46195

МОДЕЛИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Реферат

Биология и генетика

Настоящее учебное пособие содержит общие сведения о классификации моделей и подходов к математическому описанию процессов клеточного роста и образования клетками продуктов метаболизма; о применении их при планировании экспериментов, статистической обработке полученных результатов и оптимизации биотехнологических процессов. Удобно для использования при выполнении практических заданий, решении задач, планировании и обработке результатов научно-исследовательских и лабораторных работ по спецдисциплинам, при подготовке коллоквиумов, отчетов по лабораторным и научно-исследовательским практикумам, при выполнении курсовых и дипломных работ

Русский

2013-11-19

10.84 MB

163 чел.

Министерство образования и науки РФ

Бийский технологический институт (филиал)

государственного образовательного учреждения

высшего профессионального образования

«Алтайский государственный технический университет

им. И.И. Ползунова»

М.Э. Ламберова, Е.А. Скиба

МОДЕЛИРОВАНИЕ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Допущено научно-методическим советом БТИ АлтГТУ
для внутривузовского использования в качестве
учебного пособия
 для выполнения

практических заданий, лабораторного
и научно-исследовательского практикума

для студентов всех форм обучения

специальностей 240901 «Биотехнология»
и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие»

Бийск

Издательство Алтайского государственного технического
университета им. И.И. Ползунова

2011

УДК 577:663.1(075.8)

Л21

Рецензенты:

Е.Н. Широкова, к.т.н., завкафедрой перерабатывающей промышленности лицея 22;

Е.Ю. Егорова, к.с-х.н., доцент кафедры ОХЭТ
БТИ АлтГТУ.

    

Работа подготовлена на кафедре «Биотехнология».

Ламберова, М.Э. 

 Л21

 

Моделирование биотехнологических процессов: учебное пособие для выполнения практических заданий, лабораторного и научно-исследовательского практикума для студентов всех форм обучения специальностей 240901 «Биотехнология» и 260204 «Технология бродильных производств и виноделие» / М.Э. Ламберова, Е.А. Скиба; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. – Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2011. – 114 с.

Настоящее учебное пособие содержит общие сведения о классификации моделей и подходов к математическому описанию процессов клеточного роста и образования клетками продуктов метаболизма; о применении их при планировании экспериментов, статистической обработке полученных результатов и оптимизации биотехнологических процессов.

Удобно для использования при выполнении практических заданий, решении задач, планировании и обработке результатов научно-исследовательских и лабораторных работ по спецдисциплинам, при подготовке коллоквиумов, отчетов по лабораторным и научно-исследовательским практикумам, при выполнении курсовых и дипломных работ.

УДК 577:663.1(075.8)

Рассмотрено и одобрено на заседании научно-методического совета Бийского технологического института.

Протокол № 7 от 01.07.2010 г.

© Ламберова М.Э., Скиба Е.А., 2011

© БТИ АлтГТУ, 2011

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….........

5

1 МОДЕЛИРУЕМЫЙ ОБЪЕКТ – КЛЕТОЧНАЯ

ПОПУЛЯЦИЯ…………….....................................................................

6

1.1

Фазы развития клеточных культур…………………............

6

1.2

Общие принципы моделирования популяции

микроорганизмов……………………….................................

8

1.3

Способы описания кинетики роста популяции

микроорганизмов………………………………………….…

10

1.4

Способы культивирования микроорганизмов….……….…

12

1.4.1

Периодические способы культивирования…….…

14

1.4.2

Промежуточные способы культивирования……...

14

1.4.3

Непрерывные способы культивирования ...............

15

1.5

Идеальные реакторы для изучения кинетики

клеточного роста.....................................................................

18

1.5.1

Идеальный реактор периодического действия…...

18

1.5.2

Идеальный проточный реактор с полным

перемешиванием……………………………………

19

2 ЭКСПОНЕНЦИАЛЬНАЯ ФАЗА РОСТА КЛЕТОЧНЫХ
КУЛЬТУР……………………………………………..……………....

22

2.1

Кинетика сбалансированного роста…..…………………...

22

2.2

Уравнение Моно для кинетики клеточного роста………..

23

2.3

Зависимость клеточного роста от скорости разведения….

25

2.4

Графическое определение параметров роста клеточной культуры……………………………………………………...

28

3 ИНГИБИРОВАНИЕ И АКТИВАЦИЯ КЛЕТОЧНОГО

РОСТА…………………………………..……………………………...

32

3.1

Графический способ определения типа

ингибирования…………..…………………………….………

32

3.2

Влияние эндогенного метаболизма и метаболизма

поддержания на кинетику клеточного роста…………..…...

35

3.3

Другие уравнения кинетики клеточного роста…………….

37

3.4

Зависимость удельной скорости роста от концентрации одного продукта метаболизма…………………………..…...

39

3.5

Многофакторные зависимости………………………………

40

3.6

Влияние других параметров на кинетику

клеточного роста………………………………………….…

41

4 КИНЕТИКА КЛЕТОЧНОГО РОСТА В ПЕРЕХОДНОМ

СОСТОЯНИИ ……………………..…………………………………..

45

4.1

Лаг-фаза…………..…………………………….……………

45

4.2

Экспоненциальная фаза роста в реакторе

периодического действия……………………..…………...…

48

4.3

Стационарная фаза……………………………………..…….

49

4.4

Фаза отмирания…………………………………………..…...

51

5 КИНЕТИКА ТЕПЛОВОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК И СПОР………......

54

5.1

Факторы, влияющие на гибель клеток и спор…………..….

54

5.2

Критерий стерилизации…………………………………..….

59

6 НЕСТРУКТУРИРОВАННЫЕ МОДЕЛИ КЛЕТОЧНОГО

РОСТА В ПЕРИОДИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ…………………...…...

62

6.1

Построение логистической кривой…………………….…...

62

6.2

Рост филаментозных организмов……………………….…..

65

7 СТРУКТУРИРОВАННЫЕ МОДЕЛИ КИНЕТИКИ

КЛЕТОЧНОГО РОСТА……………………………………………..….

68

7.1

Общие принципы построения………………………….……

68

7.2

Компартментальные модели…………………………….….

69

7.3

Метаболические  модели………………………………….…

74

8 ОПТИМИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОГО РОСТА………………………....

82

8.1

Моделирование клеточного роста как оптимального
процесса……………………………………………………....

82

9 КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ ПОПУЛЯЦИЯМИ КЛЕТОК
ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА……………………………………...

85

9.1

Неструктурированные модели кинетики образования
продуктов метаболизма……………………………………...

85

9.2

Химически структурированные модели кинетики

образования продуктов жизнедеятельности клеток……..…

91

9.3

Генетически структурированные модели кинетики

образования продуктов жизнедеятельности клеток……..…

96

9.4

Кинетика образования продуктов метаболизма 

филаментозными организмами…………………………..…

101

10 СЕГРЕГИРОВАННЫЕ МОДЕЛИ КИНЕТИКИ КЛЕТОЧНОГО РОСТА И ОБРАЗОВАНИЯ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА……....

109

ЛИТЕРАТУРА……………………………………………..……….…..

113

ВВЕДЕНИЕ

Моделирование различных процессов давно применяется в различных отраслях науки, техники и технологии. Одной из первых моделей развития популяции можно считать модель развития поголовья кроликов, описанную в 1202 г. в «Трактате о счёте» Фибоначчи. Эта модель дискретная, т.е. фиксирующая значение моделируемой функции через определённые дискреты – интервалы.

В общем случае все математические выражения, описывающие взаимосвязь между параметрами можно считать моделями тех или иных процессов. Модель – это компактно организованная информация, позволяющая восстановить или спрогнозировать значение функции по известным значениям аргумента. Это свойство привлекает внимание исследователей. Помимо чисто утилитарных вопросов прогнозирования, математическая модель может служить инструментом назначения в исследовательской практике.

Математическая модель позволяет быстро проигрывать различные варианты воздействия факторов на моделируемую систему и спрогнозировать её поведение. Хорошо проработанная модель, адекватно описывающая поведение моделируемого объекта, может оказать неоценимую помощь в выработке стратегии поиска и получения результата исследовательских работ с наименьшими потерями времени.

Построение математической модели требует знания некоторого набора параметров системы, которые могут быть определены из наблюдения или эксперимента. Работа с моделью требует систематизации, а часто и применения новых методик, и постановки экспериментов. Весь процесс моделирования, от построения модели до проверки предсказанных с её помощью результатов, должен быть связан с тщательно отработанной стратегией исследования и строгой проверкой используемых экспериментальных данных.


1 МОДЕЛИРУЕМЫЙ ОБЪЕКТ – КЛЕТОЧНАЯ ПОПУЛЯЦИЯ

1.1 Фазы развития клеточных культур

Если небольшое количество живых клеток поместить в раствор, содержащий все необходимые питательные вещества, то при определённой температуре и рН клетки будут расти.

Для использования микроорганизмов в производстве необходимо всестороннее изучение их свойств, в том числе закономерностей роста и развития.

Культура клеток представляет собой популяцию генотипически однородных клеток, которые функционируют и делятся in vitro. Культуры клеток, полученные путём целенаправленных или случайных мутаций, называются клеточными линиями.

Под ростом понимают увеличение биомассы микроорганизмов за счет усвоенных ими питательных веществ среды, а под развитием – изменение морфологических и физиологических свойств в процессе жизненного цикла (например, у мицелиальных грибов увеличивается длина и число гиф мицелия).

Обычно микроорганизмы размножаются почкованием или простым делением и очень редко при большом дефиците питательных веществ и других неблагоприятных факторах – спорообразованием.

Рост клеточных культур in vitro имеет сложный характер (рисунок 1). В целом можно выделить следующие фазы.

1) Индукционный период (лаг-фаза). В течение лаг-фазы не происходит сколько-нибудь заметного увеличения числа клеток или образования продуктов. Данная фаза обычно наблюдается после пересева клеточной культуры. В ней происходит адаптация микробных клеток к новой культуральной среде, перестраивается метаболизм микробной клетки.

2) Фаза экспоненциального роста. Характеризуется максимальной для данной культуры скоростью размножения и быстрым образованием продуктов жизнедеятельности. В данной фазе наиболее часто встречаются митозы по сравнению с остальными фазами роста клеточной культуры. Большинство клеток в этой фазе физиологически молодые и биологически активные.

В замкнутой культуре фаза экспоненциального роста не может продолжаться бесконечно долго. Она переходит в фазу линейного
роста.

3) Фаза линейного роста характеризуется уменьшением числа митозов. В этой фазе наблюдается линейное увеличение числа микробных клеток в зависимости от времени культивирования.

1 – индукционный период; 2 – фаза экспоненциального роста;
3 – фаза линейного роста; 4 – фаза замедленного роста;
5 – стационарная фаза; 6 – фаза отмирания культуры

Рисунок 1 – Типичная кинетическая кривая роста
клеточной культуры

  1.  Фаза замедленного роста. В этой фазе уменьшается рост клеточной культуры за счёт уменьшения числа митозов. Это объясняется тем, что через несколько часов после начала логарифмической фазы роста в питательной среде создаются неблагоприятные условия для размножения микроорганизмов: уменьшается концентрация питательных веществ, изменяется рН, часть клеток переходит в состояние покоя и гибнет вследствие различных причин. Интенсивность деления клеток уменьшается, а гибель клеток учащается, рост числа живых клеток происходит все медленнее.

5) Стационарная фаза. Наблюдается вслед за фазой замедленного роста. Абсолютное число клеток в популяции перестает увеличиваться, хотя многие из них находятся в стадии активного деления. Число делящихся клеток равно числу умирающих.

Число клеток в единице объема в стационарной фазе максимальное, их размеры близки к размерам клеток в исходном материале. Это максимальное значение числа клеток является важным признаком каждого вида микроорганизмов и зависит от внешних условий.

  1.  Фаза отмирания культуры, в которой преобладают процессы гибели клеток и практически не наблюдаются митотические деления. Из-за начавшегося автолиза уменьшается и суммарная биомасса культуры. Отмечаются морфологические и физиологические изменения, появляются инволюционные (необычные) формы клеток. Фаза отмирания противоположна экспоненциальной фазе.

Таким образом, на различных стадиях развития культур микроорганизмов изменяется скорость роста клеток, модифицируется их физиологическая активность. Молодые клетки потребляют питательные вещества и образуют продукты обмена гораздо быстрее, чем клетки, рост которых начал замедляться, а также легче синтезируют адаптивные ферменты. В то же время обладают меньшей устойчивостью к неблагоприятным внешним факторам (повышенной температуре, осмотическому давлению, ядовитым веществам и др.).

В процессе роста культуры происходят также изменения ферментного аппарата клеток. В связи с этим одни биохимические свойства клеток проявляются в период быстрого роста, другие – в период отмирания.

Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 6 наблюдаются в значительной  степени за счёт истощения субстратов, необходимых для роста популяции клеток, или же за счёт накопления токсичных продуктов их жизнедеятельности.

1.2 Общие принципы моделирования популяции

микроорганизмов

С клеточным ростом связано два процесса:

1) поглощение клеткой питательных веществ из окружающей среды;

2) выделение конечных продуктов метаболизма клетки в среду.

Метаболизм – это совокупность биохимических реакций в клетке (обмен веществ).

Эти процессы осуществляются с разной скоростью в различных биологических объектах. При этом есть несколько типичных путей утилизации субстрата и образования продуктов жизнедеятельности.

Точность математического описания кинетических свойств системы зависит от её сложности.

Начнем с самого сложного случая – с анализа растущей популяции клеток в самом общем виде (рисунок 2). Затем рассмотрим, какие можно допустить упрощения.

Прежде всего, необходимо учитывать, что есть две взаимодействующие системы: биологическая фаза, состоящая из популяции, и фаза, окружающая популяцию, – среда.

Клетки выделяют тепло, а температура среды определяет температуру клеток. В результате накопления клеточной массы и продуктов метаболизма изменяется вязкость среды, в свою очередь среда оказывает механическое воздействие на клетки посредством гидростатического давления.

Характеристики среды:

  1.  Многокомпонентность среды,  обусловленная тем, что среда состоит из различных питательных веществ; по мере роста клеток накапливаются продукты метаболизма, следовательно, изменяются температура, рН, ионная сила, реологические свойства.
  2.  Многофазность – может состоять из газа и жидкости, или из двух несмешивающихся жидкостей, или из газа и двух несмешивающихся жидкостей.

Среда (окружение)

Популяция клеток

  •  многокомпонентность
  •  реакции в растворе

  •  кислотно-основное

равновесие

  •  изменение рН, температуры и других параметров

  •  изменение реологических свойств (вязкость и др.)

  •  многофазность (гж, жж,  

   гжж)

  •  объёмная неоднородность

  •  многокомпонентность
  •  гетерогенность

   популяции клеток

  •  множественность реакций

  •  системы внутренней регуляции

  •  способность к

   адаптации

  •  стохастические

   факторы

  •  генетические

изменения

Рисунок 2 – Некоторые из основных параметров, явлений
и взаимодействий, определяющих кинетику
роста популяции клеток

Характеристики популяции:

  1.  каждая клетка не однородна на клеточном уровне;
    1.   в зависимости от условий изменяется тип химических реакций;
      1.  клетки внутри популяции отличаются по возрасту;
      2.  в процессе жизнедеятельности клетки могут мутировать.

Для описания микробиологических процессов специфичными являются уравнения кинетики роста, образования продуктов метаболизма, потребления субстратов, а также кинетики автолиза биомассы и инактивации продуктов метаболизма. Эти процессы происходят на фоне сопутствующих процессов массообмена, теплообмена, материального и теплового баланса.

1.3 Способы описания кинетики роста популяции

микроорганизмов

Поскольку невозможно создать кинетическую модель, которая учитывала бы все параметры и факторы, то используют ряд приближений, позволяющих упростить задачу.

1) Допускают, что за исключением одного компонента среды, остальные присутствуют в высоких концентрациях и их изменения не отражаются на общих скоростях процессов. Компонент, который находится в недостатке, называют лимитирующим (ограничивающим) клеточный рост. При анализе влияния состава среды на кинетику роста клеток учитывают концентрацию только этого компонента.

2) Допускают, что системы контроля и регулирования биореакторов могут поддерживать на постоянном уровне ряд параметров среды (рН, температуру, концентрацию кислорода).

Основные приближения и способы описания, используемые при математическом анализе клеточной фазы представлены на рисунке 3.

Подходы к анализу микробиологических систем классифицируются в соответствии с числом компонентов, используемых при описании клеток, а также в зависимости от того, рассматриваются ли клетки как гетерогенная популяция различных объектов или как популяция некоторых усредненных клеток (т.е. клетки не отличаются от какого-либо компонента раствора).

Многокомпонентные модели клеток называют структурированными, а однокомпонентные – неструктурированными. Описание популяций клеток с учётом их гетерогенности называют сегрегированным подходом, а в несегрегированном рассматривают только усреднённые свойства клеток.

Реальная ситуация отвечает структурированной сегрегированной системе. Такие модели описываются стохастическими вероятностными уравнениями.

Если гетерогенность клеток не влияет в существенной степени на кинетику исследуемых процессов, то можно принять приближение «усредненной» клетки. В так называемом состоянии «сбалансированного роста» средний состав клеток постоянен. Поэтому допустимо не учитывать многокомпонентную природу клеток.

Неструктурированный

Структурированный

Несегрегированный

Популяция клеток рассматривается как однокомпонентное растворенное

вещество

Многокомпонентное описание усредненной клетки

Сегрегированный

Однокомпонентное описание,

индивидуальные

клетки гетерогенны

Многокомпонентное описание,

индивидуальные

клетки гетерогенны

Рисунок 3 – Способы описания кинетики роста популяции клеток

Существующие в настоящее время математические модели биологических процессов можно разбить на три класса.

1) Описательные модели, в которых регрессионные и другие эмпирически установленные количественные зависимости не претендуют на раскрытие механизма процесса.

2) Качественные модели, которые строятся с целью выяснения динамического механизма изучаемого процесса. Это детерминированная модель.

3) Имитационные модели конкретных сложных живых систем,  учитывающие всю имеющуюся информацию об объектах. Цель пост-роения таких моделей – детальное прогнозирование поведения сложных систем или решение практических оптимизационных задач.

Приступая к построению математической модели системы, необходимо определить вид системы, сформулировать основные вопросы о поведении системы, отобрать наиболее важные законы её функционирования. Также необходимо сформулировать гипотезы, проверка которых будет производиться при исследовании адекватности.

Критерием адекватности всегда служит практика, поэтому полностью формализовать этот критерий невозможно.

Словарь

Детерминированная система – внешние воздействия и внутренние возмущения носят закономерный характер, а реакция объекта предсказуема.

Стохастическая система – возмущения носят случайный характер, а реакция объекта непредсказуема.

1.4 Способы культивирования микроорганизмов

Ферментация (культивирование) – это вся совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную питательную среду посевного материала (инокулята) до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпания питательных веществ среды.

Известно множество процессов культивирования микроорганизмов. Они различаются:

–  по содержанию кислорода – на аэробные и анаэробные;

– по количеству ферментеров – на одно-, двух- и многостадийные;

– по наличию или отсутствию перемешивания – на динамические и статические;

– по состоянию питательной среды – на поверхностные и глубинные.

При поверхностном культивировании посевной материал высевают на поверхность питательной среды, распределенной небольшим слоем (около 2 см) в металлических кюветах.

При глубинном культивировании клетки находятся в толще питательной среды. Глубинный способ является более выгодным для промышленности по сравнению с поверхностным способом, так как позволяет осуществлять полную механизацию и автоматизацию процесса, избегать инфицирования посторонней микрофлорой.

Классификация процессов культивирования микроорганизмов по способу действия (периодический, непрерывный и промежуточные) представлена на рисунке 4.

