36703

Определение собственной люминесценции белка

Лабораторная работа

Физика

Характеристики люминесценции спектр длительность квантовый выход. Задачи Исследование спектров люминесценции Спектром люминесценции называется кривая зависимости интенсивности люминесценции от длины волны или частоты: I = f  Интенсивность люминесценции выражается обычно в величинах пропорциональных энергии или числу квантов. Качественный и количественный анализ веществ в растворе и в живой клетке может производиться по спектрам люминесценции аналогично тому как это было описано выше для спектров поглощения.

Русский

2013-09-23

1.1 MB

25 чел.

Лабораторная работа №20

 «Определение собственной люминесценции белка»

Цель работы: При помощи экспериментальной установки определить спектр собственной люминесценции белка.

 

Вопросы теории ( исходный уровень)

Люминесценция, ее виды. Характеристики люминесценции (спектр, длительность, квантовый выход). Законы Вавилова и Стокса. Люминесцентный анализ. Люминесцентные метки и зонды. Медицинское применение люминесцентных методов исследования. Лекция № 14)

Содержание занятия:

1.Выполнить работу по указаниям в руководстве к данной работе.

2.Оформить отчет.

3.Защитить работу с оценкой.

4.решить задачи.

Задачи

Исследование спектров люминесценции

Спектром люминесценции называется кривая зависимости интенсивности люминесценции от длины волны (или частоты): I = f (), Интенсивность люминесценции выражается обычно в величинах пропорциональных энергии или числу квантов.

Качественный и количественный анализ веществ в растворе и в живой клетке может производиться по спектрам люминесценции аналогично тому, как это было описано выше для спектров поглощения. Преимуществом люминесцентного метода является его более высокая чувствительность.

Интенсивность люминесценции пропорциональна количеству света, поглощаемого объектом в единицу времени. Как видно из уравнения , поглощение (I0  I) не пропорционально концентрации, а изменяется при увеличении концентрации по логарифмическому закону, асимптотически приближаясь к полному поглощению, Изменение интенсивности люминесценции с концентрацией следует тому же закону.

При малых концентрациях интенсивность люминесценции прямо пропорциональна концентрации. Поэтому количественное определение концентрации люминесцирующих веществ проводят при минимальной оптической плотности раствора (D  0,1 0,2).

Свет люминесценции частично вновь поглощается в самой толще объекта. Это явление носит название реабсорбции люминесценции. В результате реабсорбции происходит уменьшение интенсивности и искажение спектров люминесценции. Эффект реабсорбции наиболее выражен в концентрированных растворах и при измерениях в толстых слоях. Поэтому, чтобы уменьшить реабсорбцию, следует измерять люминесценцию в тонких слоях и при возможно меньших концентрациях раствора (D  0,1 — 0,2).

Измерение спектров люминесценции является одним из основных методов изучения состояния веществ в биологических системах, так как даже незначительные изменения состояния вещества: агрегация, комплексообразование, изменение кислотно-основного равновесия и т. д., часто очень сильно сказывается на его люминесцентных свойствах.

На основании данных о люминесценции можно судить также о величине кванта энергии, запасаемой в молекуле (по положению максимума люминесценции), о времени сохранения энергии возбуждения в молекуле (по скорости затухания люминесценции) и о процессах растраты энергии молекулой (по интенсивности люминесценции). Если в системе поглощают молекулы одного вещества, а флуоресцируют молекулы другого вещества, то проводя измерения спектров поглощения и люминесценции, можно изучать механизм межмолекулярных переносов энергии (миграции энергии).

Лабораторная работа. Измерение спектров люминесценции

Схема установки для измерения спектров люминесценции в видимой и ультрафиолетовой области приведена на рис. 80. Возбуждающий свет ртутно-кварцевой лампы фокусируется на объект, укрепленный в держателе, а свет люминесценции фокусируется вогнутым алюминированным зеркалом на входную щель монохроматора СФ-4. После выхода из моно-хроматора свет собирается кварцевой линзой на фотокатод фотоумножителя. Фототок измеряется с помощью какого-либо чувствительного гальванометра, например, М-91/А.

Возбуждение люминесценции. Люминесценция возбуждается светом ртутно-кварцевой лампы СВД-120 или СВДШ-250 с соответствующими светофильтрами и фокусирующими конденсорами (описание осветительных устройств см. стр. 348—352).

Рис. 80. Установка для измерения спектров люминесценции.

1— осветительное устройство, 2— лампа СВД-120 в кожухе, 3— кварцевая колба с раствором Бекштрема (светофильтр и конденсор), 4— газовый хлор-бромный фильтр, 5 — светонепроницаемая камера для объекта, 6 — сосуд Дьюара с держателем объекта (при измерениях при комнатной температуре вместо сосуда Дьюара ставится обойма для кюветодержателя — см. рис. 84), 7 — алюминиевое вогнутое зеркало, 8—котировочные винты для перемещения вогнутого зеркала, 9— светофильтр на входе монохроматора, 10 — монохроматор СФ-4, 11 — кварцевая линза, фокусирующая свет на фотокатод, 12— кожух фотоумножителя, 13— фотоумножитель, 14— выход сигнала с ФЭУ, 15— гальванометр М-91/А, 16— делитель напряжения, 17— источник высокого напряжения для питания ФЭУ

Светофильтры используются для выделения отдельных участков спектра. Основной характеристикой всякого светофильтра является величина его пропускания (Т) при различных длинах волн:

,

где I0 —интенсивность падающего, а I —интенсивность пропущенного светофильтром монохроматического света.

Пропускание системы из двух светофильтров ав) равно Та  Т в.

При измерении люминесценции существенно отделить рассеянный объектом возбуждающий свет от света люминесценции. Важно, чтобы светофильтр, помещенный на пути возбуждающего света перед объектом, совершенно не пропускал света в области, где измеряется люминесценция, и, наоборот, пропускал как можно больше света в области поглощения объекта (рис. 86).

Рис. 86. Выбор светофильтра для возбуждения люминесценции:

1— спектр поглощения листа фасоли, 2— спектр флуоресценции листа, 3— пропускание светофильтра СЗС-8 (светофильтр хорошо пропускает в области поглощения листа, но не может быть использован, т. к. пропускает и в области флуоресценции), 4 — пропускание светофильтра СЗС-9, применяемого при люминесценции в области более 640 ммк, 5— пропускание светофильтров СЗС-8 и СЗС-9, комбинация которых позволяет измерять спектры люминесценции этиолированных и зеленых листьев, начиная от 600 мм

При выборе светофильтров следует исходить из спектра поглощения объекта и правила Стокса, согласно которому спектр люминесценции сдвинут в длинноволновую сторону по сравнению со спектром поглощения.

Система из двух различных светофильтров пропускает свет только тех длин волн, который пропускают оба светофильтра. Использование комбинации из нескольких фильтров часто позволяет выделять довольно узкие участки спектра. Кривые пропускания Т = f() нескольких стеклянных светофильтров, применяемых для измерения люминесценции, изображены на рис. 86. Стеклянные светофильтры, выпускаемые промышленностью, снабжаются паспортами, в которых приведены кривые пропускания и другие характеристики светофильтров. При работе в ультрафиолетовой области спектра приходится использовать наряду со стеклянными жидкостные и газовые светофильтры. Например, для возбуждения люминесценции белков в области 240—280 ммк используют комбинацию жидкостного светофильтра Бекштрема и газового хлорбромного фильтра от ультрафиолетового микроскопа МУФ.

