38713

Определение биохимических и фармакокинетических свойств эритроцитов-переносчиков антрациклиновых антибиотиков

Диссертация

Биология и генетика

Преимущества использования нагруженных антрациклиновыми антибиотиками эритроцитов по сравнению со стандартными формами этих препаратов показаны в ряде экспериментов на культурах клеток и на животных [Zocchi 1988 1989 Bentti 1989 Gudreult 1989 tullkhnov 1992 1994]. Описаны случаи использования эритроцитов нагруженных доксорубицином в ветеринарии [Mtherne 1994] а также единичные случаи применения их в клинической практике [Tonetti 1992 tullkhnov 1997 Куликова 1998]. Однако несмотря на обнадеживающие результаты существует проблема...

Русский

2013-09-29

236.5 KB

18 чел.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Одно из направлений современной фармакологии – поиск и использование переносчиков лекарственных препаратов. Снижение токсичности препарата и увеличение его эффективности при использовании переносчиков может быть достигнуто за счет уменьшения максимальной концентрации препарата в крови при увеличении времени его циркуляции либо за счет преимущественной доставки препарата в пораженные органы и ткани. В качестве переносчиков лекарственных препаратов могут выступать макромолекулы, частицы (микросферы и микрокапсулы) и клетки [Gregoriadis 1977, 1989]. В качестве клеток–переносчиков наиболее удобны эритроциты из-за доступности, биосовместимости и способности к биодеградации. Эритроциты-переносчики могут использоваться для решения многих медицинских проблем, таких как коррекции метаболизма, лечение ферментопатий. Они представляются перспективными в терапии онкологических заболеваний, где актуальна проблема снижения токсичности противоопухолевых препаратов, их пролонгированного действия, а также направленного транспорта этих препаратов в опухолевые ткани. Эритроциты могут быть использованы как переносчики антрациклиновых антибиотиков рубомицина и доксорубицина, которые являются базисными препаратами в терапии гемобластозов. Методики введения различных препаратов в эритроциты просты и достаточно эффективны: в частности, нагруженные антрациклиновыми антибиотиками эритроциты могут быть легко получены за счет связывания этих препаратов клетками в изотонической среде.

Преимущества использования нагруженных антрациклиновыми антибиотиками эритроцитов по сравнению со стандартными формами этих препаратов показаны в ряде экспериментов на культурах клеток и на животных [Zocchi 1988, 1989, Benatti 1989, Gaudreault 1989, Ataullakhanov 1992, 1994]. Описаны случаи использования эритроцитов, нагруженных доксорубицином, в ветеринарии [Matherne 1994], а также единичные случаи применения их в клинической практике [Tonetti 1992, Ataullakhanov 1997, Куликова 1998]. Эритроциты-переносчики доксорубицина приводили к существенному изменению фармакокинетики доксорубицина, увеличивая время его циркуляции в крови в несколько раз [Ataullakhanov 1997, Куликова 1998].

Однако, несмотря на обнадеживающие результаты, существует проблема повреждения эритроцитов при приготовлении эритроцитов-переносчиков. Важным вопросом является выяснение способности эритроцитов-переносчиков нормально циркулировать в кровотоке, т.е. сохранения их деформируемости. Также до конца не выяснено, насколько отличается связываемость антрациклиновых антибиотиков эритроцитами доноров и эритроцитами больных.

Таким образом, представляется актуальным исследование связывания антрациклиновых антибиотиков с эритроцитами больных, а также изучение повреждающего воздействия антрациклиновых антибиотиков на эритроциты. Также представляет значительную актуальность исследование в клинической практике эритроцитов-переносчиков рубомицина и продолжение изучения эритроцитов-переносчиков доксорубицина.

Цель работы.

Определение биохимических и фармакокинетических свойств эритроцитов-переносчиков антрациклиновых антибиотиков.

Задачи исследования.

1 Изучение связывания рубомицина и доксорубицина с эритроцитами пациентов и разработка установки для приготовления эритроцитов-переносчиков антрациклиповых антибиотиков.

2 Изучение повреждающего воздействия рубомицина и доксорубицина на эритроциты.

3 Исследование фармакокинетики рубомицина и доксорубицина после введения эритроцитов-переносчиков антрациклиновых антибиотиков больным с гемобластозами.

4 Разработка методики инкапсулирования в мышиные и человеческие эритроциты антибиотика эремомицина, а также оценка эффективности эремомицина, инкапсулированного в мышиные и человеческие эритроциты, in vitro и in vivo на мышах.

Научная новизна.

Показано, что антрациклиновые антибиотики рубомицин и доксорубицин в концентрации выше 1,0 мг/мл клеток вызывают выход К+ из эритроцитов и ухудшение их деформируемости. Показано, что в концентрации ниже 1,0 мг/мл клеток повреждающее воздействие этих антибиотиков пренебрежимо мало и эритроциты могут быть использованы в качестве переносчиков антрациклиновых антибиотиков. Исследование фармакокинетики рубомицина и доксорубицина после применения эритроцитов-переносчиков антрациклиновых антибиотиков показало, что уменьшается концентрационный пик этих антибиотиков и увеличивается время их циркуляции в крови.

Практическая ценность работы.

Результатом работы является создание методов получения эритроцитов-переносчиков рубомицина и доксорубицина. Полученные данные по фармакокинетике этих препаратов показывают, что при использовании эритроцитов-переносчиков открываются возможности повышения дозы антрациклиновых антибиотиков.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Оптимизация действия лекарственных препаратов при использовании различных носителей.

Использование носителей (переносчиков) лекарственных препаратов дает возможность оптимизировать лекарственное воздействие этих препаратов на организм. Создание новых лекарственных форм препаратов, связанных с переносчиками, направлено на увеличение эффективности и снижение токсичности этих препаратов. Использованием переносчиков лекарственных препаратов можно достичь их защиты от преждевременного разрушения и инактивации; предотвратить или уменьшить иммунные реакции организма на введенный препарат; осуществлять направленный транспорт препарата в те органы и ткани, где его применение оптимально.

Важной предпосылкой успеха в применении фармакологически активных веществ является специфичность. Однако большая часть веществ взаимодействует также и с неспецифическими мишенями, что хорошо показано на примере химиотерапии онкологических заболеваний: медленный прогресс в этой области является следствием неспособности цитотоксических веществ действовать исключительно на злокачественные клетки.[Гаузе-1987]. Низкая селективность лекарственного препарата часто усугубляется развитием лекарственной устойчивости опухолевых клеток к стандартным формам препарата. Для решения этой проблемы функциональные молекулы, могут доставляться к месту непосредственного действия с помощью переносчиков.

Необходимые требования к переносчикам лекарственных препаратов - нетоксичость и способность к биодеградации.

 Переносчики лекарственных препаратов можно разделить на три группы: макромолекулярные переносчики, микроконтейнеры и клетки.

Примером макромолекулярных переносчиков являются иммуноглобулины. Так, противоопухолевые препараты в комплексе с антителами показали большую цитотоксичность для злокачественных клеток, обладающих антигенами, соответствующими переносчикам-иммуноглобулинам [Rubens 1974, Gregoriadis 1989]. Однако, несмотря на свою привлекательность, подход с применением переносчиков-антител связан с рядом трудностей, среди которых наиболее важные - выделение антигенов и получение их в препаративном количестве. Одной из групп макромолекулярных переносчиков являются асиалогликопротеины. Они высокоспецифичны в условиях in vitro к клеткам паренхимы печени. Используя асиалофетуин, оказалось возможным направить в печень лизоцим и альбумин, сшитые с этим белком [Rogers 1973]. Таким же образом можно использовать агалактогликопротеины и агексозамин гликопротеины, обладающие тропностью соответственно к печени и почкам [Stockert 1974]. Другими потенциальными молекулами-переносчиками являются трофические гормоны, лектины и некоторые лизосомальные ферменты [Hickman 1974]. В отличие от антител, многие из этих веществ легкодоступны, однако, им недостает широты выбора мишени, присущей группе иммуноглобулинов. При другом подходе используются способности некоторых типов клеток (например, фагоцитов и некоторых злокачественных клеток) к активному эндоцитозу специфических макромолекул. Перспективным препаратом является НРМА [N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide]-полимер-связанный доксорубицин. Этот препарат является полимерной молекулой, содержащей доксорубицин (около 8,5 %). Эта лекарственная форма показала высокую противоопухолевую активность на мышиных  моделях; его применение особенно эффективно в клеточных моделях солидных опухолей. Увеличение активности по сравнению со свободным доксорубицином связано с преимущественным захватом этого препарата опухолевой тканью и последующим локальным выходом доксорубицина из комплекса с переносчиком. У НРМА-полимер-связанного доксорубицина снижена как кардиотоксичность, так и общая токсичность в сравнении со свободным доксорубицином [Fraier 1995]. Также переносчиком лекарственных препаратов может являться ДНК [Trouet 1972], с которой можно связать контактным способом такие цитотоксические препараты, как дауномицин (рубомицин) и доксорубицин. Эксперименты с ДНК-связанными дауномицином (DNR-DNA) и доксорубицином (ADR-DNA) показали, что сниженная токсичность связанного препарата и повышенное поглощение комплекса ДНК-антибиотик опухолевыми клетками увеличивают эффективность препарата при лечении животных с опухолями [Trouet 1972]. Также существуют работы, где описаны попытки применения такого препарата в клинике: показано, что комплекс ADR-DNA так же эффективен, как свободный доксорубицин при лечении некоторых карцином, комплекс DNR-DNA так же эффективен, как свободный рубомицин при лечении острого нелимфобластного лейкоза, комплекс ADR-DNA был более эффективен, чем DNR-DNA при лечении острых лимфобластных лейкозов. Во всех случаях применения комплексов с ДНК кардиотоксичность антрациклиновых антибиотиков была снижена по сравнению со стандартной формой препарата [Trouet 1979, Cornu 1974]. В другом исследовании комплекс ADR-DNA исследовали при терапии острых миелоидных лейкозов у детей. Показано изменение фармакокинетики доксорубицина в крови (увеличение среднего уровня препарата), показана хорошая переносимость DNR-DNA , но побочные эффекты были сравнимы со стандартной формой доксорубицина. После терапии с использованием DNR-DNA и цитозин арабинозида (ara-C) из 16 детей у 14 была достигнута ремиссия [Lie 1979]. Однако все исследования комплексов ДНК с антрациклиновыми антибиотиками относятся к семидесятым годам, в настоящее время они не проводятся.

Вообще следует отметить, что клинические исследования с макромолекулами-переносчиками представлены не значительно, в основном потому, что эти формы эффективны in vitro, но in vivo они плохо циркулируют в кровотоке. После введения они выводятся так же быстро, как и свободные препараты, а иногда и скорее.

Эффективными переносчиками являются микроконтейнеры, которые способны переносить вещества внутри некоторого пространства, защищенного от внешних воздействий. Такими переносчиками могут служить как небиодеградируемые синтетические системы (например, нейлоновые полупроницаемые микрокапсулы) [Грачева 1978], так и биодеградируемые системы [Woodland 1973, Gregoriadis 1977, 1989, Sukhorukov 1998, Bobreshova 1999]. Примером таких биодеградируемых систем являются микросферы из альбумина или казеина. При использовании их для транспорта 5-фторурацила, противоопухолевого антиметаболита, показана эффективность таких переносчиков in vitro, а также in vivo на мышах [Truter 1995, Latha 1994]. Перспективными носителями являются микрокапсулы из полимолочной кислоты: так, микрокапсулы с циклазоцином дают возможность пролонгировать действие этого препарата [Woodland 1973]. Интерес представляет методика создания микрокапсул, согласно которой на положительно заряженный агрегат из не реактивного вещества наносятся слои отрицательно заряженных коллоидных частиц, которые, собственно, и являются оболочкой микрокапсул. После этого «ядро» растворяется и остается полая оболочка, внутрь которой помещают вещество, необходимое для транспортировки [Sukhorukov 1998, Bobreshova 1999]. 

