4014

Генетика микроорганизмов

Реферат

Биология и генетика

Генетика микроорганизмов Генетическая система бактерий состоит из ядерных и внеядерных структур. Аналог ядра прокариотов значительно отличается от ядра эукариотических клеток. Он представлен нуклеоидом, лишенным оболочки и включающем в себя почти вс...

Русский

2012-11-10

114.5 KB

143 чел.

Генетика микроорганизмов

Генетическая система бактерий состоит из ядерных и внеядерных структур. Аналог ядра прокариотов значительно отличается от ядра эукариотических клеток. Он представлен нуклеоидом, лишенным оболочки и включающем в себя почти всю ДНК бактерии. Бактериальная хромосома состоит из одной двунитевой молекулы ДНК кольцевой формы. Молекула ДНК построена из двух полинуклеотидных цепочек. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара дезоксирибозы и фосфатной группы. Азотистые основания представлены пуринами (аденин, гуанин) и пиримидинами (тимин, цитозин). Каждый нуклеотид обладает полярностью. У него имеются дезоксирибозный 3' -конец и фосфатный 5' -конец. Нуклеотиды соединяются в полинуклеотидную цепочку фосфодиэфирными связями между 5' -концом одного нуклеотида и 3' -концом другого. Соединение между двумя цепочками обеспечивается водородными связями комплементарных азотистых оснований: аденина с тимином, гуанина с цитозином. Нуклеотидные цепи антипараллельны: на каждом конце линейной молекулы ДНК расположены 5' -конец одной цепи и 3' -конец другой цепи. Наследственная информация у бактерий хранится в форме последовательности нуклеотидов ДНК, которая определяет последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Каждому белку соответствует свой ген , т.е., дискретный участок на ДНК, отличающийся числом и специфичностью последовательности нуклеотидов. Бактериальная хромосома содержит до 4000 отдельных генов. Совокупность всех генов называется геномом . Внешнее проявление генома называется фенотипом . Размеры бактериальной хромосомы у различных представителей царства Procaryotae варьируют от 3 х 10 8 до 2,5 х 10 9 Д. Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы всегда сопровождается ее делением.

Генетическая информация в бактериях может содержаться во внеядерных (внехромосомных) молекулах ДНК, представленных плазмидами, транспозонами и инсерционными (вставочными) последовательностями. Они не являются жизненно необходимыми, так как не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в метаболизме бактериальной клетки.

Плазмиды бактерий представляют собой двунитевые молекулы ДНК размером от 10 6 до 10 8 Д, несущие от 40 до 50 генов. Количество плазмид в бактериальной клетке может быть от 1 до 200. Выделяют плазмиды, находящиеся в виде отдельной замкнутой молекулы ДНК ( эписомы ) и встроенные в хромосому бактерии ( интегрированные плазмиды ). Плазмиды выполняют регуляторные и кодирующие функции. Первые направлены на компенсацию метаболических дефектов, вторые вносят в бактерию информацию о новых признаках. Как составляющая часть генетического материала бактерии плазмиды играют важную роль в ее жизнедеятельности, детерминируя такие характеристики, как способность продуцировать экзотоксины, ферменты или бактериоцины, устойчивость к лекарственным препаратам и т.д.

Удвоение ДНК некоторых плазмид индуцирует деление бактерий, т.е. увеличивает их «плодовитость». Такие плазмиды обозначают как F -плазмиды или F -факторы (от англ. fertility - плодовитость). Интегрированные F -плазмиды называют Hfr -плазмиды или Hfr -факторы (от англ. high frequency of recombinations - высокая частота рекомбинаций). Hfr -факторы осуществляют перенос части генетической информации данной хромосомы в другую клетку.

Плазмиды, детерминирующие устойчивость к лекарственным препаратам, называются R -плазмидами или R -факторами (от англ. resistance - устойчивость). R -плазмиды содержат гены, детерминирующие синтез ферментов, которые разрушают антибактериальные препараты. В результате бактериальная клетка становится устойчивой к действию целой группы лекарственных веществ. Многие R -плазмиды являются трансмиссивными и, распространяясь в популяции бактерий, переносят резистентность к воздействию антибактериальных препаратов.
Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства микроорганизмов, детерминируя синтез факторов патогенности. Так, например, Ent -плазмида определяет синтез энтеротоксина. Развитие инфекционного процесса, вызванного возбудителями чумы, сибирской язвы, кишечного иерсиниоза, клещевого иксодового боррелиоза связано с функционированием плазмид патогенности.

Конъюгативные плазмиды переносятся от бактерии к бактерии внутри вида или между представителями близкородственных видов в процессе конъюгации. Чаще всего конъюгативными плазмидами являются F - или R -плазмиды. Подобные плазмиды относительно крупные (25-150 млн Д) и часто выявляются у грамотрицательных палочек. Большие плазмиды обычно присутствуют в количестве 1-2 копий на клетку и их репликация тесно связана с репликацией бактериальной хромосомы.

