38522

Технологічний процес виробництва НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду)

Дипломная

Производство и промышленные технологии

Складено аналітичний огляд літератури щодо властивостей сучасних лікарських форм та галузей застосування коферментів. завдяки сучасним біотехнологіям отримало надзвичайні можливості щодо вирішення соціальних проблем пов’язаних з харчуванням зростаючого населення планети підтримкою здоров’я людини і навколишнього середовища поповненням джерел енергії та природних ресурсів [1]. Стан біотехнологічної галузі потребує великої уваги з боку держави тому що роль сучасної біотехнології є вирішальною для становлення економіки...

Украинкский

2013-09-28

1.51 MB

43 чел.

Реферат

Проект присвячений виробництву коферменту НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду), що служить в переносі атомів водню та електронів, та є одним із важливих коферментів, що відповідають за окисно – відновні процеси в клітинах. У  курсовому   проекті  дано  обґрунтування  та  викладено  технологічний процес по виділенню препарату, який включає стадії відділення цільового продукту, очистка культуральної рідини та отримання готового продукту. Складено  аналітичний  огляд  літератури  щодо  властивостей,  сучасних лікарських форм  та  галузей  застосування  коферментів.

Загальний обсяг роботи:

  •  сторінок 127;
  •  малюнки – 7;
  •  таблиці – 3;
  •  літературні джерела - 26

У курсовому проекті обґрунтовано та наведено технологічний процес виробництва НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду).

Наведено аналітичний огляд літератури щодо застосування препарату, значення у життєдіяльності людини, джерела одержання.

 Ключові слова: НАД (нікотинамідаденіндинуклеотид),

Brevibacterium amoniagenes, субстанція, штам, біосинтез, кофермент.

Перелік умовних позначень

НАД             нікотинамідаденіндинуклеотид

НАДН          нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений

НАДФН       нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат відновлений

ТС                 технологічна схема

АС                 апаратурна схема

БАР               біологічно активна речовина

ПС                 поживне середовище

КР                  культуральна рідина

Вступ

Міжнародними експертами в галузі біотехнологічних  наукових досліджень, інтелектуальної власності та економічної політики на Всесвітньому біотехнологічному форумі було одностайно визнано, що людство в ХХI ст. завдяки сучасним біотехнологіям отримало надзвичайні можливості щодо вирішення соціальних проблем, пов’язаних з харчуванням  зростаючого населення планети, підтримкою здоров’я людини і навколишнього середовища,  поповненням джерел енергії та природних ресурсів [1].

Стан біотехнологічної галузі потребує великої уваги з боку держави, тому що роль сучасної біотехнології є вирішальною для становлення економіки України, розвиток котрої базується на впровадженні високотехнологічних виробництв. Залучення біотехнологічних розробок уможливлює розв’язання актуальних завдань сучасної медицини, сільського господарства, фармакології, екології, низки галузей промисловості [3].

Біотехнологічні процеси з використанням мікроорганізмів і ферментів вже на сучасному технічному рівні широко застосовують у харчовій промисловості. Промислове вирощування мікроорганізмів використовують для одержання багатьох цінних сполук - ферментів, гормонів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків, метанолу, органічних кислот (оцтової, лимонної, молочної) і т.д.

 В наш час в Україні модернізація промисловості і науки являється актуальною проблемою в вирішенні якої значне місце відводиться біотехнології.

Однією з важливих задач модернізації являється вдосконалення технології отримання біологічно активних речовин.

Нікотинамідаденіндинуклеотид є коштовним лікувальним препаратом, субстанцією для фармакологічної промисловості і реактивом для хімічних виробництв і наукових досліджень.

НАД являється одним із основних метаболітів клітини, застосовується в медицині, як ліки – імуномодулятори, при лікування і профілактиці хвороб – як реактив і компонент діагностики.

Коферменти – це низькомолекулярні небілкові компоненти складних ферментів, які виконують роль каталізаторів біохімічних процесів.

Найбільш відомими є коферменти НАД  та НАДФ.

Основна функція НАД та НАДФ полягає в оборотному переносі атомів водню та електронів. Безпосередню в переносі протонів та електронів приймає участь нікотинамідна частина молекул цих коферментів.

За участю НАД та НАДФ відбуваються такі процеси:

· гліколіз (аеробний, анаеробний)

· декарбоксилювання a-кетокислот

· пентозофосфатний цикл (в ньому йде синтез НАДФН)

· циклі трикарбонових кислот

· β-окислення та синтез жирних кислот

· синтез та гідроксилювання холестерину та стероїдів

· гідроксилування ксенобіотиків.

В організмі НАД і НАДФ утворюються з ніацину - вітаміну РР  (нікотинова кислота та нікотинамід) через стадії приєднання фосфорибозилпірофосфату та АТФ і при необхідності через амінування нікотинової кислоти в нікотинамід [3].  

Актуальність теми. На даний час виробництво НАД в Україні відсутнє. За кордоном методи отримання НАД (методи екстракції із біомаси) мають низький вихід цільового продукту. Найбільш перспективним методом отримання НАД є мікробіологічний синтез. Виконання мікробіологічного синтезу НАД має значні труднощі, пов'язані головним чином з нестачею запропонованих штамів – продуцентів НАД і методи його отримання.

Новизна теми: Новизною даного проекту є можливість отримання очищенного препарату НАД  за допомогою Brevibacterium ammoniagenes  із застосуванням стадії  сепарації для відділення біомаси та ультрафільтрації для очищення від високомолекулярних домішок.

Максимальний синтез НАД (6,5 мг/мл) відбувається в присутності детергентів. Найбільш ефективним виявився цетилпіридинний хлорид в концентрації 1 – 2 мг/мл [17].

Розділ 1. Аналіз стану проблеми

1.1. Характеристика і основні галузі застосування продукту

Нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД) є одним із важливих коферментів, які відповідають за окисно – відновні процеси в клітинах. НАД використовується у медицині, як імуномодулятор. Він забезпечує нейротрансмітерну функцію – передачу нервових імпульсів між мозком і іншими органами тіла. Порушення синтезу деяких гормонів, наприклад, інтерферону, також може бути викликано недостатньою кількістю НАД. Нікотинамідні коферменти являються антиоксидантами, які захищають організм від вільних радикалів, токсинів, канцерогенів, забрудненого оточуючого середовища. Крім того, НАД  захищає печінку від алкоголю, утворюючи алкогольіндукуючий інгібітор – тестостерон. Він також нормалізує рівень холестерину і кров΄яного тиску. НАД входить до складу лікувальних препаратів, які використовуються для лікування хвороб, що пов΄язані з порушенням роботи центральної нервової системи, таких хвороб, як Паркінсона і Альцгеймера. Також препарати, які містять НАД+  застосовуються в медицині при лікування захворювань серця, шлунку та печінки. Наприклад, препарат «Енергостим», який містить НАД, цитохром С та інозит, застосовували в терапії тварин, котрі страждали токсикоз – алергічним міокардом [25].

Нікотинамідаденіндинуклеотид(НАД) має вирішальну роль у багатьох біохімічних і біологічних процесах. Його функція, як кофактора у окисно –відновних процесах добре відома. НАД також може бути використаний в якості субстрату в деяких біохімічних реакціях.

 

Коферменти можуть сполучатися з білковою частиною (апоферментом) нековалентними фізико-хімічними або ковалентними зв’язками (в останньому випадку вони є простетичними групами ферментного білка — флавінові коферменти, піридоксальфосфат, ліпоєва кислота тощо); деколи коферменти утворюють комплекси з апоферментом лише в ході каталітичного процесу (НАД, НАДФ). Структура найбільш поширених коферментів. Коферменти — похідні вітаміну РР (нікотинаміду) входять до складу дегідрогеназ: нікотинамідаденіндинуклеотид (НАД+) та нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат (НАДФ+).

НАД є одним із найважливіших коферментів, які відповідають за окисно-відновні процеси в клітинах.

Відомо, що НАД регулює життєво важливі процеси в клітині, він є кофактором для процесу гліколізу і циклу трикарбонових кислот, відновлюючи АТФ, в більшості клітинних процесів. НАД служить також попередником НАДФ (нікотінамідаденіндинуклеотидфосфату) [26].

НАД є небілковою частиною ферментів дегідрогеназ, які беруть участь у процесах окислення органічних сполук у клітині. Молекула НАД складається з двох залишків п'ятивуглецевого цукру рибози, які з'єднані двома фосфатними групами. Один цукор зв'язаний з аденіном, а другий — з іншою азотистою основою — нікотинамідом.

1.2. Галузі застосування та потреба на ринку

Нікотинамідаденіндинуклеотид входить в склад лікувальних препаратів, які  використовують для лікування хвороб, що пов΄язані з порушенням роботи центральної нервової системи, таких як хвороби Паркінсона і Альцгеймера.  З приблизно дев'ятисот хворих паркінсонізмом, регулярно приймали добавки НАДН, у 80% спостерігалися різні ступені полегшення тремтіння голови, ригідності кінцівок, уповільнення ходи, втоми та інших симптомів.

У людей з хворобою Альцгеймера поліпшувалася пам'ять. НАДН використовували для пацієнтів з різним ступенем втрати пам'яті, і несподівано в великої частини з них спостерігалося щонайменше відновлення короткочасної пам'яті. Бікмайер перевіряв добавки НАДН на сімнадцяти пацієнтах з хворобою Альцгеймера, яка в біохімічному відношенні багато в чому схожа на хворобу Паркінсона. У всіх випробуваних значно поліпшувалися показники в стандартних місцях на функції пам'яті. Крім того було відзначено уповільнення прогресивної дегенерації мозку, в даний час вважається неминучим наслідком цього захворювання.

У мозку НАДН  допомагає нейронам виробляти дофамін - нейромедіатор, зміст якого порівняно знижений при хворобі Паркінсона. Традиційна медицина лікує це захворювання L-ДОФА – препаратом - замінником дофаміну, який при довготривалому використанні ще більше порушує здатність мозку самостійно виробляти цей нейромедіатор, З цих причин Іоргов Біркмайер - австрійський дослідник, який розробив добавку НАДН  і виконав основну частину роботи  її початкового вивчення - рекомендує лікарям знижувати дозу L-ДОФА своїм пацієнтам з паркінсонізмом при спробах лікування НАДН.  L-ДОФА викликає вивільнення вільних радикалів, які можуть пошкоджувати клітини мозку, тоді як НАДН є одним з найпотужніших антиоксидантів мозку. Таким чином, НАДН зазвичай допомагає так само, як L-ДОФА, однак без будь-яких побічних ефектів [5].

Серцеві захворювання. Хоча дослідники починають вивчати можливості застосування НАДН в інших областях, проте вже відомо, що він, судячи з усього, має суттєве значення при лікуванні серцевих захворювань. В одному експерименті лікарі вводили внутрішньовенно по 15 мг НАДН пацієнтам, яким, згідно з прогнозами, залишалося жити не більше двох днів. Але всупереч всім очікуванням їх стан покращився і вони прожили набагато довше [5].

Поєднання НАДН з іншими стандартними серцево-судинними біодобавками, зокрема, з коферментом Q10 і карнитином, допомагає людям з багатьма серцевими захворюваннями. Ще в одному дослідженні виявлені ознаки того, що він здатний знижувати високий вміст холестерину і високий кров'яний тиск [5].

Підвищення рівня енергії. Отримані в Європі успішні результати застосування НАДН  для поліпшення спортивних показників надихнули американських вчених на проведення аналогічних досліджень. Повідомлялося про один  експеримент, в якому щоденний прийом 5 мг НАДН протягом чотирьох тижнів дозволив сімнадцяти спортсменам у віці від 18 до 35 років поліпшити час реакції і загальні фізичні показники.

Розділ 2 Порівняльна характеристика методів одержання і промислових способів виробництва НАД

В наш час НАД за кордоном отримують мікробіологічним і хімічним синтезом. Хімічний синтез являється багатостадійним процесом з застосуванням дорогих реагентів. В Україні виробництво НАД на сьогодні відсутнє. В світі розвинуті багатотонажні біотехнологічні виробництва, в яких відходом являється мікробна біомаса, яка може бути потенційним джерелом НАД. В літературі приводиться опис методів виділення нікотинамідаденіндинуклеотиду із мікробної біомаси, які не використовують в промисловості через складність масштабування процесу і застосування дорогих і важкодоступних реагентів. Для промислового отримання нікотинамідаденіндинуклеотиду найкращим продуцентом є хлібопекарські дріжджі Saccharomyces cerevisiae, які випускаються в великих об΄ємах, а також утворюються в великих кількостях, в якості відходів спиртового виробництва.

 Є актуальною розробка технології виділення НАД із біомаси хлібопекарських дріжджів з застосуванням дешевих і доступних реагентів (розчини мінеральних кислот, солей і лугів) і технологічних операцій, які можуть бути реалізовані в промисловості з утилізацією утворюваних твердих і рідких відходів.

Перспективним методом отримання нуклеотидів і нуклеотидних коферментів  є de-novo-і salvage (селвідж) - синтези, здійснювані штамами-

продуцентами з групи корінеподібних бактерій. Ці організми знаходять застосування  за кордоном в промисловості для ферментації нуклеотидів методом de-novo-синтезу нуклеотидів.

За кордоном в даний час здійснюються  інтенсивні біохімічні та генетичні дослідження корінеподібних бактерій, проводяться роботи зі створення штамів продуцентів селвідж-синтезу. Раніше був здійснений синтез НАД за допомогою Corynebacterium ammoniagenes АТСС 6872.

 В даний час компанією "Елест" розроблена технологія отримання НАД шляхом біосинтезу. Нікотінамідаденіндинуклеотид отримують при культивуванні штаму Brevibacterium amoniagenes на оптимальних середовищах, що  забезпечують максимальний вихід продукту.

2.1 Методи одержання нікотинамідаденіндинуклеотиду

2.1.1 Мікробний синтез

Найбільш перспективним методом отримання НАД являється мікробіологічний синтез. Необхідно зазначити, що практичне виконання мікробіологічного синтезу НАД має деякі труднощі, пов΄язані головним чином з нестачею штамів – продуцентів НАД і методів його отримання.

Об'єктами дослідження являлися музейні штами корінеподібних бактерій, а також штами – продуценти нуклеотидів.

Найкращий ріст був показаний у Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 з внесенням у середовище попередника. Вирощування культури біологічного агенту проводять на середовищах, які містять глюкозу, сечовину, дріжджовий екстракт, фосфати, солі магнію, кальцію та біотин. Попередниками НАД можуть бути нікотинова кислота та нікотинамід, які вводять на другу добу культивування. На 5- ту добу у середовищі накопичується НАД і культура входить у стаціонарну фазу росту. Окрім НАД у середовищі присутній проміжний продукт його синтезу – мононуклеотид нікотинової кислоти. Нікотинова кислота безпосередньо включається у біосинтез. Якщо ж попередником виступає нікотинамід, то спочатку відбувається ферментативна реакція його дезамінування з утворенням кислоти [11].

2.1.2. Глибинний метод одержання НАД

Культивування продуцентів біологічно активних речовин можна здійснювати двома способами: поверхневим і глибинним.

Поверхневий спосіб вирощування

Культуру вирощують в тонкому шарі пористого (сипучого) середовища з природною або примусовою аерацією.

Спосіб не є актуальним, оскільки суттєвими недоліками вирощування поверхневим методом являються велика трудомісткість робіт, необхідність у громіздкому обладнанні, недосконала гігієна праці. При цьому отримуваний продукт часто має незадовільну якість і активність препарату, як правило, низька. У зв’язку з цим поверхневий метод отримання біологічно активних речовин витіснився глибинним.

Глибинний спосіб вирощування

При глибинному способі культуру вирощують на рідкому середовищі при перемішуванні і примусовій аерації [16].

Процес отримання НАД здійснюють методом глибинної ферментації, як двохстадійний. Ферментацію здійснюють на круговій качалці в колбах Ерлен-мейєра. На першій стадії накопичується біомаса,а на другій, яка починається після внесення в середовище ПАР і попередників, розмноження культури припиняється і відбувається синтез НАД. Виділення, очистку НАД із культуральної рідини здійснювали за допомогою методів ультрафільтрації та осадження.

Ідентифікацію і кількісне визначення НАД і нуклеотидів здійснювали методом  хроматографії (бумажної), спектрофотометричним аналізом, методом з алкогольдегідрогеназою [19].

Як продуцент використовували культуру Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872, яку вирощували на поживному середовищі, яке містило: вуглець, азот, магній, кальцій, стимулятори росту. При цьому джерела вуглецю і азоту вносили по мірі їх вичерпування в поживному середовищі. Культивування проводять до накопичення біомаси не менше 12 мг/мл (по сухій масі), після чого вносять ПАР і попередники біосинтезу НАД. ПАР вносять в кількості, що становить 5-7% від кількості біомаси. Було встановлено, що вихід  НАД залежить від співвідношення ПАР і біомаси. Подальше культивування проводять для біосинтезу НАД, підтримуючи рН в середовищі 6,5-7,0, на протязі 36-42 год до досягнення максимальної кількості НАД в середовищі. Культивування в таких умовах дозволяє стабільно отримати високий вихід НАД (5,7-6,5 мг/мл) [17].

2.2  Вплив основних факторів і параметрів на процес біосинтезу НАД

До основних параметрів, що впливають на процес біосинтезу слід віднести :

  •  параметри культивування  (температура, тиск, частота перемішування, час культивування);

При зміні часу культивування ми не отримуємо потрібну для даного препарату кількість колоніє утворювальних одиниць (КУО). Якщо  буде змінена температура вирощування то дані умови будуть не оптимальними для росту культури коферменту, що також призведе до зниження КУО. Збільшення тиску та частоти перемішування також вплине на кількість КУО, оскільки підвищення даних параметрів відіб’ється на життєздатності клітин.

Зменшення частоти або часу центрифугування призведе до потрапляння культуральної рідини до готової продукції, збільшення ж даних параметрів призведе до зменшення кількості клітин.

Збільшення часу та температури заморожування та ліофілізації призведе до зменшення кількості клітин коферменту, а зменшення відіб’ється на терміні зберігання готової продукції.

Завданням даного проекту є: підбір оптимальної технологічної схеми; вибір найкращого продуцента; розрахунок складу поживного середовища для виробництва коферменту – нікотинамідаденіндинуклеотиду.