Самым распространенным классом микрокапсул являются липосомы. Материалом для таких переносчиков являются гидрофобные полярные фосфолипиды, из которых образованы сферические бислойные липосомы [Gregoriadis 1977, 1989]. Физические свойства липосом могут быть различными: радиус может изменяться приблизительно от 12 нм для моноламеллярных липосом до нескольких микрон для мультиламеллярных липосом, а поверхность липосом может нести положительный или отрицательный заряд. Изменения различных физических характеристик липосом и способа их введения дают возможность при помощи липосом варьировать как скорость выведения из кровообращения, так и распределение в тканях веществ, инкапсулированных в них. При этом в липосомы можно ввести не только водорастворимые вещества, но и жирорастворимые препараты, а также белки, гидрофобные области которых могут быть иммобилизованы в липидное пространство бислоев [Gregoriadis 1972]. Например, внутривенно вводимые липосомы достаточно быстро выводятся из кровотока, и заключенные в них недиффундирующие вещества (в частности, ферменты) попадают преимущественно в печень и селезенку [Gregoriadis 1972] после разрушения там липосом. Хорошо диффундирующие вещества, такие как 5-фторурацил [Valero 1999] и пенициллин [Gregoriadis 1973], медленно высвобождаются, хотя липосомы в этом случае тоже циркулируют недолго, выводясь из кровотока печенью. Созданы липосомы из фосфолипидов, устойчивых к кишечным фосфатазам, которые способны транспортировать инсулин из кишечника в кровяное русло и снижать уровень глюкозы в крови у нормальных и диабетических мышей [Dapergolas 1976]. Целевую доставку липосом можно обеспечить встраиваним в поверхность липосом специфичных антител [Matthay 1986, Peeters 1988]. Также было обнаружено, что встраивание в структуру липосом сиалогликопротеинов, экстрагированных из мембраны эритроцитов, может способствовать связыванию в условиях in vitro таких липосом с эритроцитами в присутствии лектинов. Так, десиалированный фетуин (проявляющий аффинность к клеткам паренхимы печени), встроенный в поверхность липосом, способствует поглощению липосомального блеомицина клетками печени [Gregoriadis 1975].

Эффективность направленой доставки липосом в области-мишени тела в значительной степени будет зависеть от решения двух вопросов. Во-первых, в тех случаях, когда мишень не является клетками паренхимы печени или не относится к ретикулоэндотелиальной системе необходимо  уменьшение взаимодействия с печенью и селезенкой. Во-вторых, размеры и состав липосом должны быть изменяемы таким образом, чтобы позволить проникновение через различные анатомические барьеры. Существование минимального (12 нм) радиуса липосом затрудняет эту задачу.

Липосомы особенно перспективны для терапии онкологических заболеваний [Gregoriadis 1989, Valero 1999, Краснопольский 1998].

В одной из первых работ по применению липосомальных форм противоопухолевых препаратов липосомы, содержащие меченый блеомицин, вводили онкологическим больным, имеющим печеночные метастазы. Было показано, что липосомы быстро накапливаются в печени, однако не было замечено преимущественного попадания препарата в клетки опухоли [Segal 1976].

 Были разработаны липосомальные формы метотрексата. На мышах было обнаружено, что при применении липосом ингибирование роста раковых клеток в 5 раз эффективнее , чем при введении свободного препарата из-за гораздо большего поглощения таких липосом почечными клетками [Singh 1991].

Были созданы липосомальные формы противоопухолевых прапаратов - производных платины. Такие формы оказались стабильными, они имели не большую токсичность, чем стандартные формы препарата за счет изменения фармакокинетики, и также показали хорошую активность на мышиных моделях различных опухолей [Lautersztain 1986, Bandak 1999, Каледин 1996].

В липосомы была введена олтрансретиноидная кислота (ATRA) и такая липосомальная форма была использована в курсах монотерапии в клиническом исследовании у пациентов с первичным острым промиелоцитарным лейкозом. Отслеживалась частота полных гематологических ремиссий. Этот показатель для липосомальной формы ATRA был сравним с таковым при терапии ATRA и идарубицином [Estey 1999].

В течение многих лет предпринимались попытки создания липосом с рубомицином (даунорубицином) и доксорубицином, антрациклиновыми антибиотиками, широко применяющимися в онкологии. В настоящее время получены и успешно проходят клинические испытания липосомы с даунорубицином (DaunoXome) [Gill 1995, Cortes 1999, Verdonck 1998]. Показано, что этот препарат более эффективен по сравнению со свободным даунорубицином, при введении больным с саркомой Капоши, развившейся у больных СПИДом [Gill 1995]. Также DaunoXome проходит клинические испытания при лечении больных с острыми лейкозами [Cortes 1999, Verdonck 1998]. При введении липосомной формы препарата отмечается снижение токсичности антибиотика [Gill 1995, Cortes 1999], а в некоторых случаях – частичное снятие множественной лекарственной резистентности [Verdonck 1998]. Введение липосомной формы изменяет фармакокинетику препарата: DaunoXome выводится гораздо медленнее из организма, его высокие концентрации в плазме обнаруживаются гораздо дольше по сравнению со свободным даунорубицином. При введении даунорубицина в липосомах значительно увеличивается время циркуляции препарата и площадь под фармакокинетической кривой [Gill 1995]. Нужно отметить, что применяя липосомы можно значительно увеличивать разовые дозы антрациклиновых антибиотиков без существенного увеличения токсичности [Cortes 1999].

Разработана и испытывается в клинике липосомная форма доксорубицина Doxil [Valero 1999]. Основой технологии получения этих липосом является применение полимера для покрытия обычных липосом (следует отметить, что почти во всех последних иследованиях липосом используются полимерные покрытия липосом). Это полимерное покрытие (PEG-EE) является производным полиэтиленгликоля. Эта оболочка позволяет липосомам избегать узнавания и удаления иммунной системой, что приводит к увеличению времени циркуляции в кровотоке в экспериментах на мышах. Doxil также характеризуется более высоким значением площади под фармакокинетической кривой. [Hong 1999, Tseng 1999].

 Исследование механизмов взаимодействия липосом с клетками показало, что существует два механизма ассоциации липосом с клетками: эндоцитоз и слияние. Первый механизм имеет место как в условиях in vitro, так и in vivo у клеток, способных к активному эндоцитозу. В результате этого процесса вещества, связанные с липосомами, оказываются в лизосомах, где они высвобождаются, и в случае, если такие вещества сохраняют свою активность в лизосомальной среде, они способны оказывать воздействие. С другой стороны, в тех случаях, когда физические свойства веществ позволяют, эти вещества могут диффундировать из лизосом и достигать других клеточных областей. Также, в дополнении к процессу эндоцитоза, возможно слияние липосомных бислоев с клеточными мембранами в условиях in vitro. Это может привести либо к встраиванию жирорастворимых веществ (находящихся в липидной фазе липосом) в клеточную мембрану, либо к попаданию водорастворимых соединений (помещающихся в водном пространстве липосом) в цитоплазму клетки [Gregoriadis 1977].

Несмотря на широкие и интенсивные исследования липосом, несмотря на  возможности использования липосом, показанные in vitro на культурах клеток, in vivo на животных липосомальные формы многих препаратов очень быстро выводились из кровотока. Возможно, по этой причине в клинической практике исследование липосомальных форм происходит лишь для небольшого числа препаратов. Все такие исследования находятся на стадии клинических испытаний.

 В качестве переносчиков лекарственных препаратов можно использовать целые клетки. Преимуществами клеток как переносчиков являются: их доступность, биосовместимость, способность к биодеградации, возможность длительной циркуляции в организме.

 Описан метод лечения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры с помощью тромбоцитов-переносчиков винбластина [Ahn 1978]. Винка-алкалоиды винбластин и винкристин широко применяются при лечении лимфопролиферативных заболеваний, миеломной болезни, острых лейкозов и других онкологических заболеваний [Гаузе 1987, Vidal 2000]. В работе [Ahn 1978] больным вводился вибластин, связанный с тромбоцитами (после инкубации тромбоцитов в растворе винбластина при температуре 37oС в течение 1 часа), с последующей обработкой тромбоцитов антителами. Введение такого препарата показало хороший терапевтический эффект [Ahn 1978, Simon 1987, Penneys 1982 ]. Также были использованы тромбоциты, нагруженные винбластином, для лечения больных с аутоимунной гемолитической анемией [Ahn 1983].

Из клеток, используемых в качестве переносчиков, наиболее удобными представляются эритроциты. Исходно идея использования эритроцитов-переносчиков принадлежит Ihler [Ihler 1973] и Zimmermann [Zimmermann 1976] независимо. Преимущества, достигаемые при использовании эритроцитов-переносчиков [Ihler 1973, Pitt 83]:

1. Находясь внутри эритроцита лекарственный препарат в ряде случаев может предохраняться от разрушения и инактивации в русле крови.

2. Удлиняется срок нахождения препарата в организме. Для  эритроцитов-переносчиков время жизни в кровотоке теоретически может быть равно времени жизни нормальной клетки. При этом в русле крови довольно долгое время может поддерживаться некоторая концентрация препарата.

3. Отсутствуют или снижаются реакции иммунной системы организма на введение препарата, защищенного эритроцитом-переносчиком.

4. Возможно осуществление направленного транспорта лекарственных средств в органы и клетки-мишени (ретикулоэндотелиальной системы - РЭС).

В литературе для эритроцитов-переносчиков обычно используются термины: эритроциты, нагруженные (заполненные) препаратом; препарат, связанный с эритроцитами; эритроцитарная иммобилизованная форма препарата; фармакоциты. В данной работе преимущественно будет использоваться термин эритроциты-переносчики.

Свойства эритроцитов-переносчиков сильно зависят от способа приготовления. В зависимости от поставленных задач возможно создание либо малоповрежденных (максимально сходных с нормальными) эритроцитов-переносчиков, либо специально обработанных так, что после их введения в организм в течение нескольких часов все окажутся выведенными из кровотока РЭС. В первом случае возможно продление времени циркуляции препарата и увеличение его противоопухолевого действия. При этом в эритроциты может быть введен препарат, медленно диффундирующий наружу, или фермент, который взаимодействует с низкомолекулярным субстратом, легко проникающим внутрь клетки из кровотока. В этом случае очень важно, что препараты, работающие внутри эритроцитов-носителей, защищены от иммунных реакций. Специально обработанные или частично поврежденные фармакоциты могут быть использованы для быстрого направленного транспорта лекарственного препарата в органы ретикулоэндотелиальной системы.

2 Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов

 Способы получения эритроцитов, нагруженных лекарственными препаратами.

 Распространенный способ заполнения эритроцитов лекарственными веществами - обратимый осмотический лизис. Отмытые от плазмы эритроциты помещают в гипотонический раствор (с тоничностью порядка десятков осмолей), содержащим препарат, который необходимо ввести в эритроциты. Во время этой процедуры увеличивается объем эритроцитов и образовываются разрывы в мембранах эритроцитов, через которые препарат и попадает внутрь эритроцитов. Далее эритроциты запечатывают, восстанавливая тоничность раствора добавлением необходимого количества NaCl. После этой процедуры часть препарата остается внутри эритроцитов. Далее эритроциты с препаратом внутри инкубируют некоторое время при 37C. При использовании этого метода удается ввести в эритроциты только около 10-20%  препарата из раствора. Данный метод приводит к большим потерям эритроцитов из-за необратимого лизиса, что является следствием достаточно быстрого и грубого воздействия на клетки. Не разрушившиеся эритроциты бывают сильно повреждены и иногда не обладают достаточно большим временем жизни в организме. Кроме того, метод требует расхода дорогих препаратов, так как в процессе заполнения необходимо сильное разбавление исходного объема эритроцитов лизирующим раствором, содержащим препарат, большая часть которого остается неиспользованным [Ihler 1973].

Более мягким методом заполнения эритроцитов некоторыми препаратами является мето, при котором лизис эритроцитов происходит не сразу, а постепенно [Alpar 1985, Pitt 1983]. Добавление к эритроцитам гипотонического раствора, содержащего лекарственный препарат, в этом случае производят не сразу, а небольшими порциями до достижения "точки лизиса" клеток, при этом необходимо отмывать эритроциты перед каждой заменой среды. Далее эритроциты «запечатывают» путем инкубации в среде с нормальной тоничностью. Таким способом удается ввести в эритроциты около 25% препарата из раствора. Эритроциты, полученные данным методом, имеют хорошую приживаемость в организме, однако, большое число отмывок (с центрифугированием) все же повреждает клетки.

Известен метод включения веществ в эритроциты путем высоковольтного диэлектрического пробоя мембраны [Serpersu 1985, Zimmermann 1976] с образованием в эритоцитарной мембране пор. Оптимальными условиями этого процесса являются: продолжительность воздействия 20 микросекунд и напряжение 1-2 kV см-1. Данный метод дает хорошие по качеству эритроциты, однако он широко не используется из-за его трудоемкости и из-за того, что позволяет получать незначительное количество наполненных эритроцитов.

Существует также диализный метод [DeLoach 1977, 1991 BAB, Tonetti 1990]. Согласно этому методу отмытые эритроциты помещают в диализный мешок, куда добавляется небольшое количество концентрированного запечатываемого вещества в изоосмотическом растворе. Диализ ведут два часа при комнатной температуре, гематокрите суспензии 70-80 %, против гипоосмотического внешнего раствора при постоянном перемешивании. Таким образом, изменение тоничности внутри диализного мешка происходит постепенно. После завершения диализа против гипоосмотического раствора, во внешней среде восстанавливается тоничность и запечатывают  эритроциты, инкубируя их в изоосмотической среде при температуре 37оС. Метод позволяет получать высокую концентрацию вещества внутри эритроцитов и позволяет ввести в эритроциты 40-50% препарата. Недостатком данного метода является: достаточно быстрое снижение тоничности внутри диализного мешка из-за высокого градиента в концентрациях солей снаружи и внутри мешка, из-за использования в качестве гипоосмотического раствора  дистилированную воду или 5 mM фосфатный буфер. Это приводит к быстрому раскрытию эритроцитов,что может повреждать их. Более хорошую приживаемость в русле крови показывают эритроциты, полученные методом ступенчатого диализа [Sinauridze 1992,Perez 1999]. Он отличается от метода простого диализа тем, что тоничность гипоосмотического раствора снижается ступенями. Отмытые эритроциты смешиваются с высококонцентрированным раствором вводимого препарата и помещаются в диализный мешок, после чего начинают диализ против гипоосмотического раствора. Через 15-20 минут во внешний диализирующий раствор добавляют дистиллированную воду, таким образом диализ проводится в более мягких условиях, эритроциты набухают постепенно, с медленным достижением "точки лизиса". При этом методе эритроциты меньше травмируются, после введения in vivo они дольше циркулируют в кровотоке. При использовании этого метода удается ввести в эритроциты 50-55 % от исходного количества препарата. Преимущества этого метода – малые потери как препарата, так и эритроцитов в процессе приготовления эритроцитов-переносчиков. Ограничения – возможность включения только высокомолекулярных веществ.