Жидкостный фильтр Бекштрема представляет собой раствор сернокислого никеля
(303
г/л) и сернокислого кобальта (86,5 г/л) в дистиллированной воде. Такой раствор, разведенный в три-пять раз, наливают в кварцевую колбу, которая служит одновременно светофильтром, тепловым фильтром и конденсором (см. рис. 80 и 81, Б). Концентрацию раствора Бекштрема в колбе желательно подобрать такой, чтобы светофильтр пропускал как можно больше света в области 240—480 ммк, совершенно не пропуская света в области 282—530 ммк. Для проверки измеряют отражение света от алюминиевой пластинки, помещенной на месте объекта. Если светофильтр приготовлен правильно, то интенсивность линии 265 ммк должна быть максимальной и в то же время должна совершенно отсутствовать в отраженном свете линия 435 ммк. Для уменьшения интенсивности рассеянного возбуждающего света перед входной щелью монохроматора помещают светофильтры, пропускающие только свет в исследуемой области люминесценции и не пропускающие возбуждающего света. Так, например, при исследовании белков используется светофильтр БС-2, отсекающий возбуждающий свет (240—280 ммк) и пропускающий более длинноволновую люминесценцию. При измерении спектров люминесценции хлорофилла применяют красный светофильтр, пропускающий только люминесценцию пигмента.

Камера для объекта. Газовый светофильтр, держатель объекта и зеркало для фокусировки света люминесценции на щель монохроматора помещают в светонепроницаемой камере (например, из эбонита;» см. рис. 80). При комнатной температуре растворы измеряют в кюветах от спектрофотометра СФ-4, которые укрепляют в металлическом держателе, вставляемом в обойму (см. рис. 84, А). При низких температурах объект помещают в металлическую кювету, которую либо непосредственно погружают в сосуд Дьюара с жидким азотом, либо укрепляют в держателе, служащем холодопроводом (см. рис. 84, Б). Перемещение фокусирующего зеркала (поворот вокруг оси и приближение к щели) производят с помощью котировочных винтов.

Работа на установке. Включение установки и предварительная фокусировка возбуждающего света были описаны выше. Окончательную фокусировку лучше всего производить, используя в качестве объекта раствор хорошо люминесцирующего вещества с известным спектром люминесценции.

При работе в ультрафиолетовой области объектом может служить пустая кювета от СФ-4 со стеклянной крышкой спектрофотометра, которая при возбуждении в области 240—280 ммк люминесцирует в области около 400 ммк. Изменяя поворот зеркала и его расстояние от объекта, добиваются максимального отклонения стрелки гальванометра. Для фокусирования света на фотокатод перемещают фокусирующую линзу перед фотоумножителем, также добиваясь максимального показания прибора. Напряжение на ФЭУ подбирается согласно правилам, изложенным выше, так, чтобы величина темнового тока составляла 4—5 делений по шкале гальванометра (амплитуда шумов при этом будет не более чем 1—2 деления). Ширина щелей монохроматора должна быть по возможности наименьшей, так как это обеспечивает наилучшее разрешение структуры спектра. Как правило, ширина щели устанавливается такой, чтобы при оптимальной фокусировке стрелка гальванометра отклонялась на всю шкалу при длинах волн, соответствующих максимуму в спектре люминесценции. Желательно, чтобы при измерении в области 300—400 ммк ширина щели не превышала 0,1 мм, а в более длинноволновой области составляла несколько сотых миллиметра.

Для измерения люминесценции растворы наливают в пробирку или кювету, укрепляемую в держателе; при измерении в вакууме удобно пользоваться трубками Тунберга (см. рис. 84). Такие объекты, как листья растения, можно укрепить на держателе, изображенном на рис. 84.

Для контроля на рассеянный свет при измерениях растворов при комнатной температуре и растворов или гомогенатов при температуре жидкого азота производят измерения с растворителем. Показания прибора для каждой длины волны при измерении растворителя вычитают из показаний, полученных при измерении люминесценции раствора в той же самой кювете и в идентичных условиях.

Измерение люминесценции при низкой температуре. При низких температурах тормозятся биохимические процессы и темновые стадии фотохимических реакций. При измерениях люминесценции объект предохраняется от фотохимического действия интенсивного возбуждающего света. Низкотемпературные спектры люминесценции позволяют получить ряд

новых сведений о свойствах вещества и его состоянии в биологической системе.

Понижение температуры сопровождается усилением флуоресценции. При этом более четко проявляется тонкая структура спектров люминесценции. При глубоком охлаждении многих биологических объектов удается наблюдать и исследовать наряду с флуоресценцией также и их фосфоресценцию. Наиболее просто измерить люминесценцию при глубоком охлаждении объекта можно, поместив кювету с образцом непосредственно в жидкий азот (температура — 196°С), налитый в прозрачный (непосеребренный) сосуд Дьюара.

При изучении ультрафиолетовой люминесценции необходимо применять кварцевые сосуды Дьюара с впаянными окошками из прозрачного оптического кварца, так как обычный кварц сильно люминесцирует. При измерении люминесценции в жидком азоте необходимо проводить контрольные измерения люминесценции растворителя, кювет и сосуда Дьюара. Спектр, полученный при измерении растворителя, вычитается из спектра, полученного при измерении раствора в тех же условиях.

Работа с жидким азотом требует соблюдения ряда предосторожностей. При ударе сосуд Дьюара может взорваться и поранить осколками окружающих; попадание жидкого азота на кожу может привести к сильному обмораживанию. Сосуды Дьюара нельзя плотно затыкать пробками. На стеклянные сосуды Дьюара нужно надевать чехлы из плотной материи или металлические сетки; при работе рекомендуется надевать защитные стеклянные очки. Наливая жидкий азот в стеклянный сосуд Дьюара, нужно вначале «ополоснуть» его, чтобы охлаждение стенок не было слишком резким. При переливании жидкого азота из стеклянного сосуда необходимо медленно вращать сосуд, чтобы его края охлаждались равномерно. Резкое охлаждение теплых стенок стеклянного сосуда Дьюара приводит к взрыву.

Жидкий азот бесцветен. Если налитый в сосуд Дьюара азот имеет голубоватый оттенок, это говорит о примеси кислорода. С жидким азотом, содержащим кислород, а тем более с жидким воздухом работать опасно! Охлаждение биологического объекта жидким азотом нужно проводить быстро; при этом структура объекта меньше повреждается, и предотвращается образование агрегатов в растворе. Однако слишком быстрое замораживание может привести к повреждению кювет и растрескиванию образца. Поэтому рекомендуется производить охлаждение, быстро погружая кювету с раствором в жидкий азот и вынимая ее обратно несколько раз подряд, так, чтобы вся операция охлаждения занимала 15—39 сен. Объект для измерения люминесценции помещают в прозрачный сосуд Дьюара (см. рис. 84, Б). Если стенки сосуда запотевают, нужно смазывать их 5-процентным раствором глицерина в спирте. От обмерзания поверхности сосуда* Дьюара можно избавиться, обдувая окошко током воздуха. При замораживании водных растворов происходит увеличение объема, поэтому пробирки и трубки Тунберга при погружении в жидкий азот лопаются. Чтобы избежать этого, водные растворы охлаждаются либо на поверхности стеклянной пластинки, либо в предварительно охлажденной металлической кювете (кюветы от СФ-4 охлаждать нельзя).

