49022

Методы ближнепольной и конфокальной микроскопии. Их аппаратное и метрологическое обеспечение

Курсовая

Коммуникация, связь, радиоэлектроника и цифровые приборы

Содержание пояснительной записки курсовой работы проекта: Методы ближнепольной микроскопии Ближнепольный растровый оптический микроскоп БРОМ Аппаратное обеспечение ближнепольной микроскопии Методы конфокальной микроскопии Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Применение конфокального микроскопа...

Русский

2013-12-19

726.5 KB

119 чел.

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Юго-Западный государственный университет»

Кафедра Нанотехнологий и инженерной физики

ЗАДАНИЕ НА КУРСОВУЮ РАБОТУ (ПРОЕКТ)

Студент (слушатель)   Сергеева О.Ю.     шифр 210600.62  группа НТ-01б

                  (фамилия, инициалы)

  1.  Тема «Методы ближнепольной и конфокальной микроскопии. Их аппаратное и метрологическое обеспечение »

  1.  Срок представления работы (проекта) к защите «___»____________20___г.

  1.  Исходные данные (для проектирования, для научного исследования):

использованы учебная и учебно-методическая литература, материалы периодической печати, а так же ресурсы официальных сайтов сети Интернет.

  1.  Содержание пояснительной записки курсовой работы (проекта):
    1.   Методы ближнепольной микроскопии
    2.   Ближнепольный растровый оптический микроскоп (БРОМ)
    3.   Аппаратное обеспечение ближнепольной микроскопии
    4.   Методы конфокальной микроскопии 
    5.   Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп
    6.    Применение конфокального микроскопа
  2.  Перечень графического материала:

рисунки и схемы

Руководитель работы (проекта): ________________          А.Е.Кузько

                                                             (подпись, дата)  (инициалы, фамилия)

                                                                 

    Задание принял к исполнению:   _________________       О.Ю. Сергеева

                                                                                            (подпись, дата)                      (инициалы, фамилия)


СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……...……………………………………………………...………...4

1.Методы ближнепольной микроскопии…………………………………..…5

  1.  Дифракционный предел в оптике…………………………………….5
    1.  История создания…………..………………………………………….6

2.Ближнепольный растровый оптический микроскоп (БРОМ)…………..8

  1.  Разновидности БРОМ…………………………………………………8
    1.  Принципы Ближнепольной оптической микроскопии……………...9
    2.  Разрешающая способность ближнепольных микроскопов …….…17
    3.  Определение ближнего поля………………………………………...18

3.Аппаратное обеспечение ближнепольной микроскопии………………..21

  1.  Микроскопия ближнего поля с использованием апертуры……….21
    1.   Методики освещения и/или детектирования сигнала…………....22

4. Методы конфокальной микроскопии…………………………………….23

4.1 Принципы конфокальной микроскопии………………………….23

4.2 Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе…….27

           4.3 Влияние диафрагмы в фокальной плоскости…………...……….30

5.Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп………………….33

            5.1 История создания и принцип работы…………………………....33

            5.2 Разрешающая способность КЛСМ………………………………35

6. Применение конфокального микроскопа……………………………….37

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………….38

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………….39


ВВЕДЕНИЕ

Ближнепольная (БП) микроскопия – это способ диагностики, разрешающая способность которого не зависит от рабочей длины волны устройства λ, а определяется размером апертуры зонда D. Уже к концу 1990-х были созданы БП микроскопы (БПМ) микронного и субмикронного разрешения. В самое последнее время появились первые образцы БПМ, имеющие D~30 нм. Для приборов диапазона СВЧ соотношение D/λ составляет 10-5 - 10-6, т.е. устройства обладают «глубоким» субволновым разрешением. Важно, что БП микроскопия это бесконтактная неразрушающая диагностика. Наибольшие перспективы применения БПМ связывают с твердотельной микро- и наноэлектроникой, хотя, соответствующие методы интересны также для материаловедения, дефектоскопии, медицины, фундаментальных исследований и др.

 Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов конфокальной микроскопии, и в настоящее время они широко используются в клеточной биологии.

 Конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет применения подсветки сфокусированной объективной линзой в область анализа и размещения диафрагмы в плоскости наблюдения перед фотодетектором.

Современная конфокальная микроскопия позволяет решать три основные задачи: изучение тонкой структуры клетки, колоколизации (пространственного взаиморасположения) в клетке двух или более веществ, а так же исследование динамических процессов, протекающих в живых клетках.

 


1.Методы ближнепольной микроскопии

1.1 Дифракционный предел в оптике

Понятие о предельном пространственном разрешении, введенное в конце XIX века Эрнстом Аббе и лордом Рэлеем на основе дифракционной теории, гласит, что минимальное разрешаемое расстояние между двумя точками на плоскости ∆x равно:

        (1),

где n- показатель преломления среды, в которую помещен объект, θ  - так называемый апертурный угол объектива регистрируемой системы. Поскольку = NA – числовая апертура и  (NA)max=n (величина, немного отличающаяся от единицы для воздуха), то ∆x можно увеличить лишь уменьшением λ. Отсюда были сделаны выводы о бесперспективности оптической микроскопии и о необходимости перехода к волнам меньшей длины- рентгеновским и электронным.

Лишь в последние годы был сделан целый ряд открытий и нововведений, которые позволяют надеяться на преодоление дифракционного предела в оптике. Наиболее ярким примерами этого являются лазерная технология формирования субмикронных пленочных структур в микроэлектронике, так называемое «сверхразрешение», интерферометрический контроль поверхностей с точностью до тысячных долей длины волны и, наконец, ближнепольная оптика. В лазерной технологии это стало возможным за счет использования пороговых эффектов взаимодействия лазерного излучения с веществом, в сверхразрешении- за счет математических процедур становления сверхмалых деталей в изображении, в интерферометрии- путем математического анализа кривизны полос, а в ближнепольной оптике- за счет использования эванесцентных (затухающих) полей, а также малости излучающей апертуры а и расстояния до объекта наблюдения l (a,l>>λ).


