36638

Предмет і задачі вірусології

Конспект

Биология и генетика

Історія вірусології досить незвичайна. Перша вакцина для попередження вірусної інфекції — віспи була запропонована англійським лікарем Є. Дженнером в 1796 г., майже за сто років до відкриття вірусів, друга вакцина — антирабічна була запропонована засновником мікробіології Л. Пастером в 1885 г.— за сім років до відкриття вірусів.

Украинкский

2013-09-23

484.5 KB

12 чел.

Модуль І.

Змістовний модуль І. Предмет і задачі вірусології.

Тема 1. Предмет та завдання вірусології, історія розвитку вірусології, її роль у розвитку сучасної біології та медицини.

Історія вірусології досить незвичайна. Перша вакцина для попередження вірусної інфекції — віспи була запропонована англійським лікарем Є. Дженнером в 1796 г., майже за сто років до відкриття вірусів, друга вакцина — антирабічна була запропонована засновником мікробіології Л. Пастером в 1885 г.— за сім років до відкриття вірусів.

Честь відкриття вірусів належить нашому співвітчизнику Д. І. Івановському, який уперше в 1892 г. довів існування нового типу збудника хвороб на прикладі мозаїчної хвороби тютюну. Будучи студентом Петербурзького університету, він виїжджав на Україну й у Бессарабію для вивчення причин хвороби тютюну, а потім, після закінчення університету, продовжував дослідження в Никитському ботанічному саду під Ялтою. У вмісті ураженого листу він не виявив бактерій, однак сік хворої рослини викликав поразки здорових листів. Д. І. Івановський профільтрував сік хворої рослини через свічу Шамберлана, пори якої затримували дрібні бактерії. У результаті він виявив, що збудник проходить навіть через такі пори, тому що фільтрат продовжував викликати захворювання листів тютюну. Культивування його на штучних живильних середовищах виявилося  неможливим. Д. І. Івановський доходить висновку, що збудник має незвичайну природу: він фільтрується через бактеріальні фільтри й не здатний рости на штучних живильних. середовищах Він назвав новий тип збудника «фільтрівні бактерії».

Досліди Д. І. Івановського в 1898 г. повторив голландський учений М. В. Бейєринк, пришедши, однак, до висновку, що збудник тютюнової мозаїки — рідкий живий контагіоз. Д. І. Івановський із цим висновком не погодився. До цього часу були опубліковані роботи Ф. Леффлера й П. Фроша, що показали, що збудник ящуру також проходить через бактеріальні фільтри. Д. І. Івановський, аналізуючи ці дані, дійшов висновку, що агенти ящуру й тютюнової мозаїки принципово подібні. У суперечці з М. В. Бейєринком правим виявився Д. І. Івановський. Досліди Д. І. Івановського були покладені в основу його дисертації « Про дві хвороби тютюну», представленої в 1888 г., і викладені в книзі на ту ж назву, що вийшла в 1892 р. Цей рік і вважається роком відкриття вірусів. Іванівський відкрив вірус рослин. Ф. Леффлер і П. Фрош відкрили вірус, що вражає тварин. Нарешті, в 1917 р. Ф. д'эррель відкрив бактеріофаг — вірус, що вражає бактерії. Таким чином, віруси викликають хвороби рослин, тварин, бактерій.

Слово «вірус» означає отруту, воно застосовувалося ще Л. Пастером для позначення заразного початку. Пізніше стали застосовувати назва «ультравірус» або «фільтруючий вірус», потім визначення відкинули й укоренився термін «вірус». Швидкий прогрес в області вірусологічних знань, заснований значною мірою на досягненнях суміжних природничих наук, обумовив можливість поглибленого пізнання природи вірусів. Як у жодній іншій науці, у вірусології простежується швидка й чітка зміна рівнів пізнання — від рівня організму до субмолекулярного. Наведені періоди розвитку вірусології відображають ті рівні, які були домінуючими протягом одного — двох десятиліть. Рівень організму (40 роки XX століття). Основною експериментальною моделлю є лабораторні тварини (білі миші, пацюки, кролики, хом'яки і т.д.), основним модельним вірусом — вірус грипу. В 40 роки у вірусологію як експериментальну модель міцно входять курячі ембріони у зв'язку з їхньою високою чутливістю до вірусів грипу, віспи й деяким іншим. Використання цієї моделі стало можливим завдяки дослідженням австралійського вірусолога й імунолога Ф. М. Бернета, автора посібника з вірусології «Вірус як організм».

Відкриття в 1941 р. американським вірусологом Херстом феномена гемаглютинації чимало сприяло вивченню взаємодії вірусу із клітиною на моделі вірусу грипу й еритроцитів.

Великим внеском вітчизняних вірусологів у медичну вірусологію з'явилося вивчення природновогнищних захворювань — епідемічних енцефалітів. В 1937 р. була організована перша експедиція, очолювана Л. А. Зільбером, у складі якої були Е. Н. Левкович, А. К. Шубладзе, М. П. Чумаків, В. Д. Соловйов і ін. Завдяки проведеним дослідженням був відкритий вірус кліщового енцефаліту, виявлені його переносники — іксодові кліщі, розроблені методи лабораторної діагностики, профілактики й лікування. Радянськими вірусологами були вивчені вірусні лихоманки, розроблені препарати для діагностичних і лікувально-профілактичних цілей.

Рівень клітини ( 50 роки). В 1949 р. відбувається значна подія в історії вірусології — відкриття можливості культивувати клітини в штучних умовах. В 1952 р. Дж. Ендерс, Т. Уеллер, Ф. Робінс одержали Нобелевську премію за розробку методу культури клітин. Використання культури клітин у вірусології з'явилося справді революційною подією, що послужили основою для виділення численних нових вірусів, їх ідентифікації, клонування, вивчення їх взаємодії із клітиною. З'явилася можливість одержання культуральних вакцин. Ця можливість була доведена на прикладі вакцини проти поліомієліту. У співдружності з американськими вірусологами Дж. Солком і А. Сейбіном, радянськими вірусологами М. П. Чумаковим, А. А. Смородинцевим і ін. була розроблена технологія виробництва, опробована й впроваджена в практику вбита й жива вакцини проти поліомієліту. В 1959 р. була проведена масова імунізація дитячого населення в СРСР ( близько 15 млн.) живою полиомієлітною вакциною, у результаті різко знизилася захворюваність поліомієлітом тому й практично зникли паралітичні форми захворювання. В 1963 р. за розробку й впровадження в практику живої поліомієлітної вакцини М. П. Чумакову й А. А. Смородинцеву була присуджена Ленінська премія. Іншим важливим доповненням техніки вирощування вірусів з'явилося одержання Дж. Эндерсом і А. А. Смородинцевим живої коревої вакцини, широке застосування якої обумовило значне зниження захворюваності кором і є основою для викорінювання цієї інфекції.

Широко впроваджувалися в практику й інші культуральні вакцини — енцефалітна, ящурна, антирабічна і т.д.

Молекулярний рівень (60 роки). У вірусології широко стали використовувати методи молекулярної біології, а віруси завдяки простій організації їх генома стали розповсюдженою моделлю для молекулярної біології. Жодне відкриття молекулярної біології не обходиться без вірусної моделі, включаючи генетичний код, увесь механізм внутрішньоклітинної експресії генома, реплікацію ДНК, процесинг (дозрівання) інформаційних РНК і т.д. У свою чергу використання молекулярних методів у вірусології дозволило встановити принципи будови (архітектури) вірусних індивідуумів — віріонів (термін, введений французьким мікробіологом А. Львовим), способи проникнення вірусів у клітину і їх репродукції.

Субмолекулярний рівень (70 роки). Стрімкий розвиток молекулярної біології відкриває можливості вивчення первинної структури нуклеїнових кислот і білків. З'являються методи секвенування ДНК, визначення амінокислотних послідовностей білка. Одержують перші генетичні карти геномів ДНК-вмісних вірусів.

В 1970 р. Д. Балтімором і одночасно Г. Теміним і С. Мізутані була відкрита зворотна транскриптаза в складі РНК-вмісних онкогенних вірусів, фермент, що переписує РНК на ДНК. Стає реальним синтез гена за допомогою цього ферменту на матриці, виділеної з полісом іРНК. З'являється можливість переписати РНК у ДНК і провести її секвенування.

В 1972 р. виникає новий розділ молекулярної біології — генна інженерія. Цього року публікується знспілкування П. Берга в США про створення рекомбінантної молекули ДНК, яке поклало початок ері генної інженерії. З'являється можливість одержання великої кількості нуклеїнових кислот і білків шляхом введення рекомбінантних ДНК до складу генома прокаріот і простих еукаріот. Одним з основних практичних додатків нового методу є одержання дешевих препаратів білків, що мають значення в медицині (інсулін, інтерферон) і сільськім господарстві (дешеві білкові корми для худоби).

Цей період характеризується важливими відкриттями в області медичної вірусології. У полі вивчення — три найбільш масові хвороби, що наносять величезний збиток здоров'ю людей і народному господарству— грип, рак, гепатит.

Змістовний модуль ІІ. Особливості будови, класифікації та хімічного складу вірусів.

Тема 1. Загальна характеристика вірусів.

Із часу відкриття вірусів по теперішній час уявлення про природу вірусів перетерпіли значні зміни.

Д. І. Івановський і інші дослідники того часу підкреслювали дві властивості вірусів, що дозволили виділити їх із загальної маси мікроорганізмів: здатність до фільтрувальності і нездатність розмножуватися на всіх штучних живильних. середовищах Пізніше з'ясувалося, що ці властивості не абсолютні, тому що були виявлені фільтрівні (Ь) форми бактерій і мікоплазми, що ростуть на штучних живильних середовищах за розмірами, які наближаються до найбільш великих вірусів (віруси віспи людини й тварин).

Внутрішньоклітинний паразитизм вірусів також виявився не абсолютним критерієм, що відмежовує їх від інших мікроорганізмів. Внутрішньоклітинними паразитами є не тільки віруси, але й деякі бактерії (гонококи, менингококи) і найпростіші (малярійний плазмодій). З розвитком знань про віруси були знайдені більш надійні критерії, наприклад існування у вірусів тільки однієї із двох нуклеїнових кислот, у той час як в усіх інших мікроорганізмів є обидві нуклеїнові кислоти — дезоксирибонуклеїнова (ДНК) і рибонуклеїнова (РНК).

Іншою унікальною властивістю вірусів є відсутність у них власних білоксинтезуючих систем. Синтез вірусних білків здійснюється білоксинтезуючим апаратом клітини — клітинними рибосомами, які зв'язуються з вірусними іРНК. Віруси вводять у клітину лише свою генетичну інформацію, яка успішно конкурує із клітинною інформацією, незважаючи на мізерно малі розміри вірусних геномів (на 5-6 порядків менших за молекулярними масами, ніж геном еукаріотичної клітини). Тому й рівень паразитизму у вірусів інший, ніж у бактерій або найпростіших: на відміну від внутрішньоклітинного паразитизму останніх паразитизм вірусів визначається як генетичний паразитизм, а віруси розглядаються як генетичні паразити. Яскравим прикладом генетичного паразитизму є здатність ряду вірусів інтегрувати (поєднуватися) із клітинним геномом. У цьому випадку вірусні гени перетворюються в групу клітинних генів і позначаються як провірус. Стадія інтеграції, крім помірних ДНК-вмісних фагів, характерна для онкогенних ДНК-вмісних вірусів і вірусу гепатиту В. Ця стадія обов'язкова для великої групи РНК-вмісних вірусів — ретровірусів.

Однак і в тому випадку, коли інтеграції не відбувається й вірусний геном перебуває в автономному стані, виникнення інфекції обумовлене конкуренцією вірусного й клітинного геномів.

До унікальних властивостей вірусу відноситься його спосіб розмноження, який різко відрізняється від способів розмноження всіх інших клітин і організмів (бінарний поділ, брунькування, утворення спор). Віруси не ростуть, і їхнє розмноження позначається як диз’юнктивна (роз'єднана) репродукція, що підкреслює роз'єднаність у просторі (на території клітини) і часу синтезу вірусних компонентів (нуклеїнових кислот і білків) з наступною зборкою і формуванням віріонів.

У зв'язку з вищевикладеним не раз виникали дискусії із приводу того, що ж таке віруси — живе або не живе, організми або не організми. Безумовно, віруси мають основні властивості всіх інших форм життя — здатністю розмножуватися, спадковістю, мінливістю, пристосовністю до умов зовнішнього середовища; вони займають певну екологічну нішу, на них поширюються закони еволюції органічного миру на землі. Тому до середини 40-х років сформувалося уявлення про віруси як про найбільш прості мікроорганізми. Логічним розвитком цих поглядів було введення терміна «віріон», що позначав позаклітинний вірусний індивідуум. Однак з розвитком досліджень по молекулярній біології вірусів стали накопичуватися факти, що суперечать уявленню про віруси як організми.

Відсутність власних білоксинтезуючих систем, диз’юнктивний спосіб репродукції, інтеграція із клітинним геномом, існування вірусів сателітів і дефектних вірусів, феноменів множинної реактивації й комплементації — усе це мало вкладається в уявлення про віруси як організми. Уявлення це ще більше втрачає зміст, коли ми звернемося до вірусоподібних структур — плазмід, віроїдів і агентів типу збудника скріпи.

Плазміди (інші назви — епісоми, епівіруси) представляють двониткові кільцеві ДНК із молекулярною масою в кілька мільйонів, які реплікуються клітиною. Вони спочатку були виявлені в прокаріотів, і з їхнім існуванням зв'язані різні властивості бактерій, наприклад стійкість до антибіотиків. Оскільки плазміди звичайно не пов'язані з бактеріальною хромосомою (хоча багато з них здатні до інтеграції), їх вважають екстрахромосомними факторами спадковості.

Плазміди були виявлені й в еукаріотів (дріжджів і інших грибів), більш того, звичайні віруси вищих тварин також можуть існувати у вигляді плазмід, тобто кільцевих ДНК, позбавлених власних білків. Зокрема, у вигляді плазмід можуть існувати віруси папіломи корів, мавпячий вірус 40 (SV40). При персистенції вірусу герпеса в культурі клітин можуть утворюватися плазміди — кільцеві ДНК, що становлять лише частину генома цього вірусу.

До вірусів відносять віроїди — агенти, відкриті Т. О. Дайнером в 1972 р., що викликають захворювання  деяких рослин і здатні передаватися як звичайні інфекційні віруси. При їхньому вивченні виявилося, що це порівняно невеликі за розмірами молекули кільцевої суперспіралізованої РНК, що складаються з деяких 300—400 нуклеотидів. Механізм реплікації віроїдів не цілком з’ясований.

Нарешті, слід згадати про агента скріпи — збудника губкоподібної енцефалопатії овець. Імовірно, подібні агенти викликають і інші форми губкоподібної енцефалопатії тварин і людини, в основі яких лежить прогресуюче руйнування нервових клітин, у результаті чого мозок набуває губчатої структури. Агент скріпи має білкову природу й навіть одержав спеціальну назву — пріон ( від слів proteinaceous infectious particle — білкова інфекційна частка). Передбачається, що цей білок є одночасно й індуктором і продуктом якогось клітинного гена, що став автономним та вислизнув від регуляції («скажений ген»).

Усі віруси, включаючи сателіти й дефектні віруси, плазміди, віроїди й навіть агенти скріпи (їх гени), мають щось загальне, їх об'єднуюче. Усі вони є автономними генетичними структурами, здатними функціонувати й репродукуватися в сприйнятливих  до них клітинах тварин, рослин, найпростіших, грибів, бактерій. Очевидно, це найбільш загальне визначення, що дозволяє окреслити царство вірусів. На підставі сформульованого визначення віруси, не будучи організмами, проте є своєрідною формою життя й тому підкоряються законам еволюції органічного миру на землі.

Походження вірусів

З питання про походження вірусів висловлювалися різні припущення. Одні автори вважали, що віруси є результатом крайнього прояву регресивної еволюції бактерій або інших одноклітинних організмів. Гіпотеза регресивної еволюції не може пояснити різноманітності генетичного матеріалу у вірусів, неклітинної їхньої організації, диз’юнктивного способу репродукції й відсутності білоксинтезуючих систем. Тому в цей час ця гіпотеза має скоріше історичне значення й не розділяється більшістю вірусологів.

Згідно із другою гіпотезою віруси є нащадками прадавніх, доклітинних форм життя — протобіонтів, що передували появі клітинних форм життя, з яких і почалася біологічна еволюція. Ця гіпотеза також не розділяється в цей час більшістю вірусологів, тому що вона не пояснює тих же питань, дозволити які виявилася неспроможної перша гіпотеза.

Третя гіпотеза припускає, що віруси походять від генетичних елементів клітин, що стали автономними, хоча не ясно, які із цих елементів дали початок настільки великій різноманітності генетичного матеріалу у вірусів. Ця гіпотеза, яку іронічно назвали гіпотезою «скажених генів », знаходить найбільше число прихильників, однак не в тому первісному виді, у якому вона була висловлена, тому що й вона не пояснює наявність у вірусів форм генетичного матеріалу (однонитчата ДНК, двонитчата РНК), відсутніх у клітинах, утворення капсида, існування двох форм симетрії й т.п.

Імовірно, віруси дійсно є дериватами генетичних елементів клітин, але вони виникали й еволюціонували разом з виникненням і еволюцією клітинних форм життя. Природа як би випробувала на вірусах усі можливі форми генетичного матеріалу (різні види РНК і ДНК), перш ніж остаточно зупинила свій вибір на канонічній його формі — двонитковій ДНК, загальної для всіх клітинних форм організмів, починаючи від бактерії й закінчуючи людиною. Будучи, з одного боку, автономними генетичними структурами, з іншого боку, нездатними розвиватися поза клітинами, віруси протягом мільярдів років біологічної еволюції проробили настільки різноманітні шляхи розвитку, що окремі їхні групи не мають спадкоємному зв'язку між собою. Очевидно, різні групи вірусів виникали в історично різні часи з різних генетичних елементів клітин і тому існуючі в цей час різні групи вірусів мають поліфілетичне походження, тобто не мають єдиного загального предка. Проте, універсальність генетичного коду поширюється й на віруси, свідчачи тим самим, що й вони є породженням органічного миру землі.

Роль вірусів в еволюції

Віруси звичайно розглядаються як паразити — збудники інфекційних хвороб, що наносять шкоду людині, тваринам, рослинам. Однак такий підхід не можна визнати правильним. Була висловлена гіпотеза [Жданов В. М., 1974], згідно з якою віруси є важливим чинником еволюції органічного миру. Долаючи видові бар'єри, віруси можуть переносити окремі гени або групи генів, а інтеграція вірусної ДНК із хромосомами клітин може призводити до того, що вірусні гени стають клітинними генами, які виконують важливі функції.

Оскільки віруси, будучи особливими формами життя, не є мікроорганізмами, то й вірусологія є не розділом мікробіології, а самостійною науковою дисципліною, що має свій об'єкт вивчення й свої методи дослідження.

Тема 2. Методи вивчення морфології вірусних часток.

Методи вивчення вірусних часток базуються на різних принципах та підходах при яких враховуються фізико-хімічні, біологічні властивості вірусів різних організмів, а також стан об’єкту, що використовується для виділення вірусу. До цих методів необхідно віднести: виділення вірусів шляхом отримання їх в ізоелектричній точці, отримання вірусів при осадженні сульфатом амонію; очистка на іонообмінний хроматографії; використання гель фільтрації, фракціювання вірусів та їх компонентів в градієнті сахарози, фракціювання електрофорезом в поліакриламідному гелі та ін.. Для приготування градієнтів концентрації застосовують крім сахарози також гліцерин, солі цезію та інші речовини. Фракціювання заклечається в тому, що різні компоненти суміші розділяються за швидкістю седиментації. Різні віруси утворюють зони, які інтенсивно розсіюють світло та легко проглядаються при підсвіченні, і їх можна фотографувати. Для такого дослідження вірусів та їх компонентів використовують різні типи роторів. Цей метод ефективний в тих випадках, коли у розчині є два віруси різної морфології.

Електрофорез в поліакриламідному гелі (ПАГ) базується на тому, що швидкість та напрямок руху компонентів, наприклад, білкової суміші в буферному розчині залежить від рН та його іонної сили. При цьому враховується те, що білки являють собою амфотерні електроліти і їх заряд змінюються у відповідності з рН середовища. В зв’язку з цим білкові молекули рухаються під час електрофорезу до анода або катода. Цей метод надзвичайно чутливий і його використовують при аналізі білків та нуклеїнових кислот вірусів.

Метод радіоізотопних попередників знайшов широке використання у вірусологічних дослідженнях шляхом підбору радіоактивних елементів. Що дає можливість простежити за технологією збірки, транспорту та локалізації вірусів в організмі. Існують відповідні прилади, які дають змогу розділяти та ідентифікувати випромінення різних ізотопів. В практиці сучасної вірусології часто використовують електрофорез та хроматографію з одночасним використанням ізотопної мітки. При дослідженні морфології вірусів, їх структури та локалізації в клітинах організму надійним методом являється просвічуюча електронна мікроскопія з різними модифікаціями підготовки об’єкту та його вивчення. Для дослідження вірусів препарат виготовляють безпосередньо із суспензій матеріалу, а також з очищених препаратів. Зразки наносять на плівку-підкладку з сіткою, а потім напилюють на вакуумних установках металами. Найбільш часто препарат контрастують фосфорно-вольфрамовою кислотою, ураніл ацетатом, та ін. Надійним методом вивчення локації вірусів в клітині, та структури клітинних компонентів в електронному мікроскопі є дослідження ультра тонких зрізів клітин ссавців, рослин, мікроорганізмів та ін. Ультра тонкі зрізи виготовляють на ультра мікротомах різних конструкцій та марок, препарати контрастують, а потім досліджують в електронному мікроскопі.

Значне поширення в дослідженні вірусів набули електронні методи за допомогою яких можна виявити приховану (латентну) вірусну інфекцію на ранніх періодах її розвитку. На сьогоднішній період вивчення біополімерів існують різні модифікації замірів їх спектрів. При цьому, система приладів дозволяє самореєструвати криві їх співвідношень, що дає змогу автоматично вимірювати концентрацію нуклеїнових кислот, визначати ступінь гвинтоутворення поліпептидів та білків.

2. По своїй будові віруси можна поділити на 4 типи, які відрізняються по характеру упаковки морфологічних субодиниць:

1) віруси з спіральною симетрією;

2) ізометричні віруси з кубічною симетрією;

3) вірус з бінарною симетрією, наприклад, фаги: у них головка має кубічний тип симетрії, а хвостик – спіральний;

4) більш складно організовані  віруси, які мають другу оболонку.

Оболонка, в яку упакована геномна нуклеїнова кислота, називається капсидом. Найбільш просто організовані віруси представляють собою нуклеокапсиди: вони складаються тільки із нуклеїнової кислоти і білкової оболонки, яка збудована з ідентичних пептидних молекул. Існує всього два способи упаковки однакових білкових молекул в капсид, при яких він був би стабільним. Полімер буде стабільним, якщо він відповідає найменшому рівню вільної енергії. Процес утворення такого полімера споріднені з процесом кристалізації, він протікає по типу само зборки. Один із варіантів такої само зборки відбувається з використанням спіральної симетрії, другий – кубічної симетрії. При спіральній симетрії білкові субодиниці розташовуються по спіралі, а між ними, також по спіралі, укладена геномна нуклеїнова кислота. Краще всього цей тип організації вібріона вивчено у вірусу та бачної мозаїки. він представляє собою нуклеопротеїди, який має довжину 300 нм, діаметр 18 нм. Молекулярна вага вібріона 40апсид вібріона складається з 2130 білкових молекул, які по спіралі укладені навколо РНК. При спіральній симетрії білковий чохол краще захищає нуклеїнову кислоту, але при цьому потрібна більша кількість білка, ніж при кубічній симетрії

Більшість вірусів з замкненим чохлом має кубічну симетрію. В її основі полягають різні комбінації рівносторонніх трикутників, які утворюються із сполучення кулястих білкових субодиниць. Сполучаючись відповідним чином один з одним, вони можуть формувати замкнуту сферичну поверхню. Із різних сполучень рівносторонніх трикутників можуть з’являтися різні варіанти многогранників: тетраедри. октаедри і еконосаедри. Ікосаедр – сама ефективна і економічна симетрія для формування замкнутого чохла, так як у цьому випадку при його зборці використовуються білки мінімального розміру і забезпечується найбільший внутрішній об’єм вібріона.

Складніше збудовані віруси, які мають другу оболонку. спочатку вона отримала назву «пеплоса». Пізніше її стали називати суперкапсидом. він представляє собою звичайну біологічну мембрану, яка складається із двох ліпідів, які мають клітинне походження. Суперкапсидні вірусні білки, які утворюють шипи, виконують важливі для вірусу функції: вони розпізнають клітинні рецептори і зв’язуються з ними, сприяють розповсюдженню вірусу в організмі за рахунок злиття клітин. До складних вірусів належать ортоміксовіруси, параміксовіруси, коронавіруси. Віріон ретровірусів має ікосаедричний капсид, всередині якого знаходиться спіральний нуклеокапсид, а сам віріон вкритий ліпідною оболонкою, яка надає йому сферичну форму.

Найуспішніше метод електронної мікроскопії застосовують для виявлення вірусів, що не культивуються, а саме: ротавірусів, вірусу гепатиту А, кишкових аденовірусів, вірусу Норфолка, каліци-, астровірусів тощо. Метод імунної електронної мікроскопії є високочутливим; за його допомогою можна проводити серотипізування вірусів, вивчати антигенну будову вірусних часток.

Електронна мікроскопія – єдиний метод експрес-діагностики, який дає змогу візуально виявляти віруси в клінічному матеріалі незалежно від їхніх розмірів. За допомогою електронної мікроскопії можна виявити віруси у пробах, ідентифікувати їх за морфологією та дати відповідь протягом кількох годин. Це можливо, якщо вміст вірусних часток в 1 мл матеріалу становить 105—106 і більше.

Будова електронного мікроскопа. Для лабораторії діагностики вірусних інфекцій використовують електронні просвічуючі мікроскопи, наприклад, серійні мікроскопи "ПЕМ.-100" вітчизняного виробництва, "JЕМ 100СХ-2" японської фірми "Jeol", голландської фірми "Рhilips" та ін.

Електронний мікроскоп складається з вертикальної колони, в якій розміщені електронна гармата й система електромагнітних лінз, та пульта керування. Усередині колони створюється вакуум 1,3×103—1,3×104 кПа (10-4–10-5 мм рт. ст.).

Пучок електронів немовби просвічує об'єкт, взаємодіючи з атомами його речовин. При цьому електрони відхиляються від початкових траєкторій і потрапляють у магнітне поле лінзи об'єктива. Різні ділянки об'єкта, залежно від їх щільності, а також плівка-підкладка, на якій розміщений об'єкт, розсіюють електрони неоднаково. Чим щільніші ділянки, тим більша їхня розсіювальна здатність, отже, тим темнішим буде їхнє зображення на екрані. Лінза об'єктива, найважливіша частина електронного мікроскопа, формує первинне збільшене зображення об'єкта.

