38637

Транскриптомный анализ генов контроля генеза митохондрий и реактивности иммунной системы при действии адаптогенов

Дипломная

Биология и генетика

В соответствии с вышесказанным, в планируемой работе, с целью поиска подходов к специфической модуляции гена PGC-1α, мы планировали решение серии взаимосвязанных задач методического и методологического плана. В частности, предполагалось освоение методик культивирования клеток человека для постановки in vitro экспериментов

Русский

2013-09-28

198.5 KB

4 чел.

Министерство образования и науки Российской Федерации

Московский Государственный Гуманитарный Университет имени М.А. Шолохова

Факультет экологии и естественных наук

Выпускная квалификационная работа
студентки 6 курса очно-заочного отделения
экологии и естественных наук факультета

Теняновой Варвары Александровны

на тему

«Транскриптомный анализ генов контроля генеза митохондрий и реактивности иммунной системы при действии адаптогенов»

Научный руководитель: Нурбеков М.К.
Рецензент:
Допущена к защите:

Москва - 2012


Содержание

[1] Введение

[1.1] Цель

[1.2] Задачи

[2] Глава 1. Обзор  литературы

[2.1] Мышцы. Состав и пластичность

[2.2] PGC-1 коактиваторы

[2.2.1] PGC-1 и окислительный метаболизм

[2.2.2] PGC-1 и типы волокон

[2.2.3] PGC-1 и физические упражнения

[2.2.4] PGC-1 и ангиогенез

[2.2.5] PGC-1 и болезнь

[2.3] Актуальные направления

[3] Глава 2.  Материалы  и  методы

[3.1] 2.1. Культивирование клеток

[3.2] 2.2. Выделение  РНК

[3.2.1] Выделение РНК из клеточной культуры  набором «YellowSolve»

[3.3] 2.4. Методика  ПЦР

[3.3.1] Проведение процедуры обратной транскрипции

[3.3.2] Проведение процедуры полимеразной цепной реакции

[3.4] Метод горизонтального электрофореза в агарозном геле.

[4] Результаты

[5] Выводы

[6] Список использованных источников

Список сокращений??


Введение

Основными органоидами энергетического обмена в животных клетках являются митохондрии. Их количество повышается при регулярной физической нагрузке. Этот процесс можно наблюдать в тканях скелетных мышц, сердечной мышце, печени, жировой и нервной ткани. При длительной гиподинамии происходит обратный процесс, в результате которого могут развиться такие заболевания как ожирение, диабет второго типа, атеросклероз и другие заболевания сердечно-сосудистой системы. В самом деле, физическая активность является одной из основных предпосылок для крепкого здоровья.

В  силу  вышесказанного, понимание молекулярных путей, лежащих в основе биогенеза митохондрий, представляет большой интерес. Значительный прогресс в раскрытии молекулярных механизмов, регулирующих синтез митохондрий был достигнут за последнее десятилетие. PGC-1 коактиваторы, по-видимому, играют ключевую роль, т.к. они запускают каскад процессов биогенеза митохондрий, и тем самым представляют большой интерес с точки  зрения  мышечной биоэнергетики. PGC-1α и PGC-1β очень сильно регулируют широкий спектр базовых генетических программ контроля обменных  процессов, в том числе активацию окисления жирных кислот, окислительное фосфорилирование, а также многочисленные сопутствующие активности, необходимые для поддержания функций митохондрий. Непосредственный  механизм  действия коактиватора PGC-1α  заключается в активации закодированных в ядре генов, вовлеченных в биогенез митохондрий  через  активацию не менее трех транскрипционных факторов. Эти факторы взаимодействуют и активируют регуляторные локусы у многих митохондриальных генов, закодированных в ядре. Гены окисления жирных кислот, который  является в значительной степени митохондриальным процессом, регулируются через  коактивацию ядерного PPARa рецептора. PGC-1α также активирует экспрессию митохондриальных факторов транскрипции. Эти факторы являются ключевыми регуляторами пролиферации и транскрипции митохондриального генома. Для  поддержания  функциональности  большинства  тканей  организма необходимо  поддерживать  на  оптимальном  высоком  уровне  активность  митохондрий,  которые  особенно  подвержены  повреждениям  и  являются  основным источником оксидативного стресса в клетках и организме. Как уже отмечалось, ключевым регулятором биогенеза и  функций  митохондрий  является  ген PGC-1α  и  его белковый  продукт.

Эффективный  контроль  биогенеза  митохондрий  критически  важен для поддержания  уровня  продукции  энергии, предотвращения  эндогенного  окислительного  стресса и,  в  конце  концов,  для  замедления  старения  организма. Следовательно, исключительно важным является поиск  различных  биологически  активных  соединений  и  препаратов,  способных тканеспецифически  активировать  указанный  ген  на  различных  уровнях и,  в  зависимости, от выявляемых тонких механизмов активирующего  действия  препаратов рекомендовать  их  для  различных  целей  общей  или  специфической активации функций митохондрий и регуляции  энергетического  метаболизма  в  клетках,  тканях  и  организме  человека.

В  соответствии с вышесказанным, в планируемой работе, с целью поиска  подходов к специфической модуляции гена PGC-1α, мы планировали  решение  серии  взаимосвязанных задач методического и  методологического  плана. В частности, предполагалось освоение методик культивирования  клеток человека для постановки in vitro экспериментов, методик получения   чистых и недеградированных препаратов РНК, пригодных для дальнейших  молекулярно-генетических процедур, включая ПЦР и ПЦР в реальном  времени. В конечном этапе дипломной работы предполагается  проведения  пробного  in vitro эксперимента  по  воздействию  выбранного  перечня  биологически  активных  препаратов (трекрезан,  кверцетин,  амарант,  дигидрокверцетин) на  функциональную  активность  гена  PGC-1α  по продуцируемой  в  культивируемых  клетках  специфической  мРНК

Цель

Провести всесторонний анализ регуляторной роли гена PGC-1α в контроле  метаболических процессов, отработать  и  оптимизировать методики получения препаратов  РНК из  культуры клеток, а также изучить  возможные подходы  к  специфической  модуляции  гена PGC-1α,   при действии различных биологически активных соединений.

В  частности  предполагалось  освоение  методик  культивирования  клеток  человека  для  постановки  in vitro  экспериментов,  методик  получения   чистых и  недеградированных препаратов  РНК,  пригодных  для   дальнейших  молекулярно-генетических  процедур,  включая  ПЦР  и  ПЦР  в  реальном  времени.  В  конечном  этапе  дипломной  работы  предполагается  проведения  пробного  in vitro эксперимента  по  воздействию  выбранного  перечня  биологически  активных  препаратов (трекрезан,  кверцетин,  амарант,  дигидрокверцетин) на  функциональную  активность  гена  PGC-1α  по продуцируемой  в  культивируемых  клетках  специфической  мРНК

Задачи

  1.  Подробный анализ роли гена PGC-1α в регуляции энергетических обменных процессов в различных тканях и влияние вариаций гена на склонность к распространенным патологиям.
  2.  Отработка и отладка методик получения препаратов  и РНК, пригодных для ПЦР-анализа из  культур клеток
  3.  Освоение и оптимизация методик анализа активности гена PGC-1α  через  специфическую  мРНК.
  4.  Предварительный анализ характера воздействия распространенных биологически активных соединений и адаптогенов на уровень активности гена PGC-1α.


Глава 1. Обзор  литературы

Мышцы преобразуют химическую энергию в физическую работу. Перечень физических активностей выполняемых мышцами широко варьирует, начиная от быстрого подъема тяжестей, заканчивая  постоянной,  без сбоев и нарушений, перекачкой крови в течение десятилетий. Более того, эти задачи меняются с течением времени. Чтобы приспособиться к этим меняющимся условиям, мышцы имеют разнообразный  состав и обладают высокой пластичностью: состав и функции мышц могут адаптироваться к внешним факторам, таким как различные  виды выполняемой активности или гормональным воздействиям. Это верно как в норме,  так  и  при патологии. Упражнения на выносливость, например, делают мышцы более адаптированными к окислительным обменным процессам и последние становятся более устойчивыми к утомлению. И наоборот, неупотребление и системные катаболические патологии приводят к атрофии, сопровождающейся глубокой потерей мышечной функции. В  силу  вышесказанного, понимание молекулярных путей, лежащих в основе этой пластичности,  представляет большой интерес.