1.2 История создания

Если попытаться кратко сказать, что такое ближнепольная оптика(БПО) , то это- направление оптики, где показано, что в рамках классических представлений можно получить изображение с разрешением в 10-100 раз выше, чем в обычном (дальнепольном) микроскопе, если источник света имеет размер a ≈λ/(10-100) расстоянии, т.е. в ближнем (a,l>>λ) поле.
Любопытно, что также как и лазеры, и голография, БПО, которую иногда называют третьей революцией в оптике ХХ века или оптикой Х1Х века, могла быть создана уже в начале нашего столетия, когда были сформулированы основные теоретические предпосылки этого направления. Их связывают прежде всего с формулировкой законов сохранения на границе двух сред, где наряду с уходящим (распространяющимся) излучением возникает быстро затухающее или эванесцентное поле, известное с момента классических опытов Ньютона по полному внутреннему отражению. Фундаментальными свойствами этого поля является его стационарность (не излучается в направлении, перпендикулярном поверхности) и затухание по экспоненциальному закону при удалении от поверхности. По существу эванесцентное поле сосредоточено на расстоянии меньше λ/2 от поверхности светящихся объектов и с атомарной дискретностью воспроизводит ее физико-химическую структуру. Таким образом, достаточно найти способ измерения распределения светового поля непосредственно у поверхности исследуемого образца и можно будет получать изображения с разрешением значительно выше дифракционного предела.

Одним из перспективных путей решения этой задачи является использование в световой микроскопии, как и в широко известных растровых туннельных электронных и атомно-силовых микроскопах, микрозондовых принципов формирования изображения. Естественно для этого должен использоваться оптический зонд субдлинноволнового размера, способный излучать или воспринимать свет, находясь непосредственно у поверхности образца.
Идея построения светового микроскопа на этом принципе, по-видимому, впервые была высказана Сингом в 1928 г. Экспериментально эта идея была подтверждена  в 1972 г., когда Аш и Николс продемонстрировали ближнепольное изображение с разрешением λ/60 в работе «Сверхразрешающий апертурный микроскоп», используя электромагнитное излучение с длиной волны 3 см и освещая им отверстие диаметром 1,5 мм на расстоянии 5 мм от поверхности. Они же предложили начать работы по созданию на основе этого принципа микроскопов для видимой и ИК областей спектра.

В связи со сложностью изготовления и управления элементами оптики размером менее λ исследования по созданию ближнепольного растрового оптического микроскопа (БРОМ) были начаты лишь в начале восьмидесятых годов, после появления технических возможностей создания устройств для перемещения элементов приборов с нанометровой дискретностью на основе пьезоэлектрического эффекта.

В отличие от появившихся к этому времени туннельных электронных и атомно-силовых микроскопов  БРОМ имеет существенные преимущества: фотоны не имеют массы и электрического заряда, свободно распространяются в воздухе и многих диэлектрических материалах, легко изменяют поляризацию, имеют сравнительно большую длину волны и т.д. Эти особенности оптического излучения позволяют БРОМ существенно пополнить возможности других микрозондовых приборов.
 Среди возможных механизмов формирования контраста в БРОМ следует отметить поглощение, отражение, люминесценцию, цвет и др. Эти возможности отсутствуют в электронной и атомно-силовой микроскопии. Помимо всего, световой микроскоп является сравнительно дешевым и неразрушающим методом контроля в обычных условиях и позволяет исследовать биологические и медицинские препараты в естественных условиях.

2. Ближнепольный растровый оптический микроскоп (БРОМ)

2.1 Разновидности БРОМ

В настоящее время существуют несколько разновидностей БРОМ, работающих в десятках лабораторий мира.
Чаще всего используется просвечивающая микроскопия в режиме  освещения ( illumination mode) или в режиме сбора (collection mode) фотонов с помощью апертурных зондов. При работе с отражающими непрозрачными объектами БРОМ может работать в режиме сбора отраженного света. При этом отраженный свет может быть собран либо волоконно-оптическим зондом непосредственно, для чего часто применяются непокрытые зонды.
Другой подход используется в туннельной растровой оптической (ТРО) микроскопии, когда на поверхности образца генерируются эванесцентные (затухающие) волны с помощью дальнепольного освещения образца под углом большим критического. При этом зонд работает как локальный приемник фотонов из эванесцентного поля, вызывая появление распространяющегося излучения, которое может быть зарегистрировано подобно тому, как это более легкой в реализации, ТРО-микроскопия сложнее в интерпретации. Представляет интерес также ее разновидность, которая объединяет в себе возможности отображения микрорельефа образца с помощью атомно-силового микроскопа с одновременной регистрацией распределения светового поля на фиксированном расстоянии от поверхности. В таком варианте ТРО-микроскоп- рычажный микрощуп атомно-силового микроскопа- одновременно является светопроводящим диэлектрическим нанозондом (оптической антенной) ближнепольного микроскопа. В плазменной БПМ поверхностные плазмоны генерируются на поверхности образца в тонкой металлической пленке и распределение светового поля у поверхности образца регистрируется диэлектрическим светопроводящим зондом.
Наиболее распространен в настоящее время ставший уже классическим апертурный БРОМ, работающий в режиме регистрации дальнопольной (illumination mode) компоненты переизлучения объекта. Однако его существенным недостатком является весьма низкая эффективность освещения объекта через острие, составляющая 10
-4-10-6 от введенного в волокно света.