У колоні мікроскопа, нижче від лінзи об'єктива, розміщена проміжна лінза, призначена для одержання другого збільшення об‘єкта. І, нарешті, наступна після неї проекційна лінза створює остаточне збільшення зображення об‘єкта, видиме на флюоресціюючому екрані електронного мікроскопа.

Обробка клінічного матеріалу. Для клінічної діагностики антигенний матеріал не слід дуже очищати. Так. з метою виявлення вірусу грипу можна досліджувати й неочищену алантоїсну рідину. Суспензії калу, секрету носової частини глотки, біоптатів мозку необхідно освітлити.

Суспензію калу або біоптат мозку (10 %) готують на розчині Хенкса, гомогенізують струшуванням і центрифугують протягом 30 хв на швидкості 3000 об/хв. З надосадової рідини готують препарати й досліджують під мікроскопом.

Для дослідження методом імунної електронної мікроскопії вірусвмісний матеріал змішують із нерозведеною імунною специфічною сироваткою, а також з її розведеннями у 10 і 100 разів у співвідношенні 4 – 5:1. Після перемішування суміш витримують протягом 1 год при температурі 37 °С, потім протягом 16 – 18 год при 4 °С. Наступного дня суміш центрифугують протягом 30 хв на швидкості 10000 об/хв (для осадження імунних комплексів), а якщо досліджуються віруси невеликого розміру (типу парво-, пікорна-, паповавірусів) – протягом 30 хв (15000 об/хв). Осад ресуспендують у мінімальному об'ємі дистильованої води і готують препарати.

Приготування препаратів для електронної мікроскопії. Краплю суспензії вірусів або імунних комплексів наносять тонко відтягнутою пастерівською піпеткою на предметну сітку з опорною плівкою-підкладкою. Протягом 30—60 с вірусні частки адсорбуються на гідрофільній колодієвій плівці-підкладці. Зайву вологу видаляють фільтрувальним папером. Потім цю процедуру повторюють для концентрування вірусу на плівці-підкладці.

Негативне контрастування електронно-мікроскопічних препаратів здійснюють 2 % розчином ФВК безпосередньо на плівці-підкладці. Краплю ФВК наносять па предметну сітку з препаратом на кілька секунд (до 10с). Надлишок контрастуючої речовини знімають фільтрувальним папером.

Суть негативного контрастування полягає в тому, що контрастуюча речовина (ФВК або її солі) обволікає вірусні частки, проникає в їхні гідрофільні ділянки, замішуючи воду, і робить віріони електронно-щільними, чітко визначаючи при цьому їхню структуру. Контрастуюча речовина непроникна для електронного пучка, що легко проходить крізь органічний матеріал. Вірусні частки здаються світлими па темному тлі.

Дослідження в електронному мікроскопі проводять при інструментальному  збільшенні у 30000—60000 разів. Переглядають не менше 5 – 10 пічок предметної сітки. Діагностичне важливим є тільки позитивний результат.

Тема 3. Особливості морфології та структури вірусних часток.

Архітектура віріонів

Вивчення будови віріонів призвело до висновку, що їх формування підкоряється строгим математичним законам побудови просторових структур — від кристалів до архітектурних споруд — законам, заснованим на утворенні структур з найменшим рівнем вільної енергії. Тому поняття «структура віріонів» змінене на більш точне визначення «архітектура віріонів», яке й залишилося у вірусології.

Обов'язковим структурним елементом вірусів є капсид — білкова оболонка, що оточує вірусну нуклеїнову кислоту. Прості віруси, такі як пікорновіруси й парвовіруси, складаються з капсида, що оточує одну молекулу нуклеїнової кислоти. Складні віруси мають ще додаткову зовнішню оболонку — суперкапсид. Ця термінологія введена Д. Каспаром і А. Клагом в 1962 р.

Морфологічними субодиницями капсида, видимими в електронний мікроскоп, є капсомери. Цей термін звичайно застосовують для ізометричних капсидів з кубічним типом симетрії. Структурними одиницями капсида є білкові субодиниці, що складаються з однієї або декількох молекул білка. Структурна одиниця вірусу тютюнової мозаїки складається з однієї молекули білка, вірусу поліомієліту - із   чотирьох   молекул

Існують два типи будови капсидів віріонів, які забезпечують утворення  структури з мінімумом вільної енергії. В одному випадку капсомери асоціюються з геномом і утворюють спіралевідну, гвинтоподібну структуру. Такий тип укладки називається спіральним типом симетрії, сама структура — нуклеокапсидом.

Такий тип симетрії нуклеокапсида характерний для віріонів тютюнової мозаїки, ортоміксовірусів, параміксовірусів, рабдовірусів. Нуклеокапсиды можуть бути ригідними, як, наприклад, у параміксовірусів, або гнучкими, якщо міжмолекулярні сили не занадто жорстко зв'язують структурні одиниці капсида, як, наприклад, у вірусу везикулярного стоматиту.

       В іншому випадку капсомери утворюють порожнє ізометричне тіло, у центрі якого перебуває геном. Таку укладку називають кубічним типом симетрії. Останнє означає, що тіло є симетричним у трьох взаємно перпендикулярних напрямках (осях симетрії). Ізометричні вірусні частки з кубічним типом симетрії мають форму геометричної фігури пюсаедра — багатогранника, що складається звичайно з 60 кратних 60 геометрично ідентичних елементів, 12 вершин, 20 граней, 20 ребер. По типу ікосаедра побудовано багато дрібних вірусів і нуклеокапсиди складно влаштованих вірусів. Наприклад, віріон поліомієліту представляє ікосаедр, що складається з 60 капсомерів; віріон парвовіруса представляє ікосаедр з 32 капсомерів. У зараженій клітині ікосаедри ізометричних вірусів утворюють кристалоподібні скупчення. Багато складно влаштованих вірусів мають зовнішню ліпопротеїдну оболонку — суперкапсид, що представляє собою ліпідний бішар із вбудованими в нього суперкапсидними білками. Форма таких віріонів наближається до сферичної. Суперкапсидні білки є типовими інтрамембранними білками  та найчастіше представлені глікопротеїдами. Глікопротеїди формують морфологічні субодиниці, які в електронному  мікроскопі  мають  вигляд шипів. У ряду тогавірусів шипи мають паличкоподібну форму; у респіраторно-синцитіального вірусу (сімейство парамиксовірусів) — форму пляшки; у коронавірусів — форму сонячної корони; у вірусу грипу шипи, утворені гемаглютиніном, мають паличкоподібну форму, а шипи, утворені нейрамінідазою,— форму барабанної палички.

Деякі віріони, що містять спіральний нуклеокапсид, мають своєрідну форму. Так, віруси везикулярного стоматиту, сказу й деяких хвороб рослин мають форму гвинтівкової кулі. Зовнішній і внутрішній капсиди реовірусів побудовані по кубічному типу симетрії; обоє вони утворюють як би два футляри, один з якого вкладений у другий. Капсомери внутрішнього капсида досягають зовнішнього капсида, завдяки чому структура віріона нагадує обід колеса. Особливо чітко така форма виражена в представників роду ротавірусів.

При недостачі генетичного матеріалу й при надлишковій продукції білків можуть утворюватися порожні вірусні частки, позбавлені нуклеїнової кислоти.

Досить складну будову мають віріони осповакцини. Серцевина їх, що містить вірусну ДНК у складі нуклеопротеїда, має форму двоввігнутого кільця й оточено двома лінзоподібними  латеральними тільцями. Вірус має кілька оболонок, з яких  найбільш складну будову має зовнішня оболонка.

У ряду складно влаштованих вірусів капсид оточений додатковими внутрішніми структурами, утвореними звичайно внутрішніми білками. У цьому випадку внутрішній компонент позначають як «серцевина» (core), або нуклеоїд.

Морфогенез вірусів

При внутрішньоклітинній репродукції вірусів формуються структури, відсутні в незаражених вірусом клітинах.  Ці  утворення — місця  синтезу  й  зборки субвірусних структур (компонентів дочірніх віріонів) одержали різні найменування — клітинні матрикси, бріки, віропласти, включення. Ці структури є продуктами кооперативних процесів клітини й вірусу. Морфологічно матрикси виглядають по-різному в різних вірусів. Звичайно це місця синтезу білків, тому в матриксах виявляються значні скупчення рибосом (полісоми). До їхнього складу входять різні клітинні структури — мембрани, мікротрубочки, осміофільні волокна й т.п. Матрикси проходять певний цикл розвитку, якщо спочатку в них превалюють полісоми, то пізніше з'являються субвірусні компоненти, які можна виявити при використанні серологічних методів дослідження типу ІФ або ІЕМ, а нерідко й при звичайної ЕМ. При ряду інфекцій матрикси пов'язані з мембранами ендоплазматичної сітки, апаратом Гольджі й іншими клітинними структурами, куди транспортуються всі вірусні компоненти.

Утворення, подібні з цитоплазматичними матриксами, виявлені також у ядрах, де відбувається репродукція більшості ДНК-вмісних вірусів. При фарбуванні клітин вони мають вигляд внутрішньоядерних включень. На пізніх стадіях інфекції в матриксах або по сусідству з ними накопичується велике число віріонів, що часто утворюють кристалоподібні формування. Внутрішньоядерні кристалоподібні включення виявлені, наприклад, у реовірусів, аденовірусів, паповавірусів, парвовірусів. Процес формування віріонів у вірусів, що мають ліпопротеїдні оболонки, значно складніший, ніж у просто влаштованих вірусів, і протікає багатоступенчасто. Так, наприклад, ізометричні нуклеокапсиди вірусу герпеса формуються в ядрах і надалі транспортуються в цитоплазму шляхом брунькувания через ядерну мембрану. Після цього віріони транспортуються до апарата Гольджі, проходячи через мембрану ендоплазматичної сітки й захоплюючи її, як це було при проходженні через ядерну мембрану. Тому позаклітинний вірус має дві оболонки, одна з яких формується з ядерної, друга — із цитоплазматичної мембрани.

Формування РНК віріонів параміксовірусів відбувається в цитоплазмі, де вони накопичуються у вигляді тяжів і потім транспортуються до плазматичної мембрани. У цей час плазматична мембрана клітини вже модифікована, тому що в неї вбудовані із зовнішньої сторони вірусні глікопротеїди, а із внутрішньої сторони — матриксний білок. При наближенні до таких модифікованих ділянок плазматичної мембрани рибонуклеопротеїдні тяжі звиваються в щільно впаковані клубки й, проходячи через плазматичну мембрану, покриваються нею, здобуваючи таким шляхом зовнішню оболонку. Цей тип формування віріонів називається брунькуванням. Брунькування може відбуватися й у внутрішньоклітинній вакуолі.

Морфогенез вірусу віспи ще більш складний. У цитоплазмі утворюються складні матрикси, у яких відбувається синтез численних вірусоспецифічних структур. Тут же відбувається й формування віріонів, які спочатку представляють пухирчасті утворення, і лише пізніше з них формуються зрілі віріони. Вихід вірусних часток із клітини здійснюється або шляхом брунькування через мембрани у внутрішньоклітинні вакуолі, або при руйнуванні клітини.

Біофізичні властивості вірусів

Біофізичні властивості вірусів характеризуються багатьма показниками — седиментацією, щільністю, в'язкістю вірусних суспензій, дифузійними властивостями. Усі ці характеристики відносяться також до субвірусних компонентів. Найбільш важливими біофізичними характеристиками вірусів є седиментаційні й щільнісні властивості. Вони найчастіше виміряються при дослідженні вірусів.

Різні групи вірусів мають неоднакову стійкість у зовнішньому середовищі. Найменш стійкими є віруси, що мають ліпопротеїдні оболонки, найбільш стійкими — ізометричні віруси. Так, наприклад, ортоміксовіруси й параміксовіруси інактивуються на поверхнях протягом декількох годин, тоді як віруси поліомієліту, аденовіруси, реовіруси зберігають інфекційну активність протягом декількох днів.

Однак із цього загального правила є й виключення. Так, вірус віспи стійкий до висихання й зберігається в екскрементах протягом багатьох тижнів і місяців. Вірус гепатиту В стійкий до дії несприятливих зовнішніх факторів і зберігає свою активність у сироватці навіть при короткочасному кип'ятінні.

Чутливість вірусів до ультрафіолетового й рентгенівського опромінення залежить переважно від розмірів їх генома. Тому, наприклад, вірус осповакцини інактивується при рентгенівськім опроміненні близько 5∙104 рад, у той час як дрібний вірус папіломи для інактивації вимагає опромінення 4∙105 рад.

Чутливість вірусів до інактивації формальдегідом і іншими хімічними речовинами, що інактивують генетичний матеріал, залежить від багатьох умов, серед яких слід назвати щільність упаковки нуклеїнової кислоти в білковий футляр, розміри генома, наявність або відсутність зовнішніх оболонок і т.п. Віруси, що мають ліпопротеїдні оболонки, чутливі до ефіру, хлороформу й детергентам, у той час як просто влаштовані ізометричні й паличкоподібні віруси стійкі до їхньої дії.

Нарешті, важливою особливістю вірусів є чутливість до рН. Є віруси, стійкі до кислих значень рН (2,2—3,0), наприклад віруси, що викликають кишкові інфекції й проникають в організм аліментарним шляхом. Однак більшість вірусів інактивується при кислих і лужних значеннях рН.

Тема 4. Хімічний склад вірусів.

Просто організовані віруси являють собою нуклеопротеїди або нуклеокапсиди й складаються з нуклеїнової кислоти (РНК або ДНК) і декількох білків, що кодуються нею та формують вірусну оболонку навколо нуклеїнової кислоти — капсид.

Складно організовані віруси містять додаткові оболонки, білкові або ліпопротеїдні, і мають більш складний хімічний склад. Крім нуклеїнової кислоти й білків, вони містять ліпіди в зовнішніх оболонках і вуглеводи в складі білків зовнішніх оболонок (глікопротеїдів). Звичайно ліпіди й вуглеводи мають клітинне походження. У складі деяких вірусів виявляються також клітинні нуклеїнові кислоти й білки.

Нуклеїнові кислоти

Клітини всіх живих організмів містять два види нуклеїнової кислоти — ДНК і РНК. ДНК являє собою двонитчату молекулу, а РНК — однонитчату. Двонитчата ДНК — це клітинний геном, що виконує функції зберігання й реплікації спадкоємної інформації. Однонитчата РНК представлена 3 класами молекул: 1) інформаційні РНК (іРНК) транскрипції, що утворюються в результаті транскрипції  генома й передають закладену в геномі інформацію на білоксинтезуючий апарат клітини; 2) рРНК, що є структурним елементом рибосоми; 3) тРНК, що поставляють амінокислоти до білоксинтезуючого апарату.

На відміну від клітин віруси містять лише один вид нуклеїнової кислоти — або РНК, або ДНК. І та, і інша може бути зберігачем спадкоємної інформації, виконуючи таким чином функції генома.

Вірусні нуклеїнові кислоти характеризуються різноманітністю форм. Вірусний геном може бути представлений як однонитковими, так і двонитковими молекулами РНК і ДНК. ДНК може бути як лінійною, так і кільцевою молекулою, РНК — як безперервною, так і фрагментованою і кільцевою молекулою.

Молекулярна маса вірусних ДНК варіює в широких межах від 106 до 250∙106. Найбільші вірусні геноми містять кілька сотень генів, а найменші містять інформацію, достатню для синтезу лише декількох білків.

У геномах, представлених двонитковими ДНК, інформація звичайно закодована на обох нитках ДНК. Це свідчить про максимальну економію генетичного матеріалу у вірусів, що є невід'ємною властивістю їх як генетичних паразитів. У зв'язку із цим оцінка генетичної інформації не може бути проведена за  молекулярною масою молекул.

Хоча в основному структура ДНК унікальна, тобто більшість нуклеотидних послідовностей зустрічаються лише по одному разу, однак на кінцях молекул є повтори, коли в кінцевому фрагменті лінійної ДНК повторюється її початкова ділянка. Повтори можуть бути прямими й інвертованими.

Здатність набувати кільцевої форми, яка потенційно закладена в кінцевих прямих і інвертованих повторах, має велике значення для вірусів. Кільцева форма забезпечує стійкість ДНК до екзонуклеаз. Стадія утворення кільцевої форми обов'язкова для процесу інтеграції ДНК із клітинним геномом. Нарешті, кільцеві форми являють собою зручний і ефективний спосіб регуляції транскрипції й реплікації ДНК.

У складі віріонів, що містять однонитчату ДНК, звичайно містяться молекули ДНК однієї полярності. Виключення становлять аденоасоційовані віруси, віріони яких містять ДНК або однієї полярності (умовно називаної «плюс»), або ДНК із протилежним знаком (умовно — «мінус»). Тому тотальний препарат вірусу складається із двох типів часток, що містять по одній молекулі «плюс»- або «мінус»-ДНК.

Інфекційний процес при зараженні цими вірусами виникає лише при проникненні в клітину часток обох типів.

Вірусні РНК

З декількох сотень відомих у цей час вірусів людину й тварин РНК-геном містить близько 80% вірусів. Здатність РНК зберігати спадкоємну інформацію є унікальною особливістю вірусу.

У просто організованих і деяких складно організованих  вірусів вірусна РНК під час відсутності білка може викликати інфекційний процес. Уперше інфекційна активність РНК вірусу тютюнової мозаїки була продемонстрована X. Френкель-Конратом і співавт. в 1957 р. і А. Гирером і Г. Шраммом в 1958 р. Згодом положення про інфекційну активність РНК було перенесено на всі РНК- вмісні віруси, однак зусилля довести це для таких вірусів, як віруси грипу, параміксовірусів, рабдовірусів ( так званих мінус-ниткових вірусів), виявилися безплідними: у цих вірусів інфекційною структурою є не РНК, а комплекс РНК із внутрішніми білками. Таким чином, геномна РНК може мати інфекційну активність залежно від своєї структури.

Структура вірусних РНК надзвичайно різноманітна. У вірусів виявлені однониткові й двониткові, лінійні, фрагментовані й кільцеві РНК. РНК-геном в більшості випадків є гаплоїдним, але геном ретровірусів — диплоїдний, тобто складається із двох ідентичних молекул РНК.

Однониткові РНК. Молекули однонитчатих вірусних РНК існують у формі одиночного полінуклеотидного ланцюга зі спіралізованими ДНК-подібними ділянками. При цьому некомплементарні нуклеотиди, що розділяють  комплементарні ділянки, можуть виводитися зі складу спіралізованих ділянок у формі різних «петель» і «виступів». Сумарний відсоток спіралізації вірусних РНК не виявляє яких-небудь особливостей у порівнянні з такими в клітинних РНК.

Віруси, що містять однониткові РНК, діляться на дві групи. У вірусів першої групи вірусний геном має функції інформаційної РНК, тобто може безпосередньо переносити закодовану в ньому інформацію на рибосоми. За пропозицією Д.  Балтімора (1971), РНК із властивостями інформаційної умовно позначена «плюс» і у зв'язку із цим віруси, що містять такі РНК (пікорнавіруси, тогавіруси, коронавіруси, ретровіруси), позначені як « плюс-ниткові» віруси, або віруси з позитивним геномом.

Друга група РНК-вмісних вірусів містить геном у вигляді однонитчатої РНК, яка сама не має функції іРНК. У цьому випадку функцію іРНК виконує РНК, комплементарна геному. Синтез цієї РНК (транскрипція) здійснюється в зараженій клітині на матриці геномної РНК за допомогою вірусспецифичного ферменту — транскриптази. У складі «мінус-ниткових» вірусів обов'язкова присутність власного ферменту, що здійснює транскрипцію геномної РНК і синтез іРНК, тому що аналога такого ферменту в клітинах немає. Геном цих вірусів умовно позначають як «мінус»-РНК, а віруси цієї групи як «минус-ниткові» віруси, або віруси з негативним геномом. До цих вірусів відносяться ортоміксовіруси, параміксовіруси, буньявіруси, рабдовіруси. РНК цих вірусів не здатна викликати інфекційний процес.

Відповідно до різних властивостей вірусних РНК між двома групами вірусів є й структурні відмінності. Оскільки РНК « плюс-ниткових» вірусів виконує функцію іРНК, вона має специфічні структурні особливості, характерні для 5'- і З'- кінців цих РНК.

5'-кінець клітинних і вірусних РНК звичайно має структуру так званої шапочки (по-англійському «сар»): являє собою 7-метилгуанін, приєднаний пірофосфатним зв'язком до гуанілового нуклеотида, цукровий залишок якого також метильован по другому вуглецевому атому. На 3'-кінці інформаційних РНК є полі (А), кількість яких досягає 200 і вище. Ці модифікації кінців іРНК, здійснювані після синтезу полінуклеотидного ланцюга, мають істотне значення для функції іРНК: «шапочка» потрібна для специфічного розпізнавання іРНК рибосомами, функції полі (А) менш точно визначені й, очевидно, полягають у додаванні стабільності молекулам іРНК.

Такі ж модифіковані кінці мають геномні РНК « плюс-ниткових» вірусів. Виключення представляє 5'-кінець геномної РНК вірусу поліомієліту, яка не містить «шапочку», і замість неї має на 5'-кінці ковалентно приєднаний до залишку урацила низькомолекулярний термінальний білок. Геномні РНК «мінус-ниткових» вірусів не мають ні «шапочки», ні полі (А); модифіковані кінці характерні для іРНК цих вірусів, що синтезуються в клітині на матриці віріонної РНК і комплементарних їй. Геномна РНК ретровірусів, хоча і є «плюс-нитьовою», однак не містить «шапочку»; цю структуру містить гомологична РНК, синтезована на матриці інтегрованої провірусної ДНК.

Існують віруси, що містять як « плюс-ниткові», так і «мінус-ниткові» РНК гени (амбісенс-віруси). До них відносяться аренавіруси.

В більшості випадків однониткові РНК є лінійними молекулами, однак РНК-фрагменти буньявірусів виявлені у вигляді кільцевої форми. Кільцева форма виникає за рахунок утворення водневих зв'язків між кінцями молекул.

Двониткові РНК. Цей незвичайний для клітини тип нуклеїнової кислоти, вперше виявлений у реовірусів, широко розповсюджений серед вірусів тварин, рослин і бактерій. Віруси, що містять подібний геном, називають диплорнавіруси.

Загальною особливістю диплорнавірусів є фрагментований стан генома. Так, геном реовірусів складається з 10 фрагментів, ротавірусів — з 11 фрагментів.

Розміри РНК ряду вірусів тварин наведені в табл. 4. Як можна побачити, молекулярна маса РНК варіює в широких межах.

Білки

У зараженій клітині вірусний геном кодує синтез двох груп білків: 1) структурних, які входять до складу вірусних часток потомства, і 2) неструктурних, які обслуговують процес внутрішньоклітинної репродукції вірусу на різних його етапах, але до складу вірусних часток не входять.

Структурні білки. Кількість структурних білків у складі вірусної частки варіює в широких межах залежно від складності організації віріона. Найбільш просто організований вірус тютюнової мозаїки містить усього один невеликий білок з молекулярною масою 17—18∙103, деякі фаги містять 2—3 білка, просто організовані віруси тварин — 3—4 білка. Складно влаштовані віруси, такі як віруси віспи, містять більш 30 структурних білків.

Структурні білки діляться на 2 групи:

1) капсидні білки, що утворюють капсид, тобто футляр для нуклеїнової кислоти вірусу, та входять до складу капсида геномні білки, і ферменти;

2) суперкапсидні білки, що входять до складу суперкапсида, тобто зовнішньої вірусної оболонки.

Оскільки суперкапсид називають також «пеплос», ці білки називають пепломерами.

Просто організовані віруси, що представляють собою нуклеокапсид, містять тільки капсидні білки. Складно організовані віруси містять капсидні й суперкапсидні білки.

Капсидні білки. Первісне уявлення про те, що капсидні білки є всього лише інертною оболонкою для вірусної нуклеїнової кислоти, склалося на підставі вивчення найбільш просто організованого вірусу тютюнової мозаїки, частка якого складається з однієї молекули РНК і одного типу білка, що утворює чохол для РНК. Однак таке уявлення неправильне. Хоча основною функцією капсидних білків  є функція захисту вірусного генома від негативних впливів зовнішнього середовища, у багатьох вірусів у складі капсида є білки й з іншими функціями. Тому термін «капсид» далеко виходить за межі уявлення про нього як про футляр або чохол для вірусної нуклеїнової кислоти.

У складі капсида деяких вірусів (пикорнавіруси, паповавіруси, аденовіруси) містяться білки, ковалентно пов'язані з вірусним геномом (геномні білки). Ці білки є термінальними, тобто з'єднаними з кінцем вірусної нуклеїнової кислоти. Функції їх нерозривно пов'язані з функціями генома і їх регуляцією.

У ряді складно організованих вірусів у складі капсида є ферменти, що здійснюють транскрипцію й реплікацію вірусного генома — РНК і ДНК (РНК- та ДНК-полимерази), а також ферменти, що модифікують кінці іРНК. Якщо ферменти й геномні білки представлені одиничними молекулами, то капсидні білки представлені множинними молекулами. Ці білки й формують капсидну оболонку, в яку у складно організованих вірусів вставлені молекули білків з іншими функціями.

Основним принципом будови капсидної оболонки вірусів є принцип субодиничности, тобто побудова капсидної оболонки із субодиниць-капсомерів, утворених  ідентичними поліпептидними ланцюгами. Правильно побудовані білкові субодиниці — капсомери виникають завдяки здатності вірусних капсидних білків до самозборки. Самозборка пояснюється тим, що впорядкована структура — капсид має найменшу вільну енергію в порівнянні з неупорядкованими білковими молекулами. Зборка капсидної оболонки із субодиниць запрограмована в первинній структурі білка й відбувається мимовільно або при взаємодії з нуклеїновою кислотою.

Принцип субодиничності в будові вірусного капсида є універсальною властивістю капсидних білків і має величезне значення для вірусів. Завдяки цій властивості досягається величезна економія генетичного матеріалу. Якби капсидна оболонка була побудована з різних білків, то на кодування її потрібна була б основна частина генетичної інформації, закладеної у вірусному геномі. У дійсності на кодування, наприклад, одного поліпептидного ланцюга вірусу тютюнової мозаїки, витрачається менш 10% генома. Далі, у механізмі самозборки закладена можливість контролю над повноцінністю вірусних поліпептидів: дефектні й чужорідні поліпептидні ланцюги при такому способі зборки віріонів будуть автоматично відкидатися.

Описана здатність до зборки в пробірці й у зараженій клітині характерна тільки для простих вірусів. Зборка складно організованих вірусів є набагато більш складним багатоступінчастим процесом, хоча окремі її етапи, наприклад формування капсидів і нуклеокапсидів, також засновані на самозборці.

