43183

ВИВЧЕННЯ МУТАГЕННОЇ АКТИВНОСТІ ГРУНТІВ З ПОРОДНЬОГО ВІДВАЛУ ВУГІЛЬНИХ ШАХТ ЦЗФ ЗАТ «ЛЬВІВ СИСТЕМ ЕНЕРГО»

Курсовая

География, геология и геодезия

Основний породний відвал ЦЗФ має висоту 68 метрів і займає площу 75 га. Верхівка відвалу плоска з горбом посередині, висота якого 10-12 метрів. Навколо горба на верхівці відвалу, розташовані досить великі за площею, плоскі відсипки породи, які відрізняються за кольором – при обстеженні нами у 2006 році на території породного відвалу ЦЗФ переважали аргілітові породи в основному чотирьох кольорів – чорного, червоного, темно-сірого та сіро-жовтого, які і займали основну площу породного відвалу. Площа відвалу терасована на 5 терас, шириною приблизно 8-10 метрів, які утворились за рахунок доріг, по яких їздять важковантажні машини.

Украинкский

2013-11-03

334 KB

1 чел.

PAGE   \* MERGEFORMAT 31

Міністерство освіти і науки України

Львівський національний університет імені Івана Франка

Біологічний факультет

Кафедра генетики та біотехнології

ВИВЧЕННЯ МУТАГЕННОЇ АКТИВНОСТІ  ГРУНТІВ З ПОРОДНЬОГО ВІДВАЛУ ВУГІЛЬНИХ ШАХТ ЦЗФ ЗАТ «ЛЬВІВ СИСТЕМ ЕНЕРГО»

Курсова робота

студентки ІІІ курсу

Х.Я. Думін

Науковий керівник:

К.б.н., доцент 

Л.С.Боднар

ЛЬВІВ – 2009

       ЗМІСТ

ВСТУП……………………………………………………………………..……………………..3

1.ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ…………………………………………………………………………5

Екологічна ситуація Червоноградського району………………………....................................5

Забруднення важкими металами  їх вплив на біологічні об’єкти…….....................................7

1.2.1 Надходження важких металів в організм та їхнє накопичення………………………....8

1.2.2. Загальнотоксичний, тератогенний, ембріоток-сичний та

канцерогенний вплив важких металів…………………………………………………………11

1.2.3. Мутагенні та цитотоксичні властивості важких металів ……………………..……….10

1.2.4. Механізми пошкоджуючої дії важких металів……………………………....................13

1.2.5. Захист клітини від пошкоджуючої дії важких металів………………………………...15

1.3. Бісульфіт – мутаген, який викликає в ДНК дезамінування

      азотистих основ…………………………………………………………………………….19

  1.  МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ……………………………………………………….................22

2.1. Матеріали досліджень……………………………………………………………………...22

2.2. Методи дослідження……………………………………………………………………….22

2.2.1. Метод домінантних летальних мутацій (ДЛМ) на Drosophila melanogaster

2.2.2. Ана-телофазний  тест на клітинах кореневої меристеми Allium cepa L……….23

2.2.3.Тест Еймса……………………………………………………………….......................24

3 РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ…………………………………………………………...26

ВИСНОВКИ…………………………………………………………………….……………...30

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ………………………………………………………………………...31

 

ВСТУП

     Питання хімічного мутагенезу в наш час привертають до себе  все більшу увагу науковців. Причиною цього є постійне збільшення  кількості хімічних сполук, які потранляють у навколишнє середовище. Масова хімізація сільського господарства і побуту призвела до постійного контакту  з хімічними  сполуками, серед яких і ті, що мають мутагенну дію. Постійно зростає число підприємств де на робочих місцях знаходяться мутагенні речовини. Через недостатність очисних систем в деяких випадках подібні речовини викидаються у навколишнє середовище [1].

    Накопичення  в  гідросфері,  літосфері  та  атмосфері  ксенобіотиків,  переважна більшість  яких  є  мутагенами,  створює реальну загрозу для генофондів тих хто живе на нашій планеті. В біосферу введено вже близько 4 000 000 невластивих їй хімічних сполук, у вигляді промислових відходів, пестицидів, лікарських препаратів, тощо [2].

      Шкідливий вплив хімічних мутагенів на спадковий апарат людини привів до росту частоти народження дітей з різними спадковими хворобами. Окрему увагу варто звернути на те, що мутагени здатні викликати збільшення рецесивних мутацій, що ведуть до тяжких спадкових  захворювань,  які  не  проявляються  в  першому  поколінні  а поступово нагромаджуються  у  популяції і через декілька поколінь проявляються з величезною частотою [3].

      В Україні проведено серію досліджень про комбіновану та комплексну дію чинників природного та антропогенного походження на спадковий апарат живих організмів [1]. Однак остаточно не розроблені методологічні та методичні підходи щодо оцінки їх впливу на біологічні об’єкти в умовах навколишнього та виробничого середовища. Ведеться пошук нових тест-систем оцінювання сумарного впливу забруднювачів довкілля і мутагенів на загальний стан організму і функціонування його спадкового апарату [2].

      Лише поєднання екогенетичного моніторингу з біоіндикацією мутагенів за допомогою різних тест-об’єктів з врахуванням трьох рівнів організації спадкового апарату (генний, хромосомний, геномний) дасть змогу верифікувати мутагенне навантаження на популяцію людини. Як відомо, збільшення мутагенного навантаження до рівня, здатного подвоїти частоту виникнення мутацій у людини, може привести до істотних змін генофонду нації. Тому, вельми необхідним є розв’язання таких проблем, як контроль над процесами забруднення навколишнього середовища мутагенами, запобігання наростанню мутагенного забруднення, розуміння природи дії мутагенів і пошуки засобів захисту живих організмів від їх негативного впливу [2].

     Внаслідок значного розвитку гірничодобувної промисловості в Червоноградському районі створилася несприятлива екологічна ситуація яка є однією з основних причин погіршення здоров'я населення: захворювання дітей на гіпоплазію зубів в кількості понад 5 тис. чол., а також збільшення частоти захворювань по іншим хворобам на 60%, в порівнянні з середніми даними по країні. Територія району характеризується, як одна з найвищих в Львівській області за антропогенним впливом на навколишнє природне середовище, що викликано, в першу чергу, техногенним впливом на навколишнє середовище таких галузей промисловості, як вуглевидобувна, вуглезбагачувальна та хімічна. Велика частина земель регіону зайнята відходами вуглевидобутку (териконами), що потребує рекультивації земель, зокрема шляхом озеленення териконів [3].

    Метою нашої роботи було дослiдження мутагенної активності вiдходiв вугiльнопереробної промисловостi – грунтiв з породнього вiдвалу центральної збагачувальної фабрики (ЦЗФ).

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1. Екологічна ситуація Червоноградського району

     Розвиток  економіки  на Україні пов’язаний із залученням у промислове виробництво все нових й нових обсягів мінеральних ресурсів. Особливе місце у цьому процесі відіграє гірничодобувна промисловість. Але її інтенсивний розвиток, як правило, призводить до суттєвого погіршення якості навколишнього природного середовища як в локальному, так і реґіональному масштабах. Особливу небезпеку при цьому становить техногенне забруднення ландшафтів, яке охоплює практично всі їх компоненти, а також активізація негативних фізико-географічних явищ. Не зважаючи на те, що райони розробки корисних копалин займають лише від 1–2 до 5–6% площі промислових реґіонів України, масштаби перетворення їх ландшафтів є вражаючими, а екологічна ситуація – вкрай несприятливою для життєдіяльності людини [6].

     Територія Львівської області характеризується значним розповсюдженням небезпечних геологічних, як природних, так і техногенно-активізованих  процесів. Діяльність підприємств вугільної промисловості Західно-Української вугільної холдингової компанії “Львіввугілля” та закриття шахт №1 “Червоноградська” і №5 “Великомостівська” спричинили надзвичайну екологічну ситуацію, пов’язану із суттєвими змінами геологічного та гідрогеологічного середовища на території  регіону. Насамперед це обумовлено підвищенням рівня  ґрунтових вод, підтопленням та заболоченням значних територій, забрудненням грунтів  та водоносних горизонтів [7].

         Львівсько – Волинський вугільний басейн являє собою приклад  одного з техногенно перевантажених, екологічно небезпечних районів України. Його географічні межі  проходять по наступних населених пунктах: Устилуг – Володимир-Волинський - Городок – Радехів – Буськ – Львів – Рава Руська. На цій території сформувались три вугленосні райони: Південно – Західний (Львів, Жовква), Нововолинський (Володимир Волинський, Нововолинськ, Устилуг), Червоноградський ( Червоноград, Сокаль, Соснівка).