Упражнение  1.

Измерение спектра люминесценции белка при комнатной и низкой температуре

Схема установки для измерения спектров люминесценции приведена на рис. 85. Люминесценция белка возбуждается с помощью осветителя с лампой СВД-120А (см. рис. 81, Б). Область возбуждения люминесценции 240—280 ммк выделяется с помощью комбинации светофильтров: жидкостного фильтра Бекштрема и газового хлорбромного светофильтра от ультрафиолетового микроскопа МУФ. Для уменьшения рассеянного света перед входом спектрофотометра помещается светофильтр БС-2, пропускающий только свет люминесценции (более 280 ммк). На выходе моно-хроматора СФ-4 помещают фотоумножитель ФЭУ-18 в кожухе.

Включение фотоумножителя и подбор напряжения питания — см. упражнение 1 на стр. 346, включение лампы СВД-120А и фокусировку осветительного устройства — см. упражнение на стр. 350.

Приготавливают раствор белка (например, сывороточного альбумина человека) в концентрации 1 мг/мл. Заполняют им круглую кювету с кварцевыми крышками от спектрофотометра СФ-4. Кювету укрепляют в держателе, который помещают в обойму в камере для объекта (см. рис. 84, Л). Подбирают ширину щели, при которой отклонение стрелки гальванометра при 245 ммк будет равно 25—50 делениям. Вращают барабан длин волн и производят отсчеты по шкале гальванометра через каждые 5 ммк в интервале длин волн 285—450 ммк. Поскольку под действием возбуждающего света происходит «выцветание» белка, сопровождающееся уменьшением люминесценции, измерения нужно производить по возможности быстро, разумеется, не жертвуя .при этом точностью. Измерения спектра проводят два раза: один раз, вращая барабан длин волн в сторону больших, а другой раз — в сторону меньших длин волн,—и берут среднюю из двух измерений (I). Точно таким же образом производят контрольные измерения, поместив на место кюветы с раствором белка кювету с водой (IК ).

Затем следует рассчитать величину энергии излучения флуоресцирующего образца (в относительных единицах) при каждой длине волны:

где А — поправка на спектральную  чувствительность прибора.

На основании полученных данных строят кривую спектра люминесценции белка, откладывая по оси абсцисс длину волны, а по оси ординат — энергию излучения .

Измерения спектров люминесценции белка при температуре жидкого азота производятся на той же установке, но на место обоймы с кюветодержателем помещают сосуд Дьюара с кварцевыми окошками /см. рис. 84, Ь), в который наливают жидкий азот правила работы с жидким азотом см. стр. 380—381).

Раствор белка (1 мг/мл) наливают в металлическую кювету, предварительно охлажденную в жидком азоте. Как только раствор замерзнет, кювету опускают в сосуд Дьюара, укрепленный в установке. Угол между поверхностью образца и направлением светового пучка от осветителя должен быть почти прямым. Сохраняя этот угол постоянным, следует поворачивать сосуд Дьюара вокруг оси, наблюдая за изменениями величины фототока при 340 ммк (I). Эта величина будет максимальной при хорошей фокусировке света от образца на входную щель монохроматора. Ту же операцию следует повторить, вынув кювету из сосуда Дьюара и поставив длину волны 400 ммк. Желательно добиться того, чтобы фототок при этом был минимальным, так как он обусловлен флуоресценцией стенок сосуда Дьюара (IК). Следует установить сосуд Дьюара таким образом, чтобы отношение  было наибольшим.

Измерение спектров люминесценции производится в области 285—530 ммк через каждые
5
ммк. В остальном измерение спектра и его построение производятся так же, как и в предыдущем упражнении.

Упражнение 2.

Измерение спектров люминесценции суспензии дрожжей в видимой области

Измерения производятся при комнатной температуре в основном так же, как и в предыдущем упражнении. Возбуждение осуществляется с помощью осветительного устройства с лампой ДРШ-250 (см. рис. 81, Л и стр. 350), свет проходит через светофильтр УФС-3 (область возбуждения 313—-366 мк). Объект исследования (5-процентная суспензия пекарских дрожжей в воде) помещают в кювете от СФ-4 в светонепроницаемую камеру. Перед входом в монохроматор помещают светофильтр ЖС-4, пропускающий только свет люминесценции в области 380 ммк. В качестве приемника света может быть использован фотоумножитель ФЭУ-18 или ФЭУ-17, Измерения производятся в области 400 — 600 ммк через каждые 5 ммк.

Контролем служит кювета с водой. В остальном измерение и построение спектра производится так же, как и в упражнении 1.

Упражнение 3.

Измерение спектров люминесценции раствора пигментов и листьев растений

Измерения проводятся на установке, схема которой представлена на рис. 80. Для возбуждения люминесценции используют осветитель с лампой ДРШ-250 (см. рис. 81, А), свет которой проходит через систему светофильтров СЗС-8 + СЗС-9, выделяющих область возбуждения 380-580 ммк. Образец опускают в стеклянный сосуд Дьюара, в который при низкотемпературных измерениях наливают жидкий азот. Перед входом в спектрофотометр СФ-4 помещают красный светофильтр КС-2, отсекающий рассеянный возбуждающий свет. В качестве приемника света необходимо использовать фотоумножитель ФЭУ-22, чувствительный в длинноволновой области спектра. Включение фотоумножителя и осветительного устройства см. стр. 346-355.

Готовят из листьев спиртовый экстракт с оптической плотностью при 660 ммк около 0,1—0,2 (см. упражнение 2 на стр. 359). Пробирку с экстрактом помещают в сосуд Дьюара в камере для объекта. Спектр люминесценции измеряют в области 630 — 760 ммк через каждые 5 — 10 ммк. Раствор хлорофилла выцветает при освещении, поэтому измерения следует производить достаточно быстро и повторять регистрацию спектра дважды: с коротковолнового идлинноволного конца спектра (см. упражнение 1). Затем измеряют спектр новой порции того же экстракта при температуре жидкого азота.

Укрепляют зеленый лист растения (например, фасоли) на держателе в сосуде Дьюара (см. рис. 84, Б). Измерения при комнатной температуре проводят аналогично измерениям экстракта пигментов. Для измерения спектра при глубоком охлаждении берут второй лист (или половину листовой пластинки) с того же растения, который укрепляют в держателе и погружают в сосуд Дьюара, предварительно наполненный жидким азотом. Измерение спектра производят в области 640—800 ммк однократно (при температуре жидкого азота пигмент почти не выцветает).

На основании полученных данных следует построить спектры флуоресценции экстракта и зеленого листа при низкой и комнатной температуре и проанализировать, как отличается спектр нативного пигмента от спектра пигмента в растворе и каким образом влияет охлаждение на спектр люминесценции.

Ультрафиолетовое излучение. Первичные механизмы действия ультрафиолетового излучения на биологические объекты.

Электромагнитное излучение, занимающее спектральную область между фиолетовой границей видимого света (= 400 нм) и  длинноволновой частью  рентгеновского излучения (= 10 нм),  называют ультрафиолетовым (УФ).

В медицине находит применение УФ, длинна волны которого выше 200 нм.

Значительная доля излучения накаленных твердых тел при высоких  температурах  -  УФ-излучение.  Если максимум светимости нагретого тела находится в УФ области спектра, то температура этого тела больше 7000 К. Т. е. в обычных условиях нагре0тые тела не могут служить эффективными источниками УФ-излучения.

