3914

Использование спектрофотометра СФ-26 в практической деятельности

Лабораторная работа

Физика

Научиться пользоваться спектрофотометром СФ-26. Задания: Определение концентрации белка с помощью биуретовой реакции. Построить график зависимости оптической плотности Е550 от концентрации белка в растворе. Определение спектра поглощения раствора ге...

Русский

2014-12-02

271 KB

62 чел.

Научиться пользоваться спектрофотометром СФ-26.

Задания:

Определение концентрации белка с помощью биуретовой реакции. Построить график зависимости оптической плотности Е550 от концентрации белка в растворе.

Определение спектра поглощения раствора гемоглобина.

Построить зависимость оптической плотности Е от длины волны λ в интервале 360 – 600 нм.

Теоретические сведения

Оптические методы исследования веществ основаны на способности этих веществ

порождать оптическое излучение или взаимодействовать с ним.

Фотометрия – совокупность оптических методов и средств измерения фотометрических

величин светового потока. Основным понятием фотометрии является поток излучения, смысл  которого в мощности переносимого электромагнитного (оптического) излучения.

В аналитической химии и клинической лабораторной диагностике широкое

применение нашли фотометрические методы количественного анализа,  основанные на

переведении определяемых компонентов в поглощающие свет соединения с последующим определением их количеств путем измерения светопоглощения растворов.

По окраске растворов окрашенных веществ можно определять концентрацию компонентов при помощи фотоэлектрических приемников оптического излучения (фотоприемников) - приборов, превращающих световую энергию в электрическую. Если измерение ведется без выделения  узкого диапазона длин волн, то есть измеряются характеристики всего светового потока, то такой  метод анализа часто называется колориметрическим. Если же выделяется характерный для поглощения данным веществом оптический диапазон и измерение проводится на определенной длине волны, тогда говорят о собственно фотометрическом методе анализа. Фотометрический метод является более объективным методом, чем колориметрический, поскольку результаты его меньше зависят от поглощения света другими (интерферирующими) окрашенными веществами.

Фотометрический анализ - один из самых старых и распространенных физико-химических

методов, для него требуется относительно  простое оборудование, в то же время он

характеризуется высокой чувствительностью и возможностью определения большого количества органических веществ. Открытие все новых и новых реагентов, образующих окрашенные соединения с неорганическими ионами и органическими веществами, разработка принципов сопряженных реакций делает в настоящее время применение этого метода почти

неограниченным. Фотометрический метод анализа может применяться для большого диапазона

определяемых концентраций. Его используют как для определения основных компонентов

различных сложных веществ, так и для определения микропримесей в объектах.

Комбинирование с некоторыми методами разделения и обогащения - хроматографическим,

экстракционным - позволяет на несколько порядков повысить чувствительность

фотометрических методов.  

Фотометрические свойства растворенного вещества характеризуются коэффициентом

пропускания T (τ), коэффициентом отражения R (ρ), и коэффициентом поглощения A (α), которые для одного и того же вещества связаны соотношением T + R + A = 1.

Определение безразмерных величин T, R и A выполняется с помощью фотометров

(приборов для измерения какой-либо фотометрической величины) путем регистрации реакций

приемника оптического излучения на соответствующие потоки излучения. При этом в рутинной лабораторной практике принято обозначать приборы, регистрирующие поглощение света веществом,  фотометрами, отражение – отражательными фотометрами.

Фотометрические методы применяются также в тех случаях, когда изучается способность

веществ рассеивать  (нефелометрия)  и пропускать излучение (турбидиметрия), переизлучать

поглощенное излучение  (флуориметрия), изменять степень поляризации излучения при

прохождении его через оптически активные вещества (поляриметрия).

Кроме того, одним из важных разделов физической оптики является рефрактометрия,

изучающая показатели преломления оптического излучения твердых, жидких и газообразных

веществ в зависимости от длины волны излучения.  

Названные оптические методы применяются для изучения состояния биологических

систем и их изменения в процессах ассоциации-диссоциации, взаимодействия с другими

молекулами, образования и распада комплексов фермент-субстрат, антиген-антитело, белок-

липид, белок-нуклеиновая кислота; фотофизических  и фотохимических процессов и т.д.

Высокая чувствительностью, точность, быстродействие и удобство использования для

рутинных исследований предопределяют широкое применение оптических методов в клинической лабораторной диагностике.

Фотометрия

Способность химического соединения поглощать лучистую энергию определенных длин

волн используется при фотометрическом анализе.