     Червоноградський гірничо - промисловий район є основним вугледобувним районом басейну і на нього припадає практично найбільше екологічно небезпечне навантаження, так як тут на відносно невеликій – 180км2 – розташовано дванадцять вугільних шахт і 211 га відведено під породні відвали.  До 80% техногенного навантаження відноситься до площі приблизно в 30 км2, яка знаходиться в межиріччі річок Бугу і Рати, де проживає більшість населення району і одночасно розташовано сім вугільних шахт і основний відстійник шахтних вод [3].

      У 1979 році приблизно за три кілометри від смт. Соснівка збудовано і введено в дію центральну  збагачувальну фабрику (ЦЗФ) ЗАТ „Львівсистеменерго”, на якій збагачується вугілля, що видобувається 10 вугільними шахтами. Річний видобуток вугілля складає біля 3,2 млн. тон, фабрика переробляє 2,0 млн.тон. При цьому готового продукту (вугільного концентрату), що відвантажується споживачу, 1435,5 тис.тон. В результаті технологічного процесу утворюються тверді і рідкі відходи. Тверді відходи складають 1,8 млн.т/рік, рідкі відходи - 1,35 млн. т/рік.

     Основний породний відвал ЦЗФ має висоту 68 метрів і займає площу 75 га.  Верхівка відвалу плоска з горбом посередині, висота якого 10-12 метрів.  Навколо горба на верхівці відвалу, розташовані досить великі за площею, плоскі відсипки  породи, які  відрізняються за кольором – при обстеженні нами у 2006 році на території породного відвалу ЦЗФ переважали аргілітові породи в основному чотирьох кольорів – чорного, червоного, темно-сірого та сіро-жовтого, які і займали основну площу породного відвалу.  Площа відвалу терасована на 5 терас,  шириною приблизно 8-10 метрів, які утворились за рахунок доріг, по яких їздять  важковантажні машини. Між дорогами-терасами знаходяться схили висотою 10-12 метрів, під кутом приблизно 45 градусів.  Основну масу породи породного відвалу складають алевритисті та алевритові аргіліти.  Аргілітами називають осадкові породи з групи глин, які не несуть явних слідів метаморфізму, не розмокають або розмокають дуже слабо у воді. За описом Бобровника [4] ці аргіліти виникли під водою, в водоймищі, що сполучалось з морем та є, як і піщаники, з якими вони перешаровуються, основними складовими частинами Львівсько-Волинського вугленосного басейну. Наявність піриту (до 1%) в аргілітах відвалу свідчить про те, що водний басейн мав в своєму складі достатньо сірководню. Аргіліти в основній своїй масі від темно-сірого кольору до чорного, інколи попелясто-сірі.   Навколо породного відвалу викопана неглибока дренажна канава та знаходиться невеликий став, що утворився за рахунок стоків з відвалу [5].

     За мінералогічним складом у породі відвалу в середньому: аргіліту – 97%, алевроліту – 17–28%, піщанику – 220%, вугілля – 117%, піриту – 1%, вологість – 67%. Хімічний склад породи (середній з 4 видів) наступний: SiO2 – 56,2%; Fe2SO4 – 10,18%, Al2O3 – 23,71%; CaO – 0,99%; MgO – 0,73%; K2O – 2,44%; Na2O – 0,5%; SO3 – 7,55%; TiO2 – 1,09%, Вміст мікро та ультрамікроелементів визначався методом атомно-адсорбційної фотометрії [10].

Таблиця 1.1

 

Вміст мікроелементів в породі відвалу ЦЗФ(г/т )

Вміст

елементу

Cu

Zn

Mn

Pb

Mo

Ni

Ba

Cr

Ti

Мін.

12,59

0

86,78

7,638

0

16,53

106,8

31,188

2717

Серtl

89,04

35,7

2353,6

35,66

1,64

37,56

369,3

235,36

1234,2

Максим.

244,16

62,1

4484,4

273,24

3,97

79,48

583,5

2159,0

4595,2

Таблиця 1.2

Вміст рідкоземельних елементів в породі відвалу ЦЗФ (г/т)

Вміст

елементу

Be

Bi

Yb

Y

Sc

Ga

V

Sn

Мінім.

0,543

0

2,278

2,278

3,728

7,797

76,38

0

Середн.

2,645

9,435

4,65

44,11

15,02

25,43

151,88

4,48

Максим.

4,566

24,30

10,87

108,7

53,98

48,88

387,95

36,93

   В таблицях 1.1, 1.2 наведені результати визначення вмісту мікро- та ультрамікроелементів (всього визначено 21 елемент у відібраних 212 зразках ґрунту згідно [8], зокрема важких металів, таких як свинець, нікель, мідь, цинк, роль яких в житті рослин приблизно відома. Що стосується інших елементів, то їх значення для метаболізму рослин вивчено недостатньо. В той же час всі ці елементи є екологічно важливими факторами середовища, тому вивчення їх кількісного складу має важливе актуальне значення. ГДК для Pb складає 6 мг/кг ґрунту, Cu 3 мг/кг, Ni – 4 мг/кг, Zn – 2 мг/кг, а як видно з таблиць вміст цих важких металів значно перевищує ГДК (при перерахунку по їх максимальному значенню) свинцю в 45,5 разів, міді в 81,3 рази, нікелю в 19,8 рази і, нарешті, цинку в 31 раз. Слід відмітити, що в різних місцях відбору проб породи вміст елементів сильно розрізняється, що є зрозумілим, так як порода привозиться з  різних шахт району.

     

1.2. Забруднення важкими металами їх вплив на біологічні об’єкти

     Сполуки важких металів є одним із найбільш розповсюджених хімічних факторів професійного ризику в умовах сучасної промисловості. Широко зустрічаються й профпатології, пов'язані з дією цих сполук. Щоправда, за даними В003, гострі виробничі отруєння важкими металами в наш час трапляються досить рідко, але тим більшої актуальності набуває проблема впливу на організм малих доз їхніх сполук та спільної з іншими мутагенами дії останніх, а особливо віддалених наслідків такого впливу.[9]

    Водночас зростає насиченість навколишнього середовища сполуками важких металів, що, в свою чергу, призводить до накопичення цих сполук в організмах людей, які проживають на забруднених територіях, починаючи вже з дитячого віку. Згідно з деякими прогнозами, в майбутньому сполуки важких металів як загроза екологічному станові довкілля можуть вийти на перше місце, випереджаючи в цьому відношенні відходи атомних станцій та органічні антропогенні забруднення. Такі загрозливі перспективи забруднення біосфери важкими металами обумовлені їхньою стійкістю в навколишньому середовищі та включенням у кругообіг речовин (розчинність в атмосферних опадах, здатність до сорбції грунтами, донними відкладеннями, засвоєння рослинами — все це в сукупності призводить до їхнього поступового накопичення в сфері проживання людини).[9]

    Така ситуація зумовила потребу в аналізі та узагальненні наявних у літературі відомостей щодо токсичної і особливо генетичної дії важких металів на організм у цілому та окремі клітини людського та інших організмів.

1.2.1. Надходження важких металів в організм та їхнє накопичення.

    Важкі метали, які знаходяться в складі літосфери, практично недоступні для живих організмів (за винятком засвоювання, в основному, рослинами та грибами сполук, що входять до складу грунту)  Надходження їх в атмосферу та гідросферу відбувається як природним, так і антропогенним шляхом. [10].

    В наші часи саме антропогенна емісія є основним джерелом потрапляння важких металів у навколишнє середовище. Особливо актуальним питання про токсичну та генетичну дію надлишкових кількостей важких металів є стосовно контингенту осіб, які професійно контактують із сполуками цих металів. Проте масивне забруднення довкілля цими речовинами призводить до нагромадження їх надлишкових кількостей також в організмах людей, що не мають професійного контакту з важкими металами. Цифрові дані щодо характеру природної емісії, антропогенного забруднення довкілля та професійного контакту з цими сполуками широко представлені в літературі.

    Основними шляхами надходження важких металів до організму є респіраторний та аліментарний. Характер накопичення їх у тканинах є специфічним для кожного металу, а також пов'язаним із шляхом надходження цих сполук до організму. В основному респіраторним шляхом надходить свинець, неорганічна ртуть. Нікель також ефективно засвоюється інгаляційно. Хром проникає в організм, як правило, аліментарним шляхом .[11]

    Хром після надходження в організм накопичується більше всього в м'язовій тканині, волосяному покриві  і в селезінці [13]. Нікель також здатний накопичуватися в тваринному організмі; він збирається, головним чином, у тканині легенів (при інгаляційному надходженні), а також у м'язовій тканині, ендокринних залозах, печінці тощо [12]. Основна маса засвоюваного організмом свинцю стабільно зв'язується в кістковій тканині і не бере участі в наступному обміні речовин. Проте значна кількість засвоєного свинцю потрапляє і в інші тканини, зокрема, в кров. Близько 90 % свинцю крові зосереджено в еритроцитах, оскільки він має досить високу спорідненість до гемоглобіну. Ртуть також може накопичуватися в організмах тварин, у тому числі в біотранс-формованій формі (метилртуть), причому максимальний вміст іонів Нg2+ при хронічній інтоксикації спостерігається в крові [13].