Другой разновидностью БРОМ является туннельный растровый оптический микроскоп (ТРОМ)- оптический аналог туннельного растрового электронного микроскопа (ТРЭМ), энергетическая эффективность которого значительно выше. Принцип работы ТРОМ основан на регистрации эванесцентного (затухающей) компоненты поля, выходящего за пределы прозрачного объекта при освещении его под углом, большим критического. При этом эванесцентное поле оказывается промодулированным геометрическим рельефом и оптическими неоднородностями вблизи поверхности обьекта. Введение ближнепольного зонда- диэлектрического точечного острия (световода) с радиусом закругления при вершине а>λ – в область эванесцентного поля вызывает появление эффекта туннелирования фотонов в острие без существенного нарушения структуры ближнегополя объекта подобно тому как это происходит в ТРЭМ при туннелировании электронов в металлическое острие. При этом стационарное эванесцентное поле преобразуется в распространяющуюся по заостренному световоду излучающую моду. Путем перемещения острия по трем координатам производится запись пространственного распределения интенсивности светового поля у поверхности образца[1].

2.2 Принципы Ближнепольной оптической микроскопии

Традиционные методы получения оптических изображений объектов имеют существенные ограничения, связанные с дифракцией света. Одним из основополагающих законов оптики является существование так называемого дифракционного предела, который устанавливает минимальный размер (R) объекта, изображение которого может быть построено оптической системой при использовании света с длиной волны λ:

 R=λ/2n          (2),
где
 n - показатель преломления среды. Для оптического диапазона длин волн предельный размер составляет величину порядка 200÷300 нм. В ближнепольной оптической микроскопии используются другие принципы построения изображения объекта, которые позволяют преодолеть трудности, связанные с дифракцией света, и реализовать пространственное разрешение на уровне 10 нм и лучше. Ближнепольный оптический микроскоп (БОМ) был изобретен Дитером Полем (лаборатория фирмы IBM, г. Цюрих, Швейцария) в 1982 году сразу вслед за изобретением туннельного микроскопа.
В основе работы данного прибора используется явление прохождения света через субволновые диафрагмы (отверстия с диаметром много меньше длины волны падающего излучения).

  

Рис. 1а   Прохождение света через отверстие в экране с субволновой апертурой

Рис. 1 б.  Линии постоянной интенсивности оптического излучения в области субволнового отверстия

При прохождении света через субволновое отверстие наблюдается ряд особенностей. Электромагнитное поле в области диафрагмы имеет сложную структуру. Непосредственно за отверстием на расстояниях Z<100Ǻ располагается так называемая ближняя зона, в которой электромагнитное поле существует, в основном, в виде эванесцентных (не распространяющихся) мод, локализованных вблизи поверхности диафрагмы. В области расстояний Z>100 Ǻ располагается дальняя зона, в которой наблюдаются лишь излучательные моды. Мощность излучения за субволновой диафрагмой в дальней зоне может быть оценена по следующей формуле (3):

(3)

где k – волновой вектор,W0– плотность мощности падающего излучения.
Оценки показывают, что для излучения с длиной волны порядка 500 нм и диафрагмы с отверстием ~ 5 нм мощность излучения в дальней зоне составляет по порядку величин 10–10 от мощности падающего излучения. Поэтому, на первый взгляд, кажется, что использование малых отверстий для построения растровых оптических изображений исследуемых образцов практически невозможно. Однако, если поместить исследуемый объект непосредственно за отверстием в ближней зоне, то вследствие взаимодействия эванесцентных мод с образцом часть энергии электромагнитного поля переходит в излучательные моды, интенсивность которых может быть зарегистрирована оптическим фотоприемником.

Таким образом, ближнепольное изображение формируется при сканировании исследуемого образца диафрагмой с субволновым отверстием и регистрируется в виде распределения интенсивности оптического излучения в зависимости от положения диафрагмы I(x;y). Контраст на БОМ изображениях определяется процессами отражения, преломления, поглощения и рассеяния света, которые, в свою очередь, зависят от локальных оптических свойств образца [2].

С физической точки зрения Ближнепольная Сканирующая Оптическая Микроскопия (БСОМ) основана на присутствии в дальней зоне излучения вполне идентифицируемых следов взаимодействия света с микрообъектом, находящимся в ближнем световом поле, которое локализовано на расстояниях много меньших длины волны. В техническом смысле БСОМ сочетает элементы обычной оптики и сканирующей зондовой микроскопии. Отличительным элементом ближнепольных приборов является оптический зонд (рис. 2), обычно представляющий собой заостренное оптическое волокно, наружная поверхность которого, за исключением вершины конуса, покрыта непрозрачным слоем металла.

Рис. 2 Схема волоконно-оптического ближнепольного зонда: 1 – заострённое оптическое волокно; 2 – металлическое покрытие; 3 – проходящее через зонд излучение; 4 – выходная апертура зонда, d<<λ; 5 – поверхность исследуемого образца и расстояние до зонда, h<<λ. Штрихами очерчена область ближнепольного контакта.

При сканировании зонд собирает оптическую информацию с поверхности  образца с разрешением равным диаметру апертуры.
На практике используются несколько конструктивных схем ближнепольного оптического микроскопа. Основные конфигурации БОМ показаны схематично на рис. 3. Наиболее часто реализуется схема, в которой оптическое излучение лазера локализуется в пространстве с помощью волоконного зонда. Такая схема позволяет получить максимальную мощность излучения в области субволнового отверстия и проводить исследование образцов как на отражение (рис. 3 а)), так и на просвет (рис. 3 б)). Для увеличения чувствительности излучение, отраженное от образца или прошедшее сквозь образец, собирается на фотоприемнике с помощью фокусирующего зеркала или линзы. Кроме того, данная конфигурация БОМ широко используется в экспериментах по ближнепольной оптической литографии.
В экспериментах, когда требуются высокие уровни оптической накачки (как, например, при исследовании локальных нелинейных свойств образцов), реализуется схема, в которой мощное лазерное излучение направляется на исследуемую структуру, а прием осуществляется с помощью ближнепольного зонда[3].