Технологічна частина

Розділ 3 Характеристика кінцевої продукції виробництва

1. Опис нікотинамідаденіндинуклеотиду

Препарат НАД у вигляді культуральної рідини Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872  повинен відповідати таким параметрам: однорідна рідина, жовтувато-білого кольору, із специфічним запахом. рН – 2,0, густина (ρ) – 1100 кг/м.

Нікотинамідаденіндинуклеотид присутній в усіх живих клітинах, входить до складу ферментів групи дегідрогеназ, каталізуючих окисно – відновні реакції, виконує функцію перенощика електронів і водню, які приймають від окислених сполук. Відновлена форма (НАДН) здатна переносити їх на інші сполуки.

Являє собою динуклеотид, молекула якого побудована із аміду нікотинової кислоти і аденіну, які зв'язані між собою, складається з двох залишків D – рибози і двох залишків фосфорної кислоти, застосовується в клінічній біохімії при виявленні активності ферментів крові.

 Нікотинамідаденіндинуклеотид отримують з відібраного штаму бактерій Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872. Чистота і якість перевірені в мікробіологічних лабораторіях.

2. Форма випуску.

Порошок (субстанція) у пакетах подвійних поліетиленових, вкладених у барабани HDPE для виробництва нестерильних лікарських форм.

3. Фармакокінетика.

Швидко розподіляється у всі тканини. Проникає через плацентарний бар'єр і в грудне молоко. Метаболізується в печінці з утворенням нікотинамід-n-метилнікотинаміда. Виводиться нирками.

4. Протипоказання до вживання.

Гіперчутливість, важкі форми артеріальної гіпертензії, стенокардія.

5. Побічна дія.

Після введення: рідко - алергічні реакції (шкірний висип, шкірне свербіння). При вживанні високих доз: аритмія, запаморочення, діарея, сухість шкіри і слизистої оболонки очей, гіперглікемія, глюкозурія, спрага, нудота, блювота, пептична виразка, що виснажує шкірне свербіння. При тривалому вживанні - жирова дистрофія печінки, холестаз.

6. Розчинність.

Розчинний у воді, його розчинність складає 1 г/100 мл.

Приготування розчину нікотинамідаденіндинуклеотиду

30 міліграм динатрієвой солі НАДН і 60 міліграм двовуглекислого натрію розчиняють в 6 см3   води. Розчин стійкий при температурі 4ºС протягом чотирьох тижнів.

7. рН (Кислотність або лужність).

Для проведення даного випробування можуть використовуватися два підходи: вимірювання рН (2.2.3) і напівкількісне індикаторне титрування (кислотність і/або лужність). Звичайно випробування проводять у водних розчинах субстанції, але можливе використання і змішаних розчинників. Допустимий інтервал рН звичайно має бути не більше 2.

рН нікотинамідаденіндинуклеотиду становить 1,5 [8].

8. Мікробіологічна чистота

Присутність деяких мікроорганізмів в лікарських засобах може викликати зменшення або навіть інактивацію їх терапевтичної дії і, внаслідок цього, негативно впливати на здоров'я пацієнтів. Тому виробники мають забезпечити низький рівень біологічного забруднення готових дозованих форм шляхом виконання поточних директив належної виробничої практики (НВП, GMP) під час виробництва, пакування, зберігання та розповсюдження лікарських засобів. Критерії прийнятності грунтуються на результатах одного випробування, або на середньому результаті декількох повторних випробувань (наприклад, при випробуванні методом прямого висівання на чашки Петрі) [8].

9. Специфічна нешкідливість

Препарат повинен бути нешкідливим для білих мишей при введенні                                                                                                            його перорально в кількості однієї дози.

Для визначення нешкідливості випробувані зразки розводять 0,9 % розчином хлориду натрію з розрахунку 0,5 мл на одну дозу препарату. Отриману мікробну завись по 0,5 мл вводять 5-ти білим мишам масою (15±1) – г кожній по 1 дозі. Спостереження за мишами ведуть на протязі п'яти діб.

У випадку загибелі за цей строк хоча б однієї миші контроль повторюють на подвійній кількості тварин. Якщо під час повторного контролю ні одна з 10 мишей на гине, препарат вважають таким, що витримав випробування. В протилежному випадку цю серію препарату бракують.

10. Кількісне визначення.

Для кількісного визначення основної речовини в субстанції бажане використання прямих методів аналізу. Для солей звичайно достатньо аналізу лише одного з іонів —  краще фармакологічно активного. Зазначають межі вмісту основної речовини в субстанції (звичайно у перерахунку на суху або безводну речовину) або, якщо це неможливо визначити, наводять вимоги за параметрами, пов'язаними зі вмістом основної речовини в субстанції.

Якщо необхідно, визначають біологічну активність. Якщо визначення вмісту основної речовини в субстанції неможливе, проводять визначення таких кількісних показників, які пов'язані зі вмістом основної речовини у субстанції.

Температура плавлення нікотинамідаденіндинуклеотиду - 160ºС

10.1 Кількісне визначення субстанції НАД

Приготування розчину НАДН.

30 мг. динатрієвої солі НАДН і 60 міліграм двовуглекислого натрію розчиняють в 6 см3   води. Розчин стійкий при температурі 4ºС  протягом чотирьох тижнів.   

Кількісне визначення субстанції   нікотинамідаденіндинуклеотид.  Близько 0,15  г препарату  (точна наважка) поміщають  в  колбу для  титрування, розчиняють в 15 мл свіжопрокип'яченої гарячої води і  після  охолоджування  титрують  0,1М  розчином  їдкого  натрію  до  не  зникаючого протягом 1хв.  рожевого забарвлення. 1 мл 0,1М розчину їдкого натрію відповідає 0,1231 г нікотинамідаденіндинуклеотиду.  

Ідентифікація нікотинаміду.   0,1  г  препарату  нагрівають  з  0,1  г  безводого  карбонату  натрію,  розвивається запах піридину.   0,1 г препарату нагрівають з 2 мл 0,1М розчину їдкого натрію, з'являється запах аміаку (відмінність від нікотинової кислоти).    

Кількісне визначення субстанції   нікотинаміду.  Близько 0,15 г заздалегідь висушеного препарату (точна наважка)  розчиняють  в  20  мл безводної  оцтової  кислоти  і  титрують  0,1М  розчином  хлорної  кислоти  з  індикатором  кристалічний  фіолетовий до появи смарагдово-зеленого забарвлення.

11. Пакування і зберігання.

Упаковка та умови зберігання мають забезпечувати якість субстанції протягом терміну придатності. Зберігати в захищеному від світла місці при температурі від 8 до 25˚С. Зберігати в недоступному для дітей місці.   Термін придатності – 5 років.

12. Маркування.

Маркування має містити відомості про виробника, торгову та міжнародну непатентовану назву субстанції, умови зберігання, застережні заходи (якщо необхідно), дату виготовлення і термін придатності.

13. Термін придатності.

1 рік з моменту ліофілізації.

Розділ 4 Обгрунтування вибору технологічної схеми

Вибір технології

На сьогоднішній день технологія одержання коферментів, зокрема НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду) широко розвивається в багатьох країнах світу, зокрема і в Україні, що спричинено стрімким зростанням хворих на серцеві захворювання. Але на жаль, на сьогодні, ще не винайдена технологія дешевого НАД. Майже весь НАД одержують за допомогою мікробного синтезу, який є занадто дорогим.

Вимоги, які висувають до обладнання мікробіологічної промисловості більш жорсткі, ніж до обладнання хімічної промисловості, тому що більшість технологічних процесів мікробного синтезу, а також процес виділення із культуральної рідини цільового продукту відбувається в обмеженому інтервалі температур і тиску, значеннях рН, що близьке до нейтрального.

Обов΄язковою умовою до обладнання мікробіологічної промисловості є дотримання санітарно – гігієнічних норм та уникнення контамінації. Також однією із умов є герметичність ферментаційного обладнання. Враховуючи ці умови мікробіологічне виробництво дозволяє одержати більш якісний та високоефективний, екологічно чистий продукт, ніж хімічне виробництво.

Мікробіологічне отримання препарату у порівнянні з хімічним практично не залежить від конструктивних особливостей апарату та його параметрів, тому що велике значення для хімічної технології має правильний вибір матеріалу із якого виготовляють обладнання, так як компоненти матеріалу можуть викликати як активуючі так і інгібуючі дії під час синтезу.       Головною перевагою мікробіологічного виробництва препарату НАД здійснюється за посередництвом мікроорганізму без втручань людини, яка підтримує умови існування живого мікроорганізму, що дозволяє здешевити виробництво, хоча даний продуцент росте на досить дорогому субстраті, а саме на глюкозі. Адже його отримують у досить малих кількостях і цей препарат є дорогим. Недоліком хімічних шляхів одержання препарату є те, що вони більш енергозатратні та економічно нестабільні, потребують у великих кількостях діючої речовини, що лежить в основі препарату, а також весь технологічний процес ведеться під пильним контролем людей, із урахуванням математичних розрахунків.

4.1. Аналітичний огляд способів і методів реалізації мети виробництва

Метою будь – якого технологічного процесу, що враховує властивості продуцента, є одержання максимального виходу цільового продукту з мінімальними затратами під час виробництва.

Для якісного і безпечного процесу виробництва НАД необхідним є дотримання правил техніки безпеки персоналом. Керівництво має забезпечити персонал спецодягом та засобами індивідуального захисту. Також обов’язковими є регулярні планові заняття з персоналом та перевірка засвоєного матеріалу.

Миючі засоби готуються у спеціальних змішувачах. Розчин перекису водню використовується для дезінфекції приміщень під час генерального прибирання. Розчин каустичної соди використовується для миття ферментера.

Підготовка приміщень до роботи також має велике значення – виробничі приміщення повинні бути чистими для попередження виникнення контамінації у процесі виробництва. Для цього проводяться щоденні прибирання з синтетичними миючими засобами. Обов’язковими є щотижневі генеральні прибирання. Для такого прибирання використовується дезінфікуючий засіб перекис водню. Після генерального прибирання проводиться мікробіологічний контроль.

Обладнання та комунікації повинні бути у належному стані. Стадії підготовки обладнання і комунікацій включають в себе миття розчином каустичної соди, ополіскування водою, перевіркою обладнання на герметичність та стерилізацію ферментера. Все це здійснюється для забезпечення асептичності умов процесу. Відпрацьовані розчини та конденсати відправляють на знешкодження і утилізацію.

Стерильність повітря – один з найважливіших критеріїв для досягнення асептичності виробництва. Оскільки бактерія Brevibacterium ammoniagenes являється аеробом, повітря має подаватись безпосередньо у ферментер через патрубок – барботер.  Повітря забирається на висоті 30 м і подається у перший фільтр для очищення від пилу та інших частинок. Далі повітря стабілізується для отримання ламінарності його потоку. У головному фільтрі йде очищення від більшості мікроорганізмів, далі йде очистка у індивідуальному фільтрі для досягнення більш досконалої стерильності. Подача стерильного повітря забезпечує асептичніть і зменшує ризик контамінації.

Компоненти поживного середовища мають бути дозовані відповідно до рецепту та простерилізовані для попередження контамінації сторонньою мікрофлорою. Хоча компоненти і стерилізуються в однакових умовах, стерилізуються вони окремо. Це проводиться для того, щоб запобігти утворенню осадів. Так, солі фосфору та солі натрію стерилізуються окремо від сірчанокислих солей та кукурудзяного екстракту. Для утворення розчинів солей використовується питна вода. Стерилізація проводиться за температури 127о С 20 хв. За такої температури гинуть контамінантні мікроорганізми.

Далі йде підготовка посівного матеріалу. Для цього музейну культуру, що зберігалась не більш як півтора року за температури 4-5оС під шаром вазелінової олії пересівають у колби і вирощують на качалках, зберігаючи асептичність умов. Далі культуру переносять у інокулятор де продовжується накопичення біомаси культури. Для цих процесів використовується промислове поживне середовище.

Стадія виробничого культивування – одна з головних стадій усього виробництва, адже під час культивування утворюється цільовий продукт. Якість нашого продукту дуже залежить від попередніх підготовок та допоміжних робіт – від правильного дозування та стерилізації компонентів поживного середовища, від стерильності повітря та робочого місця, від попередньої підготовки обладнання і т.д.

На підставі альтернативного порівняння з іншими технологіями отримання біологічно активних речовин, технологія отримання НАД не є дуже вибагливою, а саме до біологічного агенту, оскільки Brevibacterium ammoniagenes – це факультативний анаероб, і це в свою чергу значно спрощувало процес, оскільки цей мікроорганізм може рости як за присутності кисню, так і без нього, даний продуцент не є вибагливим до складу поживного середовища. Позитивною властивістю біологічного агенту, є те, що можливість синтезувати НАД не лімітується вмістом магнію в середовищі культивування. Ще однією перевагою, є те, що даний продукт накопичувався в культуральній рідині, тому не потрібно було застосовувати методів екстракції з біомаси. Альтернативою може бути поверхневе вирощування в спеціальних ростильних установках, але оскільки даний вид культивування є не рентабельним то використовується глибинне культивування продуценту. Глибинний спосіб є вигіднішим для промисловості у порівнянні з поверхневим способом, так як дозволяє виповнити повну механізацію та автоматизацію процесу, запобігти інфікуванню технологічного процесу сторонньою мікрофлорою. Періодичний спосіб використовується для отримання посівного матеріалу на деяких етапах.

Показано, що важливими умовами культивування з метою дослідження максимального виходу НАД є вміст дріжджового екстракту 1,2%, час культивування до внесення попередників 24 год. і час культивування з попередником 39 год. Досліджували вплив різних співвідношень глюкози і сечовини при здійсненні процесів ферментації. Показано, що найбільше накопичення біомаси досягається при вмісті в поживному середовищі: глюкози – 7%; сечовини – 0,6% і тривалість ферментації 36 год.

Отже, біосинтез НАД проводять безперервним глибинним способом в ферментерах не складних конструкцій. Безперервний глибинний спосіб обирають тому, що саме при його використанні спостерігається синтез максимальної кількості НАД в культуральній рідині.

4.2. Обгрунтування вибору біологічного агента

В СРСР був розроблений синтез НАД в культурі хлібопекарських дріжджів. Хлібопекарські дріжджі являють собою мікроорганізми з родини сахароміцетів, основний вид яких використовується – Saccharomycetes cerevisiae. Дріжджові клітини фактично використовують як мікрореактори для синтезу НАД із попередників в присутності джерела енергії. Система складається із наважки дріжджових клітин (50%) в розчині, який містить фосфати, солі магнію, аденін і нікотинамід в якості попередника, а також глюкозу та екстракти хлібопекарських дріжджів. При цьому у порівнянні з початковою кількістю НАД збільшується в 10 разів. Далі відбувається екстракція НАД із клітини і виділення його шляхом іонообмінної хроматографії.

Синтез шляхом культивування продуцента Proteus mirabilis проходить з попередниками. Вирощування продуцента рекомендується проводити на середовищах,які містять глюкозу, сечовину, дріжджовий екстракт, фосфати, солі магнію, кальцію і біотину. Попередники  зазвичай вводять на 2 доби росту культури При цьому на 2 добу в середовищі накопичується НАД в значній кількості. В цей час культура вступає в фазу стаціонарного росту. рН має бути 6-7 [7].

Подальші дослідження довели переваги використання в промислових масштабах саме  Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872.

  1.  Являються факультативними анаеробами, що дає їм змогу розвиватись і рости як в присутності кисню так і без нього.

B. ammoniagenes АТСС 6872.

  1.   Ростуть на великій кількості поживних середовищ, а саме МПА, МПБ, напівсинтетичне середовище з низьким вмістом неорганічного фосфату, кров΄яний агар і жовточно-спиртовий агар.
  2.  Ростуть в широкому діапазоні температур(від 10 до 43˚С).
  3.  B. ammoniagenes АТСС 6872, не вирощували на таких складних середовищах, як Himedia, для накопичення НАД, як це проводили з іншими мікроорганізмами.
  4.  При використанні в синтезі С. ammoniagenes (Brevibacterium) АТСС 6872 спостерігається значне накопичення НАД, вихід 30,5 мг/г біомаси, достатньо високий, коли інші мікроорганізми синтезують невелику кількість НАД (до 0,5 мг/мл).
  5.  При вирощуванні  B. ammoniagenes АТСС 6872, в середовище вносили дріжджовий екстракт, для того щоб досягти максимального виходу НАД.
  6.  При використанні B. аmmoniagenes АТСС 6872,  НАД накопичувалася в культуральній рідині, і вихід продуцента був достатньо високим, ніж ті, які накопичувалися в середині клітини.

Біологічний агент вибраний правильно, адже він дозволяє виробляти цільовий продукт з меншими затратами ресурсів, часу та коштів, а також є більш екологічно безпечним, ніж, наприклад, використання будь-якого іншого агенту [13,15].

4.3 Обгрунтування вибору складу поживного середовища

Для синтезу всіх клітинних компонентів мікроорганізмам потрібні поживні речовини − розчинні у воді сполуки, з яких мікроорганізми будують свою клітину. Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, повинні відповідати таким мінімальним вимогам: в них повинні бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, причому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати. До складу бактеріальної клітини входять такі елементи, % до маси сухої речовини: вуглець — 50; кисень — 20;азот — 10 -14;водень — 8;фосфор — 3;сірка, калій, натрій — 1; кальцій, магній, хлор — 0,5;  залізо — 0,2;  решта елементів — близько 0,3 [15].

Продуцент – бактерії B. аmmoniagenes .

Вирощування культури ведеться на поживному середовищі, що містить: глюкозу, сечовину, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4×7H2O, CaCl2, дріжджовий екстракт та біотин.

Як джерело вуглецю та енергії використовували глюкозу, хоча вона являється досить дорогим субстратом, та наш препарат має теж дорогу ціну і випускається у малих кількостях.

У склад поживного середовища входить сечовина, яка служить матеріалом для отримання лікарських препаратів, яким і являється НАД.

Біотин – функціонує як коензим у реакціях карбоксилювання, залежних від бікарбонату.

Фосфору у середовищі міститься близько 1 %, який входить у склад KH2PO4 та  K2HPO4, фосфор входить до складу головних біоелементів, являється компонентом нуклеїнових кислот, фосфоліпідів і нуклеотидів.