      Свинець здатний проходити через фетоплацентарний та гематоенцефалічний бар'єри, накопичуватися в амніоні та в амніотичній рідині. Як фетоплацентарний, так і гематоенцефалічний бар'єри є проникними тахож для іонів Нg2+   [15].

    Транспорт неорганічної ртуті в клітину відбувається, в основному, за рахунок зв'язування з сульфгідрильними групами білків цитомембрани, на відміну від ртутьорганічних сполук, які потрапляють у клітину внаслідок взаємодії, головним чином, з її ліпідним компонентом. Цей процес протікає досить інтенсивно: за допомогою авто-радіографічних досліджень виявлено, що крива включення радіоактивної ртуті в клітину досягає плато уже через 15 хв після додавання її до культурального середовища. Розподіляється ртуть у клітині таким чином: ядро > мікросоми >> цитоплазма > мітохондрії [16 ].

    1.2.2. Загальнотоксичний, тератогенний, ембріоток-сичний та канцерогенний вплив важких металів.

 Токсична дія важких металів добре відома. Ступінь токсичності можна оцінити, використовуючи поняття відносної летальної токсичності. Ця величина являє собою відношення відсотка елемента в організмі до LD50. Для свинцю вона становить близько 10-2, для ртуті — 10-3, для хрому та нікелю відповідно 2-10-2 та 5-10-3. Але частіше використовують або саму LD50, або гранично допустимі концентрації (наприклад, небезпечною концентрацією для свинцю вважається 300—800 мкг/л повітря , а для ртуті — 25 мкг/м3 (для металічної ртуті) і 50 мкг/м (для солей) [17].

      Характер токсичної дії на організм різних металів значно відрізняється. Так, за даними літератури, для свинцю особливо характерною є гемолітична активність; він спричиняє також прояви астено-вегетативного характеру, зменшення плодючості  Гостра інтоксикація ртуттю є критичною для нирок та респіраторних органів, хронічна — для нирок та нервової системи їй притаманна також гонадотоксична та імунотоксична дія [18].

    Надлишок хрому спричиняє алергізацію організму та інші порушення імунологічного статусу. Виявлено також гонадо- та ембріотоксичність хрому (III). Нікелева інтоксикація, в свою чергу, призводить до гістологічних змін у паренхімі печінки та легенів, порушення імунологічного балансу [19].

    Для важких металів характерною є цитотоксична дія, зокрема, для свинцю. Цитотоксична дія НgС12 в культурі ембріональних гепатоцитів проявлялася, починаючи від концентрації 3 мкМ (величина LD50 для даної системи знаходиться в межах 10—50 мкМ). Концентрація 0,5 мкМ, яка за умов короткочасного експерименту не викликає загибелі клітин, призводить до прискорення збільшення біомаси порівняно з інтактними культурами протягом перших 5—6 діб культивування і масової елімінації клітин на 7-му добу. Нікель також виявляє цитотоксичні властивості; подібний вплив хрому низький, при концентрації порядку 1 мМ він не проявляється [20].

    Деяким важким металам та їхнім сполукам притаманна також канцерогенна дія. Наприклад, ртутьорганічні сполуки є канцерогенами, проте підтвердження канцерогеняості неорганічних її солей не отримано. Є дані і про канцерогенну дію хрому. Металічний нікель та більшість сполук нікелю є канцерогенами. Канцерогенні властивості нерозчинних його сполук значно вищі, ніж розчинних: Ni3S2 та NiO індукують розвиток пухлин, а розчинний NiSO4 таких властивостей не проявляє. Канцерогенність металічного нікелю залежить від його дисперсності [20, 21].

     

1.2.3. Мутагенні та цитотоксичні властивості важких металів.  

   Для важких металів також є характерними мутагенні властивості. При статистичному дослідженні протікання вагітності у жінок з різними рівнями вмісту свинцю в крові виявлено вірогідне зростання частоти спонтанних абортів на ранніх стадіях вагітності в групі з високим рівнем свинцю, що, як відомо, є інформативним показником темпу мутаційного процесу [9].

   У деяких груп працівників промислових підприємств, які контактують із свинцем та його сполуками, зафіксовано підвищену частоту хромосомних аберацій, що цілком відповідає вільно-радикальному типові ушкоджень. Відомо, що саме вільнорадикальні процеси є характерною ознакою пошкоджуючої дії свинцю. Так, у групах осіб, які працюють у приміщенні з концентрацією свинцю в повітрі, близькою до ГДК, частота хромосомних аберацій становить 2,3 ± 0,5 %; в інших групах працівникiв цей показник становить 3,5 ± 0,5 %, тоді як контрольна група має частоту хромосомних аберацій лише 1,25± 0,38 % [22].

       Вірогідне підвищення частоти хромосомних аберацій зафіксовано також у працівників цеху виплавки свинцю [22]. В обох останніх випадках є великі міжіндивідуальні розбіжності, причинами яких можуть бути різний стаж роботи в умовах підвищеної концентрації свинцю, різниця в отриманих різними працівниками дозах свинцю і, можливо, в стані захисних систем, що запобігають появі пошкоджень під дією цього фактора, а також наявність синергічних або антагоністичних впливів різної природи.

   Підвищену частоту хромосомних аберацій та сестринських хроматидних обмінів (СХО) зафіксовано також у працівників хімічної промисловості, які професійно контактували із сполуками хрому (в тому числі, Сг(Ш)) , причому кореляції між частотою СХО та хромосомних аберацій не виявлено. Крім того, мутабільність клітин під впливом хрому (III), як і інших пошкоджуючих факторів, зростає з віком донорів, імовірно, через послаблення активності захисних систем. У модельній системі культивованих лімфоцитів людини СгС13 індукує хромосомні аберації, починаючи з концентрації 5-10-6 М; аналогічні властивості має також (СН3СОО)2РЬ у концентрації 105—103 М [23].

   Хрому притаманна значна пошкоджуюча дія відносно ізольованих ядер та ДНК, проте для цілісних клітин та організмів у літературі зустрічаються протилежні дані, особливо стосовно сполук хрому (III). Концентрація солей хрому порядку 1 мМ не індукує хромосомних аберацій в культивованих клітинах ссавців. Показано, що немутагенною є також концентрація 12 мM. Проте, за іншими даними, хром дає виражений мутагенний ефект для клітинних культур уже в дозах 0,01—1 мМ і навіть 1 мкМ. Підтверджується мутагенність хрому в концентраціях 60 і 120 мМ (тест на хромосомні аберації). Він також здатний спричиняти однониткові розриви ДНК. Вказується на блокування іонами хрому мітозу на стадіях про- та телофази. Спостерігається зростання частоти хромосомних аберацій та СХО у працівників, які професійно контактують з нікелем [13].

   Нікель індукує хромосомні аберації в культурах клітин та при введенні гризунам іп vivo . На гризунах та культурах клітин ссавців показано здатність солей нікелю індукувати хромосомні аберації в дозах, вищих за 0,2 мМ; для різних сполук нікелю показано різний рівень мутагенності: К4[Ni(CN4)] індукував хромосомні аберації вже в концентрації 0,2 мМ, (СН3СОО)2Ni і NiS — починаючи від 0,6 мМ, а для NiСІ2 мутагенного ефекту не виявлено взагалі. У дослідах на культурах клітин ссавців виявлено індукцію генних мутацій нікельорганічними сполуками, але не NiСІ2, в діапазоні концентрацій 0,2—0,3 мМ; проте, згідно з іншими даними, хлорид нікелю в такій концентрації теж збільшує частоту мутацій на генному рівні. Переважної індукції певного типу генних мутацій (транзиції, трансверси, зсув рамки зчитування) не виявлено [12].

   Дослідження молекулярних аспектів мутагенності іонів нікелю показало наявність індукції однониткових розривів ДНК, крос-лінків, а також пригнічення синтезу нуклеїнових кислот та репарації. В інтервалі доз 0,005—10 мМ на культурах клітин гризунів виявлялися аналогічні фізичні та функціональні пошкодження, однак на культурах клітин людини їх зафіксовано не було. Виявлено також індукцію однониткових розривів NiСІ2 та N у діапазоні концентрацій 1—20 мкг/мл. Здатність нікелю індукувати однониткові розриви підтверджується іншими авторами на еукаріотичних моделях [12].

    В експериментах з культивованими клітинами ссавців виявлено, що під дією свинцю пригнічується функціональна активність клітин; зокрема, пригнічується, а при високих дозах блокується протікання S-фази клітинного циклу, знижується функціональна активність хроматину, знижується точність синтезу ДНК [24].