Мощным источником УФ-излучения является  Солнце, 9% излучения которого на границе земной атмосферы составляет УФ.

Для практических целей в качестве источников  УФ-излучения используют электрический разряд в газах и парах металлов.  Такое излучение характеризуется линейчатым спектром.

Энергия кванта света УФ-излучения достаточна для перевода атома или молекулы в электронно-возбужденное состояние. Максимумы спектров поглощения сложных биологических молекул  лежат именно в области УФ (рис.3.1). Избыточная энергия атома или молекулы в электронно-возбужденном состоянии тратится либо на химические реакции молекулы, либо на люминесценцию.

Работа люминесцентных микроскопов основана на интенсивной флюоресценции (видимая область спектра) некоторых биологических объектов, поглощаемых свет в УФ. Основное применение УФ-излучения в медицине связано со свойством УФ вызывать фотохимические процессы. УФ (области В и  А)  обладает  антирахитным действием, так  как  фотохимическим  путем образует витамин Д из его провитамина (спектр поглощения лежит в областях А и В УФ). Эти же области УФ играют важную роль в образовании пигмента, который придает коже коричневую окраску. Излучение области С УФ вызывает разрушение биологически важных молекул, поэтому используется в медицине в качестве бактерицидного фактора. Это свойство используют для предотвращения распространения заразных  болезней  и стерилизации помещения,  в котором проводятся микробиологические работы. УФ может  быть при избыточном воздействии причиной конъюнктивита (область С) и рака (область В).

Измерение УФ-излучения  в основном осуществляется фотоэлектрическими приёмниками: фотоэлементами, ФЭУ. Индикаторами УФ света являются люминесцирующие вещества и фотопластинки.

Источником УФ-излучения, применяемого для лечебных и профилактических целей,  являются  специальные  газоразрядные  лампы: ртутно-кварцевые, бактерицидные и другие.

2. Устройство и принцип работы ртутных ламп

В основном в медицине используются  лампы,  в  которых электрический разряд  происходит в атмосфере ртутных паров.  При этом возбужденные атомы ртути дают интенсивное  излучение  в  УФ области спектра.  Ртутные  лампы  разделяются  на  лампы низкого (0,011,0 мм ртутного столба), высокого (150 400 мм ртутного столба) и сверхвысокого  (выше  атмосферного) давления.  В медицине используются лампы низкого и высокого давления.

Медицинская ртутно-кварцевая лампа высокого давления представляет прямую трубку из кварцевого стекла,  из  которой  удален воздух (рис.3.2). Трубка  наполнена  аргоном под невысоким давлением (2-3 мм рт. ст) и содержит также небольшое количество ртути.  Впаянные по концам металлические электроды a  и b для улучшения эмиссии электронов покрыты окислами щелочных металлов. Вдоль трубки расположена тонкая металлическая полоска В, прижатая к ней кольцами c и d. Полоска В и оба кольца играют роль одной из обкладок конденсатора. При включении лампы кольцо с через конденсатор С1 заряжается, знак заряда кольца противоположен заряду электрода a. В результате между электродами и кольцами создается мощное электрическое поле. В аргоне возникает тлеющий разряд. Разряд начинается за счет тех единичных ионов и электронов,  которые имеются в естественном газе и поддерживается за счет  вторичной ионизации. Характерной особенностью этого вида разряда в газе является малая плотность тока и сравнительно большое напряжение на электродах.

Электроды вследствие бомбардировки их ионами газа и электронами нагреваются, и с их поверхности происходит электронная эмиссия. Нагревается вся лампа, и имеющаяся в ней ртуть испаряется.  Возникает дуговой разряд в ртутных парах. Характерной особенностью дугового разряда является высокая плотность тока и малая разность потенциалов на электродах. С возникновением дугового разряда давление ртутных паров возрастает до некоторого предела (около 1 атм), и постепенно устанавливается нормальный режим работы горелки. При этом лампа дает излучение с  линейчатым  спектром в УФ области (максимум излучения при =365 нм), а также в сине-фиолетовой части видимого света. Это излучение и наблюдается глазом при работе лампы.

Рис. 2. Устройство ртутной лампы высокого давления.

a и b- электроды, В – пластинка, c и d – кольца, К – ключ, С1 и С2- конденсатор, D – дроссель.

Лампу включают в сеть переменного тока,  параллельно  лампе через кнопку включен конденсатор С2,  разряд которого облегчает зажигание лампы. Погашенная горелка перед повторным зажиганием требует полного охлаждения в течение 8-10 минут. Последовательно с лампой включается дроссель D, который стабилизируется ток в цепи лампы.  При разряде в газе незначительное изменение напряжения между электронами может вызвать непропорционально большое изменение тока, которое нарушает работу лампы. При изменении тока в дросселе возникает э.д.с. самоиндукции, противодействующая этому изменению, и таким образом сила тока автоматически ограничивается до 5-6 А, а напряжение достигает 20-25 В. Подобный режим длится 2-3 минуты. С образованием дугового разряда  и постепенным повышением давления ртутных паров ток снижается до 3 А, а напряжение возрастает до 115-120 В. эти значения соответствуют установившемуся рабочему режиму лампы. Процесс длиться примерно 10-12 минут.

Ртутная лампа низкого давления,  называемая в медицине бактерицидной лампой, представляет собой трубку из увиолевого стекла, на концах которой имеются два электрода в форме спиралей накала (рис. 3).

Рис.3. Устройство ртутной лампы низкого давления.

Трубка заполнена аргоном  под  давлением  в  несколько  мм ртутного столба  и  в  ней помещается капля металлической ртути. Лампа включается в сеть последовательно с дросселем, параллельно электродам лампы включен стартер.  Он представляет неоновую лампочку с биметаллическим электродом,  который замыкает цепь  тока для накала спиралей основных электродов. Как только   электроды   лампы  нагреются и  возникнет  электронная эмиссия,    ток   через стартер уменьшится  и биметаллическая пластинка   размыкает цепь. При  этом между электродами в лампе возникает тлеющий разряд в атмосфере аргона.  Постепенно ртуть испаряется и  ее  пары заполняют трубку.  Лампа переходит на рабочий режим, при котором тлеющий разряд происходит уже в атмосфере ртутных паров и  между холодными электродами. Лампа дает  излучение  с  линейчатым спектром преимущественно в УФ области, максимум которого (до 70 %всего излучения) падает на длину волны 253,7 нм.

Люминесцентные лампы, используемые для освещения помещений, устроены подобно  ртутной лампе низкого давления, но делаются из простого стекла, внутренняя сторона которого покрыта соответствующим люминофором. В зависимости  от  состава люминофора лампы дают белый свет различных оттенков и часто называются  лампами  дневного  света.  В спектре люминесцентной  лампы сочетается сплошной спектр излучения люминофора с линейчатым спектром частично проходящего  через люминофор излучения паров ртути.

Разработана люминесцентная лампа,  которая дает длинноволновое УФ излучение (максимум при 310 - 320 нм), содержащееся в солнечном излучении, достигающем земной  поверхности.  Лампа называется эритемной  и применяется для освещения в школах,  яслях, больницах при недостатке солнечного света.

Вопрос 3. 10 минут   

3. Инфракрасное излучение. Первичные механизмы действия инфракрасного излучения на биологические объекты. Аппараты светолечения.