Також середовище містить близько 1 % Mg, який являється кофактором ферментів, присутній у клітинних стінках, мембранах та ефірах фосфорної кислоти.

Середовище містить Са близько 0,01%, який є важливим компонентом ендоспор.

До складу поживного середовища входить S, яка є компонентом коферменту.

У середовищі міститься азот, який входить до складу сечовини та біотину. Дріжджовий екстракт – виступає фактором росту, як повноцінний та дешевий субстрат. Отже поживне середовище для культивування B. аmmoniagenes АТСС 6872 містить всі необхідні елементи, з яких будується клітина, причому в доступній для засвоєнням організмом формі. Такими основними компонентами є джерело вуглецю та енергії, джерела мінеральних сполук ( азот, фосфор, сірка, магній, кальцій ), а також фактор росту.

Як посівний матеріал використовують 10 % рідкого інокуляту, отриманого при вирощуванні культури на середовищі, що містить пептон, дріжджовий екстракт, як повноцінне та дешеве джерело, NaCl, біотин [21].

4.3.1. Розрахунок складу поживного середовища

Скласти базове поживне середовище для вирощування ауксотрофного штаму Brevibacterium ammoniagenes – продуцента НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду), якщо за 72 год культивування концентрація нікотинамідаденіндинуклеотиду в культуральній рідині становить 6,5 мг/мл, а концентрація біомаси – 18 мг/мл.

 Розрахунок вмісту в середовищі джерела вуглецевого живлення.

Як джерело вуглецю для одержання нікотинамідаденіндинуклеотиду використовується глюкоза.

Розрахуємо, скільки вуглецю (за елементом С) міститься в 6,5 мг НАД. Молекулярна маса нікотинамідаденіндинуклеотиду становить 663. Отже , у 663 г нікотинамідаденіндинуклеотиду міститься 252 г вуглецю, а в 6,5 мг  (252×6,5)/663=2,5 мг вуглецю.

Далі розраховуємо, у скількох грамах глюкози міститься 2,5 мг вуглецю, враховуючи, що вміст вуглецю у глюкозі становить 50%. Отже у 100 г глюкози міститься 50 г вуглецю, а у 2,5 мг вуглецю міститься у (2,5×100)/50=5 мг глюкози.

Для одержання 6,5 мг нікотинамідаденіндинуклеотиду, вміст глюкози у середовищі повинен бути 5×2=10 мг/мл або 0,1%. Враховуючи, що при вирощуванні на вуглеводах, в нашому випадку на глюкозі, близько 40% субстрату окислюється до СО2 для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму, вміст глюкози у середовищі становитиме (10×0,4)+10=14 мг/мл=0,14%.

Потреби для синтезу біомаси(вуглець). У біомасі міститься 50% вуглецю, отже вміст вуглецю у 18 мг біомаси становить 18×0,5=9 мг. Джерелом вуглецю у промисловому виробництві НАД є глюкоза (С6Н12О6), яку вносять у середовище у кількості 100 г. Вміст вуглецю у С6Н12О6 становить 72/180=0,4 або 40%. Отже можемо записати 4×Х=9, звідки Х=2,25. Концентрація глюкози у середовищі становить (180×2,25)/72=5,625 г/л. Отже середовище для культивування продуцента НАД містить 5,625 г/л С6Н12О6.

Отже загальна кількість вуглецю у поживному середовищі становить: 14 г/л +5,625 г/л =19,625 г/л

 Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення

Потреби для синтезу нікотинамідаденіндинуклеотиду.

Азот входить до складу нікотинамідаденіндинукдеотиду.

Молекулярна маса нікотинамідаденіндинуклеотиду становить 663. У 663 г нікотинамідаденіндинуклеотиду міститься 98 г азоту (N), тоді у 6,5 мг нікотинамідаденіндинуклеотиду вміст азоту становить (6,5×98)/663=0,96 мг.

Розрахунок вмісту органічного азоту у біотині.

Біотин є джерелом органічного азоту, який засвоюється продуцентом нікотинамідаденіндинуклеотидом. У 30 мкг міститься (30×28)/244=3,4 мкг азоту, де 28 молекулярна маса азоту, 244 – молекулярна маса біотину.

Азот також ще входить до складу сечовини СО(NH2)2. Вміст сечовини у складі поживного середовища становить 0,6%. У 0,006 мг міститься (0,006×28)/60=0,0028мг азоту.

Отже загальна кількість азоту в середовищі становить: 0,96 мг +3,4 мкг +0,0028 мг =4,3628 мг.

 Розрахунок вмісту фосфору у середовищі.

У біомасі міститься близько 1% фосфору (за елементом Р). Отже для синтезу 18 мг/мл біомаси вміст фосфору у середовищі повинен становити 18×0,01=0,18 мг/мл. Джерелами фосфору у промисловому виробництві нікотинамідаденіндинуклеотиду є одно та двозаміщений калій фосфорнокислий – КН2РО4 і К2НРО4, які вносять у середовище у рівних кількостях (співвідношення 1:1).

Вміст фосфору у КН2РО4 становить 31/136=23%, а у К2НРО4 – 31/174=18%. Отже у КН2РО4 міститься у 23/18 =1,3 рази більше фосфору,ніж у К2НРО4. Приймемо вміст фосфору (Р) у К2НРО4за 1(одиницю), тоді вміст Р у КН2РО4 буде 1,3. Отже можемо записати 2,3×Х=0,18 мг/мл, звідси Х=0,08.

Таким чином вміст Р у вигляді К2НРО4становить 0,08 мг/мл, а у вигляді КН2РО4 – 0,08×1,3=0,104 мг/мл.

Відповідно,концентрація цих солей у середовищі становить (174×0,08)/31=0,45 мг/мл та (136×0,104)/31=0,45 мг/мл.

Отже, середовище для культивування продуцента НАД містить по 0,45 мг/мл  КН2РО4 і К2НРО4.

Розрахунок вмісту хлору в середовищі

У біомасі міститься близько 0,5% хлору (за елементом Cl). Отже для синтезу 18 мг/мл біомаси вміст хлору у середовищі повинен становити 18×0,005=0,09мг/мл.

Джерелом хлору у промисловому виробництві НАД є сіль СаСl2, яку вносять у кількості 0,1 г. Вміст хлору у СаСl2 становить 71/111=63%.

Отже можемо записати 6,3×Х=0,09, звідки Х=0,014. Відповідно концентрація цієї солі становить (111×0,014)/71=0,02 мг/мл.

Отже, середовище для культивування продуцента НАД містить 0,02 мг/мл СаСl2.

 Розрахунок вмісту кальцію у середовищі

У біомасі міститься близько 0,5% кальцію (за елементом Са). Отже для синтезу 18 мг/мл біомаси вміст кальцію у середовищі повинен становити 18×0,05=0,09 мг/мл.

Джерелом кальцію у промисловому виробництві НАД є сіль СаСl2, яку вносять у кількості 0,1г. Вміст кальцію у СаСl2 становить 40/111=0,36 або 36%.

Отже можемо записати 3,6×Х=0,09, звідки Х=0,025. Відповідно концентрація цієї солі становить (111×0,025)/40=0,07 мг/мл.

Отже середовище для культивування продуцента НАД містить 0,07 мг/мл СаСl2.

 

Розрахунок вмісту магнію у середовищі

У біомасі міститься близько 0,5% магнію (за елементом Мg). Отже для синтезу 18 мг/мл біомаси вміст магнію у середовищі повинен становити 18×0,05=0,09 мг/мл.

Джерелом магнію у промисловому виробництві НАД є МgSO4×7H2O, у кількості 10г. Вміст магнію у МgSO4×7H2O  становить 24/246=9%.

Отже можемо записати 0,9×Х=0,09, звідки Х=0,1. Відповідно концентрація становить (246×0,1)/24=1,025 мг/мл.

Отже середовище для культивування продуцента НАД містить 1,025 мг/мл Мg.

 Розрахунок вмісту сірки в середовищі

У біомасі міститься близько 1% сірки (за елементом S). Отже для синтезу 18 мг/мл біомаси вміст сірки у середовищі повинен становити 18×0,01=0,18 мг/мл.

Джерелом сірки у промисловому виробництві НАД є МgSO4×7H2O, у кількості 10г. Вміст сірки у МgSO4×7H2O  становить 32/246=13%.

Отже можемо записати 1.3×Х=0,18, звідки Х=0,13. Відповідно концентрація становить (246×0,13)/32=0,99 мг/мл.

Сірка входить не тільки до складу МgSO4×7H2O, а ще й біотину С10Н16О3N2S.

Отже для синтезу 18 мг/мл біомаси вміст сірки у середовищі повинен становити 18×0,01=0,18 мг/мл. Біотин міститься у кількості 30 мкг. Вміст сірки у С10Н16О3N2S становить 32/244=13%.

Отже, можемо записати 1,3×Х=0,18, звідки Х=0,13. відповідно концентрація становить (244×0,13)/32=0,99 мг/мл.

Отже загальна кількість сірки у середовищі становить – 0,99+0,99=1,98 мг/мл.

4.4 Обґрунтування вибору ферментаційного обладнання

Всі форми та види ферментаційних систем створюються, маючи за основну мету забезпечення однакових умов для всіх компонентів, що містяться в реакторі. Біореактор повинен бути сконструйований так, щоб виключити можливість потрапляння забруднюючих мікроорганізмів, а також забезпечити збереження потрібної мікрофлори. Об’єм культивуємої суміші повинен залишатися постійним. Рівень розчинного кисню повинен підтримуватися вище критичних рівней керування культури аеробних організмів; параметри зовнішнього середовища, такі як температура, рН та інші повинні постійно контролюватися. Культура при вирощування має добре перемішуватись.

Конструктивні відмінності ферментерів визначаються в основному способами підвода енергії та аерації середовища:

  1.   ферментер з підведенням енергії до газової фази;
  2.   ферментер з підведенням енергії до рідкої фази;
  3.  ферментер з комбінованим підведенням енергії.

Ферментери з введенням енергії до газової фази

Самим простим і найбільш розповсюдженим є подача повітря в рідину через барботери або інші аеруючі пристрої (дифузори, форсунки та ін). Група ферментерів в які енергія вводиться аеруючим газом є найбільш поширеною і відомою. Апарати цієї групи здавна використовуються для отримання мікробної маси в асептичних та умовно асептичних типах біосинтезу. Технологічні переваги цих апаратів базуються на простоті конструкції, відсутності рухомих елементів і простоті керування, що обумовлює високу експлуатаційну надійність ферментерів цієї групи. Конструктивні особливості барботажних ферментерів визначаються типом аератора і об’ємом апарата. Серед барботажних ферментерів найбільш відомі апарати типу ВДА конструкції М.Ф.Осипова і М.І.Дерканосова, ще випускаються ферментери ВДА 2А-100 (розробка М.П.Гандзюка та інших) з новою системою аерації. Геометрична місткість серійних апаратів - 30 і 100 м3.

Ступінь подрібнення повітря при використанні барботерів визначається числом отворів і їх діаметром. При цьому застосовуються барботери різноманітної форми (кільцеві, променеві, і т.д.). Діаметр отворів складає 0,5 – 2мм. Число отворів визначається з розрахунку, щоб їх сумарна площа забезпечувала необхідну швидкість повітря при виході з них. Для одержання максимального ступеня диспергування повітря в деяких випадках допускається швидкість до 100м/с, однак при цьому спостерігається значна втрата напору, тому необхідно підвищити тиск повітря, що подається до 2 – 2,5 атм. Тому, щоб уникнути значних втрат напору, швидкість повітря повинна бути в межах 5 – 10м/с [22].

Але використання барботерів має суттєві недоліки. Як би мілко не розпилювалося повітря, при проходженні через рідину окремі маленькі на початку бульбашки збільшуються, внаслідок чого величина поверхні контакту фаз зменшується і може виявитися недостатньою. Єдиний спосіб посилення масообміну в цьому випадку – збільшення подачі повітря. Тому при аерації за допомогою барботерів завжди необхідна велика затрата повітря.

В процесі росту культури постійно виникає нерівномірність розподілення в середовищі поживних речовин і продуктів обміну, оскільки найближчі до поверхні культури шари середовища збіднюються першими й збагачуються останніми. Тому енергійне перемішування при вирощуванні продуцента є необхідною умовою нормального розвитку мікроорганізму і максимально можливого накопичення ферментного препарату.

Перемішування середовища за допомогою барботеру є недостатнім, особливо для ферментерів об’ємом 4 – 5м3 і більше. Тому аерування і перемішування середовища тільки за допомогою барботеру допустиме лише у випадках, коли вимоги до активності вирощуваної культури не є високими, наприклад в посівних апаратах.

В процесі проектування відділення біосинтезу треба прийняти до уваги, що більшість ферментерів системи ВДА має циліндричну форму, має сорочку для терморегуляції культуральної рідини. Сорочка секційна і складається з 10 поясів. Аераційна система представлена трубою та коробами, що прокладені на дні ферментера. Для миття коробів змонтовано сопло.

Пластинчата аераційна система апаратів ВДА складається з розподільного колектора та короба, який зверху закритий перфорованими пластинами з отворами діаметром 0,5 мм. В деяких апаратах змонтовані трубчасті системи аерації, що складаються з перфорованих трубок.

Рис 2.1. Схеми ферментерів з підводом енергії газовою фазою

Ферментери з підведенням рідинної фази

Рис. 2.2  Ферментери з підводом енергії рідкою фазою: 

аодновальний ферментер із самозасмоктуючою мішалкою: 1 —  корпус, 2 — самозасмоктуюча мішалка, 3 — циркуляційний контур-теплообмінник;

бферментер із самозасмоктуючими мішалками багатовальний: 1 — корпус, 2 — самозасмоктуюча мішалка,  3  — теплообмінник;

вферментер   із самозасмоктуючими мішалками багатовальний з зовнішнім циркуляційним контуром: 1 — корпус, 2 — самозасмоктуюча мішалка, 3 — теплообмінник, 4 — насос, 5, 6 — дифузор;

г — ферментер ежекційний: 1 — корпус, 2 — насос, 3 — ежектор, 4 — дифузор-теплообмінник, 5 — повітрезабірник;

д — ферментер  струменевий з  затопленим  струменем: 1 —  ежектор, 2 — теплообмінник, 3 — корпус, 4 — насос, 5 — розсікач, 6 — труба  с насадкой;

е  — ферментер струменевий  з падаючим струменем: 1 —  теплообмінник, 2 — насос, 3 — корпус, 4 — ежектор.

Ферментери з введенням енергії рідкою і газовою фазами

Група апаратів з перемішуючими пристроями, в які енергія вводиться одночасно як рідкою фазою за допомогою перемішуючого пристрою, так і газовою фазою при її примусовій подачі в ферментер. Ферментери з комбінованим введенням енергії найбільш поширені на стадії біосинтезу аеробних біологічних агентів. Переваги цих апаратів в їх мобільності тому, що в них може бути створений будь який оптимальний для біологічного агента гідродинамічний режим за рахунок зміни швидкості обертання мішалки швидкості циркуляції рідини, яку перекачує насос або зміни швидкості руху газової фази. Основним конструктивним елементом ферментерів є механічний перемішуючий пристрій – мішалка, яка забезпечує високу інтенсивність транспорту кисню та високий рівень диспергації газової фази нерозчинних субстратів та забезпечує гомогенність взаємодіючих фаз. До цієї групи апаратів відносяться ферментери в рідку фазу, яких енергія вводиться одночасно перемішуючим пристроєм і насосом або тільки насосом. В свою чергу енергія газової фази доставляється звичайним чином – через аеруючі пристрої відомих конструкцій [10].

Основні конструктивні відмінності в цій групі ферментерів базуються на різній кількості мішалок, які розташовані в одній місткості, різній кількості мішалок на одному валу, різній конструкції газорозподільного пристрою та використанні специфічних циркуляційних контурів.

Ферментери цієї групи переважають в асептичних виробництвах завдяки можливості надійної герметизації внутрішнього об’єму апарата. Ферментери використовують як для отримання посівного матеріалу, так і для проведення виробничого біосинтезу.

Таблиця 1

Технічна характеристика промислових ферментерів з комбінованим введенням енергії

Об’єм, м3

40

50 (м. Суми)

63

Коефіцієнт заповнення, %

60-65

62

Висота корпусу, м

6,2

7,772

6,470

Внутрішній діаметр апарата, м

3,0

3,0

3,2

Тип мішалки (мішалок)

відкрита турбіна

відкрита турбіна

відкрита турбіна

Кількість ярусів мішалок

2

3

3

Число обертів мішалки, с-1

3

3

3,27

Потужність електродвигуна, кВт

14

75

90

Поверхня охолодження м 2:

Сорочка

28,2

-  

50

Теплообмінник

-

4 змійовика (30)  

4 спір. ( 40)

Тип барботера

кільцевий з 12 променями

кільцевий з 12 променями

Витрати повітря м3/год

432

Маса, кг

5702

Рис.2.3 Ферментер  з турбінною мішалкою та барботером, розроблений КБ ВНИИФСа (об`єм 40 м3):  1 — корпус; 2 — сальник; 3 — тяги; 4 — вал с мішалками; 5 — барботер; 6—підп`ятник; 7 — стійка; 8 — лаз-павук діаметром 400 мм; 9 и 10 — муфти; 11 — стійка; 12 — електродвигун; 13 — смотрове скло; 14 — гільза для термометра; 15—проміжний вал; 16 — редуктор; 17, 18 и 19 — штуцери для виходу води, для гільзи термометру та для наповнення; 20, 21 и 22 — штуцера для завантаження посівного середовища, для барботера та подачі води; 23, 24 и 25 — штуцера для манометра, відбору проби та виходу повітря.

Ферментер для культивування Bmmoniagenes

В промисловості для культивування Bmmoniagenes використовують ферментери VEB Chemieanlagenbau Erfurt-Rudisleben місткістю 20 м3. Культивування  передбачається здійснювати глибинним способом в ферментерах з комбінованим введенням енергії.

В представленій роботі передбачено використання ферментеру з механічним перемішуванням, який обладнаний багатоярусними мішалками. Введення газової фази здійснюється через барботери різних конструкцій.

Характерною рисою цього ферментера є те, що він має нижній привід

мішалки, потужність електродвигуна-120/180 кВт, швидкість обертання валу мішалки 1 та 2 с-1.