   Мутагенну дію свинцю досліджували і на гризунах. Хромосомні аберації в клітинах кісткового мозку зареєстровано при концентрації свинцю 5-10-2 мг/кг; у тесті на домінантні деталі підвищення преімплантаційної смертності спостерігалося вже при дозі 5-10-3 мг/кг, а при дозах, які викликають хромосомні аберації, зростала і постімплан-таційна смертність. Проте в дослідах  в культурі клітин концентрація солей свинцю 308— 976 мкг/мл не спричинювала вірогідного зростання числа генних мутацій; але слід зауважити, що в цьому діапазоні доз спостерігається наявність цитотоксичного ефекту. В дослідах на чутливих до свинцю лініях мишей (цитогенетичні дослідження з використанням тесту на домінантні леталі) було показано, що біотрансформований свинець менш мутагенний порівняно з його іонною формою. Можливо, це пов'язано з десмутагенністю відносно свинцю ряду речовин, які містяться в рослинах (наприклад, таніни, що реагують з важкими металами з утворенням нерозчинних і погано засвоюваних організмом сполук). Мутагенна дія хрому підтверджується і за допомогою тесту на ДЛМ (при хронічній експозиції протягом 6 місяців, щоденна доза 0,25 мг/кг) [22].

   Мутагенність важких металів залежить від вікових характеристик досліджуваних клітин: при старінні як in vitro, так і in vivo чутливість клітинної ДНК до пошкоджуючого впливу зростає, очевидно, через зниження ефективності репаративннх систем [24].

   Крім гризунів та культивованих клітин ссавців, для вивчення мутагенного впливу сполук важких металів застосовують також різні лінії Drosophila melanogaster  та рослинні тест-системи. Так, мутагенність NiSO4 та NiCl2 підтверджена в дослідах на дрозофілі (дози 0,14—7 мМ). Мутагенність РbJ2, (0,95. 10-4—3,8. 10-4 М) та Рb(NO3) (1.10-1 М) зафіксовано для Сrepis сарllаrіs. Відзначено, що чутливість рослинних клітин до мутагенної дії свинцю максимальна у фазі G0, а мінімальна — в мітозі [25].

   Як видно з наведених прикладів, мутагенна активність важких металів проявляється по-різному в тест-системах відмінної біологічної природи. Порівняння даних з визначення мутагенності солей важких металів для про- та еукаріот показує особливо суттєву різницю між рівнем мутагенної та пошкоджуючої активності цих сполук для організмів з різною організацією спадкового матеріалу.

1.2.4. Механізми пошкоджуючої дії важких металів.

   Як відомо, існують такі типи мутацій, які виникають в результаті пошкодження генетичного апарату клітини на різних рівнях: геномні, хромосомні та генні. Всі ці типи мутацій можуть індукуватися підвищеними концентраціями важких металів в клітині.

   Механізми пошкоджуючої дії важких металів мають багато спільних рис. Так, усі згадувані метали, ймовірно, мають властивість прямо ушкоджувати ДНК. Нікель та ртуть можуть спричиняти розриви в молекулі ДНК. Іони Нg2+ здатні пошкоджувати клітинну ДНК, індукуючи одно- та двониткові розриви, зшивки ДНК—білок, генні мутації всіх типів, СХО та посилювати спіралізацію ДНК. Токсичні дози ртуті викликають масивний синтез ДНК по всьому об'єму ядра; проте  в найсильніше  пошкоджених клітинах він практично не відбувається, скоріш за все, через порушення роботи репаративних систем. Одним із можливих механізмів пошкоджуючої дії хрому (НІ) є, очевидно, пряме ушкодження ДНК [26].

   Серед опосередкованих механізмів мутагенної та пошкоджуючої дії, характерних для важких металів, значну роль, імовірно, відіграє індукція перекислих процесів. її механізми, в свою чергу, можна умовно поділити на безпосередній та спричинений зниженням активності захисних систем клітини. Безпосередня індукція вільних радикалів особливо характерна для металів із змінною валентністю—нікелю та хрому. Так, іони Ni2+ в біологічних системах здатні вступати в реакції, в ході котрих змінюється заряд іона, внаслідок чого утворюються вільні радикали. Подібним механізмом відзначається і дія хрому (III) [23].

   Цікаво, що саме Сг3+ в понадфізіологічних концентраціях серед усіх можливих форм існування хрому в клітині найактивніше ушкоджує ДНК. Хоча хромат- та біхромат-іони в культурі клітин індукують значно більше первинних пошкоджень ДНК, ніж Сг3+ [4 ]. На ізольованих ядрах, навпаки, саме хром (НІ) спричинює найбільше таких пошкоджень, зокрема, розривів ДНК. Це явище можна пояснити таким чином: хром (VI) легко проходить через цитомембрану; всередині клітини він відновлюється мікросомними ферментами до хрому (III), який і є, власне, формою, здатною пошкоджувати ДНК; слабка мутагенність останнього для інтактних клітин може бути обумовлена поганою проникністю цитомембрани для іонів Сг3+. Перехід Сг6+ → Сг3+, за [26 ], також супроводжується появою вільних радикалів, внаслідок чого виникають додаткові пошкодження клітинної ДНК. Хоча для ртуті припускається можливість участі в аналогічні реакції, основна маса пошкоджень, індукованих іонами Нg2+ та Нg+, можливо, відбувається за рахунок інших механізмів [13, 14].

   Кінцеві продукти перекисних процесів не виявляють значної мутагенної активності, проте вільні радикали, що утворюються в ході зазначених процесів, за численними даними, є пошкоджуючим ДНК фактором. На рис. 1.1. наведено можливий механізм індукції таких пошкоджень [27].

Рис.1.1.Імовірний механізм вільно радикального пошкодження ДНК у ході перекисних процесів.

    Помічено, що для РbJ2 залежність між дозою мутагена та ефектом не є прямолінійною; частота пошкоджень, поступово підвищуючись, сягає максимуму в межах дози 1,9-10-4 М, після чого починає спадати. Можливо, це пояснюється тим, що при дозах, вищих за «оптимальну», цитотоксична дія свинцю настільки виражена, що ушкоджені клітини гинуть або припиняють проліферацію і, таким чином, пошкодження їхнього хромосомного апарату не можуть бути виявлені [17].

   Крім того, між вмістом мікроелементів в організмі існує взаємозв'язок, тому зростання вмісту одних іонів спричинятиме зміну концентрації в клітині інших мікроелементів, а оскільки значна їхня кількість бере участь у стабілізації структури ДНК в різних біохімічних процесах, то порушення мікроелементного складу клітини може сприяти виникненню її пошкоджень.

   Таким чином, механізми мутагенної дії важких металів характеризуються різноманітністю та складністю. Одні й ті ж самі іони можуть пошкоджувати клітинну ДНК, діючи на різних рівнях і за різними механізмами, що створює широке поле діяльності для дослідників цих процесів.

1.2.5. Захист клітини від пошкоджуючої дії важких металів. 

   В організмі існують різні механізми захисту від пошкоджуючої дії ксекобіотиків. Ініціація вільнорадикальних пошкоджень є одним з основних його процесів. Детоксикація перекисних та вільнорадикальних сполук здійснюється, в основному, за рахунок системи антиоксидантного захисту [27].

   Як правило, знешкодження тих чи інших мутагенних сполук відбувається за допомогою цілого ряду захисних факторів, однак елімінація навіть однієї з ланок системи антиоксидантного захисту (наявність так званого нульового, тобто кодуючого функціонально неактивний білок, алеля одного з ферментів, зокрема, однієї з глутатіон-трансфераз класу µ або цитохрому р450) може в деяких випадках призводити до вірогідного зростання частоти пошкоджень генетичного апарату [27].

    Проте ця система має певні особливості; так, при взаємодії токсичних сполук з цитохромом р450 може відбуватись їхня метаболічна активація, тобто утворення більш токсичних сполук, ніж ті, що вступили в реакцію [23]. Прикладом може служити поява показаного на схемі радикала –О2- тощо.

     Антиперекисні ферменти каталаза, супероксиддисмутаза (СОД), селенова глутатіонпероксидаза (ГП), глутатіонзалежиа ліпопероксидаза та глутатіонтрансфераза спричиняють метаболічну активацію значно рідше. Три останніх ферменти в процесі функціонування використовують GSH, перетворюючи його на окислену форму (GSSG) або стійкі кон'югати [112]. GSSG може відновлюватися за допомогою ферменту глутатіон-редуктази (GR); пул GSH у клітині відновлюється також шляхом синтезу de novo. Однак тіоли (особливо глутатіон) мають так звану «парадоксальну» дію: на відміну від інших антимутагенів, протекторний ефект GSH проявляється лише при порівняно високих концентраціях його в клітині, а в низьких концентраціях він є мутагеном; існує кілька припущень стосовно причин такого ефекту, а саме:

   - тіоли в ході детоксикаційних реакцій генерують H2O2 та інші аналогічні сполуки; при високих концентраціях GSH, перекисні сполуки знешкоджуються ним же;

   -  метаболічна активація йде активніше при дефіциті тіолів;

   - високі концентрації тіолів призводять до елімінації дефектних клітин тощо [23].

