000 белков, масса которых в 30 раз больше чем рибосома. Белки ЯПК носят название нуклеопоринов 50-100 видов. Эти белки собраны примерно в 12 субкомплексов.

В последнее время удалось получить отчетливые изображения ЯПК в электронном микроскопе, что дает возможность понять их структурную организацию. Внешний диаметр порового комплекса составляет около 100 нм, а высота - 75 нм. В целом он представляет собой цилиндрическую фигуру с признаками октогональной симметрии. Несмотря на очень впечатляющие изображения выделенных ЯПК, разные авторы дают разные схемы строения этого сложного комплекса, обладающего симметрией восьмого порядка.

Если посмотреть на ЯПК в плане на ультратонком срезе, то бросается в глаза, что его периферия представлена восьмью глобулами (рис. 108, 109). На выделенных же ЯПК в первую очередь видны кольчатые структуры. От периферических компонентов ЯПК в сторону цитоплазмы простираются фибриллярные выросты. Со стороны ядра тоже фибриллярные выросты образуют корзинкоподобную структуру, связанную терминальным кольцом. В большинстве моделей центр цилиндрической фигуры ЯПК содержит “пробку” (центральную гранулу, или транспортер). По одной из моделей (см. рис. 93) цитоплазматические филаменты отходят от цитоплазматического кольца, состоящего из 8 субъединиц. Между ним и внешней ядерной мембраной располагается тонкое кольцо, а затем звездчатое кольцо. Цитоплазматическое кольцо связано внутренними филаментами с транспортером, который находится в центре и заполняет пространство между внешней и внутренней ядерной мембраной. Сходная структура находится на внутренней мембране: нуклеоплазматическое кольцо поддерживает филаменты “корзины”. Другие варианты моделей показаны на (рис. 110).

Весь ЯПК закрепляется интегральными белками, гликопротеидами gp 210 и РОМ 121 в стенке мембранной перфорации.

По своей сложности организации и, главное, по функциональной значимости комплекс ядерной поры можно было бы отнести к органеллам клетки, т.к. их роль заключается в контроле за ядерно-цитоплазменными связями.

Размер ядерных пор и их структура стандартны не только для данной клетки, но и для всех клеток данного организма, более того для всех эукариот.

Число ядерных пор (см. табл. 13) зависит от метаболической активности клеток: чем выше синтетические процессы в клетках, тем больше пор на единицу поверхности клеточного ядра. Так, у эритробластов (клетки-предшественники ядерных эритроцитов) низших позвоночных животных во время интенсивного синтеза и накопления гемоглобина обнаруживается в ядре около 30 ядерных пор на 1 мкм2. После того как эти процессы заканчиваются, в ядрах зрелых клеток - эритроцитов прекращаются синтезы ДНК и РНК, и количество пор падает до 5 на мкм2. В ядерных оболочках полностью зрелых сперматозоидов поры не обнаруживаются, так же как у микронуклеусов некоторых инфузорий. Количество пор может изменяться в течение клеточного цикла. Первое возрастание числа пор наблюдается при реконструкции и росте ядер после митоза, второй этап увеличения числа пор происходит во время синтеза ДНК.

Таблица 13. Количество ядерных пор в различных объектах

Объект

Число ядерных пор на мкм2.

Число пор на одно ядро

Ксенопус, почки

10,05

3400

Ксенопус, ооцит

51,0

37,6 х 106

Мышь, культура ткани

10,83

5050

Человек, культура ткани

11,24

3930

Крыса, гепатоцит

16,1

3800

Мышь, лимфоцит

3,3

400

Человек, лимфоцит

4,47

700

По поверхности ядра поры располагаются более или менее равномерно, но их число резко падает в местах ассоциации с ядерной оболочкой участков гетерохроматина, ядрышкового организатора, теломерных участков.