Изменения в программах обмена веществ лежат в основе мышечной пластичности. Большой прорыв был сделан в течение последнего десятилетия в понимании молекулярных путей, которые направляют эти изменения. Транскрипционные коактиваторы PGC-1, в этой связи, представляют большой интерес с точки  зрения  мышечной биоэнергетики, потому что эти белки являются доминантными регуляторами окислительного метаболизма во многих тканях. PGC-1α и PGC-1β очень  сильно регулируют широкий спектр  базовых генетических программ  контроля обменных  процессов, в том числе активацию окисления жирных кислот, окислительное фосфорилирование, а также многочисленные сопутствующие активности, необходимые для поддержания функций митохондрий. Этот обзор будет посвящен роли PGC-1 коактиваторов в регуляции метаболизма мышц и обеспечения их  пластичности.

  1.  Мышцы. Состав и пластичность

Скелетные мышцы приобретают большую часть своей гетерогенности в процессе развития. Мышцы состоят из тысяч волокон, каждое из которых представляет  собой  синцитий сотен клеток простирающихся  от  одного сухожилия к другому. Физические активности, которые выполняют группы волокон или мышц колеблются от непрерывной, низкоуровневой активности, такой как поддержание позы, до внезапных всплесков интенсивной активности. Для достижения таких разнообразных функций, в мышцах существуют волокна с различными биоэнергетическими и биофизическими свойствами [1,2]. Есть четыре преобладающих типа волокон у скелетных мышц взрослых мышей: I, IIA, IIX и IIB, названных в соответствии с видами тяжелых цепей миозина (МНС), которые первично экспрессируются в  мышцах. АТФазы миозина управляют кинетикой актин/миозинового механизма  сокращений, а также активностью вспомогательных саркомерных белков и белков  сарколеммы, которые регулируют потоки ионов кальция в волокнах, MHC, таким образом, определяют биофизические свойства волокон. Волокна MHC типа IIB, исторически называются «быстрыми гликолитическими» (FG) волокнами, и способны к быстрым и мощным сокращениям,  обеспечивая быстрые вспышки активности. Это происходит за счет высоких уровней потребления АТФ, и больших и быстрых потоков ионов кальция. Волокна MHC типа I, исторически названные «медленными окислительными» (SO) волокнами, с другой стороны, обеспечивают более медленные физические  активности типа сокращение/релаксация, которые являются более энергетически эффективным. Волокна Типа I также богаты комплексом митохондриальных сетей, что способствует  преимущественному окислению жирных кислот, это является гораздо более эффективным источником АТФ, нежели анаэробный гликолиз. Волокна типа IIA и IIX, названные исторически «быстрыми окислительно-гликолитическими" (FOG) волокнами, имеют промежуточные биофизические свойства, но, как правило, также склонны быть окислительными и поэтому  они  богаты митохондриями.

Мышцы, содержащие преимущественно волокна типа I, IIA, и IIX волокна, таким образом, способны поддерживать стабильное снабжение АТФ, сохранять запасы гликогена, и обеспечивают устойчивость к  утомлению. Эти мышцы, такие как камбаловидная и глубокие икроножные, обеспечивают постоянные, но маломощные активности,  такие  как  простое движение. И наоборот, мышцы богатые волокнами типа IIB, такие как поверхностные четырехглавые мышцы быстро устают, но обеспечивают быстрые и мощные сокращения, полезные для спорадических всплесков интенсивной работы. У некоторых организмов, различные типы волокон распределены между отдельными мышцами. У птиц, например, окислительные волокна находятся почти исключительно в задних конечностях, где наблюдаются высокие концентрации миоглобина и цитохромов, что делает эти волокна красными (или коричневыми при кулинарной обработке и, следовательно, называются "темным мясом"). У наземных млекопитающих, более глубоко расположенные части мышц, как правило, богаче в содержании окислительных волокон, в соответствии с их ролью в ходьбе.

Хотя базовый состав типа волокон мышц во многом определяется во время развития, зрелые мышцы сохраняют высокий потенциал  пластичности [1,2]. Физическая активность, или отсутствие таковой, имеют особенно сильное значение. Тренировка на выносливость вызывает увеличение  содержания митохондрий, значительную активацию ангиогенеза, и переключение  типа  волокон «быстрые-медленные». Это приводит к улучшению выносливости и повышенной устойчивости к утомлению, что  характерно, например, для марафонцев. Силовые тренировки, с другой стороны, вызывают значительную гипертрофию мышц, трансформацию типа  волокон «медленные-быстрые», и переключение на использование гликолиза как предпочтительного источника энергии. Эти эффекты воспроизводились в течение длительного периода филогенеза, хотя степень пластичности значительно варьировалась в зависимости от вида организма  и  реализуемой программы физической  активности.

Серия элегантных, и теперь классических экспериментов, показала, что нервная регуляция является основным фактором, определяющим преобразования типов волокон [3]. Когда двигательные нервы, иннервирующих быстрые и медленные волокна взаимно заменяются, фенотипы волокон обращаются в течение нескольких недель (в том числе состав волокон и содержания митохондрий). Кроме того, тоновые низкочастотные электрические импульсы нервовьбыстро сокращающихся мышц приводят к превращению волокон по типу «быстрые-медленные». Таким образом, амплитуда и частота электрической стимуляции являются основным фактором, определяющим идентичность волокон. При этом, различные другие сигналы, прежде всего активность тироидных гормонов, накладываются друг на друга.

Заболевание может также оказать глубокое воздействие на скелетные мышцы. Патологическая атрофия мышц, или кахексия, часто сопровождается такими хроническими заболеваниями, как почечная недостаточность и сердечная недостаточность [4]. Отсутствие двигательной активности, как в случае длительного постельного режима, а также возрастной саркопении, уменьшает существенно как мышечную массу, так и функции.

Потеря мышечной иннервации, как это происходит при амиотрофическом боковом склерозе, также вызывает серьезную атрофию. Эти программы атрофии не просто обращают программы гипертрофии; при  этом специфические протеазы и ферменты, нацеленные, на белки-мишени вызывают протеосомную деградацию и активируются действием атрофических сигналов [5]. Интересно, что различные типы волокон проявляют различную чувствительность к атрофии; окислительные волокна, например, противостоят атрофии в условиях денервации.

Изменения в скелетных мышцах, в свою очередь, влияют на развитие и прогрессирование заболеваний. Наличие кахексии при хронических заболеваниях, таких как сердечная недостаточность, являлось  фактором, существенно ухудшающим прогноз [4]. Мышцы также являются основным депо для утилизации глюкозы из крови, и резистентность к инсулину в скелетных мышцах является одной из основных причин сахарного диабета второго типа. Тренировка на выносливость, а также связанные с этим изменения в мускулатуре, защищают от сердечно-сосудистых заболеваний, диабета II типа, а также ряда других заболеваний. В самом деле, физическая активность является одной из основных предпосылок для крепкого здоровья. Взаимодействие между пластичностью мышц и этими болезнями все еще недостаточно изучены. Тем не менее, значительный прогресс в раскрытии молекулярных механизмов, регулирующих мышечную пластичность был достигнут за последнее десятилетие. PGC-1 коактиваторы, по-видимому, играют ключевую роль в этом процессе.

  1.  PGC-1 коактиваторы

Коактиваторы это белки, которые связываются на транскрипционных факторах и вызывают изменения структуры хроматина и транскрипционного  комплекса, приводя к стимуляции экспрессии генов. Большинство факторов транскрипции, вероятно, связываются с одним или несколькими коактиваторами для инициации транскрипции. В последнее время коактиваторы стали важной мишенью физиологических стимулирующих  факторов и гормонов. PGC-1α является наиболее изученным примером такого рода регулируемых коактиваторов [6]. PGC-1α был впервые выявлен в качестве индуцируемого холодом PPAR-связывающего белка в буром жире. С тех пор стало очевидным, что PGC-1α может связываться и коактивировать, большинство членов семейства ядерных рецепторов, а также воздействовать на многие другие факторы транскрипции. Вполне вероятно, что PGC-1a приобретает большую часть своей специфичности, коактивируя различные транскрипционные факторы в различных контекстах.