Группы атомов, поглощающих кванты света в УФ- и видимой области спектра, называют

хромофорами. Основными хромофорами в белках являются остатки ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан), в нуклеиновых кислотах - пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил).

Группы атомов, которые сами не поглощают свет в указанном диапазоне спектра, но при

включении в какую-либо хромофорную систему приводят к смещению максимума полосы

поглощения и изменению ее интенсивности, называют ауксохромами. В белках ауксохромами

являются оксо-, амино- и сульфгидрильныс группы.

Следует отметить, что образование окрашенных в видимой области спектра соединений

необходимо только для методов колориметрического анализа. Применение инструментальных

методов позволяет использовать спектры поглощения, лежащие как в ультрафиолетовой, так и в инфракрасной областях спектра.

Фотометрические исследования проводятся на фотометрах и спектрофотометрах, с

помощью которых измеряют оптические плотности окрашенных растворов исследуемых веществ в спектральном диапазоне  поглощения веществ.

Сплошные спектры изучаются с помощью спектрофотометров.

Колориметрия

Оптические свойства окрашенных растворов

При прохождении белого света с интенсивностью I0 через прозрачный стеклянный сосуд,

заполненный раствором, происходит ослабление этого света (рисунок). Выходящий свет будет

иметь другую, меньшую, интенсивность I. Ослабление светового потока связано, в основном, с

поглощением световой энергии Iа раствором. Кроме того, имеет место отражение света Iотр от

границ раздела воздух-стекло, стекло-раствор (см. рисунок). Наконец, в растворе происходить

рассеяние света Iр мельчайшими взвешенными частицами.  

Рис.  Поглощение, рассеивание и отражение света от раствора в кювете.

Бером было установлено, что при прохождении света через газы и растворы  степень поглощения вещества зависит от числа частиц в единице объема, то есть оптическая

плотность зависит от концентрации вещества:

D = k·l·C,

где k - показатель поглощения – постоянная величина, характерная для растворов вещества

(для света определенной длины волны); l – толщина слоя; C – концентрация вещества.

Эта зависимость оптической плотности от концентрации вещества в растворе и толщины

поглощающего слоя известна под названием закона Бугера-Ламберта-Бера.

Таким образом, оптическая плотность D есть мера непрозрачности вещества толщиной l

для оптического излучения. Оптическая плотность характеризует ослабление оптического

излучения в слоях различных веществ (красителях, светофильтрах, растворах, газах и т. д.).

Оптическая плотность не зависит от площади поперечного сечения падающего на слой вещества светового потока, она зависит только от толщины поглощающего слоя, концентрации

поглощающего вещества и поглощающей способности вещества.

Величина оптической плотности D безразмерна, но может исчисляться в «беллах» (сокращение - Б). Оптическая плотность D связана с концентрацией с прямо и линейно.

Измерение в максимуме спектральной полосы  поглощения

Исследование растворов рекомендуется проводить при длине волны облучения, соответствующей максимальному поглощению, то есть длине волны, при которой максимален

молярный показатель поглощения ελ. Действительно, из рисунка видно, что тангенс угла

наклона прямой, связывающий оптическую плотность D и концентрацию c, максимален при λmax .

Из закона Бугера также следует, что D = ε λlc, где ελ есть тангенс угла наклона указанной

зависимости при l = 1. Очевидно, что чувствительность фотометрического определения

максимальна при λmax.

Рис. Фотометрическая чувствительность:

а - определение разницы двух концентраций аналита (С1– С2) существенно выше при измерении на λмакс , соответствующей максимальному коэффициенту молярной экстинкции ε аналита;

б – зависимость изменения оптической плотности от изменения концентрации имеет больший tg при измерении на λмакс , т.е. большую чувствительность.

Однако для большинства субстратов и продуктов реакций, исследуемых в клинической

лаборатории, максимум поглощения лежит далеко за пределами спектрального диапазона

применяемых приборов. В таких случаях используют сопряженные реакции, в которых

применяют хромогены с хорошо известными спектрами поглощения.

 

Поскольку молярный показатель поглощения является функцией длины волны света, зависимость ε(λ) может служить количественной характеристикой спектра данного вещества.  

Для каждого вещества характерен свой спектр поглощения, причем он часто разный для

окисленных и восстановленных форм. На изменении спектра поглощения при переходе

окисленная ↔ восстановленная форма аналитов основано определение концентрации

большинства субстратов и активности практически всех ферментов.  