   З цієї схеми видно, що описана система не є специфічною лише для антиоксидантного захисту, її захисні функції значно ширші. В схему включено не всі регуляторні та індукуючі фактори. Так, слід зазначити, що, наприклад, інтерлейкіни відіграють важливу роль у регуляції активності ряду згадуваних ферментів [19].

   При взаємодії свинцю, котрий за своїми властивостями є металом-прооксидантом, з системою антиоксидантного захисту (АОЗ) можна виділити такі фази: напруга гомеостазу (нестійкість показників стану системи АОЗ, індукція факторів АОЗ; спостерігається при відносно низьких концентраціях свинцю в крові (до 6 мМ»; пригнічення, яке настає із зростанням вмісту свинцю, і, нарешті, вичерпання захисних механізмів [17].

   Важливу роль антиоксидантна система відіграє і в детоксикації іншого металу-прооксиданта — ртуті (зокрема, каталаза, глутатіон та низка низькомолекулярних SH-вмісних сполук). Існують також інші фактори детоксикації. Значну роль у знешкодженні токсичних сполук відіграють вітаміни, такі як токофероли, ретинол, каротиноїди, а також аскорбінова кислота. Антиоксидантними властивостями наділені й вітаміни В12, К, К1, Р, Q, U ; надлишкові концентрації вітамінів є прооксидантними [23].

   Протекторна дія вітамінів реалізується частково за рахунок їхніх антиоксидантних властивостей. Проте для елементів, які знаходяться на одному з найвищих ступенів окислення (зокрема, хром (VI)), взаємодія з антиоксидантами може призвести до утворення ще більш небезпечних сполук та вільних радикалів, тобто для біоантиоксидантів вірогідною є метаболічна активація [8].

  Вітаміни здатні модифікувати активність ферментів системи антиоксидантного захисту. Так, за умов недостатності ретинолу знижується активність глутатіонредуктази; можливо, ретинол також здатний до вибіркового пригнічення ізоформ ферментів, які здійснюють метаболічну активацію певних чинників. Модифікація активності ферментів АОЗ (СОД, каталаза, глутатіон-пероксидаза) показана і при дії токоферолу. Генопротекторна дія вітамінів може бути опосередкована і через систему циклічних нуклеотидів. Крім того, аскорбінова кислота стабілізує структуру ДНК, а ретинол збільшує тривалість клітинного циклу, що, в свою чергу, підвищує ефективність репарації [26].

   Протекторний ефект вітамінів стосовно іонів важких металів певною мірою підтверджується тим, що існує обернена кореляційна залежність між вмістом свинцю та токоферолу в крові. Проте, за іншими даними, ця кореляція, навпаки, є прямою; але тут же стверджується, що наявність токоферолу знижує токсичність свинцю за рядом параметрів [23].

   Захисним ефектом наділені й інші біологічно активні речовини: амінокислоти, гормони тощо. їхня захисна активність може бути як обумовленою безпосередньо детоксикаційними властивостями, так і здійснюватися через регуляторні системи клітини, зокрема, систему циклічних нуклеотидів. Важливим захисним фактором у відношенні до важких металів є система металотіонеїнів. За своїми біохімічними характеристиками металотіонеїни — це білки, які містять до 30 % цистеїну та мають молекулярну масу порядку 6—7 кДа [11].

     Металогіонеїни можуть індукуватися іонами відповідних металів, а також дією інших факторів, наприклад, іонізуючого випромінювання. Найчастіше в літературі зустрічаються дані про детоксикаційну роль металотіонеїнів відносно іонів кадмію, однак інші метали також мають високу афінність до цих білків. Одним із можливих механізмів індукції металотіонеїнів є ампліфікація їх генів, спричинена ушкодженням ДНК. Стійкість клітини до впливу металів залежить від кількості копій генів металотіонеїнів [28].

    Механізм захисної дії металотіонеїнів не зводиться до зв'язування іонів металів, оскільки зафіксовано зниження рівня однониткових розривів та цнтотоксичності неметалічних сполук (.N0, бромбензолу) за умов попередньої індукції в досліджуваних клітинах металотіонеїнів або введення екзогенного білка, а також виявлено зв'язок між високим рівнем експресії металотіонеїнів у пухлинах та резистентністю останніх до терапевтичних заходів. Металогіонеїни мають і визначені антиоксидантні властивості. Вони відіграють також певну роль у підтриманні нормального іонного балансу в клітині [28].

   Генопротекторна дія біологічно активних речовин може бути спричинена не лише їхніми детоксикаційними властивостями, але й спроможністю їх стимулювати репаративні процеси. Репарогенні властивості особливо характерні для інтерферону. Оскільки його захисні функції базуються на здатності до активації певних генів системи репарації, протекторний ефект інтерферону не проявляється ні в непроліферуючих, ні в деяких дефектних за репарацією клітинах. Зокрема, зафіксовано репарогенну дію інтерферону для однониткових розривів, індукованих CdCl2. Репарогеном, можливо, є й аскорбінова кислота [23].

   За певних умов захисні функції у відношенні важких металів здійснюють іони інших мікро- та макроелементів. Механізми такої дії можуть бути різними: наприклад, кальцій прискорює виведення свинцю з організму, ймовірно, за конкурентним механізмом. Аналогічний взаємозв'язок спостерігається також між вмістом свинцю й міді, цинку та заліза . Антагоністом нікелю є магній [25].

    Особлива роль у процесі детоксикації належить селену, котрий, зокрема, входить до складу активного центра деяких компонентів системи антиоксидантного захисту. Селен є активним антагоністом металів з вираженими прооксидантними властивостями, таких як ртуть та свинець [2].

    У низки живих організмів може спостерігатися генетично обумовлена стійкість до ртуті, котра залежить від комплексу генів. Експресія цього комплексу генів, яка носить назву теr, регулюється за допомогою білка Меr. Цей білок зв'язаний з ДНК таким чином, що перешкоджає транскрипції згаданих генів і має високу спорідненість до іонів ртуті; утворюючи з нею сполуку, він змінює конформацію, що робить просторово допустимим зв'язування з промотором тer РНК-полімерази [21].

   Важливу роль у детоксикації неорганічної ртуті відіграють інші мікроелементи, зокрема, цинк та селен. Селен є антагоністом ртуті  і утворює з нею стійкі комплекси типу селен— ртуть—білок. Таким чином, надлишкова ртуть вилучається з метаболізму. Щодо цинку, то він стимулює активність глутатіон-3-трансферази та металотіонеїнів, завдяки чому зростає активність детоксикації [11].

   Насамкінець, можна зробити висновок стосовно того, що існують кілька рівнів та ряд паралельних механізмів захисту клітини від мутагенної дії важких металів.

1.3. Бісульфіт – мутаген, який викликає в ДНК дезамінування  азотистих основ

   Окрім важких металів у складі відвалу ЦЗФ міститься значна кількість інших неорганічних речовин. Зокрема, вміст сірки значно перевищує гранично допустимий рівень (табл. 1.3.). Імовірною мутагенною сполукою сірки виступає бісульфіт – газ без кольору, добре розчинний у воді; швидко гідратується і утворює сірчисту кислоту, яка при дисоціації утворює сульфітні і бісульфітні іони [29].

Таблиця  1.3.    

Порода

мг/кг

Cr

Cu

Pb

Fe

Co

Ni

Cd

Zn

Mn

S

Червона

3,09

1,07

8,32

28,7

193,7

53,1

1,75

15,3

110,3

5650

Чорна

2,02

2,93

7,01

34,0

571,7

24,9

3,35

4,95

70,1

7480

ГДК

100

2.1

6.0

-

5

32

0,5

23

500

0,4(по H2S)

   Дезамінування цитозину. Хоч і існують данні про те, що при підвищеній температурі бісульфіт може реагувати з аденіном і гуаніном, проте в інтервалі температур до 370 такі реакції не відбуваються. Реакції бісульфіта з урацилом і тиміном є нестабільними. Тому основна реакція бісульфіта – реакція дезамінування цитозина. Ця реакція проходить в три етапи (рис. 1.4.1.).        

Рис. 1.2. Дезамінування цитозину.

    Оптимальні умови цієї реакції – високі концентрації бісульфіта та рН 5-6. Утворення аддукта бісульфіт-цитозин (ІІ) при цих умовах проходить швидко, і швидкість реакції визначається другим етапом. При нейтральних рН швидкість реакції сильно падає і становить 1 % від максимальної [29].

    Перехід аддуктів урацил-бісульфіт в урацил при кислих і нейтральних рН проходить повільно, тоді як при лужному  складає декілька годин при рН 9 і декілька хвилин при рН 10. Важливою особливістю бісульфіта є його здатність з різною швидкістю реагувати з однонитковою і нативною ДНК.