Электромагнитное излучение, занимающее спектральную область между красной границей видимого света ( = 760 нм) и коротковолновом радиоизлучением ( = 1-2 мм), называют инфракрасным (ИК).

Нагретые твердые и жидкие  тела  испускают  непрерывный  ИК спектр. Согласно законам теплового излучения, если максимум спектральной плотности энергетической светимости нагретого тела лежит в ИК области, то тела нагрето до температуры 38001,5  К.  Т. е. все жидкие и твердые тела в обычных условиях не только являются источниками ИК-излучения,  но и имеют максимальное излучение в ИК области спектра. При невысоких температурах  энергетическая  светимость  тел мала. Поэтому далеко не все тела могут быть  использованы  в  качестве таких  источников.  Для практических целей наряду с тепловыми источниками ИК-излучения используют  ртутные  лампы  высокого давления и лазеры, спектр излучения которых линейчатый. Мощным источником ИК-излучения является Солнце, около 50% его излучения лежит в ИК области спектра.

Лечебное применение  ИК-лучей основано на их тепловом действии. Наибольший эффект достигается коротковолновым ИК-излучением, близким к видимому свету. Для лечения используют специальные лампы: лампы накаливания (соллюкс) и  ИК-излучатели  (инфраруж), укрепленные в  специальном рефлекторе на штативе.  ИК излучатели устроены подобно бытовым электрическим  нагревателям  с  круглым рефлектором. Спираль нагревательного элемента накаливается током до температуры 400 - 500 0С.

ИК излучение проникает в тело на глубину около 20 мм,  поэтому в большей степени прогреваются поверхностные слои. Терапевтический эффект обусловлен возникающим температурным градиентом, что активизирует деятельность терморегулирующей системы (рис. 3.4.). Усиление кровоснабжения облученного места приводит  к  благоприятным лечебным последствиям.

Рис. 4. Возникновение температурного градиента при облучении части тела человека ИК излучением.

В медицине с диагностическими целями проводят  фотографирование в ИК-лучах.  Различие оптических свойств видимого и ИК-излучения позволяет увидеть детали, не видимые на обычной фотографии. С  помощью этого метода диагностируют кожные и сосудистые заболевания. Полезную информацию на молекулярном уровне дает спектроскопия ИК-излучения.

Методы обнаружения и измерения ИК-излучения делятся  в  основном на  две  группы: тепловые и фотоэлектрические. Примером теплового приемника служит термоэлемент, нагревание которого вызывает электрический ток. К фотоэлектрическим приемникам относят фотоэлементы, ЭОП, фотосопротивления. Обнаружить и  зарегистрировать ИК-излучение можно также фотопластинками и фотопленками со специальным покрытием.

4. Люминесценция, ее виды. Характеристики люминесценции (спектр, длительность, квантовый выход). Законы Вавилова и Стокса.

Фотопроцессы в биологических системах сопровождаются возникновением электронно-возбужденных состояний молекул. Электронно-возбужденные состояния молекул характеризуются энергией и временем жизни. Молекула не может долго находится в электронно-возбужденном состоянии и переходит в основное состояние с испусканием кванта света. Испускание света молекулой (люминесценция) происходит за время более длительное, чем время поглощения света молекулой (10-15 с). За это время с молекулой может произойти ряд изменений, определяющих изменения спектров испускания (люминесценции) по сравнению со спектрами поглощения.

По Вавилову С. И.: Люминесценция есть свечение вещества,  являющееся  избыточным над тепловым  излучением этого вещества при данной температуре и имеющее длительность,  значительно превышающую  период  излучаемых  световых волн.

По способу возбуждения молекулы люминесценцию различают:

1. Люминесценция, вызванная заряженными частицами:

а) ионолюминесценция - ионами;

б) катодолюминесценция - электронами;

в) радиолюминесценция - ядерным излучением.

2. Люминесценция, вызванная квантами рентгеновского излучения - рентгенолюминесценция; оптического излучения - фотолюминесценция.

3. Люминесценция, вызванная электрическим полем - электролюминесценция.

4. Люминесценция, сопровождающая химическую реакцию, называется хемилюминесценцией. К ней относится биолюминесценция - видимое свечение организмов,  связанное с процессами их жизнедеятельности.

По внутриатомным процессам различают люминесценцию:

а) спонтанную;

б) вынужденную;

в) рекомбинационную.

При спонтанной люминесценции  излучение  происходит  непосредственно вслед за возбуждением. Некоторые энергетические уровни молекулы или атома могут быть метастабильными, т.е. вероятность переходов электронов с этих уровней на любые уровни с меньшей энергии очень мала. Атом или молекула может достаточно долго находится в таком электронно-возбужденном состоянии. Переход с метастабильного на основной  уровень  может  быть ускорен путем внешнего энергетического воздействия на атом или молекулу. Например, переход атома или молекулы с метастабильного энергетического уровня на основной может инициироваться квантом излучения той же энергии, что и инициированный переход. Вызванное при  этом  излучение называется вынужденным (индуцированным или стимулированным), а само явление вынужденной люминесценцией. Рекомбинационной называется  люминесценция,  происходящая  в результате рекомбинационных процессов,  например, при рекомбнации электронов и ионов в газах, электронов и дырок в полупроводниках и так далее.

Фотолюминесценция. Правило Стокса.

Фотолюминесценция делится на флуоресценцию (кратковременное послесвечение) и фосфоресценцию (сравнительно длительное послесвечение) (не менее 10-3 сек).

Фотолюминесценцию жидкостей  и  твердых тел можно наблюдать

при освещении их видимым или ультрафиолетовым светом.  Примером может  служить  свечение обыкновенного керосина,  серной кислоты, раствора флуоресцеина, зеленое свечение стекол с примесью солей урана,  красное свечение  стекол  с примесью солей марганца,  синей - с примесью солей церия.  Светятся также различные краски и особые неорганические составы и минералы, которые называют фосфорами (люминофорами).

Спектр люминесценции в целом  и  его  максимум всегда оказывается  в области более длинных волн по сравнению со спектром поглощенного излучения, способного вызвать эту люминесценцию (рисунок). Это правило называется правилом Стокса.

Энергия падающего фотона h0 расходуется на  излучение (h1) и безизлучательные процессы (A) внутри вещества:

 

h0 = h1 + A.                                      (1)

Поэтому 1 < 0 или 1 > 0, то есть испускаемый при люминесценции свет должен иметь более длинные волны, чем поглощаемый (рис.5.).  Если A = 0, то 1 = 0; в этом предельном случае испускаемый свет будет иметь ту же длину волны, что и поглощаемый. В редких случаях, при возбуждении фотолюминесценции отдельной спектральной линией (то есть монохроматическим светом, когда фотон поглощается уже возбужденной молекулой,  возможен процесс, при котором испускаемый фотон уносит с собой дополнительно часть энергии молекулы. При этом испускаемый люминесценцией свет будет иметь большую частоту (меньшую длину волны):  h1 > h0  или 1 < . Такое излучение называется антистоксовым. Антистоксовое излучение редко, при большом числе актов поглощения и излучения наиболее вероятно испускание света с большей длиной волны по сравнению со светом поглощаемым.  Поэтому максимум кривой спектра люминесценции всегда находится в области  более длинных волн по сравнению с максимумом кривой спектра поглощения.