PGC-1 активирует транскрипцию путем связывания набора из нескольких белков, имеющих гистон ацетилтрансферазную активность, в том числе CBP, p300, и SRC-1 [7], а также промежуточных  белков  комплекса MPC, который, как полагают,  обеспечивает  функционирование РНК-полимеразы II [8]. Кроме того, PGC-1α содержит РНК-связывающий мотив, RRM и подозревается  в  участии в процессинге многих мРНК, транскрипцию которых он инициирует [9]. Деятельность PGC-1α можно модулировать с помощью многочисленных посттрансляционных регуляторных сигналов, включая фосфорилирование p38 МАРК и AMPK [10, 11], ацетилированием гена долголетия SIRT1 [12], и метилирования [13]. PGC-1α имеет два структурных гомолога, PGC-1P и более отдаленные PGC-1 родственные коактиваторы (PRC), оба из которых были первоначально идентифицированы по гомологии последовательностей с PGC-1, и которые были менее изучены.

PGC-1 и окислительный метаболизм

PGC-1 коактиваторы имеют разнообразные биологические активности в различных тканях, включая мышцы, и большинство из этих активностей связаны с окислительным метаболизмом. Оба PGC-1α и р экспрессируются на высоких уровнях в тканях с окислительным метаболизмом, таких как сердце, мозг, почки и мышц. При эктопической экспрессии, PGC-1α и р индуцируют биогенез митохондрий и увеличение клеточного дыхания в культуре клеток. PGC-1α -/- и PGC-1 р -/-  мутантные экспериментальные животные имеют аномальные энергетики скелетной и сердечной мышц и у PGC-1α - / - мыши развивают быструю сердечную недостаточность при стрессе [14-17]. При трансгенной экспрессии в скелетных мышцах, как PGC-1α и PGC-1P вызывают заметную  стимуляцию митохондриального биогенеза [18-20].

Интенсивная индукция кислородсодержащих цитохромов и миоглобина приводит  к  тому, что обычно белые мышцы по всему телу трансгенных мышей становятся красными. Трансгенные мыши имеют существенно  возросшую окислительную мощность [20] и сопротивляемость к утомлению [18], и трансгенные мыши имели улучшенную спсобность  к  осуществлению   активностей,  требующим  аэробный тип  обмена [19,21].

Как PGC-1 активирует биогенез митохондрий изучено достаточно подробно (см. обзор в [6]). PGC-1 коактиваторы активируют закодированные в ядре гены, вовлеченные в биогенез митохондрий  через  коактивацию не менее трех транскрипционных факторов: NRF-1 и 2 и ERR. Эти факторы взаимодействуют и активируют регуляторные локусы у многих митохондриальных генов, закодированных в ядре. Гены окисления жирных кислот, который  является в значительной степени митохондриальным процессом, регулируются через  коактивацию ядерного PPARa рецептора. PGC-1α также активирует экспрессию Tfam и факторов B1 и B2 [6], эти факторы являются ключевыми регуляторами пролиферации и транскрипции митохондриального генома. Таким образом PGC-1 коактиваторы комплексно  управляют активацией сотни генов, закодированных в ядре, а также пролиферацией и транскрипцией митохондриального генома, каждый из которых имеет решающее значение для развития этих критически  важных и сложных органелл. Генетические исследования на мышах показали, что различные ткани лишенные либо PGC-1α, либо р имеют значительные дефекты в структуре  и  функциях  митохондрий, но животные по-прежнему имеют функциональные митохондрии [14-17]. Удаление обоих PGC-1 коактиваторов, испытаны до сих пор только в контексте бурых жировых клеток, приводит к почти полной потере митохондрий [22].

PGC-1 и типы волокон

В большинстве своих тканеспецифических ролей, PGC-1 коактиваторы увеличивают базовые программы биогенеза митохондрий и дыхания, а также вспомогательных программ, которые активируются вместе с повышением уровня дыхания в каждой ткани [6]. Экспрессия PGC-1α в белых жировых клетках, например, также придает им многие из свойств бурых жировых клеток, включая увеличение биогенеза митохондрий и экспрессии UCP-1. В печени, голодание вызывает индукцию PGC-1α, что приводит к глюконеогенезу и р-окислению жирных кислот. Аналогичным образом, PGC-1α не только активирует митохондриальные программы в скелетных мышцах, но также индуцирует гены, кодирующие белки миофибрилл, характерные  для окислительных волокон.

Мыши трансгенно экспрессирующие PGC-1α увеличивают долю волокон экспрессирующих MHC I и IIA [18], в то время как мыши, экспрессирующие PGC-1P почти полностью переключаются на окислительные типы волокон IIX [19]. PGC-1 коактиваторы таким образом осуществляют комплексную фенотипическую трансформацию, включая  базовые программы митохондриального биогенеза и вспомогательные маршруты  определяющие содержание миофибрилл.

Достоверно остается не совсем ясно, какие именно факторы транскрипции опосредуют активацию специфических для волокон генов коактиватором PGC-1α. Предполагается, что Mef2 семейство факторов транскрипции вовлечено в процесс   определения типа  волокон и  последние активируются через  физические упражнения [23]. В экспериментах на культуре клеток, PGC-1α коактивирует Mef2, с последующей индукцией генов волокон типа I, таких как тропонин I и миоглобин [18]. Тем не менее, PGC-1P является в равной степени активным индуктором Mef2 в этих тестах, однако PGC-1р имеет очень различающееся воздействие на состав волокон in vivo [19]. Очевидно, что  существуют  и другие факторы,  которые  должны обеспечивать специфичность этих программ. Одним из возможных кандидатов является PPARp, чувствительный к липидам ядерный рецептор. Мышце специфичное  удаление PPARp приводит  к  сдвигу  типа  волокон «медленные-быстрые»,  а  мышце - специфическая  суперэкспрессия PPARp имеет обратный эффект [24].  Совместное  воздействие коактиваторов PGC-1 и PPARp  на волокно-специфические промоторы, однако, не было достаточно изучено.

Важно подчеркнуть, что коактиваторы PGC-1, вероятно, не единственные  факторы  определяющие  тип волокна. Животные,  лишенные PGC-1 в скелетных мышцах имеют редуцированные  волокна типов I и IIa, но они сохраняют необходимое количество этих волокон [25]. Интересно, что животные лишенные PGC-1α по всему телу имеют нормальные количества  волокон типа I и IIA [14],  что  еще  раз подчеркивает наличие PGC-1-независимых компенсационных механизмов. Содержание волокон животных лишенных PGC-1  обоих  видов  (α или  Р) не сообщалось.

PGC-1 и физические упражнения

Тренировка на выносливость индуцирует биогенез митохондрий а и переключение  типов  волокон  «быстрые-медленные» волокна в скелетных мышцах. Как PGC-1α, так и р преимущественно экспрессируются в окислительных волокнах [18,19], а PGC-1α преимущественно экспрессируется в скелетных мышцах  богатых   волокнами типа I и IIA,  таких как камбаловидной или глубокой икроножной [18]. Экспрессия PGC-1α в  скелетных  мышцах человека и грызунов сильно индуцируется физической активностью (например, [26]), в то время как экспрессия PGC-1β остается  неизменной. Эти наблюдения, в сочетании со способностью PGC-1 индуцировать биогенез митохондрий и процесс переключения развития типов волокон, привели к положению о том, что PGC-1α опосредует действие множество геномных эффектов физических упражнений.