    Реакція бісульфіта з ДНК в присутності амінів. В присутності значних кількостей амінів  реакція  бісульфіта з ДНК може піти  і по іншому шляху. В результаті цієї реакції утворюються зшивки нуклеїнових кислот з білком. Слід зазначити, що ця реакція, як і попередня реакція дезамінування, є специфічною для однониткової ДНК. Можливо, що в тих випадках, коли білки тісно зв’язані з ДНК, утворення ДНК-білок при дії бісульфіта все-таки  буде здійснюватись [29].

   Реакція бісульфіта і ДНК при низьких концентраціях бісульфіта. На відміну від описаних вище реакцій , які ефективно проходили при достатньо високих (більше 0,3 М) концентраціях бісульфіта, при низьких його концентраціях (не вище 0,01 М) основну роль відіграють реакції з вільними радикалами. При обробці ДНК 0,01 М розчином бісульфіта в присутності Mg2+ при кімнатній температурі і нейтральному рН нитки ДНК пошкоджувались, так що при подальшій обробці ДНК лугом приводила до появи розривів ниток.

   Таким чином можна стверджувати, що основним продуктом реакції бісульфіта і ДНК при кислих рН (рН 5-6) і достатньо високих концентраціях бісульфіта (більше 0,3 М) є дезамінований цитозин. Крім того , можливе утворення зшивок РНК-білок і ДНК-білок. При низьких концентраціях бісульфіта (не більше 0,01 М) і нейтральних рН дія бісульфіта на ДНК в основному визначається реакціями вільних радикалів [29].     

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1. Матеріали досліджень

   Матеріали  для  досліджень  служили водні  витяжки з породного відвалу центральної збагачувальної фабрики (ЦЗФ),  на якій збагачується вугілля з усіх шахт Червоноградського промислового району Львівської області.

2.2. Методи дослідження.

2.2.1. Метод домінантних летальних мутацій (ДЛМ) на Drosophila melanogaster

    Суть методу полягає у порівнянні частоти виникнення домінантних летальних мутацій ( ДЛМ ) в контролі і під дією досліджуваних речовин. Метод реєструє хромосомні аберації і мікроделеції.

    Для постановки однієї серії експерименту  відбиралось 120 віргінних самок і 90 самців   (їх обробляли речовиною, яку досліджували на мутагенність, в установці: 200 г банки з капроново-сітчастим дном поставлені на чашки Петрі з фільтрами змоченими досліджуваними пробами води). Для дослідів були використані самці, які перебували на затравці дві доби. Оброблених самців схрещували з інтактними  віргінними самками. Через добу запліднених самок в банках з капроновими сітками садили на зафарбоване агарове середовище на чашки Петрі для відкладання яєць. Середовище готували наступним чином: кип’ятили 30 г агару в 200 мл води з наступним додаванням 2,5 г активованого вугілля, після чого розливали в чашки Петрі товщиною 2-3 мм. Агарове середовище охолоджували при кімнатній температурі і покривали дріжджовою суспензією ( 8 г дріжджів на 20 мл води).

     Через кожні 5-6 годин, мух в досліді і контролі паралельно перекидали на нові чашки Петрі. В свіжих яйцекладках підраховували кількість відкладених яєць, а потім після 48 годин термостатування ( t =24˚С ) – кількість яєць, що не розвивалися (серед них розрізняють незапліднені (прозорі), яйця з ранньою (матові) та пізньою (з кольоровим відтінком) ембріональною загибеллю).

Частоту домінантних леталей підраховували в відсотках за формулою :

Частота ДЛМ = (Кількість яєць з ДЛМ ⁄ Кількість запліднених яєць) • 100 %

    Якщо частота ДЛМ в досліді перевищує спонтанний рівень менше ніж в 2 рази, то мутагенний ефект відсутній; перевищення в 2-3 рази – слабка мутагенна активність; більше ніж в 3 рази – активний мутагенний ефект.

    Статистичну обробку результатів проводили по критерію оцінки достовірності різниці між відсотковими характеристиками двох альтернативних сукупностей за коефіцієнтом Ст'юдента. Достовірною вважалася різниця при t ≥ 2,3.

2.2.2. Ана-телофазний  тест на клітинах кореневої меристеми Allium cepa L.

   Суть методу полягає у виявленні хромосомних аберацій, які виникають у меристем них клітинах корінців Allium cepa L. При пророщуванні на досліджуваних субстратах.

    Для одержання корінців, цибулини пророщують зануреними у воду 3 доби. Коли довжина корінців досягла 0,5-1 см, корінці зрізають і переносять у бюксики з фіксатором. Зрізання та фіксацію коренців проводили у вечірній час ( 18-19 год.), коли кількість мітотичних поділів для даного виду максимальна. Фіксація проводилась з метою припинення життєвих процесів в об’єкті зі збереженням незмінних тонких структур клітин і тканин. Кількість фіксатора має в 5-10 разів перевищувати кількість матеріалу. Період фіксації триває не менше 12 год. Для фіксації використовували фіксатор Кларка (етанол і льодяна оцтова кислота 3:1). Промивали у 96% спирті. На тривале зберігання переносили у 70% спирт.

    Виготовляли тимчасові давлені препарати корінців цибулі. Переносили корінці в склянку з водою, помішували, поки корінці не опустяться на дно (фіксатор в клітинах заміщувався на воду). Вийняли корінці і просушили фільтрувальним папером. Переносили в тигель і заливали фарбою (ацетоорсеїном). Доводили до кипіння шість разів протягом 20 хв з інтервалом 3-4 хв. Охолоджували під кришкою. Зафарбовані корінці використовували для виготовлення препаратів. Для цього на обезжирене предметне скло помістили зафарбований корінець. Відрізали і залишали меристему (2-3 мм). Решту корінців викинули, на відрізану частину капнули ацетоорсеїн. Зверху накрили покривним скельцем, на яке поклали фільтрувальний папір. Притримуючи покривне скельце, надавили тупим кінцем препарувальної голки так, щоб клітини розшарувалися в один шар. Розглядали препарати під мікроскопом.

    Клітини аналізували на стадії анафази, коли відстань між ділянками хромосом на полюсах більша від розмірів самих хромосом, а також на стадії ранньої телофази – на початку утворення фрагмопласту.

     Досліджували нативний (без розведення і концентрування) зразок води та розведений у 10 разів, контролем слугувала дистильована вода.

     Основними типами аберацій, які виявляються ана-телофазним методом є делеції і транслокації.

2.2.3.Тест Еймса.

Штами і середовища.

      В роботі використовували штами Salmonella typhimurium, характеристики яких наведені в таблиці 2.1.

Таблиця 2.1.

Штами S. typhimurium, які використовуються для виявлення мутагенності хімічних препаратів

Штам

Мутація в опероні

Тип мутації

Дефект полісахар. шару кліт. стінки

Дефект репарації

Наявність плазмід

ТА 98

his D3052

зсув рамки

rfa

uvrb

+

ТА 100

his G46

заміна пар основ

rfa

uvrb

+

     Штами ТА 98 і ТА 100 є похідними лабораторного штаму LT-2. Для підвищення чутливості до дії мутагенів в геном індикаторних бактерій були внесені додаткові мутації, які дозволили отримати штами, які в наш час широко використовуються. Делеція galbiouvrb охоплює біотиновий оперон, частину галактозного оперону  і ген uvrb. Останній дефект,  викликає порушення системи ексцизійної репарації, що ще більше підвищує чутливість тестерних ліній до дії ряду мутагенів. Мутація rfa збільшує проникність клітинної стінки внаслідок дефектів в полісахаридному шарі і робить штам непатогенним. Обидва штами несуть плазміду pKM101, наявність якої на кілька порядків збільшує їх чутливість до дії ряду речовин [Федоренко].

     Для постановки тесту Еймса за допомогою напівкількісного методу  з внесенням речовин в шар напіврідкого агару , в якості нижнього шару використовували мінімальне середовище (МС) такого складу :

  1.  водний агар: 20 г агару, вода дистильована ( до 1 л)
  2.  сольовий розчин : лимоннокислий натрій – 2 г, K2HPO4 x 3 H2O – 48 г, KH2 PO4 – 18г, (NH4)2SO4 – 4 г, вода дистильована – 1 л.

Компоненти (1) і (2) 0,8 атм 30 хв.

  1.  20% розчин глюкози 0,8 атм 30 хв.
  2.  1%  розчин MgSO4  (стерилізували 0,8 атм 30 хв ).

    Для приготування МС до 300 мл розплавленого водного агару додавали 100 мл сольового розчину, 10 мл розчину глюкози, 2 мл розчину MgSO4. У досліді використовували також напіврідкий мінімальний агар: NaCl – 6 г,агар – 7 г, вода дистильована – до 1 л. Стерилізували в автоклаві при 0,8 атм 30 хв. Для приготування напіврідкого агару додавали 10 мл 0,5 мМ розчину гістидину і 10 мл 0,25 мМ розчину біотину і заливали в стерильні пробірки по 2 мл.

    Для розведення суспензії клітини використовували стерильний фізіологічний розчин ( 0,9 % розчин NaCl ).