1.4.1 Периодические способы культивирования

При периодическом способе культивирования стерильная питательная среда засевается исходной культурой продуцента, и далее в этой же емкости микроорганизмы при определенных условиях проходят через все стадии роста и развития популяции (кривые роста культуры мы рассмотрели ранее в п. 1.2). Когда процесс культивирования заканчивается, емкость для выращивания освобождают, и цикл возобновляется, начиная от засева питательной среды исходной культурой продуцента. При таком способе культивирования (его можно назвать «закрытой» системой, когда хотя бы один из компонентов не может поступать в нее или выводиться из нее) скорость роста биомассы всегда должна стремиться к нулю либо из-за недостатка питательных веществ, либо из-за накопления в среде токсических метаболитов.

Ранее применялось культивирование на поверхности плотных питательных сред в пробирках, колбах, матрасах, бутылях. Выращиваемая в этих условиях культура гетерогенна (разнородна) в физиологическом отношении, так как клетки на различных участках поверхности и в разных слоях находятся в различных условиях и развиваются неодинаково. Этот способ иногда применяется для наращивания биомассы.

В настоящее время в промышленности используют жидкие питательные среды, применение которых позволило избежать недостатков плотных питательных сред и увеличило выход процесса за счет использования больших емкостей для культивирования (ферментеров). Применение жидких питательных сред потребовало перемешивания культуры с целью выравнивания условий роста микроорганизмов в разных частях рабочего сосуда и аэрирования (насыщения кислородом). Для этого используются мешалки, качалки, бутыли с барботажем газа.

Периодические системы широко применяются в промышленности. Они отличаются гибкостью и позволяют получать разнообразные продукты синтеза: от пива до антибиотиков.

С технологической точки зрения, периодический метод имеет некоторые недостатки: циклический ход операций, сменные технологические режимы, сложность контроля и регуляции процесса.

1.4.2 Промежуточные способы культивирования

Продленный периодический процесс, как и периодический, предусматривает одноразовую загрузку и разгрузку ферментера. Однако цикл развития микроорганизмов в продленном периодическом процессе удлиняется либо за счет подпитки (периодического или непрерывного добавления питательной среды), либо за счет длительного удержания клеток в системе (диализная культура). Таким образом, продлевается экспоненциальная фаза и фаза линейного роста. Суть процесса диализа заключается в том, что культура развивается в пространстве, ограниченном полупроницаемой мембраной, а продукты метаболизма диффундируют во внешний раствор. Наиболее простой диализный метод – культивирование в целлофановых мешках, погруженных в питательную среду.

Многоциклическими процессами культивирования называют такие, в которых цикл выращивания культуры повторяется многократно без многократной стерилизации емкости. Многоциклическое культивирование может быть различным. Его можно вести в одном ферментере, многократно повторяя полный цикл развития культуры без перерыва на стерилизацию. Способы, осуществляемые в одном ферментере, называют одностадийными. Возможны и многостадийные многоциклические процессы, основанные на принципе повторного и последовательного периодического культивирования, протекающего в нескольких ферментерах, соединенных в батарею, с целью длительного использования культуры.

Многоциклические процессы культивирования микроорганизмов применяют как для получения биомассы, так и для производства продуктов микробного синтеза – антибиотиков, внеклеточных ферментов, аминокислот. Применение данного способа позволяет в несколько раз сократить затраты труда на производство продукта по сравнению с периодическим способом.

В полунепрерывных системах полная загрузка и разгрузка фер-ментера осуществляются однократно, однако в процессе роста культуры часть культуральной жидкости сливается, а освободившийся объем заливается свежей питательной средой. Таким образом функционирует сливно-доливная система. Различные варианты полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков и лимонной кислоты.

1.4.3 Непрерывные способы культивирования

При непрерывном культивировании в ферментатор непрерывным потоком поступает свежая питательная среда и постоянно вытекает готовая культуральная жидкость вместе с клетками введенной культуры микроорганизма.

Непрерывное культивирование позволяет задержать культуру на любой стадии развития и заставить клетки размножаться с соответствующей скоростью  по экспоненциальному закону.

При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать скорость притока питательной среды так, чтобы вымывания культуры из системы не происходило, т.е. концентрация клеток была бы постоянной.

Непрерывный метод обеспечивает однородность и стандартность получаемого продукта. Продуктивность микроорганизмов непрерывно поддерживается на максимальном уровне. Процесс все время идет с равномерной скоростью, что позволяет его автоматизировать.

На протяжении всего процесса поддерживаются благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов без изменения состава среды и свойств самих микроорганизмов – в этом большое преимущество непрерывного способа культивирования по сравнению с периодическим, преимущество «открытой» системы по сравнению с «закрытой».

Концентрация целевого продукта в культуральной жидкости при непрерывном культивировании ниже, чем при периодическом, поэтому требуется мощное оборудование для его выделения. Поэтому непрерывный способ применяется для синтеза биомассы, но не для получения антибиотиков и чистых биохимических препаратов – это экономически не оправдано.

Непрерывная ферментация может проходить в системе идеального смешения, системе полного вытеснения или системе твердожидкостного типа.

Системы идеального смешения. По количеству ферментеров системы идеального смешения могут быть одностадийными, двухстадийными и многостадийными.

Для получения высоких концентраций используются одностадийные системы с возвратом клеток, в которых клетки, отделенные от культуральной жидкости с помощью насоса, возвращают обратно в ферментер. Возврат клеток (рециркуляция) имеет важное значение в тех процессах, в которых за время пребывания в ферментере клетки не успевают реализовать свои потенциальные возможности в отношении синтеза целевого продукта.

Многостадийные системы состоят из ряда последовательно соединенных ферментеров (батареи). Многостадийное культивирование применяется при получении молочной кислоты, этилового спирта.

Основным аппаратом непрерывной системы является ферментер идеального смешения с устройством для поступления среды и слива культуры, поддерживающим постоянный уровень среды.

Процесс непрерывного культивирования может быть гомо- или гетерогенно-непрерывным. Способ проточного культивирования, при котором во всех точках ферментера благодаря интенсивному перемешиванию поддерживаются одинаковые параметры среды и содержание микробной биомассы в единице объема жидкости остается все время постоянным, называют гомогенно-непрерывным. Применение такого способа обеспечивает постоянство состава среды в ферментаторе.

Когда культивирование проводят в одном ферментаторе, непрерывность процесса создается благодаря подвижному равновесию между приростом микробной биомассы и ее снижением за счет разбавления культуры свежей средой.

В бродильном производстве распространен гетерогенно-непрерывный метод, при котором процесс ведется в батарее после-довательно соединенных ферментаторов. Состав жидкости, протекающей через аппараты, постепенно изменяется согласно некоторо-
му градиенту. Поэтому этот способ называют также градиентно-непрерывным. Питательная среда поступает в первый ферментатор,
а культуральная жидкость вытекает из последнего ферментатора.

Реакторы непрерывно-проточного действия с интенсивным перемешиванием могут контролироваться по двум принципам.

Турбидостат контролируется по принципу обратной связи: скорость потока зависит от требуемой концентрации биомассы клеток на выходе.

Хемостат контролируется напрямую: задается скорость потока и к ней подстраивается концентрация биомассы.

Системы культивирования идеального вытеснения. Открытая система полного вытеснения отличается от системы идеального смешения тем, что культура в ней не перемешивается, а представляет собой поток жидкости через трубку. Наиболее распространенным аппаратом для культивирования в данном случае является трубчатый ферментер. Он может иметь различную форму (прямую, S-образную, спиральную) и устанавливается горизонтально или вертикально. Система полного вытеснения представляет собой пространственный, проточный вариант периодической культуры. Такая культура за время от посева до выгрузки проходит через все стадии периодической культуры, то есть фазы роста распределены не во времени, а в пространстве, причем каждой части ферментера в установившемся режиме соответствует определенный отрезок кривой роста. Этот способ культивирования используется для анаэробных процессов. Посев осуществляется непрерывно на входе в ферментер одновременно с подачей среды. Этот принцип может использоваться на стадии брожения при производстве пива.

Системы твердожидкостного типа. К системам твердожидкостного типа относят многофазные системы, в которых культура растет на границе разных фаз: жидкость–твердая фаза–газ. В этих системах клетки удерживаются путем прилипания к твердой основе – наполнителю и размножаются на нем, образуя пленку биомассы. Типичным примером является производство уксуса в стружечных аппаратах.

Культивирование микроорганизмов, образующих пленку из биомассы, осуществляется в ферментере типа колонки с наполнителем. В качестве наполнителя может использоваться макроноситель (кокс, прутья, стружки, стеклянные шарики и т.д.) и микроноситель (амберлитовые смолы, частички сефадекса и т.д.). Клетки, культивируемые таким образом, называют иммобилизованными. Использование иммобилизованных клеток имеет несколько преимуществ.

Во-первых, появляется возможность длительной эксплуатации клеток в случае непрерывной ферментации.

Во-вторых, известны примеры повышения устойчивости клеток к действию различных неблагоприятных внешних факторов (температуры, кислотности, концентрации токсичных веществ и других) в результате иммобилизации.

В-третьих, существенно упрощаются процедуры выделения целевого продукта.

В промышленной микробиологии системы твердожидкостного типа нашли применение при очистке сточных вод, в производстве органических растворителей и кислот и т.д.

1.5 Идеальные реакторы для изучения кинетики

клеточного роста

Если в разных участках объёма реактора условия неодинаковы, то трудно получить достоверную информацию о кинетике роста. Поэтому в основном кинетику изучают в реакторах с полным перемешиванием.

1.5.1 Идеальный реактор периодического действия

Основой многих биохимических процессов является периодический рост популяции клеток, при котором после внесения клеток в жидкую среду, в неё в течение всего периода культивирования ничего не добавляется и ничего не удаляется (кроме некоторых газов).

По мере роста клеток изменяется их концентрация, а также концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма.

Материальный баланс по компоненту i показывает, что скорость его накопления, выраженная в виде производной общего количества компонента i по времени должна быть равна скорости его образования, обусловленного химическими реакциями в реакторе:

(1)

или        

,                                  (2)

где    – объём культуры в реакторе;

– количество молей i в единице объёма культуры;

– количество образовавшихся в реакции молей i в единице объёма культуры за единицу времени.

Если в реактор ничего не добавляют и ничего не отбирают из него и если потерями жидкости с потоком газа можно пренебречь, то  постоянно и уравнение упрощается

,                                                (3)

Аналогичными уравнениями можно выразить не только изменение количества молей, но и массы или концентрации.

Определение скорости изменения концентрации компонента i позволяет непосредственно определить общую скорость образования i в реакциях, которые происходят в реакторе периодического действия. В общем случае скорость образования  зависит от состояния клеточной популяции (состава, морфологии, распределения по возрасту и т.д.) и всех параметров среды, оказывающих влияние на скорости реакций в клетках и среде.

1.5.2 Идеальный поточный реактор с полным                           перемешиванием (ПРПП)

Если реактор предназначен для изучения роста культур клеток, то его называют хемостат (рисунок 5). Перемешивание в реакторе осуществляется с помощью мешалки, потока пузырьков газа (барботаж) или того и другого одновременно.

Примем, что в ПРПП перемешивание культуральной жидкости настолько эффективно, что концентрация любых компонентов в любой из фаз одинакова во всём объёме реактора. Таким образом, состав вытекающего потока не отличается от состава содержимого реактора.
В реактор непрерывно подаётся среда и непрерывно отводятся продукты метаболизма.

Рисунок 5 – Проточный реактор с полным перемешиванием

с указанием обозначений, применяемых при моделировании

и анализе таких реакторов

Если реактор снабжён устройствами для полного перемешивания, эффективного отвода тепла и регулирования температуры на заданном уровне, то система изотермическая, температура постоянна и не учитывается.

В стационарном состоянии, когда концентрация всех компонентов в реакторе не изменяется во времени, к любому компоненту системы применимо уравнение:

,    

                                                                                                                         (4)

или

           (5)

где    – общий объём культуры в реакторе, л;

– объёмная скорость потока раствора питательных веществ и вытекающего потока, л / ч;

– молярная концентрация компонента i в потоке питательных веществ, М;

– молярная концентрация компонента i в реакционной смеси и вытекающем потоке, М;

– количество образовавшихся в реакции молей i в единице объёма культуры за единицу времени, М/лч.

Преобразуем это уравнение

,                     (6)

где  – скорость разведения, которая может быть найдена по уравнению

                                  (7)

определяет время пребывания или скорость переработки в реакторе и равна числу объёмов жидкой фазы реактора, проходящему через него в единицу времени.

Кинетика процессов в ПРПП проще, чем в реакторе периодического действия. Не нужно определять зависимость концентрации от времени и дифференцировать полученные данные. Кроме того, в ПРПП клетки могут приспособиться к стационарным условиям и таким путём перейти в состояние сбалансированного роста. С другой стороны, эксперименты по изучению роста клеток в периодических процессах легко организовать в лаборатории: они могут быть выполнены в небольших сосудах, размещенных на термостатированной качалке, оборудование для ПРПП значительно сложнее и дороже. Состояние стационарности может быть достигнуто только через несколько часов или дней, что существенно повышает опасность загрязнений, делая бесполезными результаты эксперимента.


2 ЭКСПОНЕНЦИАЛЬНАЯ ФАЗА РОСТА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

2.1 Кинетика сбалансированного роста

Моделирование кинетики клеточного роста начнём с неструктурированных моделей, в которых биофаза характеризуется только величиной клеточной массы или численной концентрацией (x).

Общую скорость роста клеточной массы  выражают как

.         (8)

Если общую скорость клеточного роста выразить в единице клеточной массы, то получим удельную скорость клеточного роста µ, вычисляемую по формуле

,                          (9)

тогда

.                    (10)

где    х – клеточная масса в единице объёма культуры;

– удельная скорость роста клеток, ч-1.

В этих параметрах уравнение материального баланса для ПРПП (проточный реактор с полным перемешиванием) будет в стационарном состоянии выглядеть следующим образом:

                                   (11)

где  – клеточная масса в потоке питательных веществ,

тогда

.                                (12)

Поток раствора чаще всего состоит только из питательной среды, поэтому  тогда отличная от нуля популяция клеток может существовать только в стационарном состоянии в условиях сбалансированного роста

                                (13)

то есть когда удельная скорость роста равна скорости разведения.

2.2 Уравнение Моно для кинетики клеточного роста

Скорость роста зависит от подачи питательных веществ. Однакопитательные вещества не следует подавать в избытке, так как избыточная концентрация может ингибировать рост клеток или привести к их гибели. Кроме того, если клетки растут слишком интенсивно, то накапливающиеся конечные продукты метаболизма могут нарушить нормальные биохимические процессы в клетках. Поэтому обычно общий рост клеток лимитируют, ограничивая количество одного питательного вещества в среде.

Впервые на лимитирование процессов роста культур клеток субстратами ферментативных реакций обратил внимание Жакоб Моно. Субстраты, ограничивающие рост микробных популяций, получили название лимитирующих.

Было показано, что зависимость скорости роста клеточной культуры от концентрации лимитирующего субстрата можно представить в следующем виде (в экспоненциальной фазе):

                                             (14)

где    – число клеток;

– коэффициент пропорциональности, называемый удельной скоростью роста, мин-1, ч-1, с-1.

                                (15)

Проинтегрируем уравнение (14) и получим

                                             (16)

Так как значение удельной скорости роста зависит от концентрации лимитирующего субстрата s, то

,                                              (17)

 – максимальная скорость роста, достигаемая при ;

– концентрация субстрата;

– параметр, называемый константой сродства субстрата к микроорганизму;

– это такая концентрация лимитирующего клеточный рост питательного вещества, при которой удельная скорость роста вдвое ниже максимального значения.

Это уравнение Моно. Уравнение Моно соответствует зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (уравнению Михаэлиса–Ментен) и выражается кривой типа гиперболы.

Уравнение Моно достаточно просто, его можно применять, когда  и  На основании литературных данных показано, что значения варьируют в диапазоне 10-2…10-5 с-1;  – в диапазоне    10-2…10-8 М.

На практике нет клеток с  выше 10-2 с-1 и ниже 10-5 с-1.

Верхний предел скорости роста клеточных популяций связан со скоростью процессов репликации ДНК. Нижний связан с низкой жизнеспособностью медленно растущих популяций.

Среднее значение составляет порядка 10-4 с-1, а среднее время удвоения клеточной популяции составляет около 2 ч и вычисляется по уравнению

                                (18)

Если применимо уравнение Моно (то есть ), то можно составить материальный баланс по клеточной массе, так как  зависит от s. Введём понятие экономического коэффициента

.            (19)

Тогда уравнение материального баланса по субстрату для стационарного состояния можно записать как

                               (20)

Подставим в (20) уравнение Моно (17) и получим

                  (21)

В этом случае уравнение материального баланса по клеточной массе будет выглядеть следующим образом.

Преобразуем уравнение (12)

,                    (22)

в него подставим уравнение Моно

    (23)

Уравнения (21) и (23) также называют моделью Моно для хемостата (для ПРПП).

Если питательные вещества стерильны, то есть  как обычно и бывает, то из уравнения (20)

                  (24)

а из уравнения (23)

.                   (25)

Задача 1. Вывод уравнений. Вывести уравнения (24) и (25).

2.3 Зависимость клеточного роста от скорости разведения

Уравнения (24) и (25) выражают зависимость х и s от скорости потока  в стационарном состоянии. Для очень медленных скоростей потока при заданном объёме  и, следовательно,  Так как почти весь вводимый в реактор субстрат поглощается клетками, то х – концентрация клеточной массы на выходе из реактора будет равна      

     (26)

По мере постепенного повышения  возрастает и S: сначала пропорционально, а затем, по мере приближения  к , ещё быстрее. Таким же образом снижается концентрация клеточной массы: сначала в линейной зависимости от , а затем при  с большей скоростью. В какой-то момент  это означает, что скорость разведения  превышает максимальную возможную скорость роста. Потеря всех клеток называется вымыванием, при

                  (27)

На рисунке 6 приведены отражаемые уравнениями (24) и (25) графики зависимостей. Вблизи точки вымывания реакционная смесь становится очень чувствительной к колебаниям , даже небольшое изменение  сопровождается большими изменениями х и s.

Это очень важно, когда целью процесса является производство биомассы. Максимальную скорость образования клеток можно вычислить, решив дифференциальное уравнение:

                  (28)

в котором для описания х как функции от  используется уравнение (25). Решение уравнения даёт

                 (29)

 

Если, как часто бывает на практике,  то  
и следовательно, находится вблизи точки вымывания. В такой ситуации (см. рисунок 6), чтобы избежать диапазона наибольшей чувствительности, не целесообразно добиваться максимальной скорости образования биомассы.

При изучении закономерностей образования конечных продуктов непрерывных микробиологических процессов введём ещё один коэффициент

      (30)

Рисунок 6 – Зависимость концентрации субстрата s, клеточной
массы
х и скорости образования клеток  от скорости
разведения непрерывной культуры D, вычисленные на основе
модели Моно для хемостата (=1 ч
-1; Кs =0,2 г/л; Yх/s=0,5; =10 г/л)

Применив этот коэффициент, запишем уравнение материального баланса для продукта жизнедеятельности клеток в стационарном состоянии

    (31)

или

     (32)

Уравнение (32) позволяет вычислить концентрацию продукта в выходящем из реактора потоке. Производительность реактора по отношению к продукту равна  и при постоянном  максимальна, если D имеет значение, определяемое из уравнения (29). Следовательно, при попытках добиться максимальной производительности процесса также необходимо учитывать фактор чувствительности.

Задача 2. Рост популяции микроорганизмов. Найден новый микроорганизм, при делении которого из каждой родительской клетки образуются три дочерних. По приведённым ниже экспериментальным данным (таблица 1), определяющим рост популяции, вычислить среднее время между двумя последовательными делениями клеток.

Таблица 1 – Зависимость массы клеток от времени культивирования

t, ч

Масса сухого клеточного вещества, г/л

0

0,10

0,5

0,15

1,0

0,23

1,5

0,34

2,0

0,51

Задача 3. Кинетика Моно в ПРПП. Рассмотрим организм, кинетика роста которого подчиняется уравнению Моно при  и

а) При какой скорости разведения D будет обеспечиваться максимальная общая скорость образования клеточной массы, если принять, что культура находится в стационарном состоянии, содержание проточного реактора полностью перемешивается, в культуре клетки не гибнут и  г клеточной массы/г субстрата.