Суперкапсидні білки. Глікопротеїди. Суперкапсидні білки, або пепломери, розташовуються в ліпопротеїдній оболонці (суперкапсиді або пеплосі) складно влаштованих вірусів. Вони або пронизують наскрізь ліпідний бішар як, наприклад, глікопротеїди альфа-вірусів (вірусу лісу Семлікі), або не доходять до внутрішньої поверхні. Ці білки є типовими внутрішньомембранними білками й мають багато загального із клітинними мембранними білками. Як і останні, суперкапсидні білки звичайно глікозильовані. Вуглеводні ланцюжки прикріплені до молекули поліпептиду в певних ділянках. Глікозилювання здійснюють клітинні ферменти, тому той самий вірус, що продукується різними видами клітин, може мати різні вуглеводні залишки: може варіювати як склад вуглеводів, так і довжина вуглеводного ланцюжка й місце прикріплення її до поліпептидного кістяка.

У більшості вірусів глікопротеїди формують «шипи» на поверхні вірусної частки, довжина яких досягає 7—10 нм. Шипи являють собою морфологічні субодиниці, побудовані з декількох молекул того самого білка. Віруси грипу мають два типи шипів, побудованих відповідно з гемаглютиніна та нейрамінідази. Параміксовіруси також мають два типи шипів, побудованих відповідно із двох глікопротеїдів (НІ й Р), рабдовіруси мають тільки один глікопротеїд і, відповідно, один тип шипів, а альфа-віруси мають два або три глікопротеїда, що формують один тип шипів.

Глікопротеїди є амфіпатичними молекулами: вони складаються із зовнішньої, гідрофільної частини, яка містить на кінці аміногрупу, і зануреної в ліпідний бішар, та гідрофобної частини, яка містить на зануреному кінці гідроксильну групу (С-кінець). С-кінцем поліпептид «заякорюється» у ліпідному бішарі. Є, однак, і виключення із цього загального положення: нейрамінідаза вірусу грипу взаємодіє з ліпідним бішаром не С-, а N-кінцем.

Основною функцією глікопротеїдів є взаємодія зі специфічними рецепторами клітинної поверхні. Завдяки цим білкам здійснюється розпізнавання специфічних клітинних рецепторів і прикріплення до них вірусної частки, тобто адсорбція вірусу на клітині. Тому глікопротеїди, що виконують цю функцію, називають вірусними прикріпними білками.

Іншою функцією глікопротеїдів є участь у злитті вірусної й клітинної мембран, тобто в події, що веде до проникнення вірусних часток у клітину. Вірусні білки злиття відповідальні за такі процеси, як гемоліз і злиття плазматичних мембран сусідніх клітин, що призводить до утворення гігантських клітин, синцитіїв і симпластів.

«Адресна функція» вірусних білків. Віруси викликають інфекційний процес у відносно невеликого кола хазяїв. Вірус повинен «впізнати» чутливу клітину, яка зможе забезпечити продукцію повноцінного вірусного потомства. Якби вірус проникав у будь-яку клітину, яка зустрілася на його шляху, це привело б до зникнення вірусів у результаті деструкції «батьківської» вірусної частки й відсутності вірусного потомства. У процесі еволюції у вірусів вироблялася так звана адресна функція, тобто пошук чутливого хазяїна серед нескінченного числа нечутливих клітин. Ця функція реалізується шляхом наявності спеціальних білків на поверхні вірусної частки, які впізнають специфічний рецептор на поверхні чутливої клітини.

Неструктурні білки. Неструктурні білки вивчені набагато гірше, ніж  структурні, оскільки їх виділяють не з очищених препаратів вірусів, а із заражених клітин, і виникають труднощі в їхній ідентифікації й очищенні від клітинних білків.

До неструктурних білків відносяться: 1) попередники вірусних білків, які відрізняються від інших неструктурних білків нестабільністю в зараженій клітині в результаті швидкого нарізування на структурні білки; 2) ферменти синтезу РНК і ДНК (РНК- і ДНК-полімерази), що забезпечують транскрипцію й реплікацію вірусного генома; 3) білки-регулятори; 4) ферменти, що модифікують вірусні білки, наприклад протеїнази й протеїнкінази.

Однак багато неструктурних білків при ряді вірусних інфекцій ще не ідентифіковані й функції їх не визначені.

Ліпіди

Ліпіди виявлені в складно організованих вірусів і в основному перебувають у складі ліпопротеїдної оболонки (суперкапсида),  формуючи її ліпідний бішар, у який вставлені суперкапсидні білки.

Усі складно організовані РНК-вмісні віруси мають у своєму складі значну кількість ліпідів ( від 15 до 35% від сухої ваги). Із ДНК-вмісних вірусів ліпіди містять віруси віспи, герпеса й гепатиту В (табл. 5). Приблизно 50—60% ліпідів у складі вірусів представлені фосфоліпідами, 20—30% становить холестерин. Ліпідний компонент стабілізує структуру вірусної частки. Екстракція ліпідів органічними розчинниками, обробка вірусної частки детергентами або ліпазами приводить до деградації вірусної частки й втрати інфекційної активності.

Віруси, що містять ліпопротеїдну мембрану, формуються шляхом брунькування на плазматичній мембрані клітин (або на мембранах ендоплазматичної сітки з виходом у внутрішньоклітинні вакуолі). Тому ліпопротеїдна оболонка цих вірусів являє собою мембрану клітини хазяїна, модифіковану за рахунок наявності на її зовнішній поверхні вірусних суперкапсидних білків. Із цього випливає, що склад ліпідів, вірусів, які брунькуються, близький до складу ліпідів клітини-хазяїна. До вірусів, що брунькуються, відносяться великі РНК-вмісні віруси: ортоміксовіруси, параміксовіруси, рабдовіруси, тогавіруси, ретровіруси, буньявіруси, аренавіруси, коронавіруси. У зв'язку із клітинним походженням ліпідів загальний склад ліпідної фракції й зміст її окремих компонентів у того самого вірусу можуть суттєво різнитися залежно від клітини хазяїна, де відбувалася репродукція вірусу. Навпаки, якщо різні віруси, що брунькуються, репродукувалися в тих самих клітинах, їх ліпіди виявляються більш-менш подібними.

У вірусів віспи й гепатиту В ліпіди мають інше походження, тому що ці віруси не брунькуються крізь плазматичну мембрану. У вірусів віспи ліпіди не утворюють диференційованої оболонки. Обробка вірусу осповакцини ефіром не приводить до втрати інфекційної активності або яким-небудь структурним змінам віріона. Ліпіди вірусу гепатиту В и його НВ-Антигену утворюються шляхом інвагінації мембран ендоплазматичної сітки. Вірус герпеса формується шляхом брунькування крізь  ядерну оболонку, тому в його складі є ліпіди ядерної оболонки.

Вуглеводи

Вуглеводний компонент вірусів знаходиться в складі глікопротеїдов. Кількість цукрів у складі глікопротеїдов може бути досить великим, досягаючи 10—13% від маси віріона. Хімічна специфічність їх повністю визначається клітинними ферментами, що забезпечують перенос і приєднання відповідних цукрових залишків. Звичайними цукровими залишками, що виявляються у вірусних білках, є фруктоза, сахароза, маноза, галактоза, нейрамінова кислота, глюкозамін. Таким чином, подібно ліпідам, вуглеводний компонент визначається клітиною-хазяїном, завдяки чому той самий вірус, вирощений у клітинах різних видів, може значно різнитися за складом цукрів залежно від специфічності клітинних глікозілтрансфераз.

Вуглеводний компонент глікопротеїдів відіграє істотну роль у структурі й функції білка. Він є каркасом для локальних ділянок глікопротеїда, забезпечуючи збереження конформації білкової молекули, і обумовлює захист молекули від протеаз. Можливі й інші функції вуглеводів, які поки вірогідно не встановлені.

Компоненти клітини-хазяїна

У складі віріонів можуть перебувати компоненти клітини-хазяїна. До таких компонентів можуть відноситися білки й навіть цілі клітинні структури. Так, наприклад, у складі ряду оболонкових вірусів може перебувати білок цитоскелета актин, у складі паповавірусів містяться клітинні гістони. Ряд вірусів містить клітинні ферменти, наприклад протеїнкінази. У складі аренавірусів виявлені рибосоми.

Клітинні компоненти можуть включатися у віріон випадково або закономірно. У деяких випадках вони відіграють істотну роль у репродукції вірусу, як, наприклад, гістони в репродукції паповавірусів.

Модуль 2.

Змістовний модуль І. Взаємодія вірусів з клітинами.

Тема 1. Форми та механізми взаємодіїі вірусів різних груп з клітиною-хазяїном. Літичний та лізогенний тип взаємодії.

Взаємодія вірусу із клітиною починається із процесу адсорбції, тобто прикріплення вірусних часток до клітинної поверхні. Процес адсорбції можливий при наявності відповідних рецепторів на поверхні клітини та субстанцій що їх пізнають, на поверхні вірусу. Самі початкові процеси адсорбції мають неспецифічний характер, і в основі їх може лежати електростатична взаємодія позитивно й негативно заряджених груп на поверхні вірусу й клітини. Однак впізнавання клітинних рецепторів вірусними білками, що веде до прикріплення вірусної частки до клітини, є високо специфічним процесом. Білки на поверхні вірусу, що пізнають специфічні групи на плазматичній мембрані клітини й зумовлюють прикріплення до них вірусної частки, називаються прикріпними білками.

Віруси використовують рецептори, призначені для проходження в клітину необхідних для її життєдіяльності речовин: поживних речовин, гормонів, факторів росту і т.д. Рецептори можуть мати різну хімічну природу і являти собою білки, вуглеводний компонент білків і ліпідів, ліпіди. Рецепторами для вірусів грипу й параміксовірусів є сіалова кислота в складі глікопротеїдов і гліколіпідів (гангліозидів), для рабдовірусів і реовірусів — також вуглеводний компонент у складі білків і ліпідів, для пікорна- та  аденовірусів — білки, для деяких вірусів — ліпіди. Специфічні рецептори відіграють роль не тільки в прикріпленні вірусної частки до клітинної поверхні. Вони визначають подальшу долю вірусної частки, її внутрішньоклітинний транспорт і доставку в певні ділянки цитоплазми і ядра, де вірус здатний ініціювати інфекційний процес. Вірус може прикріпитися й до неспецифічних рецепторів і навіть проникнути в клітину, однак тільки прикріплення до специфічного рецептора призведе до виникнення інфекції.

Прикріплення вірусної частки до клітинної поверхні спочатку відбувається шляхом утворення одиничного зв'язку вірусної частки з рецептором. Однак таке прикріплення нестійке, і вірусна частка може легко відірватися від клітинної поверхні (оборотна адсорбція). Для того щоб настала необоротна адсорбція, повинні з'явитися множинні зв’язку між вірусною часткою й багатьма молекулами рецепторів, тобто повинно відбутися стабільне мультивалентне прикріплення. Кількість молекул клітинних рецепторів у ділянках адсорбції може доходити до 3000. Стабільне зв'язування вірусної частки із клітинною поверхнею в результаті мультивалентного прикріплення відбувається завдяки можливості вільного переміщення молекул рецепторів у ліпідному бішарі плазматичної мембрани, яке визначається рухливістю, «тікучістю» білково-ліпідного шару. Збільшення тікучості ліпідів є одним з найбільш ранніх подій при взаємодії вірусу із клітиною, наслідком якого є формування рецепторних полів у місці контакту вірусу із клітинною поверхнею й стабільне прикріплення вірусної частки до виниклих груп — необоротна адсорбція.

Кількість специфічних рецепторів на поверхні клітини коливається між 104 і 105 на одну клітину. Рецептори ряду вірусів можуть бути представлені лише в обмеженому наборі клітин-хазяїв, і цим може визначатися чутливість організму до даного вірусу. Наприклад, пікорнавіруси адсорбуються тільки на клітинах приматів. Рецептори для інших вірусів, навпаки, широко представлені на поверхні клітин різних видів, як, наприклад, рецептори для ортоміксовірусів і параміксовірусів, що представляють собою сіалілвмісні сполуки. Тому ці віруси мають відносно широкий діапазон клітин, на яких може відбуватися адсорбція вірусних часток. Рецептори для ряду тогавірусів мають клітини винятково широкого кола хазяїв: ці віруси можуть адсорбуватися й інфікувати клітини як хребетних, так і безхребетних.

Наявність специфічних рецепторів на поверхні клітини в ряді випадків обумовлює феномен залежного від хазяїна обмеження, тобто здатність вірусу заражати лише певні види тварин. У цілому обмеження при взаємодії рецепторних систем вірусу й клітини біологічно виправдані й доцільні, хоча в ряді випадків вони є «перестраховкою». Так, багато ліній клітин, стійких до вірусів поліомієліту й Коксакі, можна заразити депротеїнізованими препаратами РНК, виділеними із цих вірусів. Таке зараження клітин іде в обхід природніх вхідних шляхів інфекції через взаємодію із клітинними peцепторами. Відома потенційна здатність вірусів тварин реплікуватися в протопластах дріжджів, грибів і бактерій, а бактеріофагів — у клітинах тварин. Таким чином, вірусні ДНК і РНК мають здатність заражати і більш широке коло хазяїв, ніж віруси.

Вірусні прикріпні білки. Прикріпні білки можуть перебувати в складі унікальних органел, таких як структури відростка у Т-бактеріофагів або фібри у аденовірусів, які добре видні в електронному мікроскопі; можуть формувати морфологічно менше виражені, але не менш унікальні аранжування білкових субодиниць на поверхні вірусних мембран, як, наприклад, шипи в оболонкових вірусів, «корону» у коронавірусів.

Просто організовані віруси тварин містять прикріпні білки в складі капсида. У складно організованих вірусів ці білки входять до складу суперкапсида й представлені багатьма молекулами. Наприклад, у вірусу лісу Семлікі (альфа-вірус) є 240 молекул глікопротеїда в одному віріоні, у вірусу грипу — 300—450 гемаглютинуючих субодиниць, у реовіруса — 24 молекули білка про-1, у  аденовіруса — 12 фібрів.

Проникнення вірусів у клітину

Історично склалося уявлення про два альтернативних механізма  проникнення в клітину вірусів тварин — шляхом віропексиса (ендоцитоза) і шляхом злиття вірусної й клітинної мембран. Однак оба ці механізма не виключають, а доповнюють один одного.

Термін «віропексис», запропонований в 1948 р. Фазекасом де сан Гро, означає, що вірусна частка попадає в цитоплазму в результаті інвагінації ділянки плазматичної мембрани й утворення вакуолі, яка містить вірусну частку.

Рецепторний ендоцитоз. Віропексис являє собою окремий випадок рецепторного або адсорбційного ендоцитоза. Цей процес є звичайним механізмом, завдяки якому в клітину надходять поживні й регуляторні білки, гормони, ліпопротеїни та інші речовини з позаклітинної рідини. Рецепторний ендоцитоз відбувається в спеціалізованих ділянках плазматичної мембрани, де є спеціальні ямки, покриті з боку цитоплазми особливим білком з великою молекулярною масою — клатрином. На дні ямки розташовуються специфічні рецептори. Ямки забезпечують швидку інвагінацію й утворення покритих клатрином внутрішньоклітинних вакуоль. Напівперіод проникнення речовини усередину клітини за цим механізмом не перевищує 10 хв із моменту адсорбції. Кількість  вакуоль, що утворюються за одну хвилину, досягає 2000. Таким чином, рецепторний ендоцитоз являє собою добре влаштований механізм, який забезпечує швидке проникнення в клітину чужорідних речовин.

Покриті вакуолі зливаються з іншими, більшими цитоплазматичними вакуолями, утворюючи рецептосоми, що містять рецептори, але не містять клатрину, а ті у свою чергу зливаються з лізосомами. Прониклі таким шляхом в клітину білки звичайно транспортуються в лізосоми, де відбувається їхній розпад на амінокислоти; вони можуть і обминати лізосоми, і накопичуватися в інших ділянках клітини в недеградованій формі. Альтернативою рецепторного ендоцитоза є рідинний ендоцитоз, коли інвагінація відбувається не в спеціалізованих ділянках мембрани.

Більшість оболонкових і безоболонкових вірусів тварин проникає в клітину за механізмом рецепторного ендоцитоза. Ендоцитоз забезпечує внутрішньоклітинний транспорт вірусної частки в складі ендоцитарної вакуолі, оскільки вакуоль може рухатися в будь-якому напрямку й зливатися із клітинними мембранами (включаючи ядерну мембрану), звільняючи вірусну частку у відповідних внутрішньоклітинних ділянках. Таким шляхом, наприклад, ядерні віруси попадають у ядро, а реовіруси — у лізосоми. Однак прониклі в клітину вірусні частки перебувають у складі вакуолі й відділені від цитоплазми її стінками. Їм треба буде пройти ряд етапів, перш ніж вони зможуть викликати інфекційний процес.

Злиття вірусної й клітинної мембран. Для того щоб внутрішній компонент вірусу міг пройти крізь клітинну мембрану, вірус використовує механізм злиття мембран. В оболонкових вірусів злиття обумовлене крапковою взаємодією вірусного білка злиття з ліпідами клітинної мембрани, у результаті якого вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує із клітинною мембраною, а внутрішній компонент вірусу виявляється по іншу її сторону. У безоболонкових вірусів один з поверхневих білків також взаємодіє з ліпідами клітинних мембран, у результаті чого внутрішній компонент проходить через мембрану. Більшість вірусів тварин виходить у цитозоль з рецептосоми.

Якщо при ендоцитозі вірусна частка є пасивним пасажиром, то при злитті вона стає активним учасником процесу. Білком злиття є один з її поверхневих білків. До теперішнього часу цей білок ідентифікований лише в параміксовірусів і ортоміксовірусів. У параміксовірусів цей білок ( Р-Білок) являє собою один із двох глікопротеїдів, що перебувають на поверхні вірусної частки.

Функцію білка злиття у вірусу грипу виконує мала гемаглютинуюча  субодиниця, НА2.

Параміксовіруси викликають злиття мембран при нейтральному рН, і внутрішній компонент цих вірусів може проникати в клітину безпосередньо крізь  плазматичну мембрану. Однак більшість оболонкових і безоболонкових вірусів викликають злиття мембран тільки при низькому значенні рН — від 5,0 до 5,75. Якщо до клітин додати слабкі основи (хлорид амонію, хлороквін і ін.), які в ендоцитарних вакуолях підвищують рН до 6,0, злиття мембран не відбувається , вірусні частки залишаються у вакуолях, і інфекційний процес не виникає. Сувора залежність злиття мембран від значень рН обумовлена конформаційними змінами вірусних білків злиття.

У лізосомі постійним є низьке значення рН (4,9). В ендоцитарній вакуолі (рецептосомі) закислення створюється за рахунок АТФ-залежного «протонового насоса» ще на клітинній поверхні при утворенні покритої вакуолі. Закислення ендоцитарної вакуолі має велике значення для проникаючих у клітину фізіологічних лігандів, тому що низьке значення рН сприяє дисоціації ліганда від рецептора й рециркуляції рецепторів.

Той же механізм, який лежить в основі злиття вірусних і клітинних мембран, обумовлює індукований вірусами гемоліз і злиття плазматичних мембран клітин, що прилягають  один до одного,  з утворенням багатоядерних клітин, симпластів і синцитіїв. Віруси викликають два типи злиття клітин: 1) «злиття ззовні» і 2) «злиття зсередини». «Злиття ззовні» відбувається при високій множинності інфекції й виявляється протягом перших годин після зараження. Цей тип злиття, описаний для параміксовірусів, обумовлений білками вірусу і не вимагає внутрішньоклітинного синтезу вірусних компонентів. Навпаки, «злиття зсередини» відбувається при низькій множинності інфекції, виявляється на порівняно пізніх стадіях інфекційного процесу й обумовлене синтезованими знову вірусними білками. «Злиття зсередини» описане для багатьох вірусів: вірусів герпеса, онковірусів, збудників повільних інфекцій і ін. Цей тип злиття викликають ті ж вірусні глікопротеїди, які забезпечують проникнення вірусу в клітину.

Тема 2. Взаємодія бактеріофагів з клітиною-хазяїном.

Літичний цикл інфекції починається з того, що частинка бактеріофагу випадково зіштовхується з клітиною-хазяїном. Якщо у віріону є ділянка адсорбції, хімічно комплементарна специфічній рецепторній ділянці на повехні бактеріальної клітини, то виникає необоротна адсорбція. Рецептори для одних фагів грамнегативних бактерій знаходяться в ліпопротеїдному зовнішньому шарі клітинної стінки, для інших – в ліпополісахаридному шарі. Для ряду фагів рецептори знаходяться на відростках клітин – джгутиках та пілях. Такі фаги, які приєднались, зісковзують потім до основи джгутика та ін’єкують далі свою нуклеїнову кислоту через клітинну стінку.

Цей процес вивчений на Т-парних фагах, які мають здатний скорочуватися чохол хвостового відростку. Після того, як нитки відростка адсорбувались, чохол скорочується і стриень відростка проходить крізь клітинну стінку. Коли кінчик стрижня досягає мембрани клітини, то ДНК в головці фага впорскується під стінку. Цей механізм Т-парних фагів, який діє як шприць, є унікальним. Яким чином долають клітинну стінку інші фаги і як фагова ДНК проникає через мембрану клітини – залишається невідомим.

Такий процес проникнення, коли білки капсиду залишаються зовні клітинної стінки, як це має місце у випадку Т-парних фагів, вважався характерним для всіх бактеріофагів. Однак, у деяких фагів механізм проникнення зовсім інший. Так у ниткоподібних (спіральних) фагів, які містять одноланцюгову ДНК, основний білок спірального капсиду проходить через клітинну стінку і залишається на (або в) клітинній мембрані, а мінорний білок оболонки, А-білок, проникає разом з фаговою ДНК в цитоплазму.

Застосування електронної мікроскопії, методу мічених атомів та інших методів дало змогу докладно вивчити взаємодію фагів з бактеріальними клітинами. В цьому процесі розрізняють два типи взаємодії — літичний і лізогенний. Перший закінчується лізисом (руйнуванням) ураженої клітини і призводить до виходу дозрілих фагових частинок з клітини, а другий не руйнує уражену клітину, а робить її своєрідним носієм фага.

Літичний тип взаємодії фагів з бактеріями часто ще називають (як і для інших вірусів) продуктивною інфекцією. При такому типі взаємодії фага з клітиною хазяїна розрізняють чотири стадії або етапи: 1) адсорбцію фагів на поверхні бактеріальних клітин; 2) проникнення активного вмісту (нуклеїнової кислоти) в бактеріальну клітину; 3) латентний період (екліпс) внутрішньоклітинного розвитку фага; 4) руйнування (лізис) клітини і вихід з неї новоутворених фагів.

Найкраще вивчено першу стадію розмноження фагів — адсорбцію. Фаги, які мають відростки, адсорбуються на поверхні фагочутливих бактерій дистальним кінцем цих відростків, а базальна пластинка з шипами і нитками забезпечує тісний контакт. Фаги можуть прикріплятися до різних ділянок клітини, джгутиків, ворсинок чи інших виростів. Адсорбція фагів на клітинах — специфічна реакція. Вона зумовлюється утворенням тісного зв'язку між спеціальним рецепторним апаратом фага і специфічними рецепторами клітини. Фагорецептори бактеріальної клітини є складними антигенними комплексами або структурами, які розташовані в різних ділянках і шарах клітинної стінки.

Адсорбцію фагів на сприйнятливих до них бактеріях можна спостерігати в електронний мікроскоп. Вона залежить від фізичних і хімічних властивостей середовища, температури, природи фага, фізіологічного стану бактерій, а також від їхніх антигенних структур.

Після адсорбції фага на поверхні бактерій за допомогою фермен-та типу лізоцима, який міститься в нижній частині відростка, відбувається розчинення клітинної стінки, і в цей невеличкий отвір кінець відростка, стискуючись (завдяки енергії АТФ), як шприц, впорскує нуклеїнову кислоту головки фага в бактеріальну клітину. Білкова оболонка фага залишається на поверхні бактерії і подальшої участі в розмноженні фага не бере. Слід зазначити, що ще досі детально не з'ясовано механізм уведення нуклеїнової кислоти у фаго-чутливу клітину фагами, які не мають відростків, а також тими фага-ми, в яких відростки не скорочуються

З моменту проникнення генома фага в бактерію починається третя стадія його взаємодії з клітиною — латентний (прихований) період внутрішньоклітинного розмноження фага. Тривалість цього періоду в різних фагів триває від 15—40 хв до 5 год. і більше. У цій стадії нуклеїнова кислота фага, завдяки закодованій у ній інформації, спричинює швидку перебудову внутрішніх процесів у бактеріальній клітині, повністю спрямовуючи їх на утворення нових частинок фага.

На початку третьої стадії розмноження, у екліпс-фазі, виявити в зараженій клітині вегетативний фаг не вдається. Проте саме в цей час під його впливом відбувається пригнічення функції синтезу низки клітинних ферментів і водночас індукується утворення фагових ферментів або так званих «ранніх» білків, які каталізують процеси реплікації фагової ДНК з використанням нуклеїнових кислот самої бактеріальної клітини.

Дещо пізніше в клітині починається синтез «пізніх» білків, які являють собою структурні білки фагів. У результаті агрегації таких білків відбувається побудова окремих елементів нових фагів: головок, відростків, базальних пластинок тощо. Після утворення всіх компонентів фага здійснюється складання дозрілих віріонів фага відповідної форми. Залежно від виду фага, стану бактеріальної клітини та інших чинників у одній клітині може утворитися від кількох десятків до кількох сотень фагових частинок.

Отже, в результаті дії вегетативного фага у зараженій бактерії з'являється значна кількість нових корпускул фагів і ми говоримо про репродукцію фагів бактеріальною клітиною на основі генетичної інформації, заданої нуклеїновою кислотою батьківського фага. Саме в цьому й виявляється своєрідна форма паразитизму фагів на субклітинному молекулярному рівні.

Внутрішньоклітинний розвиток у фагів, які містять різні типи нуклеїнової кислоти, дещо відрізняється за характером її реплікації, зокрема, одноланцюгова ДНК і РНК фага спочатку повинні набути дволанцюгової реплікативної форми, а вже після цього в клітині нагромаджуються нові молекули відповідної фагової нуклеїнової кислоти.

Водночас із формуванням дозрілих віріонів у бактеріальній клітині утворюються літичні ферменти, детерміновані нуклеїновою кислотою фага. Ці ферменти можуть розкладати цупкий пептидо-глікановий шар клітинної стінки; з їхньою допомогою здійснюється четверта стадія взаємодії фага з бактеріальною клітиною — лізис клітинної стінки і вихід нового потомства бактеріофагів назовні.