Поровые комплексы могут встречаться и в других мембранных компонентах клетки, но гораздо реже, чем в ядерной оболочке. Иногда поровые комплексы видны в составе мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума. Они обнаруживаются в составе окончатых мембран цитоплазмы, которые представляют собой тесно расположенные пачки замкнутых плоских мембранных мешков, сплошь пронизанных поровыми комплексами, имеющими такую же структуру, как и поры в ядерной оболочке.

Интересные данные были получены при морфометрическом изучении поровых комплексов в ядрах и окончатых мембранах бластодермы эмбрионов дрозофилы. Оказалось, что при переходе от синцитиальной к целлюлярной стадии, количество пор в оболочках ядер остается неизменным, а количество пор в окончатых пластинках вырастает примерно в 10 раз. В дальнейшем окончатые мембраны полностью исчезают. На основании этого было сделано предположение, что на ранней стадии развития в бластодерме дрозофилы происходит “суперпродукция” поровых комплексов (или их компонентов), избыток которых “встраивается” в окончатые мембраны. Т.е. макромолекулярный ансамбль, составляющий комплекс ядерных пор, способен к автономной самосборке и к последующему встраиванию в различные мембранные системы.

Роль ядерной оболочки в ядерно-цитоплазматическом обмене 

Со времени открытия ядерной оболочки и описания ее строения делалось заключение о том, что ядерная оболочка может служить регулятором в ядерно-цитоплазматическом обмене и главная роль в этих процессах отводилась ядерным порам. Обмен же продуктами между ядром и цитоплазмой в самом деле очень велик: все ядерные белки поступают в ядро из цитоплазмы и все формы РНК выводятся из ядер. И в этом процессе комплекс поры выступает как супрамолекулярный комплекс, выполняющий роль не только транслокатора, механизма переноса, но и роль сортировщика, узнающего и отбирающего специальным образом переносимые молекулы.

В процессе ядерно-цитоплазматического транспорта ядерные поры функционируют как некоторое молекулярное сито, пропуская частицы определенного размера пассивно, по градиенту концентрации. Так, ионы, сахара, нуклеотиды, АТФ, гормоны - свободно поступают в ядра. С другой стороны ядерные поры осуществляют избирательный транспорт.

Через ядерную оболочку беспрепятственно в обе стороны происходит пассивный транспорт высоко молекулярных соединений, имеющих массу не более 5 х 103 дальтон. Для определения размеров частиц, могущих пройти сквозь пору, используются гранулы декстрана или коллоидного золота, которые путем микроинъекции вводятся в цитоплазму живой клетки. Было обнаружено, что максимальный размер частиц, способных транспортироваться в ядро составляет 8,5-10 нм. При этом сначала частицы собираются в зоне поровых комплексов, а затем оказываются в ядре. Неядерные белки с массой большей, чем 20 000-40 000 дальтон проникают в ядро медленнее, если вообще проникают. Так инъецированные белки с массой 17 кД могут проникнуть в ядро довольно быстро, за 2-3 минуты, белки 40 кД - за 30 минут, белки 60 кД - вообще не проникают в ядра. Считается, что белки с гидродинамическим радиусом больше 3,5 нм (что соответствует глобулярному белку с массой 65 кД), не могут просто механически проходить через ядерную пору. В этих случаях ядерная пора выступает в качестве реального молекулярного сита.

Но дело осложняется тем, что многие белки поступают как в ядро, так и выходят из него против градиента концентраций. Так, например, концентрация гистонов в ядре значительно выше, чем в цитоплазме. Но, несмотря на это, во время синтеза ДНК происходит транспорт огромного количества (106 молекул каждые три минуты, или по 100-500 молекул через одну пору за 1 минуту) гистонов из цитоплазмы в ядро. С другой стороны через ядерные поры реально могут проходить некоторые белки и даже макромолекулярные комплексы с массой значительно большей, чем 60 кД.