Визначення мутагенності зразків води за допомогою напівкількісного методу Еймса з внесенням зразку в шар напіврідкого агару

   В експерименті на мутагенну активність використовували “нічну” культуру S. typhimurium. Для отримання цих культур  штам пересіювали петлею на 10 мл МПБ (3г МПБ на 200 мл води) і інкубували без аерації 18 годин при 37˚С.

    Колби з 20 мл МПБ засівали 2 мл “нічної” культури і інкубували в умовах аерації при 37˚С.Потім біомасу переносили в стерильні центрифужні пробірки і двічі центрифугували 15 хв при 5 тис. об/хв.. Осад ре суспендували в стерильному фізіологічному розчині. Чашки Петрі заливали мінімальним агаром і витримували при кімнатній температурі протягом 1 години. Пробірки з напіврідким напівзбагаченим агаром плавили і поміщали в термостатну водяну баню з температурою 46 ˚С на 15-20 хв. Після цього в кожну пробірку додавали по 0,1 мл культури тест - штамів і по 0,2 мл досліджуваних зразків. Вміст пробірок швидко виливали на поверхню чашок з мінімальним агаром і швидко розподіляли тонким шаром. Чашки з двошаровим агаром витримували при кімнатній температурі 30 хв, після чого поміщали в термостат при 37˚С і інкубували дві доби. В якості контролю замість досліджуваних зразків в шар напіврідкого агару вносили 0,2 мл дистильованої води. Через дві доби підраховували число колоній his+  ревертантів на дослідних і контрольних чашках.

    Мутагенний ефект прийнято вважати встановленим в тому випадку, коли співвідношення кількості колоній-ревертантів в досліді  і контролі складає 2,5 і більше, при чому мутагенний ефект характеризується як слабкий при перевищенні кількості дослідних колоній над контрольними у 2,5-10 разів (1 бал), середній – у 10-100 разів (2 бали), сильний – у більше ніж 100 разів (3 бали) [Дуган А.М.,1990].

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Проведений аналіз мутагенної активності водних витяжок з порід відвалу ЦЗФ ЗАТ «Львівсистеменерго» за  допомогою тест-системи на дрозофілі, анателофазної тест-системи на клітинах кореневої меристеми Allium cepa L. і  мікробної  тест системи на Salmonella  typhimurium Результати аналізів наведені нижче.

Таблиця 3.1

Індукція домінантних летальних мутацій у D. melanogaster

при дослідженні водної витяжки з відвалу чорної породи

№ п/п

Досліджуваний зразок

Кількість відкладених яєць

Відсоток незапліднених яєць, %

Відсоток яєць з ранніми ДЛМ, %

Відсоток яєць з пізніми ДЛМ, %

Коефіцієнт Стьюдента, t

Частота ДЛМ,%

1.

Водна витяжка з чорної породи

1056

8,24±1,13

4,26±0,98

2,75±0,59

1,14

7,6±1,30

2.

Контроль

1043

3,07±0,74

0,67±0,35

0,19±0,12

0,82±0,07

    Частота домінантних летальних мутацій у D. melanogaster при обробці досліджуваним зразком водної витяжки з чорної породи становила 7,6±1,30%, що майже у 10 разів перевищує показники контролю (табл. 3.1). Дані результати свідчать про середній рівень мутагенної активності досліджуваного зразка. Отже, досліджуваний зразок містить хімреагенти, які здатні викликати анеуплодії за аутосомами, асиметричні транслокації, великі делеції і втрати цілих хромосом.

Таблиця 3.2

Індукція домінантних летальних мутацій у D. melanogaster

при дослідженні  водної витяжки з відвалу червоної породи

№ п/п

Досліджуваний зразок

Кількість відкладених яєць

Відсоток незапліднених яєць, %

Відсоток яєць з ранніми ДЛМ, %

Відсоток яєць з пізніми ДЛМ, %

Коефіцієнт Стьюдента, t

Частота ДЛМ,%

1.

Водна витяжка з червоної породи

1011

9,20±2,03

3,56±1,36

1,78±

0,45

2,10

5,9±0,96

2.

Контроль

1043

3,07±0,74

0,67±0,35

0,19±

0,12

0,82±0,07

   Водна витяжка з червоної породи виявила мутагенний ефект слабкої сили у тесті на індукцію домінантних леталей у D. Melanogaster. Частота ДЛМ у досліді становила 5,9±0,96 (табл. 3.2); спостерігалося значне підвищення частоти появи незаплідних яєць (9,20±2,03), у порівнянні з контролем (3,07±0,74).

Таблиця 3.3

Рівень хромосомних аберацій, індукованих зразком води зі ставу

Зразок

Всього ана-телофаз

Кількість аномальних ана-телофаз

M±m

t

p

Абсолютна кількість

___

||

[

[]

інші

Водна витяжка з червоної породи

317

18

7

5

6

-

-

3,6±0,89

1,95

>0,999

Водна витяжка з чорної породи

311

17

8

6

3

-

-

3,4±0,45

2,26

0,945

Контроль

327

2

1

1

-

-

0,4±0,22

--- - одинарний фрагмент                         [ - одинарний (хроматидний) міст

 || - подвійний фрагмент                         [] - подвійний (хроматидний) міст

    Під час  ана-телофазного аналізу на тест-об’єкті A. сepa виявлено різні типи порушень в правильному розходженні хромосом до полюсів веретена поділу (відставання хромосом, утворення одинарних та парних фрагментів та мостів, тощо), що може бути викликано делеціями та транслокаціями хромосом. Відсоток аномальних ана-телофаз в меристемах корінців в досліджуваному зразку червоної породи 3,6±0,89; в зразку чорної породи 3,4±0,45 (табл. 3.4).

Таблиця 3.6

Визначення мутагенної активності водних зразків з відвалу на штамі ТА 98 

S. typhimurium

Зразки

Концентрація,

г/мл

Хс

 

Xд/Xк

Мутагенність, бали

Х1

Х2

Х3

Водна витяжка з червоної породи

1:10

11

17

19

15,6

6,8

1

Водна витяжка з чорної породи

1:10

12

12

13

12,3

5,4

1

Контроль, Хк

2

2

3

2,3

   Дослідження на штамі ТА98 показали, що компоненти водної витяжки з відвалу чорної породи здатні викликати реверсії до прототрофності шляхом виникнення мутацій типу зсуву рамки зчитування. Про це свідчить перевищення кількості колоній-ревертантів  у досліді порівняно з контролем у 5,4 рази (табл. 3.6). Відношення показників досліду до контролю для водної витяжки з червоної породи було дещо вищим і становило 6,8.  

Таблиця 3.7

Визначення мутагенної активності водних зразків з відвалу на штамі ТА 100 

S. typhimurium

Зразки

Концентрація,

г/мл

Хс

Xд/Xк

 Мутагенність,  бали

Х1

Х2

Х3

Водна витяжка з червоної породи

1:10

27

31

23

27,0

2,6

1

Водна витяжка з чорної породи

1:10

24

23

20

22,3

2,2

0

Контроль Хк

12

9

10

10,3

    Перевищення контрольних показників дослідними при визначенні мутагенної активності червоної та чорної порід  на штамі ТА100, становило 2,6 і 2,2, відповідно (3.7), а отже, сполуки, що входять до складу червоної породи є слабкими мутагенами і здатні викликати появу ревертантів S. typhimurium за рахунок виникнення мутацій типу заміни пар основ.

ВИСНОВКИ

Виявлено середній рівень мутагенної активності водної витяжки з червоної  породи відвалу ЦЗФ при дослідженні у тесті на індукцію ДЛМ у D. Melanogaster (частота ДЛМ становила 7,6±1,30). Це свідчить про те, що досліджуваний зразок містить хімреагенти, які здатні викликати делеційні втрати хромосом і генні домінантні леталі. Для чорної породи встановлено низький рівень мутагенної активності .

Виявлено різні типи порушень у розходженні хромосом в меристемних клітинах               A. cepa при дослідженні зразків з відвалу. Середня кількість аномальних ана-телофаз для обох зразків перебувала на однаковому рівні (3,6±0,89 для червоної породи та 3,4±0,45для чорної), що приблизно у 9 разів перевищує показники контролю. Найчастіше зустрічалися делеційні фрагменти та одинарні і хроматидні мости.