Неконъюгативные плазмиды обычно имеют небольшие размеры и характерны для грамположительных кокков, но встречаются также у некоторых грамотрицательных микроорганизмов (например, у Haemophilus influenzae , Neisseria gonorrhoeae ). Мелкие плазмиды могут присутствовать в больших количествах (более 30 на клетку), так как только наличие такого количества обеспечивает их распределение в потомстве во время клеточного деления. При наличии в бактерии одновременно конъюгативных и неконъюгативных плазмид донор может передавать и неконъюгативные плазмиды за счет связывания генетического материала последних с факторами, обеспечивающими их перенос в процессе конъюгации. Подвижные генетические элементы входят в состав бактериального генома, бактериальной хромосомы и плазмид. К ним относятся вставочные последовательности в ДНК и транспозоны . Вставочные или инсерционные последовательности ( Is -элементы) представляют собой участки ДНК, способные перемещаться из одного места локализации в другое, и содержат только гены, необходимые для перемещения. Is -последовательности осуществляют координацию взаимодействий плазмид, умеренных фагов, транспозонов и нуклеоида для обеспечения репродукции; регулируют активность генов бактериальной клетки. Они могут инактивировать гены, в которые включились («выключение» гена) или, встраиваясь в хромосому, проявлять эффект промотора, включающего или выключающего транскрипцию соответствующих генов.

Транспозоны ( Tn ) - это сегменты ДНК, состоящие из вставочных последовательностей и структурных генов, обеспечивающих синтез молекул со специфическими биологическими свойствами (токсичность, устойчивость к антибиотикам и др.). Транспозоны не способны к самостоятельной репликации и размножаются только в составе бактериальной хромосомы.

Репликация бактериальной ДНК

Воспроизведение генетического материала бактерий осуществляется в процессе репликации, которая у бактерий протекает по полуконсервативному механизму. Это означает, что каждая из двух цепочек ДНК хромосомы или плазмиды служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепочки ДНК. В процессе репликации участвует комплекс ферментов. Репликация начинается с момента расплетения двунитевой структуры ДНК, которое осуществляется ферментом ДНК-гидролазой. При этом формируются две репликативные вилки, которые двигаются в противоположных направлениях, пока не встретятся. Формирование новой дочерней цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой . Особенностью функционирования ДНК-полимеразы является ее способность присоединять комплементарные матрице нуклеотиды к свободному 3 ' -концу растущей цепочки. Поэтому для осуществления реакции полимеризации нуклеотидов на матрице родительской цепочки ДНК-полимеразе требуется затравка, которая называется праймером (от англ. primer - запал). Праймер представляет собой короткую нуклеотидную цепочку, комплементарную матричной цепочки со свободным 3 ' -концом. На этом свойстве ДНК-полимеразы основана полимеразная цепная реакция (ПЦР), широко используемая в диагностике инфекционных заболеваний.

Две цепи двойной спирали ДНК комплементарны друг другу. На каждой цепи из структурных элементов ДНК - дезоксирибонуклеозидтрифосфатов - синтезируется новая цепь; при этом с каждым из оснований спаривается комплементарное ему основание, так что каждая из двух новых цепей будет комплементарна родительской цепи. Обе новые двойные цепи состоят из одной родительской и одной вновь синтезированной цепи. Такая точная репликация ДНК гарантирует сохранение генетической информации.

ДНК бактерий, будучи носителем наследственной информации, сама не служит матрицей для синтеза полипептидов. Биосинтез белков происходит на рибосомах , которые непосредственно с ДНК не соприкасаются. Передачу записанной в ДНК информации к местам синтеза белка осуществляет матричная или информационная РНК (мРНК). Она состоит из одной цепи и отличается от одиночной цепи ДНК тем, что тимин (Т) в РНК заменен урацилом ( U ). мРНК синтезируется на одной из цепей ДНК, причем механизм этого процесса сходен с механизмом репликации ДНК. Образование мРНК начинается на 5 ' -конце, и по последовательности оснований ее цепь комплементарна цепи ДНК. Этот процесс называется транскрипцией , а перевод нуклеотидной последовательности в последовательность аминокислот - трансляцией .

Каждый ген представлен определенным участком молекулы ДНК. Специфическая информация, содержащаяся в гене, определяется последовательностью оснований в цепи ДНК. Специфичность ферментных белков, синтез которых контролируют гены, определяются последовательностью аминокислот в полипептидных цепях. Эта же последовательность определяет и пространственную структуру белка - конформацию.

Так растет полипептидная цепь по мере продвижения рибосомы вдоль мРНК. Одновременно происходит закручивание этой цепи и свертывание ее в клубок, определяемое последовательностью аминокислот и природой их боковых цепей (гидрофобные и гидрофильные группы), и в результате возникает структура, обусловливающая специфические свойства и функцию данного белка. К мРНК обычно прикрепляется несколько рибосом, так что на одной и той же матрице одновременно синтезируется несколько полипептидных цепей. На конце мРНК находится кодон, от которого зависит отделение сформированной полипептидной цепи от рибосомы.

Т.о., нуклеотидная последовательность ДНК представляет собой закодированную «инструкцию», определяющую структуру специфического белка. Этот универсальный процесс передачи информации при репликации ДНК, транскрипции и трансляции применим как к эукариотам, так и к прокариотам.