б) Сколько последовательных реакторов одинаковой ёмкости потребуется для уменьшения концентрации субстрата до 1 г/л при найденном D?

2.4 Графическое определение параметров роста

клеточной культуры

В условиях, когда концентрация субстрата и других компонентов, необходимых для роста клеток постоянна, процесс увеличения числа клеток носит автокаталитический характер. Данный процесс описывается следующим дифференциальным уравнением (14), из которого можно найти число клеток (16) в виде экспоненциальной зависимости. Эти два уравнения описывают экспоненциальную фазу роста клеточных культур. В произвольных логарифмических координатах данное уравнение может быть представлено следующим образом:

                               (33)

Таким образом, анализ экспериментальных данных по исследованию кинетики роста клеточных популяций следует начинать в полулогарифмических координатах. Если в этих координатах наблюдается спрямление экспериментальных данных, то они описываются уравнением (14). Тангенс угла наклона прямой равен удельной скорости роста клеточной культуры, а ордината точки пересечения графика с осью Y равна начальному числу клеток в культуре (рисунок 7).

Пример 1. В таблице 2 приведены данные по кинетике роста культуры Methanobacter  tindaris на среде с метанолом при 37 ºС,
рН 7,0. На основании экспериментальных данных определить удельную скорость роста этой культуры.

Таблица 2 – Кинетика роста культуры Methanobacter tindaris

Время, ч

Число микроорганизмов

0

2,5107

5

5,16·107

10

1,08·108

20

4,85·108

25

8,49·108

40

1,32·109

Экспериментальные данные, приведённые в таблице 1, представлены на рисунке 8 в полулогарифмических координатах.

Рисунок 7  – Определение
кинетических параметров роста клеточной культуры

Рисунок 8 – Кинетика роста

клеточной культуры M. tindaris

Из рисунка 8 видно, что при достаточно небольшом времени инкубации данной культуры наблюдается линеаризация экспериментальных данных в полулогарифмических координатах, что свидетельствует о наличии экспоненциальной фазы роста культуры Methanobacter
tindaris.

Определяем

Достаточно часто удельная скорость роста клеточной культуры зависит от концентрации лимитирующего субстрата и определяется уравнением Моно

     (34)

В этом случае наиболее удобным представляется анализ экспериментальных данных в двойных обратных координатах, переход к которым описывается уравнением

                                     (35)

Параметры, определяемые с помощью двойных обратных координат, представлены на рисунке 9.

Рисунок 9 – Определение кинетических параметров
роста клеточной культуры в двойных обратных
координатах

Пример 2. Удельная скорость Methanobacter thermoautotrophicum зависит от концентрации углекислого газа в газовой среде и описывается данными таблицы 3. На основании этих данных определить константу Михаэлиса  и максимальную удельную скорость роста

Таблица 3 – Кинетика роста Methanobacter thermoautotrophicum 

при рН 7,0, 65 ºС, 80 % водорода в газовой смеси

%

5

0,2

10

0,27

12

0,3

17

0,35

20

0,4

Экспериментальные данные по зависимости удельной скорости роста Methanobacter thermoautotrophicum  от концентрации углекислого газа в газовой среде представлены на рисунке 10. Из графика находим: µ= 0,45 ч-1, Кs=1/0,14=7 %.

Рисунок 10 – Зависимость удельной скорости роста

Methanobacter thermoautotrophicum от концентрации
углекислого газа в газовой смеси

3 ИНГИБИРОВАНИЕ И АКТИВАЦИЯ
КЛЕТОЧНОГО РОСТА

 

3.1 Графический способ определения типа ингибирования

Практически для всех клеточных популяций характерно изменение скорости роста под действием ингибиторов и активаторов.

Классификация ингибиторов и активаторов:

1. По мишени, на которую действует вещество:

а) ингибиторы, действующие на ДНК;

б) ингибиторы, действующие на РНК;

в) ингибиторы синтеза белка;

г) ингибиторы синтеза клеточной стенки;

д) мембраноактивные вещества;

е) ингибиторы энергетических процессов;

ж) ингибиторы лимитирующего фермента.

Чувствительность ферментов к их действию зависит от природы функциональных групп активного центра конкретного фермента.

2. По кинетике действия

а) необратимые ингибиторы и активаторы;

б) обратимые ингибиторы и активаторы.

Также для кинетики роста клеток характерно наличие процессов ингибирования избытком субстрата и продуктом, что будет проанализировано позднее.

По аналогии с ферментативной кинетикой общую схему действия эффектора R на процесс роста биомассы с лимитирующим субстратом, можно записать следующим образом:

                 (36)

Удельная скорость роста клеточной культуры в этом случае описывается следующим уравнением:

         (37)

Рассмотрим наиболее важные с точки зрения кинетики клеточного роста случаи ингибирования и активации.

1. Полное конкурентное ингибирование В этом случае удельная скорость роста клеток описывается уравнением

         (38)

В двойных обратных координатах наблюдается пучок прямых, пересекающихся на оси ординат (рисунок 11).

Рисунок 11 – Полное конкурентное ингибирование
клеточного роста

2. Полное неконкурентное ингибирование При этом в двойных обратных координатах наблюдается пучок прямых, пересекающихся на оси абсцисс (рисунок 12).

Рисунок 12 – Полное неконкурентное ингибирование
клеточного роста

3. Неконкурентная активация

Максимальная скорость роста в этом случае увеличивается

.                   (39)

В двойных координатах данный случай практически не отличим от случая неконкурентного ингибирования (см. рисунок 12).

4. Смешанные типы ингибирования и активации

Пример 3. Зависимость удельной скорости роста E. coli от концентрации ацетата в аэробных и анаэробных условиях приведена в таблице 4. Определить тип ингибирования или активации. Использовать преобразованные координаты Диксона ().

Таблица 4 – Зависимость удельной скорости роста E. coli 

от концентрации ацетата

Анаэробные условия

Аэробные условия

Ацетат, мМ

, ч-1

Ацетат, мМ

, ч-1

5

0,31

20

0,75

10

0,25

40

0,51

15

0,22

60

0,40

20

1,17

100

0,32

25

0,13

120

0,25

30

0,10

140

0,20

Как видно из рисунка 13, в аэробных условиях E. coli растёт существенно быстрее, чем в анаэробных. Следовательно, кислород является активатором роста для данной культуры. Экспериментальные данные представлены в координатах Диксона (1/µ, S). Пересечение прямых, аппроксимирующих экспериментальные данные в координатах Диксона, не наблюдаются ни на одной из осей, следовательно,
кислород является смешанным активатором (частично конкурентным, частично неконкурентным) роста
E. coli. По точкам пересечения гра-
фика в координатах Диксона с осью абсцисс определяем константы
ингибирования. В аэробных условиях  а в анаэробных

Рисунок 13 – Зависимость удельной скорости роста  E. coli
от концентрации ацетата

3.2 Влияние эндогенного метаболизма и метаболизма

поддержания на кинетику клеточного роста

Приведённые на рисунке 14 данные для культуры Aerobacter aerogenes показывают, что при малых скоростях разведения концентрация клеток заметно снижается.

Рисунок 14 – Снижение концентрации клеточной массы
A. аerogenes в глицериновой среде в проточном реакторе

Эту особенность, противоречащую модели Моно для хемостата, можно объяснить, если в модели учесть возможность эндогенного
метаболизма. Под эндогенным метаболизмом подразумеваются происходящие в клетке реакции, в которых расходуются клеточные вещества. Чтобы учесть этот эффект, дополним уравнение Моно слагаемым  

                               (40)

Слагаемое  в уравнении (40) можно интерпретировать как скорость гибели клеток.

Модифицированное уравнение Моно согласуется с другими экспериментальными данными. Например, если скорость дыхания аэробной культуры пропорциональна скорости утилизации субстрата, то есть

     (41)

то из уравнений (12), (40) и (41) следует, что удельная скорость дыхания равна

                               (42)

Наблюдаемая зависимость экономического коэффициента Y от D также подтверждает справедливость уравнения (40) для скорости клеточного роста. Если скорость поглощения субстрата равна

                               (43)

где  – это «истинный» коэффициент, то из уравнений (40) и (43) и определения  ( – стехиометрический коэффициент, равный частному от деления общей массы образовавшихся клеток на общую массу поглощённого субстрата, поэтому при условии стерильности питательных веществ ) следует, что

     (44)

Экспериментально показано, что для ряда микроорганизмов зависимость  от D выражается уравнением (44).

Кроме эндогенного метаболизма, субстрат может параллельно расходоваться как для клеточного роста, так и для других энергетических потребностей клетки (метаболизм поддержания). В этом случае скорость утилизации субстрата определяется выражением

                               (45)

где  – удельная скорость потребления субстрата, расходуемого в метаболизме поддержания.

Если принять, что , то

                  (46)

Таким образом, мы получили такую же функциональную зависимость  от D, как и в случае модели эндогенного метаболизма, уравнение (44).

3.3 Другие уравнения кинетики клеточного роста

Предлагались и другие математические выражения, определяющие скорость клеточного роста.

Иногда кинетическая кривая имеет сигмоидный характер. В этом случае модель можно описать с помощью уравнения Мозера

,                   (47)

где К – константа, формально соответствующая числу молекул субстрата, вступающих в реакцию с ферментом с образованием одной молекулы продукта,

1 – уравнение Моно; 2 – уравнение Мозера; 3 – уравнение Андрюса;
4 – уравнение для веществ активаторного типа

Рисунок 15 – Кинетические зависимости удельной скорости роста

микроорганизмов от концентрации субстрата

Ещё один распространённый вид кинетической зависимости отражает ингибирование роста биомассы высокими концентрациями субстрата. Такая зависимость описывается уравнением Андрюса

,      (48)

где  – константа ингибирования.

В отличие от уравнения Моно в этом уравнении константа  не равна максимальной скорости роста, а  не соответствует концентрации субстрата, при которой

Для веществ активаторного типа предложена следующая зависимость:

,                   (49)

где К1 и К2 – коэффициенты.

Теиссье предложил следующее уравнение, определяющее удельную скорость роста:

     (50)

Задача 4. Уравнение Теиссье. Построить кинетическую кривую для уравнения Теиссье при S от 0 до 10 г/л; г/л;

Задача 5. Особенности расчета ПРПП при ингибировании клеточного роста. Постройте график зависимости х и s от D, если

,      (51)

где s0=10 г/л, Кs=1 г/л, Кi=0,01 г/л, i=0,05 г/л, µm=0,5 ч-1, Yx/s=0,1 г клеток/г субстрата.

На том же чертеже постройте графики зависимостей x и s от D при i=0.

3.4 Зависимость удельной скорости роста от концентрации одного продукта метаболизма

В ряде процессов микробиологического синтеза рост культуры ингибируется продуктами метаболизма, выделяемыми в ферментационную жидкость. Например, рост микроорганизмов ингибируется ацетоном и бутанолом при ацетоно-бутиловом брожении. Вообще, ин-гибирование продуктами метаболизма рано или поздно наступает в
любом периодическом процессе, если питательная среда содержит большое количество субстратов. Это явление описывают линейным уравнением Хиншельвуда

                               (52)

где    К – константа;

р – концентрация метаболита,

или гиперболической зависимостью Иерусалимского

.                    (53)

1 – уравнение Хиншельвуда; 2 – уравнение Иерусалимского

Рисунок 16  – Кинетические зависимости удельной скорости роста

микроорганизмов от концентрации продуктов метаболизма

Аиба, Шода, Нагатани для спиртового брожения (анаэробные условия, субстрат–глюкоза, микроорганизм–дрожжи) предложили уравнение

   .                   (54)

3.5 Многофакторные зависимости

В ряде случаев на скорость роста микроорганизмов оказывают существенное влияние два фактора и более. Для описания таких процессов используют зависимости трёх видов: аддитивные, мультипликативные и уравнения с более сложным характером взаимодействия. В первых двух случаях многофакторная зависимость представляет собой комбинацию двух однофакторных зависимостей и более в виде суммы или произведения. Например, аддитивная зависимость

,                   (55)

мультипликативная зависимость

.                   (56)

В третьем случае взаимовлияние двух и более факторов более тесное и нельзя выделить эффект каждого в виде отдельного слагаемого или множителя, например,

,                   (57)

.                   (58)

Уравнения (53) и (54)  по существу представляют собой модификацию уравнения Моно.

а – аддитивная; б – мультипликативная;
в – описываемая уравнением (57); 1, 2, 3 – кривые,
соответствующие различным значениям второго фактора

Рисунок 17 – Зависимости удельной
скорости роста микроорганизмов от двух факторов

Для описания каждого конкретного процесса микробиологического синтеза необходимо экспериментально изучить зависимость удельной скорости роста от одного или нескольких основных факторов, а затем подобрать математическое выражение, наиболее точно отражающее эту зависимость.

3.6 Влияние других параметров на кинетику клеточного роста

При сбалансированном росте для характеристики кинетики роста популяции достаточно только одного параметра . По этой причине параметр удельной скорости роста  широко используется для описания влияния среды на поведение популяции. Рассмотрим прежде всего влияние температуры. Известно, что живые организмы могут существовать в диапазоне температур от минус 5 до плюс 95 ºС. Принято классифицировать прокариоты в соответствии с диапазоном температур их роста.

Таблица 5 – Классификация микроорганизмов в соответствии

с зависимостью скорости их роста от температуры

Группа микроорганизмов

Температура, ºС

min

opt

max

Термофильные

(+40)÷(+45)

(+55)÷(+75)

(+60)÷(+80)

Мезофильные

(+10)÷(+15)

(+30)÷(+45)

(+35)÷(+47)

Психрофильные:

облигатные

факультативные

(–5)÷(+5)

(–5)÷(+5)

(+15)÷(+18)

(+25)÷(+30)

(+19)÷(+22)

(+30)÷(+35)

Для каждого класса микроорганизмов характерна некоторая оптимальная температура, при которой скорость роста достигает максимума, а также верхняя и нижняя температурные границы, вне которых популяция вообще не способна к росту (рисунок 18).

Рисунок 18 – При повышении температуры скорость роста клеток

Escherichia coli до определенного момента возрастает,
но при слишком высокой температуре клетки погибают (
а);

та же зависимость в координатах Аррениуса (б)

В координатах Аррениуса классическое аррениусовское поведение наблюдается только при низких температурах, а по мере приближения температуры к той границе, при которой бактерии начинают погибать, скорость их роста резко падает.

Уравнение Аррениуса

,                                (59)

где   – предэкпоненциальный множитель;

Е – энергия активации;

R – универсальная газовая постоянная,

отражает зависимость скорости реакции от температуры. (Скорость обычных реакций, протекающих при нормальной температуре изменяется в 2–3 раза при увеличении температуры на 10 ºС.)

Таким образом, в нашем случае зависимость удельной скорости роста от температуры может быть представлена в виде

                  (60)

     (61)

Задача 6. Зависимость скорости клеточного роста от температуры.

Джонсон, Эйринг и Полиссар предложили следующее уравнение для зависимости удельной скорости роста E. сoli от температуры в диапазоне от 18 до 43 ºС:

                               (62)

где   

Начертить график этой функции в виде зависимости  от

Конформация белка и его активность зависит от рН. Поэтому рН оказывает существенное влияние на процессы клеточного транспорта, скорости реакций, а следовательно, и на скорость роста клеток. Обычно скорость роста бактерий максимальна в диапазоне рН от 6,5 до 7,5.

Рисунок 19 – Влияние температуры
и рН на время удвоения  
Escherichia coli

Отклонение от оптимального рН на 1,5…2 ед. в любую сторону от оптимальной величины приводит к практически полному прекращению роста. Дрожжи лучше всего растут при рН 4…5, плесневые гри-
бы – при рН 5…7.

Зависимость удельной скорости роста микроорганизмов от рН может быть описана уравнениями

,     (63)

    (64)


4 КИНЕТИКА КЛЕТОЧНОГО РОСТА

В ПЕРЕХОДНОМ СОСТОЯНИИ

В определённые периоды роста культур клеток в реакторах периодического действия или после возмущений в проточных реакторах непрерывного действия, популяции клеток находятся в переходном состоянии, кинетика которого достаточно сложна.

4.1 Лаг-фаза

Время лаг-фазы, наблюдаемой после инокуляции свежей среды, зависит как от изменений в составе питательных веществ, так и от возраста и дозы инокулята.

При переносе клеток из одной среды в другую резко изменяются условия жизнедеятельности клеток. Сталкиваясь с новым питательным веществом, клетка начинает его усваивать только после синтеза новых ферментов. Поэтому перенос из одной среды в другую сопровождается периодом с незначительной скоростью деления клеток.

Аналогично лаг-фаза может наступить и после изменения концентраций питательных веществ. Если новая питательная среда богаче лимитирующим клеточный рост питательным веществом, то в течение некоторого времени это вещество будет расходоваться не на рост клеток, а на повышение концентраций метаболирующих ферментов. Уменьшение питательного вещества может и не сопровождаться лаг-фазой, в этом случае экспоненциальный рост возобновляется сразу же после снижения концентрации, но скорость клеточного роста уменьшается.

Для активации многих внутриклеточных ферментов необходимы те или иные ионы металлов (активаторы), которые могут проникать через клеточные мембраны. Перенос небольшого объёма клеток культуры в значительно больший объём среды вызовет обратную диффузию этих необходимых для ферментативного катализа веществ в среду, если в последней они отсутствуют или если среда резко отличается от инокулята по своей ионной силе. В этом случае скорость роста уменьшается из-за уменьшения концентрации активаторов в клетке. Поэтому лаг-фаза продлится до «включения» новых механизмов синтеза этих активаторов.

На длительность лаг-фазы очень большое влияние оказывает фаза роста, в которой находится инокулят. Культура молодых клеток быстрее адаптируется к изменившейся питательной среде, выработав новые ферменты. Объём инокулята влияет на количество диффундирующих в среду веществ, например, витаминов и активаторов.

Рисунок 20 – Двухфазный рост Escherichia coli

Если среда содержит несколько источников углерода, то иногда  может наблюдаться ряд последовательных лаг-фаз (рисунок 20). Это явление, называемое диауксией (двухфазным ростом), обусловливается изменением метаболического механизма в процессе роста. При диауксии сначала усваивают один источник углерода, затем когда это питательное вещество истощается, клетки синтезируют другие ферменты и утилизируют другой источник углерода. В основе такой последовательной утилизации питательных веществ лежит явление катаболитной репрекии.

Чтобы свести к минимуму время роста культуры в периодическом процессе, необходимо сократить продолжительность лаг-фазы. Для этого:

1) культура инокулята должна обладать максимальной активностью, а в момент введения в среду инокулят должен находиться в фазе экспоненциального роста;

2) среда, в которой выращивался инокулят, должна быть по составу близкой к среде крупномасшабного микробиологического процесса;

3) для предотвращения обусловленных диффузией потерь незаменимых промежуточных веществ и активаторов целесообразно применять инокулят в количестве не менее 510 %.


Задача 7.
Кинетика микробиологических процессов с одним и несколькими субстратами. Культура растет на простой среде, содержащей 0,3 % (масса/ /объем) глюкозы. В момент времени t=0 культуру (как инокулят) разбавляют большим объемом идентичной стерильной среды. Процесс роста культуры контролируют по изменению оптической плотности (OD) при 420 нм во времени. Полученные данные приведены в столбце (1) таблицы 6.

В столбце (2) таблицы 6 указано изменение OD этой же культуры, выросшей в сложной среде и разбавленной питательным раствором, содержащим 0,15 % глюкозы и 0,15 % лактозы (масса/объем). Допустим, что OD (при 420 нм) пропорциональна концентрации клеточной массы, причем OD, равная 0,175, соответствует концентрации 0,1 мг клеток в 1 мл (в расчете на массу сухого вещества).