Ферментери з комбінованим введенням енергії місткістю більше 20 м3 мають ряд загальних конструктивних ознак:

  •  вони обладнані багатоярусними мішалками;
  •  введення газової фази здійснюється через барботери різних конструкцій;
  •  промислове використання орієнтоване на проведення асептичного біосинтезу;
  •  використання приводу мотор-редуктор дозволяє змінювати в широкому діапазоні рівень зрізових зусиль.
  •  при необхідності в типовому корпусі можлива установка додаткових пристроїв – дифузори, центральні або периферійні аератори, різні конструкції піногасників ( вмонтовані, виносні ), секційонування за допомогою тарілок різних конструкцій.
  •  додаткова турбулізація поживного середовища забезпечується за допомогою відбиваючих перегородок;
  •  для створення циркуляційних контурів поживного середовища використовують вбудовані в ферментер спіральні теплообмінники або дифузори.

Підтримання температури, t=37ºC, яка є оптимальною для гарного росту біомаси і прояву їм підвищеної фізіолого-біохімічної активності, забезпечується сорочкою ферментера або системою змійовиків. Змійовики використовуються також для подачі пари в процесі стерилізації або води для охолодження [10].

 Ферментер забезпечений пристосуваннями для перенесення інокуляту,  
внесення додаткових поживних речовин, необхідних для покращення розвитку продуцента та пристроєм для взяття проб.

Для забезпечення стерильності процесу ферментації в обраному ферментері передбачено використання торцевих ущільнень валу перемішуючого пристрою з паровим захистом. За допомогою застосування такої конструкції вдається практично повністю запобігти потраплянню атмосферного повітря в апарат, що є дуже важливим для збереження асептичних умов культивування [22].

4.5. Обгрунтування вибору стадій після ферментаційного виділення та концентрування продукту мікробного синтезу

Вихідним матеріалом для відділення продуктів мікробіологічного біосинтезу є культуральна рідина. Незалежно від локалізації продукту (позаклітинний чи внутрішньоклітинний метаболіт) першою стадією підготовки культуральної рідини є відділення біомаси.

Для відділення біомаси на сьогоднішній день застосовують такі методи:

  1.  фільтрація
  2.  флотація
  3.  центрифугування
  4.   сепарація

Фільтрування – відділення твердої фази від рідкої шляхом проходження через фільтруючий матеріал або через полімерну сітку з відповідним діаметром отворів [10].

Принципова схема роботи фільтру проста: суспензія потрапляє на фільтруючу перегородку, при цьому рідка фаза проходить фільтруючий матеріал, а тверда фаза затримується на фільтруючому матеріалі у вигляді шару осаду.

Недоліки процесу фільтрування заключаються в великих втратах біомаси за рахунок проходження частини клітин через пори фільтруючого матеріалу, через що пори засмічуються та потребують заміни чи регенерації [10].

Флотація – виділення з рідких твердих часток або часток іншої рідини за допомогою продування крізь неї газу. Флотація заснована на прилипанні часток, які треба виділити до пухирців газу.  Флотація поділяється на :

  •  механічну – у рідину занурюється пристрій, який дозволяє всмоктувати повітря з атмосфери за рахунок обертового руху рідини;
  •  пневматичну – продування повітря крізь дрібнопористі тканини;
  •  вакуумну – пухирці повітря утворюються з розчинених у воді газів при створенні розрідження;
  •  ежекційну – рідинна надходить до камери ежектора з великою швидкістю, до камери також надходить повітря і відбувається розподіл часточок газу у повітрі;
  •  електролітичну – в камері флотатора розташовуються 2 електроди, в результаті електролізу води утворюються газова фаза і відбувається процес флотації [10].

Недоліком флотації являються великі втрати біомаси.

Центрифугування – процес зневоднення і розділення суспензій на рідку і тверду фази під дією відцентрових сил. Машини для здійснення таких операцій називаються центрифугами, які підрозділяються на фільтруючі, осаджувальні і комбіновані (осаджувально-фільтруючі) [10].

Метод центрифугування заснований на дії відцентрової сили на неоднорідної системи, що складається з двох та більше фаз.

В промислових установках розділення під дією відцентрових сил застосовують для розділення часточок розміром від 0,5мкм до 25 мм. При розділенні суспензі у фільтруючих центрифугах в роторі під дією відцентрових сил відбувається фільтрація рідини через фільтрувальну тканин або через металеву сітку з одночасним затриманням твердої фази; рідка фаза проходить через сито і потім через отвори в роторі викидається в кожух центрифуги, а осад відвантажується або під час обертання ротору, або після його зупинки [10].

Недоліки процесу центрифугування полягають в:

  •  меншій ефективності у порівнянні з сепаруванням.

Сепарація – процес відділення твердої фази від рідкої,  оснований на відділенні часточок з різними характеристиками. Рушійною силу процесу являється відцентрова сила [10].

Ефективність сепарування пропорційна частоті обертів барабану, діаметру с барабану, розміру часток, різниці густин твердої та рідкої фаз.

По технологічному призначенню сепаратори поділяються на такі типи:

  •  фільтруючі для розділення двох взаємно нерозчинних розчинів з одночасним виділенням твердої фази;
  •  осаджувальні для відділення твердої фази від рідкої;
  •  фільтруючо-саджувальні можуть налаштовуватися як фільтруючі або як очисні в залежності від положення ротору;
  •  згущюючі для підвищення концентрації зважених чи колоїдних компонентів суспензії з одночасним розділенням у випадку емульсії;
  •  розподільчі для розподілення зважених компонентів суспензії по розміру або густині часток [10].

Переваги:

  •  менші втрати біомаси порівняно з фільтруванням та флотацією;
  •  можливість автоматизувати процес;
  •  більша ефективність порівняно з центрифугуванням.

Після фільтрування проходить концентрування культуральної рідини.

Обгрунтування вибору способу концентрування

Для концентрування на сьогоднішній день застосовуються такі методи:

  •  ультрафільтрація
  •  іонообмінна сорбція
  •  випарювання
  •  осадження

  Ультрафільтрація - процес концентрації розчинів високомолекулярних з’єднань (наприклад, ферментів) з одночасним очищенням їх від низькомолекулярних домішок шляхом пропускання розчину через мембрану з порами розміром від 0,01 до 0,1 мкм. На відміну від мікрофільтрації або звичайної фільтрації при ультрафільтрації затримуються окремі молекули розчиненої високомолекулярної речовини, при ультрафільтрації відбувається не розділення фаз, а перерозподіл розчинених в рідкій фазі речовин. Тим часом проблема забивання пір фільтруючого матеріалу, характерна для звичайної фільтрації, має не менше, а можливо, і більше значення.

Важливою характеристикою будь-якої мембрани ультрафильтраційної є її селективність, що визначає ступінь затримання розчиненої речовини.

Селективність мембрани залежить від розмірів і форми молекул розчиненої речовини. Слід мати на увазі, що практично у всіх випадках існують молекули, що затримуються мембраною лише частково.

Для процесу ультрафільтрації характерне явище концентраційної поляризації — підвищення концентрації розчиненої речовини поблизу поверхні мембрани. Воно пов’язане з тим, що через мембрану проходять в основному молекули розчинника. Внаслідок цього знижується швидкість фільтрації. Для зменшення концентраційної поляризації застосовують хімічні інгібітори, що перешкоджають утворенню поляризаційного шару, або установки фільтрації спеціальної конструкції, де забезпечується турбулізація потоку або підвищення його швидкості при пропусканні через вузькі канали.

Для ультрафільтрації, як правило, використовують пористі полімерні мембрани на основі полиуретанов, складних ефірів целюлози, поливинилового спирту і ін. Такі мембрани отримують шляхом опромінювання зарядженими частинками полімерної плівки з подальшим її травленням. Для забезпечення механічної міцності в умовах гідравлічного тиску основну тонку мембрану прикріплюють до грубішої підкладки товщиною 125—250 мкм.

 На стадії ультрафільтрації при очищенні НАД випробувані мембрани: УПМ – 10, УПМ – 15, УПМ – 20. Встановлено, що найкращими показниками володіє мембрана УПМ – 10, яка має максимально інтегральну селективність по всіх домішках [19].

Характеристика мембран

Таблиця 2.2

Мембрани

Виробник

Матеріал

Робочий тиск, МПа

Селективність по 0,2% MgSO4, 0,5%

Відсічення по молекулярній масі, 97%

Продуктивність по чистій воді, л/м2

Діапазон робочих рН

УПМ-10

Владипор

Полісульфонамід

0,1

__

64500

15

2-12

УПМ-15

Владипор

Полісульфонамід

0,1

__

64500

60

2-12

УПМ-20

Владипор

Фторопласт

1,6

__

64500

250

2-8

Ультрафільтрація має ряд переваг:

  •  виключається денатурація білка, оскільки процес проходить без фазових перетворень при будь - якій температурі, коли суміш перебуває у рідкому стані і розчинена речовина не піддається дії робочого тиску;
  •  можливе одночасне концентрування й очищення від мінеральних і низькомолекулярних органічних речовин;
  •  незначні витрати енергії;
  •  ультрафільтраційні установки характеризуються простотою конструкції та експлуатації.

Існують такі види випарних установок за допомогою яких можна концентрувати НАД:  випарні апарати з вертикальними трубками, апарати з примусовою циркуляцією, плівкові випарні апарати [10].

Іонообмінна хроматографія

Хроматографія БАР за допомогою іонообмінних сорбентів, названа іонообмінною— це один із методів розділення, які мають найбільш тривалу історію розвитку. Тепер промислова іонообмінна хроматографія стала однією з найважливіших .технологічних стадій одержання комерційне прийнятних кількостей БАР.

В основі іонообмінної хроматографії лежить реакція обміну між нерухомим твердим іонообмінним сорбентом і розчиненою у розчиннику речовиною.

Іонообмінні матеріали

Іонообмінні сорбенти — це нерозчинні у воді речовини, синтетичні або природні, які містять у своїй структурі іоногенні групи кислого (катіоніти) або основного (аніоніти) характеру. Іони водню (при наявності катіонітів) або іони гідроксилу (при наявності аніонітів), що входять до складу іоногенних груп, можуть обмінюватися з катіонами або аніонами що знаходяться в розчині і утворювати сольові форми іонітів.

Вибір іонообмінника

В першу чергу слід вирішити, який іонообмінник потрібний для вирішення даного завдання — аніоніт або катіоніт. Якщо речовини, які повинні зв'язуватися на колонці, мають один заряд (або плюс, або мінус), вибір не складний. Проте багато речовин (наприклад, білки) несуть як негативний, так і позитивний заряд одночасно, і вибір того чи іншого іонообмінника для конкретного хроматографування визначається насамперед його загальною і реальною ємністю, а також пористістю та ситовим розміром часток. Для розділення низькомолекулярних сполук використовуються іоніти з невеликими розмірами пір (з високим ступенем зшивання), а для розділення макромолекул (білки, полінуклеотиди) — сорбенти з великими розмірами пір. Проте більшість іонообмінників, за винятком сефадексу, не виявляють помітну залежність між пористістю і молекулярною масою речовин, що підлягають розділенню. Особливо це стосується сорбентів на основі стиролу та дивінілбензолу.

Принциповою основою іонообмінної хроматографії є те, що спорідненість речовини до іонообмінника залежить від електричних властивостей його самого і відносної спорідненості інших заряджених речовин, що знаходяться в розчиннику. Отже, зв'язана речовина може бути елюювана за допомогою зміни рН до значення, що змінює заряд речовини, або додаванням конкуруючої речовини, одним з прикладів якого можуть служити солі. Оскільки різні речовини володіють різними електричними властивостями, умови виділення мінятимуться для кожного виду зв'язаних молекул. Загалом, для отримання хорошого розділення слід вибрати або безперервне елюювання в градієнті іонної сили, або ступінчасте (рН не використовують унаслідок трудності створення його без одночасного збільшення іонної сили). При хроматографії на аніонітах постійно підвищують або рН і іонну силу, або тільки іонну силу елюанта. Хроматографію ж на катіонітах проводять як в градієнті рН, так і в градієнті іонної сили буферу.

Аніоніт АВ-17-8

Аніоніт АВ-17-8 - іонообмінна смола сильноосновна із структурою гелю. Аніоніт містить функціональні групи основного характеру. Виготовлений на основі сополімера стиролу і дивінілбензолом.

Основні властивості аніоніта АВ-17-8:  

- володіє стійкістю до кислот і лугів;  

- володіє високою механічною міцністю;

- обмінна ємкість катіоніту не залежить від рН робочого середовища;

- нерозчинний у воді і органічних розчинниках.

Фільтрат наносили на колонку АВ17×8 в аніонній формі, елюювали НАД 0,05н. НСlО4, елюати нейтралізували 30% розчином КОН, упарювали на роторному випарнику, відділяли осадок КСlO4.

Випарювання – процес концентрування рідин, що заключається у видаленні рідкої фази шляхом шляхом випаровування при кипінні.

Випарні установки поділяються:

  •  по типу теплоносія — на апарати з паровим, газовим, з підігрівом високотемпературним теплоносієм під високим тиском та з електронагріванням;
  •  по тиску всередині апарату — на працюючі під вакуумом та під надлишковим тиском;
  •  по режиму роботи — на періодичні та безперервні [10];
  •  по характеру циркуляції — на апарати з однократною циркуляцією, та багатократною;
  •  по способу подачі теплоносія — на апарати з подачею теплоносія в середину трубок та з подачею в між трубний простір;
  •  по виду теплоносія — на апарати з паровими сорочками, вертикальними внутрішніми нагрівальними трубами, змійовиками та з безпосереднім змішуванням граючої пари з рідиною.

Недоліком даного процесу являється можлива інактивація клітин [10].

Випарні апарати з вертикальними трубками.

Апарат складається із корпусу, конічного дна з рубашкою і пара сепараторної головки. Всередині корпусу розміщені дві решітки з трьома вертикальними тонкостінними трубками. Нижче верхньої решітки підводиться пара, яка обігріває між трубний простір і у вигляді конденсату відкачується вакуум – насосом. Загальна площа випарювання 2,2 м2. Над верхньою решіткою розміщена сепараторна головка, яка складається з стакана, відбійника і зливної труби. Ферментна витяжка підлягає випарюванню, підводиться через сепараторну головку за допомогою передбаченого в ній циліндричного кільця.

Штуцер для відводу неконденсованих парів із камери калоризатора приварений до верхньої його частини. Конденсат відводиться знизу. До нижньої конусної частини камери підведена холодна вода.

Водна витяжка в кількості 50-60 л/год поступає в апарат між корпусом і стаканом у вигляді тонкої плівки розтікається впродовж всієї поверхності трубок. Пар, відділяється за допомогою відбійників сепараторної голівки від крапель рідини, надходить в холодильник з водним охолодженням, конденсується і збирається в приймачі, а краплини вологи по зливній трубі повертається в апарат. Упарений конденсат (сироп) надходить в приймач.

Промислові досліди показали, що при подачі на випарювання 50 – 60 л витяжки в годину з вмістом сухих речовин 10 – 12% витяжка концентрується в 5 разів.

 Недоліки. Втрата ферментної активності в процесі випарювання при вакуумі 96,3 – 97 кн/м2 і температура випарювання 27 - 32ºС складає до 12%. Для зменшення витрат необхідно вести процес при більш глибокому вакуумі і зменшити тривалість контакту витяжки з теплоагентом.

Вакуум – випарні апарати з примусовою циркуляцією

Складається з підігрівача, циркуляційного насосу, теплообмінників з водним охолодженням, двох приймачів, мокроповітряного і сухоповітряного вакуум-насосів. Підігрівач забезпечений паровою рубашкою апарату, апарат циліндричної форми з кришкою і конічним дном. В середині розміщена система вертикальних двійних трубок (труба в трубі), причому верхній кінець трубок закритий, а нижній відкритий, у внутрішніх трубках  обидва кінці відкриті.

Витяжка підігрівається вакуумним водяним паром,  що поступає в парову рубашку. Водяний пар подається в нижній відкритий  кінець внутрішніх трубок, піднімається по них вверх і рухається по простору між внутрішніми і зовнішніми трубками. Таким чином, при малому діаметрі підігрівача невеликим числом трубок можна отримувати поверхність підігріву і  велику продуктивність. Пар, видалений із обігріваючої системи відкачується плунжерним мокроповітряним вакуумним насосом. Одночасно в насос для конденсації парів подається холодна вода, яка разом з водним конденсатом використовується на інші потреби чи відводиться в каналізацію [9].

Для концентрації і очистки НАД найкраще використовувати випарні установки плівкового типу.

Плівкові випарні апарати

У всьому світі і зокрема в Україні останнім часом широкого використання набули біологічно активні речовини (БАР), як ліки і засоби для підтримання здоров'я. Виробництво БАР здійснюється біотехнологічною промисловістю.

Біотехнологія - галузь народного господарства, націлена на виготовлення ліків, антибіотиків, ферментів, вітамінів і інших біологічно активних речовин. Ці виробництва досить складні і тривалі, і тому вимагають створення оптимальних технологічних схем, оснащених високоефективним обладнанням.

Одна із заключних стадій виробництва біотехнологічної продукції - це концентрування культуральних рідин, що містять розчини БАР. Для цього їх, зазвичай, концентрують (упарюють) у випарних апаратах.

Більшість продуктів біотехнологічного синтезу в процесі тривалої обробки втрачають свої цінні властивості. Тому випарні апарати мають  забезпечувати мінімальний час перебування термолабільних розчинів у зоні нагрівання або кипіння. Забезпечити мінімальний час обробки можна у плівкових випарних апаратах.

Актуальним є проектування таких плівкових випарних апаратів, в яких використовуються температури, що не викликають інактивацію БАР і в яких досить велика швидкість обробки продукції [10].

Для належної роботи плівкового випарного апарата дуже важливо створити рівномірно розподілений по периметру рідкий шар, бо при розривах плівки різко знижується інтенсивність тепло-масообміну. Найбільш ефективними є апарати з рівномірним розподіленням рідини по перерізу [3]. Забезпечення постійної товщини плівки по всій поверхні нагріву і умов нерозривності потоку є головними завданнями створення надійних пристроїв для розподілу рідини.