Регуляция выражения генетической информации у бактерий

Бактериальная клетка способна запустить или прекратить синтез того или иного фермента в зависимости от присутствия соответствующего субстрата. Для этого бактериальные гены объединены в группы ( кластеры ) таким образом, что все ферменты, необходимые для осуществления определенного пути биосинтеза, детерминируются генами, сцепленными друг с другом. Вся группа генов может транскрибироваться в одну полицистронную мРНК, которая последовательно транслируется рибосомами с образованием каждого из белков. Такая форма организации позволяет координировано регулировать выражение всех генов одной единицы транскрипции.

Экспрессия генов у прокариот регулируется главным образом на уровне транскрипции. Роль сигнальных веществ для запуска транскрипции играют молекулы-эффекторы , представляющие собой низкомолекулярные соединения, которые являются либо субстратом для фермента, либо продуктом ферментативной деятельности соответственно. Индукция и репрессия представляют собой разные стороны одного и того же явления. Малые молекулы, индуцирующие образование ферментов, способных метаболизировать их, называются индукторами . Те же, которые предотвращают образование ферментов, способных синтезировать их, - корепрессорами .

Молекулы-эффекторы не могут вступать в прямое взаимодействие с ДНК, посредником для них служит специальный регуляторный белок . Регуляторный белок, который связывается с ДНК в отсутствии индуктора, называется репрессором .

За синтез регуляторных белков ответственны регуляторные гены . В присутствии белка-репрессора транскрипция блокирована; его удаление обусловливает доступ РНК-полимеразы к генам и запуск транскрипции. Прекращение синтеза фермента при помощи белка-репрессора получило название репрессии . Репрессия позволяет бактериальной клетке избежать перевода своих ресурсов на ненужную в данный момент синтетическую активность. Если индуктор присутствует в клетке в высокой концентрации, то в результате специфического присоединения к регуляторному белку он изменяет его конформацию и тем самым - его способность связываться с ДНК.

Контроль транскрипции достигается взаимодействием регуляторного белка с регуляторным сайтом, называемым оператором , который расположен между структурными генами и промотором (участком, распознаваемым ДНК-зависимой РНК-полимеразой). Промотор служит местом связывания РНК-полимеразы, и от него начинается транскрипция. Совокупность промотора, оператора и структурных генов образует оперон . Оперон является функциональной генетической единицей, регулирующей экспрессию одного или группы генов (рис. 2).

Перенос генетического материала бактерий

Обмен генетическим материалом у бактерий осуществляется путем генетических рекомбинаций. Под генетической рекомбинацией подразумевают взаимодействие между двумя геномами, которое приводит к образованию рекомбинаций ДНК и формированию дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей. Особенности рекомбинаций у бактерий определяются отсутствием истинного полового процесса и мейоза у прокариот и гаплоидным набором генов. В процессе рекомбинации бактерии условно делятся на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые этот материал воспринимают. В клетку-реципиент проникает не вся, а только часть хромосомы клетки-донора, т.е. один или несколько генов. Образуется только один рекомбинант, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включением фрагментов хромосомы донора.

Рекомбинация может быть гомологичной , при которой в процессе разрыва и воссоединения ДНК происходит обмен между участками ДНК, обладающими высокой степенью гомологии. Встречается также сайт-специфическая рекомбинация, которая происходит только в определенных участках (сайтах) генома и не требует высокой степени гомологии ДНК, например включение плазмиды в хромосому бактерии. Передача генетического материала между бактериями осуществляется 3-мя механизмами: конъюгацией, трансдукцией и трансформацией (рис. 3).

 Коньюгация - это перенос генетического материала путем прямого контакта между двумя клетками. Необходимым условием конъюгации является наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды. Трансмиссивные плазмиды кодируют половые пили, образующие конъюгационную трубочку между клеткой-донором и клеткой-реципиентом, по которой плазмидная ДНК передается из клетки-донора в клетку-реципиент. В результате такого переноса клетка-реципиент получает донорские свойства. Интегративной трансмиссивной плазмидой является F -фактор. Клетки-доноры, обладающие F -фактором, обозначаются как F + -клетки, а клетки-реципиенты, не имеющие F -фактора - F - -клетки. Если F -фактор встраивается в хромосому клетки-донора и начинает функционировать в виде единого с хромосомой трансмиссивного репликона, то хромосома донора приобретает способность передаваться в клетку-реципиент. Донорские клетки, имеющие встроенный в хромосому F -фактор, называются Hfr -клетками . Хромосомная ДНК реплицируется, одна цепь копии хромосомы переносится в реципиентную F - -клетку, тогда как другая остается в Hfr + -клетке, т.е. донор сохраняет свое генетическое постоянство.

Передача генетического материала при конъюгации начинается с расщепления ДНК в районе локализации F -фактора. Одна нить донорской ДНК передается через конъюгационный мостик в клетку-реципиент. Процесс сопровождается достраиванием комплементарной нити до образования двунитевой структуры. Переданная в реципиентную клетку и достроенная до двунитевой структуры, нить ДНК рекомбинирует с гомологичным участком реципиентной ДНК с образованием стабильной генетической структуры.

Биологическая значимость конъюгации хорошо видна на примере распространения резистентности бактерий к антибиотикам. Устойчивость к антибиотикам бактерия может получить в результате мутации, что происходит 1 раз на каждые 10 6 клеточных делений. Однако, однажды изменившись, генетическая информация может быстро распространяться среди сходных бактерий посредством конъюгации, поскольку каждая третья из близкородственных бактерий способна именно к этому типу генетического переноса.