Для увеличения проницаемости мембран эритроцитов для нагружаемого препарата иногда в дополнение к основным методикам заполнения эритроцитов используют Амфотерицин В [Kitao 1978, 1980 ]. Описан метод регистрации АТФ в эритроцитах с помощью введенной в клетки люциферазы [Атауллаханов 1981].

В некоторых исследованиях в качестве модификаций существующих методик мембраны заполненных препаратом эритроцитов специально обрабатывались антителами для лучшего их распознавания макрофагами [Magnani 1997, Chiarantini 1992].

Для некоторых препаратов перспективным методом является метод прямой инкубации эритроцитов в среде, содержащей данный препарат. Было обнаружено, что эритроциты человека, а также мышиные и собачьи эритроциты при инкубации в растворе рубомицина или доксорубицина могут связывать антибиотик непосредственно из инкубационной среды [Атауллаханов 1993, Tonetti 1990, DeLoach 1985 J Appl Bioch]. Так, эритроциты мышей связывают 80 – 90% добавленного в суспензию рубомицина при температуре 21оС и гематокрите суспензии 30%. С ростом начальной концентрации рубомицина в среде от 0,3 до 2,5 мг/мл абсолютная скорость связывания рубомицина растет, а относительная – падает. При этом связывание происходит за 5 – 30 минут [Атауллаханов 1993]. Показано, как на связывание рубомицина и доксорубицина эритроцитами человека влияет температура, концентрация антибиотика и гематокрит суспензии [Атауллаханов 1994, Ataullakhanov 1994]. Установлено, что оптимальными условиями для связывания антрациклиновых антибиотиков эритроцитами человека в инкубационной среде являются pH = 7,4 и температура 37оС.

Однако процесс инкубации рубомицина с эритроцитами сопровождается выходом Hb из эритроцитов, что указывает на повреждающее воздействие антрациклиновых антибиотиков на эритроциты [Атауллаханов 1993].

Исследован способ иммобилизации препаратов в эритроцитах путем обработки глютаровым альдегидом эритроцитов, заполненных различными препаратами [DeLoach 1977]. Этот способ используется также как один из методов обеспечения направленного транспорта инкапсулированного препарата в селезенку и печень: обработанные клетки распознаются в качестве поврежденных и удаляются в печени и селезенке [DeLoach 1977]. Также такая обработка помогает предотвратить быстрый выход инкапсулированного вещества из эритроцитов, а также дольше сохраняет целостность эритроцитов [Атауллаханов 1993], однако, делая их менее деформируемыми [Lisovskaya 1998], т.к. глютаральдегид образовывает ковалентные связи с белками мембраны, а также инактивирует некоторые метаболические системы в эритроцитах [Gaudreault 1989, Tonetti 1990]. Исследовалась обработка глютаровым альдегидом эритроцитов, нагруженных рубомицином [Gaudreault 1989, Атауллаханов 1993], доксорубицином [Tonetti 1990], метатрексатом [DeLoach 1983]. 

 Эритроциты как переносчики лекарственных препаратов.

 Эритроциты можно использовать как биологические носители для различных типов лекарственных препаратов. Введение больным лекарственного соединения в эритроцитах-переносчиках позволяет поддерживать концентрацию этого препарата в крови на постоянном уровне или за счет диффузии препарата из клеток, или за счет постепенного разрушения эритроцитов-переносчиков в кровяном русле [Gregoriadis 1977, Sprandel 1979].

Возможность коррекции метаболизма с помощью эритроцитов-переносчиков показана в работах [Sprandel 1985, Fazi 1994, Rossi 1992]. В опытах in vitro доказана способность к окислению метанола эритроцитами, нагруженными алкогольоксидазой. В опытах in vivo у мышей, получавших такие эритроциты, отмечался половинный уровень метанола в крови в сравнении с контрольной группой, получавшей ненагруженные эритроциты. Исследование показывает возможность с помощью эритроцитов-носителей снижать токсический эффект метанола [Fazi 1994].

Исследована способность человеческих и мышиных эритроцитов с инкапсулированной глюкооксидазой регулировать потребление глюкозы в опытах in vitro. В опытах на мышах показано, что эритроциты, нагруженные глюкооксидазой и гексокиназой способны регулировать уровень глюкозы в крови в пределах физиологических значений [Rossi 1992].

Антидот цианидов тиосульфат натрия и его катализатор бычья роданеаза были инкапсулированы в мышиные эритроциты. Они эффективно использовались для предотвращения летальных эффектов, вызванных цианидами у мышей [Cannon 1994, Petrikovics 1994].

Продемонстрирована возможность регулирования уровня мочевой кислоты при помощи уратооксидазы, инкапсулированной в эритроциты [Sprandel 1985].

Фермент глютамат дегидрогеназа, заключенный в эритроциты, эффективен in vitro и in vivo на мышах для быстрого снижения высоких уровней аммония в кровотоке [Sanz 1999].

Для профилактики и снятия органофосфорной интоксикации принципиально возможно использовать эритроциты-переносчики рекомбинантной фосфотриэстеразы. Показана эффективность такого препарата in vitro [Pei 1994].

Описана попытка методом обратимого осмотического лизиса инкапсулировать в эритроциты противоопухолевый препарат карбоплатину. Был достигнут высокий процент включаемости препарата в эритроциты и сохранности эритроцитов при инкапсулировании препарата, наблюдался медленный выход препарата из эритроцитов, однако внутри эритроцитов препарат включался в метаболизм и быстро инактивировался, преобразовываясь в свои метаболиты [Tonetti 1992].

 В работе [Атауллаханов 1985] исследовалась проницаемость человеческих эритроцитов для аспарагина. Аспарагин способен проникать в человеческие эритроциты из внешней среды, и заполнение эритроцитов аспарагиназой путем обратимого осмотического лизиса не влияет на их проницаемость для аспарагина. При инкубации таких эритроцитов с аспарагином в них накапливается аспарагиновая кислота, что указывает на быструю переработку проникающего в клетки аспарагина находящейся внутри аспарагиназой. Эритроциты, нагруженные L-аспарагиназой, были получены методом ступенчатого диализа и была исследована фармакокинетика таких эритроцитов на мышах. При введении мышам свободного препарата L-аспарагиназы его концентрация в крови падает до нуля в течение двух суток, при введении инкапсулированного препарата в эритроциты, его концентрация в плазме не снижается до нуля и через 30 суток [Sinauridze 1992]. В других экспериментах L-аспарагиназа, инкапсулированная в эритроциты, вводилась мышам c 6C3HED опухолью. Была показана эффективность препарата и его направленный транспорт в органы ретикулоэнлотелиальной системы [Alpar 1985]. В работах [DeLoach 1990, Naqi 1988] L-аспарагиназа, инкапсулированная в эритроциты методом гипотонического диализа, внутривенно и внутрибрюшинно вводилась собакам. Показана хорошая приживаемость эритроцитов, нагруженных L-аспарагиназой.

Возможно и подкожное введение эритроцитов-переносчиков препаратов, в стандартном виде вызывающих экстравазацию и некрозы тканей [DeLoach 1988 BAB Subcutaneous.]. Специально разработанный микотоксин трикотецеин (Т-2) был инкапсулирован в бычьи эритроциты для снятия его высокой токсичности. Препарат вводился мышам внутрибрюшинно и обнаруживался в терапевтических концентрациях в печени, где ингибировал рост 50% бактерий [DeLoach 1988 BAB Targ].

Собачьи эритроциты, заполненные метотрексатом, обрабатывались глютаровым альдегидом, что обеспечивало направленный транспорт (более 50%) препарата в печень собак [DeLoach 1983, 1981].

Сообщают, что пациентам с болезнью Гаучера вводили глюкоцереброзидазу в эритроцитах [Beutler 1977]. Время полунахождения препарата в кровотоке составляло 10 дней, что значительно превышало этот показательдля свободного препарата. Побочных эффектов не наблюдалось и был получен заметный терапевтический эффект.

Введение мышам гликопротеина В (gB1s) из вируса Herpes simplex (HSV) в аутоэритроцитах для иммунизации предохраняло мышей от летальных эффектов при заражении большими дозами HSV, а также было эффективно против латентной формы HSV-1 [Chiarantini 1997].

Для снятия высокой токсичности, возникающей при введении высоких доз интерлейкина-2, этот препарат вводился с помощью эритроцитов-переносчиков, при этом его биологическая активность сохранялась в экспериментах in vitro и in vivo на мышах [Moyes 1996, Kirch 1994].

Эритроциты, содержащие инозитол гексафосфат вводились мышам, после чего мышей заражали Babesia microti. Процент паразитемии был значительно снижен в 3, 5, 7 дни после инфицирования. Авторы предлагают препарат эритроцитов, нагруженных инозитол гексафосфатом для профилактики заболевания [DeLoach 1988 Res vet].

В мышиные и овечьи эритроциты инкапсулировали рекомбинантный человеческий интерлейкин-2, получали 70% препарата, включенного в эритроциты. Препарат работал in vitro, а в экспериментах in vivo после подкожного введения мышам обнаруживался в тканях даже через три дня после инъекции [DeLoach 1988].

В работе [DeFlora 1988 ] показана возможность инкапсулирования в эритроциты препарата 5-фтор-2-деоксиуридин-5-монофосфата (FdUMP) без повреждающего влияния на метаболизм и морфологию эритроцитов. В эритроцитах происходило дефосфорилирование FdUMP до 5-фтор-2-деоксиуридина (FdUrd), противоопухолевого препарата, медленно выходящего из эритроцитов. Позже были разработаны и синтезированы различные молекулярные комплексы, также являющиеся предшественниками пиримидиновых антиметаболитов, которые инкапсулировались в эритроциты для внутриклеточной наработки FdUrd и 5-фторурацила (FU) [Gasparini 1994 ]. Аналогичные эксперименты были проведены для 2-фтор-ара-АМФ (флюдарабин фосфат), который инкапсулировался в эритроциты. Он не оказывал повреждающего воздействия на метаболизм эритроцитов и дефосфорилировался с помощью клеточных ферментов до флюдарабина, который по мере наработки может свободно выходить через эритроцитарную мембрану [Fraternale 1996]. Теоретически, вышеназванные системы могут служить долго циркулирующими и медленно высвобождающими активное вещество биореакторами. Данные работы находится на стадии экспериментов in vitro.

Была разработана эритроцитная система направленной доставки фосфорилированных аналогов нуклеотидов в макрофаги, пораженные вирусом ВИЧ-1 [Rossi 1999, Rossi 1998, Magnani 1997, Magnani 1996, Benatti 1996, Fraternale 1999], вирусом Herpes simplex [Rossi 1998] или Mycobacterium avium [Rossi 1999]. Эта система основана на возможности инкапсулирования фосфорилированных препаратов в аутологичные эритроциты с последующей селективной модификацией их мембран для распознавания и фагоцитирования таких эритроцитов макрофагами [Magnani 1997]. Этими же авторами была разработана специальная установка “Red Cell Loader” для приготовления методом обратимого осмотического лизиса эритроцитов, нагруженных препаратами, изначально не диффундирущими через эритроцитарную мембрану [Magnani 1998 BAB].

Доставка с помощью эритроцитов-переносчиков в человеческие, кошачьи и мышиные макрофаги была эффективнее в отношении ВИЧ-1, кошачьего вируса иммунодифицита (FIV) и мышиного иммунодифицитного вируса LP-BM5 по сравнению со стандартным введением нуклеотидных аналогов [Magnani 1997].

На клеточных моделях СПИДа in vitro показана эффективность эритроцитов, наполненных дидеоксицитидин-5-трифосфатом (DDCTP) [Rossi 1993, Magnani 1994 ]. В работе [Magnani 1994] сообщается, что макрофаги кошачьих, инфицированные FIV, были обработаны DDCTP -нагруженными эритроцитами, при этом наблюдалось подавление продукции и активности вируса. В работе [Rossi 1993] сообщается, что мышам с MAIDS (мышиной моделью СПИДа) вводили эритроциты-переносчики DDCTP в комбинации с 2-3-дидеоксицитидином (DDC), также наблюдалось подавление продукции и активности вируса.