Ці питання потребують теоретичних і експериментальних досліджень, а питання застосування плівкових апаратів в кожному конкретному випадку повинні аналізуватися на основі подібних виробництв і лабораторних випробувань.

Основні задачі, для вирішення яких створена установка (рис. 1):

1. Дослідження процесу концентрування біологічно активних речовин .

2. Перевірка адекватності математичної моделі процесу концентрування БАР.

3. Встановлення залежності активності розчину від часу перебування плівки розчину в апараті.

4. Дослідження ліній току (ліній постійних швидкостей).

Після проведення процесу на установці, необхідно встановити концентрацію упареного розчину та його активність. Для визначення концентрації упареного розчину буде використовуватись пікнометричний метод, а для визначення активності – титрування.

 Рис. 2.4 - Схема установки для дослідження процесу концентрування НАД упарюванням

Аналізуючи літературні матеріали [3], слід відзначити, що застосування у біотехнологічних схемах випарної апаратури з плівковою течією рідини має дати позитивний економічний ефект для виготовлення БАР.

Переваги: У багатьох випадках замість вакуум-насосів використовують інжектор, що дозволяє значно знизити витрати електричної енергії.

Ще однією перевагою роторного апарату є те, що ферментна активність не втрачається в процесі випарювання, як це відбувається у вакуум-випарних апаратах з вертикальними трубками.

Обгрунтування вибору способу приготування кінцевої форми продукту.

Кінцевою формою препарату «НАД» є ліофільно висушений порошок, оскільки при ліофілізації не інактивуються клітини та більшим є термін зберігання препарату.

Для отримання сухого концентрату можуть застосовуватися наступні операції:

  •  сушіння
  •  ліофілізація

Сушіння – процес видалення вологи шляхом її випаровування. У цьому процесі  волога переходить із твердої фази  в газову чи парову і для її  випару  до матеріалу необхідно безупинно підводити тепло [10].

     Розрізняють  три  принципово різних  способи  передачі  тепла: теплопровідністю,  тобто  переходом тепла усередині  матеріалу  від однієї  молекули  до  іншої,  що  знаходиться  з  нею  в  контакті; конвекцією, тобто переносом тепла від однієї точки до іншої разом з масою   речовини   теплоносія;  тепловим   випромінюванням,   тобто передачею  тепла випромінюванням, радіацією. У реальних умовах  має місце передача тепла комбінованим шляхом, але в залежності від типу сушарки  переважає  який-небудь один  спосіб.  Для  сушіння  різних матеріалів  застосовується  різне устаткування,  тому  класифікація сушарок досить багатозначна. Їх можна підрозділити:

  •  за способами передачі  на контактні (барабанні), конвективні,           радіаційні і комбіновані; за видами на повітряні, газові і парові;
  •  за способом руху теплоносія і матеріалу — на прямоточні, протиточні і перехресні;
  •  за величиною тиску теплоносія в сушильні на атмосферні, вакуумні і високого тиску;
  •  за режимом на сушарки безперервної і періодичної дії.

Недоліком даної операції являється контакт висушуваної речовини з високою температурою та як наслідок інактивація клітин мікроорганізму, що входить у продукт [10].

Ліофілізація - спосіб м'якого висушування речовин, при якому висушуваний препарат заморожується, а потім вміщюється у вакуумну камеру, де і відбувається сублімація розчинника [10]

Метод ліофілізації дозволяє отримувати сухі тканини, препарати, продукти тощо без втрати їх структурної цілісності та біологічної активності. При ліофілізації більшість білків не піддається денатурації і може довго зберігатися при помірному охолодженні (близько 0 ° C). Ліофілізовані тканини і препарати при зволоженні відновлюють свої первинні властивості.

Процес ліофільного сушіння проводять в глибокому вакуумі. Матеріал на початкових стадіях сушки віддає частину вологи, охолоджується і самозаморожується. Потім у сушарку подається тепло і лід сублімує. Процес висушування ферментних осадів в сублімаційній сушарці проходить в три стадії: заморожування, осадка, сублімація льоду і видалення остаточної вологи. Тривалість висушування залежить від температури, товщини шару замороженого матеріалу, розрідження в камері, температури теплоносія і фізико-хімічних властивостей матеріалу, що висушується. Тривалість висушування в середньому складає 6-7 год і, як і після висушування в вакуум-сушильній шафі, препарат потрібно подрібнювати.

Ліофілізацію застосовують при необхідності тривалого зберігання і консервування різних продуктів біологічного походження, для одержання сухої плазми донорської крові, сухих сироваток і вакцин, при трансплантації органів і тканин, у фармацевтичній і харчовій промисловості. У системах життєзабезпечення космічного корабля ліофілізація застосовується як один з перспективних способів регенерації води з вологозберігаючих матеріалів.

Переваги ліофілізації

  •  висушену продукт можна зберігати досить тривалий термін;
  •  відсутність впливу високих температур.

 

Рис.2.5 Сублімаційна установка

Розділ 5 Характеристика біологічного агенту

5.1. Морфолого – культуральні ознаки

На основі біохімічних і хімічних критеріїв, пропонується, щоб Brevibacterium ammoniagenes була віднесена в рід Corinebacterium, тип штаму якого АТСС 6871(NCIB 8143)

Розміщення виду ammoniagenes в рід Brevibacterium, є спірним в наш час.

До недавного часу рід Brevibacterium була погано описана і входила до гетерогенної групи грам позитивних, неспороносних паличкоподібних бактерій. Рід  Brevibacterium недавно були переглянуті і виявилося, що вони є строгими аеробами і факультативними анаеробами.

                        

Рис.2.7. Морфолого – культуральні ознаки Brevibacterium ammoniagenes

Так як Brevibacterium ammoniagenes відноситься до Corinebacterium, то до складу клітинної стінки входять міколові кислоти. Ці високомолекулярні β – оксикислоти з довгим аліфатичним ланцюгом біля С2 – атома служать важливим хемотаксономічним маркером для класифікації та ідентифікації бактерій. В складі клітинної стінки не міститься мезо-діамінопімелінової.

Характеризуються значно складнішою будовою клітинної поверхні, ніж інші грампозитивні бактерії. Зовнішній шар клітинної стінки формує білкові молекули. Наступний шар містить в основному полісахариди (глікани й арабіноманани), а також гліколіпіди та ліпіди.

 Мікроорганізми цієї групи гетерогенні за морфологічними особливостями та каталазною активністю, не мають ендоспор, деякі з них здатні рухатися. Для їх клітин характерне розташування у вигляді «V»-форми. Деякі види бактерій у життєвому циклі проходять фази перетворення паличок у кокоподібні форми з переважанням паличок у молодих культурах, а кокоподібних форм у старіючих культурах. Деякі представники даних бактерій дуже повільно ростуть на середовищах без ліпідів, при цьому на середовищах з 0,5-1,0 % Твін-80 (ефір олеїнової кислоти) ростуть добре і в 1-2 денних культурах формують колонії діаметром близько 1 мм. Такі штами називають «ліпофільними».

Brevibacterium поширені в об’єктах довкілля (вода, грунт, рослини) та серед тварин і людей. Наявність факторів патогенності – нейрамінідази, гіалуронідази, сфінгомієлінази, здатності до адгезії та інше, обумовлюють патологічні процеси у людей. Більшість фахівців вважають, що види Brevibacterium, які патогенні для тварин, можуть стати причиною нового зооантропонозу чи опортуністичної інфекції у людини.

5.2. Фізіолого – біохімічні ознаки

Хемоорганотрофи, що володіють і дихальним, і бродильним типом метаболізму з утворенням кислоти з глюкози і різних інших вуглеводів в аеробних і в анаеробних умовах.  Каталазопозитивні  відновлюють нітрати до нітриту. При рості на агаризованому середовищі з пептоном і дріжджовим екстрактом утворюють опуклі жовті колонії

Росте при 24 – 42°С, але оптимальною для росту є температура 31°С, тобто є мезофільним мікроорганізмом. Відхилення від оптимальної температури росту небажані. Підвищення на 5 – 7°С приводить до швидкого автолізу культури, якщо культура використовується як продуцент при виробництві певного мікробіологічного продукту. Зниження температури на 4 – 6°С також не вигідно, так як культивування затягується на 12 – 20 год.

 Іони Н+ та ОН- є найважливішим з усіх іонів і найменші зміни дуже діють на мікроорганізми. Тому підтримання рН має велике значення для росту мікроорганізму. Brevibacterium ammoniagenes найкраще росте за нейтрального рН або в середовищах, значення рН яких близькі до нейтрального (6,8 – 7,2), такі мікроорганізми називаються нейтрофілами.

5.3.Таксономічний статус Brevibacterium ammoniagenes

Таксономічне положення багатьох видів бактерій переглядається по мірі накопичення нових знань. Досі залишається не визначеним таксономічне положення деяких потенційно патогенних видів.  Наприклад, до них відносяться «CDC-ферментуючи корінеформні бактерії», які виділяють із різних біотопів людини.

Фенотипові властивості недифтерійних корінебактерій  при їх ідентифікації

  Так як Brevibacterium ammoniagenes входить до роду  Corynebacterium,  то цей рід включає 75 видів, причому деякі з них мають невизначене таксономічне положення У більшості видів проявляються варіабельні біохімічні реакції. Наприклад, до них відносяться «CDC-ферментуючи коринеформні бактерії», які виділяють із різних біотопів людини.

Згідно з ІХ виданням Керівництва Бергі з систематики бактерій (фенотипові систематика) Brevibacterium ammoniagenes

 відносять до:

 відділ Firmicutes

 клас – Thallobacteria

 рід –Brevibacterium

 вид – B. аmmoniagenes

Згідно з Х виданням Керівництва Бергі з систематики бактерій [15].

відділ – Actinobacteria

    клас -  Actinobacteria

підклас – Actinobacteridae

порядок – Actinomycetales

під порядок – Micrococcineae

родина – Brevibacteriaceae

рідBrevibacterium

 Згідно філогенетичній класифікації за книгою «Procariotes» (1986 р.) Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 відноситься до першої, з одинадцяти основних, групи, яка складається з двох підгруп: клостридії (з низьким вмістом ГЦ в ДНК) та актиноміцети (з високим вмістом ГЦ в ДНК). Brevibacterium sp. входить в групу «Actinomycetes» до якої увійшли: Actinomyces, Bifidobacterium, Propionobacterium, Artrobacter, Micrococcus, Aureobacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Nocardioides, Corynebacterium, Microbacterium, Nocardia та деякі інші  [15].

5.4.  Шлях біосинтезу НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду) з глюкози

        Біосинтез НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду) здійснюється через гліколіз. Піруват утворюється у процесі катаболізму глюкози з фосфоенолпірувату. Глюкозо-6-фосфат залучається у пентозофосфатний цикл з якого утворюється еритрозо-4-фосфат, який разом з фосфоенолпіруватом через хоризмат синтезують триптофан, з якого одержують нікотинову кислоту, яка далі під дією ферменту НАД-синтази перетворюється на НАД (нікотинамідаденіндинуклеотид) [24].

РОЗДІЛ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу НАД

Найменування

Категорія та номер НТД

Показники НТД, обов'язкові для перевірки

Особливі властивості

1

2

3

4

6.1. Характеристика сировини, матеріалів та напівпродуктів

Діючі речовини

Глюкоза

ч.д.а., х.ч.,

Фарм.

ГОСТ 975-88

Опис, розчинність, кількісне визначення, втрата в масі при висушуванні

Для приготування середовища

Кукурудзяний згущений екстракт

ТУ 10-04-08-14-88

Опис, розчинність, прозорість, кольоровість, відносна густина

Використовують як ростовий фактор

Біотин

ГОСТ 18300—72)

Опис, розчинність, кількісне визначення,

Для приготування середовища

Сечовина

ГОСТ 29207-91

Опис, прозорість, кольоровість

Для корегування рН виробничої культури

КН2РО4

ГОСТ 4198-75

Опис,прозорість, кольоровість

Для приготування середовища

Допоміжна сировина

Спирт етиловий ректифікований 96%

ДФУ доп.1,ст. 339

Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість, кислотність або лужність, домішки

Для обробки обладнання та устаткування

Хлорамін

ГОСТ 177-88Е

Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість

Для потреб робочого персоналу

Каустична сода

ГОСТ 2263-79

Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість

для миття технологічного обладнання, приміщень, інвентарю

6.2. Технологічна схема виробництва

       Технологічна схема процесу отримання нікотинамідаденіндинуклеотиду представлена у вигляді креслення формату А1 на трьох листах. Дана схема подана у вигляді блоків, що відповідають певним стадіям отримання цільового продукту: санітарна підготовка виробництва, підготовка стерильного стисненого повітря, підготовка та стерилізація поживного середовища, підготовка посівного матеріалу, виробничий біосинтез,виділення цільового продукту, концентрування культуральної рідини, отримання готового продукту,  розфасовка та упаковка.

6.3 Опис технологічного процесу

Стадія ДР 1 Санітарна підготовка виробництва

ДР 1.1  Підготовка персоналу

При влаштуванні на роботу та щорічно персонал, який безпосередньо зайнятий у виробництві мікробіологічних препаратів, повинен пройти медичний огляд, пройти систематичне навчання щодо санітарно-гігієнічних вимог, а також дотримуватися правил особистої гігієни.

Кожен працівник виробничого цеху повинен бути забезпечений 4 комплектами санітарного одягу, заміна одягу проводиться щоденно і у міру забруднення. Працівники перед початком роботи  повинні одягти чистий санітарний одяг, підібрати волосся під хустинку або ковпак, зняти з себе прикраси, змити лак з нігтів, ретельно вимити руки теплою водою з милом і продезінфікувати їх.

Кожен працівник на підприємстві несе відповідальність за виконання правил особистої гігієни, за стан робочого місця, за виконання технологічних і санітарних вимог на своїй ділянці.

ДР.1.1.1. Навчання персоналу

Персонал, який працює на біотехнологічному виробництві, проходить навчання для кваліфікованого виконання своїх обов'язків. Інструкція проводиться 1 раз на рік. Під час навчання детально обговорюється концепція забезпечення якості продукції, підготовка та проведення технологічного процесу.

ДР 1.2  Підготовка миючих та дезінфікуючих розчинів

Всі мийні, дезінфікуючі розчини і суміші готує блок стерилізації, або співробітник, призначений начальником цеху, ділянки, підрозділу за наказом.

В реактори  через вимірювач об’єму (дозатор), який встановлено на трубопроводі , надходить потрібна кількість дезинфекційного або миючого розчину (каустична сода, пероксид водню, дексоцид) та змішується з водою, яка дозується через датчик об’єму. Після 10хв перемішування отримуємо розчини для миття і дезинфекції обладнання та комунікацій .

ДР 1.2.1 Підготовка хлораміну, 1%

Для отримання 1 л розчину в емальоване відро наливають 990 мл водопровідної води і розчиняють в ній 10,0 г хлораміну Б, перемішують і накривають відро кришкою. Розчин готують в Зб-2 для одноразового використання.

ДР 1.2.2.  Підготовка розчину каустичної соди

Каустична сода (їдкий натр) – це безбарвна, дуже гігроскопічна речовина, легко захоплює вологу повітря добре розчинна у воді. Розчини володіють високою миючою та бактерицидною дією.

Для миття і дезінфекції використовують розчини каустичної соди 40% - ної концентрації. Розчини готують у дезустановках. Застосовуються переважно для механічного (циркуляційного) миття обладнання, виготовленого із нержавіючої сталі, в основному для теплообмінних препаратів.

Температура розчинів при обробці обладнання забезпечує повне очищення поверхні обладнання від залишків культуральної рідини, поживного середовища тощо.

Використовується для ручного миття технологічного обладнання, приміщень, інвентарю 0.5 % розчином з температурою 20°С, циркуляційного промивання комунікацій та обладнання 1-2 % розчином з температурою 50°-60°С. Готують у полімерних або нержавіючих ємкостях  (неприпустимо застосування ємкостей з алюмінію, тому що каустична сода викликає його корозію).

ДР 1.3 Підготовка приміщень

Виробничі приміщення повинні мати між собою технологічний зв’язок і розташовуватися за ходом технологічного процесу, не допускаючи перехрещення потоків сировини та готових виробів, чистого та використаного посуду, а також повинні бути створені відповідні умови для дотримання виробничої та особистої гігієни працюючим персоналом.

Для дотримання чистоти у виробничих приміщеннях встановлюють металеві або педальні бачки з кришками, а також корзини із полімерних матеріалів для збору санітарного браку та сміття. Бачки та корзини повинні щоденно очищатися, промиватися та дезінфікуватися дезінфікуючими засобами.

Забороняється зберігати у виробничих приміщеннях миючі, дезінфікуючі засоби, відходи, інвентар, які не мають безпосереднього відношення до виробничого процесу. Зберігання протирального інвентарю, миючих та дезінфікуючих засобів здійснюється в окремих приміщеннях. Інвентар (відра, щітки тощо) повинен бути маркірований і закріплений за виробничими, допоміжними і підсобними цехами.

ДР 1.3.1 Щоденне прибирання.

Щоденне прибирання приміщень проводять після кожної зміни вологим способом: із приміщень видаляють готову продукцію, напівпродукти, відходи виробництва, невикористані матеріали.  Вологе прибирання приміщень проводять миючим засобом, цим же розчином миють підлогу. Особливо дуже ретельно протирають дезрозчином ручки і нижні частини дверей. Обробку ведуть в гумових рукавичках, чоботах, фартусі. Зовнішні двері промивають по мірі необхідності, але не рідше 1 разу в тиждень. Вологе прибирання приміщень проводять за 1,5-2 години до початку роботи або за 30 хвилин до закінчення роботи.

Після закінчення вологого прибирання для знезараження повітря вмикають настінні або настельні бактерицидні лампи встановлені з розрахунку 2,5 Вт на 1м3 приміщення (за відсутності людей)  та за 30 хвилин до початку роботи – виключити їх. Кількість ламп розраховують, виходячи із загальної площі і об’єму приміщення. Про заміну і режим роботи ламп ведуть запис в журналі.

Матеріали: вода, миючий розчин.

ДР 1.3.2 Генеральне прибирання.