У тесті Еймса на S. typhimurium зафіксовано мутагенний ефект слабкої сили для водної витяжки з червоної породи на штамах ТА100 і ТА 98. Компоненти чорної породи проявили генотоксичний вплив на штамі ТА98, що свідчить про здатність викликати генні мутації типу зсуву рамки зчитування.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

  1.  Бариляк І.Р., Сердюк А.М., Стемпурський Ю.М. Захист генофонду населення  України // Цитологія і генетика. – 1993. – Т. 27,  № 4. – С. 3-9.
  2.  Сердюк А.М., Янышева Н.Я., Черниченко И.А., Баленко Н.В. Закономерности модифицирующего влияния химических факторов окружающей среды на канцерогенез // Довкілля та здоров’я. – 1997. – №2. – С. 18-22
  3.  Горовая А.И., Бобырь Л.Ф., Скворцова Т.В., Дигурко В.М., Климкина И.И. Методологические аспекти оценки мутагенного фона и генетического риска для человека и биоты от действия мутагенних екологических факторов // Цитология и генетика. – 1996. – Т. 30, №6. – С. 78-86.
  4.  Баранов В.І., Книш І.Б.. Хіміко-мінералогічний склад порід  відвалу вугільних шахт ЦЗФ    “ Львівсистеменерго” та їх вплив на проростання насіння // Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку. Матеріали V міжнар. наук. конф. – Донецьк, 2007. – С. 36.

5. Бобровник Д.П., Болдирєв Т.О., Іщенко А.М. та інші. Львівсько - Волинський
     кам'яновугільний басейн. – К.: Вид. АН УРСР, 1962. – 145 с.

6. Екологія з елементами біології / За ред. Назарука М.М., Магури Н.Л. Львів: ЛОНМІО, 1995. – 158с.

7.  Екологія Львівщини 2005. – Львів.: Сполом, 2006. – С. 119.

     8.  ГОСТ 17.4.4.02-84. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа.

9. Ковальчук Л.Є., Нейко Є.М., Братівник Л.І. Комплексна оцінка мутагенних наслідків антропогенного забруднення довкілля і принципи їх профілактики // Цитологія і генетика. – 1996. – Т. 30, №5. – С. 60-65.

  10. Определение содержания тяжелых металлов в пробах почвы. Сб.: Методические указания по определению тяжелых металлов в почвах сельхозугодий и продукции растениеводства: издание 2-е, переработанное и дополненное. М., 1992. 32 с.

11. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. Наслественность человека и мутагены внешней среды. – М.: Медицина, 1989.272 с.

12. Сидоренко Г. И., Ицкова И. Никель.— М.: Медицина, 1980—171 с.

              13. Замокав И. Е., Синьков В. И., Захарова Я. Л. Закономерности накооления и     рапределения трехвалентного Сг в организме крыс // Гигиена и санитария.—1986.—№ 3.— С. 81—83.

14.  Ермаченко А. Б, Гигненическая оценка распределения и накоплекия ртути в организме животїшх при хроническом посту плении из различнмх сред // Гигиена и санитария,— 1987.-1* 6.—С. 72—73.

15. Recommended health-based limits in occupational exposure to heavy metals.-Gneva: WHO, 1980.—205 p.

16. Трахтенберг Н. М., Иванова Л. А Современные представления о воздействии ртути на клеточные мембраны // Гигиена и санитария.—1984.—№ 5.—С. 59—63.

17. Вийтак А. А., Хедреярв X. X. К вопросу об определении свинца  крови // Гигиена труда и проф. патологи в Эстонской ССР.—1984—Вып. 11—С. 17—19.

18. Кristenson Р., Еіlеrsten E., Еіnaisdottir Е., Наugen F. Fertility in mісе after prenatal  ехроsurе to benzо[а]руrеnе аnd  inrganic Іеаd // Env. Неаlth Регsp.—1995—103, N 6. — Р. 588—592.

19. Environmetal health criteria.—Gепеуа: WHO,  1991.—V. 108.—383 р.

20. Rossner Р., Вепсkо V., Srат R. Сочетанное действие хрома и никеля на клеточные культуры фибробластов мышей и крыс // Журн. гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии—1981.—25, № З—С. 224—229.

21. Bucio L., Souza V., Albons A., Serra A. Cadmium and mercury  toxicology  in a human  fetal hepatic cell line // Toxicology. – 1995. – 102. N 3.  – P. 285 – 299.

22. Фоменко В. Н.. Глущенко В. И., Катосова Л. Д., Павленко Г. И. К вопросу о мутагенности и гонадотропном действии свинца // Гигиена труда и проф. заболевания.— 1982.—№ 10.—С. 38—41.

23.  Дурнев А. Д.,  Середенин С. Б. Мутагены скрининг и фармакологическая профилактика воздействий). – М.: Медецина, 1998. –328 с.: ил.—ISBN 5-252-04429-8

24. Джохадзе Т. А, Лежава Т. А Изучение структурных мутаций хромосом, имдуцированых солями тяжелых металлов, при старений іп vivo и іп vitro II Генетика.— 1994 —30. № 12.—С. 1630—1632.

25. Рупошев А Р. Мутагеннoе действие ионов тяжелых металлов и модификация йми цитогенетического эффекта этиленимина: Автореф. дис. ... канд. биол. наук —М., 1986.— 25 с.

26. Сьяксте Т. Г., Сьяксте Н. И. Химические соединения, повреждающие ДНК.—Рига: Зинатне, 1991.—152 с

27. Ильинских Н. Н., Медведеев М. А, Бессуднова С. С, Ильинскых И. Я. Мутагенез при различных функциональкмх состояниях организма.—Томск. 1990.—228 с.

28. Котеров А. Н., Конь И. Я. Антиоксидантний эффект металлотионеинов при острой интоксикации бромбензолом у мышей // Укр. бюхім. журн.—1995.—67, № 5.—С. 99— 104.

                29. Барыляк И.Р., Бужиевская Т.И., Быкорез А.И. и др. Генетические последствия загрязнения окружающей среды. – Киев.: Наукова думка, 1989. – 232 с.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

81801. Традиционность науки и виды научных традиций. Традиции и новации 29.55 KB
  Традиции и новации. Кун впервые рассмотрел традиции как основной конституирующий фактор развития науки. Он обосновал казалось бы противоречивый феномен: традиции являются условием возможности научного развития. традиции.
81802. Традиции и революции в науке. Научные революции как пререстройка оснований науки 30.76 KB
  Научные революции как пререстройка оснований науки. Этапы развития науки связанные с перестройкой исследовательских стратегий задаваемых основаниями науки см. Перестройка оснований науки сопровождающаяся научными революциями может явиться вопервых результатом внутридисциплинарного развития в ходе которого возникают проблемы неразрешимые в рамках данной научной дисциплины. В зависимости от того какой компонент основания науки перестраивается различают две разновидности научной революции: а идеалы и нормы научного исследования...
81803. Глобальные научные революции, их социокультурные предпосылки 33.12 KB
  Так создание механической картины мира сопровождалось борьбой двух научно-исследовательских программ – ньютоновской и картезианской. Сущностные основания регулярного воспроизводства такой фазы развития науки как революция следующие при этом каждое последующее основание вытекает из предыдущего..
81804. Первая научная революция и формирование научного типа рациональности 29.03 KB
  В ходе этой революции сформировался особый тип рациональности получивший название научного. Научный тип рациональности радикально отличаясь от античного тем не менее воспроизвел правда в измененном виде два главных основания античной рациональности: вопервых принцип тождества мышления и бытия вовторых идеальный план работы мысли. Тип рациональности сложившийся в науке невозможно реконструировать не учитывая тех изменений которые произошли в философском понимании тождества мышления и бытия.
81805. Смена типов научной рациональности 41.37 KB
  С научной картиной мира связывают широкую панораму знаний о природе включающую в себя наиболее важные теории гипотезы и факты. Структура научной картины мира предлагает центральное теоретическое ядро фундаментальные допущения и частные теоретические модели которые постоянно достраиваются. Когда речь идет о физической реальности то к сверхустойчивым элементам любой картины мира относят принципы сохранения энергии постоянного роста энтропии фундаментальные физические константы характеризующие основные свойства универсума: пространство...
81807. Главные характеристики современной, постнеклассической науки 33.24 KB
  В ходе развития науки в последней трети XX в. Ее фундамент составляют ставшие общенаучными принципы развития и системности. Такое понимание процессов развития исходит из синергетики. Вопервых принцип развития эволюции в современной науке получил статус фундаментальной мировоззренческой и методологической константы.
81808. Новые стратегии научного поиска. Глобальный эволюционизм и современная научная картина мира 33.72 KB
  Концепция глобального эволюционизма оформилась в 80е гг. Наряду со стремлением к объединению представлений о живой и неживой природе социальной жизни и технике одной из целей глобального эволюционизма явилось стремление интегрировать естественнонаучное обществоведческое гуманитарное а также техническое знание. В этом своем качестве концепция глобального эволюционизма претендует на создание нового типа целостного знания сочетающего в себе научнометодологические и философские основания. Обоснованию глобального эволюционизма...
81809. Этические проблемы науки XXI века. Проблемы гуманитарного контроля в науке и высоких технологиях. Экологическая этика 29.07 KB
  Проблемы гуманитарного контроля в науке и высоких технологиях. Этические проблемы в области биоэтики оформились как чрезвычайно острые требуюшие своего неотлагательного решения и реакции общества. Проблемы биоэтики возникли на стыке биологии и медицины.