Был разработан и синтезирован специальный препарат ди(тимидин-3-азидо-2,3-дидеокси-D-рибозид)-5-5-p1-p2-пирофосфат (AZTp2AZT), который при свободном введении показывал эффективность, сравнимую с уже существующим препаратом азидтимидином (AZT), а при введении в эритроцитах показывал большую эффективность in vitro [Magnani 1997, Magnani 1996, Benatti 1996, Fraternale 1999] и in vivo на мышах [Magnani 1998, Fraternale 1999] из-за постепенного выхода из эритроцитов действующего активного агента AZT.

Описаны попытки использования эритроцитов как биореакторов, способных преобразовывать непроходимые через эритроцитарную мембрану предшественники активных форм азидтимидина (AZT) и этамбутола (ЕМВ) такие как AZTpEMB, AZTpEMBpAZT, AZTp2EMB, в активные формы, проходящие через мембрану эритроцита и действующие на ретровирусы и микобактерии. Показано, однако, что только AZTp2EMB гидролизируется в эритроцитах с медленным высвобождением во внеклеточное пространство AZT и ЕМВ со временем полуснижения концентрации AZTp2EMB в эритроцитах 48 часов при 37оС. Была показана эффективность такого препарата in vivo на мышах [Rossi 1999].

Аналогично был разработан комплекс азидтимидина (AZT) и акловира (ACV), противогерпетического препарата. Гетеродинуклеотидный комплекс AZTp2ACV был инкапсулирован в аутологичные эритроциты, модифицированные для лучшего распознавания и фагоцитирования макрофагами. Была показана эффективность такого препарата in vitro [Rossi 1998].

Исследовалась возможность осуществления направленного транспорта эритроцитов, к мембранам которых «пришивали» антитела к коллагену человека (1 типа). Этот белок не взаимодействует с кровью, пока эпителий не поврежден. Показано, что эритроциты, несущие антитела к коллагену 1 типа, входят в поврежденные участи сосудов человека в 11 раз лучше, чем нормальные эритроциты [Самохин 1986 ].

 Существует довольно много лекарственных препаратов для которых необходим направленный транспорт в селезенку и печень, что можно обеспечить с помощью эритроцитов-переносчиков. Доставка в пораженные селезенку и печень описана для некоторых противоопухолевых препаратов: метотрексата [DeLoach Barton 1981 AJVR], цитозинарабинозидтрифосфата [Zimmermann 1978 JClinChemClinBio], антрациклиновых антибиотиков [DeLoach 1983 J Appl Bio].

3. Сведения об антрациклиновых антибиотиках

Антрациклиновые антибиотики (рис. 1) содержат тетра-гидро-тетрацен-хиноновый хромофор, состоящий из алициклического кольца и трех шестичленных компланарных ароматических колец. Хромофор связан с одним или несколькими остатками сахаров. Известны десятки различных антрациклиновых антибиотиков, некоторые из них обладают выраженным противоопухолевым действием в эксперименте, однако широкое практическое применение в химиотерапии онкологических заболеваний нашли только некоторые из них: рубомицин (дауномицин, рубидомицин, даунорубицин), доксорубицин (адриабластин, адриамицин), карминомицин и идарубицин [Гаузе 1987, Vidal 2000]. Также в клинической практике используются полусинтетические аналоги антрациклинов – антрациноиды, например, митоксантрон [Vidal 2000].

Рубомицин получают из культур Streptomyces coeruleorubidus subsp. rubomycini, Streptomyces peucetius, Streptomyces coeruleorubidus. Доксорубицин выделяется из мутантного штамма Streptomyces peucetius subsp. caesius или получается химическим путем из рубомицина и представляет собой 14-гидроксирубомицин.

Рубомицин и доксорубицин подавляют рост грамположительных бактерий, некоторых грибов и простейших, но малоактивны в отношении грамотрицательных бактерий стойчивость грамотрицательных бактерий к антрациклиновым антибиотикам определяется плохой проницаемостью их клеточной оболочки). Рубомицин и доксорубицин обладают сильным противоопухолевым действием [Гаузе 1987, Savchenko.1997, Buchner 1992, 1992, 1999, Wiernik 1992, Vidal 2000]. Несмотря на близость структуры всех антрациклиновых антибиотиков, имеются значительные различия в их химико-терапевтических свойствах и в метаболизме [Vidal 2000, Гаузе 1987, LeBot 1988, Robert 1993, 1987 Ph..pa, 1993 Ph ]. Рубомицин - один из наиболее активных препаратов для лечения различных вариантов острого лейкоза [ Vidal 2000, Buchner 1992, 1992, Wiernik 1992, Savchenko.1997]. Доксорубицин менее эффективен при лечении острых лейкозов [Гаузе 1987]. Рубомицин активен также при лечении лимфо- и ретикулосарком, хорионэпителиомы матки [Vidal 2000, Гаузе 1987]. Доксорубицин высокоактивен в терапии рака молочной железы, лимфогранулематозов, сарком мягких тканей и остеосарком. Положительные результаты были получены также при лечении рака легкого, щитовидной железы и мочевого пузыря, опухоли Вильмса [Vidal 2000, Гаузе 1987].

Механизмы действия антрациклиновых антибиотиков на биохимическом и молекулярных уровнях в целом сходны [Гаузе 1987]. Антрациклиновые антибиотики рубомицин и доксорубицин в эукариотических и прокариотических клетках избирательно подавляют синтез нуклеиновых кислот, причем в животных клетках это в течение длительного времени не сопровождается подавлением синтеза белка. По-видимому, первичным эффектом антрациклинов, приводящим к гибели клеток, является торможение синтеза нуклеиновых кислот. Это торможение объясняется подавлением матричной активности ДНК в процессах транскрипции и репликации: образование комплексов антрациклинов с ДНК приводит к ингибированию РНК-полимеразных и ДНК-полимеразных реакций. Образование комплексов с ДНК связано с интеркаляцией плоских хромофоров антрациклинов между парами оснований ДНК или РНК. Кажущиеся константы связывания рубомицина, доксорубицина и других антрациклинов сходны и имеют величину порядка 106 М–1 [Гаузе 1987, Брикинштейн 1985].

Имеются, однако, предположения о том, что цитотоксическое действие антрациклинов связано не только с интеркаляцией в ДНК, а и с другими механизмами, в частности с образованием свободных радикалов, повреждающих ДНК (вызывающих однотяжевые и двутяжевые разрывы) [Nakazawa 1985, Bachur 1979]. Третий возможный механизм цитотоксичности антрациклиновых антибиотиков связан с прямым воздействием на плазматическую мембрану [Гаузе 1987, Arancia 1995].

Токсичность (и в первую очередь - кардиотоксичность) антрациклинов - один из главных факторов, ограничивающих их применение в клинике. Поскольку частота проявления кардиотоксического действия зависит от дозы и резко повышается при высоких кумулятивных дозах, противоопухолевую активность антрациклиновых антибиотиков нельзя использовать полностью. У человека кардиотоксичность значительно повышается при кумулятивной дозе свыше 550-650 мг/м2, которая обычно принимается в расчет в качестве максимально допустимого уровня антрациклинов [Savchenko 1997 Singal 1998].

Рубомицин и доксорубицин вводятся больным внутривенно. После введения антрациклиновых антибиотиков в крови наблюдаются высокие концентрации антибиотика, которые быстро, за времена порядка минут или десятков минут, распределяются в органы и ткани [Гаузе 1987, Холодов 1985]. Высокие пиковые концентрации препарата в крови могут оцениваться с разных позиций. С одной стороны, существует достоверная зависимость между плазменной концентрацией и степенью ответа опухоли [Robert 1982], а с другой стороны, одной из важнейших причин кардиотоксичности является именно высокая плазменная концентрация антрациклиновых антибиотиков[Singal 1998].

Наиболее широкое распространение получило представление о свободнорадикальном механизме кардиотоксического действия антрациклиновых антибиотиков ) [Nakazawa 1985, Bachur 1979, Гаузе 1987]. В соответствии с этой гипотезой образующиеся в присутствии антрациклинов свободные радикалы и перекись водорода стимулируют перекисное окисление липидов, что приводит к повреждению митохондрий и ингибированию синтеза жизненно важных ферментов. Не исключается также возможность повреждения свободными радикалами ДНК митохондрий и ядер клеток сердечной мышцы. Считают, что низкая активность каталазы и супероксиддисмутазы в сердце по сравнению с другими органами объясняет его избирательную чувствительность к свободным радикалам, генерируемым антрациклиновыми антибиотиками. Различия в токсичности разных антрациклинов, очевидно, определяются их способностью накапливаться в сердце и поступать в клетки различных типов. Действительно, N, N-диметилдоксорубицин , оказывающий более сильное кардиотоксическое действие, чем исходный антибиотик, накапливается в сердце в концентрациях, в 8 раз превышающих концентрации доксорубицина, а карминомицин, в отличие от рубомицина и доксорубицина, не вызывает изменений саркоплазматического ретикулума в клетках сердца, но зато вызывает атрофию миофибрилл. Поэтому, чтобы ослабить кардиотоксический эффект антрациклинов, не снижая их противоопухолевого действия, необходимо уменьшить их поступление в клетки сердца. Предпринимаются различные попытки снизить токсичность антрациклиновых антибиотиков. Так, повторяющийся прием малых доз или длительные введения доксорубицина могут уменьшить опасность воздействия на сердце, при этом противораковая активность препарата не ослабляется [Legha 1982 Cancer, Legha 1982 Ann I, Gralla 1979, Preisler 1984]. Исследуется возможность снижения кардиотоксического действия доксорубицина и рубомицина с помощью различных антиоксидантов и ингибиторов свободных радикалов, таких как альфа-токоферол (витамин Е), цистеамин, N-ацетилцистеин, глутатион, витамин К3, пробукол, ловастатин, тролокс, кардиоксан, 5,5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide (DMPO), bi-(3,5-dimethyl-5-hydroxymethyl-2-oxomorpholin-3-yl) (DHM3) [Averbuch 1985, Lenzhofer 1983, 1983, Green 1984, Iliskovic 1998, Gutierrez 1983].

Главные метаболиты антрациклиновых антибиотиков в организме человека – 13-дигидропроизводные антрациклинов (для рубомицина – рубомицинол, для доксорубицина – доксорубицинол), образующиеся под действием цитоплазматической альдокеторедуктазы [Гаузе 1987]. Помимо восстановления антрациклинов альдокеторедуктазой, в клетках может происходить расщепление гликозидной связи в образованием соответствующих агликонов и 7-дезоксиагликонов, которые являются минорными метаболитами [Гаузе 1987]. Многие авторы считают, что даунорубицинол и доксорубицинол обладают так же, как и даунорубицин и доксорубицин, значительной противоопухолевой активностью, хоть и в меньшей степени [Гаузе 1987, Robert 1993]. Следует отметить, что в некоторых работах говорится, что даунорубицинол и доксорубицинол – малоактивны [Гаузе 1987]. Агликоны и 7-дезоксиагликоны антрациклиновых антибиотиков обладают очень низкой биологической активностью и являются продуктами инактивации антрациклиновых антибиотиков [Гаузе 1987]. Элиминация антрациклинов на 40 - 50% осуществляется печенью и только на 4 – 5 % почками [Schrijvers 1999].

Концентрацию антрациклиновых антибиотиков в крови и плазме определяют различными методами: спектрофлуорометрическим [Ataullakhanov 1997, Куликова 1998, Lonnerholm 1999,  Piazza 1980,1981, Zara 1999, Bogush 95, Barabas 92], методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [Холодов 1985, Zucchetti 1999, Robert 1982, LeBot 1988, Martini 1984 ], хроматомасс-спектрометрическим, тонкослойно-хроматографическим, радиоиммунным [Холодов 1985], микробиологическим [Lonnerholm 1999]. Наиболее распространенные – ВЭЖХ и спектрофлуорометрический метод. ВЭЖХ обеспечивает высокую чувствительность и возможность разделения метаболитов, но он относительно сложный, трудоемкий и дорогой. Спектрофлуорометрический метод прост, что позволяет промерять относительно большое количество проб, но он имеет меньшую чувствительность по сравнению с ВЭЖХ, а также в случае с антрациклинами не позволяет различать собственно антибиотик и его главный метаболит (для рубомицина – рубомицинол, для доксорубицина – доксорубицинол).

4. Попытки использования эритроцитов как переносчиков антрациклиновых антибиотиков

 Как было сказано выше, эритроциты могут служить носителями антрациклиновых антибиотиков. Использование эритроцитов-носителей может приводить к увеличению терапевтической эффективности, снижению токсичности этих препаратов, а также дает возможность осуществлять направленный транспорт в печень и селезенку. Терапевтическая эффективность эритроцитов, нагруженных антрациклиновыми антибиотиками была исследована на культурах клеток и на животных. Также были осуществлены первые введения эритроцитов-переносчиков доксорубицина в клинике.