Через ядерные поры из цитоплазмы в ядро транспортируются крупные молекулы белков, например, белок нуклеоплазмин, пентамер с молекулярной массой 125 кД. Из ядра через поры выходят в цитоплазму субъединицы рибосом и другие рибонуклеопротеиды, меньшие из которых могут иметь массу 250 кД. Эти данные показывают, что комплексы ядерных пор не представляют собой просто механические сита, которые ограничивают транспорт молекул в зависимости от их размеров.

Работы последнего времени показывают, что многие ядерные белки проходят через ядерные поры с помощью специальных механизмов, включающих узнавание и связывание крупных ядерных белков, а затем только их транслокацию, перенос через поры. Было найдено, что белки, транспортируемые в ядро, имеют определенные последовательности аминокислот - последовательности ядерной локализации (NLS), которые узнаются рецепторами ядерных пор. Такие NLS характерны для кариофильных белков, т.е. для белков ядерной локализации, которые синтезируются на рибосомах в цитоплазме, а затем транспортируются в ядро.

Импорт кариофильных белков

Впервые аминокислотные последовательности ядерной локализации были обнаружены на С-конце субъединиц молекулы нуклеоплазмина (ядерный белок, принимающий участие в структуризации хроматина). Эти эксперименты были проведены на бесклеточной системе, когда выделенные ядра помещались в цитоплазматический экстракт ооцитов ксенопуса, куда добавляли нативные или измененные молекулы нуклеоплазмина. Это крупный белок (125 кД), состоящий из пяти субъединиц, каждая из которых обладает глобулярной и фибриллярной, С-концевой, частями. Если удалит путем протеолиза примерно 50 аминокислот с С-конца, то ни пентамер, ни мономеры в ядро не попадают, в то время как отщепленные фибриллярные участки через поры проходят свободно, так как содержат NLS-участок.

Более того, при смешивании неядерных белков с этими NLS-фрагментами, такие комплексы способны транспортироваться в ядро. Даже крупные частицы декстрана (20 нм), неспособные проникать в ядро, при связывании с ними NLS-последовательностей нуклеоплазмина транспортировались из цитоплазматического экстракта в ядро.

Подробно строение NLS изучено у белка Т антигена вируса SV40. Кариофильный сигнал состоял из последовательности: Pro-Lys-128Lys-Lys-Arg-Lys-Val. Одна лишь аминокислотная замена (128Lys на Thr или Asp) полностью лишают этого фрагмента кариофильных свойств. Оказалось. что можно создавать химерные белки с этим аминокислотным доменом, что позволяет необычные для ядер белки (альбумин плазмы, иммуноглобулин G, и даже ферритин с мол. массой 465 кД) транспортировать через ядерные поры.

Было показано, что белок с NLS проходит в ядро через несколько этапов (рис. 111). Импорт начинается с того, что NLS-белок связывается с гетеродимером рецептора NLS, с белками импортинами и , локализованными в цитоплазме. Возникший белковый комплекс (импортируемый белок с NLS, связанный с импортинами и ) подходит к внешней ядерной мембране и закрепляется на цитоплазматических филаментах порового комплекса. Затем этот комплекс входит в ядерную пору и проходит через “транспортер”. Считается, что транспортер состоит из множества извитых белковых филаментов, обогащенных аланином и глицином (FG-филаменты), представляющих собой барьер для транспорта некариофильных белков. Комплекс же, имеющий NLS как бы разрыхляет эту сеть и проходит через канал транспортера. После перехода комплекса в нуклеоплазму импортин связывается с белком RAN, представляющего собой малую GTP-азу, что приводит к распаду комплекса. Импортируемый белок освобождается и остается в ядре, импортин возвращается в цитоплазму, так же как и импортин , но в связи с RAN-GDP, где последние также диссоциируют. Тем самым только белок с NLS остается в составе ядра (рис. 111).