Рис. 2. Схема циклу розмноження бактеріофага Т2:

І — фаги оточили бактерію; 2 — віріон фага прикріплюється до клітини; 3 — в клітину впорскується вірусна ДНК; 4 — капсид фага залишається ззовні бактерії; 5 — синтезуються нові молекули ДНК; 6 — утворюються білкові оболонки фагів;  7 — відбувається збирання нових віріонів; 8 — бактерія руйнується (лізується), і віріони фага виходять назовні

Літичний, або продуктивний, цикл розвитку характерний для вірулентних фагів, які є справжніми паразитами бактерій. Однак у природі поширеними е й так звані помірні фаги. При зараженні ними бактерій гине тільки невелика частина клітин, а решта нормально розмножується і стає носіями відповідних помірних або симбіотичних фагів. Явище фагоносіння бактеріями дістало назву лізогенії.

Докладне вивчення показало, що існують псевдолізогенні та справжньолізогенні бактеріальні культури. Переважна більшість клітин першого типу є стійкою до цього фага і тільки невеличка кількість їх може заражатися фагом і давати його репродукцію. Справжньолізогенні — це культури, в яких кожна бактерія несе в собі фаг у певній прихованій формі і може за відповідних умов репродукувати його.

Встановлено, що особлива форма фага, яка перебуває у справжньо-лізогенних бактеріях (профаг) є нуклеїновою кислотою (геном фага), яка тісно інтегрована з генетичним матеріалом бактеріальної клітини, і в разі поділу бактерії передається її потомству. Отже, в лізоген-ній клітині профаг поводить себе як нормальний її компонент.

Важливою властивістю лізогенної культури є її стійкість до фагів, які містяться в ній. У зв'язку з цим вивчення помірних фагів лізогенної культури можливе тільки тоді, коли є інша культура цього виду, чутлива до помірного фага даної лізогенної культури. Такі культури дістали назву індикаторних.

Лізогенія дуже поширена серед усіх систематичних груп мікробів. Вона спостерігається у збудників черевного тифу і паратифу, дифтерійної палички, спороносних і бульбочкових бактерій, дріжджів, пе-ніцилу тощо.

Профаг лізогенної культури може спонтанно або в разі індукції перетворитися на дозрілий бактеріофаг. Натомість у деяких випадках під впливом різних чинників у профага виникають мутації, в результаті яких при індукції він не здатний перетворюватися на повноцінну фагову частинку. Внаслідок цього в середовище можуть виділятися дефектні фаги, що складаються тільки з однієї головки або відростка. Такі фаги можуть адсорбуватися на бактеріях, але не можуть розмножуватися у них. Дефектні фаги привернули до себе увагу вчених, оскільки, як виявилось, багато описаних бактеріоцинів є дефектними фагами. Дефектна лізогенія дуже поширена в природі.

Останніми роками одержано цікаві дані не тільки з вивчення суті лізогенії, а й щодо з'ясування ролі профагів як додаткових генетичних факторів. Зміни, які зумовлюються помірними фагами в лізоген-ній клітині, дістали назву лізогенних конверсій. Слід зазначити, що немало досягнень сучасної генетики і молекулярної біології ґрунтується на вивченні явищ спадковості і мінливості у фагів, оскільки помірним фагам властиве явище трансдукції.

Тема 3. Особливості розмноження вірусів тварин.

Роздягання

Прониклі в клітину вірусні частки повинні роздягнутися для того, щоб викликати інфекційний процес. Зміст роздягання полягає у видаленні вірусних захисних оболонок, які перешкоджають експресії вірусного генома. У результаті роздягання звільняється внутрішній компонент вірусу, який здатен викликати інфекційний  процес.   Роздягання   супроводжується рядом характерних особливостей: у результаті розпаду вірусної частки зникає інфекційна активність, у ряді випадків з'являється чутливість до нуклеаз, виникає стійкість до нейтралізуючої дії антитіл, втрачається фоточутливість при використанні ряду препаратів.

Кінцевими продуктами роздягання є серцевини,  нуклеокапсиди  або  нуклеїнові  кислоти.  Для ряду вірусів було показано, що продуктом роздягання являються не голі нуклеїнові кислоти, а нуклеїнові кислоти, пов'язані із внутрішнім вірусним білком. Наприклад, кінцевим продуктом роздягання пікорнавірусів є РНК, ковалентно пов'язана з білком Vpg, кінцевим продуктом роздягання аденовірусів, вірусу поліоми та SV40 є ДНК, ковалентно пов'язана з одним із внутрішніх вірусних білків.

У ряді випадків здатність вірусів викликати інфекційний процес визначається можливістю їх роздягання в клітині даної системи. Тим самим ця стадія є однієї зі стадій, що лімітують інфекцію.

Роздягання ряду вірусів відбувається в спеціалізованих ділянках усередині клітини (лізосомах, структурах апарата Гольджі, навколоядерному просторі, ядерних порах на ядерній мембрані). При злитті вірусної й клітинної мембран проникнення в клітину сполучається з роздяганням.

Роздягання й внутрішньоклітинний транспорт є взаємозалежними процесами: при порушенні правильного внутрішньоклітинного транспорту до місць роздягання вірусна частка попадає в лізосому та руйнується лізосомальними ферментами.

Проміжні форми при роздяганні. Роздягання вірусної частки здійснюється поступово в результаті серії послідовних реакцій. Наприклад, у процесі роздягання пікорнавіруси проходять ряд стадій з утворенням проміжних субвірусних часток з розмірами від 156 S до 12 S. Роздягання вірусів ECHO має наступні стадії: віріони (156 S) -> А-Частки (130 S) -> РНК і порожні капсиди (80 S) РНК із термінальним білком (12 S). Роздягання аденовірусів відбувається в цитоплазмі і ядерних порах і має принаймні 3 стадії: 1) утворення субвірусних часток з більшою щільністю, ніж  віріони; 2) утворення серцевин, у яких відсутні 3 вірусних білка; 3) утворення ДНК-білкового комплексу, у якому ДНК ковалентно з'єднана з термінальним білком. Вірус поліоми в процесі роздягання втрачає зовнішні білки й перетворюється в субвірусну частку з коефіцієнтом седиментації 48 S. Потім частки зв'язуються з ядерними білками (гістонами) і формується 190 S комплекс (з коефіцієнтом седиментації 190 S), здатний викликати інфекційний процес. Вірус грипу спочатку втрачає ліпопротеїдну оболонку й перетворюється в субвірусну частку, з якої після видалення М-білка звільняється нуклеокапсид.

Транскрипція

Транскрипція — це перепис ДНК на РНК за законами генетичного коду. Це означає, що РНК складається з нуклеотидних послідовностей, комплементарних ДНК. Нитки ДНК у ділянці транскрипції розділяються й функціонують як матриці, до яких приєднуються комплементарні нуклеотиди завдяки спарюванню комплементарних основ (аденін зв'язується з тиміном, урацил — з аденіном, гуанін — із цитозином і цитозин — з гуаніном). Транскрипція здійснюється за допомогою спеціального ферменту — РНК-полімерази, який зв'язує нуклеотиди шляхом утворення 3'-5'-фосфодіефірних містків. Таке зв'язування відбувається лише при наявності ДНК-матриці.

Продуктами транскрипції в клітині є іРНК. Сама клітинна ДНК, що є носієм генетичної інформації, не може безпосередньо програмувати синтез білка. Передачу генетичної інформації від ДНК до рибосом здійснює РНК-посередник. На цьому заснована центральна догма молекулярної біології, яка виражається наступною формулою:

Транскрипція→трансляція
ДНК → РНК → білок,

де стрілки показують напрямок переносу генетичної інформації.

Реалізація генетичної інформації у вірусів. Стратегія вірусного генома відносно синтезу іРНК у різних вірусів різна. У ДНК-вмісних вірусів іРНК синтезується на матриці однієї з ниток ДНК. Формула переносу генетичної інформації в них така ж, як і в клітині.

транскрипція→трансляція
ДНК→ РНК → білок.

ДНК-вмісні віруси, репродукція яких відбувається в ядрі, використовують для транскрипції клітинну полімеразу. До цих вірусів відносяться паповавіруси, аденовіруси, віруси герпеса. ДНК-вмісні віруси, репродукція яких відбувається в цитоплазмі, не можуть використовувати клітинний фермент, що знаходиться в ядрі. Транскрипція їх генома здійснюється вірусспецифічним ферментом — ДНК-полімеразой, яка проникає в клітину в складі вірусу. До цих вірусів відносяться віруси віспи й іридовіруси.

РНК-вмісні віруси, у яких зберігачем генетичної інформації є не ДНК, а РНК, вирішують цю проблему особливим образом. У РНК-вмісних «плюс-ниткових» вірусів, у яких функції іРНК виконує сам геном, передача генетичної інформації здійснюється за найбільш простою формулою:

РНК→білок

До цієї групи вірусів відносяться пікорнавіруси, тогавіруси, коронавіруси. В них немає необхідності в акті транскрипції для синтезу вірусспецифічних білків. Тому транскрипцію як самостійний процес у цих вірусів не виділяють. Інакше  справа у вірусів, геном яких не може виконувати функцію іРНК. У клітині синтезується комплементарна геному РНК, яка і є інформаційною. Передача генетичної інформації у цих вірусів здійснюється по формулі:

РНК→РНК білок

У цих вірусів транскрипція виділена як самостійний процес в інфекційному циклі. До них відносяться дві групи вірусів тварин.

Віруси, геном яких представлений однонитчатою РНК: ортоміксовіруси, параміксовіруси, рабдовіруси, буньявіруси. Оскільки геномна РНК цих вірусів є «мінус-ниткою», зазначену групу вірусів називають «мінус-нитковими» вірусами.

Віруси, геном яких представлений двонитчатою РНК (діплорнавіруси). Серед вірусів тварин до них відносяться реовіруси.

У клітині немає ферменту, який може полімеризувати нуклеотиди на матриці РНК. Цю функцію виконує вірусспецифічний фермент — РНК-полімераза, або транскриптаза, яка міститься в складі вірусів і разом з ними проникає в клітину.

Серед РНК-вмісних вірусів тварин є сімейство ретровірусів, які мають унікальний шлях передачі генетичної інформації. РНК цих вірусів переписується на ДНК, ДНК інтегрує із клітинним геномом і в його складі переписується на РНК, яка має інформаційні функції. Шлях передачі генетичної інформації в цьому випадку здійснюється по більш складній формулі:

РНК → ДНК → РНК → білок

У складі цих вірусів є унікальний вірусспецифічний фермент, який переписує РНК на ДНК. Цей процес називається зворотною транскрипцією, а фермент — зворотна транскриптаза, або ревертаза. Той же фермент синтезує нитку ДНК на матриці ДНК. Двонитчата ДНК після замикання в кільце інтегрує із клітинним геномом, і транскрипцію інтегрованої ДНК у складі клітинних геномів здійснює клітинна РНК-полімераза. Оскільки іРНК ретровірусів гомологічна геномній РНК (а не комплементарна їй), ретровіруси є «плюс-нитковими» вірусами.

Ферменти, що транскрибують вірусний геном. Транскрипція ряду ДНК-вмісних вірусів — паповавірусів, аденовірусів, вірусів герпеса, парвовірусів, гепадна-вірусів здійснюється в ядрі клітини, і в цьому процесі широко використовуються механізми клітинної транскрипції — ферменти транскрипції й подальшої модифікації транскриптів. Транскрипція цих вірусів здійснюється клітинною РНК-полімеразою ІІ — ферментом, який здійснює транскрипцію клітинного генома. Однак особлива група транскриптів аденовірусу синтезується за допомогою іншого клітинного ферменту — РНК-полімерази III. У двох інших сімейств ДНК-вмісних вірусів тваринних вірусів віспи й іридовірусів — транскрипція відбувається в цитоплазмі. Оскільки в цитоплазмі немає клітинних полімераз, транскрипція цих вірусів потребує спеціального вірусного ферменту — вірусної РНК-полімерази. Цей фермент є структурним вірусним білком.

У РНК-вмісних вірусів транскрипція здійснюється вірусспецифічними транскриптазами, тобто ферментами, закодованими у вірусному геномі. Вірусспецифічні транскриптази можуть бути як структурними білками, що входять до складу віріона (ендогенна транскриптаза), так і неструктурними білками, які синтезуються в зараженій клітині, але не включаються у віріон.

Транскрипція в зараженій клітині. Синтез комплементарних РНК на батьківських матрицях за допомогою батьківської транскриптази називається первинною транскрипцією на відміну від вторинної транскрипції, що відбувається на більш пізних стадіях інфекційного циклу на знову синтезованих, дочірніх матрицях, за допомогою вдруге синтезованої транскриптази. Більша частина іРНК у зараженій клітині є продуктом вторинної транскрипції.

Транскриптивні комплекси. У складно влаштованих РНК-вмісних вірусів тварин транскрипція відбувається не на матриці голої РНК, а в складі вірусних нуклеокапсидів або серцевин (транскриптивні комплекси). Пов'язані з геномом капсидні білки не тільки не перешкоджають транскрипції, але й необхідні для неї, забезпечуючи правильну конформацію тяжа РНК, захист його від клітинних протеаз, зв'язок окремих фрагментів генома один з одним, а також регуляцію транскрипції.

Вдруге синтезовані іРНК виходять із транскриптивних комплексів і транспортуються до рибосом.

На моделі реовірусів було показано, що обидві нитки двонитчатих молекул РНК залишаються в складі серцевини, а вдруге синтезовані іРНК виштовхуються із серцевини через отвори в 12 порожніх циліндрів, що перебувають у складі серцевини.

Регуляція транскрипції. Транскрипція вірусного генома строго регулюється протягом інфекційного циклу. Регуляція здійснюється як клітинними, так і вірусспецифічними механізмами. У деяких вірусів, в більшості ДНК-вмісних, існує три періоди транскрипцій — передрання, рання й пізня. До цих вірусів ставляться віруси віспи, герпеса, паповавіруси, аденовіруси. У результаті передранньої і ранньої транскрипції вибірково зчитуються передранні й ранні гени з утворенням передранніх або ранніх іРНК. При пізній транскрипції зчитується інша частина вірусного генома — пізні гени, з утворенням пізніх іРНК. Кількість пізніх генів звичайно перевищує кількість ранніх генів. Багато передранніх генів є генами для неструктурних білків — ферментів і регуляторів транскрипції й реплікації вірусного генома. Напроти, пізні гени звичайно є генами для структурних білків. Звичайно при пізній транскрипції зчитується весь геном, але з перевагою транскрипції пізніх генів.

Фактором регуляції транскрипції в ядерних вірусів є транспорт транскриптів з ядра в цитоплазму, до місця функціонування іРНК — полісомам.

Продуктом передранньої транскрипції вірусів герпеса є а-білки. Функція одного або декількох з них необхідна для транскрипції наступної групи генів, що кодують Р-білки. У свою чергу Р-білки включають транскрипцію останньої групи пізніх генів, що кодують у-білки. Такий тип регуляції одержав назву «каскадної».

У РНК-вмісних вірусів синтез транскриптів також строго контролюється у відношенні як кількості кожного класу транскриптів, так і періоду інфекції, коли певні транскрипти синтезуються з максимальною швидкістю. На ранній стадії інфекції переважно синтезуються транскрипти двох генів вірусу грипу — 1ЧР і N8, на пізній стадії інфекції — транскрипти генів М, НА й ІА. Інші три гени для Р-білків синтезуються приблизно з однаковою швидкістю протягом усього періоду інфекції. У реовірусів на ранній стадії інфекції переважно транскрибується 4 з 10 фрагментів генома й лише на пізній стадії транскрибується весь геном. Однак якщо помістити геном вірусу в безклітинну РНК-синтезуючу систему, буде відбуватися рівномірна транскрипція всіх 10 фрагментів генома. Ці факти говорять про твердий контроль транскрипції з боку клітини-хазяїна й можливій наявності специфічних клітинних регуляторів.

У параміксовірусів й рабдовірусів весь геном являє собою одну транскрипційну одиницю з єдиним промотором (ділянка зв'язування транскриптази й початку транскрипції) у 3'-кінця. Уздовж генома існує як би градієнт ефективності транскрипції. Найближчий до 3'-кінця ген (ген білка 14Р) зчитується найчастіше. Напроти, ген для найбільш високомолекулярного білка — транскриптази — що міститься лише в кількості декількох молекул на віріон, знаходиться на протилежному кінці генома й транскрибується значно рідше. Така регуляція експресії генів шляхом порядку їх розташування в геномі називається «полярність». При цьому способі регуляції кількість молекул поліпептидів визначається полярністю гена, тобто відстанню його від промотору.

Трансляція

Синтез білка в клітині відбувається в результаті трансляції іРНК. Трансляцією називається процес переводу генетичної інформації, що міститься в іРНК, на специфічну послідовність амінокислот. Іншими словами, у процесі трансляції здійснюється переклад 4-хлітерної мови азотистих основ на 20-тилітерну мову амінокислот.

Транспортні РНК. Свою амінокислоту тРНК пізнають по конфігурації її бічного ланцюга, а специфічний фермент аміноацилсинтетаза каталізує асоціацію тРНК із амінокислотою. У клітині існує велика кількість різноманітних видів тРНК. Оскільки для кожної амінокислоти повинна бути своя тРНК, кількість видів тРНК повинна бути не менше 20, однак у клітині їх значно більше. Це пов'язане з тим, що для кожної амінокислоти існує не один, а кілька видів тРНК. Молекула тРНК являє собою однонитчату РНК зі складною структурою у вигляді кленового листа. Один її кінець зв'язується з амінокислотою (кінець а), а протилежний — з нуклеотидами іРНК, яким вони комплементарні (кінець б). Три нуклеотида на іРНК кодують одну амінокислоту й називаються «триплет» або «кодон», комплементарні кодону три нуклеотида на кінці тРНК називаються «антикодон».

Рибосоми. Синтез білка в клітині здійснюється на рибосомі.  Рибосома складається із  двох субодиниц, великої і малої, мала субодиниця приблизно у два рази менше великої. Обидві субодиниці містять по одній молекулі рибосомальної РНК і ряд білків. Рибосомальні РНК синтезуються в ядрі на матриці ДНК за допомогою РНК-полімерази I. У малій рибосомальній субодиниці є канал, у якому перебуває інформаційна РНК. У великій рибосомальній субодиниці є дві порожнини, що захоплюють також малу рибосомальну субодиницю. Одна з них містить аміноацильний центр ( А-Центр), інша — пептидильний центр ( П-Центр).

Фази трансляції. Процес трансляції складається із трьох фаз: 1) ініціації, 2) елонгації й 3) термінації.

Ініціація трансляції. Це найбільш відповідальний етап у процесі трансляції, заснований на впізнаванні рибосомою іРНК і зв'язуванні з її особливими ділянками. Рибосома пізнає іРНК завдяки «шапочці» на 5'-кінці й сковзає до 3'-кінцю, поки не досягне ініціаторного кодону, з якого починається трансляція. В еукариотичній клітині ініціаторним кодоном є кодон АУГ або ГУГ, що кодують метіонін. З метіоніну починається синтез усіх поліпептидних ланцюгів.

Спочатку з іРНК зв'язується мала рибосомальна субодиниця. До комплексу іРНК із малою рибосомальною субодиницею приєднуються інші компоненти, необхідні для початку трансляції. Це кілька молекул, які  називаються  «ініціаторні  фактори».

Їх принаймні три в прокаріотичній клітині й більш дев'яти в еукаріотичній клітині. Ініціаторні фактори визначають впізнавання рибосомою специфічних РНК і, таким чином, є визначальним чинником у дискримінації між різними іРНК, присутніми в клітині, як правило, у надлишковій кількості.

У результаті формується комплекс, необхідний для ініціації трансляції, який називається ініціаторним комплексом. В ініціаторний комплекс входять: 1) іРНК; 2) мала рибосомальна субодиниця; 3) аміноацил-тРНК, що несе ініціаторну амінокислоту; 4) ініціаторні фактори; 5) кілька молекул ГТФ.

У рибосомі здійснюється злиття потоку інформації з потоком амінокислот. Аміноацил-тРНК входить в А-Центр великої рибосомальної субодиниці, і її антикодон взаємодіє з кодоном іРНК, що перебуває в малій рибосомальній субодиниці. При просуванні іРНК на один кодон тРНК перекидається в пептидильний центр, і її амінокислота приєднується до ініціаторної амінокислоти з утворенням першого пептидного зв'язку. Вільна від амінокислоти тРНК виходить із рибосоми й може знову функціонувати в транспорті специфічних амінокислот. На її місце з А-центру в П-центр перекидається нова тРНК і утворюється новий  пептидний зв'язок. В А-Центрі з'являється вакантний кодон іРНК, до якого негайно  приєднується відповідна тРНК і відбувається приєднання нових амінокислот до зростаючого поліпептидного ланцюга.

Елонгація трансляції. Це процес подовження, нарощування поліпептидного ланцюга, заснований на приєднанні нових амінокислот за допомогою пептидного зв'язку. Відбувається постійне протягання нитки іРНК через рибосому й «декодування» закладеної в ній генетичної інформації. іРНК функціонує на декількох рибосомах, кожна з яких синтезує ту саму поліпептидну нитку, що кодується даною іРНК. Група рибосом, що працюють на одній молекулі іРНК, називається полірибосомою, або полісомою. Розмір полісом значно варіює залежно від довжини молекули іРНК, а також від відстані між рибосомами. Так, полісоми, які синтезують гемоглобін, складаються з 4—6 рибосом, високомолекулярні білки синтезуються на полірибосомах, що містять 20 і більш рибосом.

Термінація трансляції. Термінація трансляції відбувається в той момент, коли рибосома доходить до термінуючого кодону в складі іРНК. Трансляція припиняється, і поліпептидний ланцюг звільняється з полірибосоми. Після закінчення трансляції полірибосоми розпадаються на субодиниці, які можуть увійти до складу нових полірибосом.

Властивості полірибосом. За топографією в клітині полірибосоми ділять на дві більші групи — вільні й пов'язані з мембранами ендоплазматичної сітки, які становлять відповідно 75% і 25%. Між двома групами полірибосом немає принципових структурних і функціональних відмінностей, вони формуються з того самого пулу субодиниць і в процесі трансляції можуть обмінюватися субодиницями. Мембрани, з якими зв'язані полірибосоми, називаються грубими або шорсткуватими мембранами на відміну від гладких мембран, що не містять полірибосоми. Зв'язок полірибосом з мембранами здійснюється за допомогою сигнального пептиду — специфічної послідовності на аминоконці синтезованих глікопротеїдов. На пов'язаних з мембранами полірибосомах синтезуються усередині мембранні білки, які відразу ж після синтезу виявляються в складі мембран.

Трансляція в заражених вірусом клітинах. Стратегія вірусного генома, що використовує клітинний апарат трансляції, повинна бути спрямована на створення механізму для пригнічення трансляції власних клітинних іРНК і для виборчої трансляції вірусних іРНК, які завжди перебувають у значно меншій кількості, ніж  клітинні матриці. Цей механізм реалізується на рівні специфічного дізнавання малою рибосомальною субодиницею вірусних іРНК, тобто на рівні формування ініціюючого комплексу. Оскільки багато вірусів не пригнічують синтез клітинних іРНК, у заражених клітинах виникає парадоксальна ситуація: припиняється трансляція величезного фонду функціонально активних клітинних іРНК, і на рибосомах, що звільнилися, починається трансляція одиночних молекул вірусних іРНК. Специфічне дізнавання рибосомою вірусних іРНК здійснюється за рахунок вірусоспецифічних ініціаторних факторів.

Два способи формування вірусних білків. Оскільки геном вірусу тварин представлений молекулою, що кодує більш ніж один білок, віруси поставлені перед необхідністю синтезу або довгої іРНК, що кодує один гігантський поліпептид-попередник, який потім повинен бути нарізаний у специфічних точках на функціонально активні білки, або коротких моноцистронних іРНК, кожна з яких кодує один білок. Таким чином, існують два способи формування вірусних білків: 1) іРНК транслюється в гігантський поліпептид-попередник, який після синтезу послідовно нарізається на зрілі функціонально активні білки; 2) іРНК транслюється з утворенням зрілих білків, або білків, які лише незначно модифікуються після синтезу.

Перший спосіб трансляції характерний для РНК-вмісних «плюс-ниткових» вірусів — пікорнавірусів і тогавірусів. Їх іРНК транслюється в гігантський поліпептидний ланцюг, так званий поліпротеїд, який сповзає у вигляді безперервної стрічки з рибосомного «конвеєра» і нарізається на індивідуальні білки потрібного розміру. Нарізування вірусних білків є багатоступінчастим процесом, здійснюваним як вірусоспецифічними, так і клітинними протеазами. У клітинах, заражених пікорнавірусами, на кінці поліпротеїна-попередника знаходиться білок із протеазною активністю. Вірусна протеаза здійснює нарізування попередника на 3 фрагмента, один з яких є попередником для структурних білків, другий — для неструктурних білків, функції третього фрагмента невідомі. В подальшому  нарізуванні беруть участь вірусоспецифічні й клітинні протеази.

Цікавий варіант першого способу трансляції виявляється в альфа-вірусів (сімейство тогавірусів). Геномна РНК із коефіцієнтом седиментації 42 транслюється з утворенням поліпептиду-попередника для неструктурних білків. Однак домінуючою в заражених клітинах іРНК є РНК із коефіцієнтом седиментації 26 Б, що складає одну третину геномної РНК. Ця іРНК транслюється з утворенням попередника для структурних білків.

Другий спосіб формування білків характерний для ДНК-вмісних вірусів і більшості РНК-вмісних вірусів. При цьому способі синтезуються короткі моноцистронні іРНК у результаті виборчої транскрипції однієї ділянки генома (гена). Однак усі віруси широко використовують механізм посттрансляційного нарізування білка.

Вірусоспецифічні полісоми. Оскільки довжина вірусних іРНК варіює в широких межах, розмір вірусоспецифічних полісом також широко варіює: від 3-4 до декількох десятків рибосом на одній нитці іРНК. При інфекціях, викликаних пікорнавірусами, формуються великі полісоми, що представляють собою агрегати, що складаються із 20—60 рибосом. При інфекціях, викликаних іншими вірусами тварин, що використовують другий спосіб трансляції, формуються полісоми невеликого розміру. Між розмірами іРНК і величиною полісом існує певна кореляція, однак у ряді випадків полісоми мають більший або менший розмір у порівнянні з очікуваним. Ця особливість вірусних полісом пояснюється незвичайним просторовим розташуванням рибосом на вірусних матрицях, пов'язаних з меншою щільністю упаковки рибосом на молекулі іРНК.

Вірусоспецифічні полісоми можуть бути як вільними, так і пов'язаними з мембранами. У заражених вірусом поліомієліту клітинах поліпротеїд синтезується на пов'язаних з мембранами полісомах; при інфекціях, викликаних складно влаштованими вірусами, формуються як вільні, так і пов'язані з мембранами полісоми, які залучені в синтез різних класів вірусних поліпептидів. Внутрішні білки звичайно синтезуються на вільних полісомах, глікопротеїди завжди синтезуються на полісомах, пов'язаних з мембранами.