Таблица 6 – Контролируемые показатели культивирования

микроорганизмов

Продолжительность культивирования, ч

Оптическая

плотность

Концентрация

клеток, мг/мл

(1)

(2)

(1)

(2)

0

0,06

0,06

0,5

0,08

0,06

1,0

0,11

0,06

1,5

0,14

0,07

2,0

0,20

0,10

2,5

0,26

0,13

3,0

0,37

0,18

3,5

0,49

0,26

4,0

0,35*

0,32

4,5

0,44*

0,43

5,0

0,52*

0,48

5.5

0,52*

0,50

6,0

0,52

6,5

0,30*

7,0

0,42*

7,5

0,50*

8,0

0,50*

*Определению оптической плотности предшествовало разведение пробы равным объемом, не содержащей клеток среды

Постройте график зависимости концентрации клеток для случаев (1) и (2).

Объясните форму кривых для каждого случая. Рассчитайте максимальную удельную скорость роста µm, продолжительность лаг-фазы tlag и общий экономический коэффициент Y (выраженный числом граммов клеток на 1 г субстрата) при условии, что субстрат всегда утилизируется полностью.

4.2 Экспоненциальная фаза роста в реакторе периодического действия

К концу лаг-фазы популяция микроорганизмов приспосабливается к новым условиям. Теперь клетки могут быстро размножаться и клеточная масса удваивается через определённые промежутки времени. Увеличение числа клеток в этот период может быть описано уравнением

                 (65)

Таким образом, скорость увеличения х пропорциональна концентрации культуры.

Проинтегрируем уравнение (65)

                  (66)

или    

                  (67)

Отсюда следует, что время, необходимое для удвоения численности популяции клеток составляет

      (68)

Как и в случае роста клеток в стационарном состоянии в ПРПП, для описания популяции в ходе экспоненциального роста в периодическом процессе необходим только один параметр  (или ). В первом приближении можно считать, что в этой фазе рост периодической культуры сбалансирован. Следовательно, путём изучения роста культуры клеток в реакторе периодического действия можно получить полезные данные о кинетике сбалансированного роста, если это изучение ограничено экспоненциальной фазой.

4.3 Стационарная фаза

Экспоненциальный рост заканчивается, когда одна из важных переменных процесса (например, концентрация питательного вещества или токсина) достигает значения, не обеспечивающего максимальную скорость роста клеток. Истощение запасов лимитирующего рост питательного вещества может привести к очень резкому изменению скорости клеточного роста, поскольку в экспоненциальной фазе общая скорость утилизации питательного вещества увеличивается очень быстро. Чтобы найти описывающее это явление приближенное математическое выражение, предположим, что до установления стационарной фазы скорость потребления питательного вещества А пропорциональна массовой концентрации живых клеток

                   (69)

Допустим далее, что экспоненциальный рост продолжается до тех пор, пока не установится стационарная фаза и что экспоненциальный рост начинается в нулевой момент времени, тогда

                                (70)

где х0 – массовая концентрация живых клеток в момент начала экспоненциальной фазы.

Если в нулевой момент времени концентрация  то из уравнений (69) и (70) следует, что  будет полностью утилизировано, когда

         (71)

Здесь  – массовая концентрация популяции в тот момент, когда вещество истощено и популяция переходит в стационарную фазу, следовательно,  представляет собой максимальную концентрацию биомассы в периодическом процессе.

Преобразованием уравнения (64) можно получить уравнение, выражающее максимальную концентрацию биомассы в момент истощения питательного вещества:

                  (72)

Линейная зависимость  от начальной концентрации питательного вещества а0 во многих случаях наблюдалась экспериментально
(
 часто настолько мало, что им можно пренебречь).

Рисунок 21 – Зависимость максимальной концентрации биомассы

в периодическом процессе от исходной концентрации питательного вещества, лимитирующего рост для Pseudomonas sp.

Если в культуре накапливается токсин, тормозящий скорость роста клеток (по сравнению с ростом в экспоненциальной фазе), то для описания поведения такой системы может оказаться полезным уравнение следующего типа:

,      (73)

где  – концентрация токсина.

В частном случае линейной зависимости скорости роста от  это уравнение приобретает вид

                               (74)

где  – константа.

Логично предположить, что скорость образования токсина зависит только от х и пропорциональна х

                   (75)

Поэтому  (если  при ), а уравнение клеточного роста преобразуется следующим образом:

                  (76)

Величина мгновенной эффективной удельной скорости роста  равна

    (77)

Эта величина уменьшается во времени с возрастающей скоростью, так что

,                   (78)

.                                (79)

Рост клеток прекращается, когда

.                    (80)

4.4 Фаза отмирания

Согласно уравнению (80), рост клеток прекращается только тогда, когда сt достигает значения, равного 1/b. Разведение данной среды, со-держащей токсин, или введение непитательного вещества, связывающего этот токсин, должно сопровождаться возобновлением клеточного роста и, следовательно, увеличением максимальной концентрации  биомассы xs. в стационарной фазе. Если рост сдерживается истощением питательного вещества, то разведение раствором, не содержащим питательных веществ, не влияет на xs.

Этими зависимостями можно пользоваться в качестве критериев для предварительной оценки причин снижения скорости и прекращения клеточного роста. Более точные критерии сформулировать труднее, поскольку рост популяции клеток в условиях истощения основного питательного вещества замедляется несколько раньше, чем это вещество полностью утилизируется, а скорость роста клеток в присутствии токсина может стать неизмеримо малой задолго до того момента, когда dx/dt станет равной нулю.

На рисунке 22 изображена предсказываемая теорией зависимость максимальной концентрации биомассы от исходной концентрации данного питательного вещества. Постепенное снижение концентрации питательного вещества в конце концов приводит к линейной зависимости максимальной концентрации биомассы от начальной концентрации питательного вещества. В этом случае отсутствие фазы экспоненциального роста, очевидно, вызвано недостатком питательного вещества. Напротив, повышение начальной концентрации питательного вещества может привести к тому, что величина xs в конце концов перестанет быть зависимой от а0; возможно, это объясняется накоплением токсичных веществ или влиянием другого лимитирующего клеточный рост питательного вещества.

Рисунок 22 – Взаимосвязь между начальной концентрацией

питательного вещества и минимальной концентрацией
биомассы в периодической культуре

При высоких концентрациях питательных веществ, когда они определяют максимальную концентрацию биомассы, фактором, лимитирующим концентрацию, может стать накопление токсичных веществ.

Изучая всю популяцию, мы не должны забывать о судьбе индивидуальных клеток. В общем случае популяции всегда негомогенны, и кривая роста популяции в периодическом процессе отражает лишь некоторый усредненный параметр чрезвычайно сложной системы. Во время фазы экспоненциального роста, например, некоторые клетки делятся, другие растут и созревают. Поскольку клетки разного возраста обычно имеют различные размеры и химический состав, мы можем рассматривать клетки одного возраста как некоторое «вещество». С этой точки зрения, рост одного вида микроорганизмов приводит к популяции, содержащей множество различных «веществ».

Гетерогенность популяции становится особенно заметной в стационарной фазе и фазе отмирания. Так, в стационарной фазе некоторые клетки делятся, а некоторые погибают. Мертвые клетки часто подвергаются лизису (разрушению и растворению); в результате углеводы, аминокислоты и другие компоненты клеток попадают в среду и становятся питательными веществами для живых членов популяции. Такой каннибализм способствует сохранению массы популяции в стационарной фазе. В конце концов, однако, истощение питательных веществ и накопление токсинов приводит к отмиранию всей популяции.

Фазе отмирания было посвящено сравнительно небольшое число исследований, потому что промышленные микробиологические периодические процессы заканчиваются задолго до наступления этой фазы. Обычно считается, что гибель популяции подчиняется экспоненциальному закону

     (81)

где t – время, прошедшее с начала фазы отмирания.

В основу уравнения (81) положено допущение о том, что в любое время погибает одна и та же доля живых клеток.

Одно из объяснений экспоненциального уменьшения численнос-ти популяции в фазе отмирания заключается в том, что в культуре клеток летальный исход является случайным событием и гибель данной клетки определяется только вероятностью этого события. Недостатком такого объяснения является пренебрежение историей популяции.

Дин и Хиншелвуд предположили, что в стабильной и отмирающей популяциях не только живые клетки существуют за счет отмерших, но и конкурирующие участки метаболического механизма клетки в борьбе за дефицитные промежуточные соединения также существуют один за счет другого. Если принять это предположение, можно показать, что скорость гибели клеток должна подчиняться экспоненциальному закону.


5 КИНЕТИКА ТЕПЛОВОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК И СПОР

5.1 Факторы, влияющие на гибель клеток и спор

Активность клеток, спор и вирусов в воздухе или жидких средах может снижаться в результате их разрушения (под воздействием тепла, радиации, химических агентов или механических сил), при механическом отделении (фильтрованием или центрифугированием) или за счет ингибирования (при переохлаждении, высушивании, воздействии химических реагентов). Жидкости стерилизуют в основном путем нагревания (в промышленности) или хлорирования (для бытовых нужд), а для стерилизации воздуха применяют главным образом фильтрование.

На рисунке 23 изображены результаты экспериментального изучения воздействия повышенной температуры на вегетативные клетки и споры. В общем случае клетки погибают быстрее спор. Тепловая обработка приводит также к инактивации вирусов и бактериофагов, поэтому использующаяся в микробиологической промышленности тепловая стерилизация снижает как численность популяции жизнеспособных микроорганизмов, так и концентрацию (титр) вирусов в подаваемом в реактор потоке питательных веществ.

Гибель каждой конкретной клетки обусловливается термической денатурацией одного или нескольких жизненно важных для этой клетки белков, например, ферментов. Кинетика превращений таких сложных молекул может изменяться во времени самым неожиданным образом. К тому же скорость молекулярных процессов, приводящих в конце концов к гибели клетки, зависит от состава среды, в том числе и от концентрации растворителя. Например, как показано в таблице 7, температура, при которой наступает коагуляция (денатурация с последующей интенсивной необратимой сшивкой молекул денатурированного белка) альбумина яичного белка, повышается с уменьшением содержания в системе воды.

Таблица 7 – Зависимость температуры коагуляции альбумина
от содержания воды

Показатель

Значение показателя

Содержание воды, %

50

25

15

5

0

Ориентировочная температура коагуляции, ºС

56

76

96

149

165

Эти и ряд других данных свидетельствуют о том, что в случае сравнительно обезвоженных организмов и структур (например, вирусов или спор) их инактивацию правильнее рассматривать как двухэтапный процесс, при котором сначала происходит гидратация, а затем, возможно, и денатурация. Такому механизму отвечает зависимость скорости гибели от относительной влажности, обнаруженная в случае бактериофагов. Совместное влияние нескольких инактивирующих факторов не обязательно носит аддитивный характер; так, совместные обезвоживание и тепловая обработка могут быть менее эффективными, чем можно было бы предположить, судя по эффективности каждого из этих факторов в отдельности.

а – скорость гибели клеток Escherichia coli в буферном растворе;
б – скорость инактивации вегетативных спор Bacillus subtilis;
в – скорость инактивации вегетативных спор
Вacillus stearothermophilus

Рисунок 23 – Результаты экспериментального
определения скорости тепловой гибели клеток и спор

Как уже упоминалось, популяция состоит из множества клеток различного возраста. Природа клеточной стенки и путь метаболизма зависят от возраста данной клетки и культуры в целом. Следовательно, устойчивость клеток к тепловой или другой инактивации будет зависеть от их истории, то есть от довольно неопределенного фактора, который далеко не всегда удается охарактеризовать количественно. В частности, клетки популяции, находящейся в фазе экспоненциального роста, имеют относительно проницаемые стенки, что способствует эффективному обмену растворенными веществами между внутриклеточным объемом и средой. Если эти растворенные вещества влияют на устойчивость белков, то можно ожидать, что их присутствие окажет влияние и на рост клеток в экспоненциальной фазе.

Линейная зависимость логарифма доли оставшихся в живых клеток от времени указывает на первый порядок процесса снижения численности популяции жизнеспособных клеток п

                                (82)

Отсюда следует, что при постоянном kd 

.                   (83)

Здесь n0 – концентрация спор или вегетативных клеток при t = 0. Наклон прямой полулогарифмической зависимости равен kd; график зависимости ln kd от обратной температуры также представляет собой прямую, поэтому зависимость kd от температуры может быть выражена уравнением аррениусовского типа

.      (84)

Для многих спор и вегетативных клеток величина параметра Ed лежит в диапазоне от 50 до 100 ккал/моль. Другой ранее применявшийся параметр Dr, равный 2,303/kd и называемый временем децимальной редукции (десятичным коэффициентом снижения численности популяции), представляет собой не что иное, как время, в течение которого численность популяции жизнеспособных клеток снижается в 10 раз.

Приведенные выше кинетические уравнения справедливы только при том условии, что количество спор или клеток в популяции достаточно велико. По мере снижения числа клеток или спор (n) вероятность отклонений от величин, предсказываемых указанными уравнениями, возрастает, поскольку, например, при нормальном распределении стандартное отклонение возрастает пропорционально 1/n. Из предыдущего уравнения детерминистической модели следует, что оставшаяся жизнеспособной доля популяции (если допустить, что в данных летальных условиях роста клеток не происходит) определяется уравнением

.    (85)

Если судьба каждого организма не зависит от других организмов, если организмы не самовоспроизводятся и если летальные условия одинаковы для каждого организма, то стохастический анализ процесса стерилизации показывает, что вероятность наличия в популяции N жизнеспособных организмов в любой момент времени t равна

,    (86)

(! – факториал, ).  

Здесь N0численность жизнеспособных организмов в стерилизуемой жидкости непосредственно перед началом стерилизации.

В этом уравнении параметр kd имеет тот же смысл, что и константа скорости в уравнении (82); в стохастической модели kd можно интерпретировать как величину, обратную средней продолжительности жизни организма. По мере того как число организмов снижается до некоторой сравнительно малой величины, допущение о гомогенной популяции, достаточно полно описываемой одним параметром kd, становится все менее и менее обоснованным. То есть, небольшая доля популяции отличается повышенной устойчивостью к тепловой обработке.

Иногда допускается, чтобы после стерилизации остается довольно значительное количество жизнеспособных организмов (так, в пастеризованном молоке высшего качества концентрация живых бактерий не должна превышать 30000 клеток в 1 мл). В других ситуациях, например при выращивании чистых культур, к стерилизации предъявляются значительно более жесткие требования. В таких случаях важно оценить вероятность гибели популяции, то есть вероятность инактивации всех организмов. Подставляя в уравнение (87) N = 0, получаем

.    (87)

Отсюда следует, что вероятность выживания по меньшей мере одного организма составляет

     (88)

Обычно N0>>1, поэтому

                  (89)

где

     (90)

Величину (1P0(t)) можно интерпретировать как долю стерилизаций, которые не должны приводить к полной гибели всех организмов.

В клетке имеется несколько альтернативных путей усвоения энергии и осуществления биосинтеза. Поэтому повышаются шансы организмов выжить в неблагоприятных условиях.

Самый простой подход к анализу популяции из т различных типов клеток (спор или вирусов) также сводится к допущению о независимости видов организмов; тогда суммарная популяция жизнеспособных организмов будет равна сумме индивидуальных популяций, выражаемых уравнениями типа (83) с соответствующими индивидуальными коэффициентами kdi

                               (91)

График этой зависимости в полулогарифмических координатах не должен представлять собой прямую. Значения индивидуальных параметров kdi не всегда известны; некоторые методы оценки верхнего и нижнего пределов значений n(t)/n0 по начальным данным обсуждены Хатчинсоном и Лассом. Достоверность таких оценок зависит от точности исходных данных о гибели популяции и требует определения второй производной d2n/dt2 при t = 0.

Задача 8. Кинетика инактивации и гибели клеток; хлорирование. Предложено несколько уравнений, описывающих скорость инактивации или гибели клеток; одним из первых уравнений предусматривалось экспоненциальное снижение во времени численности активных спор возбудителя сибирской язвы в присутствии 5 %-ного фенола. Соответствующее уравнение инактивации часто называют законом Чика

                  (92)

Применялись и другие математические модели

                               (93)

     (94)

а) Проинтегрируйте каждое из приведенных уравнений; покажите, какую форму будут иметь кривые соответствующих графических зависимостей.

б) В таблице 8 приведены данные, отражающие зависимость степени инактивации популяции Е. coli от времени и концентрации хлора. Соответствуют ли эти данные какому-либо из приведенных выше урав-нений?

Таблица 8 – Зависимость скорости инактивации клеток E. coli от

концентрации хлора и времени экспозиции (рН 8,5; 2–5 °С);

указана доля (в %) клеток, сохранивших жизнеспособность

Концентрация хлора, мг/л

Длительность экспозиции, мин

0,5

2

5

10

20

0,14

52

11

0,7

0,07

80

56

30

0,5

0

0,05

92

85

65

21

0,31

5.2 Критерий стерилизации

Если процесс стерилизации осуществляется при различной температуре (несколько этапов процесса) и, следовательно, различных значениях удельной скорости гибели  то интеграл для выражения удельной скорости гибели можно записать следующим образом:

(95)

или

(96)

где  – количество живых микроорганизмов перед стерилизацией (при ).

Ф.Х. Дейндорфер и А.Е. Хемфри предложили левую часть этого уравнения обозначить  (набла) и назвать критерием стерилизации. При постоянной температуре  критерий стерилизации будет равен

     (97)

Чтобы рассчитать эффективность принятого режима стерилизации, следует взять из таблицы 9 значение  которое обычно устанав-ливается по экспериментальным данным для наиболее термоустойчивого эталонного микроорганизма – Bacillus stearothermophilus 1518 – в зависимости от температуры.

Таблица 9 – Зависимость удельной скорости гибели клеток и критерия стерилизации от температуры

ºС

мин-1

или

ºС

мин-1

или

100

0,013

0,013

122

2,440

11,825

101

0,017

0,030

123

3,075

14,900

102

0,023

0,053

124

3,765

18,665

103

0,030

0,083

125

4,570

23,235

104

0,036

0,119

126

5,9

29,13

105

0,038

0,167

127

7,4

36,53

106

0,062

0,229

128

9,3

45,88

107

0,083

0,312

129

11,7

57,58

108

0,109

0,421

130

14,8

72,38

109

0,135

0,556

131

16,6

88,98

110

0,163

0,719

132

18,6

107,58

111

0,193

0,912

133

23,4

130,98

112

0,234

1,146

134

29,5

160,48

113

0,302

1,448

135

37,2

197,68

114

0,412

1,860

136

46,8

244,48

115

0,540

2,400

137

59,0

298,48

116

0,653

3,053

138

74,2

377,68

117

0,810

3,863

139

93,5

471,18

118

1,002

4,865

140

104,8

474,98

119

1,210

6,075

141

118,0

693,98

120

1,480

7,550

142

148,0

841,98

121

1,830

9,385

143

Для расчёта и обоснования режима стерилизации при неизотермических условиях реального производства используют приближенный метод Т. Ричардса. Метод предполагает учитывать критерии стерилизации при нагревании стерилизуемого объекта (), выдерживания его при температуре стерилизации () и охлаждения ().

Обрабатывая многочисленные экспериментальные данные, Т. Ричардс отмечает, что обработка при температуре ниже 100 ºС малорезультативна и составляет около 2 % общего критерия стерилизации. Был проведён расчёт критерия стерилизации  и  в интервале от 100 до 125 ºС при прогрессировании температуры обработки 1 ºС в минуту. Позднее Д. Уэнга с сотрудниками рассчитали значения критерия стерилизации для температуры 143 ºС, то есть для таких температур, которые используются в настоящее время при стерилизации.

Если темп нагревания или охлаждения отличается от принятого при составлении таблицы (1 ºС за 1 мин), то для расчёта действительного критерия стерилизации можно использовать соотношение


(98)

где   – табличное значение;

t – длительность изменения температуры от 100 ºС до

– температура стерилизации, ºС.

Эффект стерилизации определяется по сумме критерия стерилизации

(99)

Число оставшихся жизнеспособных клеток будет рассчитываться так:


(100)

Задача 9. Режим стерилизации. Объём стерилизуемой среды V = 1 м3, нагревание ведётся от температуры 100 ºС до = 125 ºС в течение мин (1 ºС в мин), выдерживание при температуре  125 ºС составляет мин, охлаждение от 125 до 100 ºС, Концентрация спорового материала в среде С = 105 ед./ мл. Обеспечивает ли выбранный режим стерилизацию объекта?