Если да, то какие  процессы  являются  предшествующими  действию PGC-1a? Целый ряд сигнальных маршрутов, активированных во время физических упражнений могут  влиять на PGC-1α. Сокращение мышц генерирует мощные потоки ионов кальция. Амплитуда и частота этих потоков активирует различные сигнальные маршруты, в том числе, регулируемые фосфатазой кальциневрина и кальмодулин-модулированной киназой, оба из которых могут влиять на экспрессию и активности PGC-1α. Кальциневрин, в частности, активизируется низкочастотными Са2+ переходами малой амплитуды типичными при  ходьбе или тренировках на выносливость. Трансгенная экспрессия кальциневрина в скелетных мышцах вызывает переключение  типа «быстрая-медленная», в волокнах  мышц [27]. И наоборот, у мышей, у которых изоформы кальциневрина были удалены, а также у животных или изолированных мышц подвергнутых  действию ингибиторов кальциневрина, проявляют либо потерю медленных волокон или блокирование  процесса зависимого  от  физической  активности  переключения  фенотипа  волокон  по  типу «быстрые-медленные» [28]. Поэтому вероятно, что эффект кальциневрина на экспрессию генов происходит в значительной степени через PGC-1α. Это может отчасти происходить посредством  активации  транскрипционного  фактора  Mef2, известной  мишени Са2+ сигнальных  маршрутов. Физическая  активность стимулирует  активность Mef2 [23], и  индукция PGC-1α промотора при сокращение требует наличия нетронутых сайтов связывания Mef2 [29].

Упражнения  также  влияют  на уровни  высокоэнергетических фосфатов, таких как АТФ и АДФ, что приводит к активации AMФ зависимых АМФ-киназ (AMPK) [30]. В последнее время предполагается, что AMPK был вовлечены в трансформацию волокон и в биогенез  митохондрий индуцированный физическими упражнениями и другими стимулами [31]. По крайней мере, некоторые из геномных эффектов AMPK в скелетных мышцах происходят через PGC-1α, что предполагает способность PGC-1α к трансдукции вызванных физической активностью осуществлением AMPK сигналов. Адренергическая система, через циклическую AMФ и через другие вторичные мессенджеры, а также, вероятно, вносит свой вклад в осуществление опосредованных  упражнениями пластичности скелетных мышц. P-адренергическая стимуляция вызывает мощную экспрессию PGC-1α в скелетных мышцах, а  р-адренергические антагонисты частично блокировали индукцию PGC-1а при упражнениях.

Также было показано,  что  p38 МАРК, активируется упражнениями и, вероятно, вносит свой вклад в резкую индукцию экспрессии PGC-1α. Кроме того, p38 МАРК непосредственно фосфорилирует PGC-1α в культуре клеток, приводя к стабилизации как белка PGC-1α,  так  и  диссоциацию от p160myb репрессора [10,11], хотя  остается  показать происходит ли это в скелетных мышцах в ответ на упражнения. Продукция активных форм кислорода (АФК) увеличивается во время физических упражнений  и АФК может приводить  к  индукции PGC-1α, из  этого  следует,  что АФК может  служить  в  качестве  стимулятора PGC-1α через  физические  упражнения. Наконец, гипоксия,  как уже давно предполагается, является стимулом для генетических изменений в ходе прерывистых, но достаточно интенсивных упражнений, а PGC-1 является индуцируемым гипоксией фактором в клетках скелетной мускулатуры [32]. Влияние всех этих путей на PGC-1р не изучена в должной степени.

PGC-1, таким образом, видимо является важным связующим звеном для передачи внеклеточной информации в изменения экспрессии генов. Представляется весьма вероятным, что, по крайней мере, некоторые из этих путей влияют на экспрессию или функции PGC-1α (или PGC-1P) во время физических упражнений, способствуя, в свою очередь, последующим фенотипическим изменениям, включая биогенез митохондрий, переключения типов волокон и ангиогенез (см. ниже). Формально демонстрация этой идеи потребует получения мышей, лишенных PGC-1α. PGC-1α -/- мыши гиперактивны и худы, и, следовательно, трудно изучить механизм без решения  сопутствующих многочисленных вопросов [22]. Мыши, лишенные PGC-1α специфично в скелетных мышцах имеют умеренно сниженный  уровень  тренированности [25], но эффект тренировки на выносливость у этих мышей не проявлялся. Мыши, лишенные как PGC-1 и PGC-1 р, если и  были  бы жизнеспособны, также представляли бы большой интерес.

PGC-1 и ангиогенез

Заболевания периферических сосудов является ведущей причиной смертности и наиболее распространенной причиной ампутации конечностей в промышленно развитых странах. Хроническая ишемия может оказать глубокое воздействие на мышечную систему. Так  как  окислительное фосфорилирование на сегодняшний день является наиболее эффективным способом продукции АТФ в мышцах, надежный биосинтез АТФ в мышцах жизненно зависит от степени эффективности  доставки  кислорода  и питательных  веществ. Ангиогенез,  в   связи   с  этим,   является   критически  важным гомеостатическим ответом на хроническую ишемию. Ангиогенез представляет собой сложный процесс, посредством которого новые кровеносные сосуды формируются из предсуществующих сосудов [33]; он отличается от васкулогенеза представляющего формирование судов de novo во время эмбриогенеза. Процесс в значительной степени координируется растворимыми факторами, происходящими из тканей, нуждающихся в неоваскуляризации. VEGF  является наиболее изученным из этих факторов, является мощным активатором пролиферации эндотелия, проницаемости и миграции, а также имеет решающее значение для почти всех форм неоваскуляризации. Ангиогенный ответ на ишемию, однако, часто недостаточен, поэтому огромные усилия  посвящены  тому, чтобы найти способы  стимуляции  ангиогенеза  при  ишемических тканях.

Предметом интенсивного изучения в течение десятилетий  является проблема  раскрытия  комплекса  регулирующих  функции  генов  сигналов,  реально   управляющих  процессами  ангиогенеза.  Лучше  всего  понятым  является процесс с участием гипоксия индуцируемого транскрипционного фактора-1а (HIF-1a). В присутствии кислорода, HIF-1а тормозится гидроксилированием и является мишенью направленной деградации в присутствии кислорода [34]. Низкий уровень кислорода останавливает эти процессы, и стабилизированный HIF-1a фактор гетеродимеризуется с распространенным HIF-1P для активации ряда генов, участвующих в гипоксическом ответе. Среди них VEGF и других растворимых факторов, которые координируют сильный ангиогенных ответ на гипоксию.

В  последнее  время  установлено,  что PGC-1a является важным и новым индуктором ангиогенеза в скелетных мышцах [32]. PGC-1a сильно стимулирует экспрессию VEGF, а также другие ангиогенные факторы, такие как PDGFB и ангиопоэтин 2, в культуре клеток мышцы и скелетных мышцах  in  vivo. Трансгенная экспрессия PGC-1a в скелетных мышцах резко увеличивает плотность капилляров. Кроме того, PGC-1а индуцируется  при недостатке питательных веществ и кислорода, а полная индукция VEGF в этих условиях требует активности PGC-1a. Это позволило предположить, что PGC-1a может играть  важную роль в ангиогенном ответе на ишемию. В самом деле, PGC-1a  -/- мыши показывают поразительную неспособность нормально восстанавливать ток крови к конечности после ишемического инсульта. И наоборот, PGC-1а трансгенез ускоряет восстановление кровотока в конечности при ишемии. Эти результаты существенно  усиливают  вероятность вовлеченности PGC-1а в регуляцию ангиогенеза в мышцах в ответ на ишемию. Удивительно, но механизм, посредством которого PGC-1а вызывает индукцию  VEGF, по-видимому, не включают  канонические HIF маршруты. Вместо этого, PGC-1a коактивирует орфановые ядерные рецепторы ERRa как  на уровне промотора,  так  и вновь открытых энхансерах в первом интроне гена VEGF [32]. Таким образом, PGC-1 и ERRa контролируют новые, HIF-независимые ангиогенные маршруты, которые доставляют необходимый кислород и субстраты в условиях ишемии.

Вполне вероятно, что PGC-1 также играет важную роль в ангиогенезе в физиологических условиях, в дополнение к патологической ишемии. Микрососудистая плотность, максимальный поток крови, и окислительный потенциал удивительно связаны в скелетных мышцах при нормальных условиях. Мышцы с окислительным обменом содержат богатые капиллярные сети и большое  количество капилляров примыкают к окислительным нежели к гликолитическим волоконам. На самом деле, соотношение поверхности капилляров, к  поверхности внутренних мембран митохондрий в том или ином типе волокна, поддерживается  достаточно  точно на уровне 1:200 [33]. Предполагается, что эта тесная связь отражает возросшую необходимость доставки кислорода к митохондриям, и  сниженную эффективную длину диффузии, образованную наличием метаболически активных митохондрий.