Рис.3 Возможные конфигурации ближнепольного оптического микроскопа

В отличие от туннельного и атомно-силового микроскопов, сразу завоевавших признание, БСОМ некоторое время оставался в тени. Уникальные возможности БСОМ были убедительно продемонстрированы лишь в начале 90-х годов, когда удалось решить две важные технические проблемы: существенно повысить энергетическую эффективность зондов и обеспечить надежный контроль расстояния между острием и образцом. В последние годы в десятках лабораторий успешно ведутся работы по использованию БСОМ при решении широкого круга задач физики поверхности, биологии, техники записи и считывания информации и др. С 1993 года в США ведется промышленный выпуск приборов БПО.
К настоящему времени создано около 20 типов БСОМ, различающихся особенностями оптической схемы и функциональным назначением зонда. В зависимости от наличия или отсутствия диафрагмы на конце зонда их можно разбить на две основные группы: апертурные и безапертурные. Принцип действия апертурных БСОМ, составляющих преобладающее большинство современных приборов, поясняет приведенная на рис. 4 блок-схема микроскопа.
Луч лазера (обычно гелий-неонового или аргонового) через согласующий элемент попадает в заостренное металлизированное волокно и на выходе сужается до размеров диафрагмы. Взаимное перемещение острия и образца в трех измерениях x, y, z осуществляется с помощью пьезодвижителей. Прошедшие через образец или отраженные и рассеянные фотоны улавливаются одним из микрообъективов (2 или  1 соответственно, см. рис. 4) и направляются в регистрирующий прибор, обычнофотоумножитель. Такой микрообъектив, как правило, входит в схему обыкновенного оптического микроскопа, что позволяет осуществить выбор исследуемого участка и его привязку к более широкому полю. Приведенная на рис. 4 схема относится к приборам, работающим в режиме освещения (illumination mode). Широко распространены приборы, работающие в режиме сбора фотонов (collection mode), когда зонд переносит фотоны от образца, освещенного, например, через микрообъектив, к детектору. В комбинированном режиме (освещение / сбор) зонд выполняет одновременно обе функции.

Чтобы установить острие на нужной высоте над образцом, во всех сканирующих зондовых микроскопах используют зависимость величины I регистрируемого сигнала от z. В большинстве типов БСОМ зависимость I(z) неоднозначна, поскольку наряду с ближнепольным сигналом I1регистрируется также периодически изменяющийся с z сигнал I2 , вызванный интерференцией падающей и переотраженных в системе зонд-образец волн. Это затрудняет или делает полностью невозможным надежный контроль z по величине I = I1 + I2 при сближении острия с образцом. Лучшим решением проблемы является введение в БСОМ вспомогательных узлов, позволяющих им осуществлять также функции сканирующего туннельного или атомно-силового микроскопов, в которых определение z не вызывает существенных трудностей. В таких комбинированных приборах запись изображения осуществляется одновременно по двум каналам, один из которых воспроизводит рельеф поверхности, а другой - локальное распределение показателя преломления в тончайшем приповерхностном слое. Возможность различения оптического и топографического контрастов существенно упрощает интерпретацию изображения. Наибольшее распространение получил метод контроля z, основанный на изменении тангенциальной составляющей силы физического взаимодействия острия с образцом (shear force).


Рис.4 Блок- схема ближнепольного микроскопа

1-микрообъектив, работающий в отраженном свете;

2- микрообъектив, работающий в проходящем свете;

3- пьезодвижитель для перемещения зонда.

Штрихами очерчена область ближнепольного контакта


2.3 Разрешающая способность ближнепольных микроскопов

Основной характеристикой БСОМ является пространственное разрешение, которое в большей степени зависит от условий освещения или в более общем случае - от наблюдения образца, структуры его поверхности и микрогеометрии зонда. Как упоминалось ранее, функция импульсного отклика дифракционно-ограниченной оптической системы описывается распределением Эри. Полуширина главного максимума распределения соответствует разрешению по Рэлею:

  ∆x=0,61λ/sin φ         (4),
где
 φ - апертурный угол

В пределе при φ→π/2  x→∆xmin=0,61λ. При прохождении света через малую диафрагму из-за рассеяния и геометрических ограничений происходит искажение и расширение ∆ƒ спектра переносимых пространственных частот, которое также описывается распределением Эри ∆ƒ=0,61/a. В результате при а→0 волновое поле непосредственно за диафрагмой содержит сколь угодно большие пространственные частоты и как следствие этого xmin→0. В реальной ситуации из-за конечной проницаемости металлического экрана (покрытия) минимальный эффективный радиус диафрагмы определяется глубиной проникновения света в металл или толщиной δ скин-слоя. С учетом этого ожидаемое предельное разрешение, например, для зонда с алюминиевым покрытием в видимом диапазоне спектра составляет  xmin≈2δ≈13 нм, что соответствует лучшим экспериментальным результатам. Отсутствие физических ограничений размера вершины зонда в безапертурных БСОМ позволяет реализовать в них разрешение лучше 1 нм.


2.4 Определение ближнего поля

Критерий Рэлея является одной из иллюстраций принципа неопределенности Гейзенберга, согласно которому любая попытка повысить степень локализации или точность определения положения x источника света приводит к возрастанию неопределенности  сопряженного импульса фотонов. При рассеянии фотонов в максимальном диапазоне углов   ( - постоянная Планка,
 kx - x-компонента волнового вектора k) и . Возможность реализации разрешения , казалось бы, противоречит одному из основных физических принципов. Следует, однако, иметь в виду, что соотношение неопределенности в самом общем виде относится к положению частицы в импульсно-координатном пространстве. Поэтому, ограничивая одну из компонент волнового вектора, оно позволяет варьировать другие. Можно принять, например, , , где  - вещественное положительное число. Тогда При  область допустимых значений kx неограниченно растет, а x может быть сколь угодно малым.