Генеральне прибирання приміщень проводять 1 раз на  5 днів (в день профілактики обладнання) або негайно на вимогу бактеріолога у випадку виявлення мікробної контамінації. Для обробки використовують 1 % розчин хлораміну. Якщо протягом місяця в приміщенні невиявлена спороутворюча мікрофлора та гриби, масову долю хлораміну  знижують до 0,5 %. Перед обробкою обезточують все обладнання та електроприлади. Стелю, стіни, двері, вікна, перегородки та обладнання оброблюють шляхом орошення із гідропульта.         Після закінчення орошення приміщення закривають на 30-40 хвилин, після чого залишки хлораміну видаляють шляхом протирання чистою безворсовою серветкою. Для знезараження  повітря після генерального прибирання вмикають бактерицидні лампи. Проводиться прибирання і наведення порядку в шафах, стелажах.

ДР 1.4 Підготовка обладнання та комунікацій

          Інвентар, що застосовується для миття і очищення, слід вибирати і використовувати так, щоб він не став джерелом контамінації. При очищенні технологічного обладнання, використовують засоби (каустична сода) та інвентар призначені виключно для цих цілей.

ДР 1.4.1 Миття обладнання

Змішувачі в яких готуються захисне середовище та середовище для культивування, а також виробничий ферментер та інокулятор з посівним апаратом миють водою, розчином з масовою долею каустичної соди 1% після закінчення кожного технологічного циклу.

При підготовці обладнання до тривалого простою, ураховуючи періодичність виробництва, після виведення продукту і знезараження всіх його залишків, ретельному промиванню підлягає обладнання всього технологічного ланцюжка.

ДР 1.4.2 Дезинфекція та ополіскування

Дезінфекцію обладнання та комунікацій проводять лише після ретельної обробки миючим розчином каустичної соди. А далі обполіскують водою при температурі 20°С. 

ДР 1.4.3 Перевірка на герметичність

Перевірку на герметичність проводять подаючи пару, яка створює надлишковий тиск. Значення тиску контролюють по датчику, якщо тиск падає це означеє що обладнання має дефекти. Апарат з прилеглими трубопроводами перед загрузкою середовища перевіряють на герметичність під дією повітряного тиску 0,2 МПа. Нещільність в фланцевих з'єднаннях, зварювальних швах знаходяться за допомогою мильної води. Знайдені пропуски усувають і проводять повторну перевірку.

ДР 1.4.4 Стерилізація обладнання

Стерилізацію ферментера, інокулятора та посівного апарату проводять при температурі 125 - 130ºС і тиску 0,27-0,30 МПа не менше 20 хвилин. Контроль температури проводиться в "слабкій точці" - на лінії зливу з ферментеру, інокулятора та посівного апарату. Після стерилізації конденсат, що утворився подається до знешкодження.

ДР 2 Підготовка стерильного технологічного повітря

Повітря, яке використовується для аерації у процесі культивування посівного матеріалу в посівному апараті та в процесі біосинтезу в ферментері повинно бути стерильним та мати температуру 30 - 35˚С.

Перед тим, як повітря потрапляє до ферментеру, воно проходить часткову очистку, в результаті якої звільняється від мікроорганізмів під час грубої очистки і повністю очищається від мікроорганізмів під час тонкої очистки. В ферментер очищене повітря подається через барботер.

ДР.2.1. Забір атмосферного повітря

При визначенні місця забору зовнішнього повітря необхідно враховувати існуючі та можливі джерела аерозольних і газоподібних забруднень (димарі, автотранспорт, газоподібні промислові викиди, квітучі рослини тощо).

Особливо багато мікроорганізмів над поверхнею землі, з висотою концентрація їх зменшується і стає постійною на рівні близько 30 м над землею, забір атмосферного повітря відбувається на висоті близько 20–30 м.

Забір повітря здійснюється повітрозбірником ПЗ-7.

ДР 2.2. Очищення повітря від пилу і механічних домішок

На стадії попереднього очищення повітря видаляється основна маса великих частинок пилу діаметром до 150, 300 мкм. В якості фільтрів попереднього очищення використовують – фільтри грубої очистки, на схемі фільтр Ф-8. Всередині фільтра розташовані дві решітки, між якими поміщають фільтруючий матеріал – скловолокно. Ступінь очищення становить Е=80 %.

ДР 2.3. Компресування

Компресування здійснюється на компресорі К-9 при тиску 0,35–0,5 МПа та      

температурі 200ºС. При цьому відводиться конденсат.

ДР 2.4 Стабілізація термодинамічних показників повітря

За допомогою насосу повітря подається в ресивер Рс-11 для акумуляції. Ресивер має конденсато – відвідний канал. Повітря стискають до 0,35–0,5 МПа, при температурі 21 °С, W=30–60 %. Тиск повітря за компресором визначають із розрахунку тиску на подолання опору в системі підготовки повітря.

ДР 2.5. Очищення повітря в головному фільтр

Подальше очищення повітря відбувається у фільтрах групи F5 – фільтри, які видаляють частинки більше за 1 мкм (Ф-13). Стерилізується фільтр паром під тиском 0,2 МПа при 121 °С протягом 3 годин. Ступінь очищення становить 90 %. Далі використовують індивідуальні фільтри (Ф-28, Ф-29, Ф-30), ступінь очищення яких становить 99,95 %, їх встановлюють безпосереднбо перед інокулятором, посівним апаратом і виробничим ферментатором.

ДР 2.6. Стерилізація повітря в індивідуальному фільтрі

Далі очищене повітря надходить в індивідуальні фільтри тонкого очищення і подається для аерації зростаючої культури в посівному апараті  і ферментер.

Фільтруючий матеріал, що використовується для фільтрів тонкого очищення має коефіцієнт проходження 1×109, що забезпечує необхідну стерилізацію повітря, необхідного для розвитку мікроорганізмів.

Стерилізують фільтри парою. Перебивку фільтрів ведуть індивідуально - 1 раз на місяць. Ступінь очищення становить 99,99 %.

ДР 3. Підготовка та стерилізація поживного середовища

Перед приготуванням середовища усі компоненти стерилізуються. Режим стерилізації залежить від природи речовини.

Поживне середовище готується в спеціальних реакторах. Спочатку в реактор заливають воду, включають мішалку і обігрів: коли температура води досягає 85оС, в апарат додають компоненти поживного середовища. Середовище витримують протягом 10 хвилин. Охолодження поживного середовища проводять у теплообміннику, таким чином, щоб частина нагрітого поживного середовища віддавала тепло тій частині, яка ще не пройшла стерилізацію. Це дозволить скоротити витрати на стерилізацію ПС.

Поживні середовища готуються в апаратах-змішувачах, оснащених мішалками, куди завантажують окремі компоненти у певній послідовності, визначеній регламентом. дозування компонентів поживного середовища здійснюється за допомогою приладів з арсеналу харчової, хімічної та інших галузей промисловості.

ДР 3.1. Дозування та стерилізація компонентів поживного середовища для колб

Для колб готують поживне середовище такого складу, кг:

Глюкоза – 0,07;

Кукурудзяний екстракт – 0,007;

КН2РО4 – 0,069;

К2НРО4 – 0,07;

Магній сірчанокислий – 0,07;

Кальцій хлористий – 0,0001;

Сечовина – 0,0041;

Біотин – 0,02.

Загальний об’єм поживного середовища після стерилізації становить 0,5 л.

ДР 3.1.1. Приготування та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

У колбу вносять 0,07 г глюкози та 0,007 мл кукурудзяного екстракту Доводять дистильованою водою до 1100 л. Далі розчин стерилізують гострою парою 20хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 115оС. Потім розчин охолоджують до 37оС.

ДР 3.1.2. Приготування та стерилізація фосфорних солей

Зважують компоненти поживного середовища: КН2РО - 0,069 г; К2НРО4 – 0,07г, доводять водою питною до 1100 л.

 Компоненти розчиняють, ввімкнувши перемішуючий пристрій, і підкислюють 0,1н розчином соляної кислоти до рН 5. Розчин стерилізують гострою парою 20 хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 127оС. Потім розчин доводять до нейтрального рН 7 0,1н розчином гідроксиду натрію.  Розчин охолоджують до температури 37оС.

ДР 3.1.3. Приготування та стерилізація солей та сечовини

Розчин вносять у кількості: Магній сірчанокислий – 0,07 г; кальцій хлористий – 0,0001 г;  сечовину – 0,0041г. Доводять до 100 мл дистильованою водою. Стерилізують за температури 130 ˚С, впродовж 1 год.

ДР 3.1.4. Приготування та стерилізація біотину

Біотин вносять у кількості 0,02 г доводячи водою дистильованою до 100.

Стерилізують і, за температури 112 ˚С, впродовж 30 хв, для попередження розкладання термолабільних факторів росту.

ДР 3.2.  Підготовка та стерилізація поживного середовища для інокулятору

Для інокулятору Ін- готують поживне середовище такого складу, кг:

Глюкоза – 1,36;

Кукурудзяний екстракт – 0,14;

КН2РО4 – 0,14;

К2НРО4 – 0,14;

Магній сірчанокислий – 0,14;

Кальцій хлористий – 0,001;

Сечовина – 0,08;

Біотин – 0,41.

Загальний об’єм поживного середовища після стерилізації становить 15,91 л. Об’єм інокулятора Ін-29 – 0,25 м3. Сольові компоненти стерилізують окремо від вуглецевмісних.

ДР 3.2.1. Приготування та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

Їх стерилізують в окремому збірнику Зб-15. Глюкозу масою 1,36 кг та кукурудзяний екстракт масою 0,14. Далі розчин стерилізують гострою парою 20хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 115оС. Потім розчин охолоджують до 37оС і подають в інокулятор Ін-29.

ДР  3.2.2. Приготування розчину солей та їх стерилізація

Сольові компоненти стерилізують в підготовленому, стерильному інокуляторі Ін-29. В стерильний інокулятор подають питну воду, КН2РО4 – 0,14, К2НРО4 – 0,14, магній сірчанокислий – 0,14, кальцій хлористий – 0,001 компоненти розчиняють, ввімкнувши перемішуючий пристрій, і підкислюють 0,1н розчином соляної кислоти до рН 5,0 , щоб солі фосфору не випадали в осад після реакції з кальцієвими чи магнієвими солями. Розчин стерилізують гострою парою 20 хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 127оС. Потім розчин доводять до нейтрального рН 7 0,1н розчином гідроксиду натрію.  Розчин охолоджують до температури 37оС.

ДР 3.2.3. Приготування розчину сечовини та його стерилізація

Сечовину стерилізують в підготовленому стерильному інокуляторі Ін-29. В стерильний інокулятор подають воду та сечовину в кількості – 0,08. Стерилізують при температурі 115˚С, при Р=0,5 атм. І добавляють в колби (0,6%) після стерилізації.

ДР 3.2.4. Приготування розчину біотину та його стерилізація

 Біотин готують окремо, в кількості – 0,41, стерилізують пропусканням через 0,22 мкм. Фільтр.

ДР 3.3. Підготовка та стерилізація поживного середовища для посівного апарату

 Для посівного апарату використовують поживне середовище такого складу:

Глюкоза –12,91;

Кукурудзяний екстракт – 1,29;

КН2РО4 – 1,29;

К2НРО4 – 1,29;

Магній сірчанокислий – 1,29;

Кальцій хлористий – 0,01;

Сечовина – 0,77;

Біотин – 3,87.

Загальний об’єм поживного середовища після стерилізації становить 122,72 л. Об’єм інокулятора Ін-29, 2м3. Сольові компоненти стерилізують окремо від вуглецевмісних.

3.3.1. Приготування та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

 Їх стерилізують в окремому збірнику Зб-15. Глюкозу масою 12,91  та кукурудзяний екстракт масою 1,29. Далі розчин стерилізують гострою парою 20хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 115оС. Потім розчин охолоджують до 37оС і подають в інокулятор Ін-29.

  1.  Приготування розчину солей та їх стерилізація

Сольові компоненти стерилізують в підготовленому, стерильному інокуляторі Ін-29. В стерильний інокулятор подають питну воду, КН2РО4 – 1,29, К2НРО4 – 1,29, магній сірчанокислий – 1,29, кальцій хлористий – 0,01 компоненти розчиняють, ввімкнувши перемішуючий пристрій, і підкислюють 0,1н розчином соляної кислоти до рН 5,0 , щоб солі фосфору не випадали в осад після реакції з кальцієвими чи магнієвими солями. Розчин стерилізують гострою парою 20 хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 127оС. Потім розчин доводять до нейтрального рН 7 0,1н розчином гідроксиду натрію.  Розчин охолоджують до температури 37оС

ДР 3.3.3. Приготування розчину сечовини та його стерилізація

Сечовину стерилізують в підготовленому стерильному інокуляторі Ін-29. В стерильний інокулятор подають воду та сечовину в кількості – 0,77. Стерилізують при температурі 115˚С, при Р=0,5 атм.

ДР 3.3.4. Приготування розчину біотину та його стерилізація

 Біотин готують окремо, в кількості – 3,87, стерилізують пропусканням через 0,22 мкм. Фільтр.

ДР 3.4. Підготовка та стерилізація поживного середовища для ферментеру

Для ферментеру Фр-34 використовують середовище наступного складу, кг:

Глюкоза – 122,67;

Кукурудзяний екстракт – 12,27;

КН2РО4 – 12,27;

К2НРО4 – 12,27;

Магній сірчанокислий – 12,27;

Кальцій хлористий – 0,12;

Сечовина – 73,5;

Біотин – 36,8

Загальний об’єм поживного середовища після стерилізації становить 1099 л.  об’єм ферментера Фр-34,  2 м3. Сольові компоненти стерилізують окремо від вуглецевмісних.

3.4.1. Приготування та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

 Їх стерилізують в окремому збірнику Зб-15. Глюкозу масою 122,67  та кукурудзяний екстракт масою 12,27. Далі розчин стерилізують гострою парою 20хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 115оС. Потім розчин охолоджують до 37оС і подають в інокулятор Ін-.

3.4.2.  Приготування розчину солей та їх стерилізація

Сольові компоненти стерилізують в підготовленому, стерильному збірнику Зб-17. В стерильний інокулятор подають питну воду, КН2РО4 – 12,27, К2НРО4 – 12,27, магній сірчанокислий – 12,27, кальцій хлористий – 0,12 компоненти розчиняють, ввімкнувши перемішуючий пристрій, і підкислюють 0,1н розчином соляної кислоти до рН 5,0 , щоб солі фосфору не випадали в осад після реакції з кальцієвими чи магнієвими солями. Розчин стерилізують гострою парою 20 хв під надлишковим тиском 0,1МПа за температури 127оС. Потім розчин доводять до нейтрального рН 7 0,1н розчином гідроксиду натрію.  Розчин охолоджують до температури 37оС

ДР 3.4.3. Приготування розчину сечовини та його стерилізація

Сечовину стерилізують в підготовленому стерильному збірнику Зб-19. В стерильний інокулятор подають воду та сечовину в кількості – 73,5. Стерилізують при температурі 115˚С, при Р=0,5 атм.

ДР 3.3.4. Приготування розчину біотину та його стерилізація

 Біотин готують окремо, в кількості – 36,8, стерилізують пропусканням через 0,22 мкм. Фільтр.

ТП  4. Підготовка посівного матеріалу

ТП  4.1. Введення музейної культури

Для ферментації використовується музейна культура штаму Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872. Зберігається культура в лабораторії за таких умов: температура 4-5 С. Кожні півроку культуру пересівають на скошений агар. Перед використанням у виробництві культуру  перевіряють на чистоту та на здатність синтезувати цільовий продукт.

ТП 4.2. Культивування культури в колбах на качалці

Музейну культуру  культивують на качалках в колбах об’ємом 750 мл з вмістом поживного середовища 200мл при температурі 37оС 46 год, частота обертів качалки 150 – 180 об/хв. Середовище для культивування в колбах готується в лабораторії.

ТП 4.3. Культивування посівного матеріалу в інокуляторі

В попередньо простерилізований інокулятор (Фр-29) подаємо поживне середовище із змішувача  (Зм-). Стерилізуємо середовище гострою парою за температури 130 ˚С, впродовж 1 год. Після чого охолоджуємо його до 30 ˚С. Вносимо  (0,5 л) посівного матеріалу з колб. Включаємо мішалку (180–400 об/хв), барботер, витрати повітря 0,2 г∙О/л∙год, вирощуємо впродовж 24 год, за температури 30 ˚С. Під час культивування, підтримуємо концентрацію розчиненого кисню на рівні 30–40 % (від насичення повітрям), регулюючи швидкість перемішування і витрати повітря 0,2÷2,0 г∙О/л∙год.

ТП 4.4. Вирощування в посівному апараті

В попередньо простерилізований інокулятор (Фр-32) подаємо поживне середовище із змішувача  (Зм-). Стерилізуємо середовище гострою парою за температури 130 ˚С, впродовж 1 год. Після чого охолоджуємо його до 30 ˚С Вносимо  (15,91 л) посівного матеріалу з інокулятору. Включаємо мішалку (180 об/хв.), барботер, витрати повітря 0,2 г∙О/л∙год, вирощуємо впродовж 24 год, за температури 30 ˚С. Під час культивування, підтримуємо концентрацію розчиненого кисню на рівні 30–40 % (від насичення повітрям), регулюючи швидкість перемішування і витрати повітря 0,2÷2,0 г∙О/л∙год.

ТП 5. Виробничий біосинтез.

ТП 5.1. Виробниче культивування.

У стерильний ферментер з охолодженим до 37оС поживним сольовим середовищем подається частина стерильного вуглецевмісного середовища масою 30 кг. Після цього в ферментер Фр-34 подається посівний матеріал з інокулятора Фр-29 через форсунковий розбризкував.

Культивування проходить за температура 37оС, надлишковий тиск 0,1 МПа, витрати повітря 2580 м3/год. Кожні дві години в ферментер дробно за допомогою розбризкувача подається поживне середовище. Під час культивування проводять хімічний контроль середовища, мікробіологічний контроль культури та вихід готового продукту. рН підтримують на рівні 7,0, підкислюючи чи підлужнюючи середовище 0,1 розчином соляної кислоти чи 0,1н розчином гідроксиду натрію відповідно. Культивування триває 72 год. Готову культуральну рідину, що містить біомасу продуцента, подають насосом  через теплообмінник для охолодження, і далі у збірник ЗБ-36

ТП 6. Виділення цільового продукту

ТП 6.1 Сепарація

Культуральна рідина зі збірника (Зб-37) в кількості 1,104 м3 подається на сепаратор, культуральна рідина подається по боковим патрубкам коллектора. Робочий тиск – р1=2,5МПа, час циклу становить 15хв, температура – 25-30о С.