Экспорт из ядра в цитоплазму

Из ядра в цитоплазму также существует поток как белков, так и ядерных транскриптов в виде рибонуклеопротеидов. В принципе этот экспорт своей организации сходен с процессом импорта кариофильных белков. Так было обнаружено, что гликопротеидные молекулы, связывающие лиганды, локализуются в место поровых комплексов и со стороны ядра. Одна и та же пора может принимать участие как в импорте, так и в экспорте макромолекул. В пользу этого говорит то, что частички коллоидного золота, связанного с нуклеоплазмином, сорбируются на ядерной поре со стороны цитоплазмы, одновременно с сорбцией частичек, связанных с РНК, инъецированных в ядре ооцитов. Подобные эксперименты показали, что многие РНК (тРНК, 5S РНК, поли-У и поли-А), связанные с коллоидным золотом, аккумулируются в зоне ядерных пор, а затем переносятся в цитоплазму. Более того, РНК способствует переносу через ядерную пору крупных частиц золота размером до 20 нм. Обратного переноса не происходит: аналогичные частички, инъецированные в цитоплазму ооцита, в ядро не проникают.

Что касается естественных видов РНП, то комплексы ядерных пор также должны узнавать специфический сигнал на экспорт. Белковые компоненты РНП несут аминокислотные последовательности, сигналы ядерного экспорта (NES), которые дают возможность различным РНП проходить через ядерную оболочку в цитоплазму.

В этом случае также образуется сложный комплекс, состоящий из переносимого белка с NES-последовательностью (связанного с РНК или свободного), ассоциированного с белком экспортином 1, который в свою очередь связан с RAN-GTP. Этот комплекс проходит через центральный канал, создаваемый транспортером, в цитоплазму, где и диссоциирует. При этом освобождается белок с NES-участком (или РНП), который остается в цитоплазме. Экспортин 1 и RAN после гидролиза GTP снова возвращаются в ядро (рис. 112).

В процессе экспорта РНП ядерная пора контролирует не только белковый компонент. Ядерные поры узнают и не экспортируют короткие (100 нуклеотидов) тРНК, если в их структуре есть хоть одна замена. Транспорт незрелых форм иРНК, имеющих интронные участки, не происходит. Вообще в цитоплазме не обнаруживаются незрелые РНК. Вероятно, для экспорта некоторых РНК необходима их связь с особыми белками. Так 5S РНК переносится в цитоплазму вместе с транскрипционным фактором TFIIIA, или с белком L5. Мутантные формы 5S рРНК, которые не связываются с TFIIIA, остаются в ядре.

Мало изучен вопрос о транспорте в цитоплазму крупных РНП-комплексов, таких как субъединицы рибосом, информосомы и малые ядерные РНП. Возможно все они под действием каких-то факторов разворачиваются, меняют свою конформацию и проходят через поровый комплекс. В пользу этого говорят наблюдения гантелевидных РНК-содержащих частиц, в просвете пор ядер гигантских слюнных желез насекомых. Считается, что эта картина отражает момент выхода из ядер РНП-частиц 60 нм в диаметре, относимых к информоферам. Интересно, что состав белков в цитоплазматических информационных РНП иной, это может говорить о том, что в зоне поровых комплексов происходит “переодевание” информационных РНК, связь их с иными белками.

Динамика ядерной оболочки в митозе

Большей частью, но не у всех видов (исключение составляют амебы, эвгленовые, инфузории, динофлагелляты, многие водоросли, некоторые грибы), ядерная оболочка разрушается при митозе и снова возникает после деления клеток. Это так называемый открытый тип митоза (рис. 113). При этом в профазе по мере конденсации хромосом ядерная оболочка теряет  с ними связь, а затем в ней появляются разрывы. Она приобретает вид плоских мембранных вакуолей, цистерн. В это время ядерные поры еще видны. Позднее они исчезают. Во время митоза 120 мДа комплекс ядерной поры разбирается на субкомплексы примерно по 1 мДа. Разборка пор н