Мнимым kz соответствуют затухающие волны. Следовательно, при реализации субволнового разрешения антенна-зонд должна располагаться в пределах затухающего поля вблизи поверхности образца, то есть заведомо при .

Мы можем теперь уточнить понятие ближнего поля, ассоциируя его с областью существования затухающих и, следовательно, нерадиационных волн, амплитуда которых меняется с расстоянием z от границы раздела сред или малого рассеивающего объекта по закону:

         (5),
где
 g > 0.

Величина g-1 характеризует глубину проникновения затухающей волны и по порядку соизмерима с размерами субволнового рассеивателя. В частности, для диафрагмы радиуса a в тонком проводящем экране . Для поверхности со сложным рельефом величина g-1 определяется суммарным вкладом компонент спектра пространственных частот, причем  m-я компонента с периодом  обнаружима на расстоянии (В режиме сбора фотонов точность воспроизведения профиля поверхности возрастает с увеличением числа m компонент затухающего поля, участвующих в образовании изображения, а значит, с уменьшением z.) В дальнем поле при  присутствуют лишь распространяющиеся волны, к которым применимы законы и ограничения обычной оптики. Естественно, что они также вносят вклад в результирующее поле в ближней волновой зоне. Структуру ближнего поля могут определять также и различного рода поверхностные резонансные электромагнитные моды, возбуждаемые светом вблизи выходного сечения зонда.

Решение задачи о прохождении света через диафрагму радиусом  в бесконечно тонком проводящем экране было впервые получено Г. Бёте. Оказалось, что диафрагма такого размера пропускает значительно меньше света, чем можно ожидать, экстраполируя результаты расчета при . В частности, сечение рассеяния  неполяризованного света связано с величиной a и волновым числом  соотношением:

      (6),

где  - угол падения излучения.

Формула (6) помимо численного коэффициента отличается от используемой в расчетах по методу Кирхгофа дополнительным множителем . Различие вызвано тем, что значительная часть электромагнитной энергии переходит в нерадиационную форму, которая не может быть воспринята удаленным наблюдателем. С точки зрения такого наблюдателя, диафрагма рассеивает свет как пара взаимно перпендикулярных диполей: электрического, направленного вдоль оси диафрагмы, и магнитного, моменты которых равны соответственно

        (7),

где  - электрический и магнитный векторы поля перед экраном. Чисто качественно формула (7) справедлива также и в случае, когда вместо диафрагмы выступает сфера радиуса a; при этом для количественного совпадения необходимо положить, что диэлектрическая проницаемость материала сферы .


3. Аппаратное обеспечение ближнепольной микроскопии

3.1 Микроскопия ближнего поля с использованием апертуры.

В общем случае зонд для апертурной микроскопии ближнего поля представляет собой заостренное оптическое волокно покрытое слоем металла и апертурой на острие волокна. Размер апертуры и материал покрытия варьируются в зависимости от методики и требуемого разрешения. Как правило, диаметр апертуры  50-100 нм, и в качестве покрытия используется алюминий или серебро[4].

 

Рис.5  Схема получения ближнепольного оптического изображения в точке с использованием апертуры

A - область ближнего поля (h << λ), B - область дальнего поля (h ≥ λ),

C - лазерное излучение, D - оптическое волокно, E - металлическое покрытие оптического волокна, F - апертура (d << λ), G – образец

3.2 Методики освещения и/или детектирования сигнала

Рис. 6 Различные методики ближнепольной оптической микроскопии с использованием апертуры

A - падающее и отраженное излучение идут по одному и тому же оптическому волокну; B - падающее излучение идет по оптическому волокну зонда, детектируется отраженное от поверхности образца излучение; C - для освещения образца используется внешний источник лазерного излучения, для сбора отраженного излучения используется зонд;
D - для подвода излучения к образцу используется зонд, детектируется прошедшее через образец излучение. Методика применима только к прозрачным образцам; E - для подвода излучения к образцу используется внешний источник лазерного излучения, детектируется излучение прошедшее через образец. Методика применима только к прозрачным образцам

4. Методы конфокальной микроскопии

4.1 Принципы конфокальной микроскопии

Впервые концепция построения конфокального микроскопа была разработана в середине 1950-х гг. аспирантом Гарвардского университета Марвином Мински (Marvin Minsky). Но широкий интерес к этой области проявился лишь в 1980-х гг., благодаря бурному развитию компьютерной и лазерной технологий. Сегодня  конфокальные микроскопы являются незаменимым инструментом для широкого спектра исследований как в научном поиске так и при контроле производственного процесса.

Термин “конфокальный” означает “софокусный” – в плоскости, оптически сопряженной с фокальной плоскостью объектива, находится конфокальная диафрагма.

Рис.7 Cхема конфокального микроскопа

Рассеянный свет, идущий из глубины образца, отрезаются апертурами, что обеспечивает высокий контраст изображения

Конфокальный микроскоп отличается от "классического" оптического микроскопа тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой (красные лучи на рис. 8а), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек (например, синие лучи на рис. 8б) в основном задерживается диафрагмой. Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку (рис. 8в). Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рис. 8г). Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рис. 8а.  Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца.

Рис. 8б.  Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.

Рис. 8в.  Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку.

Рис. 8г.  Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива (для подсветки и сбора отраженного сигнала).

Качественно понятно, что применение конфокальной схемы должно приводить к увеличению контрастности изображения, за счет того, что "паразитный" свет от точек соседних с анализируемой перестает попадать в детектор. Платой за увеличение контрастности будет необходимость применения достаточно сложных схем сканирования либо образцом, либо световым пучком.