Супернатант надходить в збірник (Зб-39), а біомаса надходить до ЗВ 10.1

ТП 7. Концентрування культуральної рідини

ТП 7.1 Ультрафільтрація

              Фільтрат надходить до ультрафільтраційної  установки  за допомогою  насоса (Н-40). Там за допомогою перестатичного насоса Н-42  із змішувача Зм-41 фільтрат подається на фільтри попередньої очиски, а після них фільтрат подається на мембранний модуль. Потім під  тиском 0,3-0,6 МПа  рочин  пропускають  через мембрани. Швидкість  потоку  складає  0,67- 0,70 м/с. Розчин  одночасно  подається у  всі  канали фільтруючих  елементів. Після цього концентрат за допомогою насоса (Н-42) подають збірник (Зм -45).

ТП 7.2 Очищення культуральної рідини

ТП 7.2.1  Адсорбція на іонообмінних колонах

Культуральну рідину направляють на батарею іонообмінних колон І.к-47 заповнену аніонітом АВ 17×8. Співвідношення шару катіоніту до діаметра колонки коливається в межах від 8:1 до 10:1, кожні 100 г катіоніту сорбують 6-8 г НАД. Фільтрат пропускають через колонки до тих пір, доки не появляться сліди НАД, тоді подачу фільтрату припиняють і промивають колонки дезіонізованою водою по принципу "киплячого шару". Ця вода частково, залежно від вмісту НАД, повертається в процес для видалення з неї коферментів. Фільтрат культуральної рідини після сорбції видаляється.

ТП 7.2.2 Елюація

Елюацію НАД здійснювали за допомогою 0,05н. НСlO4, в (І.к-47) елюати нейтралізували КОН.

ТП 8. Отримання готового продукту

ТП 8.1 Упарювання на плівковому випарнику

Фільтрат культуральної рідини подається на ВВУ-66. Фільтрат нагрівається до температури t=75оС. Нагрівання фільтрату здійснюється нагрівальною парою, що надходить  з термокомпресора. Час проходження рідини через апарат – 3-5с.

ТП 8.2 Змішування з захисним середовищем

Після упарювання тверда фракція насосом (Н-50) перекачується до змішувача (Зм-51), де тимчасово знаходить до змішування з приготованим захисним середовищем у змішувачі Зм-51 куди надходить через насос Н-50. Змішування з захисним середовищем відбувається на протязі 30 хв, при перемішуванні та при температурі t = 34-35° С.

ТП 8. 3  Заморожування

Заморожування відбувається у ліофільній сушарці Лс-53 до температури –(-35° С) на протязі 24 годин.

ТП 8. 4  Ліофілізація

Після заморожування препарат в кількості V=90,9 м3 висушується за допомогою ліофілізації при температурі, від t заморожування (-35°С) до температури у 22+/-3°С, на протязі 48 годин. Після ліофілізації продукт подається на подальшу фасовку.

ТП 8.5. Подрібнення готового продукту

НАД із залишковою вологістю 4-7%, який являє собою масу без запаху та смаку, подрібнюють із застосуванням млинів або дезінтеграторів.

Відбирають пробу для контролю якості готового продукту.

ТП 8.6. Стандартизація препарату

Отримувану суху речовину для доведення до стандартної активності 2000 од/г подають у змішувач, де додають крохмаль у кількості 5 г на одну партію.

ПМВ 9 Пакування, маркування, відвантаження

ПМВ 9.1. Фасування НАД в подвійні  поліетиленові етикетовані пакети

Готовий порошок має вологість має вологість 4-7%. Якщо його вологість підвищиться до 8% і більше, то він згрудковується, втрачає товарний вигляд і ферментну активність. Тому його герметично пакують у етикетовані поліетиленові пакети для забезпечення вологонепроникності. Препарат фасують на дозувальному апараті (ДА) по 100г. Відбраковані поліетиленові пакети відправляють  на утилізацію. На упаковці указують назву продукту, назву(фірму) виробника, масу нетто, номер партії, активність, дату виготовлення та строк придатності. Також обов’язково вказується інструкція по використанню.

ПМВ 9.2. Пакування пакетів з НАД в ящики

Пакети з НАД пакують в ящики з гофрованого картону по 10 штук. Коробки зберігаються на складі у сухих, добре вентильованих приміщеннях. Відбраковані ящики здають в утиль.

ЗВ 10. Знешкодження відходів

До стадії подаються речовини та матеріали наступного походження:

складові миючих та дезінфікуючих розчинів, що застосовуються на стадії санітарної підготовки обладнання та приміщень;

компонентами вихідної сировини та напівпродуктів, що переробляються на стадіях.

Апаратурне оформлення виробництва не забезпечує 100%-вого використання сировини, напівпродуктів, матеріалів. Наявні втрати їх обумовлюють утворення твердих та рідких промислових відходів.

ЗВ 10.1. Знешкодження рідких відходів

До рідких відходів відносять миючі розчини (розчин каустичної соди, перекис водню та мильні розчини) та відпрацьовану воду. Їх інактивують та зливають в каналізацію.

ЗВ 10.2. Знешкодження твердих відходів

До твердих відходів відносять домішки повітря, біомасу, поліетиленові пакети та картонні ящики. Біомасу інактивують нагріванням та утилізують, а пакети та ящики відправляють на вторинну переробку.

6.4 Апаратурна схема

       Апаратурна схема одержання нікотинамідаденіндинуклеотиду подана у вигляді креслення формату А1 на 2 листах. Дана схема представляє послідовність процесів отримання цільового продукту у вигляді відповідних умовних позначень усього необхідного обладнання.

      Апаратурна схема включає в себе збірники Зб, в яких готуються поживні середовища, контрольні прилада КП для відмірювання потрібної кількості поживного середовища. Також до складу апаратурної схеми входить посівний апарат, в який подається поживне середовище, інокулятор Фр-29, після інокулятора поживне середовище переходить до посівного апарату Фр-32, з якого потрапляє у ферментер Фр-34. А далі вже культуральна рідина переходить у Зб-35, з якого вже далі йде на виділення, очищення, висушування.

 

6.5 Специфікація обладнання

Умовне позначення

Назва

Кількість

Опис

1

2

3

4

КП-1, КП-3

Контрольний прилад

2

Прилад для дозування миючих та дезінфікуючих засобів

Зб-2Зб-4

Збірники

2

Збірники для підготовки миючих та дезінфікуючих засобів

Пз-7

Повітрозбірник

1

Апарат для збору аераційного повітря

Ф-8

Фільтр попередньої очистки

1

Фільтри головної очистки повітря, що встановлені після повітрозбірника

К-9

Компресор

1

Для перегонки повітря з фільтра на теплообмінник

Т-10, Т-12

Теплообінник

2

Для нагрівання аераційного повітря

Рс-11

Ресивер

1

Вертикальний апарат для стискання та очистки повітря повітря

Ф-13

Головний фільтр

1

Фільтр головної очистки повітря

КП-14, КП-16, КП-18, КП-20

Контрольний прилад

4

Прилад для дозування компонентів поживного середовища

Зб-15, Зб-17, Зб-19, Зб-21, Зб-26,  

Збірники

5

Збірники для приготування компонентів поживного середовища

ЗП-28, ЗП-31

Засівний пристій

2

Для засіву інокулятора та посівного апарату

Ф-30, Ф-33, Ф-35

Індивідуальні фільтри

3

Фільтри для тонкої очистки повітря

Фр-29

Інокулятор

1

Вертикальний збірник

Н-5, Н-6, Н-22, Н-23,Н-24, Н-25, Н-37,Н-36,Н-38, Н-40, Н-42, Н-46, Н-48, Н-50, Н-52

Відцентрові насоси

7

Насоси для передачі компонентів поживного середовища

Фр-32

Посівний апарат

1

Вертикальний апарат

Фр-34

Ферментер

1

Вертикальний збірник

Зб-35

Збірник

1

Проміжний збірник для  культуральної рідини

Сп - 37

Сепаратор

1

Апарат для відділення біомаси

Зб - 39

Збірник

1

Збірник для фільтрованого розчину

Уф - 44

Ультрафільтраційна установка

1

Для концентрації цільового продукту

І.к - 47

Іонообмінна колона

1

Для очищення та концентрування цільового продукту

ВВУ - 49

Випарна установка

1

Для концентрування цільового продукту

Зм-51

Змішувач

1

Змішувая для випареного розчину

Лс - 53

Ліофільна сушарка

1

Для сушки кінцевого продукту

Др - 54

Дробарка

1

Для подрібнення готового продукту

Пм - 55

Пакувальна машина

1

Для пакування порошку в поліетиленові пакети

6.6 Контроль виробництва

Таблиця 6.6.1

6.6.1. Карта постадійного контролю

Номер контрольної точки та назва стадії

Об’єкт контролю і показник, що визначається

Метод контролю

Періодичність перевірки та порядок відбору проб

Нормативна характеристика показника, що визначається

1

2

  3

 4

5

Кт, Кх 1.2.1. Перевірка правильності підготовки  миючих засобів

хлорамін

-перевірка концентрації

Після приготування розчину

Концентрація  розчину хлораміну повинна становити 1 %,

Кх 1.2.2.  Перевірка     правильності підготовки  миючих розчинів

Каустична сода

-перевірка концентрації

Після приготування розчину

Концентрація  розчину «каустичної соди» повинна становити 1 %, при Т=20˚С

Км. 1.3.2. Перевірка генерального прибирання

Розчин хлораміну

Перевірка КУО

Після генерального прибирання

Кількість КУО повинна бути КУО<100

Кт 1.4.1. Миття обладнання

Обладнання

-манометр технічний-термометр

Температура та тиск визначають безперервно під час миття

Р=0,15 МПа

Т=70 - 80˚С

τ =1,5 год

Кт 1.4.2. Ополіскування ферментера

Обладнання

-манометр технічний-термометр

Температуру визначають під час ополіскування

Т=70 - 80˚С

τ =1,5 год

Кт 1.4.3 Перевірка на герметичність

Обладнання

-манометр технічний

Тиск визначають під час операції

Р=0,15-0,2 МПа

Кт  1.4.4

Стерилізація обладнання

Обладнання

-манометр технічний

- термометр

Температура та тиск визначають безперервно під час стерилізації

Р = 0,15 МПа

Т = 125–130oC      

τ = 2 год           

Кт 2.2. Підготовка   повітря

попередня очистка повітря

-перевірка ступеня очищення

Під час очистки повітря в фільтрі грубого очищення

Е = 80%

Продовження таблиці 6.6.1

Кт 2.3

Компресу-вання

стискання повітря

-манометр технічний

-термометр

Під час компресування повітря

Р=0,35–0,5 мПА

Т=200 ˚С

Кт 2.4.  Стабілізація термодинамічних показників

кондиціонува-ння повітря

-перевірка температури і вологості

Під час проведення стабілізації термодинамічних показників повітря

Т = 30 ºС,

W = 60%,

Р=0,2МПа

Кт, Км 2.5

Очищення в головному фільтрі

очищення повітря в фільтрі тоного очищення і індивідуальному фільтрі

-перевірка ступеня очищення

Під час очистки повітря в фільтрі тоного та індивідуального очищення

Е = 99,95%

КУО<1

Км, Кт 2.6

Очищення в індивідуальному фільтрі

Очищення повітря в індивідуальному фільтрі

-перевірка ступеня очищення

Під час очистки повітря в головному фільтрі

Е=99,99%, КУО<1

Продовження таблиці 6.6.1

Кт, Км 3.1.1 Приготуван-ня та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

розчин глюкози та кукурудзяного екстракту

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину

Т=115 ˚С, р=0,5 мПА, τ = 1 год.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.1.2 Приготуван-ня та стерилізація фосфорних солей

розчин солей

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину сольових компонентів

Т=127 ˚С, р=0,15 мПА, τ = 20 хв.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.1.3

Приготування та стерилізація розчину солей та сечовини

розчин інших солей та сечовини

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину солей

Т=130 ˚С, р=0,1 мПА, τ = 1 год.   Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт 3.1.4

Приготуван-ня та стерилізація біотину

біотин

- перевірка діаметра фільтру

Під час приготування біотину

d=0,22 мкм

Продовження таблиці 6.6.1

Кт 3.2.1 Приготування та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

розчин глюкози та кукурудзяного екстракту

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину

Т=115 ˚С, р=0,5 мПА, τ = 1 год.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.2.2 Приготуван-ня та стерилізація фосфорних солей

розчин солей

перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину сольових компонентів

Т=127 ˚С, р=0,15 мПА, τ = 20 хв.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.2.3

Приготування та стерилізація розчину солей та сечовини

розчин інших солей та сечовини

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину солей

Т=130 ˚С, р=0,1 мПА, τ = 1 год.   Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт 3.2.4

Приготуван-ня та стерилізація біотину

біотин

- перевірка діаметра фільтру

Під час приготування біотину

d=0,22 мкм

Кт 3.3.1 Приготування та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

розчин глюкози та кукурудзяного екстракту

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину

Т=115 ˚С, р=0,5 мПА, τ = 1 год.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.3.2 Приготуван-ня та стерилізація фосфорних солей

розчин солей

перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину сольових компонентів

Т=127 ˚С, р=0,15 мПА, τ = 20 хв.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.3.3

Приготування та стерилізація розчину солей та сечовини

розчин інших солей та сечовини

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину солей

Т=130 ˚С, р=0,1 мПА, τ = 1 год.   Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт 3.3.4

Приготуван-ня та стерилізація біотину

біотин

- перевірка діаметра фільтру

Під час приготування біотину

d=0,22 мкм

Кт 3.4.1 Приготування та стерилізація глюкози та кукурудзяного екстракту

розчин глюкози та кукурудзяного екстракту

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину

Т=115 ˚С, р=0,5 мПА, τ = 1 год.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.4.2 Приготуван-ня та стерилізація фосфорних солей

розчин солей

перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину сольових компонентів

Т=127 ˚С, р=0,15 мПА, τ = 20 хв.

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт, Км 3.4.3

Приготування та стерилізація розчину солей та сечовини

розчин інших солей та сечовини

- перевірка температури

- перевірка тиску

- мікробна контамінація

Під час приготування розчину солей

Т=130 ˚С, р=0,1 мПА, τ = 1 год.   Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт 3.4.4

Приготуван-ня та стерилізація біотину

біотин

- перевірка діаметра фільтру

Під час приготування біотину

d=0,22 мкм

Кт, Кх 4.2         Вирощування культури в

колбах на качалках

вирощування посівного матеріалу

в колбах на качалці

-термометр,

-рН-метр

Під час вирощування культури в колбах на качалках

Т = 28ºС, рН = 7  200 об/хв., τ = 24 год. Відсутність сторонньої

мікрофлори

Кт , Кх 4.3         Вирощування культури в інокуляторі

вирощування культури в інокуляторі

-термометр         -рН-метр

Під час вирощування культури в інокуляторі

Т =37˚С, рН = 7, τ = 24 год

Кт , Кх 4.4          Вирощування культури в посівному апараті

вирощування культури в посівному апараті

-термометр         -рН-метр

Під час вирощування культури в посівному апараті

Т =37˚С, рН = 7, τ = 42 год

Кт , Км, Кх 5.1          Вирощуван-ня культури в ферментері

вирощування культури в ферментері

-термометр         -рН-метр

-мікробна чистота

Під час вирощування культури в ферментері

Т =37˚С, рН = 7, τ = 72 год,

Відсутність сторонньої мікрофлори

Кт 6.1

Контроль параметрів сепарування

Перевірка умов сепарування

Перевірка часу, обертів, температури

Під час сепарування

t=15 хв,

 w=3000 об/хв,

Т=25-30˚С

Кт 7.1

Контроль параметрів ультрафільтрації

Перевірка умов концентрування

Перевірка тиску

Під час тривалості операції

Тиск, Р=0,5-0,6 МПа, УПМ-10

Кт 8.1

Контроль параметрів упарювання

Перевірка умов упарювання

Перевірка часу,

Перевірка температури

Під час тривалості операції

t=3-5 c,

Т=75˚С

Кт 8.2

Контроль параметрів змішування з захисним середовищем

Перевірка умов змішування з захисним середовищем

Перевірка часу,

Перевірка температури

Під час виконання операції

t=30 хв,

Т=34-35˚С

Кт 8.3

Контроль параметрів заморожування

Перевірка умов заморожування

Перевірка часу, перевірка температури

Під час тривалості операції

t=24 год,

Т=(-35˚С)

Кт 8.4

Контроль параметрів висушування

Перевірка умов сушіння

Перевірка часу,

Перевірка температури

Під час тривалості операції

t=48 год,

Т=(-35˚С)

Кт 8.5 Контроль параметрів дроблення препарату

Перевірка умов дроблення

Перевірка розмірів

Під час дроблення

D часток<0,1 м,

Н=7100об/хв

Кт 8.6

Контроль параметрів стандартизації

Перевірка умов активності

Перевірка активності

Під час стандартизації

Аст=2000 од/г, mн=

Кт, Кх, Км 9.1 Контроль стадій пакування

Маса та вологість

Перевірка маси та вологості готового продукту

Під час пакування

m=100г, w=4-6%, КУО≤25

Для забезпечення відповідності готової продукції на підприємстві забезпечується контроль процесу та контроль готової продукції.

Мікробіологічний контроль

Мікробіологічна чистота

Присутність деяких мікроорганізмів в лікарських засобах може викликати зменшення або навіть інактивацію їх терапевтичної дії і, внаслідок цього, негативно впливати на здоров'я пацієнтів. Тому виробники мають забезпечити низький рівень біологічного забруднення готових дозованих форм шляхом виконання поточних директив належної виробничої практики (НВП, GMP) під час виробництва, пакування, зберігання та розповсюдження лікарських засобів. Критерії прийнятності грунтуються на результатах одного випробування, або на середньому результаті декількох повторних випробувань (наприклад, при випробуванні методом прямого висівання на чашки Петрі) [8].

Служить для встановлення мікробіологічної чистоти та морфологічної однорідності посівного матеріалу і здійснюється методом розливу спорової суспензії на чашках Петрі з сусло–агаром (СА), м'ясо–пептонним агаром (МПА).