Трансформация - передача генетической информации через выделенную из клетки-донора ДНК. Процесс трансформации может произвольно происходить в природе у некоторых видов бактерий, чаще грамположительных, когда ДНК, выделенная из погибших клеток, захватывается реципиентными клетками. Как правило, любая чужеродная ДНК, попадающая в бактериальную клетку, расщепляется рестрикционными эндонуклеазами; но при некоторых условиях такая ДНК может быть интегрирована в геном бактерии. По происхождению ДНК может быть плазмидной либо хромосомной и нести гены, трансформирующие реципиента. Подобным путем процессы трансформации могут распространять гены, кодирующие факторы вирулентности, среди бактериальных популяций; однако в обмене генетической информацией трансформация играет незначительную роль.

Трансформация служит хорошим инструментом для картирования хромосом, поскольку трансформированные клетки включают различные фрагменты ДНК. Определение частоты одновременного приобретения двух заданных характеристик (чем ближе расположены гены, тем более вероятно, что они оба включатся в один и тот же участок ДНК) дает информацию о взаиморасположении соответствующих генов в хромосоме. Перенос экстрагированной ДНК является основным методом генной инженерии, используемым при конструировании рекомбинантных штаммов с заданным геномом.

Трансдукция - передача бактериальной ДНК посредством бактериофага. В процессе репликации фага внутри бактерий фрагмент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и переносится вместе с ней в бактерию-реципиент. При этом фаговые частицы как правило дефектны, они теряют способность к репродукции. Так как трансдуцируются лишь небольшие фрагменты ДНК, вероятность рекомбинации, затрагивающей какой-то определенный признак, очень мала: она составляет от 10 -6 до 10 -8 . Существуют три типа трансдукции: неспецифическая (общая), специфическая и абортивная.

Общая (неспецифическая) трансдукция - перенос бактериофагом фрагмента любой части бактериальной хромосомы. В клетке, инфицированной бактериофагом, в ходе сборки дочерней популяции в головки некоторых фагов может проникнуть фрагмент бактериальной ДНК или плазмиды либо вместе с вирусной ДНК, либо вместо нее. Этот процесс происходит вследствие того, что бактериальная ДНК фрагментируется после фаговой инфекции и кусочек бактериальной ДНК того же размера, что и фаговая ДНК, проникает в вирусную частицу с частотой приблизительно 1 на 1000 фаговых частиц. При такой форме трансдукции в клетки-реципиенты могут быть внесены практически любые гены. Феномен неспецифической трансдукции может быть использован для картирования бактериальной хромосомы.

Специфическая трансдукция наблюдается в том случае, когда фаговая ДНК интегрирует в бактерию с образованием профага. При исключении ДНК фага из бактериальной хромосомы в результате случайного процесса захватывается прилегающий к месту включения фаговой ДНК фрагмент бактериальной хромосомы. Так как большинство умеренных фагов интегрируют в бактериальную ДНК в специфических участках, для таких бактериофагов характерен перенос в клетку-реципиент определенного участка бактериальной ДНК донора. Специфическая трансдукция может служить механизмом переноса вирулентных генов среди бактерий при условии, что эти гены локализованы в непосредственной близости от мест интеграции профага.

Наиболее характерным примером служит трансдукция, осуществляемая фагом λ. Обычно он трансдуцирует определенные гены: gal (кодирует синтез галактозы) и bio (кодирует синтез биотина). При переходе в состояние профага фаг λ включается в определенный участок хромосомы бактерии-хозяина - между генами gal и bio . Отделение фаговой ДНК от бактериальной хромосомы может происходить неточно и какой-то фрагмент ее останется в хромосоме, а близко расположенные гены будут захвачены фаговой ДНК. В случае заражения трансдуцирующим фагом клеток, дефектных по определенному гену, например gal - , может произойти рекомбинация с заменой собственного дефектного гена бактерии интактным трансдуцированным геном с образованием рекомбинанта (трансдуктанта) gal + .

Абортивная трансдукция. При абортивной трансдукции внесенный фрагмент ДНК донора не встраивается в хромосому реципиента, а остается в цитоплазме и там самостоятельно функционирует. Впоследствии он передается одной из дочерних клеток (т.е. наследуется однолинейно) и затем теряется в потомстве.

Генетическая изменчивость бактерий

Изменение бактериального генома могут происходить в результате мутаций. Мутации - это изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, проявляющиеся наследственно закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. В их основе лежат ошибки копирования наследственной информации, возникающие при репликации. Фенотипическим проявлением мутации могут быть: изменение морфологии бактериальной клетки, возникновение потребности в факторах роста (например, в аминокислотах, витаминах), т.е. ауксотрофность; появление устойчивости к антибиотикам; изменение чувствительности к температуре; снижение вирулентности ( аттенуация ). Мутации у бактерий носят ненаправленный характер.