6
НЕСТРУКТУРИРОВАННЫЕ МОДЕЛИ
КЛЕТОЧНОГО РОСТА В ПЕРИОДИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

6.1 Построение логистической кривой

В простейшем подходе к моделированию роста культуры клеток в периодическом процессе мы допускаем, что скорость роста клеточной массы во времени является функцией одной лишь клеточной массы, то есть

= f (x).             (101)

Из этого уравнения не следует, что можно пренебрегать любыми изменениями, происходящими в ходе клеточного роста в среде. Одной из простейших моделей типа (101) является закон Мальтуса, который математически можно выразить следующим образом:

f(x)=µx,                          (102)

где µконстанта.

Таким же образом выражается показанная выше закономерность накопления клеточной массы в фазе экспоненциального роста. Предсказание Мальтуса о неизбежности рокового конца человечества в результате неконтролируемого роста народонаселения не оправдалось, так же и в случае популяций микроорганизмов вслед за фазой экспоненциального роста наблюдается переход к стационарной популяции. Эта теория получила дальнейшее развитие в работах Ферл-Хурста (1844 г.), а также Перла и Рида (1920 г.), которые при анализе роста популяции стали учитывать ингибирующий фактор. Допустив, что
ингибирование пропорционально
х2, эти исследователи предложили уравнение

0.  (103)

Это выражение представляет собой уравнение Риккати, его интегрирование приводит к уравнению логистической кривой

                 (104)

Как показано на рисунке 24, логистическая кривая имеет
S-образную форму и приводит к стационарной популяции с максимальной  концентрацией  биомассы  хs = 1/.

Рисунок 24 – Логистическая кривая (k0; 0)

Одно из возможных объяснений логистической кривой сводится к допущению, что скорость продуцирования токсина пропорциональна скорости роста популяции

                             (105)

Если

ct(0) = 0,    (106)

то

ct = α(xx0).                                 (107)

Обычно х0 пренебрежимо мало по сравнению с х; в таких случаях подстановка уравнения (107) в (70) приводит к уравнению типа (103).

В основу неструктурированных моделей другого типа, описываю-щих приближающиеся к стационарному состоянию популяции, положен принцип истощения лимитирующего рост питательного вещества. Если допустить, что µ= µ(s), как и при выводе уравнения Моно, и что общий экономический коэффициент Ух/s постоянен, то уравнения материального баланса для питательного вещества и клеточных веществ можно объединить в одном уравнении типа (101) (см. задачу 10).

Недостатком логистического уравнения является пренебрежение фазой снижения массы (численности) популяции после того, как стационарная популяция исчерпала все свои ресурсы. Этот фактор учтен в модели, разработанной Вольтеррой. В модели Вольтерры уравнение (102) дополняется интегральным членом (108)

                                     (108)

Физический смысл выражения (108) в первом приближении можно интерпретировать как влияние истории популяции K(t,r) на скорость ее роста. Выражение (108) отражает зависимость скорости роста во время t от всех предыдущих значений плотности популяции. Если К не зависит от t, то выражение (108) можно рассматривать как отражение влияния компонента культуры, изменение концентрации которого подчиняется закону

               (109)

Предположим, что К постоянно и равно К0, и дополним уравнение (103) выражением (99), отражающим предыдущую историю популяции. Тогда изменение массы или плотности популяции во времени можно описать следующим уравнением

               (110)

В соответствии с уравнением (110) К0 для ингибитора имеет отрицательное значение, а для соединения, промотирующего клеточный рост, – положительное. Это уравнение можно решить численно; пример такого решения приведен на рисунке 25.

Рисунок 25 – Решение уравнения Вольтерры при различных
значениях параметра
, отражающего историю популяции клеток

При отрицательных К0 масса популяции достигает максимума и затем уменьшается.

Описанные выше неструктурированные модели клеточного роста имеют несколько недостатков. В частности, в них не находит отражения лаг-фаза, не учтены влияющие на рост клеток различные переменные, а также данные о метаболизме клетки и его регуляции. В последующих разделах мы попытаемся найти связи между сложной биохимией клетки и явлениями, наблюдаемыми при росте популяции в периодическом процессе.

Задача 10. Кинетика ингибирования. Если рост микроорганизма ингибируется летучим продуктом его жизнедеятельности (например, этанолом), то скорость роста клеток можно повысить за счет постоянного вакуумирования пространства над культуральной жидкостью.

а) Покажите, что для периодического процесса, описываемого уравнением (54), временная зависимость концентрации субстрата для суммарной реакции S  0,3P + клеточная масса выражается уравнением

  µmax ,  (111)

где х  концентрация биомассы (г/л).

Экономический коэффициент Ух/S считайте постоянным.

б) Путем интегрирования приведенного выше уравнения найдите выражение, определяющее отношение х(t)/xt(t), где х и xi  концентрации биомассы в отсутствие и в присутствии ингибитора соответственно.

в) Определите отношение х(t)/xi(t) (см. пункт б) при х0=10-6 г/мл, Ух/S=0,1 г клеток/г субстрата, Ks=0,22 г/л, µmax= 0,408 ч-1, КI=16 г/л для двух концентраций субстрата: s0 = 5,0 г/л и s0 = 70 г/л (примите, что молекулярная масса S втрое больше молекулярной массы Р).

6.2 Рост филаментозных организмов

В предыдущих разделах настоящего раздела мы рассматривали популяции микроорганизмов, в которых увеличение биомассы сопровождается повышением числа клеток. По-другому складывается ситуация при росте плесневых грибов и других филаментозных организмов; здесь по мере роста культуры изменяется как масса, так и морфология гранул или суспензии плесени. Экспериментальное изучение роста погруженных культур в периодических процессах показало, что количество биомассы возрастает во времени не экспоненциально, а с меньшей скоростью, так что масса популяции приблизительно пропорциональна третьей степени времени. Чтобы объяснить эту зависимость, нужно начать изучение с одно- и двумерных культур плесневых грибов. В случае одномерной культуры скорость увеличения длины колонии остается постоянной во времени, а для культур плесеней на поверхности (двумерных) характерна постоянная скорость увеличения радиуса культуры.

Экстраполируя эти результаты на сферическую гранулу, растущую в погруженной культуре, предположим, что

   (112)

где Rрадиус гранулы. Поскольку биомасса М равна

,                 (113)

то из уравнений (112) и (113) следует, что

               (114)

Подставляя в уравнение (114) значение R из уравнения (113), получим

                (115)

где

.                 (116)

Интегрирование уравнения (115) при начальной биомассе М0 дает

                (117)

Поскольку М0  по сравнению с М обычно очень мало, то уравнение (117) cвидетельствует об упоминавшейся выше пропорциональной зависимости М от t3.

Полный анализ роста филаментозного организма должен учитывать также кинетику образования гранул. Последние возникают в результате агломерации спор и последующего роста или в результате разрастания отдельной споры.  Имеющиеся данные показывают, что на образование гранул влияют самые различные свойства организма и среды (рисунок 26).

Общая модель кинетики образования гранулы пока еще не разработана, поскольку сложные механизмы этого явления недостаточно изучены и не вполне понятны.

Рисунок 26 – Факторы, определяющие образование гранулы (а)
и ее структуру (
б) в процессе роста мицеллярных организмов

При анализе роста уже образовавшихся гранул описанная модель может рассматриваться только в качестве очень грубого приближенного описания. На кинетику роста гранул должны оказывать влияние их размер, морфология и внутренняя структура, а эти факторы в свою очередь определяются совокупностью таких параметров, как интенсивность перемешивания, концентрация гранул, свойства организма и состав среды. Кинетика роста гранул часто зависит и от взаимосвязей типа диффузия – реакция.

7 СТРУКТУРИРОВАННЫЕ МОДЕЛИ
КИНЕТИКИ КЛЕТОЧНОГО РОСТА

7.1 Общие принципы  построения

Неструктурированные модели описывают только количество био-логической фазы. Такие модели не учитывают и никоим образом не отражают состав биофазы, то есть то, что можно назвать ее качествен-ными характеристиками. Если в процессе роста существенно изменяется состав клеточной популяции и если это изменение влияет на кинетику клеточного роста, то анализ таких систем возможен только с помощью структурированных моделей. Поскольку ни в одной модели практически невозможно учесть  материальные балансы всех компонентов клетки, то при создании структурированной модели (по необходимости приближенной) мы, очевидно, должны тщательно отобрать ключевые переменные и процессы, играющие важнейшую роль в планируемом применении этой модели. Как мы покажем на ряде примеров в следующих разделах, структурированные модели могут быть постро-ены на основе различных концепций.

В структурированных моделях в качестве переменных биофазы обычно применяются массовая (xj) или молярная (сj) концентрации в единице объема биофазы. При условии полного перемешивания уравнение материального баланса по компоненту j можно записать в следующем виде:

x                (118)

где   с – плотность клеток, равная массе клеток в единице объема клеток;

rfj – молярная скорость образования компонента  j [(число молей j)  (время)-1(единица объема клеток)-1];

Фх  масса клеток, вводимых в реактор в единицу времени;

VR  объем культуры;

х концентрация клеточной массы [(масса клеток)(единица объема культуры)-1];

сj  (число молей j)(единица объема клеток)-1.

В последнем слагаемом уравнения (107) принимается, что вводимые в реактор (например, в рецикле) или выводимые из реактора клетки находятся в том же состоянии, что и популяция клеток в реакторе. Если это условие не выполняется (например, во втором или одном из последующих реакторов в каскаде ПРПП), то уравнение баланса должно быть соответствующим образом модифицировано.

Если допустить, что плотность клеток с и объем культуры VR не изменяются во времени, то после дифференцирования уравнения (118) получим

=  -     (119)

Для реактора периодического действия Фх равно нулю, а выражение в скобках в правой части уравнения (119) есть не что иное, как удельная скорость роста µ, следовательно, для этого случая уравнение (119) преобразуется следующим образом:

 =  - .                                        (120)

Физический смысл  ясен; выражение -µсj отражает снижение концентрации, обусловленное разведением в процессе роста популяции клеток. Оценка правой части уравнения (119) для ПРПП при стерильности питательных веществ опять приводит к уравнению (120).

7.2 Компартментальные модели

В простейших структурированных моделях предусматривается компартментация биомассы в небольшом числе компонентов. Иногда эти компоненты имеют приближенное биохимическое толкование, например, синтетический компонент (РНК и предшественники) и структурный компонент (ДНК и белки). Компартменты могут быть также определены как ассимилирующий компонент и синтетический компонент. В другой интерпретации при создании простых компартментальных моделей используется понятие об узких местах метаболизма.

На рисунке 27 схематично изображены некоторые модифициро-ванные варианты описанной выше модели. В двухкомпартментальной модели Хардера и Роуэлса компонент G соответствует ферментам, которые катализируют превращение субстрата в промежуточные соединения, использующиеся при построении биополимеров; составные части клетки характеризуются компонентом К, который образуется из питательного вещества S со скоростью, зависящей от количества G.

В этой простой двухкомпонентной клетке взаимопревращение G и К путем полимеризации и деполимеризации отвечает состоянию метаболизма поддержания. Составные части трехкомпонентной клетки (рисунок 27) характеризуются более четко определенной биохими-ческой природой; здесь К обозначает РНК, G – белок, а R – другие компоненты биомассы. В последнем случае метаболизм поддержания также отражен как кругооборот компонентов К и G.

Рисунок 27 – Схемы двух- и трехкомпартментальных

моделей, описанных Хардером и Роуэлсом

Эти компартментальные модели относительно просты математически и содержат небольшое число кинетических параметров. Их можно применять для описания различных состояний несбалансированного клеточного роста. С другой стороны, отсутствие в ряде случаев четкого биохимического определения компонентов затрудняет оценку модели и задачу нахождения параметров. При работе с такими моделями мы не можем воспользоваться известными нам данными о путях метаболизма клетки, регуляции молекулярных процессов и закономерностях клеточного цикла. Эти данные можно применять для моделирования кинетики клеточного роста, только располагая глубоко структурированной моделью клетки, в которой учитывалось бы значительно большее число компонентов, внутриклеточных реакций и взаимодействий.

Уильямc предложил двукомпартментальную модель, которая уди-вительно точно описывает некоторые стороны динамики клеточного роста в периодическом процессе. Основные постулаты этой модели формулируются следующим образом.

  1.  Синтетический компонент (1) продуцируется  в  результате поглощения внешнего питательного вещества S с экономическим  коэффициентом У (отношение массы компонента 1 к массе субстрата).
    Реакция образования синтетического клеточного компонента имеет первый порядок по общей плотности клеток
    х (отношению клеточной массы к объему культуры) и по массовой концентрации питательного вещества (отношению массы субстрата к объему культуры).
  2.  Структурно-генетический компонент клетки (2) продуцируется из компонента 1 со скоростью, пропорциональной 12 (i – отношение массы i к единице объема клеток).
  3.  Для деления клетки необходимо и достаточно удвоение компонента 2. Следовательно, численная плотность клеток пропорциональна концентрации компонента 2 в культуре.
  4.  Биомасса построена только из компонентов 1 и 2.

Для реактора периодического действия при условии полного перемешивания эти же постулаты можно выразить в математической форме

      (121)

       (122)

     (123)

      (124)

Принимая во внимание, что

                 (125)

и

+                  (126)

Уравнение (124) можно записать в следующей форме:

s                (127)

где f2= 2/c представляет собой долю клеточной массы, состоящей из компонента 2. С помощью двух уравнений этой модели s можно выразить через х. Если таким путем преобразовать уравнение (122), то мы получим выражение, по форме совпадающее с уравнением (103). Следовательно, изменение х будет подчиняться логистическому уравнению типа (104).

Предложенный Уильямсом подход применялся для моделирова-ния роста популяции клеток в периодическом процессе с использованием инокулята, находящегося в стационарной фазе в среде с истощен-ным питательным веществом, что соответствует 1 = 0. Полученные таким путем результаты приведены на рисунке 28.

Рисунок 28 – Моделирование роста популяции клеток
с использованием инокулята, находящегося
в стационарной фазе, по Уильямсу

Ординаты показывают измерение во времени безразмерных
параметров: концентрация субстрата (
s/s0), концентрации биомассы (x/Y s0), численности популяции (f2 x/Y s0). Здесь отражено также изменение во времени относительной массы клетки (-1+1/f2). Параметры: k1=0,0125; k2c=0,025; Y=0,5; x0=0,05; s0=1,0; f2(0)=1.

Эти результаты хорошо воспроизводят некоторые часто наблюдаемые на практике особенности роста культур микроорганизмов в периодическом процессе, включая:

  1.  Лаг-фазу, в течение которой возрастают размеры клеток.
  2.  Фазу экспоненциального роста, в которой размер клеток достигает максимума.
  3.  Изменения в составе клеток в цикле роста. Поскольку такие изменения происходят даже в экспоненциальной фазе, отсюда следует, что рост клеток идеально не сбалансирован ни в одной из фаз роста.
  4.  Стационарную фазу с относительно небольшими клетками.

Изменения во времени плотности популяции по массе и по численности клеток непропорциональны; иными словами, масса индивидуальной клетки зависит от скорости роста и даже от предыстории скорости роста. Аналогичные результаты были получены в ходе детального изучения роста популяций Еscherichia coli и Saccharomyces cerevisiae. Приведенные данные свидетельствуют о том, что динамику изменений клеточной массы часто можно описать с достаточно хорошим приближением относительно простыми математическими моделями, а расчеты динамики численности популяции более сложны.

Задача 11. Структурированная модель клеточного роста Уильямса. По Уильямсу разделим биомассу на две части. В первую часть включим промежуточные соединения, ферменты и другие компоненты, участвующие в образовании структурного и генетического материала клетки; это будет эквивалентом синтетической части биомассы в модели Уильямса. Вторую часть составит структурный и генетический материал биомассы. Предположим, что доли первой и второй частей биомассы составляют f1 и  f2 от общей биомассы; сумма f1 и  f2 равна единице.

Запишем уравнения модели в собственной форме

= ,     (128)

= ,     (129)

где

                             (130)

α  количество синтетической части  биомассы, образующейся при утилизации одной единицы массы лимитирующего скорость роста субстрата;

  количество структурной (генетической) биомассы, образующейся при утилизации одной единицы массы синтетической биомассы.

а)  Рассмотрим сбалансированный рост, при котором f1 = f2 = 0; такое состояние может быть достигнуто в том случае, если s будет постоянным достаточно длительное время. Каким образом µ зависит от s в состоянии сбалансированного роста?

б) Покажите, что модель Моно будет приближенно соответствовать состоянию сбалансированного роста, если К21 и k2 αk1К2. Чему в этом случае будут равны f1 и  f2?

в) Пусть x1 cf1 и x2 cf2, где с = x1+ x2. Напишите дифференциальные уравнения для x1, x2 и s, описывающие систему хемостата.
Напишите также дифференциальные уравнения для плотности популяции
n, примите, что постоянно (количество структурного (генетического) материала в клетке).

г) Постройте графики зависимостей lgс и lgn от t и  (средний размер клеток = с/n) от t для клеточного роста в периодическом процессе при двух различных начальных значениях f1 / f2 = 0,40 и
f1= 0,05. И в первом, и во втором случае примите, что с0 =  210-3 г/л и s0 = 5,0 г/л. При построении используйте следующие константы: α = =  = 0,50; k1 = 6,0 ч-1; k2 = 3,0 ч-1; К1.= 0,20 г/л; К2.= 0,25 г/л; масса клетки 1,110-13 г.

д) С помощью параметров, перечисленных в пункте (г), постройте график, отражающий изменение µ в зависимости от s для состояния сбалансированного роста. На том же чертеже постройте график зависимости µ от s в соответствии с уравнением Моно. Константы µm и Кs
в уравнении Моно подберите таким образом, чтобы µ асимптотически приближалось к постоянной величине при больших значениях s и чтобы производная µ по s при s = 0 имела бы одно и то же значение и в модели Моно, и в общей модели.

е) Постройте графики зависимости с, s и  от скорости разведения для стационарного хемостата при sf = 5,0 г/л.

ж) Как будут меняться с1, s и  при «сдвиге» условий в хемостате от D = 0,1 ч-1 до D = 0,3 ч-1 и от D = 0,3 ч-1 до D = 0,1 ч-1 ? Примите, что «сдвигу» предшествует стационарное состояние сбалансированного роста.

7.3 Метаболические модели

По мере включения в модель все большего числа биологических деталей она становится более специфичной для определенного организма или процесса. При создании метаболической кинетической модели определенной системы необходимо учитывать ключевые детали метаболизма, иногда известные из научных данных или биотехнологической литературы. При этом, чем более детализированной становится наша модель, тем больше мы должны знать об изучаемом организме
a priori. В противном случае, задача выбора кинетических уравнений и значений параметров становится слишком неопределенной, причем неизвестные параметры модели нельзя определить на базе имеющихся (ограниченных) экспериментальных данных. Хотя некоторые из описываемых здесь и других высокоструктурированных моделей, которые мы обсудим позднее, относятся к индивидуальной клетке, обычно принимаемый детерминистический принцип предполагает описание поведения усредненной клетки в большой популяции клеток.

Сначала мы изучим метаболическую модель, разработанную Бийкерком и Холлом, а также Памментом, Холлом и Барфордом для аэробного роста почкующихся дрожжей S. cerevisiae. В основу этой модели положены перечисленные ниже допущения, большая часть которых соответствует известным данным о закономерностях клеточного цикла, метаболизма и регуляции экспрессии ферментов организма.

Принятые в модели допущения

1. Индивидуальные изолированные клетки не рассматриваются.

2. Лимитирующий рост клеток, субстрат S является одновременно источником углерода и энергии; символом Е обозначен этанол.

3. Биомасса состоит из двух частей, А и В.

4. Масса А обеспечивает поглощение субстрата и снабжение клетки энергией,  масса В  синтез клеток и их деление.