В жидких  и твердых веществах спектр люминесценции не зависит от спектра возбуждающего света (или от длины волны поглощенного излучения,  если  оно  является монохроматическим).  Если в пределах спектра поглощения изменять частоту возбуждающего  света, то спектр люминесценции при этом не меняется.  Он характеризует люминесцирующее вещество и обусловлен природой его молекул, а не энергией возбуждающего фотона.

Энергия, затраченная на возбуждение молекул вещества,  превращается в энергию  излучения не полностью, а часть энергии рассходуется на различные безизлучательные процессы в веществе. Процессы, приводящие к рассеиванию энергии, называются тушением люминесценции.

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая правило Стокса.

Полнота преобразования поглощенной энергии в энергию  излучения характеризуется  выходом люминесценции. Различают:

  1.  энергетический выход ВЭ люминесценции - отношение энергии люминесценции WЛ к поглощенной энергии Wп:

                                                ВЭ ;                                       (2)

2) квантовый выход BК люминесценции -  отношение числа  квантов

NЛ, излученных веществом, к числу NП поглощенных квантов:

                                              .                                       (3)

В некоторых случаях величина выхода люминесценции может быть большой;  например, для флуоресцина он равен 0,76.  В большинстве случаев выход люминесценции значительно меньше единицы.

Флуоресценция и фосфоресценция.

Флуоресценция и фосфоресценция различаются природой квантовых переходов. В структуре энергетических уровней молекулы параллельно существуют две системы уровней: синглентные и триплетные (рис. 6.). Эти уровни различаются мультиплетностью. Мультиплетность рассчитывается как величина 2S+1, где S – спиновое квантовое число, спин электрона равен . Мультиплетность синглетных уровней равна 1. Два электрона на этих уровнях характеризуются противоположно направленными спинами: 2 (+- )+1=1. Мультиплетность триплетных уровней равна 3. Два электрона  на этих уровнях характеризуются сонаправленными спинами: 2 (++ )+1=3. Основной уровень молекулы является синглетным, а возбужденные уровни могут быть и синглетными, и триплетными. Флуоресценция соответствует квантовым переходам с возбужденных синглетных уровней на основной синглетный уровень, а фосфоресценция – с возбужденных триплетных уровней на основной синглетный. Вероятность переходов между уровнями различной мультиплетностью (последний случай) очень мала. На возбужденном триплетном уровне электрон может находиться длительное время. Такой уровень называется метастабильным. И поэтому длительность фосфоресценции велика (более 10-3 с), по сравнению с длительностью флуоресценции (10-8 с).

Рис. 6. Системы синглетных и триплетных  энергетических уровней молекулы.

Вопрос 5. 5 минут   

5. Люминесцентный анализ. Люминесцентные метки и зонды. Медицинское применение люминесцентных методов

исследования.

Фотолюминесценция наблюдается у многих жидких и твердых тел как неорганической,  так  и  органической природы,  особенно под действием ультрафиолетового излучения.

Определение природы и состава вещества по спектру его люминесцентного излучения, называется люминесцентным анализом. Люминесцентный анализ позволяет обнаруживать люминесцентные вещества в количестве до 10-10 г. Люминесцентный анализ  используют для обнаружения начальной стадии порчи продуктов,  сортировки фармакологических препаратов и диагностики некоторых заболеваний. Под действием ультрафиолетового излучения флуоресцируют многие ткани организма (ногти, зубы, непигментированные волосы, роговая оболочка, хрусталик глаза и другие). В некоторых случаях по характеру свечения можно  отличить патологически измененные ткани. Характерное свечение дают бактериальные и  грибковые  колонии. В  связи с этим люминесцентный анализ применяется при диагностике многих заболеваний, особенно в области дерматологии.

При люминесцентной   микроскопии  исследуются  естественные препараты, имеющие собственную флуоресценцию или окрашенные флуоресцирующими красками.  Источником света являются лампы ртутные высокого и сверхвысокого давления и применяются  два  светофильтра, один  из  которых расположен перед конденсатором и выделяет область спектра источника света,  которая вызывает люминесценцию объекта; другой находящийся после объектива, выделяет свет люминесценции. Оптика микроскопа может быть обычной,  так как  через нее проходит уже видимый свет,  возникший на препарате в результате флуоресценции.

Только небольшое число соединений характеризуется люминесценцией с высоким квантовым выходом. Эти соединений используют для изучения процессов, происходящих со слаболюминесциирующими или совсем не люминесциирующими соединениями. Для этого соединения из первой группы связывают с изучаемыми молекулами. Если связь ковалентная, то говорят о люминесцентных метках, если – более слабая (водородная, гидрофобная), то говорят о люминесцентных зондах.

Например, существуют соединения,  которые не флуоресцируют в водных растворах, но сильно флуоресцируют, если они связаны с гидрофобными областями белков. В этом случае флуоресцентные свойства таких  молекул  могут быть использованы  для того,  чтобы охарактеризовать конформацию белка вблизи связывающего центра. Например, анилинонафталинсульфат (АНС) слабо флуоресцирует  в  водной среде и в других полярных растворителях;  в неполярных растворителях интенсивность его  флуоресценции  сильно  возрастает.  Это свойство было  использовано  для доказательства гидрофобного характера места связывания гема в миоглобине, т. к. АНС связывается с миоглобином в месте связывания гема. Квантовый выход флуоресценции  АНС в воде равен 0,04,  а в комплексе с апомиоглобином - почти единице. (Апомиоглобином называется миоглобин без гемовой группы).  

  1.  Хемилюминесценция. Собственная, активированная и биолюминесценция

Классификация хемилюминесценции.

Свечение, сопровождающее химические реакции, называется хемилюминесценцией. Процессы жизнедеятельности практически всегда сопровождаются слабым излучением, которое иногда называют сверхслабым свечением или собственным излучением клеток и тканей. Некоторые организмы обладают, однако способностью излучать довольно яркий свет, видимый простым глазом; это явление известно с древних времен и получило название "биолюминесценция". Хемилюминесценция наблюдается при процессах с участием свободных радикалов.

Обычно хемилюминесценция характеризуется низким квантовым выходом, поэтому для измерения ее характеристик используют специальные приборы - хемилюминометры, в состав которых входят чувствительные элементы - фотоумножители (ФЭУ). Слабый свет хемилюминесценции усиливают также иногда во много тысяч раз с использованием некоторых веществ, называемых активаторами хемилюминесценции.

Таким образом, можно рассматривать три группы хемилюминесцентных явлений:

Молекулярный механизм хемилюминесценции.

Известно довольно много химических реакций, сопровождающихся свечением. В большинстве случаев - это довольно сложные процессы со многими промежуточными стадиями.

Рассмотрим один из простых случаев, для которого механизм превращения энергии химической реакции в свет вполне понятен. Это свечение, наблюдаемое при взаимодействии органических радикалов, получаемых электрохимическим путем. В раствор люминесцирующего органического вещества (полициклические углеводороды) в органическом электролите опускали пару электродов.  С катода (-) на молекулы люминесцирующего вещества  переходят электроны и образуются анион-радикалы (заряженные отрицательно). На аноде (+) электроны отнимаются от молекул и образуются катион-радикалы (заряженные положительно, см. рис. 7., вверху). При перемешивании раствора катион-радикалы будут взаимодействовать с анион-радикалами (рис. 7, внизу); при этом образуется две молекулы исходного углеводорода, одна из которых может оказаться в электронно-возбужденном состоянии и переходит в основное состояние с испусканием кванта света (фотона).   