Конфокальная микроскопия отличается от обычной микроскопии, в первую очередь, улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива (ось Z), которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации отраженных от образца лучей. Только свет, отраженный от образца в фокусной плоскости линзы объектива может пройти обратно сквозь линзу и отверстие, и влиять на построение изображения поверхности. В качестве специального фильтра в конфокальных микроскопах фирмы Nanafocus AG используется вращающийся диск с тысячами отверстий. Его прототипом стало датируемое ещё 1884 годом изобретение германского учёного Paul Nipkow, обеспечивающее передачу изображений на расстояние. Диск Нипкова имеет множество отверстий, которые формируют множество точек света для создания конфокального изображения. Диск вращается и получается конфокальное изображение поверхности над полем зрения. Любая ошибка волнового фронта  корректируется измерением оптически плоской поверхности. Применение принципа конфокальности приводит к значительному увеличению контрастности изображения. Именно высокая контрастность изображений, полученных на конфокальном микроскопе, позволила значительно расширить круг задач, изучаемых оптическими методами. Несмотря на то, что увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а следовательно и максимальное эффективное увеличение в конфокальном микроскопе возрастает менее чем в 1,5 раза по сравнению с аналогичным по качеству широкопольным микроскопом, возможности в разрешении мелких структур возрастают многократно. Кроме того, если в обычных микроскопах в качестве источника света, используется ртутная или ксеноновая лампа, то в современных конфокальных микроскопах – это лазер (или светодиод). Преимущество светодиодных источников света по сравнению с ламповыми – это монохроматичность генерируемого света (ширина линии генерации значительно меньше 1нм) и малая расходимость (т.е. высокая параллельность) пучка света. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчета.
Как выглядит изображение в конфокальном микроскопе? Если Вы в объектив обычного микроскопа смотрите и видите его просто глазом, то в конфокальном микроскопе Вы не сможете видеть изображение просто глазом. На конфокальном микроскопе изображение Вы увидите на экране компьютера. Результаты сканирования поверхности передаются в компьютер, который формирует изображение и выводит его на экран монитора. Мощное программное обеспечение позволяет не только оцифровать объект в системе x-y-z координат, но сразу же визуализировать его как 3D-объект. При этом цифровая модель объекта может быть сохранена и сохранена на компьютере и в дальнейшем вызвана для обработки или сравнения.
 
Скорость получения информации об объекте составляет несколько секунд.


4.2 Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе

Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF) , имеет вид

       

(1)

Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами , либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами , тогда конфокальная PSF есть произведение независимых вероятностей.
На рис. 9 приведено изображение обычной PSF и конфокальной PSF.

Рис. 9  Конфокальная PSF  показана справа,а обычная PSF – слева

Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа

      

(2)

в то время как для обычного микроскопа

      

(3)

где .

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рис. 10 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) невозможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея. В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рис.10) данный объект должен хорошо регистрироваться.

Рис. 10 Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок). Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого.

Распределение интенсивности вдоль оптической оси для конфокального микроскопа определяется выражением

      

(4)

Тогда пользуясь критерием Релея получим разрешение вдоль оптической оси

       

(5)

Здесь важно отметить, что не следует путать разрешение вдоль оптической оси и глубину фокуса в обычном микроскопе. Обычно глубина фокуса в сотни раз превышает разрешение вдоль оптической оси.

4.3 Влияние диафрагмы в фокальной плоскости

Один из параметров, который никак не фигурировал в данном выше описании - это размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Отметим, что при анализе мы молчаливо предполагали источник точечным и именно в этом предположении получили функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа. Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором. Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.
Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы. Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.
Для того, чтобы учесть наличие диафрагмы математически и построить новую функцию распределения интенсивности, следует выполнить свертку

(6)

а для конфокального микроскопа уже полученную функцию  умножать на . Результирующее распределение интенсивности для случая диафрагмы с размером 5 пятен Эйри приведено на рис. 11. 

Рис.11 Функции размытия точки для обычного микроскопа с диафрагмой размером 5 пятен Эйри (верхние рисунки) и для конфокального микроскопа (нижние рисунки)


4.4 Преимущества и недостатки конфокального микроскопа.

Основными преимуществами конфокальной микроскопии по сравнению с обычной световой микроскопией являются:

1. Выше контрастность изображения.

2. Разрешающая способность выше, чем у (латеральная в 1.4 раза, аксиальная – в зависимости от размера конфокальной диафрагмы).

3. Возможность получать «оптические срезы», трехмерная реконструкция.

4. Мультиспектральные исследования с высокой степенью разделения сигналов от разных флуорохромов.

5. Возможности применения методов цифровой обработки изображений.

К недостаткам конфокальной микроскопии можно отнести:

1. Сложность в настройке.

2. Отсутствие в ЛСКМ «оптического» изображения. Оно существует только в цифровой форме и отображается на экране монитора.

3. Высокая стоимость


5.Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп

5.1 История создания и принцип работы

           В 90-х годах достижения в оптике и электронике позволили создать более мощные и надежные лазеры, сканирующие зеркальные элементы с высоким коэффициентом полезного действия, высокопроизводительную волоконную оптику, более тонкий слой диэлектрического покрытия и детекторы, уменьшившие шумовые характеристики.  Благодаря появившимся в конце 90-х годов высокоскоростным компьютерным системам, увеличенным мониторам и технологиям, позволяющим запоминать большой объем информации, наступил новый взрывной этап в развитии КЛСМ по количеству применений, на которые она могла быть нацелена. Первые сообщения о применении конфокального лазерного сканирующего микроскопа для получения изображений кожи человека in vivo были опубликованы в 1995 г. В 90-х годах группы исследователей (S. Gonzalez и соавт.) занимались изучением различных патологических состояний кожи с помощью отражательной конфокальной микроскопии и показали большую значимость данного метода как полезного диагностического инструмента.

           В зависимости от применяемого источника света существуют разные виды конфокальной микроскопии. Конфокальная микроскопия может выполняться с использованием лазера в качестве источника света или без него. В тандемном сканирующем конфокальном микроскопе обычно используется ртутная лампа. По сравнению с тандемным сканирующим конфокальным микроскопом при КЛСМ используется лазерный луч определенной длины волны и высокой мощности освещения. Кроме того, различают флюоресцентную и отражательную КЛСМ. Благодаря своей безопасности и неинвазивности прижизненная отражательная КЛСМ является более предпочтительной в использовании.

