49531

Методы анализа бактериостойкости материалов и изделий

Курсовая

Биология и генетика

Цель работы: закрепление и углубление знаний, полученных при изучении курса микробиологии, приобретение практических навыков и опыта работы в микробиологической лаборатории. Ознакомление с понятием «биоповреждение», его видами и механизмами возникновения, подробное изучение методов анализа бактериостойкости материалов и изделий, а также способов их защиты от биоповреждений.

Русский

2014-01-15

937 KB

23 чел.

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ
«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

Факультет ТОВ

Кафедра Физико-Химических Методов Сертификации Продукции

Специальность 1-54 01 03 «Физико-химические методы и приборы контроля

качества продукции»

Специализация 1-54 01 03 02 «Сертификация продовольственных товаров»

КУРСОВАЯ РАБОТА

по дисциплине: «Микробиология»

Тема: «Методы анализа бактериостойкости материалов и изделий»

                                                                                                      

Исполнитель

студентка 4 курса группы 14 _________  Черевко Н. С.

                                                                                                      подпись, дата

Руководитель

доцент кафедры БТ и БЭ      __________  Игнатенко А. В.

                                                должность, ученая степень, ученое звание       подпись, дата

Курсовая работа защищена с оценкой  ___________

Руководитель ____________   Игнатенко А. В.

      подпись

 

Минск 2011

Реферат

Курсовая работа содержит 61 страницу, 4 таблицы, 9 рисунков, 23 литературных источника.

БИОПОВРЕЖДЕНИЯ,  БАКТЕРИИ, МИКРООРГАНИЗМЫ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ, АКТИВНОСТЬ, ЗАЩИТНЫЕ ПОКРЫТИЯ, ПОЛИМЕРНЫЕ МАТЕРИАЛЫ, БИОЦИДЫ, БИОСТОЙКОСТЬ, МЕТОД, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Цель работы: закрепление и углубление знаний, полученных при изучении курса микробиологии, приобретение практических навыков и опыта работы в микробиологической лаборатории. Ознакомление с понятием «биоповреждение», его видами и механизмами возникновения, подробное изучение методов анализа бактериостойкости материалов и изделий, а также способов их защиты от биоповреждений.

Курсовая работа включает основную и экспериментальную части.

В основной части представлена подробная характеристика биоповреждений, их видов и механизмов возникновения, дано описание микроорганизмов-деструкторов, рассмотрены методы обнаружения и идентификации микроорганизмов, приведен перечень способов защиты материалов и изделий от биоповреждений микрооганизмами, а также описаны методы, применяемые для оценки материалов и изделий на биостойкость.

Экспериментальная часть несет информацию об экспериментальных исследованиях, проведенных с целью оценки биостойкости материалов различными методами и определения защитного действия биоцидных веществ на материалы и изделия.

Содержание

Введение……………………………………………………………...…………………...5

1 Основная часть……………………………………………………………......………..7

1.1 Биоповреждения материалов изделий и их виды…………………………………..7

1.1.1 Виды бактериальных биоповреждений и их характеристика………..........7

1.1.2 Факторы, влияющие на биоповреждения объектов…………………..…..10

1.1.3Механизмы бактериальных биоповреждений……….…………………….11

1.2 Характеристика микроорганизмов-деструкторов………………………………....12

1.2.1 Хемолитотрофные микроорганизмы (тионовые, нитрифицирующие,  железобактерии)…………………………………………………………………………….12

1.2.2 Гетеротрофные бактерии (протеолитические, липолитические, гликолитические)…………………………………………………………………………………15

1.2.3 Метаногенные бактерии и их свойства……………………………………22

1.3 Методы обнаружения и идентификации м/о………………………………………23

1.3.1 Методы обнаружения бактерий и определения их численности………...23

1.3.2 Методы выделения микроорганизмов-деструкторов……………………..29

1.3.3 Методы определения активности микроорганизмов и продуктов их метаболизма…………………………………………………………………………………...32

