3914

Использование спектрофотометра СФ-26 в практической деятельности

Лабораторная работа

Физика

Научиться пользоваться спектрофотометром СФ-26. Задания: Определение концентрации белка с помощью биуретовой реакции. Построить график зависимости оптической плотности Е550 от концентрации белка в растворе. Определение спектра поглощения раствора ге...

Русский

2014-12-02

271 KB

59 чел.

Научиться пользоваться спектрофотометром СФ-26.

Задания:

Определение концентрации белка с помощью биуретовой реакции. Построить график зависимости оптической плотности Е550 от концентрации белка в растворе.

Определение спектра поглощения раствора гемоглобина.

Построить зависимость оптической плотности Е от длины волны λ в интервале 360 – 600 нм.

Теоретические сведения

Оптические методы исследования веществ основаны на способности этих веществ

порождать оптическое излучение или взаимодействовать с ним.

Фотометрия – совокупность оптических методов и средств измерения фотометрических

величин светового потока. Основным понятием фотометрии является поток излучения, смысл  которого в мощности переносимого электромагнитного (оптического) излучения.

В аналитической химии и клинической лабораторной диагностике широкое

применение нашли фотометрические методы количественного анализа,  основанные на

переведении определяемых компонентов в поглощающие свет соединения с последующим определением их количеств путем измерения светопоглощения растворов.

По окраске растворов окрашенных веществ можно определять концентрацию компонентов при помощи фотоэлектрических приемников оптического излучения (фотоприемников) - приборов, превращающих световую энергию в электрическую. Если измерение ведется без выделения  узкого диапазона длин волн, то есть измеряются характеристики всего светового потока, то такой  метод анализа часто называется колориметрическим. Если же выделяется характерный для поглощения данным веществом оптический диапазон и измерение проводится на определенной длине волны, тогда говорят о собственно фотометрическом методе анализа. Фотометрический метод является более объективным методом, чем колориметрический, поскольку результаты его меньше зависят от поглощения света другими (интерферирующими) окрашенными веществами.

Фотометрический анализ - один из самых старых и распространенных физико-химических

методов, для него требуется относительно  простое оборудование, в то же время он

характеризуется высокой чувствительностью и возможностью определения большого количества органических веществ. Открытие все новых и новых реагентов, образующих окрашенные соединения с неорганическими ионами и органическими веществами, разработка принципов сопряженных реакций делает в настоящее время применение этого метода почти

неограниченным. Фотометрический метод анализа может применяться для большого диапазона

определяемых концентраций. Его используют как для определения основных компонентов

различных сложных веществ, так и для определения микропримесей в объектах.

Комбинирование с некоторыми методами разделения и обогащения - хроматографическим,

экстракционным - позволяет на несколько порядков повысить чувствительность

фотометрических методов.  

Фотометрические свойства растворенного вещества характеризуются коэффициентом

пропускания T (τ), коэффициентом отражения R (ρ), и коэффициентом поглощения A (α), которые для одного и того же вещества связаны соотношением T + R + A = 1.

Определение безразмерных величин T, R и A выполняется с помощью фотометров

(приборов для измерения какой-либо фотометрической величины) путем регистрации реакций

приемника оптического излучения на соответствующие потоки излучения. При этом в рутинной лабораторной практике принято обозначать приборы, регистрирующие поглощение света веществом,  фотометрами, отражение – отражательными фотометрами.

Фотометрические методы применяются также в тех случаях, когда изучается способность

веществ рассеивать  (нефелометрия)  и пропускать излучение (турбидиметрия), переизлучать

поглощенное излучение  (флуориметрия), изменять степень поляризации излучения при

прохождении его через оптически активные вещества (поляриметрия).

Кроме того, одним из важных разделов физической оптики является рефрактометрия,

изучающая показатели преломления оптического излучения твердых, жидких и газообразных

веществ в зависимости от длины волны излучения.  

Названные оптические методы применяются для изучения состояния биологических

систем и их изменения в процессах ассоциации-диссоциации, взаимодействия с другими

молекулами, образования и распада комплексов фермент-субстрат, антиген-антитело, белок-

липид, белок-нуклеиновая кислота; фотофизических  и фотохимических процессов и т.д.

Высокая чувствительностью, точность, быстродействие и удобство использования для

рутинных исследований предопределяют широкое применение оптических методов в клинической лабораторной диагностике.

Фотометрия

Способность химического соединения поглощать лучистую энергию определенных длин

волн используется при фотометрическом анализе.