Мутации могут быть спонтанными, т.е. возникающими самопроизвольно, без воздействия извне, и индуцированными. Спонтанные мутации появляются в результате ошибок репликации ДНК, неправильного формирования комплементарных пар оснований, структурных искажений ДНК и вследствие перемещения подвижных генетических элементов в процессе роста и размножения популяции бактерий. Спонтанные мутации могут обусловливать благоприятные и неблагоприятные генетические изменения. Вероятность возникновения определенных мутаций в расчете на одну клетку и на одну генерацию называют частотой мутирования. При высоких скоростях роста она постоянна, и ее обычно определяют для клеток в экспоненциальной фазе роста при оптимальных условиях среды. В фенотипе проявляются не все мутации. Непроявленные мутации называются молчащими . У мутанта может произойти обратная мутация или реверсия , в результате которой восстановятся свойства дикого штамма. Об истинной обратной мутации говорят лишь в тех случаях, когда вторая мутация точно восстанавливает исходный генотип, если же восстанавливается только фенотип, то говорят о вторичной реверсии или супрессорной мутации. Супрессорные мутации могут происходить как в исходном гене, так и в каких-либо других участках хромосомы ( интрагенные и экстрагенные супрессорные мутации).

Индуцированные мутации возникают под влиянием внешних факторов, которые называют мутагенами . Мутагены бывают физическими (УФ-лучи, γ-радиация), химическими (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, например, 2-аминопурин, азотистая кислота и ее аналоги, алкилирующие агенты и др.) и биологическими (транспозоны).

По протяженности повреждений мутации бывают точечными , когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, и протяженными (аберрации) . Мутации разделяют на хромосомные , обусловливающие появление нового признака при изменении двух и более участков хромосомы, и генные , обусловленные появлением нового признака при изменении гена. В этом случае может наблюдаться модификации оснований (изменения отдельных нуклеотидов), выпадение нескольких пар нуклеотидов ( делеции ), перемещение группы нуклеотидов в пределах хромосомы ( транспозиция), разрыв путем вставки посторонней ДНК ( инсерция ) или добавление нуклеотидных пар ( дупликация ) и деформации спирали ДНК. Для точечных мутаций частота реверсий довольно высока, в то время как для аберраций реверсии не характерны.

Первичный эффект мутагенного фактора не обязательно ведет к истинной мутации. Новый фенотип проявляется только тогда, когда измененный ген начнет функционировать. С помощью различных методов удается накапливать и выделять мутантов с разного рода дефектами: с нарушением процессов транспорта или использования субстрата, с дефектами промежуточного обмена, с повышенной чувствительностью к температуре и т.д.

Теоретически, мутации, вызванные радиацией, химическими веществами или другими факторами, могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, однако в любой живой клетке существуют биохимические механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру ДНК. Совокупность ферментов, катализирующих реакции коррекции повреждений ДНК, составляют системы репарации , которые принципиально различаются по биохимическим механизмам восстановления генома. Известны три основных механизма коррекции дефектов ДНК:

Непосредственная реверсия от поврежденной ДНК к исходной структуре;

Эксцизия (`выпадение') повреждений с последующим восстановлением исходной структуры;

Активация механизмов, обеспечивающих устойчивость к повреждениям.

Реверсия повреждений ДНК. К механизмам прямой реверсии повреждений ДНК относится световая репарация или фотореактивация (исправление деформации ДНК под действием УФ-лучей). Световая репарация осуществляется несколькими ферментами: фотолиазой (расщепляет тиминовый димер и восстанавливает целостность соседних тиминовых оснований), О 6 -метилтрансферазой (удаляет О 6 -метильную группу из остатков гуанина после действия метилирующих агентов), ДНК-пурин инсертазой (осуществляет встраивание утерянного при мутации основания в апуриновый сайт), ДНК-гликозилазой (удаление дефектных оснований). Все эти процессы происходят в один этап под действием конкретного фермента и безошибочно восстанавливают исходную структуру ДНК.

Системы эксцизионной репарации удаляют неправильно спаренные или поврежденные основания из ДНК и синтезируют новую последовательность ДНК, замещающую их. Место повреждения распознает эндонуклеаза, расщепляющая цепь ДНК вблизи дефекта, фрагмент удаляется, а дефект восполняется при помощи ДНК-полимеразы, которая проникает в брешь и встраивает в нее отсутствующие нуклеотиды, используя неповрежденную цепь ДНК в качестве матрицы. ДНК-лигаза ковалентно связывает 3' -конец вновь синтезированного участка ДНК с цепочкой. Поскольку эта система репарации основана на ресинтезе нуклеотидной цепи на базе неповрежденной матрицы, она также является практически безошибочной. Репарационные механизмы устойчивости к повреждениям ДНК . Кроме механизмов исправления повреждений клетки имеют возможность `обойти' вызванную повреждениями блокаду репликации ДНК, например, путем репарации в процессе рекомбинации.

Фенотипическая изменчивость бактерий

Временные, наследственно не закрепленные изменения называются модификациями . Модификации также контролируются геномом бактерий, но (в отличие от мутаций) не сопровождаются изменениями кодирующей структуры и быстро утрачиваются. Чаще всего у бактерий отмечаются морфологические (приводящие к обратимым изменениям формы) и биохимические (проявляются индуцибельным синтезом некоторых продуктов, чаще ферментов) модификации. Модификации возникают как адаптивные реакции бактериальных клеток на изменения окружающей среды, что позволяет им быстро приспосабливаться и сохранять численность популяции на жизнеспособном уровне. После устранения соответствующего воздействия, вызвавшего их образование, бактерии возвращаются к исходному фенотипу.