5. Накопление энергии и продуктов метаболизма происходит в ходе фазы G1 клеточного цикла, осуществляется массой А и описывается превращением массы А в массу В  уравнения (131) и (132).

Репликация ДНК, митоз и деление клеток (фазы S, G2 и М) происходят в течение определенного времени, осуществляются массой В и описываются превращением массы В в массу А  уравнение (133).

7. Все участвующие в процессе брожения ферменты сгруппированы и обозначены символом Ef. Аналогично сгруппированы все ферменты дыхательного пути, обозначенные Еr.

8. В каждой ферментной системе биосинтез ферментов регулируется двумя различными путями. Во-первых, ферменты продуцируются со скоростями, пропорциональными интенсивности потока метаболитов, проходящего через эту ферментную систему. Во-вторых, ферменты каждой системы продуцируются еще и в процессе адаптации клетки к изменяющимся условиям; здесь скорость их биосинтеза пропорциональна разности между имеющейся концентрацией фермента и «контрольной» величиной (eF и eR для процессов брожения и дыхания соответственно). «Контрольные» концентрации ферментов пропорциональны интенсивности потока метаболитов, который был бы достигнут при нелимитирующих концентрациях ферментов.

9. Скорости гликолиза и дыхания линейно зависят от ef /eF и от
еr /еR  соответственно.

10. Гликолитические ферменты продуцируются в результате работы дыхательного пути (таким путем образуются ферменты для глюконеогенеза, биосинтеза и утилизации внутриклеточных резервных углеводов).

В таком виде клеточный рост можно описать с помощью следующих стехиометрических уравнений (здесь и далее индексами W обозначены переменные, выраженные в единицах массы; в других случаях подразумевается число молей или единиц активности для ферментов).

Брожение

                             (rA)

AW + a1SW + Ef    2BW + a2EW + Ef + CO2  (131)

Дыхание

                     (rB)

AW + a3EW + O2 + Er+ Ef    2BW + Er + Ef + CO2 (132)

Деление

                                 rC

BW    AW    (133)

Скорости rA, rB, rC  можно выразить следующими уравнениями:

=                  (134)

=                  (134)

rC = Kb.    (135)

«Контрольные» концентрации ферментов равны

eR = (136)

eF=                                 (137)

Скорости биосинтеза ферментов систем брожения и дыхания принимаются равными соответственно

(rf)ферм. брож = rA +k5rC + k4(eF  ef ),   (138)

(rf)ферм. дых = rВ+k6(eR  er).   (139)

В этих уравнениях символами er и ef  обозначены активности ферментов в единице объема культуры. Следовательно, такая структурированная модель основана не на «собственных», или внутриклеточных, концентрациях.

Путем сравнения результатов моделирования и экспериментальных данных по росту культуры дрожжей в периодическом процессе были определены параметры модели, значения которых приведены в таблице 10.

Таблица 10 – Параметры математической модели роста

Saccharomyces cerevisiae в аэробных условиях

Параметры

Величина

Параметры

Величина

a1

5,95 г/г

Ks

0,50 г/л

a2

2,50 г/г

KE

0,02 г/л

a3

1,50 г/г

k4

0,00 ч-1

k1

5,00 ч-1

k5

0,75 ч-1

k2

0,26 ч-1

k6

0,255 ч-1

K

0,50 ч-1

k7

1,33 ч-1

kf

2,37 ч-1

sf

9,20 г/л

kh

0,244 ч-1

Значения kf  и kh вычислены по другим параметрам модели.

Применение этой кинетической модели к экспериментам по росту непрерывной культуры в стационарном состоянии потребовало незначительного изменения (от 1,79 до 1,50 в периодическом и непрерывном процессах соответственно) только одного параметра аз  экономического коэффициента роста за счет дыхания. Причиной его изменения отчасти послужила известная физиология этого организма, в частности, необходимость глюконеогенеза при росте периодической культуры на этаноле и отсутствие такой необходимости при росте проточной культуры на глюкозе в ПРПП.

Адекватность выбранной математической модели проверяется по сходимости рассчитанных в ней величин и полученных экспериментальных данных при нанесении их на графики (рисунки 29а, б, в).

На рисунке 29а изображены графики зависимости плотности клеточной массы х (х=а + b) и удельных активностей ферментов брожения (ef /x) и дыхания (еr /х) от скорости разведения для случая роста непрерывной культуры S. cerevisiae в стационарном состоянии; эти зависимости вычислены с помощью параметров, перечисленных в таблице 10. Зачерненными квадратиками на этом рисунке обозначены результаты экспериментального определения х, хорошо согласующиеся с расчетными данными.

Зависимость х от D как для экспериментальных, так и для расчетных данных резко отличается от аналогичной упрощенной зависимости, полученной на базе неструктурированной модели Моно (см. рисунок 6) На рисунке 29б приведены результаты экспериментального определения зависимости удельной активности двух ферментов, участвующих в метаболизме брожения (NADP+-глутаматдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы) от скорости разведения в ПРПП. Эти зависимости качественно согласуются с расчетными данными для ef /x модели. На кривой зависимости удельной активности двух участвующих в дыхании ферментов (малатдегидрогеназы и изоцитратлиазы) от скорости разведения экспериментально обнаружен максимум (рисунок 29в); модель предсказывает наличие максимума в зависимости еr /х от D.

а  рассчитанные путем моделирования зависимости плотности
клеточной массы
х ( кривая) и удельных активностей ферментов ef  /x
и еr /х (--- кривые) от скорости разведения D -1) для случая роста
непрерывной культуры
S. cerevisiae в стационарном состоянии в ПРПП, зачерненными квадратиками  результаты экспериментального определения x; б – результаты экспериментального определения удельных активностей ферментов брожения,
NADP+-глутаматдегидрогеназы (GluDHNADP+)
и алкогольдегидрогеназы (
ADH); в  результаты экспериментального определения удельных активностей ферментов малатдегидрогеназы (MDH) и изоцитратлиазы (ICL), участвующих в дыхании

Рисунок 29 – Метаболическая модель аэробного
роста
непрерывной культуры S. cerevisiae
в стационарном состоянии в ПРПП

Эти результаты, как и ряд других, убедительно демонстрируют некоторые из преимуществ, свойственных более структурированному описанию роста популяции клеток. Рассматриваемая модель успешно применялась для описания периодического роста S. cerevisiae с добавлением субстрата, она также хорошо отражает лаг-фазу в экспериментальных периодических процессах.

В качестве завершающего примера рассмотрим разработанную Шулером и сотрудниками модель индивидуальной клетки Еsсherichia. coli; из всех предложенных до настоящего времени моделей роста микроорганизмов она наиболее удачна и высокоструктурирована. На рисунке 30 схематично изображены учитываемые в этой модели метаболиты, биополимеры и реакции, осуществляющиеся, как предполагается, в клетке Е. coli В/г А. Прерывистыми линиями здесь обозначены информационные потоки, регулирующие кинетику реакций. В модель включены реакции образования клеточной оболочки, поэтому продолжительность клеточного цикла является величиной, предсказываемой моделью, а не исходным параметром, как в большинстве других структурированных моделей. Поскольку эта модель разрабатывалась специально для описания роста клеток в условиях ограниченного количества источника углерода или азота, в ней учтены многие структурные элементы клетки, участвующие в транспорте и ассимиляции этих веществ. Приведенные на рисунке 30 реакции учитывают также синтез и утилизацию АТР.

На рисунке 30 не показаны важные детали модели, связанные с регуляцией инициации синтеза ДНК. В течение очень короткого периода («взрывной синтез») синтезируется белок-репрессор RP; он нейтрализуется белком-антирепрессором ARP, который синтезируется со скоростью, пропорциональной скорости построения клеточной оболочки. При достаточно низкой концентрации RP начинается транскрипция, которая приводит к короткому участку РНК, необходимому для инициации репликации.

Эта модель включает около 100 стехиометрических и кинетических параметров; почти все эти параметры могут быть определены на основе опубликованных результатов изучения биохимии Е. coli. Насколько велика информация, вложенная в эту модель, настолько же велики и ее возможности. Модель достаточно точно описывает время инициации репликации хромосомы и другие важнейшие особенности клеточного цикла в широком диапазоне скоростей роста.

A1ион аммония; A2глюкоза (и соединения, образующиеся
из нее в клетке);
Wконечные продукты (СО2, Н2О и ацетат)
энергетического обмена, выделяемые в процессе аэробного роста;
P1аминокислоты; Р2рибонуклеотиды; Рздезоксирибонуклеотиды; Р4предшественники клеточной оболочки; M1белки (как
в цитоплазме, так и в клеточной оболочке);
M2RT1незрелая
«стабильная» РНК;
M2RTMзрелая «стабильная» РНК (рРНК и тРНК;
во всех случаях принимается, что рРНК составляет
85 %);
Мматричная РНК; М3ДНК; М4небелковая часть клеточной
оболочки (принимается, что она содержит пептидогликанов
16,7 %,
липидов
47,6 % и полисахаридов 35,7 %); М5гликоген; PGppGpp;
Е
ферменты, участвующие в превращении Р2 в Р3; Е2, Е3 соединения, участвующие в образовании клеточной оболочки и регуляции синтеза
ее компонентов;
GLNглутамин; Е4глутаминсинтетаза;
*
вещества, находящиеся вне клетки

Рисунок 30 – Высокоструктурированная модель роста

индивидуальной клетки Еsсherichia. сoli В/г А на среде,
содержащей глюкозу и соли аммония

На рисунке 31 приведены графики зависимости в двойных обратных координатах удельной скорости роста отдельной клетки от концентрации лимитирующего рост питательного вещества (в данном случае иона аммония), полученные экспериментально (точки) и расчетным путем на базе описанной модели (сплошная линия).

Здесь и результаты моделирования, и экспериментальные данные свидетельствуют о существовании нескольких механизмов утилизации иона аммония; это проявляется в изменении наклона при очень больших концентрациях питательного вещества (малых величинах 1/s).

Вычисленные путем моделирования закономерности изменения скорости клеточного роста, содержания в клетке гликогена и размера клетки (рисунок 32) хорошо согласуются с экспериментальными результатами. Рассмотренная нами ранее модель Уильямса предсказывает увеличение размеров клеток при высоких скоростях роста; в отличие от нее описываемая высокоструктурированная модель, учитывающая гораздо большее число биохимических особенностей и деталей  метаболизма клетки, показывает, что размер клеток зависит не только от скорости их роста, но и от того, какое питательное вещество лимитирует скорость роста.

Приведены расчетная кривая (1) изменения объема клетки при лимитируемом глюкозой росте (2, 3экспериментальные данные); то же (4) при лимитируемом ионом аммония росте (5 экспериментальные данные); расчетная кривая (6) изменения процентного содержания гликогена (7  экспериментальные данные).

сплошная линия модельные расчеты;

жирные точкиэкспериментальные данные

Рисунок 31 – Зависимость удельной скорости лимитируемого источником азота роста Еsсherichia. сoli В/г А от концентрации иона аммония

Рисунок 32Сравнение
результатов, предсказываемых моделью изолированной клетки, с экспериментальными данными

8 ОПТИМИЗАЦИЯ КЛЕТОЧНОГО РОСТА

8.1 Моделирование клеточного роста как оптимального

процесса

Изучение роста микроорганизмов на смесях различных субстратов показывает, что обычно организмы быстрее усваивают субстрат, обеспечивающий наиболее высокую скорость роста. На молекулярном уровне в основе такого поведения микроорганизмов лежат процессы индукции, репрессии, ингибирования и активации. Их можно положить в основу соответствующих моделей кинетики роста, но для этого нужно учитывать множество параметров и детальных сведений о механизме процессов. В альтернативном подходе, разработанном Рамкришной и сотрудниками, влияние регуляторных клеточных процессов описывается как результат оптимизации клеточного роста. В основе этого подхода лежит постулат о том, что в результате естественного отбора и эволюции биологические системы приобрели способность ис-пользовать среду оптимальным образом. С точки зрения такой кибернетической модели, действие регуляторных систем метаболизма можно описать как решение задачи оптимального распределения ресурсов, обеспечивающего максимальную скорость роста.

Основанный на законе соответствия для распределения ресурсов алгоритм оптимизации оказался вполне пригодным для моделирования клеточного роста на смешанных субстратах. Если отдача от утилизации ресурса Zi равна i(Zi) и если полная отдача (сумма всех i) максимизирована при условии, что сумма всех Zi равна постоянной величине, то должен удовлетворяться следующий закон соответствия

…                              (140)

Предположим, что скорость роста популяции зависит от внутриклеточных концентраций е1, е2,... ряда ферментов, необходимых для ассимиляции субстратов S1, S2,... соответственно. В таком случае, например, вклад субстрата Si в образование биомассы может быть описан уравнением

                       (141)

где

                              (142)

Весовой коэффициент определяется условиями закона соответствия для энергетического выхода процессов потребления различных субстратов, которые предполагают, что

,                                  (143)

где  энергия, высвобождающаяся при утилизации единицы массы субстрата  j. 

Применение закона соответствия к распределению клеточных ресурсов для синтеза ферментов приводит к следующему выражению для скорости синтеза фермента Еi: 

                             (144)

где

.                              (145)

Важным преимуществом этой модели является возможность экспериментального определения всех кинетических параметров в реакциях с индивидуальными субстратами. Метод оптимизации учитывает все аспекты кинетики роста популяции микроорганизмов в среде с несколькими субстратами.

На рисунке 33 приведено сравнение расчетных и экспериментальных данных по росту культуры бактерии Klebsiella oxyloca в среде, содержащей арабинозу и лактозу.

Рисунок 33 – Сравнение экспериментальных (х) и полученных
с помощью
кибернетической модели расчетных (сплошная) данных
для двухфазного периодического роста
Klebsiella oxyloca 

в арабинозно-лактозной среде

Соответствующие параметры модели, определенные в отдельных экспериментах, можно найти в литературе. В данном случае модель хорошо отражает продолжительную лаг-фазу между периодом роста на лактозе и периодом более медленного роста на арабинозе. Изучение других моделей этого класса показало, что расчетные и экспериментальные данные не только качественно, но и количественно хорошо согласуются и в случае трехфазного роста микроорганизмов на трех субстратах как в периодическом процессе, так и в стационарной и переходной фазах непрерывного процесса в ПРПП. Большой интерес представило бы распространение кибернетического подхода на другие методы оптимизации и процессы образования продуктов жизнедеятельности клеток. Кибернетические модели являются интересной альтернативой моделей, в которых метаболизм рассматривается как упрощенная сеть химических реакций.

9 КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ ПОПУЛЯЦИЯМИ
КЛЕТОК ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА

Множество конечных продуктов метаболизма выделяется клеткой в питательную среду или аккумулируется в клетке. В соответствии с особенностями стехиометрии процессы образования продуктов метаболизма удобно подразделить на четыре перечисленных ниже типа; первые три типа отвечают классификации путей анаэробного метаболизма, впервые предложенной в 1955 г. Гэйденом-младшим.

  1.  Основной продукт метаболизма является результатом первичного энергетического обмена. Примером может служить образование этанола в ходе анаэробного роста дрожжей.
  2.  Образование основного продукта метаболизма не связано непосредственно с энергетическим обменом, как, например, при биосинтезе лимонной кислоты в ходе аэробного культивирования плесеней.
  3.  Конечный продукт является вторичным метаболитом. В качестве примера можно привести биосинтез пенициллина, образующегося в аэрируемой культуре плесени.
  4.  Биотрансформация. Здесь конечный продукт метаболизма образуется из субстрата в результате одной или нескольких реакций, катализируемых клеточными ферментами. Примером может служить гидроксилирование стероидов.

Кинетика образования популяциями клеток продуктов метаболизма может быть описана аналогично росту клеточных популяций. Здесь также возможны структурированный и неструктурированный подходы. Модели кинетики белкового синтеза можно разработать и на молекулярном уровне, если воспользоваться известными в настоящее время данными по регуляции молекулярных процессов.

9.1 Неструктурированные модели кинетики образования

продуктов метаболизма

Кинетика образования продуктов жизнедеятельности клеток наиболее проста в тех случаях, когда образование метаболитов и утилизация субстрата или клеточный рост связаны простым стехиометрическим отношением. Тогда скорость образования продуктов метаболизма можно выразить следующими уравнениями:

                             (146)

                              (147)

Такие случаи типичны для микробиологических процессов типа I. Примером может служить спиртовое брожение, кинетика которого в периодическом процессе отражена на рисунке 34.

Рисунок 34Для процесса спиртового брожения характерна

простая сопряженная с клеточным ростом кинетика
образования продукта метаболизма

На рисунке 34 указано изменение во времени биомассы, массы образовавшегося спирта и утилизированного сахара (а); объемных и удельных скоростей образования биомассы, утилизации субстрата и синтеза продукта метаболизма (спирта) (б, в).

Такого типа кинетику образования продуктов жизнедеятельности иногда называют сопряженной с ростом.

Рисунок 35Усложненная кинетика биосинтеза вторичного

метаболита пенициллина

На рисунке 35 указано изменение во времени биомассы, массы образовавшегося пенициллина и утилизированного сахара (а); объемных и удельных скоростей образования биомассы, синтеза пенициллина, утилизации сахара и кислорода (б, в).

Во многих микробиологических процессах, особенно если речь идет о вторичных метаболитах, продукт жизнедеятельности клеток не образуется в сколько-нибудь значительных количествах в первых фазах периодического процесса вплоть до начала стационарной фазы или даже несколько позже, как, например, процесс биосинтеза пенициллина (см. рисунок 35).

Иногда в таких случаях кинетика образования продукта жизнедеятельности клеток удовлетворительно описывается простой, не сопряженной с ростом моделью, в которой скорость образования метаболита принимается пропорциональной не скорости роста клеток, а их концентрации.

В ставшей классической работе Льюдикина и Пайрета, посвящен-ной изучению молочнокислого брожения в присутствии бактерии Lactobacillus delbruekii, было показано, что в кинетику образования продукта метаболизма вносят вклад как сопряженные, так и не сопряженные с  ростом факторы,

                (148)

Такое уравнение скорости образования продукта метаболиз-
ма с двумя параметрами, часто называемое
уравнением ЛьюдикинаПайрета, оказалось чрезвычайно полезным при интерпретации экспериментальных результатов самых различных микробиологических процессов.

Именно такую форму зависимости следует ожидать тогда, когда изучаемое вещество является конечным продуктом метаболического пути, связанного с выделением энергии (например, в некоторых процессах анаэробного брожения). В этих случаях первое и второе слагаемые правой части уравнения (148) можно рассматривать как меру энергии, расходуемой на клеточный рост и на поддержание клеток соответственно.

Пример 9.1. Последовательное определение параметров простого периодического процесса брожения. Рассмотрим модельный периодический процесс брожения, в котором клеточный рост описывается логистическим уравнением (104), а образование продукта метаболизмауравнением ЛьюдикинаПайрета (148)

   (149)

Кинетику утилизации субстрата можно выразить следующим уравнением, в котором учтены превращение субстрата в клеточную массу и продукт метаболизма, а также его расход на поддержание клеток:

                             (150)

где

,    (151)

               (152)

Эта и другие аналогичные модели позволяют описать многие важные микробиологические процессы, в том числе и такие, в которых образуется несколько конечных продуктов метаболизма. К преимуществам этих моделей можно отнести и тот факт, что их параметры могут быть определены последовательно с помощью ряда специально разработанных удобных графических методов. Ниже мы вкратце рассмотрим эти методы.

Преобразованием уравнения (105) можно получить следующее выражение:

               (153)

Определив экспериментально хs, можно затем по графику зависимости от t найти k (тангенс угла наклона прямой) и x0 (отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат)

.

Что касается параметров кинетики образования продукта жизнедеятельности клеток, то из уравнения ЛьюдикинаПайрета для периодической культуры в стационарном состоянии следует

.                              (154)

Интегрированием уравнения (149) при х, определяемом уравнением (104), получаем

(155)

Построив график зависимости левой части уравнения (155) от (x(t)–х0) можно определить α. Аналогичным путем можно найти параметры и  в уравнении скорости утилизации субстрата.