Модифікація вірусних білків. В еукаріотичній клітині багато білків, у тому числі вірусні, зазнають посттрансляційних модифікацій, і зрілі функціонально активні білки часто не ідентичні їхнім вдруге синтезованим попередникам. Широко поширені такі посттрансляційні ковалентні модифікації, як глікозилювання, ацилювання, метилювання, сульфування (утворення дисульфідних зв'язків), протеолітичне нарізування й, нарешті, фосфорилювання. У результаті замість 20 генетично закодованих амінокислот з різних клітин різних органів еукаріот виділене близько 140 дериватів амінокислот.

Серед широкого спектра модифікованих реакцій лише невелика кількість процесів є оборотною: 1) фосфорилювання-дефосфорилювання; 2) ацилювання-деацилювання; 3) метилювання-деметилювання; 4) утворення дисульфідних зв'язків. Серед подібних оборотних модифікацій білків слід шукати процеси, що обумовлюють механізм регуляції активності білків в еукаріотичній клітині.

Гликозилювання. У складі складно влаштованих РНК- і ДНК-вмісних вірусів є білки, що містять ковалентно приєднані бічні ланцюжки вуглеводів — глікопротеїди. Глікопротеїди розташовані в складі вірусних оболонок і знаходяться  на поверхні вірусних часток. Своєю гідрофобною частиною вони занурені в подвійний шар ліпідів, а деякі глікопротеїди проникають через нього й взаємодіють із внутрішнім компонентом вірусу. Гідрофільна частина молекули звернена назовні.

Синтез і внутрішньоклітинний транспорт глікопротеїдів характеризується рядом особливостей, властивих клітинним внутрішньомембранним білкам. Їхній синтез здійснюється на полісомах, асоційованих з мембранами, і білки відразу ж після синтезу попадають у шорсткуваті мембрани, звідки транспортуються в мембрани ендоплазматичної сітки й у комплекс Гольджі, де відбувається модифікація й комплектування вуглеводного ланцюжка, а потім — у плазматичну мембрану в ряді випадків шляхом злиття з нею везикул комплексу Гольджі. Такий цілеспрямований транспорт здійснюється завдяки наявності на аминоконці білка специфічної послідовності з 20—30 амінокислот (сигнального пептида). Сигнальний пептид відрізається від білкової молекули після того, як глікопротеїд досягає плазматичної мембрани.

Гликозилювання поліпептидів є складним багатоступінчастим процесом, перші етапи якого починаються вже в процесі синтезу поліпептидів, і перший цукор приєднується до поліпептидного ланцюга, який ще не зійшов з рибосоми. Наступні етапи гликозилювання відбуваються шляхом послідовного приєднання цукрів у вигляді блоків до вуглеводного ланцюжка в процесі транспорту поліпептиду до плазматичної мембрани.    Остаточне формування вуглеводного ланцюжка може завершуватися на плазматичній мембрані перед зборкам вірусної частки. Процес гликозилювання не впливає на транспорт поліпептиду до плазматичної мембрани, але має істотне значення для експресії біологічної активності білка. При пригнічення гликозилювання відповідними інгібіторами (аналоги цукрів типу 2-дезоксиглюкози, антибіотик тунікаміцин) порушується синтез поліпептидів, блокується зборка віріонів міксовірусів, рабдовірусів, альфа-вірусів або утворюються неінфекційні віріони герпеса й онковірусів.

Сульфування. Деякі білки складно влаштованих РНК- і ДНК-вмісних вірусів сульфуються після трансляції. Найчастіше сульфування зазнають глікопротеїди, при цьому сульфатна група зв'язується із цукровим компонентом глікопротеїда.

Ацилювання. Ряд глікопротеїдів складно влаштованих РНК-вмісних вірусів (НА2 вірусу грипу, білок у вірусу везикулярного стоматиту, білок НЙ вірусу ньюкаслської хвороби й ін.) містять ковалентно зв'язані 1—2 молекули жирних кислот.

Нарізування. Багато вірусних білків і в першу чергу глікопротеїди здобувають функціональну активність лише після того, як відбудеться їхнє нарізування в специфічних точках протеолітичними ферментами. Нарізування відбувається або з утворенням двох функціональних білкових субодиниць (наприклад, більша й мала субодиниці гемаглютиніна вірусу грипу, два глікопротеїда, Ег і Ез, вірусу лісу Семлікі) або з утворенням одного функціонально активного білка й неактивного фрагмента, наприклад білки Б и НІ параміксовірусів. Нарізування звичайно здійснюється клітинними ферментами. У багатьох складно влаштованих вірусів тварин, що мають глікопротеїд, нарізування необхідне для формування активних прикріпних білків і білків злиття й, отже, для придбання вірусом здатності інфікувати клітину. Лише після нарізування цих білків вірусна частка здобуває інфекційну активність. Таким чином, можна говорити про протеолітичну активацію ряду вірусів, здійснювану за допомогою клітинних ферментів.

Фосфорилювання. Фосфопротеїди містяться практично в складі всіх вірусів тварин, РНК- і ДНК-вмісних, просто й складно влаштованих. У складі більшості вірусів виявлені протеїнкінази, однак фосфорилювання може здійснюватися як вірусними, так і клітинними ферментами. Звичайно фосфорилюються білки, пов'язані з вірусним геномом, що здійснюють регулюючу роль у його експресії. Одним із прикладів є фосфорилювання білка онкогенних вірусів, що обумовлює клітинну трансформацію. Цей білок є продуктом гена 18гс і одночасно протеїнкіназою і фосфопротеїдом, тобто здатний до самофосфорилювання.

Із процесом фосфорилювання пов'язаний механізм антивірусної дії інтерферону. У заражених вірусом клітинах інтерферон індукує синтез протеїнкінази, яка фосфорилює субодиницю ініціюючого фактора трансляції ЕІФ-2, у результаті чого блокується трансляція вірусних інформаційних РНК. Фосфорилювання білків відіграє регулюючу роль у транскрипції й трансляції вірусних іРНК, специфічному впізнаванні вірусних іРНК рибосомою, білок-нуклеїновому і білок-білковому впізнаванні на стадії зборка вірусних часток.

Реплікація

Реплікацією називається синтез молекул нуклеїнової кислоти, гомологічних геному. У клітині відбувається реплікація ДНК, у результаті якої утворюються дочірні двониткові ДНК. Реплікація відбувається на розплетених ділянках ДНК і йде одночасно на обох нитках від 5'-кінця до З'-кінця. Оскільки дві нитки ДНК мають протилежну полярність 5'-3' і 3'-5', а ділянка реплікації («виделка») рухається в одному напрямку, один ланцюг будується у зворотному напрямку окремими фрагментами, які називаються фрагментами Оказакі ( по імені вченого, що вперше запропонував таку модель). Після синтезу фрагменти Оказакі «зшиваються» лігазою у єдину нитку.

Реплікація ДНК здійснюється ДНК-полімеразами. Для початку реплікації необхідний попередній синтез короткої ділянки РНК на матриці ДНК, який називається затравкою. Із затравки починається синтез нитки ДНК, після чого РНК швидко видаляється зі зростаючої ділянки.

Реплікація вірусних ДНК. Реплікація генома ДНК-вмісних вірусів в основному каталізується клітинними фрагментами й механізм її подібний з механізмом реплікації клітинної ДНК.

Кожна вдруге синтезована молекула ДНК складається з однієї батьківської й однієї вдруге синтезованої нитки. Такий механізм реплікації називається      напівконсервативним.

У вірусів, що містять кільцеві двониткові ДНК ( паповавіруси), розрізається одна з ниток ДНК, що веде до розкручування супервитків на певній ділянці молекули.

При реплікації однонитчатих ДНК (сімейство парвовірусів) відбувається утворення двонитчатих форм, які являють собою проміжні реплікативні форми.

Реплікація вірусних РНК. У клітині немає ферментів, здатних здійснити реплікацію РНК. Тому ферменти, що беруть участь в реплікації, завжди вірусоспецифічні. Реплікацію здійснює той же фермент, що й транскрипцію; репліказа є або модифікованою транскриптазою, або при реплікації відповідним чином модифікується матриця.

Реплікація однонитчатих РНК здійснюється у два етапи: спочатку синтезуються комплементарні геному нитки, які у свою чергу стають матрицями для синтезу копій генома. У «мінус-ниткових» вірусів перший етап реплікації — утворення комплементарних ниток подібний із процесом транскрипції. Однак між ними є істотна відмінність: якщо при транскрипції зчитуються певні ділянки генома, то при реплікації зчитується весь геном. Наприклад, іРНК параміксовірусів і рабдовірусів є короткими молекулами, комплементарними різним ділянкам  генома,  а іРНК вірусу грипу на 20—30 нуклеотидів коротше кожного фрагмента генома. У той же час матриці для реплікації є повною комплементарною послідовністю генома й називаються антигеномом.

У заражених клітинах існує механізм перемикання транскрипції на реплікацію. У «мінус-ниткових» вірусів цей механізм обумовлений маскуванням ділянок термінації транскрипції на матриці генома, у результаті чого відбувається наскрізне зчитування генома. Ділянки термінації маскуються одним з вірусних білків.

При реплікації зростаюча « плюс-нитка» витісняє синтезовану раніше «плюс-нитку» або двоспіральна матриця консервується. Більш розповсюджений перший механізм реплікації.

Реплікативні комплекси. Оскільки утворені нитки ДНК і РНК якийсь час залишаються пов'язаними з матрицею, у зараженій клітині формуються реплікативні комплекси, у яких здійснюється весь процес реплікації (а в ряді випадків також і транскрипції) генома. Реплікативний комплекс містить геном, репліказу й пов'язані з матрицею вдруге синтезовані ланцюги нуклеїнових кислот. Вдруге синтезовані геномні молекули негайно асоціюються з вірусними білками, тому в реплікативних комплексах виявляються антигени. У процесі реплікації виникає частково двонитчата структура з однонитковими «хвостами», так званий реплікативний попередник (РП).

Реплікативні комплекси асоційовані із клітинними структурами або з передіснуючими, або вірусіндукованими. Наприклад, реплікативні комплекси пікорнавірусів асоційовані з мембранами ендоплазматичної сітки, вірусів віспи — із цитоплазматичним матриксом, реплікативні комплекси аденовірусів і вірусів герпеса в ядрах знаходяться в асоціації із вдруге сформованими волокнистими структурами й пов'язані з ядерними мембранами. У заражених клітинах може відбуватися посилена проліферація клітинних структур, з якими зв'язані реплікативні комплекси, або їх формування із передіснуючого матеріалу. Наприклад, у клітинах, заражених пікорнавірусами, відбувається проліферація гладких мембран. У клітинах, заражених реовірусами, спостерігається скупчення мікротрубочок; у клітинах, заражених вірусами віспи, відбувається формування цитоплазматичного матрикса.

У реплікативних комплексах одночасно із синтезом геномних молекул здійснюється транскрипція й відбувається зборка нуклеокапсидів і серцевин, а при деяких інфекціях — і вірусних часток. Про складну структуру реплікативних комплексів говорить, наприклад, такий склад реплікативного комплексу аденовірусів: однониткові ДНК, однониткові РНК, ферменти реплікації й транскрипції, структурні й неструктурні вірусні білки й ряд клітинних білків.

Регуляція реплікації. Вдруге утворена молекула геномної РНК може бути використана різним образом. Вона може асоціюватися з капсидними білками та  ввійти до складу віріона, служити матрицею для синтезу нових геномних молекул, або — для утворення іРНК, нарешті, в «плюс-ниткових» вірусів вона може виконувати функції іРНК і зв'язуватися з рибосомами. У клітині існують механізми, що регулюють використання геномних молекул. Регуляція йде за принципом саморегуляції й реалізується шляхом взаємодії вірусних РНК і білків завдяки можливості білок-нуклеїнового і білок-білкового впізнавання. Наприклад, роль термінального білка пікорна-вірусів полягає в забороні трансляції іРНК і відборі молекул для формування віріонів. Білок, що зв'язується з 5'-кінцем геномної РНК, у свою чергу впізнається капсидними білками й служить сигналом для зборка вірусної частки за участю даної молекули РНК. За тим же принципом відбираються геномні молекули РНК у «мінус-ниткових» вірусів: до З'-кінця геномних РНК приєднується молекула капсидного вірусного білка, до якої підбудовуються інші білкові субодиниці в результаті білок-білкового впізнавання, і така молекула РНК ввійде до складу віріона або послужить матрицею для реплікації. Для перемикання її на транскрипцію повинна виникнути заборона білок-нуклеїнової взаємодії. У реплікації ДНК аденовірусів бере участь молекула білка, яка зв'язується з кінцем вірусної ДНК і необхідна для початку реплікації. Таким чином, для початку реплікації необхідний синтез вірусних білків: у присутності інгібіторів білкового синтезу відсутнє перемикання транскрипції на реплікацію.

Зборка вірусних часток

Синтез компонентів вірусних часток у клітині роз'єднаний і може протікати в різних структурах ядра й цитоплазми. Віруси, реплікація яких проходить у ядрах, умовно називають ядерними. В основному це ДНК-вмісні віруси: аденовіруси, паповавіруси, парвовіруси, віруси герпеса. Віруси, що реплікуються в цитоплазмі, називають цитоплазматичними. До них відносяться із ДНК-вмісних вірус віспи й більшість РНК-вмісних вірусів, за винятком ортоміксовірусів і ретровірусів. Однак цей поділ досить відносний, тому що в репродукції тих і інших вірусів є стадії, що протікають відповідно в цитоплазмі і ядрі.

Всередині ядра й цитоплазми синтез вірусоспецифічних молекул також може бути роз'єднаний. Так, наприклад, синтез одних білків здійснюється на вільних полісомах, а інших — на полісомах, пов'язаних з мембранами. Вірусні нуклеїнові кислоти синтезуються в асоціації із клітинними структурами далеко від полісом, які синтезують вірусні білки. При такому диз’юнктивному способі репродукції утворення вірусної частки можливо лише в тому випадку, якщо вірусні нуклеїнові кислоти й білки мають здатність при достатній концентрації впізнавати один одного в різноманітті клітинних білків і нуклеїнових кислот і мимовільно з'єднуватися один з одним, тобто здатні до зборки.

В основі самозборки лежить специфічне білок-нуклеїнове й білок-білкове впізнавання, яке може відбуватися в результаті гідрофобних, сольових і водневих зв'язків, а також стеричної відповідності. Білок-нуклеїнове впізнавання обмежене невеликою ділянкою молекули нуклеїнової кислоти й визначається унікальними послідовностями нуклеотидів в некодуючій частині вірусного генома. Із цього впізнавання ділянки генома вірусними капсидними білками починається процес зборки вірусної частки. Приєднання інших білкових молекул здійснюється за рахунок специфічних білок-білкових взаємодій або неспецифічних білок-нуклеїнових взаємодій.

У зв'язку з різноманітністю структури вірусів тварин різноманітні й способи формування віріонів, однак можна сформулювати наступні загальні принципи зборки.

1. У просто влаштованих вірусів формуються провіріони, які потім у результаті модифікацій білків перетворюються у віріони. У складно влаштованих вірусів зборка здійснюється багатоступінчасто. Спочатку формуються нуклеокапсиди або серцевини, з якими взаємодіють білки зовнішніх оболонок.

2. Зборка складно влаштованих вірусів ( за винятком зборки вірусів віспи й реовірусів) здійснюється на клітинних мембранах. Зборка ядерних вірусів відбувається за участю ядерних мембран, зборка цитоплазматичних вірусів — за участю мембран ендоплазматичної сітки або плазматичної мембрани, куди незалежно друг від друга прибувають усі компоненти вірусної частки.

3. У ряду складно влаштованих вірусів існують спеціальні гідрофобні білки, що виконують функції посередників між сформованими нуклеокапсидами й вірусними оболонками. Такими білками є матриксні білки у ряду «мінус-ниткових» вірусів (ортоміксовірусів, параміксовірусів, рабдовірусів).

4. Зборка нуклеокапсидів, серцевин, провіріонів і віріонів відбувається не у внутрішньоклітинній рідині, а в спеціальних структурах, передіснуючих у клітині або індукованих вірусом («фабриках»).

5. Складно влаштовані віруси для побудови своїх часток використовують ряд елементів клітини-хазяїна, наприклад ліпіди, деякі ферменти, у ДНК-геномного БУ40 — гістони, в оболонкових РНК-геномних вірусів — актин, а в складі ареновірусів виявлені навіть рибосоми. Клітинні молекули несуть певні функції у вірусній частці, однак включення їх у віріон може з'явитися й наслідком випадкової контамінації, як, наприклад, включення ряду ферментів клітинних оболонок або клітинних нуклеїнових кислот.

Зборка РНК-вмісних  вірусів.  Зборка  просто влаштованих РНК-вмісних вірусів полягає в асоціації вірусного генома з вірусними капсидними білками з утворенням нуклеокапсида.

У складно влаштованих РНК-вмісних вірусів процеси зборки нуклеокапсидів, серцевин і зрілих віріонів звичайно роз'єднані. Нуклеокапсиди мігрують до місця зборки вірусних часток — плазматичної мембрани (або мембранам ендоплазматичної сітки) і впорядковано вибудовуються під ділянками мембран, із зовнішньої сторони яких уже вбудовані вірусні суперкапсидні білки. Зборка полягає в тому, що ділянки, які містять глікопротеїди з пов'язаними з ними нуклеокапсидами, поступово вип’ячуються крізь модифіковану клітинну мембрану. У результаті випинання утворюється «брунька», що містить нуклеокапсид і оболонку із суперкапсидними білками. «Брунька» відділяється від клітинної мембрани з утворенням вільної вірусної частки. Такий спосіб формування вірусних часток називається брунькуванням. Брунькування може відбуватися - крізь плазматичну мембрану клітини в зовнішнє середовище, як в ортоміксовірусів, параміксовірусів, рабдовірусів і альфа-вірусів, або через мембрани ендоплазматичної сітки у вакуолі, як у аренавірусів і буньявірусів. В основі випинання бруньки через мембрану лежать звичайні клітинні процеси, спрямовані на відторгнення непридатного для клітини матеріалу й відновлення мембран. Ділянка майбутньої бруньки містить фіксований нуклеокапсид, асоційований із суперкапсидними білками, але рух мембранних ліпідів триває в силу їх плинності, ліпіди обволікають майбутню бруньку й разом з ними з «бруньки» витісняються клітинні мембранні білки. У результаті цього руху відбувається набухання «бруньки» над клітинною мембраною. Механізм утворення «бруньки» пояснює, чому в складі вірусів, що брунькуються, не міститься клітинних мембранних білків.

Усі вірусні компоненти — нуклеокапсиди й суперкапсидні білки прибувають до місця зборки незалежно один від одного. Першими до місця зборки прибувають суперкапсидні білки. Звичайно цими білками є глікопротеїди, які синтезуються в полісомах, пов'язаних з мембранами, і через шорсткуваті, а потім гладкі мембрани в результаті злиття з ними везикул комплексу Гольджі транспортуються на   зовнішню поверхню плазматичних мембран або залишаються в складі везикул.

Включення глікопротеїдов у певні зони клітинних мембран призводить до модифікацій мембран. Нуклеокапсид впізнає ці ділянки й підходить до них із внутрішньої сторони ліпідного бішару. Впізнавання здійснюється за допомогою одного із двох механізмів: 1) нуклеокапсид взаємодіє з ділянкою глікопротеїда, що пронизує клітинну мембрану й виходить на її внутрішню поверхню. Такий механізм має місце у альфа-вірусів; гідрофобний фрагмент глікопротеїда Е1 проникає крізь ліпідний шар на його внутрішню поверхню, і із цим фрагментом зв'язуються нуклеокапсиди, які пізніше увійдуть до складу «бруньки»; 2) у зборку включається ще один вірусний білок, що є медіатором зборки, який називається мембранним, або матриксним білком. М-білок синтезується на вільних полісомах, але відразу після синтезу вбудовується в клітинні мембрани із внутрішньої цитоплазматичної сторони ліпідного бішару. Цей білок високо гідрофобний і тому здатний до білок-білкових і білокліпідних взаємодій.

Включення М-білка в клітинні мембрани є сигналом для зборки вірусної частки: слідом за включенням негайно слідує зв'язування нуклеокапсидів з мембранами й брунькування вірусної частки. Тим самим М-Білок виконує функцію фактора, що лімітує зборку.

Зборка ДНК-вмісних вірусів. У зборці ДНК-вмісних вірусів є деякі відмінності від зборки РНК-вмісних вірусів. Як і в РНК-вмісних вірусів, зборка ДНК-вмісних вірусів є багатоступінчастим процесом з утворенням проміжних форм, що відрізняються від зрілих віріонів за складом поліпептидів. Перший етап зборки  полягає в асоціації ДНК із внутрішніми білками й формуванні серцевин або нуклеокапсидів. При цьому ДНК з'єднується з попередньо сформованими «порожніми» капсидами.

У результаті зв'язування ДНК із капсидами з'являється новий клас проміжних форм, які називаються неповними формами. Крім неповних форм із різним змістом ДНК, існує інша проміжна форма в морфогенезі — незрілі віріони, що відрізняються від зрілих тим, що містять ненарізані попередники поліпептидів. Таким чином, морфогенез вірусів тісно пов'язаний з модифікацією (процесингом) білків.

Зборка ядерних вірусів починається в ядрі, звичайно — з асоціації з ядерною мембраною. Проміжні форми вірусу герпеса, що формуються в ядрі, брунькуються в перинуклеарний простір крізь внутрішню ядерну мембрану, і вірус здобуває таким шляхом оболонку, яка є дериватом ядерної мембрани. Подальше добудування й дозрівання віріонів відбувається в мембранах ендоплазматичної сітки й в апараті Гольджі, звідки вірус у складі цитоплазматичних везикул транспортується на клітинну поверхню.

У ліпідовмісних вірусів, які не брунькуються – вірусів віспи –  зборка віріонів відбувається в уже описаних цитоплазматичних вірусних «фабриках». Ліпідна оболонка вірусів в «фабриках» формується із клітинних ліпідів шляхом автономної зборки, тому ліпідний склад оболонок значно відрізняється від складу ліпідів у клітинних мембранах.

Вихід вірусних часток із клітини

Існують два способи виходу вірусного потомства із клітини: 1) шляхом «вибуху»; 2) шляхом брунькування.

Вихід із клітини шляхом вибуху пов'язаний з деструкцією клітини, порушенням її цілісності, у результаті чого вірусні зрілі частки, що перебувають усередині клітини, виходять в навколишнє середовище. Такий спосіб виходу з клітини властивий вірусам, що не містять ліпопротеїдної оболонки (пікорна-, рео-, парво-, папова-, аденовіруси). Однак деякі із цих вірусів можуть транспортуватися на клітинну поверхню до загибелі клітини.

Вихід із клітин шляхом брунькування властивий вірусам, що містять ліпопротеїдну мембрану, яка є дериватом клітинних мембран. При цьому способі клітина може тривалий час зберігати життєздатність і продукувати вірусне потомство, поки не відбудеться повне виснаження її ресурсів.

Тема 4. Особливості реплікації онкогенних вірусів.

До родини ретровірусів входять численні види, які здатні викликати трансформацію нормальних клітин у пухлинні. З РНК-містких онкогенних вірусів виділяють три типи - B, C, D. Вони мають будову і хімічний склад, характерний для всієї родини ретровірусів. Онковіруси культивують у різних культурах клітин, причому їх репродукція відбувається лише в тих клітинах, які активно діляться. Максимальні онкогенні властивості проявляються при культивуванні в організмі тканин-хазяїв. Онковіруси містять у складі генома онкогени, які започатковують процес трансформації клітин.

Онкогенні віруси названих типів викликають різноманітні онкологічні процеси в організмі тварин і птахів: наприклад, онковіруси типу С є збудниками сарком і лейкозів, типу В - раку й лейкозів.

Існує ще окрема Т-лімфотропна група ретровірусів людини. Зокрема, Т-лімфотропнi віруси 1 і 2 (HTLV-1 i HTLV-2) cпричиняють Т-клітинний лейкоз дорослих людей. Віруси можуть передаватись ч/з кров, трансплацентарно, а також статевим шляхом. Лабораторні методи діагностики новоутворень грунтуються на виявленні пухлинних антигенів або антитіл. Для лік. використовують моноклональні антитіла, навантажені різними цитостатиками.

Клітини організму об’єднані у тканини – однорідні групи з загальним походженням, функцією і спільною “територією”. Кількість клітин у  

даній тканині більш-менш постійна. Це відбувається завдяки тому, що молоді клітини постійно діляться та ростуть. При цьому чим більше клітин відмирає, тим більше з’явиться нових. Якщо співвідношення втрата-поповнення з якихось причин порушується на користь поповнення, то у цьому місці виникає надлишкова маса клітин – утворюється пухлина. Ріст пухлини відбувається поступово, поки не утвориться цілком відчутний вузол. Деякі пухлини досягають помітного розміру за кілька тижнів, тоді як іншим потрібні роки.

Чим шкідливішими є умови, у яких знаходиться клітина, тим більша імовірність помилок при її поділі. Травми шкіри, слизових оболонок або інших тканин організму призводять до збільшення ризику виникнення пухлини в цьому місці. Саме тому частіше хворіють на рак ті органи, слизова оболонка яких піддається інтенсивному природному навантаженню: легені, шлунок, товстий кишечник. Подразнення слизової бронхів тютюновим димом, слизової стравоходу та шлунка – гострою їжею, травмування родимок та виразок, що не гояться, підвищує ризик виникнення раку.

Будь-яка тканина займає лише свою “територію” – як за шириною, так за товщиною. Якщо пухлина не виходить за межі тканини, з якої утворилася, і не проникає у сусідні тканини, то вона доброякісна. Головною ознакою злоякісної пухлини є її вихід за межі своєї території. Ракові клітини можуть відриватись від основного вогнища, розноситись лімфою та кров’ю по всьому організму та осідати в інших органах (насамперед у лімфатичних вузлах, печінці, легенях). Там вони утворюють вторинні вогнища росту – метастази. Саме вони роблять пухлину по-справжньому злоякісною.

Ріст злоякісних пухлин необмежений та неконтрольований. Ракові клітини, відірвавшись від пухлини, можуть рости окремо від неї в чужорідному оточенні.

Ще однією невід’ємною властивістю злоякісної пухлини є безсмертя її клітин. Вони не припиняють свого розмноження ні в організмі, ні поза ним. Така пухлина безупинно прогресує до більшої злоякісності, “агресивності” та неконтрольованості.Найгіршим є те, що ракові пухлини виділяють отруйні речовини та виснажують організм, використовуючи ресурси для свого росту.