Стандартное проявление модификации - разделение однородной популяции на несколько типов. Этот феномен получил название диссоциация микробов . Обычно диссоциации возникают в условиях, неблагоприятных для исходной популяции. Примером диссоциации может служить изменение вида и структуры бактериальных колоний на твердых питательных средах. Для обозначения диссоциирующих колоний используют первые буквы английских названий: S -колонии (от англ. smooth - гладкий); R -колонии (от англ. rough - шероховатый); М-колонии (от англ. mucoid - слизистый) и D -колонии (от англ. dwarf - карликовый). Диссоциации сопровождаются изменениями биохимических, морфологических, антигенных и патогенных свойств возбудителей. Изменение фенотипа следует считать модификацией, если выполняются три основных условия: 1)определенность (связь изменения фенотипа с определенным фактором); 2)общность изменений в популяции; 3)обратимость (восстановление признака после прекращения действия фактора).

Методы изучения генетики бактерий

Выявление фенотипической изменчивости (модификации). При посеве Proteus mirabilis на питательный агар вырастают колонии протея, окруженные зоной `роения'. При пересеве колоний петлей на поверхность питательного агара с 1% сухой желчью зоны роения исчезают, а при пересеве на обычный питательный агар все колонии вновь окружены зоной роения.

Определение Col -плазмид (колициногенных факторов). Исследуемые культуры E . coli засевают методом укола в питательный агар в чашку Петри (по 7-8 уколов на 1 чашку). Посевы инкубируют при 37 ° С сутки и на внутреннюю поверхность чашки помещают кусочек ваты, смоченный хлороформом, в парах которого бактерии погибают. Затем поверхность агара равномерно заливают 3 мл расплавленного и остуженного до 45° С полужидкого (0,7%) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры (наиболее чувствительной к данному типу колицина). Результат учитывают через 18-24 ч инкубации при 37 ° С: вокруг посевов культур, продуцирующих колицины, появляются зоны подавления роста индикаторного штамма.

Определение колицинотипа. В чашку Петри в питательный агар засевают эталонные штаммы бактерий с известным колицинотипом и инкубируют при 37 ° С сутки, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. По поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культуры E . coli неизвестного колицинотипа. Результаты учитывают через 18-24 ч. Если колицинотип индикаторной культуры и исследуемого штамма совпадут, то зоны подавления роста вокруг эталонного штамма не будет.

Тест перераспределения для выявления спонтанности мутаций. В две чашки Петри с питательным агаром вносят по 0,1 мл суточной культуры E . coli М17 и распределяют равномерно по поверхности питательной среды. Через 6 ч инкубации при 37° С в одной из чашек перераспределяют шпателем выросшие микроколонии. Через 24 ч из каждой чашки культуры пересевают методом отпечатков на поверхность питательного агара с рифампицином. Через 24 ч инкубации учитывают результат: на поверхности среды с рифампицином в чашке без перераспределения выросли единичные колонии рифампицинрезистентных мутантов, а в чашке с перераспределением выросли более многочисленные (в десятки - сотни раз) колонии антибиотикоустойчивых мутантов.

Данный опыт показывает, что антибиотикоустойчивые мутанты возникли спонтанно, до контакта бактерий с селективным агентом - рифампицином. Уже через 6 ч на среде без антибиотика появляются микроколонии антибиотикоустойчивых мутантов. Благодаря перераспределению бактерии мутанты из этих микроколоний распространяются по всей поверхности среды и после посева отпечатками на среду с антибиотиками дадут начало многочисленным колониям мутантов, в то время как отпечатки с чашки без перераспределения выявляют только небольшое число колоний, соответственно исходным микроколониям мутантов.

Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения. В качестве источника УФ-лучей используют бактерицидную лампу ВУФ-15, которую устанавливают на расстоянии 60 см от центра облучаемого объекта.

Для получения lac -мутантов E . coli предварительно выращивают на питательном бульоне в течение 14-18 ч. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль раствора MgSО 4 и охлаждают на льду для прекращения деления клеток. Суспензию помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15-150 сек (предварительно определяют оптимальную мутагенную дозу, равную 0,1-1% от числа выживших бактерий), после чего клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в питательном бульоне. Пробирку с бульоном инкубируют при 37 ° С в течение 14-18 ч. Разведения 10 -2 - 10 -5 по 0,1 мл высевают на среду Эндо. Параллельно делают контрольные посевы. lac -мутанты E . coli на среде Эндо образуют бесцветные колонии.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E . coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Параллельно делают контрольные посевы. Клетки E . coli , выросшие на этой среде является антибиотикорезистентными.