В одной из первых работ по применению эритроцитов-переносчиков антрациклинов была показана возможность введения дауномицина в эритроциты путем обратимого осмотического лизиса и с помощью Амфотерицина В, продемонстрирована высокая терапевтическая активность таких эритроцитов, заполненных дауномицином in vitro, а также in vivo [Kitao 1978, Кitao 1980].

В другой работе противоопухолевая активность инкапсулированного доксорубицина сравнивалась с активностью свободного лекарства в мышиной раковой модели (L1210 лимфома). Мышам с удаленной селезенкой было введено 6,3 мг/кг свободного доксорубицина и 0,48 мг/кг инкапсулированного препарата. При этом рост легочной опухоли подавлялся сильнее при применении дексорубицина в эритроцитах. Был оценен TI (терапевтический индекс). Он оценивается как соотношение между дозой, при которой гибнет 10% мышей, LD10 и минимальной эффективной дозой ED10, дающей 90 % ингибирования печеночных метастазов. TI был равен 4,2 для инкапсулированного и 1,8 для свободного препарата. Была показана также меньшая кардиотоксичность инкапсулированного препарата. Сообщают, что 50% ингибирования роста раковых клеток в печени было получено при применении дозы 0, 48 мг/кг, в то время как такой же эффект был достигнут при применении 3 мг/кг свободного доксорубицина. Было достигнуто 90% ингибирования роста легочной опухоли при дозе свободного доксорубицина 12 мг/кг, в то время как применение инкапсулированного лекарства в дозе 1,5 мг/мл дало 80% ингибирования [Zocchi 1989, Benatti 1989].

Было показано, что рубомицин, связанный с мембранами эритроцитов при помощи глютарового альдегида или цис-аммониевой кислотой, оказывает значительную противоопухолевую активность in vitro на мышиных лейкемических клетках P388D1 и клетках человеческой остеосаркомы CRL1427, а также in vivo на мышах с P388D1 [Gaudreaut 1989].

На мышиных моделях с опухолью Р388 и лейкозом, индуцированным вирусом Раушера, продемонстрирована высокая терапевтическая активность эритроцитов, нагруженных рубомицином и необработанных глютаровым альдегидом. Обнаружено, что такие эритроциты оказывают на животных значительно меньший токсический эффект, чем свободный рубомицин [Ataullakhanov 1992, 1994].

 Во многих работах сообщают о направленном транспорте эритроцитов, наполненных доксорубицином и рубомицином, и обработанных глютаровым альдегидом в печень и селезенку [Zocchi 1987, 1988]. Например, мышам B6D2F1, разделенным на три группы, вводили раствор доксорубицина, эритроциты, наполненные доксорубицином и эритроциты с доксорубицином, обработанные глютаровым альдегидом, соответственно. Было обнаружено, что при введении свободного препарата через три часа в печени находилось 6 % от введенной дозы, при введении необработанных эритроцитов 23%  и при введении эритроцитов, обработанных глютаровым альдегидом - 70 %[ Zocchi 1987].

У крыс и кроликов после введения эритроцитов, обработанных глютаральдегидом с низкой концентрацией ( 0,05%) максимальное накопление отмечалась в селезенке, а при повышении концентрации глютаральдегида (свыше 0,1%) обработанные эритроциты, которые представляют сильно поврежденные клетки, удалялись в основном печенью [DeLoach 1977 BBA].

 Кроме того, при инкапсуляции в эритроциты изменяются фармакокинетические параметры доксорубицина. Фармакокинетика доксорубицина, введенного в эритроциты с последующей обработкой глютаровым альдегидом была исследована на собаках. Трем собакам был сначала введен свободный препарат в дозе 0, 4 мг/кг веса тела, а спустя три недели та же доза была введена в эритроцитах. При применении свободного доксорубицина начальная фаза характеризуется быстрым уменьшением концентрации лекарства в плазме с периодом полувыведения 5, 1 мин и концентрационным пиком 330 нг/мл, и спустя 24 часа лекарство в плазме не регистрируется. При введении инкапсулированного препарата концентрационный пик сразу после введения составлял 18, 3 нг/мл, период полувыведения в начальной фазе составлял 26 минут, и спустя 120 часов после инъекции концентрация препарата составляла примерно 10 нг/мл. Площадь под фармакокинетической кривой при применении инкапсулированного препарате была примерно в 5 раз больше, чем у свободного доксорубицина [Gasparini 1992]. В другой работе тоже исследовалось, как изменяется фармакокинетика доксорубицина после введения его в эритроцитах, обработанных глютаровым альдегидом. Показано увеличение времени циркуляции препарата и увеличение площади под фармакокинетической кривой со 136 мкг ч/л до 734 мкг ч/л [Tonetti 1991].

Для изучения возможного токсического действия эритроцитов, обработанных глютаральдегидом без инкапсулированного препарата было проведено исследование [Satterfield 1992], в котором оценивалась токсичность собачьих эритроцитов после обработки глютаральдегидом. Обработанные глютаральдегидом эритроциты вводились двум группам испытуемых собак с дозировкой глютарового альдегида, которая в 1 и 3 раза превышала таковую при приготовлении эритроцитов-переносчиков доксорубицина в других экспериментах на собаках. Третья группа животных использовалась в качестве контрольной, им вводили эритроциты, необработанные глютаральдегидом. У одной собаки в группе c трехкратной дозой отмечены некоторые признаки клинической токсичности (рвота и периферическая гиперемия). Имелись значительные увеличения в уровнях креатининкиназы и аспартат-амино-трансферазы у всех собак, которые получали обработанные эритроциты. Спустя 24 - 48 часов эти показатели возвратились к своим уровням, которые имели место до лечения.

Описан опыт введения эритроцитов, наполненных доксорубицином и обработанных глютаровым альдегидом собакам с лимфосаркомой . Введение таких эритроцитов индуцировало полную или частичную ремиссию с исчезновением признаков болезни при выраженных токсических реакциях. У всех собак отмечалось глубокая миелосупрессия [Matherne 1994].

Тот факт, что обработка наполненных эритроцитов глютаральдегидом иногда приводит к нежелательным побочным эффектам должен учитываться при применении эритроцитов-носителей.

Распределение эритроцитов, обработанных глютаровым альдегидом, было исследовано при введении их пациентам. Аутологичные эритроциты были обработаны глютаровым альдегидом с концентрацией 0, 15%. Перед введением эритроциты подвергались радиоактивной маркировке. Было установлено, что обработанные эритроциты в основном усваивались селезенкой, в печени и легких уровни радиоактивности были сопоставимы, но ниже, чем в селезенке [Tonetti 1994]. Нужно отметить, что в данном случае никаких побочных эффектов или признаков токсичности после ввода эритроцитов, обработанных глютаровым альдегидом не было выявлено.

Описан случай применения инкапсулированного препарата для лечения пациента с метастазами рака прямой кишки в печень [Tonetti 1992]. Доксорубицин в дозе 10 мг/м2 вводился в свободном виде в печеночную артерию и определялись уровни концентраций доксорубицина и его метаболитов в плазме. Затем доксорубицин в той же дозировке вводился в нескольких курсах в эритроцитах, обработанных 0, 15% и 0, 3% раствором глютарового альдегида. После введения препарата в эритроцитах отмечалось понижение максимума уровней препарата в плазме в сравнении с введением свободного препарата. Это снижение более значительно для эритроцитов с обработкой 0, 3%. В этой же работе отмечалось побочное действие доксорубицина, инкапсулированного в эритроциты, обработанные глютаровым альдегидом. При инъекциях стандартной формы доксорубицина в дозе 10 мг/м2 в печеночную артерию побочных эффектов не было, за исключением тошноты. Однако, во всех случаях после нескольких введений эритроцитов, нагруженных доксорубицином и обработанных глютаральдегидом, развилась тяжелая миелосупрессия. У больного также отмечалась сильная лихорадка в ответ на введение эритроцитов, нагруженных доксорубицином. Наблюдавшиеся токсические эффекты возможно были связаны с тем, что в указанных работах доксорубицин был иммобилизован в эритроцитах с помощью глютарового альдегида. Обработка глютаровым альдегидом могла существенно повлиять на свойства антибиотика, в том числе и на его токсичность [Ataullakhanov 1996].

 Важным шагом в клиническом использовании эритроцитов-переносчиков было введение эритроцитов, нагруженных доксорубицином, трем больным с лимфопролиферативными заболеваниями [Ataullakhanov 1997, Куликова 1998]. Эритроциты были нагружены доксорубицином за счет связывания препарата клетками в изотонической среде без обработки глютаровым альдегидом. Введение таких эритроцитов не сопровождалось какими-либо побочными реакциями и осложнениями. При этом наблюдалось снижение пиковой концентрации доксорубицина и увеличение времени его циркуляции в крови в несколько раз [Ataullakhanov 1997, Куликова 1998].

Таким образом, применение эритроцитов-переносчиков антрациклиновых антибиотиков открывает возможности пролонгирования действия антибиотиков при снижении их токсичности. Снижение пиковой концентрации и уменьшение токсичности антрациклинов при применении эритроцитов-переносчиков может решить вопрос о повышении дозы антрациклиновых антибиотиков.

6. Двухчастевая модель описания  фармакокинетики после введения различных форм антрациклиновых антибиотиков.

В клинических исследованиях любых лекарственных препаратов изучение фармакокинетики играет чрезвычайно важную роль [Холодов 1985].

На типичных кривых изменения концентрации препарата в крови или плазме от времени после однократного внутривенного введения обычно наблюдается двухфазное падение концентрации препарата: сначала быстрое снижение концентрации (а-фаза), а затем – медленное (в-фаза). В а-фазе препарат исчезает из крови в основном за счет проникновения в органы и ткани, а после того, как установится равновесие, снижение концентрации происходит за счет элиминации препарата из организма (в-фаза). Процесс элиминации складывается из выведения (экскреции) неизменного препарата различными путями и превращения (метаболизма, биотранформации) препарата в другие вещества.

Для описания динамики концентрации препарата в крови или плазме используют математические модели фармакокинетики, из которых достаточно корректной является двухчастевая (двухкамерная) модель.

В этой модели жидкости организма представлены как две «части» (пространственные камеры). Условно считается, что к первой (центральной) части относится, кроме крови, жидкость тех органов и тканей, в которые препарат проникает очень быстро, а ко второй части – все остальные ткани. Используя эту модель при внутривенном введении, концентрация препарата в крови описывается уравнением:

C = A exp (-at) + В exp (-вt),

где А, В, а, в – параметры, связанные с фармакокинетическими константами выражениями

А = Со (а – k 21) / (а – в)

В = Со (k 21 – в) / (а – в)

а + в = k 21  + k 12  + k эл

а в = k 21 k эл

Т1 ≈ 1 / а

Т2 ≈ 1 / в

В этих формулах Со – величина кажущейся исходной концентрации, k 12 и k 21 - константы скорости проникновения препарата из первой части во вторую (k 12 ) и обратно (k 21 ), k эл – константа скорости элиминации препарата, Т1 – время полувыведения препарата в а-фазе (быстрой), Т2 - время полувыведения препарата в в-фазе (медленной). Первое слагаемое в уравнении описывает в основном а-фазу, а второе слагаемое – в-фазу. В случае, когда величина а значительно больше, чем в, эти фазы четко разделяются на фармакокинетической кривой [Холодов 1985]. Также одним из самых важных фармакокинетических параметров является площадь под фармакокинетической кривой (ППК), получающаяся интегрированием по времени кривой зависимости концентрации исследуемого препарата от времени. ППК имеет смысл экспозиции дозы введенного вещества и отражает средний уровень концентрации препарата за весь курс [Холодов 1985].

Существует достаточно много работ, в которых описывается фармакокинетика антрациклиновых антибиотиков: довольно точно кинетику падения концентрации стандартной формы даунорубицина и доксорубицина в крови описывает двухчастевая [Thomson 1999, Ataullakhanov 1997, Куликова 1998] или трехчастевая [Robert 1982, 1993] модель. Следует отметить, что во всех фармакокинетических исследованиях антрациклиновых антибиотиков отмечается трудность изучения быстрой первой стадии распределения препарата, а также большие индивидуальные разбросы фармакокинетических параматров (обусловленные такими факторами как пол, возраст, количество предыдущих курсов химиотерапии и др.) [Гаузе 1987, Lonnerholm 1999, Robert 1982, 1993]. Также в некоторых работах отмечается, что из-за индивидуальных разбросов не наблюдалось дозовой зависимости фармакокинетических параметров (времена полувыведения, клиренс, площадь под фармакокинетической кривой) при введении доксорубицина [Robert 1983, Piazza 1980].