Наш організм складається з мільярдів клітин, які постійно діляться та ростуть. У цьому процесі рано чи пізно виникають різноманітні “збої”, в результаті яких іноді й з’являються ракові клітини. Враховуючи кількість клітин та частоту їх поділу, зовсім не дивно, що в організмі кожної людини утворюється безліч “поганих” клітин. Дивним швидше є те, що далеко не всі вони стають пухлинами і рак виникає відносно рідко.

Основною причиною цього є наша імунна система. В організмі людини є спеціальні механізми для розпізнавання і знищення таких “бракованих” клітин. Таким чином він бореться з ними так само, як із клітинами, які потрапили ззовні (бактеріями, вірусами тощо) за допомогою імунної системи. Проте іноді вона дає збій і з якихось причин не знищує цих клітин.

Очевидно, саме порушення імунної системи є визначальними в розвитку пухлин, оскільки виникнення клітинного “браку” неминуче, і все залежить від того, наскільки безвідмовно й ефективно він розпізнається і знищується.

Це підтверджується збільшенням імовірності виникнення раку з віком. Адже чим довше живе людина, тим більше ракових клітин утворюється в її організмі. На фоні ослаблення імунної системи вони перетворюються на злоякісні пухлини.

Ракові клітини виникають у організмі кожної людини. Проте є фактори, які сприяють їх розмноженню, розвитку та переродженню у злоякісні утворення. Це канцерогени – різноманітні хімічні речовини, віруси та опромінювання.

Канцерогенні речовини стимулюють розмноження найменш зрілих клітин – попередниць пухлин і сприяють їх змінам. Саме вони викликають рак сечового міхура, характерний для працівників лако-фарбової промисловості, та найбільш розповсюджений рак у людини – рак легень, що спричинюється палінням. У тютюновому димі в мікроскопічній кількості міститься хімічна речовина (3,4-бепзопірен), яка при потраплянні на шкіру мишей у високих концентраціях неодмінно викликає у них рак цього місця. На даний час визнано, що ризик розвитку цього захворювання поширюється і на людей, які не палять, але перебувають в одному приміщенні з курцями (так зване “пасивне куріння”). Джерелом більшості канцерогенів у навколишньому середовищі є викиди промислового виробництва. Хоча багато з них міститься і у продуктах харчування.

Іншу групу канцерогенів становлять віруси, які є дуже різноманітними. До них належать великі віруси, споріднені з вірусом герпесу, дрібні віруси, схожі до тих, які викликають бородавки (віруси папіломи). Вважається, що останній вірус відіграє провідну роль у розвитку раку шийки матки.

Усі віруси вносять у клітину додаткову інформацію, яка перетворює її на ракову. Проте їх роль у розвитку пухлин залишається спірною.

Ракові пухлини можуть виникати і під впливом опромінення. При загальному опроміненні організму найчастіше зустрічаються лейкози – різні форми пухлин кровоносної системи. Рідше з’являються пухлини кісток, як наслідок нагромадження у них радіоактивного стронцію, та рак щитоподібної залози – результат скупчення в цій залозі радіоактивного йоду. Подібний ефект дає ультрафіолетове випромінювання, якщо вплив достатньо тривалий. Добре відомо, що перебування на інтенсивному сонячному світлі протягом багатьох років може привести до захворювання на злоякісну меланому.

Ще одна важлива причина раку – генетична. Так, у мишей шляхом добору отримані види із 100%-ним виникненням у них певних видів пухлин. Людям, чиї родичі страждали від раку, потрібно бути особливо обережними при виборі професії, харчування, способу життя та регулярно обстежуватись у спеціалістів.

Для того, щоб вплив канцерогенів став відчутним, його інтенсивність та тривалість повинні в сотні разів перевищувати допустимі норми. Ризик захворіти на рак від зовнішніх причин для переважної більшості людей залишається меншим, ніж ризик загинути в автомобільній катастрофі.

Все ж більшість пухлин відносяться до спонтанних. Вони виникають без очевидного зв’язку з якимись діючими зовнішніми чи внутрішніми факторами, і попередити їх, на жаль, майже неможливо. Механізми переродження нормальної клітини на злоякісну ще не з’ясовані.  

Численні роботи, проведені в 1970–1980-х рр. показали, що в багатьох видів тварин є гени, схожі, але не співпадаючі з генами ретровірусів. Ці гени тварин і людини іноді називають ендогенними ретровірусами (HERV), чи провірусами.

Звичайно HERV не активні і менш онкогенні для вигляду-хазяїна, ніж екзогенні. Можливо, що викликають рак гени ряду ретровірусів колись, на ранніх етапах біологічної еволюції, закріпилися в ДНК предків виду-хазяїна. При реплікації всієї ДНК клітки онкогени передавалися з покоління в покоління. По оцінках учених HERV з'явилися в геномі предків людини приблизно 50 млн років тому.

Інтеграція екзогенного ретровіруса в геном хазяїна не сайт-специфична (випадкове), тому закріплення його в геноме підкоряється досить твердим правилам. Оскільки провірус не зникає з генома, є присутнім у всіх клітках свого носія і поширюється по популяції, та його присутність повинна бути нешкідливим для організму і, можливо, дає якісь переваги своєму хазяїну.

Маються дані про участь HERV у регуляції експресії генів, в ембріональному розвитку, у запобіганні зараження родинними екзогенними ретровірусами, у іммуносупрессії і розвитку деяких аутоіммунних захворювань.

Необхідно згадати також, що існує теорія походження ретровірусів із клітинних генів. Головну роль у цьому процесі приділяється зворотній транскриптазі, включенню створених нею ДНК у ДНК клітки і процес рекомбінації.

Опухолеродні віруси, як правило, видоспецифічні, тобто вражають тварин тільки визначеного виду. Але з кожного правила є вийнятки. Наприклад, вірусом курячої саркоми можна заразити пацюків, кроликів, хом'ячків, мавп, ящірок і навіть змій.

Група вчених під керівництвом Б.А. Лапіна установила, що вірус лейкозу людини може викликати подібне захворювання в двох видів мавп. Це привело до створення експериментальної моделі для вивчення всіх стадій розвитку захворювання, починаючи з найперших етапів.

Дослідники показали, що при зараженні клітки ретровірусом синтез його ДНК відбувається в два етапи: спочатку по нитці вірусної РНК синтезується комплементарна їй нитка ДНК, потім на останній добудовується комплементарна їй друга нитка ДНК і одночасно відбувається, деградація нитки РНК вірусу.

Онковіруси можуть брати участь у розвитку імунологічних захворювань. Так, при вивченні червоної вовчанки методом молекулярної гібридизації було показано, що в ДНК кліток уражених хворобою тканин маються послідовності, комплементарні РНК вірусу кору і зворотна транскриптаза. Це вказувало на експресію онковірусу в клітках хворих вовчанкою.

На підставі отриманих даних було висловлене припущення, що на початкових стадіях захворювання відбувається взаємодія коревого вірусу з латентним онковірусом. У результаті зворотна транскриптаза онковіруса транскрибує кореву РНК у ДНК, що потім вбудовується в геном клітки. Експресія цих додаткових генів виявляється в синтезі специфічних вірусних білків, частина з яких вбудовується в мембрани кліток і змінює їхньої властивості. Ці клітки стають чужорідними для організму і піддаються атаці власної імунної системи.

Онковіруси можуть активуватися при трансплантації (пересадженню) тканин. Розглянемо наступний приклад. При схрещуванні двох чистих ліній мишей народжується потомство, толерантне до пересадження тканин кожного з батьків: усі види тканин, включаючи і лімфоідну, що містить іммуноактивні клітки, приживаються. Однак якщо перед пересадженням лимфоидной тканини в реципієнта придушити імунну систему, те після трансплантації в мишей різко підсилюється експресія онковірусів. З часом у тварин розвиваються злоякісні лімфоми.

Можливо, онковіруси – нормальні компоненти організму, які приймають участь у процесах клітинного циклу, диференціації і проліферації. Тоді старіння, дія фізичних і хімічних канцерогенів може викликати розвиток раку. Однак присутність канцерогенів нехарактерно для природного середовища мешкання, а захворювання особин, що вийшли з репродуктивного періоду, не може відбитися на долі популяції. У той же час, інтегрований у геном клітки онковірус зі слабкими онкогенними властивостями може захистити клітку від родинного високоактивного вірусу. За смертністю онкологічні захворювання займають друге місце після серцево-судинних, за страхом, який вони вселяють людям, – перше. У європейських країнах з різних причин щорічно помирає приблизно 1% населення. На рак, хвороби серця та інсульти припадає біля 75% випадків смерті. Піввіку тому від онкозахворювань помирав кожен десятий. Зараз це співвідношення наближається до 1:5. У певний період життя рак розвивається в кожної третьої людини.

Реплікативний цикл ретровірусів зручно розділити на 5 фаз: а) ранні події: адсорбція, проникнення й «роздягання»; б) перетворення вірусного РНК-генома в неінтегровану лінійну (вільну) ДНК; в) інтеграція вірусної ДНК із хазяйським геномом; г) експресія генов. інтегрованої вірусної ДНК; д) синтез вірусних білків й оборка шрионов.

У порівнянні з іншими вірусами, у ретровирусов є 3 незвичайних властивості реплікації. По-перше, вірус повинен перетворити свій РНК-геном в ДНК. По-друге, ця ДНК довше, ніж вірусна РНК. Це подовження обумовлене подвоєнням частини послідовності вірусної РНК. Дупліковані послідовності утворюють довгі кінцеві повтори (LTR — long terminal repeat) вірусної ДНК. Сама назва вказує на те, що подвоєні послідовності розташовані на кінцях провірусної ДНК. Розмір LTR становить від 0,3 до 1,4 kb залежно від виду вірусу. Більшість послідовностей, що утворюють LTR, представлено в РНК лише однієї копією й розташовані як на 5'-, так і на 3'-кінці.

Завдання утворення LTR на обох кінцях ДНК вирішується шляхом здійснення ряду складних взаємозалежних подій. Третя незвичайна риса ретровірусної реплікації— ефективна інтеграція вільної ДНК із геномом клітини в строго певній орієнтації, яка залежить від кінцевих послідовностей обох LTR.

Фаза I: ранні події

Про цю стадію вірусної інфекції відомо порівняно небагато. Її дослідження утруднені через низьку ефективність зараження (більш 10 часток на інфекційну дозу). Оскільки більшість часток неинфекционно, за допомогою біохімічних і морфологічних приймань можна простежити скоріше шлях деградації, а не реплікації. Наприклад, деякі кількості вірусної РНК виявляли в ядрі клітин птахів через трохи хвилин після зараження. У цьому спостереженні, однак, -мало біологічного змісту, оскільки основний синтез вірусної ДНК на матрицях вирионной РНК іде в цитоплазмі.

Вище відзначалося, що проникненню віріонів ретровірусів у клітини передує специфічна взаємодія між поверхневим глікопротеїном вірусу й рецептором клітини-хазяїна. Відомості про спосіб влучення віріона усередину клітини суперечливі: неясно, чи відбувається проникнення безпосереднє через плазматичну мембрану або шляхом энодоцитоза (віропексиса). Частина віріонів деградує у лизосомах, однак невідомо, чи веде цей шлях до інфекції або загибелі вірусу. Так чи інакше, на перших етапах зараження віріон переходить у новий стан, коли він готовий, почати синтез вірусної ДНК. У якому ступені відбувається при цьому «роздягання» віріонів, залишається неясним.

Для MuLV процеси адсорбції й проникнення віріонів відрізняються специфічністю й залежать від рецепторів. ASLV адсорбуются не настільки специфічно, але проникнення цих вірусів також залежить від рецепторів. При цьому зв'язування очищеного глікопротеїна пташиних вірусів строго специфічно відносно рецептора. Частки MuLV зв'язуються із клітинною поверхнею з півперіодом (час зв'язування 50% часток) 2 год, а час їх проникнення 3 год. Зв'язування може йти при 4°С, а проникнення залежить від температури

Фаза II: синтез неінтегрованої (вільної) вірусної ДНК

Про більшість стадій цієї фази ретровірусної реплікації відомо досить багато. Головне завдання цього етапу інфекції - перетворити одноланцюговий РНК-геном у лінійну дволанцюгову вірусну ДНК. Синтез вірусної ДНК, який просунутий у цитоплазмі й вимагає принаймні чотирьох годин, здійснюється зворотної транскриптазой (ревертазой). У ході цього процесу певні послідовності, що присутні у вигляді унікальних копій у РНК, повинні бути дупліковані, щоб утворювати LTR на обох кінцях ДНК-продукту. Тому головними учасниками другої фази зараження є ревертаза, послідовності на кінцях вірусної РНК і LTR.

Тема 5. Віруси рослин.

Для культивування вірусів, в залежності від їх властивостей і від поставлених задач, використовують 4 типи рослин-господарів:

1)рослини, в яких вірус може зберігатися довгий час;

2) рослини, на яких легко виявляються симптоми, характерні для зараження даним вірусом;

3) рослини, з яких можна отримати великі кількості вірусу;

4) рослини, які використовують для оцінки інфекційності вірусу.

Для цих цілей використовують, як правило, різні види рослин. Так, наприклад, вірус мозаїки люцерни можна довгий час зберігати в люцерні, його найбільш високе накопичення спостерігається при культивуванні у тютюну, для визначення його ефективності використовують листя квасолі звичайної, а характерні симптоми, які відрізняють його від інших вірусів виявляються на тютюну, квасолі та Chenopodium amaranticolor.

Метод механічної інокуляції.

Метод механічної інокуляції – найбільш поширений  в лабораторній практиці спосіб засіб передачі вірусів здоровій рослині.

При механічній передачі інфекційний вірус (або його РНК) вводиться в клітину через пошкодження (мікротравми) кутикули листя, що викликається застосуванням при інокуляції абразивом. Дрібні (400-700 мкм) абразивні порошки діатомових водоростей (наприклад, "целіт") є найбільш ефективним матеріалом для цієї операції. Для механічної інокуляції поверхня листя опилюється абразивним порошком, потім наноситься 1-2 краплі вірусної суспензії на оброблену абразивом поверхню і за допомогою скляної палички або пластикової петлі інокулят разом з абразивом рівномірно розподіляється на поверхні ураженого листя. Цю операцію необхідно виконувати з врахуванням багатьох факторів: виду рослини, віку та стану листя, якості абразивного порошку та інших.

Методом механічної інокуляції краще всього передаються віруси, які достигають в рослинах високої концентрації та здатні уражати як епідерміс, так і інші тканини. До цієї категорії відносяться віруси, що викликають мозаїку, крапчатість або кільцеву плямистість. Після певного часу з моменту зараження чутливих до вірусу видів рослин можуть розвитися симптоми інфекції.

Віруси здатні заражати на тільки цілий організм господаря, але його окремі клітини, які вирощують у культурі (але і культурі клітин). Ціла клітинна оболонка рослин не доступна для вірусів і, якщо таку рослину обробити препаратом вірусу, зараження не відбудеться. Але, якщо зруйнувати клітинну оболонку рослини пектиназами і целюлазами, то отримані протопласти легко заражаються вірусом при додавання його у середовище для культивування протопластів. Протопласти використовують для культивування вірусів тютюнової мозаїки, огіркової мозаїки, Х- вірусу картоплі та інші.

Різні види рослин-хазяїв реагують на інфекцію по-різному. Характер реакції рослини залежить від її генетичної природи і від типу інфекції, якої заражають рослину. Відрізняють 4 основних типи реакції рослини на зараження їх вірусом:

1) імунність – рослина не заражається даним вірусом;

2) понадчутливість – рослина заражається з утворенням  уражень (некрозів), які з‘являються в наслідок відмирання клітин навколо точки зараження;

3) толерантність – вірус розповсюджується по тканинам рослини, але симптоми захворювання виражені слабо;

4) системні ураження – вірус розповсюджується по всім тканинам рослини з яскраво вираженими симптомами захворювання.

Симптоми захворювання можуть бути різними: мозаїка, деформація листя, просвітління жилок, утворення хлоротичних плям різної форми. між цими типами реакції рослини на вірусну інфекцію іноді відсутні чіткі межі. Наприклад, тяжко відрізнити реакцію толерантності  і системного ураження. У деяких рослин після механічної інокуляції спочатку утворюються некрози (зверхчутливість), далі рослини уражуються системно.

Але при вірному підборі рослин -хазяїв, а також при певних умовах інокуляції та культивування інфікованих рослин можливо отримати чіткі характерні картини інфекції.

Для кожного з вивчених вірусів можна підібрати набір рослин, які будуть специфічно редагувати на інфекцію (рослини – індикатори вірусу). Різні штами вірусу можуть відрізнятися по набору чутливих рослин-хазяїв або викликати різні типи реакції при ураженні рослин-індикаторів. Так наприклад, штам Vulgare ВТМ викликає системну реакцію на рослинах Nicotiana sylvestris L., та Nicotiana tabacum L. var Samsun EN, в той час як інші штами ВТМ викликають на цих рослинах некротичну реакцію.

Таким чином, при використанні набору рослин-індикаторів, можливо ідентифікувати даний вірус та визначити його в суміші з іншими вірусами. Такий метод ідентифікації вірусів називається візуальний.

Для ідентифікації вірусу за допомогою набору різних рослин індикаторів виконують такі операції:

1. Вимити руки, робочу поверхню стола, інструменти, роботи проводити на чистому листі фільтрувального паперу.

2. За допомогою механічної інокуляції проводять зараження 2-3 листків рослини глютинози, дурману, хеноподіуму, ячменю, квасолі.

3. Залишок вірусного препарату змивають дистильованою водою.

4. Спостерігають за станом рослини протягом 12 діб з моменту зараження; визначають симптоми інфекції та час з‘явлення симптомів. Ідентифікацію вірусів проводять на основі характеру уражень індикаторних рослин або відсутності інфекції у імунних до даного вірусу рослин.

Для перевірки результатів, отриманих за допомогою візуального методу, використовують серологічні реакції з антисироватками до кожного із визначених вірусів та екстрактами рослин з системною інфекцією. Аглютинація хлоропластів – найпростіший тест для вірусів рослин. Краплю антисироватки або нормальної сироватки змішують з краплею соку зараженої рослини. Якщо вірусні частки вступають в реакцію з антисироваткою, то відбувається аглютинація хлоропластів. Для титрування вірусних антигенів широко використовують серологічний тест – аглютинація. Для проведення цього тесту вірусний антиген у різних розведеннях змішують з одним і тим ж розведенням антисироватки і спостерігають утворення преципітату. Визначають оптимальне співвідношення концентрації антигену до антитіл при якому найшвидше утворюється преципітат та кінцеве розведення антигену, при якому можливе утворення видимого преципітату.

Серед мікроскопічних методів виявлення вірусів в рослинних клітинах широко використовується метод люмінесцентної та електронної мікроскопії. Використання флуорехрому – акридинжовтогарячого дозволяє виявити локалізацію та тип нуклеїнової кислоти.

Для дослідження ультраструктури інфікованих вірусами клітин використовують методику: фіксують невеликий шматочок тканини визначеними хімічними речовинами (наприклад чотириокис осмію), обезводжують, домішують епоксидну смолу, за допомогою скляного ножа зразок ріжуть на шматочки товщиною 50-100 нм і зрізи обробляють солями урану або свинцю та досліджують в електронному мікроскопі.

Мірою інфекційності вірусного препарату є визначення долі інфікованих клітин або час появи симптомів інфекції. В першому випадку, відносно невелика кількість вірусних часток контактує з клітинами рослин, інфікується незначна кількість клітин з утворенням некротичних уражень. Кількість уражень на кожному листі залежить від концентрації вірусу в інокуляті. У другому випадку, коли рослина інфікується одночасно кількома дозами вірусу, за міру концентрації вірусу використовують, залежний від дози, кількісний параметр інфекційного процесу – час появи симптомів.

Тема 6. Інтерференція вірусів.

Клітини, які продукують ретровірус, стають стійкими до наступного зараження цим же вірусом або іншим, але використовуючим ті ж клітинні рецептори для проникнення в клітину. Це явище називають вірусною інтерференцією. Вторинного зараження не відбувається тому, що синтезовані в клітині вірусні поверхневі глікопротеїни блокують специфічні клітинні рецептори. Оскільки цей вид резистентності залежить від клітинних рецепторів, віруси, що зв'язуються з іншими рецепторами, легко заражають уже заражені клітини. Тому вірусна інтерференція служить відмінним тестом при визначенні й класифікації глікопротеїна даного вірусу.

Інтерференція дозволяє також визначати, чи використовують два віруси з однакової тропністю (екотропні і т.д.) ті самі або різні клітинні рецептори. Саме завдяки використанню цього тесту з'ясоване, що амфотропні MuLV підрозділяються на два класи: саме амфотропні віруси й віруси, названі MCF (від англ. mink cell focus-forming - утворюючі фокуси на клітинах норки). Вірусна інтерференція показала, що екотропні, ксенотропні, амфотропні й MCF-віруси входять у клітину через різні рецептори. Ці дані узгодяться з результатами аналізу гена env іншими методами. Наприклад, сироватка, що нейтралізує віруси одного класу, звичайно вибірково нейтралізує інші віруси того ж класу. Крім того, і самі гени env і їх продукти більш подібні у вірусів одного класу.

Тема 7. Культивування вірусів різних груп.

Культури клітин

З появою методу культури клітин лабораторна діагностика вірусних інфекцій за своєю ефективністю піднялася на новий, якісно вищий щабель. Відкриття антибіотиків, конструювання штучних поживних середовищ для культивування клітин in vitro та їх промислове виробництво, поява банків клітинних культур створили оптимальні умови для впровадження методів клітинних культур у практичну вірусологічну лабораторію для виділення вірусів із клінічного матеріалу та ідентифікації їх.

Сучасну практичну вірусологічну лабораторію важко уявити без клітинних культур різного походження. Проте достатньо мати в лабораторії лише кілька ліній клітин, що характеризувалися б високою чутливістю до найбільш поширених вірусів і невибагливістю до умов культивування. Як правило*, до цього обмеженого числа клітинних культур входять клітини епітеліального походження та фібробластоподібні лінії. Із епітеліальних клітинних ліній йдеться про первинно-трипсинізовані культури нирок мавп, поросят, ембріонів людини та ін. Із перещеплюваних клітин доцільно рекомендувати такі відомі лінії, як Неlа, Нер-2, Vего, Rh тощо. Можна доповнити вказаний реєстр клітинних ліній первинно-трипсинізованою культурою фібробластів ембріонів курки або диплоїдною лінією МРС.

Лабораторну діагностику вірусних інфекцій з використанням   методу клітинних культур   звичайно   проводять у два етапи. На першому етапі доводять вірусну природу захворювання шляхом індикації (виявлення) та виділення вірусу з клінічного матеріалу. На другому — ідентифікують виділений агент. Найчастіше вірус виявляють за спричинюваною ним цитопатичною дією (ЦПД) у клітинах, що вирощують у моношарах. Всі відомі типи ЦПД буде описано далі. У цілій низці випадків для встановлення етіологічного діагнозу досить наявності характерної ЦПД. Наприклад, у багатьох лабораторіях, де здійснюють діагностику герпетичної інфекції статевих органів, проводять інфікування клітинних культур фібробластів курячого ембріона клінічним матеріалом від хворих і зазначають у звіті, що «виявлено ознаки ЦПД, властиві вірусові герпесу другого типу». Ідентифікацію виділеного агента у такому випадку не проводять, оскільки першої інформації цілком досить, щоб вона разом із даними клінічного обстеження допомогла лікарю у визначенні справжнього діагнозу. В інших випадках, коли ознаки ЦПД характеризують велику групу вірусів (наприклад, коли йдеться про ентеровіруси), обов'язково треба проводити ідентифікацію виділеного агента у реакції нейтралізації із типоспецифічними сироватками. При цьому слід брати до уваги, що реакція з метою ідентифікації виділеного агента потребує багато часу, іноді до 2—3 тижнів. Тому попередні дані можна надсилати у клініку в такому вигляді: «Виділено ентеровіруси, потрібна подальша ідентифікація».

Міксо- і параміксовіруси звичайно в найбільш використовуваних клітинних культурах не спричинюють формування ЦПД, проте здатні таким чином змінити поверхню клітин у культурі, що ті починають адсорбувати на собі еритроцити. Наприклад, клінічний матеріал інкубують з клітинами моношарової культури, потім клітини відмивають і вносять суспензію еритроцитів морської свинки або еритроцити людини, яка має 0 групу крові. Після певної інкубації з еритроцитами клітини знову відмивають і проводять облік результатів реакції гемадсорбції. Наступну ідентифікацію здійснюють за допомогою реакції гальмування гемадсорбції специфічними сироватками.

Деякі міксо- та параміксовіруси здатні виділяти у культуральне середовище розчинний гемаглютинін, тому їх ідентифікацію можна проводити в реакції гальмування гемаглютинації.

Цілий ряд вірусів, що виділяються у клітинних культурах, ідентифікують методами імунофлюоресценції. Проте, коли складається ситуація, за якої клінічна картина захворювання та характер ЦПД не дають змоги остаточно зарахувати виділений вірус до тієї або іншої групи (родини), слід зробити клітинний гомогенат і дослідити його під електронним мікроскопом. Подібним чином час від часу належить досліджувати і клітинні культури, що використовуються у повсякденній практиці, для контролю їх випадкової контамінації якимись вірусами внутрішньо-лабораторно.

Одержання культур клітин

Для виділення і типування вірусів використовують культури органів і завислих клітин (у суспензії), або моношарові культури. Робота з культурами клітин, незалежно від того, яку систему вирощування клітин при цьому застосовують, може бути ефективною тільки за умов дотримання стерильності, засвоєння методик обробки посуду і гумових виробів, хорошої якості живильних середовищ і сольових розчинів.

Живильні середовища та розчини. Живильні середовища для одержання культур клітин можуть бути ростовими та підтримувальпими. Ростові середовища, або середовища росту, містять поряд з іншими компонентами 5—15 % сироватки крові тварин і сприяють розмноженню клітин, швидкому росту й формуванню моношарових культур. Для виживання клітин у вже сформованому моношарі використовують підтримувальне середовище, де міститься близько 2 % сироватки крові тварин.

За походженням живильні середовища бувають природні й синтетичні.

Природні живильні середовища — це рідини із серозних порожнин, екстракти тканин, продукти гідролізу молока, гемогідролізати тощо. Усі вони ідентичні середовищу, в якому існують клітини в організмі. Недоліком природних живильних середовищ є неможливість створення контрольованих стандартних умов, що пов'язане з варіюючою кількістю живильних компонентів, які входять до їх складу.

Синтетичні живильні середовища, що мають точний хімічний склад, одержують штучно, шляхом додавання до сольових розчинів амінокислот і вітамінів.