Постановка опыта конъюгации. Донор штамм E . coli К12 Hfr leu + Str s . Реципиент - штамм E .coli К12 F - leu - Str r . Селективная среда - минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора и инкубируют 30 мин при

37 ° С. Затем смесь разводят до 10 -2 - 10 -3 и высевают по 0,1 мл на селективную среду в чашки Петри, где вырастут только рекомбинанты. В качестве контроля на среду сеют донорский и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй - ауксотроф по лейцину. После подстчета выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

Постановка опыта трансформации. Реципиент - штамм Bacillus subtilis Str s (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). Донор - ДНК, выделенная из штамма B . subtilis Str r (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) - питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры B . subtilis добавляют 1 мл ДНК донора и инкубируют 30 мин при 37 ° С. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл смеси высевают на селективную среду. Частоту трансформации определяют по отношению количества выросших колоний рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Постановка опыта специфической трансдукции. Реципиент - штамм E . coli lac -, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг - фаг λ dgal , в геноме которого часть генов замещена β-галактозидазным опероном E . coli . Селективная среда - среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма - ярко малиновые с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуре реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага в концентрации 10 6 - 10 7 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют 60 мин при 37 ° С и готовят ряд десятикратных разведений. Из пробирки с 10 -6 разведением по 0,1 мл культуры высевают на три чашки со средой Эндо и инкубируют в течение суток. Величину трансдукции вычисляют по отношению количества клеток рекомбинантов, обнаруженных на всех чашках к числу клеток реципиентного штамма.

Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний

Для диагностики инфекционных заболеваний генетическими методами маркером возбудителя является его геном. Методы индикации нуклеиновых кислот применяют для диагностики вирусных инфекций, для идентификации бактерий (особенно таких, которые трудно выделить) и для определения точного таксономического положения микроорганизмов. Методы позволяют обнаружить микроорганизм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК без его выделения в чистую культуру.

Метод молекулярной гибридизации основан на способности ДНК и РНК специфически соединяться ( гибридизироваться ) с комплементарными олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами .

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий меченый зонд (рис. 4). Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса при помощи соответствующей метки.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном увеличении числа копий ( амплификации ) определенного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой (рис. 5). ПЦР - это очень чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно наличие в материале одной молекулы ДНК.

ПЦР состоит из трех основных этапов: подготовки исследуемой пробы (изоляция ДНК или РНК), собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы в ПЦР. После того, как из бактерий Thermous thermophilis удалось получить ДНК-полимеразу, которая наряду с полимеразной обладает еще и обратно-транскриптазной активностью, удалось совместить эти две реакции. Этот вариант ПЦР широко применяется для детекции РНК-содержащих вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.

Для проведения ПЦР необходимы пять основных компонентов: 1)фермент ДНК-полимераза; 2)пара олигонуклеотидных праймеров; 3)набор нуклеотидов; 4)копируемая ДНК; 5)ионы Mg +2 , необходимые для функционирования ДНК-полимеразы.

Для амплификации (т.е. синтеза ДНК-матрицы) отбирают наиболее консервативную часть, уникальный ген. Для запуска синтеза на ДНК-матрице используют 2 праймера (короткие, длиной 20-30 оснований одноцепочечные фрагменты ДНК), комплементарные 3 ¢ -концам ДНК искомого гена. Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на две нити. Добавляют праймеры, затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками ( отжиг ). Добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды. При температуре, оптимальной для функционирования ДНК-полимеразы, нуклеотиды присоединяются к 3' -концам праймеров, формируется специфический фрагмент (ампликон). После этого цикл повторяют снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз в 2 раза. Рассчитано, что за 30-40 циклов из одной матрицы можно получить 10 8 ампликонов. Реакцию проводят в специальных приборах - амплификаторах. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом гель-электрофореза и визуализацию в УФ свете после окрашивания этидием бромида. Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю можно провести ДНК-гибридизацию.

Параграфы на тему „Генетика микроорганизмов“:

Конъюгация микроорганизмов

В 1946 г. Дж. Ледерберг и Э. Татум описали феномен конъюгации — передачи генетического материала из клетки в клетку при непосредственном контакте бактерий. Исследования проводились на штамме Е. coli К12. Перенос генетического материала происходил толь1 ко в одном направлении; одна клетка являлась донором, другая — реципиентом.

Трансформация микроорганизмов

Трансформация (от transformatio — преобразование) изменение свойств бактериальной клетки в результаате процесса переноса информации, при котором фрагмент ДНК клеткидонора проникает в родственную бактерию.

Рекомбинация у бактерий

У бактерий, так же как при изучении генетики высших организмов, принято выделять понятия: генотип, фенотип, модификаци

Трансдукция микроорганизмов

Осуществление переноса генетического материала от клетки донора к бактерииреципиенту с помощью фага получило название трансдукции. Траисдуцирующий фаг переносит фрагмент ДНК из предыдущего хозяина и вводит эту ДНК таким же образом, как и свою собственную молекулу ДНК, в чувствительную к нему бактериальную клетку.

Плазмиды микроорганизмов

Кроме хромосомы, у некоторых бактерий обнаруживаются дополнительные внехромосомные генетические детерминанты, получившие название плазмид. К настоящему времени обнаружено большое разнообразие плазмид, среди которых наиболее изученными являются половой фактор (F), фактор множественной лекарственной устойчивости (R), факторы бактериоциногений (Col), плазмиды, контролирующие у Е. coli синтез энтеротоксина (Ent), обеспечивающие продукцию гемолизина (Н1у), детерминирующие синтез поверхностных антигенов (К88, К99) и др.

Что такое генетика. ДНК.