Для аналізу беруть наважку спор до 35 мг і висівають на 80-90 чашках Петрі з СА і 10-20 чашках з МПА. Випробуваний споровий матеріал розводять так, щоб густина зростання була не менше 40-60 копій на чашку.

 Чашки з СА витримують у термостаті при 32˚ С 1-2 доби. На 4 і 6-у добу після посіву чашки переглядають, визначаючи однорідність (відсутність форм мінливості штаму) і чистоту культури (відсутність дріжджів і кольорової цвілі). При виявленні неактивних форм мінливості штаму більш ніж на 0,2 % або сторонньої мікрофлори посівний матеріал бракується [8].

 Визначення здатності спор до проростання.

На предметному склі за допомогою спеціальних кілець готують вологу камеру. Спори пророщують у висячій краплі руслового або мелясного розчину, приготованого так само, як і для біохімічного контролю, але додатково профільтрованого і простерилізованого протягом 30 хв під тиском в 1 атм. Спорову суспензію готують у такому розведенні, щоб у краплі було 10-15 спор. Час пророщування 9 год. при 32˚С.

 Загальна кількість переглянутих спор в кожній партії 400-600. Підрахунком встановлюють кількість пророслих і непророслих спор. Схожість – це відношення пророслих спор до загальної кількості переглянутих, виражене у відсотках. Схожість повинна бути не вище 90 %.

 Проводять визначення кількості спор в 1г посівного матеріалу. Кількість спор у 1г посівного матеріалу має бути не менше 10,0 мільярдів.

Основний мікробіологічний контроль

Здійснюється на основних стадіях проведення процесу (ферментація, ліофілізація). Для відбору проб на ферментері встановлено спеціальні пробовідбірники. Для того, щоб при відборі проб до апарату не потрапляла стороння мікрофлора з оточуючого середовища, пробовідбірники оснащені спеціальною арматурою. Перевіряють проби у центральній заводській лабораторії шляхом висіву на МПА та прямим мікроскопіюванням [13].

Для перевірки застосовують „Чашечний метод”. Цей метод знайшов широке застосування для встановлення кількості мікроорганізмів у натуральних та синтетичних субстратах. Вважають, що кожна жива клітина при посіві на щільне поживне середовище утворює колонію. Виконання аналізу включає три етапи: приготування розведень (Метод Коха), посів на щільне поживне середовище у чашках Петрі, підрахунок колоній. При виробництві НАД при мікробіологічній перевірці обладнання, приміщень, стерильного поживного середовища, повітря у пробах повинна бути відсутня будь-яка мікрофлора.

Для того, щоб отримати окремі колонії, проби матеріалу, що досліджується, попередньо десятикратно розводять за методом Коха. З цією метою стерильну воду або ж фізіологічний розчин (0,5 %-ий розчин хлориду натрію) розливають по 5 мл у стерильні сухі пробірки. 1 мл вихідної проби асептично вносять у першу пробірку, закривають ватною пробкою, добре перемішують і отримують 1 розведення – 1:10.

Отриману у першому розведенні суспензію за допомогою стерильної піпетки добре перемішують, затягуючи до піпетки і видувають з неї суспензію декілька разів. Потім цією ж піпеткою беруть 1 мл розведення і переносять до другої пробірки з 9 мл води – 2 розведення – 1:102. Беруть нову піпетку і так само готують 3 розведення – 1:103, проводять розведення до 1:108. Два останні розведення висівають на чашки Петрі із МПА, при чому кожне розведення висівають на 3 різні чашки. Посів роблять мікробіологічною петлею над полум’ям пальника. Петлею відбирають розведення, відкривають чашку Петрі над вогнем з одного боку і зигзагом (штрихом) проводять петлею по поверхні середовища. Чашку закривають і ставлять до термостату при 37°С. Також роблять відповідно посіви на середовище що містить агар з 0,5 % глюкозою та густого середовища «Сабуро». Відношення посівної дози до обсягу живильного середовища має становити 1:10 або 1:20.

Посівний матеріал розподіляють по всій поверхні поживного середовища, покачуючи пробірку. Посіви на МПА інкубують при температурі (37±1)°С спочатку в горизонтальному (на протязі 2 діб), а потім у вертикальному положенні. Результати посівів слід враховувати через 48, 72 години і остаточно через 8 діб. Посіви на середовищі Сабуро інкубують при температурі (22±1)°С на протязі 8 діб, спочатку в горизонтальному (на протязі 2 діб), а потім у вертикальному положенні.

Після інкубації посівів на протязі зазначених термінів на середовищах МПА, живильному агарі з глюкозою не повинний бути виявлений ріст сторонньої мікрофлори, на густому середовищі "Сабуро" - ріст грибів.

Методика кількісного визначення нікотинамідаденіндинуклеотиду методом спектрофотометрії

У конічну колбу поміщають 1,00 мл розчину А, додають розчин натрію фосфату двозаміщеного, розчин роданобромідний і нагрівають при температурі від 75 до 80°С на водяній бані. Розчин охолоджують до кімнатної температури, додають розчин кислоти сульфанілової 1%, кількісно переносять у іншу мірну колбу місткістю 25,00 мл за допомогою води, доводять об’єм роз-

чину водою до мітки і перемішують.Паралельно вимірюють оптичну густину

отриманого розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 425 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи у якості розчину порівняння воду. Паралельно вимірюють оптичну густину розчину, що містить 1,00 мл розчину робочого стандартного зразка (РСЗ) нікотинаміду, виготовленого аналогічно випробуваному розчину.

Вміст нікотинаміду (Xi) у 1,00 мл препарату у грамах, обчислюють за формулою (1)

Xi= D×m0×0,05/ D0,

де: D – оптична густина випробуваного розчину;

D0 – оптична густина розчину РСЗ нікотин-

аміду;

m0 – маса наважки РСЗ нікотинаміду (г).

Допустимі норми вмісту нікотинаміду становлять 0,0027 – 0,0033 г у 1,00 мл препарату.

Специфічна нешкідливість

Препарат повинен бути нешкідливим для білих мишей при введенні                                                                                                            його перорально в кількості однієї дози.

Для визначення нешкідливості випробувані зразки розводять 0,9 % розчином хлориду натрію з розрахунку 0,5 мл на одну дозу препарату. Отриману мікробну завись по 0,5 мл вводять 5-ти білим мишам масою (15±1) – г кожній по 1 дозі. Спостереження за мишами ведуть на протязі п'яти діб.

У випадку загибелі за цей строк хоча б однієї миші контроль повторюють на подвійній кількості тварин. Якщо під час повторного контролю ні одна з 10 мишей на гине, препарат вважають таким, що витримав випробування. В протилежному випадку цю серію препарату бракують [8].

Технологічний контроль

Технологічний контроль виробництва полягає у постійному визначенні та регуляції основних показників процесів стерилізації, культивування тощо. Такими технологічними показниками є : концентрації компонентів поживного середовища; температура культивування, температура води, температура середовища, температура холодоагенту та теплоагенту при ліофілізації, температура поличок при проведенні процесу ліофілізації; тиск; рН; кількість обертів мішалки, кількість обертів сепаратора; час миття та стерилізації апаратів, час стерилізації поживного та захисного середовищ. Ці параметри під час виробництва НАД постійно регулюються за допомогою спеціальних автоматизованих пристроїв, які встановлені практично на кожному апараті.

Контроль чистоти рук і одягу

Чистоту рук перевіряють перед початком виробничого процесу в робітників, що мають безпосередній контакт із продукцією або чистим устаткуванням. Контроль проводиться без попередження.

Закріплений на дерев'яному стрижні стерильний тампон змочують стерильною водою і протирають ним долоні, тильну поверхню рук, під нігтями й між пальцями обох рук. Тампон занурюють у ту саму пробірку, у якій робили змочування, добре збовтують і відбирають 1 см3 та підготовлюють розведення(1:10 та 1:100) [13].

Для визначення загальної кількості мікроорганізмів в 1 см3 змиву роблять посів розведень на м'ясопептоний агар з наступним термостатуванням при 30 º С вродовж 48 год. Залишок змиву разом з тампоном висівають у пробірки з 5 см3 середовища Кесслера і вирощують 24 год при температурі 37 ºС. Далі визначають наявність кишкових паличок за методом бродильних проб.

Для взяття змивів з спецодягу протирають тампоном змоченим у стерильній воді чотири площі по 25 см3 з нижньої частини кожного рукава і попередньої частини поверхні спецодягу. Халати, фартухи, рукавички, куртки із тканини періодично просліджуються на наявність кишкових паличок посівом 1 см3 змивної води в середовище Кесслера, при наявності газоутворення пересівають на середовище ЄНДО. Кишкові палички на чистому спецодязі відсутні.

Контроль обладнання

Контроль проводять безпосередньо після миття та дезинфекції перед початком роботи шляхом висіву відібраних змивів для визначення загальної кількості мікроорганізмів в 1 мл. Готують стерильні ватні та марлеві тампони, пробірки з 10 мл стерильної води і стерильні пінцети. Тампони закріплюють на деревяних стержнях, кожен окремо занурюють у пробірку з 10 мл води і стерилізують при 0,1 МПа протягом 20-30 хв. Змиви з великого обладнання і апаратів беруть за допомогою нержавіючих металевих трафаретів із вирізаною серединою (площа вирізу 10, 25 – 100 см2). Перед взяттям проби трафарет змочують спиртом, обпалюють та накладають на поверхню, яку досліджують. Площу, яка відкрита, промивають змоченим тампоном, після чого тампон занурюють у ту саму пробірку, занурюють у залишену воду і добре перемішують. Висівають 1 мл змиву на МПА. Визначають загальну кількість мікроорганізмів після термостатування при 37°С протягом 48 год.

 У змивах стерильного обладнання мікроорганізми відсутні. У добре вимитих апаратах загальна кількість мікроорганізмів і титр кишкової палички не повинні перевищувати їх вміст у чистій воді, що поступає для миття.

6.7. Розрахунок кількості партій виробництва, основного технологічного обладнання та матеріальний баланс

ЗВЕДЕНА ТАБЛИЦЯ РЕЗУЛЬТАТІВ РОЗРАХУНКУ

№ з/п

Найменування показника

Один. виміру

Умов. познач.

Значення

 

Культура біологічного агенту  – Вrevibacterium ammoniagenes ATCC 6872

 

 

 

1

Потужність підприємства в умовних тонах ферменту

ум.т./рік

Gут =

0,75

2

Кількість робочих днів у рік

дн.

Tрд =

320

3

СРст - стандартний вміст НАД

частка

CРст =

0,95

4

СРкр -  вміст НАД в культуральній рідині

частка

СРкр =

0,0065

5

Густина НАД

кг/м3

Роц=

1100

6

Час циклу роботи ферментера

год

Tцф =

80

7

Час циклу роботи посівного апарата

год

Tцп =

25

8

Час циклу роботи інокулятора

год

Tці =

42

9

Об'єм КР, що зливається за одну ферментацію (цикл)  

м3

Vкр =

1,104

10

Кількість ферментацій (циклів) на рік

цикл/рік

Nцк =

90,24

11

Кількість фермента у натур.кг за цикл, кг/цикл

кг/цикл

Gцк =

12

Вихід фермента у натуральних кг з 1 м3

нат.кг/м3

qнат. =

7,53

14

Об'єм виробничого ферментера

м3

Vфт =

2

15

Кількість виробничих ферментерів

один.

Nфт =

1

16

Об'єм посівного апарату

м3

Vпат =

2

17

Кількість посівних апаратів

один.

Nпат =

1

18

Об'єм інокулятора  

м3

Vінт =

0,25

19

Кількість інокуляторів

один.

Nінт =

1

20

Об'єм збірника

м3

Vзбт =

12,5

21

Кількість збірників

один.

Nзбт =

1

МАТЕРІАЛЬНИЙ БАЛАНС НА ОДНУ ФЕРМЕНТАЦІЮ (ПАРТІЮ)

№ з/п

Використано

Отримано

Назва сировини і напівпродукту

Кількість,      кг (дм³)

Назва кінцевого продукту, відходів та втрат

Кількість,    кг (дм³)

1

2

3

4

5

 

1

ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА  ДЛЯ ІНОКУЛЯТОРА

1.1.

Глюкоза

1,36

Поживне середовище (нестерильне)

14,51

1,2

Кукурудзяний екстракт

0,14

 

 

1.3.

КН2РО4

0,14

 

 

1,4

К2НРО4

0,14

 

 

1,5

Магній сірчанокислий

0,14

 

 

1,6

Кальцій хлористий

0,001

 

 

1,7

Сечовина

0,08

 

 

1,8

Біотин

0.41

(втрат немає)

0

1,9

Вода

12,1

 

 

 

Всього

14,51

Всього                                   

14,51

2

СТЕРИЛІЗАЦІЯ ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА  В ІНОКУЛЯТОРАХ

2.1.

Нестерильне поживне середовище

14,51

ПС стерилізоване в апараті

14,51

2.2.

(Конденсат - 10% води)

1,4

(втрат немає)

0

 

Всього

15,91

Всього

15,91

3

ОТРИМАННЯ ПОСІВНОГО МАТЕРІАЛУ В ІНОКУЛЯТОРАХ

3.1.

ПС стерилізоване в апараті

15,91

Посівний матеріал

15,91

3.2.

Посівний матеріал з колб

0,5

 

 

3.3.

Втрати (частка)

0,05

Втрати (кількість)

0,5

 

Всього

16,41

 

16,41

4

ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА  ДЛЯ ПОСІВНОГО АПАРАТУ

4.1.

Глюкоза

12,91

Поживне середовище (нестерильне)

102,72

4.2.

Кукурудзяний екстракт

1,29.

 

 

4.3.

КН2РО4

1,29

 

 

4.4.

К2НРО4

1,29

 

 

4.5.

Магній сірчанокислий  (MgSO4 ∙7H2O)

1,29

 

 

4.6.

Кальцій хлористий (CaCl2)

0,01

 

 

 

Сечовина

0,77

 

 

 

Біотин

3,87

 

 

4.7.

Вода

80

(втрат немає)

0

 

Всього

102,72

Всього

102,72

5

СТЕРИЛІЗАЦІЯ ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА  В ПОСІВНИХ АПАРАТАХ

5.1.

Нестерильне поживне середовище

102.72

ПС стерилізоване в апараті

122,72

5.2.

(Конденсат - 10% води)

20

(втрат немає)

0

 

Всього

122,72

Всього

122,72

6

ОТРИМАННЯ ПОСІВНОГО МАТЕРІАЛУ В ПОСІВНИХ АПАРАТАХ

6.1.

Поживне середовище

122,72

Посівний матеріал

129,42

6.2.

Посівний матеріал з інокулятору

12

 

 

6.3.

Втрати (частка)

0,05

Втрати (кількість)

6,7

 

Всього

134,72

Всього

134,72

7

 ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ ФЕРМЕНТЕРА

7.1.

Глюкоза

122,67

Поживне середовище (нестерильне)

879

7.2.

Кукурудзяний екстракт

12,27

 

 

7.3.

КН2РО4

12,27

 

 

7.4.

К2НРО4

12,27

 

 

7.5.

Магній сірчанокислий  (MgSO4 ∙7H2O)

12,27

 

 

7.6.

Кальцій хлористий (CaCl2)

0,12

 

 

 

Сечовина

0,735

 

 

 

Біотин

36,8

 

 

7.7.

Вода

670

(втрат немає)

0

 

Всього

879

Всього                                   

879

8

СТЕРИЛІЗАЦІЯ ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ ФЕРМЕНТЕРА

8.1.

Нестерильне поживне середовище

879

Стерильне поживне середовище

1099

8.2.

(Розбавлення конденсатом - 20% )

220

(втрат немає)

0

 

Всього  

1099

Всього

1099

9

ВИРОБНИЧИЙ БІОСИНТЕЗ

9.1.

Стерильне поживне середовище

1099

Культуральна рідини на фільтрацію

1098,72

9.2.

Посівний матеріал з посівних апаратів

130

 

 

9.3.

Втрати (частка)

0,1

Втрати (кількість)

122,9

 

Всього

1229

Всього

1229

2,49

Gцк =

8,31

Nцк =

90,24

Vкр =

1,104

qнат. =

7,53

1,104

0,19

194,41

         g1=

110,4

g2=

11,04

g3= 

11,04

g4=

11,04

g5=

11,04

g6=

0,1104

g7=

6,624

g8=

33,12

        G0= 

194,41

216,016

G01 =

122,67

G02 =

12,27

G03 =

12,27

G04 =

12,27

G05 =

12,27

G06=

0,12

        G07=

73,5

        G08=

36,8

G =

282,156

G2 =

21,60

G3 =

22,74

G'01 =  

12,91

G'02 =  

1,29

G'03 =

1,29

G'04 =

1,29

G'05  =

1,29

G'06  =

0,01

G'07 =  

0,77

G'08=  

3,87

G3 =

22,74

      G4 =

2,27

     

G5 =

2,39

G"01 =  

1,36

G"02 =  

0,14

G"03 =

0,14

G"04 =

0,14

G"05  =

0,14

G"06  =

0,001

G"07 =

0,08

G"08  =

0,41

G5 =

2,39

G6 =

0,12

G7 =

0,12

G"01 =  

0,07

G"02 =  

0,007

G"03 =

0,069

G"04 =

0,07

G"05  =

0,07

G"06  =

0,0001

G"07  =

0,0041

G"08  =

0,02

G7 =

1,21

G8 =

242,36

Vф =

1,23

Vпмф =

0,12

Vпсф =

1,10

Vпа =

0,13

Vпмп =

0,01

Vпсп =

0,12

Vін =

0,01

Vінм =

0,0005

Vпсі =

                  0,0095.

Vкол =

                     0,0005.

Vінк =

                      0,0014.

Vві =

0,0121

Vпак =

0,02

Vвпа =

0,08

Vфк =

0,22

Vвф =

0,67

VΣ =    

0,76

Gкр =

0,72

GвтСР=

0,03

Vкр =

0,99

Vфг =

2,04

Vфт =

аааа

Nфр =

1,12

Nфт =

2

Кзф =

0,30

0,6

Vпаг=

0,22

Nпа =

2,07

Nпат =

1

Кпат =

#ССЫЛКА!

0,55

Vіна =

0,02

Vінт =

0,25

Nіна =

1,10