Также двухчастевой моделью можно описать изменение концентрации доксорубицина после введения трем пациентам эритроцитарной формы доксорубицина [Ataullakhanov FI 1997, Куликова 1998 ]. Как видно, изменение концентрации стандартных форм антрациклиновых антибиотиков в крови больных описано достаточно хорошо. В то же время изучение фармакокинетики рубомицина и доксорубицина после введения больным эритроцитов-переносчиков этих антрациклиновых антибиотиков представляется крайне важной задачей. Кроме осуществления контроля уровня препарата в крови при введении новой лекарственной формы эритроцитов-переносчиков, будет возможно ответить на вопрос о возможности повышении дозы антрациклиновых антибиотиков, вводимой больным при помощи эритроцитов-переносчиков.

6. Сведения о эремомицине

Эремомицин – новый антибиотик из группы циклических гликопептидов (рис. 2), активный в отношении грамположительных микроорганизмов: стафилококков, энтерококов, стрептококков, коринебактерий, клостридий и других. Его активность распостраняется также на штаммы, обладающие множественной лекарственной устойчивостью, в том числе к бета-лактамным антибиотикам, широко известные как метициллин-устойчивые золотистые стафилококки и коагулаз-негативные эпидермальные стафилококки. По химическому строению является новым представителем группы циклических гликопептидов, к которой относятся используемые в медицинской практике ванкомицин, тейкопланин и ристомицин. Эремомицин в несколько раз более активен и менее токсичен, чем ванкомицин и ристомицин. В отличие от ванкомицина и ристомицина, эремомицин не обладает местно-раздражающими свойствами и может вводиться не только внутривенно, но и внутримышечно. Эремомицин может быть использован для лечения тяжелых септических заболеваний, вызванных грамположительными микроорганизмами, устойчивыми к другим антибиотикам, а также при аллергии к пенициллинам. Важное значение может иметь его эффективность в отношении заболеваний, вызванных анаэробами (клостридиями), в часности при антибиотико-ассоциированном псевдомембранозном колите. Он также может оказаться очень важным для профилактики и лечения тяжелых инфекций у больных с ослабленной иммунореактивностью: у онкологических больных (в особенности при лейкозах) и почечных больных, находящихся на длительном амбулаторном диализе; при инфекциях новорожденных, при инфекциях, обусловленных вживлением медицинских устройств (катетеры, сосудистые протезы, ортопедические устройства и т.п.), при хирургических инфекциях.

Препарат легко растворим в воде (1:8), растворах глюкозы и новокаина, практически не растворим в 95% этаноле, хлороформе, эфире. Ультрафиолетовый спектр 0,025% раствора эремомицина в воде в области от 250 до 320 нм имеет максимум поглощения при длине волны 280±1 нм.

Фармакологические свойства. При внутривенном, подкожном или внутримышечном введении эремомицина сульфата кроликам и собакам в терапевтических дозах антибиотик обнаруживается в сыворотке крови в течение 6-8 часов в концентрациях, обеспечивающих подавление 90% чувствительных к нему штаммов микроорганизмов. Максимальная концентрация эремомицина в сыворотке крови кроликов и собак достигается через два часа после подкожного или внутримышечного введения, и с этого времени концентрация антибиотика в сыворотке крови животных после внутривенного и анутримышечного введения весьма близки. Антибиотик обнаруживается в больших количествах в почках, селезенке, легких, где его концентрация превышает концентрацию в крови. Меньше его содержится в мышце сердца и печени. Через неповрежденный гематоэнцефалический барьер проникает в небольших количествах.

После однократного введения в желудок кроликов эремомицина в дозе 100 мг/кг антибиотик всасывается слабо. Максимальные концентрации в крови, обнаруживаемые через 5 часов после введения, составляют в среднем 1,4 мкг/мл, что, хотя и выше МПК для большинства чувствительных к эремомицину организмов, примерно в 17 раз ниже, чем после внутривенного или подкожного введения тех же доз эремомицина в эти же сроки. Абсолютная биодоступность составила в среднем 7%.

В высоких дозах, особенно при нарушениях функции почек, эремомицина сульфат может накапливаться в организме и оказывать нефротоксическое действие.

Способ применения и дозы. Эремомицина сульфат рекомендуется  вводить внутривенно или внутримышечно. Для внутривенного микроструйного введения 0,5 г препарата растворяют в 5-10 мл воды для инъекций или 5% раствора глюкозы. Дальнейшее разведение производят в 100 - 150 мл 5% раствора глюкозы до концентраций 0,9 - 1,3 мг/мл и вводят в течение 60 минут. Для внутримышечного введения 0,5 г эремомицина сульфата растворяют в 5-10 мл воды для инъекций или 0,5% раствора новокаина. Препарат вводят в дозе 0,5 г 2 раза в сутки с интервалом в 12 часов.

Предпосылки для инкапсулирования эремомицина в эритроциты. Как и для многих других антибиотиков, увеличение времени циркуляции эремомицина в крови может значительно увеличить его эффективность. Уменьшением пиковых концентраций эремомицина возможно снижение его токсичности при введении высоких доз этого антибиотика.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Используемые лекарственные препараты и химические реактивы

В работе для клинических исследований использовался фармацевтический препарат рубомицина - рубомицина гидрохлорид (ФАО «Ферейн», Россия); фармацевтические препараты доксорубицина - доксорубицина гидрохлорид (ФАО «Ферейн», Россия), адриабластин («Farmitalia», Италия), адриабластин («Pharmacia&Upjohn», Италия), растоцин (АО «Плива», Хорватия); фармацевтический препарат винкристина – винкристина сульфат («Pierre fabre», Франция); липосомольная форма рубомицина – DaunoXome («NeXstar», США); фармацевтический прапарат эремомицина – эремомицина сульфат, любезно предоставленный Институтом по изысканию новых антибиотиков РАМН.

Для отбора аутокрови у пациентов использовались стандартные пластиковые контейнеры «Гемакон» (Россия), содержащий 100 мл гемоконсерванта «Глюгицир» (натрия гидроцитрата двузамещенного - 20 г, глюкозы - 30 г, воды для инъекций – до 1 л), или пластиковые контейнеры фирмы Baxter, содержащий 63 мл гемоконсерванта CPDA-1 (декстрозы – 2 г, натрия гидроцитрата - 1,66 г, лимонной кислоты - 206 мг, натрия монофосфата – 140 мг, аденина – 17,3 мг).

Для экспериментов in vitro использовались химические реактивы, производства «Реахим», чистота – «осч» или «чда»

2. Методики определения антрациклиновых антибиотиков в биологических жидкостях (кровь, плазма, костный мозг, ликвор, амниотическая жидкость).

Для определения рубомицина и доксорубицина в крови и плазме крови использовался спектрофлюориметрический метод, описанный в [Атауллаханов 1998, Куликова 1998 ]. Рубомицин и доксорубицин из образцов экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К2СО3 и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация рубомицина и доксорубицина определялась спектрофлюорометрически по излучению на длине волны 600 нм (для рубомицина) и 588 нм (для доксорубицина) при длине волны возбуждения 476 нм. Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации. В работе использовались спектрофлюориметры Jobin Yvon Spectrofluo JY3 D (Франция) и Shimadzu (Япония). Минимальная концентрация препарата, которую позволяет определить спектрофлюориметрический метод в пробах крови и плазмы, составляла 20 нг/мл для Jobin Yvon Spectrofluo JY3 D и 10 нг/мл для Shimadzu RF-5000.

Для разработки методики определения рубомицина и доксорубицина в костном мозге, ликворе и амниотической жидкости предварительно была исследована возможность хлороформной экстракции рубомицина и доксорубицина из образцов костного мозга, ликвора и амниотической жидкости. Для этого к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К2СО3, после этого – 3.0 мл, 5.0 мл или 10.0 мл хлороформа. Далее смесь интенсивно встряхивалась. Показано, что из образцов ликвора и амниотической жидкости полная экстракция осуществима при добавлении 3 мл хлороформа. Из образцов костного мозга полной экстракции добиться не удалось (только 70-80%).

Также была исследована возможность точного количественного определения рубомицина и доксорубицина, экстрагированного из образцов ликвора и амниотической жидкости. Для этого спекторфлюориметрически определенная (заранее известная) концентрация рубомицина и доксорубицина, экстрагированного из образцов, сравнивалась с калибровочной прямой, построенной с использованием хлороформных экстрактов растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации в воде. Установлено соответствие.

Из проделанной работы следует, что методика определения рубомицина и доксорубицина в образцах ликвора и амниотической жидкости не отличается от таковой для крови и плазмы.

Для определения рубомицина и доксорубицина в образцах костного мозга предлагается использовать ту же методику, что и для образцов крови и плазмы, только в качестве калибровки использовать хлороформные экстракты из калибровочных образцов костного мозга. Для этого несколько образцов костного мозга, не содержащего антрациклины, следует смешать с раствором рубомицина или доксорубицина (в зависимости от того, концентрацию какого антибиотика нужно определить в костном мозге) известной концентрации. Суспензии инкубировать при 37оС в течение 0,5 – 1,0 часа при перемешивании. Таким образом приготовятся калибровочные образцы костного мозга, содержащие известную концентрацию антибиотика.

Отдельно установлено, что образцы костного мозга, ликвора и амниотической жидкости можно хранить в замороженном виде при температуре (–15оС) – (- 20оС) без потери спектрофлюориметрических характеристик рубомицина или доксорубицина не менее 3 месяцев.

3. Связывание рубомицина и доксорубицина с эритроцитами пациентов.

Было исследовано связывание рубомицина и доксорубицина с эритроцитами здоровых доноров и пациентов. Эти исследования проводились в цельной крови и в суспензии отмытых клеток. Для этого к цельной крови или суспензии эритроцитов добавлялся раствор рубомицина или доксорубицина, после чего смесь инкубировали при перемешивании в течение трех часов при 37оС. Для отмывки и инкубации отмытых эритроцитов использовался изотонический буферный раствор PBS. Во время инкубации отбирались образцы для определения концентрации препарата в пробе и во внеклеточной среде (для отделения клеток образцы центрифугировались 10 минут при 1000 g). Концентрация рубомицина в эритроцитах рассчитывалась на основании данных о его концентрации в крови (в суспензии) и во внеклеточной среде по формуле:

Ce = (Co – Cm(1 – Ht))/Ht

где

Ce - концентрация антибиотика в эритроцитах,

Co – концентрация антибиотика в крови (в суспензии),

Cm - концентрация антибиотика в среде,

Ht – значение гематокрита крови (суспензии).

Рубомицин и доксорубицин из образцов экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К2СО3 и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация препарата в хлороформных экстрактах определялась спектрофотометрически по поглощению света на длине волны 486 нм для рубомицина и 500 нм для доксорубицина (точность измерения 5%). Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов рубомицина и доксорубицина известной концентрации.

 Отдельно было проверено возможное связывание рубомицина с полимерным контейнером, а также изучена кинетика связывания эритроцитов с рубомицином в полимерном контейнере (связывание эритроцитов с доксорубицином в полимерном контейнере было исследовано ранее в нашей лаборатории). Для проверки возможного связывания рубомицина с полимерным контейнером в контейнер помещался раствор рубомицина с концентрацией 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл и 5,0 мг/мл и инкубировался при 37оС. В течение инкубации из контейнера отбирались образцы для определения концентрации рубомицина в растворе. Для изучении кинетики связывания эритроцитов с рубомицином в контейнере полимерный контейнер, содержащий консервированную эритроцитарную массу, предварительно термостатировался в водном термостате 1 час, после чего в него вводили 70 мл физиологического раствора, содержащего 100 мг рубомицина, и полученная суспензия инкубировалась 1 час при 37 градусах. В течение инкубации из полимерного контейнера отбирались образцы суспензии, для определения содержания рубомицина в среде. Определялся гематокрит исходной массы и полученной суспензии.

4. Повреждающее воздействие рубомицина и доксорубицина на эритроциты человека.

Исследования повреждающего воздействия рубомицина и доксорубицина на эритроциты  проводилось на донорских эритроцитах, выделенных из консервированной эритроцитарной массы , заготовленной на стандартном гемоконсерванте «Глюгицир». Эритроцитарную массу центрифугировали 10 минут при 1000 g и удаляли плазму и верхний слой клеток, содержащий лейкоциты и тромбоциты. После этого эритроциты трижды отмывали путем ресуспендирования в 3 кратном объеме изотонического забуференного раствора PBS (NaCl - 140mM, Na2HPO4 - 9mM, NaH2PO4 - 1.3mM, глюкоза 5mM, pH=7,4) с последующим центрифугированием 10 минут при 1000 g и удалением надосадка. Отмытые эритроциты ресуспендировались в PBS, содержащем необходимое количество антибиотика, до значения гематокрита 40-50% и суспензия инкубировалась при постоянной температуре и перемешивании до 8 часов (гематокрит суспензии (Ht) – отношение объема клеток в суспензии ко всему объему суспензии). В качестве контроля использовались эритроциты, инкубируемые в растворе PBS, не содержащем антибиотик. Для инкубации эритроцитов с доксорубицином pH инкубационного раствора снижался до значения 7,0, поскольку при больших значениях pH доксорубицин плохо растворим.