На рис. 8 показаны верхние электронные энергетические уровни в реагирующих радикалах и продуктах их взаимодействия. В молекулах на верхнем заполненном электронном уровне электроны расположены попарно (рис. 8). У катион-радикала на верхнем уровне остается только один, неспаренный электрон. У анион-радикала появляется неспаренный электрон на следующем (расположенном выше) энергетическом уровне (рис. 8). При взаимодействии радикалов (имеющих противоположный заряд и потому притягивающихся друг к другу) произойти перенос электрона может произойти таким образом, что два электрона окажутся на разных уровнях (рис. 8). Последнее означает, что один из ее внешних электронов оказывается не на самом нижнем свободном электронном уровне, как у исходных молекул, а на вышележащем электронном уровне. Такая молекула при переходе в основное состояние испускает квант света (рис. 8).

Рис. 7. Хемилюминесценция при рекомбинации катион - и анион-радикалов полициклических углеводородов.

1 - Между электродами, опущенными в раствор органического электролита, прикладывают разность потенциалов. С катода электроны захватываются молекулами и образуются анион-радикалы. На аноде электроны отрываются от молекул и образуются катион-радикалы.
2 - 5 - При взаимодействии катион-радикала и анион-радикала в результате их столкновения (2) электрон переходит с катион-радикала на анион-радикал (3). Однако при этом есть вероятность того, что он окажется не на самом нижнем электронном уровне, а на более высоком. Образуется возбужденная молекула углеводорода (красный кружок на схеме 4). При переходе электрона на более низкий уровень происходит высвечивание кванта света (5). Схема электронных уровней в радикалах и молекулах продуктов реакции дана на рис. 8.

Рис. 8. Схема электронных энергетических уровней участников реакции взаимодействия катион-радикала и анион-радикала одного и того же вещества.

1 - исходная молекула; 2 - анион-радикал; 3 - катион-радикал; 4 - перенос электрона с анион-радикала на катион-радикал; 5 - перенос электрона в электронно-возбужденной молекуле продукта реакции, который сопровождается высвечиванием кванта света хемилюминесценции.

Этот сложный процесс можно разделить на три стадии:

  1.  Восстановление одного из участников реакции (присоединение электрона) и окисление второго (отрыв электрона). Это приводит к запасанию химической энергии в системе, которая позднее выделится в виде фотона.
  2.  Перенос электрона (окислительно-восстановительная реакция) не на самый нижний, а на один из более высоких энергетических уровней и образование таким образом продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии.
  3.  Высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция).

Обычно химические реакции, сопровождающиеся свечением, протекают через целый ряд промежуточных стадий, но основные этапы запасания и высвечивания энергии, в общем, сходны.

Собственное свечение клеток и тканей животных

В настоящее время слабое свечение удается изучать и на целых органах в составе организма. На рисунке 9. изображен аппаратурный комплекс, применяемый для измерения собственного свечения тканей животного, например, печени или легкого.

Рис. 9.

Измерение собственного свечения органов лабораторного животного (в данном случае - крысы).

Наиболее важные части комплекса - это совершенно непроницаемый для света ящик, в который помещают лабораторное животное, например крысу, и высокочувствительный приемник света - фотоумножитель, соединенный через усилитель и другие промежуточные устройства с самопишущим потенциометром или же персональным компьютером. Аналогичную конструкцию используют для изучения свечения изолированных органов, например, перфузируемого легкого или сердца. Добавляя в перфузионную жидкость ингибиторы или активаторы определенных реакций, можно судить о природе химических реакций, сопровождающихся свечением.

За собственное свечение тканей могут быть ответственны реакции:

  1.  Реакции активных форм кислорода и активных форм азота.
  2.  Реакции цепного (перекисного) окисления липидов.

Реакции с участием активных форм кислорода и азота

Активными формами кислорода (АФК) обычно называют пероксидь водорода (H2O2), гипохлорит (ClO-) и кислородные радикалы: супероксид (O2·-) и радикал гидроксила (HO·). Активными формами азота  (АФА) являются монооксид азота (·NO), различные формы пероксинитрита (HOONO, ONOO-, ONOOCO2-). Главным источником АФК и АФА в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты и моноциты крови и тканевые макрофаги. Активированные фагоциты для борьбы с чужеродными клетками образуют целый букет активных форм кислорода и азота, которые, как оказалось, могут взаимодействовать друг с другом и с другими молекулами с испусканием квантов хемилюминесценции. Непосредственной причиной такого свечения считают образование синглетного кислорода (1O2), испускается квант света с длиной волны 1270 нм, и его возбужденного димера, испускается квант света с длинами волн 635, 580, 535 нм. Пероксинитрит взаимодействуя с остатками триптофана и тирозина белков, переводит их в электронно-возбужденное состояние. При переходе молекул в основное состояние испускается квант света в видимой области.

Свечение при реакциях цепного окисления липидов

Одна из главных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей - свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. Эта реакция идет с участием свободных радикалов липидов L·и липопероксидов LOO·, которые как бы "ведут" цепи окисления В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида (LOO·) образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света. Чем больше радикалов LOO· в системе, то есть чем энергичнее идут цепные реакции окисления липидов, тем выше интенсивность хемилюминесценции, сопровождающей реакцию радикалов. Вещества, реагирующие со свободными радикалами и тем самым тормозящие цепное окисление липидов (так называемые антиоксиданты), одновременно подавляют хемилюминесценцию. Изучая влияние различных природных и синтетических соединений на характеристики хемилюминесценции, можно судить о способности этих веществ защищать наш организм от вредного действия свободных радикалов и тем самым отбирать кандидатов на определенные лекарства.

Активированная хемилюминесценция

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью.

Существует несколько причин низкого квантового выхода хемилюминесценции.

  1.  Концентрация радикалов в биологических системах очень мала из-за их высокой химической активности, поэтому малы и скорости реакций, сопровождающихся свечением.
  2.  Не любое химическое взаимодействие радикалов приводит к образованию электронно-возбужденных молекул продуктов реакции. В подавляющем большинстве окислительно-восстановительных взаимодействий между молекулами или радикалами электрон переносится не на уровень возбужденного состояния, а на самый нижний свободный уровень, и последующего высвечивания кванта не происходит.
  3.  Даже если и образовалась возбужденная молекула продукта, вероятность того, что высветится квант, а не произойдет растраты энергии в тепло, тоже обычно очень мала.

Две последние причины приводят к тому, что квантовый выход хемилюминесценции в случае, скажем, реакции двух перекисных радикалов составляет всего 10-8-10-10.

Квантовый выход образования возбужденных молекул продукта:

 

а квантовый выход люминесценции продукта:

для кетонов.

Таким образом, общий квантовый выход хемилюминесценции равен 10-8-10-10.

Для усиления свечения надо увеличить QХЛ или QВОЗБ или QЛЮМ или и то и другое. Соединения, которые реагируют с радикалами с образованием возбужденных молекул продуктов, такие как люминол или люцигенин, называют химическими активаторами хемилюминесценции, или хемилюминогенными зондами. Они увеличивают QВОЗБ. Существуют и такие вещества, которые перехватывают возбужденные состояния продуктов и высвечивают кванты с высоким выходом (т. е. увеличивают QЛЮМ). Их называют физическими активаторами хемилюминесценции.

Химические активаторы ХЛ - это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.

Активатор + радикалы ® продукт* ® продукт + фотон

Известными активаторами хемилюминесценции являются люминол  и люцигенин.

Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но тем не менее многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

Радикалы ® продукт* ® продукт + фотон 1 (неактивированная ХЛ)

Продукт* + активатор ® продукт + активатор* ® фотон 2 (активированная ХЛ)

К физическим активаторам можно отнести некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов.

Примеры. 

У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться очень небольшие количества миоглобина. Гем-содержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают очень яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Свечение мочи в этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного.

На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза - фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гем-содержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси.  Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньшее. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур.

Биолюминесценция

Биолюминесценция - это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к биолюминесценции обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, весьма различен у разных видов; однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом, называемым люциферазой. 

Измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что в отсутствие кислорода фотобактерии не характеризуются свечением, свечение усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О2 от 2•10-8 до 5•10-6 моль/л. Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве "лабораторного животного", т. е. живых организмов, на которых изучают, к примеру, действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии весьма чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, скажем ионами тяжелых металлов. Свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков.  

24


УФ условно делится на три о
бласти

А (315400нм)

В (280315нм)

С (200280 нм).

h (200-400 нм) молекула (А)

                         электронно-возбужденное состояние (А*)

                    

                 А*+В                             h (видимая область спектра)

Рис. 1.

Спектры поглощения и флюоресценции некоторых биологически важных соединений. Сплошные кривые – оптическая плотность, кривые пунктиром – интенсивность флюоресценции.

С1

c

d

a

b

B

К

С2

D

С

Д

Л

Инфракрасную область

спектра условно разделяют на:

близкую

(0,7602,5 мкм),

среднюю

(2,550 мкм)

далекую

(502000 мкм).

Т1

Т2Т1

gradT

ИК излучение

Спектр поглощения

Спектр люминесценции

 погл                          люм                                                           

D, I

Триплетная

система уровней

Синглетная

система уровней

S0

S3

S2

S1

T1

T3

T2

фосфоресценция

флуоресценция

поглощение энергии

безизлучательные

переходы

Хемилюминесценция в биологических системах

Собственная

хемилюминесцннция

Активированная

хемилюминесценция

Биолюминесценция

 Рис. 86


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

81537. Роль гормонов в регуляции обмена кальция и фосфатов (паратгормон, кальцитонин). Причины и проявления гипо- и гиперпаратироидизма 106.8 KB
  Паратгормон Паратгормон ПТГ одноцепочечный полипептид состоящий из 84 аминокислотных остатков около 95 кД действие которого направлено на повышение концентрации ионов кальция и снижение концентрации фосфатов в плазме крови. Скорость распада гормона уменьшается при низкой концентрации ионов кальция и увеличивается если концентрация ионов кальция высока. Секреция ПТГ регулируется уровнем ионов кальция в плазме: гормон секретируется в ответ на снижение концентрации кальция в крови.
81538. Строение, биосинтез и механизм действия кальцитриола. Причины и проявление рахита 137.84 KB
  Действие гормона направлено на повышение концентрации кальция в плазме крови. Низкая концентрация фосфатов и ионов Са2 в крови также ускоряет синтез кальцитриола причём ионы кальция действуют опосредованно через паратгормон. Так например в клетках кишечника кальцитриол индуцирует синтез Са2переносящих белков которые обеспечивают всасывание ионов кальция и фосфатов из полости кишечника в эпителиальную клетку кишечника и далее транспорт из клетки в кровь благодаря чему концентрация ионов кальция во внеклеточной жидкости поддерживается на...
81539. Строение и секреция кортикостероидов. Изменения катаболизма при гипо- и гиперкортицизме 159.94 KB
  Гормоны коры надпочечников кортикостероиды. В коре надпочечников синтезируется более 40 различных стероидов различающихся по структуре и биологической активности. В коре надпочечников образуются предшественники андрогенов из которых наиболее активный дегидроэпиандростерон ДЭА и слабый андростендион. Самый мощный андроген надпочечников тестостерон синтезируется в надпочечниках в небольшом количестве.
81540. Регуляция синтезами секреции гормонов по принципу обратной связи 126.07 KB
  Поддержание уровня гормонов в организме обеспечивает механизм отрицательной обратной связи. Изменение концентрации метаболитов в клеткахмишенях по механизму отрицательной обратной связи подавляет синтез гормонов действуя либо на эндокринные железы либо на гипоталамус. Синтез и секреция тропных гормонов подавляется гормонами эндокринных периферических желёз.
81541. Половые гормоны: строение, влияние на обмен веществ и функции половых желез, матки и молочных желез 133.12 KB
  Биосинтез эстрогенов как биохимический процесс представляет собой ароматизацию С19стероидов катализируемую комплексом ферментов локализованных в микросомах. У женщин детородного возраста основная масса эстрогенов синтезируется в яичнике содержащем зреющий фолликул или желтое тело. Синтез эстрогенов в фолликуле определяется взаимодействием двух стероидпродуцирующих структур зернистого слоя и текаклеток. Синтез эстрогенов в зреющем фолликуле является одним из основных факторов определяющих функцию гипофизарноовариальной системы т.
81542. Гормон роста, строение, функции 102.09 KB
  Гормон роста соматотропин пептидный гормон образуется в соматотропных клетках аденогипофиза. Молекула СТГ состоит из 191 аминокислотного остатка на восемь остатков меньше чем в молекуле пролактина и в отличие от пролактина содержит не три а два внутримолекулярных дисульфидных мостика Гормоном роста соматотропин называют за то что у детей и подростков а также молодых людей с ещё не закрывшимися зонами роста в костях он вызывает выраженное ускорение линейного в длину роста в основном за счет роста длинных трубчатых костей...
81543. Метаболизм эндогенных и чужеродных токсических веществ: реакции микросомального окисления и реакции конъюгации с глутатионом, глюкуроновой кислотой, серной кислотой 144.87 KB
  В ЭР существуют две такие цепи первая состоит из двух ферментов NDPHP450 редуктазы и цитохрома Р450 вторая включает фермент NDHцитохромb5 редуктазу цитохром b5 и ещё один фермент стеароилКоАдесатуразу. Электронтранспортная цепь NDPHP450 редуктаза цитохром Р450. Восстановленный FMN FMNH2 окисляется цитохромом Р450 Цитохром Р450 гемопротеин содержит простетическую группу гем и имеет участки связывания для кислорода и субстрата ксенобиотика. Название цитохром Р450 указывает на то что максимум поглощения комплекса...
81544. Металлотионеин и обезвреживание ионов тяжелых металлов. Белки теплового шока 109.86 KB
  Белки теплового шока. Белки теплового шока это класс функционально сходных белков экспрессия которых усиливается при повышении температуры или при другихстрессирующих клетку условиях. Повышение экспрессии генов кодирующих белки теплового шока регулируется на этапе транскрипции. Чрезвычайное усиление экспрессии генов кодирующих белки теплового шока является частью клеточного ответа на тепловой шок и вызывается в основном фактором теплового шока HSF англ.
81545. Токсичность кислорода: образование активных форм кислорода (супероксид анион, перекись водорода, гидроксильный радикал) 132.6 KB
  К активным формам кислорода относят: ОН гидроксильный радикал; супероксидный анион; Н2О2 пероксид водорода. Активные формы кислорода образуются во многих клетках в результате последовательного одноэлектронного присоединения 4 электронов к 1 молекуле кислорода. Конечный продукт этих реакций вода но по ходу реакций образуются химически активные формы кислорода.