Для поддержания этого жесткого соответствия, упражнения на выносливость и стимулируют ангиогенез в скелетных мышцах, чтобы обеспечить ускорившийся биогенез митохондрий [35]. Кроме того, хроническая электрическая стимуляция «быстрых» мышц на частоте соответствующей  обычным  природным  условиям  для медленных мышц  приводит к резкому возрастанию плотности капилляров,  с одновременным увеличением окислительной мощности. В  настоящее  время  мало  данных существуют для полного  понимания молекулярных механизмов лежащих в основе этого процесса. Как уже говорилось, экспрессия PGC-1a сильно индуцируется физической нагрузкой у грызунов и у людей, и PGC-1 является мощным индуктором  митохондриального биогенеза и ангиогенеза в скелетных мышцах [20, 32]. Похоже, таким образом, что PGC-1а играет ключевую роль как в вызванной физическими  упражнениями  ангиогенезе так  и  в  пролиферации  митохондрий, таким образом, тесно координируя доставку кислорода и питательных веществ с их потреблением в митохондриях. Это еще предстоит доказать.

PGC-1 и болезнь

Большая масса белков, входящих в состав миофибриллярного аппарата скелетных мышц является важным резервуаром для аминокислот в организме. Этот резервуар может быть использован для энергетических потребностей в случае  необходимости, такие как длительное голодание, или при различных патологических состояниях, таких как рак, сепсис, а также почечная и сердечная недостаточности. В то время как распад белков нормален в ответ на длительное голодание, истощение и кахексия, связанные с хроническими заболеваниями могут быть изнурительными. В самом деле, утрата скелетных мышц является плохим прогностическим фактором во многих хронических заболеваний, таких как рак и сердечная недостаточность. Разрушение миофибриллярных белков инициируется, по крайней мере частично, набором Е3-убиквитин лигаз, в том числе и Murf1 Atrogin-1/MAFbx, которые  нацеливают  на  белки подвергающиеся деградации протеосомами [5]. Экспрессия этих лигаз сильно индуцируется при различных катаболических состояниях, как физиологических,  так и патологических, через транслокацию фактора транскрипции FoxO3 в ядро, где  последний активирует гены Murf1 и Atrogin-1. Анаболические сигналы, такие как инсулин или инсулиновый фактор роста противодействуют этому процессу.

Давно было известно, что различные мышечные волокна имеют различную чувствительность к катаболическим сигналам. Гликолитические волокна, например, атрофируются быстрее во время голодания или сепсиса, чем окислительные волокна. Наоборот, физическая активность является одним из самых эффективных способов предотвращения потери мышечной массы при патологическом катаболизме. Такие катаболические состояния, как рак, сепсис и почечная недостаточность, сильно подавляют экспрессию PGC-1а в скелетных мышцах in vivo [36], в то время как упражнение увеличивают уровень PGC-1a. Эти наблюдения  позволили предположить, что PGC-1a может защищать  организм от атрофии. Денервация задних конечностей мыши приводит к заметной атрофии -  моделирование потери  мышц,  наблюдающееся  при заболеваниях мотонейронов человека,  таких как ALS. Трансгенная экспрессия PGC-1a в скелетных мышцах полностью блокировала этот атрофический ответ [37]. Кроме того, атрофии могут быть вызваны прямой доставкой гена конститутивно  активного FoxO3 в скелетных мышцах, тем самым индуцируя Murf1 и Atrogin-1. Опять же, одновременное  внедрение PGC-1а полностью блокировало атрофию в этой ситуации [37].

PGC-1а может также защитить от миопатии, вызванной  препаратами  и наркотиками. Статины широко используются для лечения повышенного холестерина, однако распад мышц является их самым значительным, а иногда и смертельным, побочный эффектом. Обработка клеток или лечение животных статинами индуцирует атрофические программы, включая экспрессию Atrogin-1 [38]. Поразительно, что повышенная экспрессия PGC-1а сильно блокировала индукцию Atrogin-1 и также последующего повреждения мышц в данном  случае [38]. Таким образом, по-видимому,  PGC-1а, обладает мощной анти-атрофической функцией.

Как экспрессия PGC-1a регулируется в катаболических состояниях, и как PGC-1a защищает от атрофии, остаются неясными. PGC-1а, в  норме  являясь, мощным коактиватором транскрипции, в данном случае эффективно подавляет активность FoxO3 на Murf1 и Atrogin-1 генов. Наличие избыточной экспрессии PGC-1 снижает степень  связывания FoxO3 на промотере Atrogin-1 [37], что предполагает  отсутствие у PGC-1а функции прямого ингибитора транскрипции. Иннервация является мощным анаболическим сигналом, а PGC-1a вызывает индукцию  образования компонентов нервно-мышечного соединения (NMJ) [39]. PGC-1, поэтому может частично блокировать катаболические сигналы косвенно за счет увеличения анаболических сигналов через NMJ. Кроме того, биогенез митохондрий индуцированный PGC-1а может объяснять часть защиты за счет улучшения Са2+  ионных  потоков и/или энергетики клетки.

PGC-1a также обеспечивает защиту от мышечной дистрофии. Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является универсальным смертельным заболеванием вызываемыми мутациями в гене дистрофина. Отсутствие дистрофина приводит к дегенерации скелетной и сердечной мышц, и неизбежной смерти в  раннем  возрасте. Мыши, дефицитные по гену дистрофина (MDX мыши) повторяют многие из признаков МДД. Поразительно, что трансгенная экспрессия PGC-1а у MDX мышей существенно  замедляет дегенерацию мышц и улучшает мышечную функцию [39]. Опять же, не совсем ясно, как PGC-1a защищает от дистрофии. Некоторые механизмы, вероятно, частично перекрываются с анти-атрофическими программами. PGC-1 также вызывает стимуляцию утрофина, гомолога дистрофина, который может компенсировать отсутствие дистрофина [39].

Скелетные мышцы являются первичным органом  утилизации глюкозы в ответ на инсулин, и мышечное  противодействие действию инсулина является одним из основных причинных факторов диабета типа II. Роль PGC-1а в резистентности к инсулину является комплексной. PGC-1a стимулирует GLUT4, основной транспортера глюкозы в скелетных мышцах [40]. Экспрессия генов обоих коактиваторов PGC-1, а также суммарная  программа окислительного фосфорилирования скоординированно  репрессируется в скелетных мышцах у пациентов с сахарным диабетом II типа. Поразительно, что это верно даже  для членов семьи, не  затронутых  болезнью, что предполагает раннюю,  причинно-следственную связь. С другой стороны, мыши трансгенно экспрессирующие PGC-1а в скелетной мышце, не чувствительны к инсулиновой сигнализации [21], и мыши, лишенные PGC-1a в скелетных мышцах не устойчивы к действию инсулина [22, 41]. Роль PGC-1 в мышечной инсулинорезистентности, таким образом,  остается  не  до  конца  понятой. Интересно, что  отсутствие  PGC-1 в скелетной мускулатуре действительно приводит к поджелудочной р-клеточной дисфункции и низкому уровню инсулина [41]. Это подразумевает существование важного, PGC-1-зависимого, перекрестного  сигнального  сообщения между мышечными и р-клетками. Как это происходит, не ясно, однако, наличие низкого  уровня  воспаления у мышей, лишенных PGC-1 в скелетной мышце может объяснять некоторые из  наблюдавшихся эффектов [41].