Для определения выхода гемоглобина и К+ из эритроцитов образцы суспензии центрифугировались 10 минут при 1000g. Концентрацию гемоглобина в надосадке определяли на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по высоте пика оптической плотности в спектре гемоглобина при длине волны 415 нм. Общее содержание гемоглобина в суспензии определяли по высоте пика при 415 нм в спектре водного лизата суспензии. Относительный выход гемоглобина (в %) определяли как отношение высот пиков при 415 нм в спектрах надосадочного раствора и водного лизата. Концентрацию К+ в надосадках и в водных лизатах суспензии определяли на пламенном фотометре.

Подсчет числа клеток в суспензии и определение их объема производилось кондуктометрическим методом [Руденко 1995] с помощью прибора Coulter-Counter” (Франция).

Деформируемость эритроцитов оценивали по их фильтруемости (способности проходить по порам) путем измерения скорости протекания суспензии клеток через мембранные фильтры с цилиндрическими порами при давлении 60 мм водного столба с помощью прибора ИДА-01, представляющего собой модификацию гемореометра Хансса [Аттаул 1994 «Анализ, Лисов 1994]. Перед измерением фильтруемости эритроцитов из образцов инкубируемой суспензии отбирали пробы, эритроциты трижды отмывали раствором PBS и  разбавляли раствором PBS до значения гематокрита 1 % или 0,5 %. В некоторых экспериментах суспензия эритроцитов разбавлялась раствором PBS до гематокрита 0,1 % без трехкратной отмывки. Для каждого фильтра определяли время протекания 250 мкл ресуспендирующего раствора (Tb) и суспензии эритроцитов (Ts). Для характеристики деформируемости эритроцитов использовали отношение этих времен (Tb/Ts). В работе использовали фильтры толщиной 9 мкм с диаметром пор 3 мкм. Измерения проводили при комнатной температуре (21оС). Погрешность измерения (Тb/Ts) составляла около 10%.

Концентрацию ATP в эритроцитах определяли модифицированным люциферин-люциферазным методом [Атауллаханов 1981].

Также было исследовано влияние рубомицина на деформируемость и электрофоретическую подвижность (ЭФП) эритроцитов больных острыми лейкозами (ОЛ) при инкубации эритроцитов больных с раствором антибиотика в цельной крови больного. Деформируемость эритроцитов больных оценивали так же, как и деформируемость донорских эритроцитов, для характеристики деформируемости использовали отношение времен (Tb/Ts). ЭФП эритроцитов как характеристика электрического заряда поверхности эритроцитов определялась по скорости перемещения отдельных клеток в электрическом поле по формуле:

ЭФП=Р/(ЕТ),

где Е – напряженность электрического поля (вольт/см),

     Р – расстояние, пройденное клеткой, определенное с помощью светового микроскопа (мкм),

     Т – время прохождения клеткой расстояния Р (с).

Для получения достоверных результатов определялась ЭФП для 20 разных эритроцитов, вычислялось среднее значение и стандартное отклонение. Подробно методика определения ЭФП эритроцитов описана в [Козинец 1986].

5. Фармакокинетика рубомицина после введения больным с острыми лейкозами рубомицина, связанного с аутоэритроцитами.

Исследования фармакокинетики рубомицина после введения больным рубомицина, связанного с аутоэритроцитами проведены совместно с Гармаевой Т.Ц., научный консультант – д.м.н., профессор Савченко В.Г. В отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН был составлен экспериментальный протокол «Применение рубомицина, связанного с эритроцитами, у больных с резистентными формами и рецидивами острых лейкозо (I фаза )» (1997 г.) и форма информированного согласия больного на проведение лечения по данному протоколу, утвержденная в этическом комитете ГНЦ РАМН.

В данное исследование были включены 14 больных с острым лейкозом (ОЛ), из них 8 больных с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и 6 больных с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). Отбор больных на проведение лечения по протоколу с применением эритроцитов-переносчиков проводился после констатации резистентности к проводимой стандартной химиотерапии или рецидива заболевания. Пол - 7 мужчин и 7 женщин. Возраст пациентов колебался от 15 до 60 лет, медиана составила 41 год.

Химиотерапия проводилась по протоколам лечения ОМЛ «7+3» (одной больной - по программе DidAC) и ОЛЛ “RACOP” [Wiernik 1992, Buchner 1992, 1992, Савченко 1997], согласно которым рубомицин вводится пациенту однократно в 1, 2, 3 дни курса в дозах 45 или 60 мг/м2 на введение.

В данном исследовании 5 пациентам первые два введения рубомицина осуществлялись в виде стандартной формы препарата (раствор рубомицина), третье введение рубомицина осуществлялось в эритроцитной форме. Одному из пациентов такой курс проводили дважды. (Всего 6 введений).

9 больным все три введения рубомицина были проведены в эритроцитной форме. (Всего 27 введений).

Одной больной перед проведением курса с применением эритроцитов-переносчиков была удалена селезенка, у нее первые два введения рубомицина осуществлялись в виде стандартной формы препарата (раствор рубомицина), третье введение рубомицина осуществлялось в эритроцитной форме. (Всего 1 введение).

В качестве контроля у некоторых из этих больных была исследована фармакокинетика рубомицина при трехкратном введении стандартной формы препарата в тех же дозах.

Для приготовления эритроцитов, нагруженных рубомицином в клинических условиях была разработана специальная портативная установка (совмещающая в себе механическую качалку, полупроводниковый светоизолированный термостат для пластиковых контейнеров и полупроводниковый прибор для контроля температуры контейнера, а также весы для контроля количества взятой крови). Схема приготовления эритроцитов-переносчиков антрациклиновых антибиотиков в цельной крови больных и схема установки для инкубации эритроцитов с антрациклиновыми антибиотиками представлены на рис. 3. Полученный препарат эритроцитов-переносчиков рубомицина далее будет именоваться КПДА (кровь, прединкубированная с рубомицином (даунорубицином)).

Для приготовления КПДА у пациента отбиралось 300 – 400 мл крови из центрального венозного катетера в пластиковый контейнер «Гемакон» или Baxter. Во время отбора крови в контейнер осуществлялось термостатирование при 37оС и перемешивание уже отобранной крови. Количество отобранной крови контролировалось взвешиванием.

После отбора необходимого количества крови, контейнер с кровью отсоединяли от катетера больного, катетер стандартным образом промывали и закрывали. Одновременно герметично перекрывался шланг контейнера с кровью, по которому поступала кровь в контейнер от больного. В процедурном кабинете в стерильных условиях в шланг контейнера с кровью шприцем вводилось 20 – 50 мл раствора рубомицина в физиологическом растворе, после чего шланг герметично перекрывался пережиманием корнцагом и перевязыванием. Затем контейнер помещался на качалку и инкубировался в течение 1 часа при 37оС. После окончания инкубации приготовленный препарат КПДА вводился пациентам через центральный венозный катетр в течение 1 – 1,5 часа по процедуре, идентичной введению ресуспендированной консервированной донорской эритроцитарной массы при заместительной гемокомпонентной терапии.

Для контроля стерильности процедуры приготовления КПДА делался лабораторный бактериологический анализ проб крови из контейнера после отбора крови пациента и перед введением содержимого контейнера пациенту.

Для определения концентрации рубомицина у пациента отбирались образцы крови. При введении стандартной формы рубомицина первая проба отбиралась непосредственно после окончания введения, далее через 5, 15, 30 минут, 1, 2, 6, 18, 24 часа после окончания введения. При введении КПДА первая проба отбиралась через 30 минут после начала введения, а следующая проба – непосредственно после окончания введения, далее через 0.5, 1, 2, 6, 18, 24 часа после окончания введения КПДА. После введения КПДА в 3 день курса пробы регулярно отбирались в течение 5 – 7 дней раз в день до снижения концентрации препарата в крови до нерегистрируемого уровня. Образцы крови и плазмы (полученные путем центрифугирования крови в течение 10 минут при 1000 g ) хранились в замороженном виде при (–15о ) – ( - 20оС).

После завершения отбора всех проб у данного больного, образцы крови и плазмы размораживались для определения концентрации рубомицина. Концентрацию рубомицина определяли по методике, описанной выше в разделе «Методики определения антрациклиновых антибиотиков в биологических жидкостях».

6. Фармакокинетика доксорубицина после введения больным с лимфопролиферативными заболеваниями доксорубицина, связанного с эритроцитами.

Научный консультант исследования – д.м.н., профессор Пивник А.В.

В Отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии ГНЦ РАМН был составлен экспериментальный протокол "Применение доксорубицина, связанного с эритроцитами, у больных с лимфопролиферативными заболеваниями" (1996 г.) и форма информированного согласия больного на проведение лечения по данному протоколу, утвержденная в этическом комитете ГНЦ РАМН.

В данное исследование были включены 17 больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями 3 и 4 стадии. Отбор больных на проведение лечения по протоколу с применением эритроцитов-переносчиков проводился после констатации резистентности к проводимой стандартной химиотерапии, рецидива заболевания или плохой переносимости стандартной формы антрациклиновых антибиотиков. Пол - 10 мужчин и 7 женщин. Возраст пациентов колебался от 16 до 75 лет, медиана составила 50 лет. Химиотерапия проводилась по протоколам химиотерапии СНОР или ABVD, согласно которым доксорубицин вводится пациенту однократно за курс, в дозах 25 или 50 мг/м2 на введение.

В качестве контроля у 7 больных из экспериментальной группы и 2 больных не из экспериментальной группы была исследована фармакокинетика доксорубицина при введении стандартной формы препарата в тех же дозах (табл.   ).

Для приготовления препарата доксорубицина, связанного с эритроцитами, использовали:

- аутологичную цельную кровь пациентов (в этом случае препарат будет называться КПДО – кровь, прединкубированная с доксорубицином. Осуществлено 8 введений).

- аутологичные эритроциты, выделенные из крови удалением плазмы (АЭНДО – аутоэритроциты, нагруженные доксорубицином. Осуществлено 9 введений),

- консервированные донорские эритроциты (ДЭНДО – донорские эритроциты, нагруженные доксорубицином. Осуществлено 10 введений).

Для приготовления препарата КПДО использовалась специальная портативная установка, та же, что и для приготовления КПДА (рис. 3). Процедура приготовления КПДО была идентичной процедуре приготовления КПДА.

Для приготовления АЭНДО у пациента с помощью клинической установки для плазмафереза отбиралось около 400 - 500 мл крови, плазма этой крови возвращалась пациенту сразу, а в контейнер с эритроцитами вводилось 100 - 150 мл раствора доксорубицина в физиологическом растворе. Затем контейнер помещался на качалку и инкубировался в течение 1 часа при 37оС.

Для приготовления ДЭНДО в контейнер с консервированными донорскими эритроцитами (после проверки их совместимости с плазмой пациента) вводилось 150 - 200 мл раствора доксорубицина в физиологическом растворе. Затем контейнер помещался на качалку и инкубировался в течение 1 часа при 37оС.

После окончания инкубации приготовленный препарат доксорубицина, связанного с эритроцитами (КПДО, или АЭНДО, или ДЭНДО) вводился пациентам через центральный венозный либо переферический катетр в течение 1 – 1,5 часа по процедуре, идентичной введению ресуспендированной консервированной донорской эритроцитарной массы при заместительной гемокомпонентной терапии.

Для определения концентрации доксорубицина у пациента отбирались образцы крови. При введении стандартной формы доксорубицина первая проба отбиралась непосредственно после окончания введения, далее через 15, 30 минут, 1, 2, 6, 18, 24 часа после окончания введения. При введении доксорубицина, связанного с эритроцитами первая проба отбиралась непосредственно после окончания введения, далее через 15, 30 минут, 1, 2, 4, 6, 8, 18, 24, 48 часов после окончания введения, далее – регулярно, до снижения концентрации препарата в крови до нерегистрируемого уровня. Образцы крови и плазмы (полученные путем центрифугирования крови в течение 10 минут при 1000 g) хранились в замороженном виде при (–15о ) – ( -20оС).

После завершения отбора всех проб у данного больного, образцы крови и плазмы размораживались для определения концентрации доксорубицина. Доксорубицин из образцов крови и плазмы экстрагировался с помощью хлороформа. С этой целью к 1 мл образца добавлялось 10 мкл 1,6М К2СО3 и 3 мл хлороформа. Смесь интенсивно встряхивалась и центрифугировалась 3 мин при 1000 g. Хлороформный экстракт (нижний слой в центрифужной пробирке) аккуратно отбирался стекляным шприцом. Концентрация доксорубицина определялась спектрофлюорометрически по излучению на длине волны 588 нм при длине волны возбуждения 476 нм. Для калибровки использовались хлороформные экстракты растворов доксорубицина известной концентрации.

7. Инкапсулирование эремомицина в мышиные и человеческие эритроциты, оценка эффективности.

7.1 Исследование проницаемости мембраны эритроцитов человека для эремомицина при инкубации их с раствором эремомицина.