1.4 Способы защиты материалов и изделий от биоповреждений м/о………………...35

1.4.1 Использование защитных покрытий……………………………………….35

1.4.2 Полимерные материалы с антимикробными свойствами………………...36

1.5 Методы оценки биостойкости материалов и защитных покрытий……………….38

1.5.1 Почвенный метод……………………………………………………………38

1.5.2 Метод агаровых сеток………………………………………………….……39

1.5.3 Метод агаровых блоков………………………………………………….….41

1.5.4 Методы оценки адаптации бактерий к антимикробным веществам….….42

2 Экспериментальная часть……………………………………………………...………44

2.1 Материалы и оборудование………………………………………………………….44

2.2 Микроорганизмы и питательные среды…………………………………………….44

2.2.1 Питательные среды для культивирования микроорганизмов…………….44

2.2.2 Выделение чистых культур бактерий……………………………….……...46

2.3 Методы анализа………………………………………………………………………48

2.3.1 Определение общего количества бактерий методом культивирования….48

2.3.2 Построение калибровочной зависимости м/о по спектру мутности…......48

2.3.3 Анализ физиологической активности бактерий редуктазным методом…49

2.3.4 Метод определения эффективных концентраций биоцидов……………...50

2.3.5 Оценка защитного действия биоцидных веществ методом «агаровой сетки» и «агаровых блоков»………………………………………………………………...51

2.3.6 Оценка защитного действия биоцидных веществ микрокалориметрическим методом…………………………………………………………………………….52

2.4 Результаты исследований и их обсуждение………………………………………..53

2.4.1 Оценка биостойкости материалов по ГОСТ 9.048………………………...53

2.4.2 Анализ биостойкости материалов по методу «агаровой сетки» и «агаровых блоков»……………………………………………………………………………..54

2.4.3 Характеристика биостойкости материалов микрокалориметрическим методом…………………………………………………………………………………….56

Заключение…………………………………………………………………….....59

Список использованной литературы…………………………………………....60

Введение

Бурное развитие техники, освоение необжитых территорий, активное градостроительство, создание новых материалов сделали проблему биоповреждений одной из наиболее актуальных и научно-практических проблем. Человек издавна боролся с обрастанием судов, с насекомыми, с разрушающими деревья грибами, однако все это составляло лишь ничтожную долю тех потерь, с которыми он столкнулся в наши дни, и тех усилий, которые он вынужден тратить на защиту от биоповреждений. Бактерии, грибы, лишайники, водоросли, высшие растения, простейшие, кишечнополостные, черви, мшанки, моллюски, членистоногие, иглокожие, рыбы, птицы, млекопитающие – таков перечень групп, представители которых выступают в роли биоповреждающих агентов, нанося огромный ущерб хозяйству человека.

Мишенью биоповреждающего действия стали кирпичные и каменные здания, строительные сооружения, древесина и разнообразные изделия из нее, металл и металлические изделия, бумага, документы, фото архивы, библиотечные фонды, музейные ценности, краски, клеи, кожи, шерсть, одежда, обувь, стекло, силикаты, оптика, разнообразные пластмассы, полимеры, резины, радиоаппаратура и электрооборудование, дорожные покрытия, транспорт и многое другое. В одних случаях живые организмы разрушают материалы и изделия, в других – ухудшают их технологические характеристики и свойства, в третьих – затрудняют нормальную работу. Только  учтенные потери от биоповреждений составляют 5–7% стоимости мировой промышленной продукции, и они имеют тенденцию к росту.

Вышеизложенное свидетельствует об острой необходимости разработки наиболее эффективных методов оценки биостойкости материалов и изделий, а также способов их защиты от биоповреждений.

Проблемы защиты от биоповреждений требуют комплексного решения, так как создаваемые методы должны быть не только эффективными для борьбы с разрушающими микроорганизмами, но и рациональными с экономической точки зрения.

Целью данной курсовой работы является ознакомление с понятием «биоповреждение», его видами и механизмами возникновения, подробное изучение методов анализа бактериостойкости материалов и изделий, а также способов их защиты от биоповреждений с последующим применением знаний на практике.

Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:

1собраны литературные сведения в соответствии с темой курсовой работы с последующим осмыслением и систематизацией;

2 проведены экспериментальные исследования с целью оценки биостойкости материалов различными методами и определения защитного действия биоцидных веществ на материалы и изделия;

3 проведена оценка результатов исследований и дана их характеристика.

1 Основная часть

  1.  Биоповреждения материалов и изделий и их вид

1.1.1 Виды бактериальных биоповреждений и их характеристика

Воздействие живых организмов на промышленное сырье, материалы и изделия может существенно изменить их потребительские свойства, снизить качество, а в ряде случаев привести к полному их разрушению.

Свойства сырья, материалов и изделий, в том числе и потребительские, могут изменяться при хранении, эксплуатации, иногда и при производстве под воздействием физико-химических, механических и биологических факторов, вызывающих соответствующие повреждения (физико-химические, механические, биологические).

Эти повреждения возникают параллельно или последовательно, усиливая друг друга.