Группы атомов, поглощающих кванты света в УФ- и видимой области спектра, называют

хромофорами. Основными хромофорами в белках являются остатки ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан), в нуклеиновых кислотах - пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил).

Группы атомов, которые сами не поглощают свет в указанном диапазоне спектра, но при

включении в какую-либо хромофорную систему приводят к смещению максимума полосы

поглощения и изменению ее интенсивности, называют ауксохромами. В белках ауксохромами

являются оксо-, амино- и сульфгидрильныс группы.

Следует отметить, что образование окрашенных в видимой области спектра соединений

необходимо только для методов колориметрического анализа. Применение инструментальных

методов позволяет использовать спектры поглощения, лежащие как в ультрафиолетовой, так и в инфракрасной областях спектра.

Фотометрические исследования проводятся на фотометрах и спектрофотометрах, с

помощью которых измеряют оптические плотности окрашенных растворов исследуемых веществ в спектральном диапазоне  поглощения веществ.

Сплошные спектры изучаются с помощью спектрофотометров.

Колориметрия

Оптические свойства окрашенных растворов

При прохождении белого света с интенсивностью I0 через прозрачный стеклянный сосуд,

заполненный раствором, происходит ослабление этого света (рисунок). Выходящий свет будет

иметь другую, меньшую, интенсивность I. Ослабление светового потока связано, в основном, с

поглощением световой энергии Iа раствором. Кроме того, имеет место отражение света Iотр от

границ раздела воздух-стекло, стекло-раствор (см. рисунок). Наконец, в растворе происходить

рассеяние света Iр мельчайшими взвешенными частицами.  

Рис.  Поглощение, рассеивание и отражение света от раствора в кювете.

Бером было установлено, что при прохождении света через газы и растворы  степень поглощения вещества зависит от числа частиц в единице объема, то есть оптическая

плотность зависит от концентрации вещества:

D = k·l·C,

где k - показатель поглощения – постоянная величина, характерная для растворов вещества

(для света определенной длины волны); l – толщина слоя; C – концентрация вещества.

Эта зависимость оптической плотности от концентрации вещества в растворе и толщины

поглощающего слоя известна под названием закона Бугера-Ламберта-Бера.

Таким образом, оптическая плотность D есть мера непрозрачности вещества толщиной l

для оптического излучения. Оптическая плотность характеризует ослабление оптического

излучения в слоях различных веществ (красителях, светофильтрах, растворах, газах и т. д.).

Оптическая плотность не зависит от площади поперечного сечения падающего на слой вещества светового потока, она зависит только от толщины поглощающего слоя, концентрации

поглощающего вещества и поглощающей способности вещества.

Величина оптической плотности D безразмерна, но может исчисляться в «беллах» (сокращение - Б). Оптическая плотность D связана с концентрацией с прямо и линейно.

Измерение в максимуме спектральной полосы  поглощения

Исследование растворов рекомендуется проводить при длине волны облучения, соответствующей максимальному поглощению, то есть длине волны, при которой максимален

молярный показатель поглощения ελ. Действительно, из рисунка видно, что тангенс угла

наклона прямой, связывающий оптическую плотность D и концентрацию c, максимален при λmax .

Из закона Бугера также следует, что D = ε λlc, где ελ есть тангенс угла наклона указанной

зависимости при l = 1. Очевидно, что чувствительность фотометрического определения

максимальна при λmax.

Рис. Фотометрическая чувствительность:

а - определение разницы двух концентраций аналита (С1– С2) существенно выше при измерении на λмакс , соответствующей максимальному коэффициенту молярной экстинкции ε аналита;

б – зависимость изменения оптической плотности от изменения концентрации имеет больший tg при измерении на λмакс , т.е. большую чувствительность.

Однако для большинства субстратов и продуктов реакций, исследуемых в клинической

лаборатории, максимум поглощения лежит далеко за пределами спектрального диапазона

применяемых приборов. В таких случаях используют сопряженные реакции, в которых

применяют хромогены с хорошо известными спектрами поглощения.

 

Поскольку молярный показатель поглощения является функцией длины волны света, зависимость ε(λ) может служить количественной характеристикой спектра данного вещества.  

Для каждого вещества характерен свой спектр поглощения, причем он часто разный для

окисленных и восстановленных форм. На изменении спектра поглощения при переходе

окисленная ↔ восстановленная форма аналитов основано определение концентрации

большинства субстратов и активности практически всех ферментов.  

Величины ελ используются для характеристики веществ, для оценки их чистоты и для

сравнения чувствительности измерений различных производных веществ.

Рис. Спектр поглощения производных гемоглобина.  