Эритроциты выделяли из консервированной донорской крови, заготовленной с гемоконсервантом "Глюгицир". Кровь центрифугировали 10 минут при 1000 g и удаляли надосадок. Затем эритроциты отмывали два раза в изотоническом забуференном растворе ( раствор PBS ) следующего состава: NaCl - 140mM, Na2HPO4 - 9mM, NaH2PO4 - 1,3mM, глюкоза - 1mM, pH=7,4. В полученной суспензии определяли гематокрит. К выделенным эритроцитам добавляли эремомицин до концентрации 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,5 мг/мл и инкубировали при температуре 37оС в течение 90 минут. В течение инкубации отбирались пробы для определения концентрации эремомицина во всей суспензии и в инкубационной среде. Концентрация эремомицина определялась спектрофотометрически на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по измерению высоты пика оптической плотности в спектре эремомицина при длине волны 280 нм. В качестве калибровочных растворов использовались водные растворы эремомицина известной концентрации.

7.2 Определение повреждающего воздействия эремомицина на эритроциты человека

Повреждающее воздействие эремомицина на эритроциты человека определяли по выходу гемоглобина из эритроцитов. Использовались консервированные донорские эритроциты. Перед экспериментом трехкратно отмывалось 10 мл эритроцитов в трехкратном объеме изотонического буферного раствора PBS центрифугированием 10 минут при 1000 g. К отмытым эритроцитам добавляли раствор эремомицина в PBS до концентрации 6 мг/мл суспензии и инкубировали 2 часа при температуре 37оС. Концентрацию гемоглобина в надосадке определяли на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по высоте пика оптической плотности в спектре гемоглобина при длине волны 415 нм. Общее содержание гемоглобина в суспензии определяли по высоте пика при 415 нм в спектре водного лизата суспензии. Относительный выход гемоглобина (в %) определяли как отношение высот пиков при 415 нм в спектрах надосадочного раствора и водного лизата. В качестве контроля использовались эритроциты того же донора, инкубированные при тех же условиях без эремомицина.

7.3 Включение эремомицина в эритроциты человека

Эремомицин вводили в эритроциты методом обратимого осмотического лизиса. Эритроциты выделяли из консервированной донорской крови путем трехкратной отмывки 10 мл эритроцитов в трехкратном объеме изотонического буферного раствора PBS центрифугированием 10 минут при 1000 g. Затем эритроциты отмывали один раз инкубационным раствором следующего состава: 133 мМ NaCl, 3mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1,2 mM Na2HPO4, 50 mM трис-HCl, pH=7.5. В качестве лизирующего раствора использовался раствор, содержащий 5 мМ глюкозы, 2 мМ MgCl2 и эремомицин в растворе PBS в концентрации 0,3 мг/мл, 1 мг/мл, 1,9 мг/мл, 3,0 мг/мл, 6,0 мг/мл, 10,0 мг/мл суспензии. Отмытые эритроциты смешивали с 4-кратным объемом лизирующего раствора и выдерживали 1 мин при 4оС. К полученной суспензии добавляли эквивалентный объем запечатывающего раствора, содержащего 20mM Na2HPO4, 310mM NaCl, 1mM MgCl2, 5mM глюкозы. Смесь инкубировали 30 мин при 37оС. После этого заполненные эритроциты осаждали центрифугированием 10 минут при 1000 g, надосадочный раствор удаляли, а эритроцитарную массу трижды отмывали трехкратным объемом инкубационного раствора. Общий объем эритроцитов определяли по гематокриту суспензии.

Для контроля количества запечатанного в эритроциты препарата концентрацию эремомицина определяли спектрофотометрически в перхлорных экстрактах. Для этого пробу суспензии смешивали с 2-кратным объемом 0,5 М раствора перхлорной кислоты и осаждали белки центрифугированием 10 минут при 1000 g. Концентрацию эремомицина в надосадке определяли на спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) по высоте пика оптической плотности в спектре эремомицина при длине волны 280 нм. В качестве калибровочных растворов использовались водные растворы эремомицина известной концентрации. В качестве контроля использовались перхлорные экстракты суспензии эритроцитов того же донора, прошедших те же стадии лизиса, запечатки и инкубации, но без эремомицина.

7.4 Включение эремомицина в эритроциты мышей

Эремомицин вводили в эритроциты мышей методом обратимого осмотического лизиса. Эритроциты выделяли из свежевзятой мышиной крови путем трехкратной отмывки в изотоническом забуференном растворе PBS центрифугированием 10 минут при 1000 g. Затем эритроциты отмывали один раз инкубационным раствором следующего состава: 133 мМ NaCl, 3mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1,2 mM Na2HPO4, 50 mM трис-HCl, pH=7.5. В качестве лизирующего раствора использовался раствор, содержащий 5 мМ глюкозу, 2 мМ MgCl2 и эремомицин в растворе PBS до концентрации 0,2 мг/мл, 0,5 мг/мл, 1,0 мг/мл суспензии. Отмытые эритроциты смешивали с 4-кратным объемом лизирующего раствора и выдерживали 1 мин при 4оС. К полученной суспензии добавляли эквивалентный объем запечатывающего раствора, содержащего 20mM Na2HPO4, 310mM NaCl, 1mM MgCl2, 5mM глюкозы. Смесь инкубировали 30 мин при 37оС. После этого заполненные эритроциты осаждали центрифугированием 10 минут при 1000 g, надосадочный раствор удаляли, а эритроцитарную массу трижды отмывали трехкратным объемом инкубационного раствора. Общий объем эритроцитов определяли по гематокриту суспензии. Для контроля количества запечатанного в мышиные эритроциты препарата концентрацию эремомицина определяли спектрофотометрически в перхлорных экстрактах, как описано выше.

7.5 Определение противобактериальной активности эремомицина, включенного в эритроциты человека.

В данном опыте использовался штамм Stafilococcus aureus (золотистый стафилококк), резистентный к ампициллину. Бактериальная нагрузка - 107 бактериальных тел в мл. В чашки Петри с бактериальным газоном по секторам наносили исследуемые растворы и суспензии.

Для определения противобактериальной активности эремомицина, включенного в эритроциты, в чашках Петри с бактериальным газоном ставились следующие пробы:

1. Эремомицин, включенный в эритроциты и разведенный инкубационным раствором до следующих концентраций антибиотика: 2 мг/мл, 1 мг/мл, 0.5 мг/мл.

2. Гемолизат эритроцитов с включенным эремомицином, разведенный дистиллированной водой до следующих концентраций 2 мг/мл, 1 мг/мл, 0,5 мг/мл.

В качестве контролей к эритроцитарной форме эремомицина использовались:

1. Раствор для инкубации эритроцитов.

2. Лизирующий раствор, использовавшийся для приготовления эритроцитов, нагруженных эремомицином.

3. Раствор для запечатывания эритроцитов.

4. Дистиллированая вода.

5. Эритроциты без антибиотика, прошедшие те же стадии лизиса, запечатки и инкубации, но без эремомицина.

6. Раствор чистого антибиотика в соответствующих концентрациях.

 Пробы инкубировали 18 часов при температуре 37оС.

7.6 Определение минимально подавляющей концентрации антибиотика, включенного в эритроциты человека.

В чашку Петри с бактериальным газоном, разделенным по секторам, наносили гемолизат эритроцитов с включенным эремомицином, разведенный дистиллированной водой до следующих концентраций антибиотика: 2000мкг/мл, 1000мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 62,5 мкг/мл, 31,25 мкг/мл, 15,6 мкг/мл, 7,8 мкг/мл.

В качестве контроля использовалась суспензия эритроцитов без антибиотика и антибиотик, разведенный дистиллированной водой в соответствующих концентрациях. Пробы инкубировали 18 часов при температуре 37оС.

7.7 Исследование действия эремомицина, включенного в мышиные эритроциты на мышей, зараженных золотистым стафилококком.

Для эксперимента использовался штамм Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк). Пятнадцать мышей заражали внутрибрюшинно золотистым стафилококком из рассчета летальной дозы, равной 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на одну мышь. Пять мышей заражали дозой 125 млн. бактериальных тел в 0,5 мл. на одну мышь.

В качестве контроля использовали раствор эремомицина в концентрации 200 мкг\мл, который вводили подкожно пяти мышам, зараженным летальной дозой стафилококка, равной 250 млн. бактериальных тел на одну мышь.

Для лечения пяти мышам, зараженным летальной дозой подкожно вводили эритроциты, загруженные эремомицином, концентрация которого составляла 200 мкг\мл.

Оставшихся десять мышей, из которых пять были заражены дозой 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл. на одну мышь, и пять, зараженных дозой 125 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на мышь, лечению не подвергались.

7.8 Исследование действия эремомицина, включенного в эритроциты человека, на мышей, зараженных золотистым стафилококком.

Для исследования использовался штамм Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк). 26 мышей заразили внутрибрюшинно летальной дозой стафилококка, равной 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на одну мышь и 5 мышей дозой 125 млн. бактериальных тел на одну мышь.

Для лечения пяти мышам подкожно вводили эритроциты, загруженные эремомицином и разведенные раствором для инкубации до концентрации 400 мкг/мл, и пяти мышам вводили те же эритроциты, разведенные до концентрации 200 мкг/мл.

В качестве контроля использовался раствор эремомицина, который вводили в концентрациях 400 мкг/мл и 200 мкг/мл такому же количеству мышей. Одной незараженной мыши подкожно вводили суспензию эритроцитов без антибиотика для выяснения, оказывают ли человеческие эритроциты непосредственное патогенное влияние на мышей. Оставшихся десять мышей (пять, зараженных дозой 250 млн. бактериальных тел в 0,5 мл на одну мышь, и пять, зараженных дозой 125 млн. бактериальных тел в 0,5 мл ) не лечили.

44


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

54077. Использование вектора на логопедических занятиях 216 KB
  Для пропедевтики оптической дисграфии в первую очередь необходимо использовать задания, направленные на развитие зрительно-пространственных представлений и зрительно-моторных координаций.
54078. Взаємозв’язок логопеда та родини у корекційно-відновлювальній роботі з дітьми логопатами 32.5 KB
  Одне з важливих завдань професійної діяльності вчителя логопеда дитячого дошкільного навчального закладу є залучення батьків до проведення роботи із дітьми – логопатами по закріпленню засвоєного матеріалу на корекційно відновлювальних заняттях. Оволодіння дитиною мови успішно йде тоді коли з ним займаються не тільки в дошкільному закладі але і в сім'ї: Передумовою ефективного залучення сімейного оточення до корекції звуковимови у дітей є чітко організована взаємодія логопеда з батьками регулярна...
54079. Зима 36.5 KB
  Матеріали: дзеркала на кожну дитину вітрячки сніжинки ілюстрації зими сніжинки чарівна паличка мікрофон предметні картинки музика Моцарта п’єса Сніжинки музика до пісні Сніжокпушокавтор не відомий бубон Хід заняття. Сніжинки. Логопед торкається паличкою до кожної дитини повідомляє що вони тепер сніжинки. А тепер мої сніжинки давай подорожувати та про зиму розповідати.
54080. «На гостину до пташок». Конспект підгрупового заняття з елементами логоритміки в старшій логопедичній групі 37 KB
  Стеценка Синичка картинки птахів. Як називаються птахи які мешкають у лісі лісові птахи Давайте послухаємо спів птахів. Гра на розвиток уваги: Хто як голос подає Дятел стукає: тук тук Ворона каркає: кра кра Горобець: цвірінь цвірінь Сорока: скреке ке скреке ке Голуб: туркоче Сова кричить: УУУ Ластівка: щебече Соловей: заливається свистить щебече Журавель: курличе Жайворонок: бринить Пропоную під музику передати нелегкий шлях птахів які відлітають у теплі краї:легкий біг зі змахами рук присідання з низько...
54081. ЛОНДОН - СТОЛИЦЯ ВЕЛИКОБРИТАНІЇ 80.5 KB
  Good morning! I’m very glad to see you. Today we’ll travel in the world of the English language together. We’ll practise to do tests, read and sum up all the information, which you know about London as the capital of Great Britain.
54082. Великобританія. Визначні місця Лондона 5.64 MB
  Today we will practice your speaking and listening skills. We will also read about the famous places of interest in London. в) Уведення в іншомовну атмосферу. Тренування англійських звуків(7 хв.). We start with English phonetics. The program “Professor Higgins. English without accent”will help us. The main menu is on your displays.
54083. What is London? 154.5 KB
  It is the oldest building. Since it was built in 11-th century, this castle has been a royal palace, a prison, a zoo and many others. Today it is a museum and houses the Crown Jewels. ( Tower of London).
54084. London - the capital of Great Britain 160 KB
  Yes, you are right travelling is very popular nowadays and to my mind there is nothing better than travelling around the world. Let's travel together today. I want you to visit one of the wonderful cities in the world. But you have to find out the name of the city from this task. Before doing it you have to get some instructions.
54085. London Sights. The Tower of London 137.5 KB
  Last Wednesday the Londoners went to the Tower of London with their class. The next day the children wrote about their visit and drew pictures. The Tower of London is a big castle with a lot of buildings inside it. One building was a prison. Sometimes the kings and queens of England chopped off their enemies’ heads there! So people called it the Bloody Tower.