Величины ελ используются для характеристики веществ, для оценки их чистоты и для

сравнения чувствительности измерений различных производных веществ.

Рис. Спектр поглощения производных гемоглобина.  

а) – спектр поглощения гемиглобинцианида (CNmetHb),

б) – спектры поглощения производных гемоглобина: 1 – дезоксигемоглобина (HbH); 2 –

карбоксигемоглобина (HbCO) 3 – оксигемоглобина (HbO2); 4 – метгемоглобина (MetHb).

Спектрофотометр

Спектрофотометр – оптический прибор, который разлагает световой поток на

непрерывный спектр и позволяет измерять его на любой длине волны в пределах оптического

диапазона. В качестве диспергирующего устройства, разлагающего свет на монохроматический, используется диспергирующая призма или дифракционная решетка.  

Последовательность и месторасположение отдельных оптических элементов и систем на пути

следования светового потока от источника света до детектора излучения в том или ином

спектрофотометре характерны для данного прибора. Существенным для спектрофотометра

является возможность непрерывной регистрации спектра, разрешающая способность.  

Основные элементы спектрофотометра представлена на рисунке. Свет пропускается через

монохроматор, чтобы обеспечить выбор желательной области спектра, которую нужно

использовать для измерений. Щели нужны, чтобы выделить узкий луч света и, тем самым,

улучшить цветную чистоту. Свет затем проходит через поглощающую ячейку (кювету), где часть излучательной энергии поглощается, в зависимости от природы и концентрации раствора. Не поглощенный свет попадает на фотоприемник (фотоэлемент, фотоумножитель, фотодиод и др.), преобразующий энергию излучения в электрический сигнал, величина которого может быть зарегистрирована измерительным устройством и  выведена на стрелочный или цифровой

индикатор.

Рис. Основные компоненты спектрофотометра

Спектрофотометр СФ-26

Спектрофотометр СФ-26 рассчитан для измерения коэффициента пропускания T исследуемого образца, равного отношению интенсивности потока излучения I, прошедшего через измеряемый образец, к интенсивности потока излучения I0, падающего на измеряемый образец (или прошедшего через контрольный образец, коэффициент пропускания которого принимается за единицу), и выражаемого формулой . Измерение производится по методу электрической автокомпенсации.

Биуретовая реакция

Биуретовая реакция, цветная реакция на биурет, которую осуществляют, прибавляя к щелочному раствору последнего разбавленный водный раствор соли Сu2+ (обычно CuSO4). При этом раствор окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет благодаря образованию комплексного соед. (формула I, М+ - катион щелочного металла). В реакцию, подобную биуретовой, вступают многие вещества, содержащие в молекуле не менее двух амидных группировок, аминогидроксиэтиленовую группу —CH(NH2)CH(OH)—, амиды и имиды аминокислот и некоторые другие соединения. Продукты реакции в этом случае имеют фиолетовую или синюю окраску. В условиях биуретовой реакции белки дают фиолетовую окраску, что использовалось для их качественного и количественного анализа.


Порядок работы

  1.  Определение концентрации белка с помощью биуретовой реакции.

  1.  Установка требуемой длины волны – 550 нм.
  2.  Установка «нуля» - установка в световой поток кюветы со стандартным раствором.
  3.  Установка на пути потока излучения опытных образцов, съем показаний прибора по шкале оптической плотности «D».

  1.  Определение спектра поглощения раствора гемоглобина.
  2.  Установка начальной длины волны – 360 нм.
  3.  Установка в световой поток кюветы с раствором гемоглобина.
  4.  Установка длин волн λ в интервале 360 – 600 нм, съем показаний прибора по шкале оптической плотности «D».

Результаты замеров

  1.  Построить график зависимости оптической плотности Е550 от концентрации белка в растворе.

Концентрация

С, %

Оптическая плотность

D

2

0,28

4

0,51

6

0,6

8

0,72

10

0,9

Контрольные замеры:

Концентрация

С, %

Оптическая плотность

D

2,8

0,37

6,386206897

0,63

9,420689655

0,85

  1.  
    Построить зависимость оптической плотности Е от длины волны λ в интервале 360 – 600 нм.