          Основной принцип отражательной КЛСМ основан на использовании точечного источника света  (лазерный луч), освещающего маленькое пятно внутри ткани, с последующим улавливанием отраженного света через оптически соединенную апертуру (вкрапление) (рис.12). Отраженный свет проходит через вкрапление, в результате чего только находящийся в фокусе свет достигает детектора, в то время как свет вне фокуса отклоняется. Таким образом, определяется единственный план внутри образца, который расположен в фокусе. Числовая апертура линзы объектива, длина волны и размер открытой апертуры (вкрапления) определяют разрешение изображения, получаемого с помощью отражательной КЛСМ. Лазеры различных длин волн могут быть использованы в качестве источника света для отражающей конфокальной микроскопии. Более длинные, близкие к инфракрасным, длины волн проникают глубже в кожу, но дают более низкое разрешение по сравнению с короткими длинами волн видимого спектра. Отражение света возникает в результате местных различий в коэффициенте преломления внутри ткани. Для отдельных органелл и структур оно обусловлено разницей в коэффициентах преломления по сравнению с ближайшим окружением. Меланосомы дают сильное отражение с длинами волн видимого (400—700 нм) и близкого инфракрасного (700—1064 нм) спектров из-за высокого индекса преломления по сравнению с окружающим эпидермисом. Поэтому клетки, содержащие меланин, такие как базальные кератиноциты и меланоциты, дают яркое изображение [9].

Рис.12 Схема  конфокального лазерного сканирующего микроскопа

5.2 Разрешающая способность КЛСМ.

Разрешающая способность (resolution) определяет предел различимости деталей изображения (это минимальное расстояние между двумя точками объекта, при котором прибор может различать их как отдельные структуры) и поэтому является одной из главных характеристик  микроскопа. В обычном микроскопе и ЛКСМ механизмы формирования изображения различны, и это различие косвенно находит выражение в значении разрешающей способности. Оценивается разрешающая способность по характеру дифракционных явлений, возникающих при микроскопировании близко расположенных точечных светящихся объектов. Критерии ее оценки основаны на анализе функции рассеяния точки.

Теоретически, разрешение конфокального микроскопа приблизительно в 1,4 раза лучше обычного. Оно зависит, в первую очередь, от длины волны источника излучения. А так как конфокальный и обычный микроскопы - оптические приборы, предназначенные для исследований в видимом диапазоне спектра, то существует предел, накладываемый волновыми свойствами света. Также, как говорилось выше, немалое значение при этом имеет апертура объектива. Конструктивно этот предел тоже достигнут.

Разрешающая способность конфокального микроскопа бывает латеральной (находится в плоскости, которая перпендикулярна оптической оси системы) и аксиальной (находится в вдоль оптической оси). Как правило, аксиальная составляющая разрешения, в 2-3 раза хуже латеральной. Также, важное значение при определении разрешения имеет диаметр конфокальной диафрагмы, т.к. от него зависит толщина слоя (чем меньше диаметр, тем меньше толщина слоя), с которого снимается оптический сигнал, т.е. аксиальное разрешение. Но здесь получается «палка о двух концах» - чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньшее количества света будет достигать фотодетектора.
           Поскольку в конфокальном микроскопе еще и присутствует электроника, преобразующая световой сигнал в аналоговый, а затем в цифровой, то его разрешение зависит не только от оптических узлов, но и от электронных систем. Однако все эти преобразования могут ухудшить разрешение ЛСКМ. Например, на его разрешающую способность влияют такие параметры как формат кадра (т.е. число пикселов – элементов изображения на кадр) и электронное увеличение (zoom) не к максимальному увеличению прибора, а к использованию высокоапертурных объективов. Параметры сканирующей системы должны соответствовать параметрам объектива. Для правильной настройки конфокального микроскопа существуют специальные таблицы и графики. В том случае, если необходимо исследовать (а не просто обнаружить) структуры размером менее 0.2 мкм, то для этого придется применять другие методы, например, электронную микроскопию.


6.Применение конфокального микроскопа.

К настоящему времени применение конфокальной микроскопии в значительной степени вышло за рамки первоначально предполагаемого М. Минским ее использования в качестве средства исследования микроструктур головного мозга. Для исследователей, чья работа связана с изучением биологии, биофизики, биохимии и физиологии клетки, ЛКСМ стал незаменимым инструментом как для наблюдения внутриклеточных структур, так и для количественной оценки процессов в клетках, клеточных мембранах, внеклеточном окружении.

1. Диагностика примесей в водном растворе. В настоящее время актуальными являются методы исследования структуры воды и примесей, а также эффективности различных способов ее фильтрации. [7]

2. Оригинальные исследования, посвященные различным разделам биологии клетки: исследования в области нейробиологии (исследования центральной и периферической нервной системы, микроциркуляции в сосудах мозга, внутриклеточных структур, цитоскелета, рецепторов, мембран нейронов ; исследования клеточного ядра и его генетического аппарата; исследования

митохондрий и проблем митохондриального транспорта; исследования транспорта кальция и его локализаций.[8]

3. Оригинальные исследования, проводимые in vivo. Это перспективное направление применения конфокальной микроскопии в неинвазивной диагностике многих паталогий активно развивается в офтальмологии, дерматологии и проктологии.

4. Исследования в области физики твердого тела

4.1 Изучение полупроводниковых пленок

4.2 Изучение полупроводниковых нанокластеров

4.3 Анализ профилей механических напряжений облученных материалов.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ближнепольная оптическая микроскопия — оптическая микроскопия, обеспечивающее разрешение лучшее, чем у обычного микроскопа. Повышение разрешения БОМа достигается детектированием рассеяния света от изучаемого объекта на расстояниях меньших, чем длина волны света. В случае, если зонд микроскопа ближнего поля снабжен устройством пространственного сканирования, то такой прибор называют сканирующим оптическим микроскопом ближнего поля. Такой микроскоп позволяет получать растровые изображения поверхностей и объектов с разрешением ниже дифракционного предела.

Конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет применения подсветки сфокусированной объективной линзой в область анализа и размещения диафрагмы в плоскости наблюдения перед фотодетектором. Такое увеличение контрастности приводит к возможности разрешения объектов, имеющих разницу в интенсивности до 200:1.

В конфокальной микроскопии несколько улучшается разрешение в плоскости объекта (в 1.5 раза) и достигается высокое разрешение вдоль оптической оси.

Платой за полученные улучшения является необходимость применения схем сканирования, либо путем перемещения образца, либо путем перестройки оптической системы. Применение сканирования позволяет увеличить поле зрения по сравнению с обычными оптическими микроскопами.



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вейко В.П., Вознесенский Н.Б., Воронин Ю.М., Родионов С.А.,
Смирнов И.Б., Калачев А.И. Лазерная нанотехнология формирования оптических антенн для ближнепольных микроскопов и исследование их характеристик// Известия РАН. Серия физическая, 1999.т.63, №10. с.194-196;

2. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии // РАН Институт физики микроструктур, Нижний Новгород, 2004,-111с.;

3. Ч. Пул-мл, Ф. Оуенс. Нанотехнологии//М.: Техносфера. 2006.-327 с.

4. Образцова Е., Яминский И. Современные достижения нанооптики // Научно-технический журнал Наноиндустрия .2008.- №1;

5. Яминский И.В.  Зондовая микроскопия: методы и аппаратура, – М.: Научный мир.2008.-86 с.

6. Резник А.Н.   Ближнепольная сверхвысокочастотная микроскопия;

Институт физики микроструктур РАН, ГСП-105, Н.Новгород,2009.

7. Ковалев Ю.С., “Использование лазерной конфокальной микроскопии для исследования низкоразмерных структур.”, Письма в ЭЧАЯ 2010, Т.7, №5 (161) .

8.Лежнев Э.И., Попова И.И., КузьминС.В., СлащевС.М.  Конфокальная сканирующаямикроскопия: принципы, устройство, применение (часть 2) // Научное приборостроение.-2001.-Т.11.-№3.- С.26-42.

9. Лукашева Н.Н., Ткатченко С.Б., Потекаев Н.Н., Кузьмина Т.С., Василевская Е.А. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии//клиническая дерматология и венерология №5,2008.- 8 с.

PAGE   \* MERGEFORMAT 2


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

13582. Самый несчастный человек – это тот, для кого в мире не нашлось работы 16.08 KB
  Самый несчастный человек – это тот для кого в мире не нашлось работы. Т. Карнеги В выбранном мною высказывании автор британский писатель и философ Томас Карнейль обращается к проблеме роль труда в жизни человека. Эта проблема безусловно важна так как любой человек...
13583. Деньги – слуги, если умеешь ими пользоваться. Если не умеешь – господа 28 KB
  Деньги – слуги если умеешь ими пользоваться. Если не умеешь – господа. Латинская поговорка В выбранном мною высказывании поднимается проблема сущности денегих функций. Проблема того как относиться к деньгам всегда волновала не только экономистов. Как не стать рабо
13584. Инфляция – единственная форма наказания без особого основания 33.5 KB
  Инфляция – единственная форма наказания без особого основания. Милтон Фридмен Выбранное мною высказывание затрагивает вопрос о сущности и причинах инфляции. Данная тема несомненно актуальна в настоящее время так как в современном мире экономическая ситуация не...
13585. Инфляция это единственная форма наказания без законного основания 15.64 KB
  Инфляция единственная форма наказания без законного основания М. Фридман Автор данного высказывания затрагивает проблему роли и места инфляции в экономике ее воздействия на субъекты рынка. Данная проблема очень актуальна в наши дни ведь борьба с растущей инфл...
13586. Инфляция – единственная форма наказания без законного основания (Милтон Фридмен) 17.84 KB
  Инфляция – единственная форма наказания без законного основания Милтон Фридмен Выбранное мною высказывание посвящено сущности понятия инфляции и ее роли в рыночной системе экономики. Эта проблема всегда остается актуальной особенно в условиях рыночной экономик
13587. Инфляция - единственная форма наказания без законного основания. Милтон Фридман 16.89 KB
  Инфляция единственная форма наказания без законного основания Милтон Фридман Выбранное мною высказывание поднимает проблему роли и места инфляции в экономике а также её воздействия на субъектов рынка. Данная проблема достаточно актуально для многих развивающихся...
13588. Экономическая конкуренция – это не война, а соперничество в интересах друг друга 16.45 KB
  Экономическая конкуренция – это не война а соперничество в интересах друг друга. Э. Каннан В выбранном мною высказывании рассматривается сущность такого понятия как экономическая конкуренция ее важность для экономики рыночного типа. В современной России основы р
13589. Конкуренцию никак нельзя соединить с планированием, не ослабляя ее как фактор организации производства 13.98 KB
  Конкуренцию никак нельзя соединить с планированием не ослабляя ее как фактор организации производства. Ф. фон Хайек Выбранное мною высказывание связано с пониманием сущности конкуренции и ее антипода – планирования. Именно конкуренция обеспечивает взаимосвязи ры
13590. Слово «кризис», написанное по-китайски, состоит из двух иероглифов: один означает «опасность», другой – «благоприятная возможность» 15.47 KB
  Слово кризис написанное покитайски состоит из двух иероглифов: один означает опасность другой – благоприятная возможность Джон Кеннеди В данном высказывании затрагивается проблема сущности экономического кризиса и его последствий. Эта проблема очень актуа