Нет сомнений в том, что при любых нарушениях режимов хранения, тем более при аварийных ситуациях происходит биологическое повреждение.

Согласно нормативным документам, понятие биоповреждение определяется как повреждение материалов, сырья и изделий под воздействием биологического фактора [1].

Повреждать материалы способны разнообразные организмы – бактерии и грибы, лишайники, водоросли и высшие растения, простейшие и кишечнополостные, черви, моллюски и членистоногие, рыбы, птицы и млекопитающие. Однако наиболее активные возбудители повреждений – мицелиальные грибы и бактерии, на долю которых приходится до 20 % от общего числа повреждений.

Среди биоповреждений следует выделять:

         1 собственно биоповреждения;

2 биобрастания;

3 биозасорения;

4 биокоррозия.

1 Собственно биоповреждения материалов  при всем многообразии живых организмов и способов их воздействия сводятся к химическим и механическим изменениям.

Бактерии в данном случае оказывают на материалы прежде всего химическое воздействие, а насекомые и животные наносят, как правило, механические повреждения.

Таким образом, собственно повреждения материалов живыми организмами можно свести к двум типам:

1) использование материала в качестве источника питания (ассимиляция);

2) воздействие на материал, которое не связано с процессом питания и приводит к механическому или химическому разрушению материала (деструкция).

Виды материалов, способных подвергаться бактериальным биоповреждениям представлены в таблице 1:

Таблица 1

Материалы

Тип повреждения

Ассимиляция

Деструкция

Неорганические:

металлы

силикаты

отсутствует

отсутствует

присутствует

присутствует в редких случаях

Органические химические:

полимеры

синтетические волокна

присутствует

присутствует

присутствует

присутствует

Органические природные:

древесина

бумага

присутствует в редких случаях

присутствует в редких случаях

присутствует в редких случаях

присутствует в редких случаях

Текстильные волокна

присутствует

присутствует

Кожа, мех (готовые)

присутствует в редких случаях

присутствует в редких случаях

Кожевенное сырье

присутствует

присутствует

2 Биобрастание – это обрастание поверхности сырья, материалов и изделий, которое может осуществляться под химическим воздействием или без него. Биообрастание представляет собой достаточно сложный процесс, который происходит при участии не какой-то одной определенной группы микроорганизмов, а в результате жизнедеятельности различных групп и популяций.

3 Биологическое засорение объекта (биозасорение) – состояние объекта, связанное с присутствием биофактора, после удаления которого восстанавливаются функциональные свойства объекта.

4 Биокоррозия – коррозия металлов, вызываемая микроорганизмами, а также продуктами их жизнедеятельности, в частности промежуточными и конечными продуктами биохимимических реакций (органические кислоты, аммиак, сероводород и др.). В атмосферных условиях биокоррозия поверхностей металлов, покрытых лаками, красками или контактирующих с резиной, пластмассами, кожей, нефтепродуктами и т. д., вызывают плесневые грибки и бактерии, в подземных условиях - чаще всего сульфат-восстанавливающие бактерии, в морских – различные морские бактерии и организмы. Для предупреждения биокоррозии поверхностей и уничтожения вызывающих её организмов применяют обработку фунгицидами.

В результате воздействия микроорганизмов на сырье, материалы и изделия в них возникают дефекты.

По степеням значимости различают дефекты критические, значительные и малозначительные.

Критические дефекты – несоответствие изделий установленным требованиям, которые могут нанести вред здоровью или имуществу потребителей или окружающей среде.

Значительные дефекты – дефекты, которые влияют на свойства материалов, но не влияют на безопасность для потребителя или окружающей среды.

Малозначительные дефекты – дефекты, не оказывающие влияния на свойства изделий, в первую очередь, на назначение, надежность и безопасность. К ним, в частности, относится биозасорение.

В зависимости от наличия методов и средств обнаружения дефекты подразделяются на явные, для которых предусмотрены методы и средства обнаружения, и скрытые, для которых возможно применение специальных методов и средств обнаружения.

Для биоповреждений характерны именно скрытые дефекты, для обнаружения которых необходимо специальное оборудование.

В зависимости от наличия методов и средств устранения дефекты делят на устранимые и неустранимые.

Устранимые дефекты – дефекты, после устранения которых товар может быть использован по назначению. Такие дефекты характерны только для биозасорения.

Неустранимые дефекты – дефекты, которые невозможно или экономически невыгодно устранять. Например, при биоповреждении оптики прибор может быть восстановлен только после разборки и дополнительной шлифовки поверхности. В других случаях критические дефекты при биоповреждениях практически неустранимы.