В таблице 11 приведены найденные таким путем параметры кинетики четырех различных микробиологических процессов, в результате которых образуются внеклеточные полисахариды. Эти данные показывают, что процессы образования внеклеточных биополимеров по своим кинетическим характеристикам могут быть сопряжены с клеточным ростом (пуллулан и полиальгинат), не сопряжены с ним (биополимер из Pseudomonas sp.) или иметь смешанный характер (ксантан).

Временная зависимость концентрации продукта метаболизма в ходе периодического процесса может быть очень сложной, причем в среде могут накапливаться и подвергаться дальнейшим превращениям несколько веществ. Различные возможные ситуации отражены в классификации микробиологических процессов, предложенной Дейндоерфером (таблице 12).

Таблица 11 – Значения параметров модели кинетики процессов

биосинтеза внеклеточных полисахаридов различными

микроорганизмами

Продукт

процесса

или

микроорганизм

Параметры

образования

продукта

метаболизма

Параметры

утилизации

субстрата

Параметры образования биомассы

α

k, ч-1

Ксантан

0,155 г/гч

1,830 г/г

2,000 г/г

0,284 г/гч

0,15

Пуллулан (рН=4,5)

0

89,0 %

1,12

Пуллулан (рН=5,5)

0

135,0 %

0,89

Пуллулан (рН=6,5)

0

110,0 %

1,12

Альгиновая кислота

0

1,60 г/г

6,6 г/г

0,015 г/гч

0,12

Pseudomonas sp.

10-3 г/гч

0

0,165 %

2,810-2  %

0,31

Таблица 12 – Классификация микробиологических процессов

по Дейндоерферу

Тип процессов

Описание

Простой

Превращение питательных веществ в продукты метаболизма осуществляется без накопления промежуточных веществ и характеризуется строго определенной стехиометрией

Совместный

Превращение питательных веществ в продукты метаболизма не сопровождается накоплением промежуточных веществ, но стехиометрия процесса может изменяться

Последовательный

Превращение питательных веществ в продукт метаболизма сопровождается накоплением промежуточного соединения

Ступенчатый

Превращению питательных веществ в продукт метаболизма предшествует полное превращение в промежуточное соединение, или питательные вещества селективно превращаются в продукт метаболизма в каком-либо определенном порядке

В некоторых случаях сложная кинетика образования продукта жизнедеятельности клеток может отражать изменения в механизме метаболизма клетки. Показательным примером (важным как с точки зрения промышленного использования, так и в историческом аспекте) такой кинетики может служить синтез ацетона и бутанола бактерией Clostridium acetobutylicum (рисунок 36).

Рисунок 36Образование различных веществ в ходе

периодического роста Cl. acetobutylicum при рН=5,0

Приведены экспериментально найденные концентрации глюкозы (1), клеточной массы (2), уксусной кислоты (3), масляной кислоты (4), ацетона (5), бутанола (6), этанола (7).

В первой фазе периодического процесса глюкоза превращается в уксусную и масляную кислоты, которые впоследствии перерабатываются (наряду с глюкозой) в ацетон и бутанол. Образование продуктов метаболизма клетки может сопровождаться также химическими превращениями метаболитов в среде, как, например, при спонтанном гидролизе пенициллина. Описание кинетики таких сложных процессов может потребовать включения этих дополнительных реакций в схему математической модели.

9.2 Химически структурированные модели кинетики

образования продуктов жизнедеятельности клеток

В сравнении с изучением кинетики роста индивидуальной клет-
ки и популяций клеток в проблеме кинетики процессов образования продуктов метаболизма разработке структурированных моделей посвящено относительно небольшое число работ. Рассмотрим процесс образования одного из множества вторичных метаболитов, на примере которого познакомимся с рядом важных аспектов процессов микробиологического синтеза антибиотиков, а также с новыми подходами к моделированию кинетики таких процессов.

Синтез ряда микробных антибиотиков и других продуктов вторичного метаболизма ингибируется высокими концентрациями фосфатного иона. Поскольку для роста клеток фосфат совершенно необходим, очевидно, должен существовать некоторый оптимальный уровень его концентрации. Действительно, такой оптимальный уровень начальной концентрации фосфата наблюдался, например, при биосинтезе алкалоидов Claviseps purpurea (рисунок 37).

Рисунок 37Изменение во времени плотности биомассы (ПБ)
Claviseps purpurea (, г сухого вещества в 1 л)
и суммы продуцируемых алкалоидов (СА) (
o, мг/л)

при различных начальных концентрациях фосфата

Приведенные на рисунке 37 экспериментальные данные хорошо моделируются следующими уравнениями кинетики клеточного роста периодической культуры и образования продукта жизнедеятельности.

Рост клеток

               (156)

Концентрация фосфата в среде

    (157)

Кривые отражают соответствующие расчетные данные, полученные с помощью описанных в тексте математических моделей.

Концентрация фосфата в клетке

 (158)

Образование алкалоидов

                (159)

В этой модели удельная скорость роста описывается уравнением Теиссье, в котором одной из независимых переменных является внутриклеточная концентрация фосфата pi . (Эта переменная равна числу граммов КН2РО4, содержащемуся в 1 г биомассы, и отражает состав клетки. Все другие переменные этой модели, описывающие компоненты системы, измеряются в граммах на 1 л культуры). Выражение k2x2 отражает скорость лизиса клеток.

В результате лизиса фосфат выделяется в среду, как показывает второе слагаемое правой части уравнения (157), его количество пропорционально содержанию фосфата в клеточной массе Ур/х и внутриклеточной концентрации фосфата pi . Первое слагаемое той же части того же уравнения описывает активный транспорт фосфата в клетку; кинетика этого процесса характеризуется наличием режима насыщения. Уравнение материального баланса по внутриклеточному фосфату (уравнение (158)) является вариантом уравнения (120); здесь учтено, что скорость его образования равна разности между скоростью транспорта фосфата в клетку и скоростью включения фосфата в компоненты клетки. В уравнении скорости образования продуктов принято во внимание ингибирование процесса фосфатом в том виде, в каком этот эффект учитывался ранее при моделировании репрессии фермента фосфатазы.

Таблица 13 – Значения параметров в структурированной модели

кинетики биосинтеза алкалоидов в Claviseps purpurea

Параметр

Размерность

Значение

Доверительный предел

k1

сутки-1

0,5

0,058

k2

л/г в сутки

0,016

0,0024

k3

сутки-1

0,0575

0,017

k4

мг/г в сутки

6,028

1,69

Yp/x

0,0025

0,0024

K1

1,8710-4

1,7310-4

K2

г/л

4,2910-4

6,6710-4

K3

4,6510-4

9,8410-4

Сплошные кривые на рисунке 37 были вычислены с помощью описанной модели, а значения соответствующих параметров перечислены в таблице 13. Эта структурированная модель хорошо отражает закономерности изменения биомассы и массы алкалоидов во времени, в том числе наличие максимума на кривой накопления суммы алкалоидов, но в то же время при высоких концентрациях фосфата ее точность недостаточно высока. С помощью такой модели, в частности, было показано, что максимальное количество суммы алкалоидов продуцируется при начальной концентрации фосфата в среде 0,17 г/л. Математическое моделирование различных методик введения фосфата (в том числе добавления фосфата по частям в различные фазы процесса) показало, что таким путем нельзя добиться существенного повышения выхода алкалоидов по сравнению с обычным периодическим процессом при оптимальной начальной концентрации фосфата в среде.

Задача 12. Стехиометрия и кинетика метаболических превра-щений.

На рисунке 38 приведена схема биосинтеза лимонной кислоты в Candida lipolytica.

На схеме символами обозначены важнейшие стехиометрические и кинетические параметры основных реакций в цикле ТКК и в глиоксилатном цикле. Здесь iудельные скорости потоков углерода по различным метаболическим путям; car, pro и αi;стехиометрические коэффициенты; µудельная скорость роста; удельная скорость утилизации глюкозы; Qiскорость образования определенных продуктов метаболизма.

АсСоАацетил-СоА; CIT – цитрат; G6P – глюкозо-6-фосфат;

GLU – глутамат; ICT – изоцитрат; MAL – малат;
OAA –
оксалоацетат; OGT – α-кетоглутарат; PYR – пируват;
SUC –
сукцинат; GOX – глиоксилат

Рисунок 38 – Схема биосинтеза лимонной кислоты

а) Допустив, что все метаболиты находятся в квазистационарном состоянии, найдите выражения, связывающие собственные скорости элементарных реакций с наблюдаемыми общими скоростями процессов утилизации глюкозы, образования СO2, цитрата и изоцитрата.

б) Запишите уравнение общего материального баланса по углероду. Зависит ли это уравнение от выражений, найденных Вами при решении упражнения 12а?

в) Для оценки важности отдельных путей метаболизма в биосинтезе цитрата были предложены две модели, в одной из которых отсутствует глиоксилатный цикл (7 = 0), а во второй блокирован цикл ТКК (8 = 0). С помощью найденных в а и б уравнений вычислите относительные внутриклеточные метаболические потоки для указанных двух моделей при D=0,122 и 0,0769 ч-1. Какая из двух моделей, судя по результатам Ваших расчетов,  представляется более обоснованной?

9.3 Генетически структурированные модели кинетики

образования продуктов жизнедеятельности клеток

Моделирование кинетики образования продуктов метаболизма на основе механизмов молекулярных превращений используется при составлении генетически структурированных моделей. Чем точнее описание кинетики в модели отражает действительно осуществляющиеся в клетке химические события, тем более универсальной становится наша модель. Здесь под «универсальностью» понимается возможность получения удовлетворительных результатов в условиях, отличающихся от используемых в ходе разработки модели и определения ее параметров. Механизмы белкового синтеза, имеющего большое значение в производстве ферментов, гормонов и других практически важных полипептидов, изучены настолько глубоко, что становится возможной разработка моделей на уровне молекулярных событий и взаимодействий. Подобные модели должны быть в высшей степени универсальными и полезными в оптимизации параметров среды и генетической природы организма.

Материальный баланс по мРНК, образующейся при транскрипции данного гена G, можно выразить следующим уравнением (здесь квадратные скобки служат для обозначения молярных концентраций данного компонента в клетке, выраженных в молях в единице объема клетки)

  (160)

В этом уравнении kpконстанта общей скорости транскрипции, a kd  – константа скорости инактивации и (или) деструкции мРНК; допускается, что оба последних процесса имеют первый порядок. В уравнении (160) учтен также коэффициент эффективности утилизации промотора , отражающий модуляцию транскрипции оператором. Во многих случаях, представляющих практический интерес, оценка в единицах концентраций белка-эффектора и индуктора или репрессора является наиболее важным этапом всего моделирования.

Аналогично можно записать и уравнение материального баланса по внутриклеточному продукту трансляции, то есть по исследуемому белку

  (161)

Здесь скорость синтеза белка пропорциональна концентрации, кодирующей данный белок мРНК, и эффективности ее утилизации на рибосомах (можно достаточно обоснованно предположить, например, что изменение нуклеотидной последовательности в связывающем рибосому центре приведет к изменению величины ). В этом случае мы опять принимаем, что реакция инактивации белка имеет первый порядок.

При сбалансированном росте производные от [мРНК] и [Р] по времени равны нулю, и при этом условии из уравнений (160) и (161) следует, что

[P]=                 (162)

Это уравнение непосредственно выражает концентрацию внутриклеточного белка через параметры, характеризующие экспрессию гена и мРНК, а также стабильность белка в клетке.

Таблица 14Значения параметров модели кинетики экспрессии генов в Е. coli

Параметр

Значение

Размерность

kp

2400/(233µ-2+78)

мин-1

kq

3600α/(82,5 µ-2+145)

мин-1

α = 1 при µln 2

α = µ/ln 2 при µln 2

kd

0,46

мин-1

ke

0,07

мин-1

В таблице 14 приведены средние значения, которые могут потребовать уточнений при расчете скорости экспрессии определенного гена и синтеза соответствующего белка. Для удельной скорости роста µ здесь принята размерность ч-1.

Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют о том, что во многих случаях скорость экспрессии генов в Е. coli лимитируется стадией транскрипции. Следовательно, скорость экспрессии регулируемого оператором гена зависит от эффективности транскрипции этого гена, которая в свою очередь определяется совместным влиянием модулирующих агентов на сайты оператора и связывания РНК-полимеразы. В качестве примера рассмотрим систему промотор-оператор гена lac Е. coli, причем основное внимание будем уделять совместному влиянию lac-репрессора, индуктора и ДНК на экспрессию гена и, следовательно, на -галактозидазную активность

[P] = K.                  (163)

Здесь [O]общая концентрация операторных сайтов в клетке
Е. coli. Дробное выражение в правой части уравнения (163) можно определить, если учесть взаимодействия между R, O, другими неспецифическими сайтами ДНК (D), индуктором I; предполагается, что все эти взаимодействия равновесны

R + O RO KA                            (164a)

R + D  RD KB               (164б)

R + I  RI KC               (164в)

RI + O  RIO KD               (164г)

RI + D  RID KE               (164д)

Оператор О может существовать в трех разных формах, концентрации которых можно связать следующим уравнением материального баланса

[R]o = [R] + [RI] + [RO] + [RD] + [RIO] + [RID].  (165)

Поскольку концентрация [D] неспецифично связывающих сайтов ДНК выше общей концентрации R, мы можем принять, что

[D] [D]o.                               (166)

Используя приближение (166), равновесную природу реакций (164), уравнение материального баланса (165) и пренебрегая членами с множителем [O]0/[R]о, нетрудно прийти к следующему уравнению:

(167)

Опубликованные в литературе  экспериментальные данные позволяют приближенно, с точностью не ниже одного порядка величин, оценить параметры этого уравнения

[D]o = 410-2M KA = 21012 M-1,

KB = 21012 M-1, KC = 21012 M-1,                (168)

KD = 21012 M-1, KE = 21012 M-1.  

Оценка параметров этой математической модели требует обширных экспериментальных данных, но вместе с тем моделирование с учетом молекулярных взаимодействий имеет и свои преимущества. Так, ее параметры имеют строгое физико-химическое толкование и часто могут быть определены в отдельных экспериментах in vitro. Более того, модель такого уровня обладает особой характеристикой, называемой генетической структурой. Под генетической структурой в данном случае понимается четкая зависимость определенных параметров модели от генетической природы; так, изменение нуклеотидной последовательности lас-оператора должно сопровождаться изменением параметров KA и KD, характеризующих взаимодействия lас-оператора с белком-репрессором. По мере развития и углубления наших знаний о механизмах взаимодействий в системе ДНКбелок, вероятно, мы сможем учитывать влияние определенных изменений нуклеотидной последовательности на соответствующие константы связывания ДНК с белком расчетным путем. Тогда разработанная на молекулярном уровне кинетическая модель позволит осуществлять картирование нуклеотидной последовательности, отражающее продуктивность популяции клеток. Потенциальные возможности такого подхода для рациональной количественной оптимизации генетической модификации организма (или, по меньшей мере, клонированных участков ДНК) очевидны.

В качестве примера рассмотрим применение уравнения (167) для расчета влияния концентрации репрессора на скорости индуцированной и неиндуцированной транскрипции lас-промотора-оператора хромосомы Е. coli. Необходимые экспериментальные данные, в том числе внутриклеточные концентрации репрессора для каждого из мутантов, известны для мутантных штаммов i-, iq и isq Е. coli. Эти величины можно непосредственно использовать при моделировании; они не влияют на другие параметры модели.

Как показано в таблице 15, модель удовлетворительно отражает влияние внутриклеточной концентрации репрессора как в присутствии индуктора, так и без индуктора. В приведенной в конце раздела литературе можно найти другие примеры моделирования с учетом регуляции на молекулярном уровне.

Таблица 15Вычисленные и найденные экспериментальным путем величины -галактозидазной активности, регулируемой системой
lac-промотор-оператор, для дикого типа Е. coli и трех мутантов
(i-, iq и isq) с различными внутриклеточными концентрациями
lac-репрессора R ([R]0=2-10-2 М)

Генотип

Концентрация репрессора

Индуктор

-галактозидазная

активность

Вычислено

Найдено

i-

0

113

100140

i-

0

+

113

100130

i+

[R]0

0,1

0,1

i+

[R]0

+

100

100

iq

10[R]0

0,011

0,010,014

iq

10[R]0

+

62

65

isq

50[R]0

0,002

0,0030,004

isq

50[R]0

+

23

25

Задача 13. Репарация и термодинамика мутаций. 

Если в процессе участвует большое число организмов, то кинетику мутаций можно описать теми же параметрами, какие используются в кинетике обычных химических реакций.

а) В популяции бактерий с концентрацией клеток 3107мл-1 (объем культуры 1000 л) мутация гена g1 в ген g2 происходит с частотой
10
-8 на деление клетки, а обратная мутация g2 в g1с частотой 10-6 на деление клетки. Вычислите «равновесные» концентрации каждого мутанта.

б) Поскольку в клетках, способных ферментативным путем репарировать повреждения ДНК, имеется соответствующий специфический фермент, можно предположить, что в таких случаях имеет место и равновесие между нормальной и поврежденной ДНК

                            k1

Нормальная ДНК   поврежденная ДНК               (169)

                                   k-1

   ферменты репарации

Предположим, что ДНК повреждается еще и ультрафиолетовым излучением, константа скорости этой реакции равна k1. Покажите, что в этом случае равновесная популяция поврежденной ДНК повышается от k1/(k1+k-1) до (k1+k1)/(k1+k1+k-1)

в) Покажите, что после отключения источника ультрафиолетового излучения (при условии, что Km репарационного фермента значительно превышает общую концентрацию ДНК) средняя концентрация поврежденной ДНК возвратится к исходному уровню со скоростью, пропорциональной разности концентраций поврежденной ДНК в отсутствие и при наличии ультрафиолетового излучения.

9.4 Кинетика образования продуктов метаболизма 

филаментозными организмами

Кинетика образования продуктов метаболизма и утилизации субстрата плесневыми грибами и другими филаментозными организмами обычно очень сложна. Типичным примером может служить биосинтез пенициллина в периодическом процессе. Как показано на рисунке 35, существуют три различных режима усвоения субстрата. В течение первых 20 ч происходит быстрая утилизация сахара, сопровождающаяся активным ростом плесени. В стационарной фазе утилизация субстрата замедляется, а скорость образования пенициллина достигает максимума. Затем скорость усвоения сахара опять возрастает и удерживается на высоком уровне вплоть до его истощения.

Аналогичная картина наблюдается и в ходе биосинтеза других антибиотиков, хотя каждый процесс имеет и свою специфику. В производстве стрептомицина, например, максимальная скорость синтеза антибиотика достигается (по сравнению с пенициллином) позднее, а заключительная фаза ускоренной утилизации сахара не наступает вообще. Процесс продуцирования антибиотика окситетрациклина филаментозным микроорганизмом Streptomyces rimosus интересен тем, что здесь результат всего процесса зависит и от морфологии организма.

В таблице 16 суммированы основные стадии и особенности этого процесса.

Таблица 16 – Основные фазы периодического процесса биосинтеза окситетрациклина в погруженной культуре Streptomyces rimosus

Фаза

Особенности

1

2

1 Лаг-фаза

Продолжительность около 90 мин, если  объем инокулята мал; метаболическая активность не обнаруживается

2 Рост первичного мицелия

Продолжительность от 10 до 25 ч, в зависимости от инокулята; интенсив-ны дыхание, синтез нуклеиновых кислот и другие метаболические процессы; концентрация пировиноградной кислоты максимальна; антибиотик не образуется

3 Фрагментация первичного мицелия

Продолжительность около 10 ч; рост мицелия прекращается, интенсивность дыхания и синтеза нуклеиновых кис-лот снижается, концентрация пировиноградной кислоты падает до очень низкого уровня

4 Рост вторичного мицелия

Продолжительность около 25 ч; в этой фазе масса вторичного мицелия в 24 раза превышает биомассу в фазе 2; гифы мицелия значительно утоньша-ются; быстро возрастает скорость синтеза антибиотика, возобновляется син-тез нуклеиновых кислот, а интенсивность дыхания продолжает снижаться; сахара и азот (аммиак) быстро истоща-ются; концентрация пировиноградной кислоты может немного повыситься

5 Стационарная фаза

В этой фазе рост клеток прекращается, а метаболическая активность снижается; антибиотик еще какое-то время синтезируется, но скорость синтеза сравнительно низка

Ниже перечислены некоторые особенности образования продуктов жизнедеятельности, характерные только для филаментозных организмов и найденные экспериментальным путем:

1. Максимальный выход продукта метаболизма достигается в определенной фазе периодического процесса при условии оптимальной начальной концентрации субстрата. Повышение концентрации субстрата приводит к ускорению роста, но при этом субстрат расходуется в основном на образование биомассы, а метаболит синтезируется в очень малых концентрациях. Если же концентрация субстрата слишком низка, то образующееся незначительное количество биомассы не в состоянии синтезировать антибиотик в достаточных концентрациях даже в период максимальной скорости его биосинтеза.