Длина волны

λ,нм

Оптическая плотность

D

360

0,26

400

0,54

405

0,61

410

0,62

412

0,58

415

0,51

420

0,4

460

0,15

500

0,13

540

0,115

580

0,1

600

0,09


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

28832. Развитие необихевиоризма. Изменение представлений о структуре поведенческого акта 56.5 KB
  принципы поведения организмов стоящих на более низких ступенях развития аналогичны таковым принципам поведения организмов стоящих на более высоких ступенях развития. особое значение анализу поведения единичных организмов психологи должны научиться предсказывать влияние отдельных переменных на компоненты поведения отдельного организма. концепция оперантного поведения: Люди да и животные в реальной жизни редко действуют согласно классической схеме S R респондентное поведение или обусловливанием типа С стимульным. Последствия...
28833. Гештальтпсихология 82.38 KB
  Гештальтпсихология возникла из исследований восприятия. В исследованиях ученых были открыты свойства воображения восприятия и др. Принципы гештальта Целостность восприятия и его упорядоченность достигаются благодаря следующим принципам: Близость. Работы посвящены исследованию зрительного восприятия.
28834. Французская социологическая школа 46.5 KB
  Говорил о существовании коллективного сознания совокупность общих у членов одного и того же общества интересов верований убеждений чувств ценностей. исследовал структуру сознания и личности Изучая структуру сознания Жане подчеркивал что все высшие проявления духа строятся на основе низших где действие чувство и разум слиты воедино. Трехуровневая структура сознания: элементарные ощущения затем память а на ней базируется Я или личность. Ввёл в психологию понятие поле сознания это наибольшее число простых или относительно...
28835. Генетическая психология 54.5 KB
  Генетическая психология Швейцарский психолог Жан Пиаже 18961980 один из наиболее известных ученых чьи работы составили важный этап в развитии генетической психологии. Научные интересы Пиаже еще с юности были сосредоточены на биологии и математике. Пиаже начинает читать лекции в Женевском университете и работать в Женевском доме малютки. В середине 20 в Пиаже создает свой основной труд Введение в генетическую эпистемологию возглавляет Международный центр по генетической эпистемологии в составе Женевского университета.
28836. Гуманистическая психология 47.5 KB
  Гуманистическая психология как альтернатива психоанализу и бихевиоризму: представления о природе человека экзистенциальная философия предмет и методы исследований Основные методологические принципы и положения гуманистической психологии: а человек целостен и должен изучаться в его целостности; б каждый человек уникален поэтому анализ отдельных случаев case study лучше чем статистические обобщения; в человек открыт миру переживание человеком мира и себя в мире главная психологическая реальность; г человеческая жизнь должна...
28837. Когнитивная психология 54 KB
  психологии порождено скорее общим направлением и логикой развития психологии чем открытиями конкретных ученых тем не менее деятельность двух психологов в наибольшей степени способствовала её возникновению. Миллер создал первый научный Центр когнитивной психологии и начал разрабатывать новые методы изучения познавательных процессов восприятия памяти мышления речи и проводили анализ их генезиса. Положительное в метафоре компьютера то что интеллект не рассматривается как набор последовательных малосвязанных этапов переработки информации...
28838. Естественно-научная парадигма в русской психологии 74 KB
  Роль психологии вооружить общество знаниями о психических явлениях и о законах деятельности души направить развитие нравственности морального поведения человека. Когда рефлекс обрывается не перейдя в движение не получив внешнего выражения завершающая часть рефлекса а она несет в качестве движения познавательную нагрузку уходит вовнутрь превращается в мысль хотя и незримую но продолжающую служить организатором поведения. Поэтому в механизме поведения реализуемом по типу рефлекса действует рефлекторное кольцо. Павлова: предмет и...
28839. Русская философская психология 74 KB
  Предмет психологии это наука о явлениях духа а не о его сущности сущность человек понять не может давалось обоснование исследовательского метода интроспективный анализ и индуктивное из частного общее обобщение описывались основные психологические законы законы ассоциаций по сходству смежности и причинности предлагалась классификация разделов психологии и давался очерк истории психологии. В лекциях Троицкого по психологии обнаруживается сочетание разнообразных подходов к психическому: вопреки эмпирической установке которая в...
28840. Развитие экспериментальной психологии в дореволюционной России 73.69 KB
  Развитие экспериментальной психологии в дореволюционной России. Формирование современной объективной психологии было основной целью которой посвящены практически все сочинения Введенского. Главный свой труд он так и назвал Психология без всякой метафизики 1917 подчеркивая этим и необходимость и возможность построения объективной психологии. Работы Введенского имели большое значение для отечественной психологии соединяя воедино европейскую и российскую традиции в понимании задач и предмета психологии а также различных способов...