Таким образом, при биоповреждении сырья, материалов и изделий происходит:

– изменение химических свойств в результате окисления или гидролиза компонентов материала: под действием микроорганизмов изменяется кислото- и щелочестойкость, устойчивость к действию окислителей, восстановителей и органических растворителей;

– изменение физико-механических свойств материалов, например, потеря прочности древесины, резины, пластиков, тканей под действием микроорганизмов или продуктов их обмена веществ, набухание резины, потеря адгезии лакокрасочных покрытий;

– изменение оптических свойств, например, цвета, блеска, прозрачности, преломления света;

– ухудшение электрофизических свойств, например, снижение электроизоляционных свойств материалов;

– изменение органолептических свойств, например, появление дурного запаха при гниении, появление слизи на твердых поверхностях.

Сочетание благоприятной кислотности и высокой влажности, а также наличие большого количества органических веществ приводит к заселению поверхности материалов различными видами микроорганизмов, в основном, бактериями, плесневыми грибами и микроскопическими водорослями. Характер вызываемых ими повреждений определяется эксплуатационными условиями, в которых оказывается тот или иной материал или изделие. Бактерии развиваются при наличии жидких сред, т. е. на материалах и изделиях, достаточно увлажненных или погруженных в жидкость. При недостатке влаги бактериальные процессы подавляются.

Воздействие бактерий, главным образом, сказывается на физических свойствах материалов. Так, бактерии изменяют углеводородный состав топлива и смазочно-охлаждающих жидкостей. Сульфатвосстанавливающие бактерии вызывают биокоррозию нефтепромышленного оборудования. Вода, закачиваемая в нефтяные пласты, растворяет в породах сульфаты, а сульфатвосстанавливающие бактерии восстанавливают их до сероводорода. Сероводород ухудшает качество нефти и способствует коррозии металлов нефтедобывающего оборудования.

В грунтах, содержащих сульфаты, бактерии вызывают коррозию стали нефте- и газопроводов. Тионовые бактерии в аэробных условиях могут окислять в грунтах серу или ее восстановленные соединения до серной кислоты, которая в водных растворах поступает в подземные сооружения, вызывая их коррозию. В условиях соприкосновения стальных конструкций с водами, содержащими закисное железо и незначительное количество органических веществ, железо быстро окисляется железобактериями. В нефтяной промышленности более 77 % коррозионных потерь оборудования происходит в результате биокоррозии [2].

1.1.2 Факторы, влияющие на биоповреждения объектов

Главным фактором, оказывающим влияние на биоповреждения является биологический фактор. Под биологическим  фактором  подразумевают организмы

или их сообщества, воздействие которых на объект техники нарушает его исправное или работоспособное состояние. Наиболее агрессивны по отношению к материалам и изделиям микроорганизмы (микроорганизмы-деструкторы, биодеструкторы): микроскопические грибы, бактерии, дрожжи. Являясь составной частью

окружающей среды, биодеструкторы в силу специфики своей жизнедеятельности

способны быстро адаптироваться к самым различным материалам и постоянно изменяющимся условиям. Практически все используемые в изделиях техники материала подвержены повреждающему воздействию микроорганизмов –микробиологическому повреждению.

Микроорганизмы попадают на сырье и изделия в процессе их производства, транспортировки, хранения и эксплуатации из окружающей среды. Под влиянием ферментов и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов происходят деструкция структуры и ухудшение свойств изделий: эстетических, функциональных, экологических, безопасности. Наблюдаются изменение первоначального цвета изделий, появление нежелательной окраски, гнилостного запаха, уменьшение блеска и т. п.

Биоповреждения товаров зависят не только от их физической и химической структуры, вида воздействующих микроорганизмов; но и от загрязнения атмосферы, сопутствующих материалов, климатических факторов, преобладания определенной микрофлоры в верхних почвенных слоях.

Различные объекты в той или иной степени способны сохранять устойчивость по отношению к биоповреждениям. Данная устойчивость характеризуется таким термином, как стойкость к воздействию биологического фактора (биостойкость), представляющего собой свойство объекта сохранять значение показателей в течение заданного времени в процессе или после воздействия биофактора.