  1.  Актуальные направления

Многие оставшиеся без ответа вопросы явно требуют к  себе внимания. Хотя многие маршруты могут быть  связаны  с  экспрессией  или  активностью PGC-1а или активности, которые из них действуют в скелетных мышцах в ответ на внешние сигналы, пока неясно. Например, как лишение кислорода и питательных веществ индуцирует PGC-1a, а именно то  какие  маршруты   индуцируют PGC-1а во время упражнений остается лишь отчасти понятным. Как PGC-1а интегрирует эти многочисленные поступающие сигналы, также нуждается в дальнейшем исследовании. Например, недостаток кислорода / питательных веществ каким-то образом вызывает   индукцию PGC-1  и активирует ее ангиогенные программы, но не биогенез митохондрий. Пост-трансляционная модификации PGC-1, вероятно, играют важную роль. Предполагается что роль PGC-1а в тренировке выносливости   заключается  в  индукции ангиогенеза и биогенеза митохондрий и преобразования типов волокон, что также ожидает официального подтверждения. Наконец, воздействия, которые производит  PGC-1a на мышцы, по-видимому, имеют существенное влияние на отдаленные ткани, и что представляют  собой эти эффекты, и как происходит взаимное  сообщение органов, только начинают рассматриваться. Возможно, особенно  заманчивой является противовоспалительная роль PGC-1 [41].

Несмотря на множество безответных вопросов, ясно то, что мощные способности PGC-1a и P к перепрограммированию многочисленных аспектов  функционирования скелетных мышц. Улучшение физической формы, индукция ангиогенеза и защиты от атрофии и дистрофии особенно важны. Способность PGC-1  к  комплексному  управлению крупных программ экспрессии генов делает их привлекательными узловыми точками для фармацевтического вмешательства. Например, клинические испытания на человеке,  использования VEGF для лечения хронической ишемии нижних конечностей дали неутешительный результат [33], вероятно, отчасти потому, что VEGF в одиночку не способна генерировать полностью функциональные сосуды.  PGC-1a, с другой стороны, по-видимому активирует  полномасштабную  и  комплексно  управляемую  программу  ангиогенеза, включая  индукцию VEGF  а  также  ряд  ангиогенных  факторов,  таких  как ангиопоэтин 2  и PDGFB [32]. Таким  образом,  независимо  от  своей  роли  в  обеспечении  физиологичной  мышечной  пластичности, препараты,  которые  индуцируют  какой  либо  из  коактиваторов PGC-1,  могут  улучшить  множество  мышечных  патологий, от  периферических  патологий  сосудов  до  миодистрофии  Дюшенна. Интенсивные  исследования  подобных  препаратов  усиленно  осуществляются.


Глава 2.  Материалы  и  методы

2.1. Культивирование клеток

Реактивы:

  1.  Среда для культивирование DMEM
  2.  Фосфатно-солевой буфер
  3.  0,05% раствор трипсина
  4.  Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)
  5.  РНК-сохраняющий раствор EverFresh

Оборудование:

Ход работы:

Культивация клеток проводилась в испытательной лаборатории биологической активности и токсикологической безопасности ОАО «Завод экологической техники и экопитания ДИОД»

Для получения образцов РНК использовалась культура клеток Hela. Клетки HeLa  культивировали в среде DMEM с 0,3 мг/мл L-глутамина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Cibro BRL, США), 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в контролируемых условиях (+370С, 5% СО2) в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см2 (посевная концентрация 1х106 клеток/флакон).

Непосредственно перед тестированием клеточный монослой 2 раза промывали фосфатно-солевым буфером без ионов кальция и магния, после чего заливали на 5 минут 0,05% раствором трипсина (1 мл раствора на флакон). Затем инактивировали трипсин средой для культивирования клеток DMEM, осторожно пипетировали клетки в среде до образования однородной суспензии. После чего клетки осаждали центрифугированием (5 мин 400 g). После этого клетки еще 2 раза отмывали в охлажденном растворе фосфатно-солевого буфера и ЭДТА (+4°С).

Жизнеспособность клеток оценивалась окраской 0,4% трипанового синего. Суспензию клеток разводили до концентрации 1х107 кл/мл (подсчет клеток осуществлялся в камере Горяева). Хранение клеток возможно при температуре +4°С не более 3 часов.

Для лучшего сохранения РНК суспензия клеток заливалась тройным объемом раствора EverFresh.

2.2. Выделение  РНК

Выделение РНК и ПЦР проводились в лаборатории экологического биомониторинга МГГУ им. М.А.Шолохова.

Работа проводилась в резиновых перчатках во избежание попадания Рназ кожи рук в препараты ДНК.

Стеклянная посуда была прокалена при +1600С в течении 4часов. Пластиковая посуда автоклавировалась в дистиллированной воде.

Клетки для исследования транспортировались в РНК-сохраняющем растворе EverFresh в соотношении 1:3. Перед началом выделения РНК клетки осаждались центрифугированием, супернатант удалялся.

Выделение РНК из клеточной культуры  набором «YellowSolve» 

Реактивы:

  1.  Лизирующий раствор YellowSolve
  2.  Хлороформ
  3.  Депротеинизирующий раствор GгееnСlеап
  4.  Этиловый спирт 96%
  5.  Этиловый спирт 80%

Оборудование:

Ход работы:

Суспензию культуры клеток гомогенезировали в 1 мл лизирующего раствора YellowSolve до полного исчезновения комочков клеточного материала. 100мкл суспензии содержали приблизительно10млн клеток.

Лизат центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин для удаления возможных примесей внеклеточного материала, полисахаридов и пр. Прозрачный супернатант переносили в чистую пробирку.

К супернатанту добавляли 0.1 мл хлороформа, после чего  энергично перемешивали смесь на вортексе и оставляли на столе на 20 минут, встряхивая пробирку примерно каждые 5 минут. При стоянии содержимое пробирки расслаивалось на две фазы. По истечении 20 минут центрифугировали пробирку 5 минут при 12 тыс. об/мин. Образовывалось 2 слоя жидкости. Верхний слой переносили в чистую пробирку, т.к. в нем содержалась РНК. К отобранному верхнему слою добавляли равный объем депротеинизирующего фенолсодержащего раствора GгееnСlеап и энергично встряхивали смесь на вортексе 2-3 минуты, после чего центрифугировали 5 минут при 12 тыс. об/мин.

После центрифугирования снова переносили верхний слой жидкости, содержащей РНК в чистую пробирку, замеряя её объем. Добавляли двойной объем 96%-ного этанола и хорошо перемешивали содержимое пробирки. После чего пробирка помещалась в штатив на 20-30 минут при температуре -200С для формирования осадка РНК. РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин, после чего отбирался спиртовой супернатант и осторожно, по стенке пробирки, к осадку РНК добавляли 0,5мл 80%-ного этанола.  Снова РНК осаждалась центрифугированием при 12 тыс. об./мин. в течение 10-20 мин. Спиртовой супернатант максимально удалялся из пробирки

Все дальнейшие процедуры проводились при температуре +40С. Растворяли осадок РНК в воде, затем отбирали аликвоту и определяли концентрацию РНК спектрофотометрически. Оценивали нативность РНК электрофорезом в 1.2-1.5%-ной агарозе, приготовленной на х1-ном ТВЕ и содержащей 0.3 мкг/мл бромистого этидия.

Препарат РНК можно хранить замороженным в воде при температуре –200С или ниже. Предпочтительно хранение в виде спиртового осадка при температуре –200С

2.4. Методика  ПЦР

 Проведение процедуры обратной транскрипции

На этом этапе в результате проведения процедуры обратной транскрипции мы получали полноразмерную первую цепь комплиментарной ДНК (кДНК) из выделенной ранее матрицы мРНК.

В качестве праймера были выбраны случайные гексонуклеотиды. Они неспецифически связываются на мРНК, нарабатывая короткие кДНК практически по всей матрице мРНК. Такие праймеры подходят для изучения всей последовательности мРНК, особенно 5` район.

Реактивы:

  1.  M-MLV обратная транскриптаза
  2.  х10-кратный ОТ буфер для фермента
  3.  2,5 mM смесь dNTP
  4.  Гексапраймеры
  5.  Вода, свободная от Рназ

Ход работы:

Все манипуляции проводятся на льду, т.е. при температуре +40С.

В пробирке смешали 5 мкл полученной ранее мРНК, 1мкл случайного гексапраймера и довели объем смеси до 18 мкл водой, свободной от РНаз. Перемешивали и осаждали капли кратковременным центрифугированием.

Смесь инкубировалась 5 минут при +700С, после чего пробирка переносилась в лед. Капли собирались кратковременным центрифугированием.