а) – спектр поглощения гемиглобинцианида (CNmetHb),

б) – спектры поглощения производных гемоглобина: 1 – дезоксигемоглобина (HbH); 2 –

карбоксигемоглобина (HbCO) 3 – оксигемоглобина (HbO2); 4 – метгемоглобина (MetHb).

Спектрофотометр

Спектрофотометр – оптический прибор, который разлагает световой поток на

непрерывный спектр и позволяет измерять его на любой длине волны в пределах оптического

диапазона. В качестве диспергирующего устройства, разлагающего свет на монохроматический, используется диспергирующая призма или дифракционная решетка.  

Последовательность и месторасположение отдельных оптических элементов и систем на пути

следования светового потока от источника света до детектора излучения в том или ином

спектрофотометре характерны для данного прибора. Существенным для спектрофотометра

является возможность непрерывной регистрации спектра, разрешающая способность.  

Основные элементы спектрофотометра представлена на рисунке. Свет пропускается через

монохроматор, чтобы обеспечить выбор желательной области спектра, которую нужно

использовать для измерений. Щели нужны, чтобы выделить узкий луч света и, тем самым,

улучшить цветную чистоту. Свет затем проходит через поглощающую ячейку (кювету), где часть излучательной энергии поглощается, в зависимости от природы и концентрации раствора. Не поглощенный свет попадает на фотоприемник (фотоэлемент, фотоумножитель, фотодиод и др.), преобразующий энергию излучения в электрический сигнал, величина которого может быть зарегистрирована измерительным устройством и  выведена на стрелочный или цифровой

индикатор.

Рис. Основные компоненты спектрофотометра

Спектрофотометр СФ-26

Спектрофотометр СФ-26 рассчитан для измерения коэффициента пропускания T исследуемого образца, равного отношению интенсивности потока излучения I, прошедшего через измеряемый образец, к интенсивности потока излучения I0, падающего на измеряемый образец (или прошедшего через контрольный образец, коэффициент пропускания которого принимается за единицу), и выражаемого формулой . Измерение производится по методу электрической автокомпенсации.

Биуретовая реакция

Биуретовая реакция, цветная реакция на биурет, которую осуществляют, прибавляя к щелочному раствору последнего разбавленный водный раствор соли Сu2+ (обычно CuSO4). При этом раствор окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет благодаря образованию комплексного соед. (формула I, М+ - катион щелочного металла). В реакцию, подобную биуретовой, вступают многие вещества, содержащие в молекуле не менее двух амидных группировок, аминогидроксиэтиленовую группу —CH(NH2)CH(OH)—, амиды и имиды аминокислот и некоторые другие соединения. Продукты реакции в этом случае имеют фиолетовую или синюю окраску. В условиях биуретовой реакции белки дают фиолетовую окраску, что использовалось для их качественного и количественного анализа.


Порядок работы

  1.  Определение концентрации белка с помощью биуретовой реакции.

  1.  Установка требуемой длины волны – 550 нм.
  2.  Установка «нуля» - установка в световой поток кюветы со стандартным раствором.
  3.  Установка на пути потока излучения опытных образцов, съем показаний прибора по шкале оптической плотности «D».

  1.  Определение спектра поглощения раствора гемоглобина.
  2.  Установка начальной длины волны – 360 нм.
  3.  Установка в световой поток кюветы с раствором гемоглобина.
  4.  Установка длин волн λ в интервале 360 – 600 нм, съем показаний прибора по шкале оптической плотности «D».

Результаты замеров

  1.  Построить график зависимости оптической плотности Е550 от концентрации белка в растворе.

Концентрация

С, %

Оптическая плотность

D

2

0,28

4

0,51

6

0,6

8

0,72

10

0,9

Контрольные замеры:

Концентрация

С, %

Оптическая плотность

D

2,8

0,37

6,386206897

0,63

9,420689655

0,85

  1.  
    Построить зависимость оптической плотности Е от длины волны λ в интервале 360 – 600 нм.