Антибіотики. Успішне культивування клітин можливе тільки за умов дотримання асептики. Для того щоб запобігти росту бактерій та плісеневих грибів, використовують антибіотики. Звичайно обмежуються застосуванням пеніциліну (натрієва сіль бензилпеніциліну) та стрептоміцину (хлоркальцієвий комплекс), котрі вносять у живильні середовища і сольові розчини безпосередньо перед вживанням: 100 ОД/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Можна використовувати також гентаміцин (200 ОД/мл), канамі-цин і лінкоміцин (100 ОД/мл), неоміцин (50 ОД/мл), амфотерицин В, або фунгізон (5 ОД/мл), ністатин (50 ОД/мл).

Первинні культури клітин

Первинні культури клітин одержують із тканин людини або тварин шляхом їх ферментативної дезинтеграції. Ці культури клітин можуть зазнавати близько 10 поділів. Первинні культури клітин високочутливі до багатьох вірусів, онкогенно безпечні, їх можна одержати у великій кількості, а це є важливим для проведення лабораторних досліджень. Вадою таких культур вважається значна трудомісткість і тривалість одержання, а також можлива контамінація латентними вірусами.

Нині для одержання культур клітин широко застосовують методи ферментативної дезинтеграції з використанням холодного або теплого трипсину.

Метод з використанням теплого трипсину полягає в тому, що шматочки тканини або цілі органи ембріона вміщують у 0,25 % розчин трипсину при температурі 37 °С. Під час піпетування у теплому трипсині або перемішування шматочків тканин у трипсині на магнітній мішалці відбувається їх дезагрегація на окремі клітини. Порції клітин збирають у міру їх виділення, центрифугують, трипсин зливають, вносять в середовище росту і суспендують у ньому клітини. Принцип методу використання холодного трипсин)' полягає в тому, що шматочки тканин заливають 0,25 % розчином трипсину і залишають на ніч при температурі 4 °С. Потім розчин трипсину із шматочками тканин підігрівають до 37 °С, витримують кілька хвилин і швидко піпетують; суспензію центрифугують, трипсин зливають, клітини повільно піпетують у середовищі росту і визначають їх кількість у лічильній камері Горяєва

Методика приготування одношарової культури фібробластів курячого ембріона. Яйце вміщують у штатив тупим кінцем догори, шкаралупу протирають спиртом, обпалюють, надламують і зрізують. Пінцетом за шийку виймають ембріон і вміщують у чашку Петрі (після кожної маніпуляції інструменти обробляють спиртом і обпалюють). Видаляють голову і нутрощі, переносять тушку ембріона в чашку  Петрі  й  промивають  стерильним  розчином  Хенкса  з антибіотиками. Промивши, ембріон подрібнюють на шматочки розміром 2—3 мм і переносять їх у колбу з розчином трипсину. Витримують протягом 20—30 хв, слабо перемішуючи на магнітній мішалці при кімнатній температурі. Через кожні 20 хв завись клітини зливають у центрифугальні пробірки.

До тканини, що залишилася, додають розчин Хенкса і знову вміщують на магнітну мішалку для подальшої дезагрегації клітин. Процедуру повторюють до повного розщеплення тканини. Одержану суспензію клітин центрифугують на швидкості 1500—3000 об/хв протягом 7—10 хв, трипсин зливають, а клітини суспендують у середовищі росту. Потім суспензію фільтрують, використовуючи лійку з марлевим фільтром, підраховують кількість клітин, розводять середовищем росту до необхідної для посіву концентрації та розливають у пробірки, матраци або планшети для культивування. Загальний вигляд первинно-трипсинізованої культури фібробластів  курячого ембріона подано на мал. 6.

Для визначення кількості клітин у суспензії необхідно. 1) притиснути покривне скло до лічильної камери до появи кілець інтерференції з обох боків; 2) розвести суспензію клітин 0,2 % розчином трипанового синього (1:5); 3) користуючись стерильною піпеткою, асептично набрати суспензію клітин і, торкаючись краю   покривного   скла, дати краплі заповнити простір між покривним склом і лічильною камерою; 4) підрахувати під мікроскопом (об'єктив 20Х, окуляр 10Х) усі клітини у 25 великих квадратах, включаючи й ті, що містяться на верхній та лівій межі кожного квадрата; 5) одержану кількість помножити на розведення (1:5), об'єм суспензії та на постійну величину (10 000).

Американської колекції типових культур АТСС). Кожну клітинну лінію, ще отримує лабораторія, має супроводжувати свій паспорт, де подається така необхідна інформація:

  1.  Назва клітинної лінії, рік її одержання, автор.
  2.  Тканина або орган, з яких клітинна лінія походить.
  3.  Морфологія культури.
  4.  Середовище для культивування.
  5.  Посівна   концентрація   клітин на  1 мл середовища.
  6.  Рекомендована кратність пересівання.
  7.  Метод зняття клітин із скла або іншого   субстрату.
  8.  Частота пересівання.

Середовище, що захищає клітини під час їх консервування методом заморожування.

  1.  Виживання клітин після розморожування, відсоток живих клітин від усієї замороженої популяції.
  2.  Контамінанти.
  3.  Чутливість до вірусів.
  4.  Ізоферменти культури.

14. Середовище підтримки (середовище, де клітини не діляться, але зберігають свою життєздатність).

Нижче наводимо конкретний приклад такого документа:

  1.  Культура клітин 4647;  1974 рік, Л. Л. Миронова та співавтори.
  2.  Нирки дорослої зеленої мавпи.
  3.  Культура складається з епітеліальних клітин.

4. Середовище Ігла — 90 % або суміш середовища Ігла з 0,25 % розчином гідролізату лактальбуміну в рівних пропорціях, сироватка крові великої рогатої худоби — 10%.

  1.  50ХЮ00,  25ХЮ00,   13ХЮ00,  7ХЮ00,   ЗХЮ00  на 1 мл.

1:2.

0,25 % трипсин для культури клітин.

Кожні 4 дні.

  1.  Середовище Ігла — 80%, сироватка великої рога
    тої худоби — 10 %, гліцерин — 10 %.
  2.   84 %.

Бактерії, гриби, мікоплазма; віруси не виявлено.

Культура чутлива до ентеро-, арена-, флаві-, лейко-, параміксо-, рабдо-, аденовірусів.

Клітини мають Г-6-ФДГ та ЛДГ.

14. Середовище Ігла, Ігла МЕМ, 199, ГЛАХІ.
    Перещеплювані культури клітин вирощують у вигляді суспензій (із стаціонарною або проточною системою подавання живильного середовища) або одношарових культур на поверхні скла в посудинах, матрацах, пробірках, панелях. В останньому випадку необхідне систематичне проведення пасажів (посіви) клітин, використовуючи для цього культури попереднього пасажу або музейні клітини, що зберігаються в умовах консервації. Повноцінну популяцію клітин можна одержати лише за умови використання життєздатних клітин.

Для пересівання відбирають культури з чіткими межами між клітинами, що мають типову морфологію. Наявність у полі зору великої кількості округлих клітин, поява клітин з вакуолями, включеннями та іншими ознаками патології роблять дану генерацію непридатною для пересівання. Допускається невелика кількість округлих клітинних елементів, які при незначному струшуванні змиваються з поверхні моношару і не впливають на його придатність до пересівання. Під час росту клітин (на 6— 7-му добу) спостерігається зміна рН у кислий бік, при цьому іноді частина клітин відривається від поверхні скла і потрапляє у живильне середовище. Значне скаламутнення культуральної рідини може бути наслідком бактеріальної контамінації та свідчити про необхідність відповідного контролю.

Відібрану для пересівання культуру клітин відокремлюють від скла за допомогою трипсину (0,25 %), версену (0,2 %), хімопсину (0,02 %) або механічно, зішкрібаючи та подрібнюючи одержані клітини за допомогою багаторазового піпетування. У разі використання версену відокремлення клітин від скла і формування суспензії відбувається при кімнатній температурі за 5—10 хв (по-різному для різних культур). Якщо розпушення шару клітин достатнє і почалося відокремлення його від скла, розчин версену зливають, а в матраци заливають мірну кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини із скла посудини. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічильній камері Горяєва розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. У флакони місткістю 100 мл розливають по 20 мл зависі, що містить 40—60 тис. клітин в 1 мл, у матраци місткістю 1,5 л вносять по 150 мл зависі, в 1 мл якої міститься 60—70 тис. клітин. У пробірки вносять по 180—300 тис. клітин в об'ємі 1 мл. Формування моношару клітин відбувається за 48 год.

Цитопатична дія вірусів у культурах клітин

Різні віруси спричиняють неоднакові зміни у клітинах. Морфологічні зміни, що виникають під час взаємодії вірусу і клітини, називають цитопатичною дією (ЦПД), а віруси, які стають причиною цих змін,— цитопатогенними. Період розвитку і характер цитопатичних змін, спричинених цитопатогенними вірусами в інфікованих культурах клітин, визначаються: 1) властивостями вірусу;. 2) дозою вірусу; 3) властивостями клітин та умовами їх культивування.

Характерні для кожного вірусу цитопатичні зміни розвиваються в культурах клітин, заражених середніми дозами вірусу — 1000—10 000 ЦПД50*, за умови яких процес загибелі клітин розтягується (у часі. Якщо дози вірусу великі або малі, морфологічні зміни у клітинах бувають нетиповими: значні дози вірусів спричинюють розвиток некрозу з повним відшаруванням зруйнованих клітин від скла, а незначні — повільну осередкову дегенерацію клітин.

ЦПД50 — цитопатична доза вірусу, яка спричинює дегенерацію в 50 % пробірок із зараженою культурою клітин.

J.R. Enders (1954) виділив ряд морфологічних проявів вірусної цитопатогенності й запропонував класифікувати віруси на три групи: 1) ті, що спричиняють лише дегенерацію клітин; 2) ті, що зумовлюють утворення внутрішньоклітинних (внутрішньоядерних і цитоплазматичних) включень і дегенерацію клітин (наприклад, вірус віспи), сі) ті, що формують багатоядерні клітини-синцитії та спричиняють дегенерацію клітин з утворенням або без утворення внутрішньоклітинних включень.

Виділяють три основні види змін у випадку зараження культур клітин:

  1.  Утворення багатоядерних гігантських клітин, син-цитпв (мал. 10) і симпластів, що є результатом злиття цитоплазми багатьох клітин  і  амітотичного поділу
  2.  Круглоклітинна .дегенерація (пікноз, зморщування деструкція клітин), що виникає внаслідок втрати міжклітинних зв'язків (мал. 11, 12).
  3.  Розвиток осередків клітинної проліферації, що складаються з кількох шарів клітин.

Ступінь дегенерації клітин оцінюють знаком плюс-(4+)— деструкція всіх клітин (100%); (3+)—більшості клітин  (75%); (2+) - половини   клітин (50%);(+)—25% клітин; (±і)—окремих .клітин. (Відсутність дегенерації позначають знаком мінус.

Враховуючи ЦПД вірусів, слід пам'ятати про неспецифічну «вікову» дегенерацію клітин, яка спостерігається у старіючих культурах, а також про дегенерацію, зумовлену токсичною дією інокульованого матеріалу. Для виключення токсичної дегенерації клітин проводять додатковий пасаж: по 0,2 мл культуральної рідини з пробірок з деге-нерованими клітинами вносять у пробірки із свіжими культурами клітин. Якщо дегенерація була зумовлена токсичним фактором випробовуваного матеріалу, то ЦПД у культурі клітин не розвивається.

Внутрішньоклітинні включення. Надзвичайно характерним для ЦПД багатьох вірусів є формування внутрішньоядерних і цитоплазматичних включень. Динаміка їх формування, їхні форма, розмір, субклітинна організація, наявність у них вірусспецифічних нуклеїнових кислот і білків мають важливе діагностичне значення, оскільки відрізняються у вірусів різних таксономічних груп.

Включення можна виявити в забарвлених або оброблених флюорохромами препаратах. Для цього культури клітин вирощують на скляних пластинках («літаюче скло») або пластинках з прозорої слюди, у пробірках або матрацах. Потім культури заражають вірусом, і через певні строки інкубації, залежно від властивостей інокульованого вірусу, готують препарати, забарвлюючи їх барвниками або флюорохромами.

Для вивчення включень можна приготувати відбитки органів і тканин, зскрібки клітин, гістологічні зрізи з ураженої тканини. У наш час у зв'язку з трудомісткістю й тривалістю приготування препаратів метод гістологічних зрізів використовують для виявлення внутрішньоклітинних включень дуже рідко, здебільшого для діагностики сказу.

Забарвлення препаратів. Універсальним є забарвлення за Романовським Гімзою у різних варіантах, під час якого виявляються всі види вірусних включень. Забарвлені за цим методом препарати фіксують у суміші Дюбоска—Бразіля—Буена (пікринова кислота — 1 г, 4 % формалін — 60 мл, 80% етиловий спирт—150 мл, крижана оцтова кислота — 15 мл). Препарати опускають у нерозве-дений розчин барвника Романовського — Гімзи на 10 хв, промивають дистильованою водою та висушують на повітрі. Після забарвлення за цим методом вірусні включення стають рожевими або рожево-бузковими.

Забарвлення за Павловським. Препарати забарвлюють протягом   3—5   с   барвником,   виготовленим   з  10 мл   диетильованої води, 1 краплі насиченого спиртового розчину основного фуксину, 8 крапель водного або насиченого спиртового розчину метиленового синього. Барвник змивають проточною водою, і препарати висушують на повітрі.

Забарвлення за Селлером. Вологий мазок або відбиток без фіксування 10 с забарвлюють сумішшю з насичених розчинів у метиловому спирті основного фуксину (32 мл) і метиленового синього (15 мл), а також чистого метилового спирту (25 мл). Промивають проточною водою, сушать на повітрі, мікроскопують. Вірусні включення (тільця Бабеша—Негрі) забарвлюються у червоний колір, цитоплазма, ядра, ядерця — у синій, еритроцити —- у червоно-коричневий.

Забарвлення гематоксилін-еозином (оглядове гістологічне): препарати фіксують на 5—10 хв у 70% та 96% етиловому спирті, промивають дистильованою водою, забарвлюють гематоксиліном Мейєра 3—5 хв, знову промивають дистильованою водою та 1—2 с витримують у 1 % водному розчині еозину. Потім препарати промивають дистильованою водою, роблять спиртову провідку (70 %, 96 % і абсолютні спирти, в кожному по 1—2 с) і освітлюють у ксилолі протягом 10—15 хв.

Забарвлення флюорохромами. Препарати фіксують у холодному ацетоні на 10—15 хв або у 70 % етиловому спирті —5 хв, потім у 96% етиловому спирті —3—5 хв. Після цього їх вміщують у водний розчин акридинового оранжевого (1 : 10 000) на 1—3 хв, промивають дистильованою водою, сушать і досліджують під люмінесцентним мікроскопом, ДНК-вмісні структури дають зелене світіння, а РНК-вмісні — червоно-оранжеве.

Змістовний модуль ІІ. Екологічні проблеми вірусології.

Тема 1. Мінливість вірусів. Біологія розповсюдження вірусів.

В екології — науці про взаємини організмів один з одним, включаючи популяції вірусів і інші таксономічні групи, із навколишнім середовищем — існує поняття екологічної ніші — місця, яке займає дана таксономічна група на землі. Екологічна ніша — широке поняття, що включає в себе й ареал, і взаємини досліджуваної таксономічної групи з іншими групами організмів, і роль їх у природних біоценозах, і, нарешті, місце, яке вони займають у біосфері.

Як було сказано вище, віруси, не будучи організмами, проте, є своєрідною формою життя, якій властиві всі основні її прояви, аж до здатності еволюціонувати, пристосовуватися до мінливих умов середовища. Позбавлені власних білоксинтезуючих систем, вони є автономними генетичними структурами, назавжди прив'язаними до внутрішнього середовища організму — від найпростішої прокаріотичної клітини до вищого багатоклітинного організму. Ці організми і є екологічною нішею вірусів.

Віруси населяють одноклітинних прокаріотів (бактерій) і еукаріотів (гриби, найпростіші), усі види рослин і тварин. Багато вірусів здатні паразитувати в організмі лише одного виду. Такими є деякі фаги, віруси рослин, віспи тварин, гепатитів людини. Інші віруси вражають кілька близьких видів тварин. Такими є  бактеріальні плазміди, віруси хвороб картоплі й пасльонів, вірус ящуру, що вражає багато видів парнокопитних, віруси грипу людину й тварин.

Існує більша група вірусів, що мають двохфазний тип поширення, при якому або відбувається послідовна зміна хазяїв, або інший живий організм є механічним переносником. У ряді випадків організм комахи є, поряд з організмом рослини, місцем розмноження вірусу. Це типова двофазна система, де вірус послідовно міняє двох хазяїнів, що утворюють міцний біоценоз, чим і забезпечується збереження й поширення даного вірусу.

Зокрема, такі двофазні системи частіше зустрічаються у вірусів, що вражають тварин. По суті більша частина вірусів, що передаються кровосисними членістоногими — кліщами, комарами, москітами, мокрицями й т.п., послідовно змінюють двох хазяїнів, розмножуючись звичайно в організмі кожного з них.

Епідеміологія вірусних інфекцій

В епідеміології вірусних інфекцій панує антропоцентричний принцип, і епідеміологія вірусних інфекцій або, принаймні, більшості з них, не має істотних відмінностей від епідеміології бактеріальних або протозойних інфекцій.

Відповідно до її положень, епідемічний (епізоотичний) процес представляє безперервний ланцюг заражень (інфекційних процесів), що супроводжуються виходом збудника в зовнішнє середовище. У цьому ланцюзі слід розрізняти джерела інфекції, фактори передачі, організми, що заражаються

Джерелами інфекції може бути людина або тварина. Відповідно всі хвороби, викликувані збудниками, здатними паразитувати тільки в організмі людини, називаються «антропонози». Якщо ж людина заражається від тварину, такі хвороби позначають як «зоонози». Прикладами антропонозів серед вірусних інфекцій є грип, кір, віспа, герпес, поліомієліт. Прикладами зоонозів є кліщовий енцефаліт, лихоманка флеоботомна (москітна лихоманка), лихоманка Ласса, лімфоцитарний хоріоменінгіт, ящур.

До поняття джерел інфекції примикає, але не тотожно йому поняття резервуара інфекції, під яким мають на увазі сукупність видів, що підтримують існування даного збудника. Для антропонозів резервуаром інфекції є людина, людське суспільство, іноді обмежене певним ареалом. Наприклад, лихоманка денге поширена тільки в тропічному поясі. Для зоонозів під резервуаром інфекції розуміють види тварин, серед яких циркулює даний вірус, нерідко включаючи кровосисних (кліщів, комах), які стосовно людині є переносниками.

Поняття «антропонози» і «зоонози» не завжди відбивають дійсні процеси в природі й суспільстві. Так, жовта лихоманка міська безперечно є антропонозом, тому що захворювання передається від людини до людині через укуси комарів. Але першоджерелом її є жовта лихоманка лісова (лихоманка джунглів), природні вогнища якої в Центральній Африці існують незалежно від людей і забезпечуються циркуляцією вірусу між мавпами й комарами. Таким чином, це типовий зооноз. Винесення вірусу жовтої лихоманки лісової за межі природних вогнищ і циркуляція його серед людей перетворює хворобу в антропоноз. Щось подібне спостерігалося в минулому з японським енцефалітом у Японії, коли цей зооноз сільськогосподарських тварин заносився в міста й тимчасово ставав антропонозом, тому що захворювання в міських умовах передавалися комарами від людини до людині. Подібні процеси мали місце в деяких районах Середземномор'я й у Криму при флеботомній лихоманці (москітна лихоманка).

Ще складніше справа із грипом. Ця глобальна інфекція є безперечно антропонозом, тому що людина заражається нею тільки від людини. Проте, майже кожна велика епідемія грипу супроводжується викидом збудників у популяції домашніх і диких тварин (включаючи птахів), де ці віруси можуть зберігатися й циркулювати тривалий час. Більш того, є вагомі підстави вважати, що в процесі пересортовування генів вірусів грипу можуть з'являтися штами, що викликає епідемії й пандемії, які починають циркуляцію серед людей по типу чистого антропоноза.

Джерела інфекції (мова йде переважно про антропонози) підрозділяють на хворих, носіїв у стадії видужання (реконвалесценти) і здорових носіїв. Більшість вірусних інфекцій щодо цього майже не відрізняються від бактеріальних.

Фактори передачі вірусних захворювань ті ж, що й при інших інфекційних хворобах: повітря, вода, їжа, ґрунт, предмети побуту, а також членистоногі — переважно кровосисні. Відповідно розрізняють повітряно-краплинний механізм передачі, фекально-оральний, крізь ушкоджені зовнішні покриви й за допомогою укусу кровосисних членистоногих. При вірусних інфекціях існує ще один механізм передачі вірусів — вертикальний, який здійснюється двома способами: внутрішньоутробне зараження плода й генетична передача. Внутрішньоутробне зараження плода може спостерігатися при зараженні вагітної жінки вірусами краснухи, цитомегалії й ін. Циркулюючи в крові, ці віруси проникають крізь плацентарні бар'єри й ушкоджують плід, викликаючи розвиток каліцтв. Генетична передача характерна для онкогенних вірусів і обумовлена інтеграцією їх генома з геномом полових клітин.

Сприйнятливі індивідууми є тим ґрунтом, на якому розвивається епідемічний процес. При інфекціях, що передаються повітряно-краплинним шляхом, захворюваність регулюється рівнем колективного імунітету, який формується після чергової епідемії. Прикладом є виникнення епідемії кіру у ізольованих колективах, всі  члени яких занедужують, за винятком осіб, що перенесли кір при попередньому  занесенні. При грипі також захворюваність регулюється рівнем колективного імунітету, однак у зв'язку з мінливістю протективних антигенів вірусу грипу колективний імунітет не забезпечує захист від інфекцій, тому епідемії грипу повторно вражають ті ж самі контингенти.

Колективний імунітет регулює захворюваність і при ряді ентеровірусних інфекцій, зокрема при поліомієліті й гепатиті А, а в ендемічних місцевостях — і при деяких арбовірусних інфекціях. При зазначених інфекціях доцільна вакцинація, яка формує необхідний колективний імунітет.

Серед вірусних хвороб є такі, сприйнятливість до яких абсолютна й імунітет після них зберігається на багато років або навіть на все життя (недавно ліквідована віспа, кір, кліщовий енцефаліт). Існують інфекції, сприйнятливість до яких невисока, однак розвивається добре виражений імунітет ( поліомієліт, гепатит А, багато ентеровірусних інфекцій). Зустрічаються інфекції, що викликають недостатньо міцний імунітет, у результаті чого можливі повторні захворювання (параміксовірусні, риновірусні, аденовірусні інфекції), а також інфекції, при яких імунітет мало ефективний внаслідок мінливості збудника (грип), і, нарешті, інфекції хронічні, при яких імунні реакції не є ефективними (герпетичні, цитомегаловірусні, аденовірусні інфекції). Тому при вивченні епідеміології вірусних інфекцій важливо знати імунологічний статус відносно досліджуваної інфекції. Це допомагає правильно планувати й проводити профілактичні щеплення, як це робилося при масовій ліквідації поліомієліту, зниженні захворюваності кором, глобальніму викорінюванні віспи.

Тема 2. Вірусні захворювання, методи профілактики та боротьби з вірусними інфекціями.

Хіміотерапія вірусних інфекцій

Істотні відмінності в структурі й біосинтетичних процесах у прокаріотів (бактерій) і еукаріотов ( зокрема, у людини й вищих тварин) обумовлюють широкі можливості пошуку ефективних і нешкідливих для організму хіміотерапевтичних речовин, тим більше що існування багатьох з них підказала сама природа у вигляді антибіотиків. Так, наприклад, пеніциліни порушують синтез клітинної стінки бактерій — утворення, відсутнього в клітинах тварин, і тому для хворого значні дози цих антибіотиків відносно нешкідливі. Тетрацикліни порушують нормальну роботу прокаріотичних рибосом (правильність зчитування генетичного коду) і мало впливають на еукаріотичні рибосомальні системи і т.д.

Інакше справа з хіміотерапією вірусних інфекцій, що вражають людину й тварин. Репродукція вірусів найтіснішим образом пов'язана з функціонуванням еукаріотичних клітин, у яких вони паразитують, у зв'язку із чим звичайні антибіотики, що діють на прокаріоти (бактерії), неактивні відносно вірусів. Пошук антивірусних речовин, що специфічно блокують вірусну інфекцію, але не ушкоджують клітини організма, за принципом «чарівної кулі» засновника хіміотерапії П. Ерліха, є досить складним завданням. Тому успіхи в області хіміотерапії вірусних інфекцій незначні, набір хіміотерапевтичних препаратів невеликий, і кожен новий ефективний препарат з’являється не швидко.

Мішень дії антивірусних препаратів. У кожній зі стадій репродукції вірусів можна вичленувати ланку, на яку можна направити дію хіміопрепарату.

Існує, однак, і інший підхід до хіміотерапії вірусних інфекцій, заснований на положенні, що мішенню дії антивірусної речовини може бути заражена вірусом клітина. Така клітина в генетичному і функціональному відношенні відрізняється від здорових клітин і є мішенню дії стимульованих Т-ефекторів. Руйнування невеликої популяції заражених клітин у початкових стадіях інфекції до її генералізації, не повинно стати катастрофою для організму. Виявлення заражених клітин можливо, по-перше, імунологічно за допомогою антитіл, специфічних до вірусіндукованих антигенів. По-друге, селективна загибель заражених клітин можлива в результаті підвищення проникності плазматичної мембрани зараженої клітини для ряду сполук, таких як деякі аномальні нуклеозіди, бактеріальні токсини й ін.

Третя можливість полягає у використанні потенціальних токсинів — претоксинів, які можуть активуватися й перетворюватися в токсини тільки в заражених клітинах завдяки дії вірусоспецифічних ферментів. Такі вірусоспецифічні ферменти, як протеази, протеїнкінази, нуклеотидкінази можуть активувати різні групи сполук, що використовуються у вигляді претоксинів, які в результаті внутрішньоклітинної активації викликають загибель зараженої клітини.

Таким чином, мішенню дії антивірусних речовин можуть бути: 1) вірусоспецифічні процеси в зараженій клітині; 2) заражена клітина.

Пошук і відбір антивірусних препаратів. Створення нових антивірусних препаратів ведеться за двома напрямками. Першим з них є потоковий метод вивчення антивірусної активності великої кількості синтетичних і природних сполук (скринінг). Скринінг має кілька етапів. На першому етапі виявляється ступінь інгібування репродукції вірусів, на другому — токсичну дію відібраних препаратів на нормальні клітині, на третьому визначається мінімальна активна концентрація препарату, що не має токсичної дії на клітини. Таким шляхом визначається хіміотерапевтичний індекс — відношення мінімальної ефективної дози до максимальної стерпної. На останньому етапі проводиться подальше вивчення відібраних препаратів.