На льду в пробирку добавляли следующие компоненты: 0,5мкл M-MLV обратной транскриптазы, 2,5мкл х10-кратного ОТ буфера для фермента, 4мкл 2,5mM смесь dNTP. После чего смесь инкубировалась сначала 10 минут при температуре +250С, затем в течении 1 часа при температуре +370С. Реакция останавливалась путем нагревания смеси до +700С на протяжении 10 минут, после чего смесь переносили в лед.

Синтезированная кДНК может быть сразу использована для ПЦР или синтеза второй цепи и последующего клонирования. Кроме того, полученный материал можно хранить при температуре –200С и ниже. Мы проводили ПЦР в день выделения РНК и синтеза кДНК, для того чтобы максимально сохранить полученный материал.

Проведение процедуры полимеразной цепной реакции

Реактивы:

  1.  х10-кратный Taq буфер
  2.  2,5 mM смесь dNTP
  3.  ColoredTaq полимераза
  4.  кДНК матрица
  5.  Праймер 1
  6.  Праймер 2
  7.  Вода, свободная от РНаз
  8.  Минеральное масло

Оборудование: халат, перчатки, стерильные пробирки для ПЦР и наконечники для пипеток, термостат-охладитель «Термо 4-99», центрифуга, амплификатор «Терцик»

Ход работы:

В пробирке для проведения ПЦР смешали следующие компоненты: 2,5мкл х10-кратного Taq буфера, 2мкл 2,5 mM смеси dNTP, 0,5мкл ColoredTaq полимеразы, 2мкл кДНК матрицы, по 1мкл праймеров 1 и 2. Объем полученной смеси довели до 25мкл водой, свободной от РНаз. Перемешали и осадили капли кратковременным центрифугированием.

Поверх смеси наслоили 30мкл минерального масла для того чтобы она не испарялась. Пробирку поместили в амплификатор. Сколько времени и какой режим? 

Амплификат хранится при температуре –200с и ниже.

Метод горизонтального электрофореза в агарозном геле.


Результаты

Выводы

Список использованных источников

  1.  Pette D. The adaptive potential of skeletal muscle fibers. Can J Appl Physiol 2002;27:423-448. [PubMed: 12442355].
  2.  Schiaffino S, Sandri M, Murgia M. Activity-dependent signaling pathways controlling muscle diversity and plasticity. Physiology (Bethesda) 2007;22:269-278. [PubMed: 17699880].
  3.  Pette D, Vrbova G. What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity? Muscle Nerve 1999;22:666-677. [PubMed: 10366220]
  4.  Anker SD, Steinborn W, Strassburg S. Cardiac cachexia. Ann Med 2004;36:518-529. [PubMed: 15513302].
  5.  Cao PR, Kim HJ, Lecker SH. Ubiquitin-protein ligases in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol 2005;37:2088-2097. [PubMed: 16125112].
  6.  Lin J, Handschin C, Spiegelman BM. Metabolic control through the PGC-1 family of transcription coactivators. Cell Metab 2005;1:361-370. [PubMed: 16054085].
  7.  Puigserver P, Adelmant G, Wu Z, Fan M, Xu J, O'Malley B, Spiegelman BM. Activation of PPARgamma coactivator-1 through transcription factor docking. Science 1999;286:1368-1371. [PubMed: 10558993].
  8.  Wallberg AE, Yamamura S, Malik S, Spiegelman BM, Roeder RG. Coordination of p300-mediated chromatin remodeling and TRAP/mediator function through coactivator PGC-1alpha. Mol Cell 2003;12:1137-1149. [PubMed: 14636573].
  9.  Monsalve M, Wu Z, Adelmant G, Puigserver P, Fan M, Spiegelman BM. Direct coupling of transcription and mRNA processing through the thermogenic coactivator PGC-1. Mol Cell 2000;6:307-316. [PubMed: 10983978].
  10.  Fan M, Rhee J, St-Pierre J, Handschin C, Puigserver P, Lin J, Jaeger S, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Spiegelman BM. Suppression of mitochondrial respiration through recruitment of p160 myb binding protein to PGC-1alpha: modulation by p38 MAPK. Genes Dev 2004;18:278-289. [PubMed: 14744933].
  11.  Puigserver P, Rhee J, Lin J, Wu Z, Yoon JC, Zhang CY, Krauss S, Mootha VK, Lowell BB, Spiegelman BM. Cytokine stimulation of energy expenditure through p38 MAP kinase activation of PPARgamma coactivator-1. Mol Cell 2001;8:971-982. [PubMed: 11741533].
  12.  Gerhart-Hines Z, Rodgers JT, Bare O, Lerin C, Kim SH, Mostoslavsky R, Alt FW, Wu Z, Puigserver P. Metabolic control of muscle mitochondrial function and fatty acid oxidation through SIRT1/ PGC-1alpha. Embo J 2007;26:1913-1923. [PubMed: 17347648].
  13.  Teyssier C, Ma H, Emter R, Kralli A, Stallcup MR. Activation of nuclear receptor coactivator PGC-1alpha by arginine methylation. Genes Dev 2005;19:1466-1473. [PubMed: 15964996].
  14.  Arany Z, He H, Lin J, Hoyer K, Handschin C, Toka O, Ahmad F, Matsui T, Chin S, Wu PH, et al. Transcriptional coactivator PGC-1 alpha controls the energy state and contractile function of cardiac muscle. Cell Metab 2005;1:259-271. [PubMed: 16054070].
  15.  Sonoda J, Mehl IR, Chong LW, Nofsinger RR, Evans RM. PGC-1beta controls mitochondrial metabolism to modulate circadian activity, adaptive thermogenesis, and hepatic steatosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:5223-5228. [PubMed: 17360356].
  16.  Lelliott CJ, Medina-Gomez G, Petrovic N, Kis A, Feldmann HM, Bjursell M, Parker N, Curtis K, Campbell M, Hu P, et al. Ablation of PGC-1beta results in defective mitochondrial activity, thermogenesis, hepatic function, and cardiac performance. PLoS Biol 2006;4:e369. [PubMed: 17090215].
  17.  Vianna CR, Huntgeburth M, Coppari R, Choi CS, Lin J, Krauss S, Barbatelli G, Tzameli I, Kim YB, Cinti S, et al. Hypomorphic mutation of PGC-1beta causes mitochondrial dysfunction and liver insulin resistance. Cell Metab 2006;4:453-464. [PubMed: 17141629].
  18.  Lin J, Wu H, Tarr PT, Zhang CY, Wu Z, Boss O, Michael LF, Puigserver P, Isotani E, Olson EN, et al. Transcriptional co-activator PGC-1 alpha drives the formation of slow-twitch muscle fibres. Nature 2002;418:797-801. [PubMed: 12181572].
  19.  Arany Z, Lebrasseur N, Morris C, Smith E, Yang W, Ma Y, Chin S, Spiegelman BM. The transcriptional coactivator PGC-1beta drives the formation of oxidative type IIX fibers in skeletal muscle. Cell Metab 2007;5:35-46. [PubMed: 17189205].
  20.  Wende AR, Schaeffer PJ, Parker GJ, Zechner C, Han DH, Chen MM, Hancock CR, Lehman JJ, Huss JM, McClain DA, et al. A role for the transcriptional coactivator PGC-1alpha in muscle refueling. J Biol Chem 2007;282:36642-36651. [PubMed: 17932032].
  21.  Calvo JA, Daniels TG, Wang X, Paul A, Lin J, Spiegelman BM, Stevenson SC, Rangwala SM. Muscle-specific expression of PPAR{gamma} coactivator-1 {alpha} improves exercise performance and increases peak oxygen uptake. J Appl Physiol 2008;104:1304-1312. [PubMed: 18239076].
  22.  Lin J, Wu PH, Tarr PT, Lindenberg KS, St-Pierre J, Zhang CY, Mootha VK, Jager S, Vianna CR, Reznick RM, et al. Defects in adaptive energy metabolism with CNS-linked hyperactivity in PGC-1alpha null mice. Cell 2004;119:121-135. [PubMed: 15454086].
  23.  Wu H, Rothermel B, Kanatous S, Rosenberg P, Naya FJ, Shelton JM, Hutcheson KA, DiMaio JM, Olson EN, Bassel-Duby R, et al. Activation of MEF2 by muscle activity is mediated through a calcineurin-dependent pathway. Embo J 2001;20:6414-6423. [PubMed: 11707412].
  24.  Luquet S, Lopez-Soriano J, Holst D, Fredenrich A, Melki J, Rassoulzadegan M, Grimaldi PA. Peroxisome proliferator-activated receptor delta controls muscle development and oxidative capability. Faseb J 2003;17:2299-2301. [PubMed: 14525942].
  25.  Handschin C, Chin S, Li P, Liu F, Maratos-Flier E, Lebrasseur NK, Yan Z, Spiegelman BM. Skeletal muscle fiber-type switching, exercise intolerance, and myopathy in PGC-1alpha muscle-specific knock-out animals. J Biol Chem 2007;282:30014-30021. [PubMed: 17702743].
  26.  Baar K, Wende AR, Jones TE, Marison M, Nolte LA, Chen M, Kelly DP, Holloszy JO. Adaptations of skeletal muscle to exercise: rapid increase in the transcriptional coactivator PGC-1. Faseb J 2002;16:1879-1886. [PubMed: 12468452].
  27.  Naya FJ, Mercer B, Shelton J, Richardson JA, Williams RS, Olson EN. Stimulation of slow skeletal muscle fiber gene expression by calcineurin in vivo. J Biol Chem 2000;275:4545-4548. [PubMed: 10671477].
  28.  Parsons SA, Millay DP, Wilkins BJ, Bueno OF, Tsika GL, Neilson JR, Liberatore CM, Yutzey KE, Crabtree GR, Tsika RW, et al. Genetic loss of calcineurin blocks mechanical overload-induced skeletal muscle fiber type switching but not hypertrophy. J Biol Chem 2004;279:26192-26200. [PubMed: 15082723].
  29.  Akimoto T, Li P, Yan Z. Functional interaction of regulatory factors with the Pgc-1 {alpha} promoter in response to exercise by in vivo imaging. Am J Physiol Cell Physiol. 2008.
  30.  Sakamoto K, Goodyear LJ. Invited review: intracellular signaling in contracting skeletal muscle. J Appl Physiol 2002;93:369-383. [PubMed: 12070227].
  31.  Zong H, Ren JM, Young LH, Pypaert M, Mu J, Birnbaum MJ, Shulman GI. AMP kinase is required for mitochondrial biogenesis in skeletal muscle in response to chronic energy deprivation. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:15983-15987. [PubMed: 12444247].
  32.  Arany Z, Foo SY, Ma Y, Ruas J, Bommi-Reddy A, Girnun GD, Cooper M, Laznik D, Chinsomboon J, Rangwala S, et al. HIF-independent regulation of VEGF and angiogenesis by the transcriptional coactivator PGC-1 a. Nature 2008;451:1008-1012. [PubMed: 18288196].
  33.  Jain RK. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med 2003;9:685-693. [PubMed: 12778167].
  34.  Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) pathway. Sci STKE 2007;2007:cm8. [PubMed: 17925579].
  35.  Hudlicka O, Brown M, Egginton S. Angiogenesis in skeletal and cardiac muscle. Physiol Rev 1992;72:369-417. [PubMed: 1372998].
  36.  Sacheck JM, Hyatt JP, Raffaello A, Jagoe RT, Roy RR, Edgerton VR, Lecker SH, Goldberg AL. Rapid disuse and denervation atrophy involve transcriptional changes similar to those of muscle wasting during systemic diseases. Faseb J 2007;21:140-155. [PubMed: 17116744].
  37.  Sandri M, Lin J, Handschin C, Yang W, Arany ZP, Lecker SH, Goldberg AL, Spiegelman BM. PGC-1 alpha protects skeletal muscle from atrophy by suppressing F oxO3 action and atrophy-specific gene transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:16260-16265. [PubMed: 17053067].
  38.  Hanai J, Cao P, Tanksale P, Imamura S, Koshimizu E, Zhao J, Kishi S, Yamashita M, Phillips PS, Sukhatme VP, et al. The muscle-specific ubiquitin ligase atrogin-1/MAFbx mediates statin-induced muscle toxicity. J Clin Invest 2007;117:3940-3951. [PubMed: 17992259].
  39.  Handschin C, Kobayashi YM, Chin S, Seale P, Campbell KP, Spiegelman BM. PGC-1 alpha regulates the neuromuscular junction program and ameliorates Duchenne muscular dystrophy. Genes Dev 2007;21:770-783. [PubMed: 17403779].
  40.  Michael LF, Wu Z, Cheatham RB, Puigserver P, Adelmant G, Lehman JJ, Kelly DP, Spiegelman BM. Restoration of insulin-sensitive glucose transporter (GLUT4) gene expression in muscle cells by the transcriptional coactivator PGC-1. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:3820-3825. [PubMed: 11274399].
  41.  Handschin C, Choi CS, Chin S, Kim S, Kawamori D, Kurpad AJ, Neubauer N, Hu J, Mootha VK, Kim YB, et al. Abnormal glucose homeostasis in skeletal muscle-specific PGC-1alpha knockout mice reveals skeletal muscle-pancreatic beta cell crosstalk. J Clin Invest 2007;117:3463-3474. [PubMed: 17932564].