Длина волны

λ,нм

Оптическая плотность

D

360

0,26

400

0,54

405

0,61

410

0,62

412

0,58

415

0,51

420

0,4

460

0,15

500

0,13

540

0,115

580

0,1

600

0,09


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

25340. ВЫДЕЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ 48 KB
  Органами выделения у человека являются почки потовые железы легкие кишечник. Выделительные органы почки легкие потовые железы имеют важное значение и в поддержании постоянства концентрации водородных ионов в организме. Поскольку испарение воды с поверхности кожи и альвеол легких понижает температуру тела потовые железы и легкие имеют значение и в терморегуляции. Особое место среди органов выделения занимают сальные и молочные железы.
25341. ПРОЦЕСС МОЧЕОБРАЗОВАНИЯ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ 29.5 KB
  Процесс фильтрации воды и низкомолекулярных компонентов плазмы через стенки капилляров клубочка происходит только в том случае если давление крови в капиллярах около 70 мм рт. Из 150180 л первичной мочи реабсорбируется около 148178 л воды. Реабсорбции подвергаются кроме воды многие необходимые для организма органические глюкоза аминокислоты витамины и неорганические ионы К N3 Са2 фосфаты вещества. Импульсы от рецепторов почек по симпатическим нервам поступают в гипоталамус где вырабатывается антидиуретический гормон АДГ...
25342. КОЖА И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 30.5 KB
  Различные воздействия воспринимают расположенные в коже терморецепторы механорецепторы ноцицепторы. Первые воспринимают изменение температуры вторые прикосновения к коже третьи болевые раздражения. Расположенные на разной глубине в коже нервные окончания воспринимают прикосновения температурное чувство чувство боли. Распределены рецепторы неравномерно их много в коже кончиков пальцев рук ладоней подошв губ наружных половых органов.
25343. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМЫ 31.5 KB
  действием на соседние клетки в пределах одного органа или ткани биологически активных веществ тканевых гормонов гистамина серотомина кининов простагландинов и продуктов клеточного метаболизма например появление при физических нагрузках молочной кислоты в мышцах ведет к расширению в них кровеносных сосудов и увеличению доставки кислорода. В современных условиях концентрацию гормонов в железах крови или моче изучают биологическими ихимическими методами используют ультразвуковое исследований применяют радиоиммунологический метод....
25344. Гипофиз 36 KB
  В аденогипофизе главную секреторную функцию выделяют 5 групп клеток которые вырабатывают 5 специфических гормонов. Среди них выделяют тропные гормоны лат. направление регулирующие функции периферических желез эффекторные гормоны непосредственно действующие на клеткимишени. К тропным гормонам относят следующие: кортикотропин илиадренокортикотропныйгормонАКТГрегулирующий функции коркового слоя надпочечников; тиреотропный гормон ТТГ активизирующий щитовидную железу; гонадотропныи гормон ГТГ влияющий на функции половых желез.
25345. ФУНКЦИИ ВИЛОЧКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЭПИФИЗА 22.5 KB
  Функции эпифиза верхнего мозгового придатка или шишковидной железы связаны со степенью освещенности организма и соответственно имеют четкую суточную периодичность. Мелатонин угнетает функции гипофиза снижая с одной стороны выработку облегающих его функции гипоталамических либеринов а с другой непосредственно угнетая активность аденогипофиза в первую очередь подавляя образование гонадотропинов.
25346. ФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ (ТИРЕОИДНОЙ) ЖЕЛЕЗЫ 27.5 KB
  При недостаточном поступлении в организм йода возникает резкое снижение активности щитовидной железы гипотиреоз. Дефицит гормонов щитовидной железы во взрослом состоянии вызывает слизистый отек тканей микседему. Гипотиреоз может также возникать при генетических аномалиях в результате иммунного разрушения щитовидной железы и при нарушениях секреции тиреотропного гормона гипофиза.
25347. ЭНДОКРИННЫЕ ФУНКЦИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 30.5 KB
  Глюкагон вызывает расщепление гликогена в печени и выход в кровь глюкозы а также стимулирует расщепление жиров в печени I жировой ткани. Действуя путем повышения проницаемости клеточных мембран мышечных и жировых клеток он способствует переходу глюкозы внутрь мышечных волокон повышая мышечные запасы синтезируемого в них гликогена а в клетках жировой ткани способствует превращению глюкозы в жир. Продукция гормонов поджелудочной железы регулируется содержанием глюкозы в крови собственными особыми клетками островках Лангерганса ионами Са2...
25348. ФУНКЦИИ НАДПОЧЕЧНИКОВ 34 KB
  Кортикоиды являются жизненно необходимыми для организма гормонами их отсутствие приводит к смерти. все Процессы восприятия переработки информации и управления поведением организма. Нарушение секреции альдостерона может привести к гибели организма. Они угнетают синтез белков в печени и мышцах создают отрицательный азотистый баланс увеличивают выход свободных аминокислот их переаминирование и стимулируют образование из них ферментов необходимых для новообразования глюкозы вызывая при этом мобилизацию жиров из жировой ткани...