Генетика — наука о наследственности и изменчивости. Наследственность характеризует сохранение постоянства свойств вида в поколении, т. е. воспроизведение себе подобных. Изменчивость — различия в свойствах между особями одного вида.

Мутация

Под мутацией (от mutatio — изменение) подразумеваются стабильные наследуемые изменения в генотипе, проявляющиеся фенотинически в виде измененного признака. Основу мутации составляют качественные или количественные изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, которые могут возникать при жизнедеятельности бактерий под влиянием эндогенных факторов или при действии химических и физических мутагенов.

Генетика микроорганизмов раздел генетики изучающий изменчивость и наследственность микроорганизмов.

Сюда входит генетика бактерий, генетика вирусов, генетика грибов и др.

Генетика микроорганизмов изучает наследуемые изменения свойств микробов, возникающие самопроизвольно (спонтанные мутации) или в результате различных химических и физических воздействий (индуцированные мутации), а также процессы обмена генетическим материалом между микроорганизмами, структуру . и функцию их генетического аппарата.

Обмен генетическим материалом у бактерий осуществляется тремя различными способами: 1) трансформация бактерий; при этом в бактерию-реципиент вносится часть генов бактерии-донора в виде изолированной молекулы ДНК; 2) трансдукция бактерий; в этом случае роль переносчика генетического материала между клетками донора и реципиента выполняют умеренные бактериофаги. В первом и втором способах не требуется непосредственного контакта между донором и реципиентом; 3) конъюгация бактерий; при этом обмен генетическим материалом происходит в момент непосредственного контакта между донором и реципиентом. После попадания генетического материала донора в бактерию-реципиент происходит собственно генетический обмен: рекомбинация между молекулами ДНК. Генетический обмен у вирусов осуществляется при совместном размножении двух или более вирусных частиц внутри одной клетки.

Успехи современной генетики микроорганизмов позволили объяснить ряд явлений и процессов, важных для практики. Выяснены механизмы формирования лекарственной устойчивости бактерий и намечены пути для ее устранения. Получены мутанты — активные продуценты антибиотиков, витаминов и аминокислот, важных для медицинской и хозяйственной практики.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

14618. ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХФАЗНОЙ ЦЕПИ ПРИ СОЕДИНЕНИИ ПРИЕМНИКОВ ЗВЕЗДОЙ 67.77 KB
  Лабораторная работа № 3 ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХФАЗНОЙ ЦЕПИ ПРИ СОЕДИНЕНИИ ПРИЕМНИКОВ ЗВЕЗДОЙ. Цель работы: Исследование режимов работы трехфазной цепи при соединении нагрузки звездой. Симметричный и несимметричный режимы. Влияние нейтрального провода. ПОРЯДОК В
14620. АВТОМАТИЧЕСКОЕ ВКЛЮЧЕНИЕ РЕЗЕРВНОГО ИСТОЧНИКА ПИТАНИЯ 107 KB
  Отчет по лабораторному практикуму Автоматическое включение резервного источника питания Цель работы Работа предназначена для практического ознакомления с принципом выполнения схемы автоматического включения резервного источника питания АВР. Исход
14621. Усталостные испытания 2.57 MB
  Усталостные испытания Методические указания к лабораторным практическим работам и КНИРС по специальным дисциплинам для студентов всех металловедческих и материаловедческих специальностей Усталостные испытания: Методические указания к лабор
14622. Решение обратной задачи кинематики трехзвенного манипулятора 96 KB
  Лабораторная работа №5: Вариант 1 Решение обратной задачи кинематики трехзвенного манипулятора. Цель работы: изучение алгоритмов решения обратной задачи кинематики. Решение ПЗП для трехзвенного манипулятора с вращательными парами: Дано: ...
14623. Решение обратной задачи кинематики двухзвенного манипулятора 176.5 KB
  Лабораторная работа №4: Вариант 2 Решение обратной задачи кинематики двухзвенного манипулятора. Цель работы: изучение алгоритмов решения обратной задачи кинематики Решение ПЗП для двухзвенного манипулятора с вращательными парами: Дано: Получим р...
14624. Решение прямой задачи кинематики манипулятора 294 KB
  Лабораторная работа №3: Вариант 1 Решение прямой задачи кинематики манипулятора. Цель работы: решение прямой задачи о положении манипуляционной системы на ЭВМ на основе формализованного описания кинематических цепей Геометрические характеристики звеньев: ...
14625. Изучение метода преобразования систем координат промышленных роботов и кодирования кинематических цепей «иркутским методом» на примере робота МП-9С (Ритм -01-02) 196.5 KB
  Лабораторная работа №2: Вариант 1 Изучение метода преобразования систем координат промышленных роботов и кодирования кинематических цепей иркутским методом на примере робота МП9С Ритм 0102 . ЦЕЛЬ РАБОТЫ: – выбор абсолютной и связанных систем координат ПР; –
14626. Изучение методики разработки программ в системе MATLAB при изучении кинематического управления роботами 156.5 KB
  Лабораторная работа №1: Вариант 1 Изучение методики разработки программ в системе MATLAB при изучении кинематического управления роботами. Изучение методики разработки программ в системе MATLAB при изучении кинематического управления роботами Цель работы: Изу...