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

66538. Управление службой каталога в Windows-сети 20.7 KB
  Определены роли пользователей – оператор станции ввода, оператор станции обработки, оператор станции хранения. Для демонстрации ограничений, задаваемых для разных ролей, операторам станции ввода добавлен запрет на чтение ветки...
66539. Исследование мостовых соединений 201 KB
  Оборудование: Беспроводные адаптеры (типа DWL-G132) – по одному на пользователя Точки доступа (типа DWL-2100AP) – 2 штуки Точки доступа (типа DWL-3200AP) – 2 штуки Цель работы: Изучение дополнительных режимов работы WDS и WDS with AP.
66540. Моделі та методи обробки нечітких знань. Нечіткі множини 31.77 KB
  При розробці інтелектуальних систем знання про конкретну предметну область, для якої створюється система, рідко бувають повними й абсолютно достовірними. Навіть кількісні дані, отримані шляхом досить точних експериментів
66541. ДОСЛІДЖЕННЯ ЛІНІЙНОГО РОЗГАЛУЖЕНОГО ЕЛЕКТРИЧНОГО КОЛА СИНУСОЇДНОГО СТРУМУ 600 KB
  Експериментально визначити параметри резистора R, котушки індуктивності (індуктивність L, резистивний опір Rк) та конденсатора С в колі синусоїдного струму. Експериментально дослідити явище резонансу струмів, фазові й енергетичні співвідношення в колі з паралельним з'єднанням котушки індуктивності (з індуктивністю L і резистивним опором
66543. Тестування, логічна організація та форматування HDD 1.57 MB
  Натискаємо клавішу P англ і вибираємо потрібний канал вибір здійснюється стрілочками якщо ви не знаєте який у вас диск вибирайте по черзі. Натискаємо Enter і F2. Якщо не з'явився натискаємо знову P і вибираємо інший канал.
66544. Освоение технологии структурного программирования и применения стандартных методов работы с одномерными массивами при разработке и создании программы на языке Турбо Паскаль 224 KB
  Освоение методов структурного программирования при разработке и создании программы на языке Турбо Паскаль для обработки одномерных массивов. Теоретические сведения Массив это регулярная структура последовательность однотипных данных объявляемых специальной конструкцией языка...
66545. Многопоточность. Межпроцессорные взаимодействия 49 KB
  Два дочерних процесса выполняют некоторые циклы работ, передавая после окончания очередного цикла через очереди сообщений родительскому процессу очередные четыре строки некоторого стихотворения, при этом первый процесс передает нечетные четверостишья, второй - четные.
66546. МНОГОПОТОЧНОСТЬ. МЕЖПРОЦЕССНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 64.6 KB
  Написать программу, создающую два потока, которые выполняются в одном адресном пространстве (в одном процессе). Их разделяемый ресурс - целочисленный массив, который содержит данные совместного использования. Потоки должны обрабатывать массив поочередно.