2. Образование продукта метаболизма максимально при мини-мальном ветвлении активно растущих гиф инокулята. С другой стороны, уменьшение степени ветвления повышает продолжительность лаг-фазы и, следовательно, длительность всего процесса. Очевидно, должна существовать некоторая оптимальная степень ветвления гиф инокулята.

3. Поскольку плесени и другие мицелиальные микроорганизмы являются аэробами, казалось бы, что максимальная интенсивность перемешивания погруженной культуры должна способствовать эффективному переносу кислорода к плесени и, таким образом, росту последней.

В случае пенициллина, однако, было установлено, что максимальные выходы антибиотика достигаются при некоторой промежуточной интенсивности перемешивания. Этому факту было дано несколько объяснений. Известно, что на морфологию плесени влияют механические воздействия: возможно, что более энергичное перемешивание способствует ветвлению гиф, которое, как считается, снижает скорость биосинтеза антибиотика. Не исключено также, что существует некоторая оптимальная скорость подачи кислорода, но ввиду сложности системы подтвердить это предположение экспериментальным путем чрезвычайно трудно.

Пример 9.2 Морфологически структурированная модель

кинетики биосинтеза цефалоспорина С

Экспериментальное изучение биосинтеза антибиотика цефалоспорина С (ЦСС) в глубинной культуре плесени Cephalosporium acremonium показало, что в ней существуют три морфологически различные формы микроорганизмов: гифы (h), набухшие фрагменты гиф (s) и артроспоры (а). В зависимости от состава среды эти формы могут взаимопревращаться, как это схематично показано на рисунке 39. На этом же рисунке отмечено, что ЦСС преимущественно продуцируется набухшими фрагментами гиф.

Скорость синтеза ЦСС непосредственно связана с активностью соответствующих ферментов, которые индуцируются внутриклеточным метионином и подавляются глюкозой.

Эти сведения послужили основой для приведенной ниже структурированной модели биосинтеза ЦСС в периодической культуре.

Рисунок 39 Схема морфологически различных форм
плесени
Cephalosporium acremonium, их превращений
и синтеза
цефалоспорина С (ЦСС)

Рост и дифференциация плесени

                    (170)

                          (171)

                                             (172)

здесь

                            (173)

                                 (174)

В этой модели общая биомасса разделена на три морфологически различных типа, наблюдающиеся в эксперименте. Массовые концентрации глюкозы и метионина в среде обозначены символами g и m соответственно.

Модель утилизации субстрата подразумевает, что глюкоза и метионин усваиваются только морфологическими формами h и s.

Утилизация глюкозы и метионина

                             (175)

                 (176)

                              (177)

С помощью уравнений (170)–(177) были рассчитаны характеристики роста клеток и утилизации субстрата в периодическом процессе, причем для лучшего соответствия расчетных данных результатам эксперимента параметры модели уточняли методом симплексной оптимизации.

Поскольку в регуляции экспрессии ферментов, синтезирующих ЦСС, особую роль играет внутриклеточный метионин, то кинетическая модель химически структурирована таким образом, чтобы можно было раздельно оценить влияние концентраций метионина mih, mi, mia (во всех случаях в числе микромолей в 1 г клеток) в морфологических формах h, s и а соответственно. При этом использовались следующие уравнения материального баланса по метионину.

Внутриклеточный метионин

      (178)   (179)

     (180)

При выводе этих уравнений принималось, что скорость биосинтеза метионина обратно пропорциональна его внутриклеточной концентрации и что присутствие глюкозы в среде повышает скорость утилизации метионина в белковом синтезе. Средняя внутриклеточная концентрация метионина равна

                (181)

где

x=xh+xs+xa.                                          (182)

Теперь модель описывает все основные стороны процесса: рост клеток, утилизацию субстрата и концентрацию внутриклеточного
метионина. Сравнением найденных и расчетных значений
mi можно определить новые параметры, появляющиеся в уравнениях (178)– (180). Эти параметры приведены во втором столбце (группа 2) табли-цы 17.

В модели допускается, что скорость синтеза антибиотика зависит от активности синтезирующих ЦСС ферментов е (выраженной в мг ЦСС в час в расчете на 1 г клеток), которая описывается следующим уравнением:

Синтез ферментов

 (183)

где

Q =                               (184)

Параметр Q является мерой индуцируемой глюкозой катаболитной репрессии. Подстрочный индекс (t tI) указывает на развитие процесса в период (t tI), это отражает наличие лаг фазы между индукцией и экспрессией гена. Скорость образования ЦСС в этой модели описывается следующим уравнением:

Образование антибиотика

                                (185)

Параметры уравнений (184)(185) приведены в третьем столбце (группа 3) таблицы 17.

Таблица 17 – Параметры математической модели, описывающей

биосинтез цефалоспорина С (ЦСС)

Группа 1

(параметры роста
клеток и утилизации
субстрата)

Группа 2

(параметры
накопления
эндогенного
метионина)

Группа 3

(параметры образования ферментов,

синтезирующих ЦСС, и биосинтеза ЦСС)

1

2

3

µm = 0,069 ч-1

YG = 0,45 г клеток/г Glu

k3h = 7,1 ч-1

Kg = 12,0 мкмоль Met/г клеток

KG = 0,05 г Glu

Продолжение таблицы 17

1

2

3

k11 = 0,015 ч-1

k12 = 0,024 ч-1

k3s = 1,4 ч-1

k21 = 0,004 ч-1

k22 = 0,028 ч-1

k3a = 7,8 ч-1

kED = 0,38 ч-1

Km = 0,001 г Met

kPD = 0,012 ч-1

m = 0,023 г Glu/(г клеток×ч)

Umh = 0,0012 г Met/(г клеток×ч)

Ums = 0,0098 г Met/(г клеток×ч)

kD = 0,014 ч-1

На рисунке 40 изображены экспериментальные (точки) и расчетные (кривые) данные, отражающие клеточный рост, утилизацию субстратов и образование антибиотика в периодическом процессе.

Рисунок 40 Расчетные (сплошные кривые)
и экспериментальные (точки) данные, отражающие
развитие процесса биосинтеза цефалоспорина С (ЦСС)
в периодической культуре
Cephalosporium acremonium 

(Mi для внутриклеточного метионина)

Из рисунка 40 видно, что концентрация набухших фрагментов гиф сначала возрастает, а затем снижается, а артроспоры образуются в основном на поздних стадиях процесса. Модель очень хорошо отражает своеобразный характер изменения во времени концентрации внутриклеточного метионина. В то же время разработка и использование такой сложной модели с параметрами, определение которых очень трудоемко, оправданы только в том случае, если эта модель применима для изучения культивирования в достаточно широком диапазоне условий. Описанная модель вполне отвечает этому требованию.

На рисунке 41 приведены рассчитанные с помощью этой модели зависимости количества синтезируемого ЦСС (в единице объема) а) от начальной концентрации глюкозы и б) от времени введения метионина в культуру.

В полном соответствии с экспериментальными данными на первой кривой имеется четко выраженный максимум; вторая кривая свидетельствует о целесообразности введения метионина на ранних стадиях процесса, что также подтверждается экспериментом.

Рисунок 41 – Моделирование влияния начальной концентрации глюкозы (а) и времени введения метионина (б) 

на синтез ЦСС

Эта модель помогла также предсказать, что в периодическом процессе одновременное введение метионина и глюкозы способствует значительному повышению выхода ЦСС, в то время как раздельное (во времени) введение этих питательных веществ менее эффективно. Последующие эксперименты подтвердили и эти расчетные данные.

10 СЕГРЕГИРОВАННЫЕ МОДЕЛИ КИНЕТИКИ
КЛЕТОЧНОГО РОСТА И ОБРАЗОВАНИЯ
ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА

Обычно популяции клеток гетерогенны в том смысле, что составляющие популяцию индивидуальные клетки различаются по размерам, возрасту, скорости роста и другим свойствам. Чтобы модель кинетики роста популяции клеток в большей степени приближалась к реальной ситуации, она должна отражать и распределение клеток по различным категориям, обладающим разными биохимическими активностями. Другим преимуществом такого подхода к моделированию является возможность установления связи между особенностями клеточного цикла и другими свойствами изолированной клетки, с одной стороны, и общими характеристиками популяции с другой. Основной недостаток сегрегированных моделей обусловлен их математической сложностью. В этой связи в настоящем разделе основное внимание мы будем уделять распределению по возрастам и коррелированным распределениям популяций клеток, размножающихся бинарным делением. Такие модели строятся на основе вывода уравнений материального баланса популяций, использующихся в сегрегированных моделях, и решение уравнений модели для конкретных микробных систем.

Частотная функция возраста клеток W(a) позволяет определить относительное количество клеток в возрасте от а до а+ da как W(a)da. В этом разделе символом а мы будем обозначать возраст клетки, считая, что нулевой возраст соответствует только что возникшим в результате деления клеткам, а делящиеся клетки имеют возраст tD, равный продолжительности клеточного цикла или времени удвоения
индивидуальной клетки. Для сбалансированного экспоненциального роста популяции основанное на возрасте клеток уравнение баланса популяции будет выглядеть следующим образом:

µW(a).                 (186)

Здесь µ – общая удельная скорость роста популяции.

Поскольку все клетки популяции имеют возраст от 0 до tD, то W должно также удовлетворять условию

   (187)

В результате деления не всегда образуются две жизнеспособные клетки. Причиной может быть старение клеток или их гибель, а также рост содержащей неустойчивые плазмиды популяции в селективной среде. Если символом обозначить долю жизнеспособных дочерних клеток, образующихся в результате бинарного деления жизнеспособной клетки, то уравнение баланса, связывающее количество делящих-ся и новых жизнеспособных клеток, можно записать в следующей форме:

W() = (2) W(tD).                              (188)

Решение уравнения (170) с учетом условий (187) и (188) дает

W(a) = () µ.                              (189)

Из уравнений (188) и (189) следует приведенное ниже выражение для зависимости между скоростью роста µ и временем генерации клетки

µ = .                              (190)

Поскольку среднее время удвоения популяции (средняя продолжительность клеточного цикла) равна

,                              (191)

то

   (192)

Таким образом, если не равна нулю, то tD  меньше .

Это относительно простое соотношение иллюстрирует очень важный общий принцип: общие кинетические свойства популяции не обязательно должны соответствовать кинетическим параметрам на уровне индивидуальной клетки.

Во многих случаях для расчета различных частотных функций и усредненных свойств популяции, имеющих конкретное физическое содержание, можно использовать функцию плотности возраста, которую нельзя непосредственно определить. Предположим, например, что синтез некоторых компонентов клетки или продуктов ее жизнедеятельности осуществляется с постоянной скоростью в определенный период клеточного цикла от а1 до а2. Установлено, в частности, что в эукариотах ДНК синтезируется только в периоде S. Сообщалось также, что некоторые ферменты синтезируются рядом организмов только в течение очень узкого временного интервала клеточного цикла. В таких случаях скорость образования продукта жизнедеятельности клеток можно выразить уравнением

                           (193)

Для рассмотренной выше ситуации получим

  (193)

Для любого количественного параметра клеточного роста х (например, клеточной массы, содержания белка, объема, возможно также содержания определенного продукта метаболизма), непосредственно связанного с возрастом клеточного цикла a (иными словами, если a можно выразить или определить как функцию от х), частотную функцию для х в соответствии с уравнением

    (195)

Предположим, например, что в течение клеточного цикла масса отдельной клетки возрастает во времени по линейному закону

m(a)  =       (196)

так что

.                              (197)

Если в уравнение (195) подставить значения W из (189) и a из (197), то получим

               (198)

Здесь следует подчеркнуть различие между кинетикой роста отдельной клетки и популяции клеток. Масса отдельной клетки может возрастать в соответствии с уравнением (196) (такая зависимость для некоторых организмов была обнаружена и экспериментально), в то время как общая масса популяции этих же клеток возрастает экспоненциально, например, в соответствии с уравнением (65), описывающим кинетику сбалансированного роста популяции в периодическом процессе. Одно из преимуществ сегрегированного подхода к моделированию кинетики клеточного роста заключается в возможности выяснения непосредственной взаимосвязи между параметрами кинетики и регуляции роста индивидуальной клетки и параметрами кинетики роста популяции клеток.

Если допустить, что плотность клеточного вещества постоянна, то уравнение (198) можно также интерпретировать как функцию распределения клеток по объему, которое можно определить экспери-ментально с помощью счетчика Коултера или методами проточной цитометрии по рассеянию света. На практике, однако, чаще измеряют количественные характеристики популяции в целом, которые можно вычислить с помощью соответствующих частотных функций и уравнения

                                (199)

В других подходах к моделированию гетерогенность популяции клеток можно рассматривать с иных точек зрения. Предложено несколько математических моделей образования продуктов метаболизма в популяциях микроорганизмов, учитывающих длительные эффекты старения. В модели Пинг Шу удельная скорость образования продукта метаболизма клеток выражается как

                                         (200)

где   общее время пребывания клеток в реакторе. Тогда концентрацию продукта метаболизма в момент времени t периодического процесса можно вычислить по уравнению

 p(t) = .                (201)

Здесь M(, t) – частотная функция в момент времени t концентрации клеточной массы, время пребывания которой в реакторе равно . Поскольку клеточное вещество, имеющее в момент t возраст , образуется за время (t ), отсюда следует, что

M (, t) = rx (t  ).                 (202)

Эта модель отличается известной универсальностью и пригодна для описания различных механизмов накопления продуктов мета-болизма, наблюдаемых в периодических микробиологических процес-сах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии: пер с англ.
В 2 ч. Ч. 1 / Дж. Бейли, О. Оллис. – М.: Мир, 1989. – 692 с., ил.

2. Варфаломеев, С.Д. Биокинетика: практический курс / С.Д. Вар-фаломеев, К.Г. Гуревич. – М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. – 720 с.: ил.

3. Кантере, В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств: учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений / В.М. Кантере. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с., ил.

4. Грачёва, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачёва, А.Ю. Кривова. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Элевар, 2000. – 512 с.: ил. Серия «Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений».

5. Решетников, М.Т. Планирование эксперимента и статистическая обработка данных: учебное пособие / М.Т. Решетников. – Томск: Томск. гос. ун-т систем управления и радиоэлектроники, 2000. – 231 с.


Учебное издание

Ламберова Марина Эдуардовна

Скиба Екатерина Анатольевна

МОДЕЛИРОВАНИЕ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

Редактор Малыгина И.В.

Технический редактор Малыгина Ю.Н.

Подписано в печать  19.12.10. Формат  6084 1/16

Усл. п. л. 6,63. Уч.-изд. л. 7,13

Печать – ризография,

множительно-копировальный аппарат «RISO ЕZ300»

Тираж 100 экз. Заказ 2011-14

Издательство Алтайского государственного

технического университета

656038, г. Барнаул, пр-т Ленина, 46

Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ

Отпечатано в ИИО БТИ АлтГТУ

659305, г. Бийск,  ул. Трофимова, 27

    

М.Э. Ламберова, Е.А. Скиба

МОДЕЛИРОВАНИЕ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ

ПРОЦЕССОВ

Учебное пособие

Бийск  2011

PAGE  1


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

24116. Проблема развития общества. Формационный, цивилизационный подходы, технологический детерминизм в понимании процесса исторического развития 15.08 KB
  Проблема развития общества. Формационный цивилизационный подходы технологический детерминизм в понимании процесса исторического развития. Проблема развития общества Формационный подход был разработан К. В общем же характерно отрицание единства человеческой истории всеобщих исторических закономерностей Недостатками цивилизационного подхода является то что он не позволяет взглянуть на историю как на целостный закономерный процесс; применяя цивилизационный подход трудно изучать закономерности исторического развития.
24117. Культура как объект философского познания, развитие представлений о культуре в истории мысли 15.03 KB
  Культура как объект философского познания развитие представлений о культуре в истории мысли. Культура – совокупность проявлений жизни творчества и достижений народа или группы народов. Культура представляет собой средство и способ развития духовного начала в человеке своей целью имея формирование и удовлетворение его духовных запросов; цивилизация же дает людям средства существования она направлена на удовлетворение их практических нужд. Культура являет собой духовные ценности достижения науки философии искусства образования а...
24118. Психоанализ и проблема человека (З.Фрейд, К.Г. Юнг, Э.Фромм) 17.18 KB
  В психике человека Фрейд сначала выделял две относительно автономные но постоянно взаимодействующие между собой структуры бессознательного оно и сознательного Я а затем добавил к ним сверх Я которое внедряется в Я но без специального анализа не осознается им. По мнению Фрейда причиной невроза является особого рода конфликт между оно Я и сверх Я . Согласно теории Фрейда оно набрало свою изна чальную силу но параллельно с этим развивалось и я . Так как инстинкты или оно служат всего лишь внутренним наполнителем то можно...
24119. Русская философия о человеке и обществе 15.01 KB
  Ориентация на гуманитарное знание на литературу и искусство на проблемы человека является безусловной доминантой в русской философии XX века. в виде религиозной философии человека. близкая к художественному творчеству Ориентация на гуманитарное знание на литературу и искусство на проблемы человека основа рус. во весь рост встали проблемы единства человека с космосом космической природы человека и космического масштаба человеческой деятельности.
24120. Русские философы о судьбах России 15.34 KB
  Россия соединяет внутри себя два мира и поэтому в русской душе всегда боролись два начала: восточное и западное. Бердяев называет русскую историю прерывной и выделяет в ней пять периодов дающих пять разных образов России: Россия киевская; Россия времен татарского ига; Россия московская; Россия петровская; Россия советская. Главное нельзя забывать что Россия является самой молодой цивилизацией и ее истинные возможности в новом свободном государстве скоро раскроются поновому с новыми перспективами.
24121. Русский космизм 13.96 KB
  во весь рост встали проблемы единства человека с космосом космической природы человека и космического масштаба человеческой деятельности. Разум и творчество поднимут человека в космос где со временем изменится его физическая природа он приблизится к высшим организмам.
24122. Основные категории философской онтологии: «бытие», «небытие», «инобытие». Виды бытия 15.11 KB
  Основные категории философской онтологии: бытие небытие инобытие. Одна из первых философских школы которая ввела слово Бытие была школа элеатов. Парменид обращает внимание на такой аспект всякого сущего как бытие. Есть сущее и есть существование этого сущего которое и называют бытием.
24123. Категория «материя». Основные характеристики материи (время, пространство, движение, системность) 15.51 KB
  Основные характеристики материи время пространство движение системность. характеристика материи через основной вопрос мировоззрения а не через понятие вещества или набор его свойств. Существует и другая точка зрения согласно которой нужно отказаться от представления о материи как субстанции гносеологический признак материи. Но важнейшими свойствами являются: пространство; время; движение как способ существования материи.
24124. Категория «дух», «идеальное». Объективная и субъективная реальность 16.14 KB
  Категория дух идеальное. Идеальное в идеалистической традиции понимается как самостоятельное нематериальное начало существующее вне пространства и времени дух идеи. Дух философия философское понятие часто отождествляемое с невещественным началом. Определение соотношения духа и материи зачастую считается основным вопросом философии.