Результати багаторічних трудомістких пошуків антивірусних речовин шляхом емпіричного відбору виявилися досить незначними й увінчалися відкриттям одиничних хіміопрепаратів, що мають вузький спектр дії. Так, наприклад, амантадін і ремантадін ефективні лише при грипі, що викликається вірусом типу А, але не В, метисазон діє лише на інфекцію, яка викликається вірусами віспи, і т.д. Очевидно, що, ідучи цим шляхом, можна й у майбутньому очікувати одержання обмеженого числа препаратів з вузьким спектром дії.

Тим часом природа на прикладі інтерферону показує нам і інші шляхи, які могли б привести до створення антивірусних препаратів із широким спектром дії й високою ефективністю.

Завдяки досягненням фундаментальних досліджень в області вірусології й з'ясуванню молекулярних механізмів репродукції вірусів з'явилася можливість для розвитку нових підходів до хіміотерапії вірусних інфекцій, які засновані на спрямованому одержанні або синтезі хіміопрепаратів, що діють на свідомо відомі вразливі стадії репродукції вірусів або на функції клітин, необхідні на якомусь загальному для різних груп вірусів етапі їх репродукції.

Антивірусні препарати

Сьогодні застосовуються наступні групи антивірусних хіміопрепаратів: 1) аномальні нуклеозиди; 2) похідні адамантанаміна гідрохлориду; 3) тіосемікарбазони. Перспективними є нові напрямки хіміотерапії вірусних інфекцій, з яких розглядаються два: ушкодження вірусних генів і інібіція протеолітичної активності вірусів.

Аномальні нуклеозиди. Транскрипція генома ДНК-вмісних вірусів (крім вірусів віспи) і його реплікація здійснюються переважно клітинними ДНК- і РНК-полімеразами. Проте, кожний ДНК-вмісний вірус індукує в зараженій клітині синтез власних ферментів, що забезпечують транскрипцію й реплікацію вірусоспецифічної ДНК. Індуковані вірусом ферменти в ряді випадків відрізняються від клітинних ферментів за своїми властивостями, наприклад за стабільністю до температури, рН, концентрацією іонів, за субстрат-специфічністю. Тому в хіміотерапії інфекцій, що викликаються ДНК-вмісними вірусами, знайшли застосування аномальні попередники нуклеїнового обміну — похідні нуклеотидів і нуклеозидів. Найбільш активними сполуками виявилися аномальні нуклеозиди, які знаходять все більше застосування в антивірусній терапії. Одержання їх засноване на хімічній модифікації природних речовин з метою створення біологічно активних сполук спрямованої дії.

Антивірусний ефект аномальних нуклеозидів у більшості випадків обумовлений внутрішньоклітинним фосфорилюванням неактивного нуклеозида до активного нуклеотида. Як аналоги нуклеотидів, вони конкурують із природними нуклеотидами за ферменти, що беруть участь у синтезі нуклеотидів і нуклеїнових кислот. Аномальні нуклеозиди інгібують функції вірусних полімераз, а при включенні у вдруге синтезовані нуклеїнові кислоти роблять їх нефункціональними. Природно, що це відбувається не тільки з вірусною, але й із клітинними ДНК і РНК. Тому основною проблемою, що обмежує застосування аномальних нуклеозидів, є відсутність селективності їх дії й порушення клітинного метаболізму.

Хоча аномальні нуклеозиди мають широкий спектр дії, вони мало ефективні при вірусних инфекціях. Виключенням є захворювання, що викликаються вірусами герпеса й віспи, синтез ДНК яких чутливий до доз аномальних нуклеозидів, що задовільно переносяться організмом. Тому аномальні нуклеозиди знайшли широке застосування в клініці при лікуванні шкірного герпеса, герпеса очей, статевих  органів, а також вітряної віспи, цитомегалії й інфекцій, що викликаються вірусами віспи.

Антивірусна дія аномальних нуклеозидів може значно підсилитися при їхньому комбінованому застосуванні в тому випадку, якщо вони мають різні точки прикладення.

Піримідинові аналоги. Ідоксурідин (2-дезоксиурідин).   Препарат   містить атом йоду в 5-го атома піримідинового кільця і є аналогом тимідина — нуклеозида, залученого в синтез ДНК. Його антивірусний ефект обумовлений включенням нуклеотида, що утворюється при внутрішньоклітинному фосфорилюванні нуклеозида, у вдруге синтезовану вірусну ДНК. Препарат активний проти ДНК-вмісних вірусів — вірусів простого герпеса, цитомегалії, осповакцини, псевдоскаженості. Селективність препарату стосовно вірусної ДНК обумовлена більшою швидкістю синтезу її в порівнянні із клітинною в процесі репродукції вірусу. Однак препарат має низький терапевтичний індекс і в основному використовується для місцевого застосування. Широке застосування препарат одержав при герпетичному кератиті, при якому він призначається у вигляді 0,1% розчину й 0,5% мазі.

Пуринові аналоги. Аденін-арабінозид (ара-А, або видарабід). Нуклеозид виділений з карибської губки в 60-х роках і застосований спочатку як протипухлинний препарат. Пізніше була виявлена його антивірусна активність проти вірусів герпеса й віспи. Одержання нуклеозида ферментативним шляхом значно знизило його вартість. Ара-А є аналогом дезоксирибонуклеозида аденіна. Терапевтична ефективність його така ж, як у ідоксурідина, але препарат має меншу токсичність. Застосовується для лікування герпетичних кератитів, вітряної віспи, герпеса. Його здатність до проникнення крізь гематоенцефалічний бар'єр дозволив застосовувати препарат при герпетичних енцефалітах. Для місцевого застосування використовується 3% мазь, для внутрішньовенного введення — розчин, що містить не більше 0,7 мг/мол. У зв'язку з відносно високою токсичністю оптимальною дозою є 10 мг/кг у день, що вводиться протягом 12-годинного періоду.

Іншими пуриновими арабінозидами, застосовуваними для лікування герпетических інфекцій, є 5-монофосфат аденін-арабінозида (ара-АМФ) і 5-монофосфат гіпоксантин-арабінозида (ара-НхМР).

Ацикловир (ациклогуанозин). Цей аномальний нуклеозид, 9-( 2-гідроксиетоксиметил) -гуанін, є представником нового класу сполук, у яких цукор в аномальному нуклеозиді замінений аліфатичним ланцюгом. Ацикловир має селективну активність проти вірусу простого герпеса, але не має антивірусної   дії відносно   вірусу   віспи.

Препарат має меншу токсичність у порівнянні із іншими аномальними нуклеозидами й пригнічує ріст клітин у концентрації в 3000 раз більшої, ніж антивірусна концентрація. Препарат активний при герпетичному кератиті й енцефаліті, шкірному й статевому герпесах, менш активний при інфекціях, що викликаються вірусами вітряної віспи, Епстайна — Барра, цитомегалії. Його антивірусна активність обумовлена внутрішньоклітинним фосфорилюванням до 5'-монофосфата вірусоспецифічною тимідинкіназою у заражених вірусом герпеса клітинах, а потім в 5'-трифосфат, який специфічно інгібує вірусну ДНК-полімеразу. Фосфорилювання препарату в незаражених клітинах відбувається лише в незначному ступені й цим пояснюється його селективна дія на них. Завдяки низькій  токсичності та високовибірковій дії на синтез вірусоспецифічної ДНК, ацикловир є перспективним антивірусним препаратом. Він застосовується місцево у вигляді 5% мазі, внутрішньовенно в дозі 5 мг/кг у день.

Рибавірин (віразол). В 60-х роках зі стрептоміцетів були виділені антибіотики шоудоміцин і піразоміцин, що представляють собою нуклеозиди зі значною антивірусною активністю. Широкий спектр їх дії підказав синтез структурних аналогів, з яких найбільш активним антивірусним препаратом виявився рибавірин (віразол), що представляє собою 1_р_0 рибофуранозил-1, 2, 4-тріазол-3-карбоксамід. Його антивірусний ефект заснований на включенні препарату у вірусоспецифічні РНК і ДНК і дії на вірусні РНК- і ДНК-полімерази. Рибавірин має широкий спектр дії, володіючи ефективністю проти ДНК- і РНК-вмісних вірусів — вірусів грипу, парагрипу, кору, Коксакі, поліомієліту, риновіруса, Синдбіс, везикулярного стоматиту, герпеса, осповакцини й ін. Препарат застосовується перорально в дозах 400—600 мг у день. Перспективним є аерозольний спосіб введення його при респіраторних інфекціях.

Протипухлинні препарати. У відношенні ретровірусів пошук хіміотерапевтичних препаратів був спрямований на виявлення специфічних інгібіторів зворотної транскриптази (ревертази). Є ряд таких сполук, які залежно від принципу їх дії можуть бути розділені на кілька груп. Найбільший інтерес представляють препарати, що є аналогами матриць для вірусних зворотних транскриптаз. Принцип їх хіміотерапевтичної дії заснована на порушенні функціонування зворотних транскриптаз при хімічній модифікації матриці. Одним з активних сполук є аналог поліцитидилової кислоти — МК1С — що містить 5-меркаптозаміщені основи цитозина. Препарат застосовується при лікуванні лейкозів у дітей. Дія інгібіторів зворотних транскриптаз спрямована на блокування інтеграції генома ретровірусів із клітинної ДНК. Після того, як інтеграція відбулася, і при ендогенних ретровірусах ці препарати неефективні.

Похідні адамантанаміна гідрохлориду (амантандин і ремантадин). Ці речовини є синтетичними сполуками, що представляють собою первинні аміни з певною структурою (конформація «крісло»). Оба препарати інгібують репродукцію ряду вірусів — грипу, Сендай, ньюкаслськой хвороби, кору, краснухи, везикулярного стоматиту, альфа-вірусів і інших ліпідо-вмісних вірусів. Крім того, амантадин застосовується як фармакологічний засіб для лікування хвороби Паркінсона. Найбільш активні препарати відносно вірусу грипу типу А.

Дія препаратів активується на ранній стадії репродукції вірусів, мішенню їх дії є пізня стадія роздягання вірусів. Чутливість до ремантадину й амантадину різних штамів вірусу грипу типу А коливається в широких межах і обумовлена геном, що кодує М-білок.

У цей час протигрипозні препарати ряду адамантана є найбільш ефективними засобами хіміотерапії й хіміопрофілактики грипу. У нашій країні синтез ремантадина проведено в Інституті органічного синтезу АН Латвійської РСР. Препарат пройшов широкі клінічні випробування й використовується для лікування й профілактики грипу. Лікування успішне при використанні препарату на ранніх стадіях інфекції. При пероральному застосуванні препарати досягають максимального рівня в крові через 4 год, близько 90% їх виводиться в незміненому вигляді із сечею. Рекомендована доза 150—300 мг у добу нетоксична для людини. Лише при дозах, що в 12 раз перевищують цей рівень, препарати проявляють ембріотоксичну й тератогенну дію. Можливі ускладнення при тривалому застосуванні зустрічаються у винятково рідких випадках і пов'язані із проникненням препарату в ЦНС, що супроводжується явищами депресії, запамороченням, занепокоєнням. Застосування амантадина й ремантадина — синтетичних нетоксичних протигрипозних препаратів високовибіркової дії є видатним досягненням хіміотерапії й хіміопрофілактики. Однак, не виключено, що використання цих препаратів у майбутньому може бути обмежене у зв'язку з появою стійких штамів вірусу грипу.

Тіосемікарбазони. Метісазон (Marboran) — синтетичний антивірусний препарат, активний проти вірусів віспи. Антивірусна активність обумовлена беньзольним кільцем і бічним ланцюгом, що містить сірку. Механізм дії препарату полягає в пригніченні трансляції пізніх вірусних іРНК і зборці вірусної частки.

Антивірусна активність препарату відома з 1950 р., але вперше широке випробування його профілактичної дії було здійснено під час спалаху натуральної віспи в Мадрасе в 1963 р., де метізасон показав високу ефективність. Препарат застосовується для профілактики й лікування віспи й ускладнень при вакцинації.

Метісазон погано розчинний і застосовується перорально у вигляді суспензії в дозі 200 мг/кг і потім по 500 мг/кг маси тіла дробовими дозами протягом 48 год. Максимальний рівень у крові досягається через 6 год після введення. Побічним ефектом при застосуванні препарату є нудота й блювота, які з'являються через 4—6 год послу введення.

Перспективний у якості противіспенного засобу тіосемікарбазон-5-циантіофенальдегід.

Набуття стійкості до хіміопрепаратів. Обставиною, що ускладнює застосування хіміопрепаратів, є поява варіантів вірусів, стійких до інгібіторів: вірусів віспи до метісазону; вірусів грипу до амантадину й ремантадину і т.д. Зниження ймовірності появи стійких мутантів може створити комбіноване застосування антивірусних препаратів з різним механізмом дії на репродукцію вірусу, яке підсилює антивірусну дію кожного з них.

Нові напрямки хіміотерапії вірусних інфекцій

Ушкодження вірусних генів. Один з нових напрямків хіміотерапії можна сформулювати як «ушкодження вірусних генів». Із цією метою застосовували нуклеази. Надалі цей напрямок трансформувався в більш раціональну ідею, яка полягає в тому, щоб пошкоджувати ген за допомогою сполук, пов'язаних з комплементарними олігонуклеотидами.

Інгібування протеолітичної активації. У цей час нагромадилися дані про те, що для виникнення інфекційного процесу необхідна протеолітична активація вірусу, тобто нарізування одного або декількох його білків. Сутність цього феномена полягає в тому, що багато вірусних білків здобувають функціональну активність лише після протеолітичного нарізування. У пікорна-, тога-, ретро- і інших вірусів цей процес лежить в основі формування всіх структурних вірусних білків, які утворюються в результаті нарізування білка-попередника. У ортоміксо-, параміксо-, рео-, бунья-, аренавірусів і ін. протеолітичного нарізування зазнають у першу чергу глікопротеїди. Нарізування проходить по типу крапкового (обмеженого) протеолізу шляхом розрізування білка на два фрагменти й здійснюється або тільки клітинними, або клітинними й вірусоспецифічними протеазами. Для правильного нарізування білка, що забезпечує його активацію, необхідні протеази певної специфічності. Універсальність феномена протеолітичної активації й уразливість його для дії інгібіторів протеолітичної активації дозволяє розглядати його як зручну мішень для хіміотерапії ряду вірусних інфекцій.

Інгібіторами протеаз є офіціальні препарати гордокс (ВНР), контрикал (ГДР) і е-амінокапронова кислота, які застосовуються при панкреатитах і геморрагічних станах. Клінічні випробування вітчизняного препарату е-амінокапронової кислоти при грипі у дітей показали високу антивірусну активність препарату і його лікувальну ефективність. Найбільш ефективним способом застосування є інгаляційний, лікувальний ефект препарату найбільш значний на ранніх етапах інфекції.

Крім грипу, антивірусна дія інгібіторів протеолізу проявляється при інфекціях, викликаних пикорнавірусами, парагрипозними вірусами, альфа-вірусами, аренавірусами, ротавірусами.

Імунопрофілактика вірусних інфекцій

Вірусні вакцини

Вакцинація має велике значення в профілактиці вірусних інфекцій. У результаті вакцинації в організмі виробляється імунітет, обумовлений гуморальними й клітинними факторами, і організм стає несприйнятливим до інфекції. Ефективні вакцини створені проти багатьох вірусних інфекцій. У результаті вакцинації в усьому світі ліквідована віспа, переможено поліомієліт, ведеться успішний наступ на кір, жовту лихоманку й інші інфекції.

У цей час відомі наступні види вірусних вакцин. 1. Вакцини з живих аттенуйованих вірусів. 2. Корпускулярні (віріонні) вбиті вакцини. 3. Субодиничні вакцини. 4. Генноінженерні вакцини. 5. Синтетичні вакцини.

Останні два типи вакцин знаходяться у стадії розробки й практично ще не застосовуються.

Щеплення проти віспи, поліомієліту й кіру є обов'язковим. У зв'язку з ліквідацією віспи в усьому світі вакцинація проти віспи в ряді країн скасована й проводиться лише обмежена вакцинація особливо загрозливим контингентам населення. Вакцинація проти жовтої лихоманки, сказу, кліщового і японського енцефалітів проводиться особам з ризиком зараження.

Живі вакцини готуються з аттенуйованих вірусів, отриманих різними прийомами — відбором дрібних колоній, адаптованих у холоду мутантів і т.п. Вакцинні штами повинні бути генетично стабільними й не давати реверсій до дикого типу. Живі вакцини відрізняються від убитих тим, що вони імітують утворення природнього імунітету, тому що при введенні в організм вакцинальні штами розмножуються, викликаючи розвиток вакцинальної реакції, яка подібна з природнім процесом, але відрізняється відсутністю або слабкою виразністю патологічних явищ. Тому живі вакцини викликають розвиток імунітету, що супроводжується виробленням як гуморальних (В), так і секреторних (А) антитіл і появою стимульованих Т-ефекторів і клітин пам’яті. Однак живі вакцини мають ряд недоліків. Природньою живою вакциною був вірус коров'ячої віспи, який Дженнер в 1796 р. прищепив дитині. Від англ. vасса — корова — одержали свою назву вакцини. Прикладом ефективності вакцинопрофілактики є видатний успіх у боротьбі з віспою, що завершився її ліквідацією в усьому світі. Великі успіхи досягнуті в боротьбі з поліомієлітом. У нашій країні була отримана жива полиомієлітна вакцина зі штамів А. Сейбіна, встановлена її безпека й висока ефективність, після чого почалося її масове застосування в СРСР, а потім і в більшості країн світу. У результаті планової масової вакцинації ліквідовані епідемії поліомієліту й мають місце лише спорадичні випадки захворювань.

Є успіхи в боротьбі з кором. У нашій країні розроблена жива корева вакцина й організована масова вакцинація проти кору. У результаті в 8—10 раз знижена захворюваність ним. При правильній організації щеплень можна очікувати повну ліквідацію кору. Була отримана жива вакцина проти паротиту, яка застосовується в асоціації з коревою вакциною. Розроблено кілька варіантів живої грипозної вакцини. На черзі розробка живих вакцин проти гепатиту А і краснухи.

Корпускулярні вбиті вакцини готують з очищеного концентрованого вірусу, інактивованого формальдегідом, амінометилольними сполуками (сполука формальдегіду з амінокислотами) або ультрафіолетовим опроміненням (останній метод не завжди буває надійним). Перевагою цих вакцин є точне дозування антигену й, отже, більш-менш стандартна імунна відповідь. Недоліком вбитих вакцин є необхідність багаторазового введення й ін'єкційний шлях введення, у результаті чого не відбувається утворення секреторних імуноглобулінів класу А.

У нашій країні розроблені й застосовуються ряд інактивованих вакцин, наприклад вакцина проти грипу й поліомієліту. Отримана вбита вакцина проти герпеса, яка застосовується при рецидивуючих формах шкірних, очних, стоматологічних вірусних захворювань і при статевому герпесі.

Перша вакцина проти кліщового енцефаліту була розроблена радянськими вченими в 1939 р. У наступні роки препарат вдосконалювали з метою зниження його реактогенності й підвищення ефективності. У цей час отримані ареактогенні культуральні вакцини.

Застосовуються вакцини проти сказу, отримані з мозку лабораторних тварин і в культурі клітин. Отримані вакцини проти кінських західного й східного енцефаломієлітів, японського енцефаліту.

У стадії впровадження перебуває вакцина проти гепатиту В, отримана із Нв-Антитіла. Кількість вбитих вакцин у найближчі роки буде значно збільшене.

Поствакцинальні ускладнення. Вірусні вакцини й інші профілактичні вірусні препарати контролює Державний науково-дослідний інститут стандартизації й контролю медичних біологічних препаратів їм. Л. А. Тарасевича, де перевіряють нешкідливість препаратів для людини, імуногенність, стерильність і інші їхні властивості. Для кожного препарату складається інструкція з його застосування. Проте, бувають випадки поствакцинальних ускладнень, які можна розділити на дві групи. До першої групи відносяться ускладнення, пов'язані з порушенням технічних правил вакцинації, введенням вакцин аллергізованим або ослабленим особам. До другої групи відносяться ускладнення, викликані використанням недосконалих препаратів. Висока реактогенність вакцин може бути обумовлена рядом причин, у тому числі біологічними особливостями виробничого штаму вірусу, недостатньою інактивацією вірусу, контамінацією живої вакцини диким штамом і т.д. Наприклад, важкі ускладнення можуть з'явитися при використанні вакцин проти сказу й кліщового енцефаліту, отриманих з мозку лабораторних тварин. Тому ці вакцини тепер одержують на культурах клітин, що значно знижує їх реактогенність.

Вакцини контролюють на стерильність, специфічну нешкідливість (вбиті й субодиничні вакцини не повинні містити живий вірус), реактогенність і іммуногенність. Остання вивчається спочатку на тваринах, а потім на волонтерах. При цьому визначають сіроконверсію — наростання титру антитіл до даного вірусу після імунізації, а якщо щеплення багаторазове, то через два тижні після кожного щеплення. Остаточна оцінка епідеміологічної ефективності проводиться в шифрованих дослідах, у яких рівним кількостям добровольців вводять досліджувану вакцину й плацебо — індиферентну рідину, що імітує вакцину.

Субодиничні вакцини. У корпускулярних вакцинах, що готуються із складно влаштованих віріонів, лише поверхневі протективні антигени, що становлять звичайно близько 10% вірусних білків, викликають розвиток вірусоспецифічного імунітету. Інші білки й ліпіди лише підсилюють реактогенність і викликають розвиток алергійних реакцій. Тому цілком закономірним є одержання субодиничних вакцин, що містять протективні антигени. Як проміжний етап застосовуються розщеплені вакцини, для готування яких вірус обробляють ефіром або іншими жиророзчинниками, видаляючи ліпіди. Такі вакцини менш реактогенні, ніж корпускулярні, однак у них збережені баластові вірусні білки, що не відіграють ролі в створенні протективного імунітету.

Субодиничні вакцини позбавлені цих недоліків. Вони готуються таким способом. Очищені препарати вірусу руйнують детергентами — хімічними речовинами, що розчиняють ліпіди, потім відокремлюють поверхневі протективні антигени від нуклеокапсидів або шляхом центрифугування, або шляхом хроматографії на колонках. Очищені препарати стерилізують і концентрують, видаляючи детергент за допомогою діалізу. Отримані таким шляхом субодиничні вакцини мають мінімальну реактогенність, однак імуногенні властивості їх звичайно слабше, ніж у корпускулярних вакцин. Субодиничні вакцини виготовлені з віріонів грипу, на черзі — субодиничні вакцини проти вірусів герпеса, сказу й інших складно влаштованих вірусів. Синтетичні вакцини створюють шляхом синтезу антигенних детермінант протективних вірусних білків. Однак чистий антиген, виділений зі складу вірусу або штучно створений, не завжди має достатню імуногенність, та імунітет у ряді випадків не виникає. Антигени, що викликають слабку імунну відповідь, повинні бути кон’юговані з носіями й імуностимуляторами, що підсилюють імунну відповідь. Вакцини майбутнього — синтетичні вакцини — представляються у вигляді чистих протективних антигенів, отриманих шляхом клонування синтезованих ділянок генів у клітинах вищих еукаріот. Генноінженерні вакцини. Експресія генів інсуліну, соматотропного гормону (гормону росту), інтерферону людини в прокаріотичних системах показала широкі можливості генетичної інженерії й поставила на чергу завдання одержання вакцин проти інфекційних хвороб і, у першу чергу, проти вірусних інфекцій. Однак експресія багатьох вірусних генів у прокаріотичних системах відсутня або незначна в силу того, що зазначені віруси в ході еволюції пристосувалися до паразитування в організмі людини й вищих тварин і використовують для репродукції біосинтетичні системи клітини хазяїв, що мають істотні відмінності від біосинтетичних систем прокаріотів. Лише в тих випадках, коли білки (антигени) відносно прості, можливо використання прокаріотичних систем. Поряд із прокаріотичними системами доцільне використання простих еукаріотичних систем, якими є дріжджі. Однак і дріжджові клітини не можуть забезпечити синтез повноцінних антигенів ряду вірусів людини й тварин і для експресії їх генів необхідні клітини вищих еукаріотів, що значно ускладнить виробництво. Вакцини проти поліомієліту й грипу чи навряд будуть широко проводитися на перещеплюваних клітинах мавп і людини методами генної інженерії, тому що простіше й дешевше робити ці вакцини, заражаючи клітини вірусом. Для вірусу гепатиту А цей шлях найбільш перспективний у зв'язку із труднощами нагромадження його в лабораторних умовах. Для вірусу гепатиту В генноінженерні вакцини також вирішують проблему контролю вакцини, що вимагає використання дорогих порід мавп. Отримані рекомбинантні плазміди, клоновані в кишковій паличці, однак стабільної експресії НВ-Антигену в прокаріотах одержати не вдалося. Вона досягнута в клітинах нижчих еукаріот — дріжджах. Перевагою дріжджової вакцини є її відносно висока імуногенність, повна нешкідливість, відсутність необхідності контролю на мавпах, дешевизна. Експресія НВ-Антигену створена в культурі клітин ссавців (гризуни), і така вакцина може конкурувати із дріжджовою. Перспективним є також використання як вектор геномів великих ДНК-вмісних вірусів і в першу чергу вірусу осповакцини. Антиідіотипічні антитіла — це антитіла до антитіл проти вірусних антигенів, які по своїй структурі подібні з антигенами й здатні індукувати гуморальну й клітинну імунну відповідь. Передбачається в майбутньому використання їх у якості ефективних і нешкідливих вакцин. Зазначені нові напрямки особливо перспективні для здійснення специфічної профілактики інфекцій, що викликаються вірусами, які не культивуються в лабораторних умовах, мають багато серотипів або антигенно нестабільні й викликають лише короткочасний імунітет.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

62925. Воспитание патриотизма на уроках музыки в начальной школе 40.68 KB
  Теоретические основы патриотического воспитания школьников Патриотическое воспитание школьников: цель задачи принципы. Возрастные особенности младших школьников. Общетеоретическое значение для изучения педагогических аспектов патриотического воспитания...
62928. Вторая мировая война: причины, итоги, уроки 97.49 KB
  Пора разобраться с этим вопросом и сказать союзникам простое человеческое спасибо ибо 9 Мая –день окончательной победы над фашизмом –день одинаково важный для фронтовиков –участников Второй мировой войны.
62929. Структура Уголовного кодекса; правила квалифицирования 8 MB
  Задачи: дать детям начальные знания о правовой системе РФ; объяснить актуальность изучения уголовного права; показать взаимосвязь поступков и характеров для развития в детях стремления к сознательному самовоспитанию; предупредить о последствиях противоправного поведения...
62930. Моделирование и стилизация национального костюма народов Поволжья (на примере костюма Казанских татар XIX-начала XX вв.) 15.65 KB
  Цель: изучение самобытных древних традиций становления национального костюма и использование в стилизации и моделировании костюма в создании образа авторской куклы. Развивать познавательное ориентированное отношение к стилистическим элементам национального костюма казанских татар...