При ухудшении условий хранения объектов и достижении условий, благоприятных для развития бактерий, бактериостойкость понижается, и как следствие возрастает вероятность протекания биоповреждения. Таким образом, для заселения объектов бактериями наиболее подходящим условием является сочетание благоприятной кислотности и высокой влажности, а также наличие большого количества органических веществ. Бактерии развиваются при наличии жидких сред, т. е. на материалах и изделиях, достаточно увлажненных или погруженных в жидкость. При недостатке влаги бактериальные процессы подавляются. Кроме того, для различных видов изделий, существуют характерные факторы, влияющие на возникновение биоповреждений.

Рассмотрим влияние факторов, оказывающих влияние на биоповреждения на примере некоторых объектов.

Так, большое влияние на микробиологическую стойкость лакокрасочных покрытий оказывает солнечная радиация, колебания температуры и влажности воздуха, загрязнение поверхности пылью и солями, воздействие различных газов и др. Они способствуют процессам старения лакокрасочных покрытий и подготавливают питательную среду для микроорганизмов. Микробиологическим повреждениям лакокрасочных покрытий благоприятствуют также нарушения технологий нанесения покрытий и требований по уходу за ними в эксплуатации.

Микробиологическая стойкость резинотехнических изделий (РТИ) во многом

зависит от их компонентного состава. Росту микроорганизмов способствуют также и другие компоненты (стеарин, дибутилфталат). Многие исследователи связывают интенсивность роста микроорганизмов на РТИ с процессами их старения под воздействием внешних  факторов  (свет, температура, давление, озон, влага и др.) Под их воздействием происходит разрыв макромолекулярных цепей, изменение состава отдельных звеньев, разрушение поверхностного слоя резины. Все это создает благоприятные условия для развития микроорганизмов.

Вышеизложенное позволяет сделать вывод  о различной предрасположенности отдельных материалов и изделий к возникновению биоповреждений под влиянием рассмотренных факторов [3].

1.1.3 Механизмы бактериальных биоповреждений

В настоящее время механизм биоповреждения рассматривается, как правило, с позиции биохимических превращений материала, вызываемых биодеструктором и обеспечивающих возможность его ассимиляции этим биодеструктором в качестве источника питательных веществ. Количественные данные об этом процессе практически отсутствуют. Не исследованы начальные, предшествующие собственно повреждению, взаимодействия материала с присутствующими во внешней среде микроорганизмами. Невыясненным остается вопрос о причинах изменения свойств материалов под воздействием биодеструкторов, роль в этих изменениях продуцируемых микроорганизмами соединений (метаболитов) и других (не биологических) факторов внешней среды.

Проведенный анализ современного состояния работ по проблеме позволяет сделать вывод о перспективности применения в исследованиях реального процесса микробиологического повреждения материалов формально-кинетических представлений о его механизме. Такие представления предполагают рассмотрение изучаемого процесса как совокупность ряда этапов, протекание каждого из которых подчиняется отражающими его механизм кинетическому закону и аналитической модели.

Имеющиеся в литературе сведения позволяют предполагать, что процесс биоповреждения может быть представлен состоящим из трех основных этапов — взаимодействий материала с микроорганизмом: 1 – закрепления (адгезии), 2 – роста биодеструктора на материале и 3 – изменения свойств последнего [4].

Очень часто заселение материалов и изделий бактериями осуществляется по распространенной последовательности. Сначала поселяются наиболее специфичные для данного субстрата микроорганизмы, обладающие coответствующими ферментами и начинающие процесс разрушения. Затем их сменяет – группа микробов, использующих уже начинающий разрушаться субстрат, и наконец, наступает очередь организмов, живущих уже на полностью разрушенных материалах. Таким образом, материалы (особенно уже давно используемые человеком) представляют собой экологическую нишу обычно с постоянным составом и уже сложившейся сменяемостью поселяющихся на них микроорганизмов [5].

  1.  Характеристика микроорганизмов-декструкторов

1.2.1 Хемолитотрофные микроорганизмы (тионовые, нитрифицирующие, железобактерии)

Хемолитотрофные бактерии – это один из видов хемотрофных микроорганизмов, получающий энергию за счет окисления восстановленных неорганических соединений азота, серы, железа, а также молекулярного водорода. Хемолитотрофные бактерии обычно являются аэробными микроорганизмами, что объясняет их потребность в свободном молекулярном кислороде для процессов синтеза энергии.

В зависимости от химической природы окисляемых неорганических соединений данная группа микроорганизмов разделена на 4 подгруппы.

В первую подгруппу включены грамотрицательные бактерии, объединенные в семейство Nitrobacteraceae , источником энергии для которых являются процессы окисления аммонийного азота или нитритов. Во второй подгруппе объединены бактерии, способные окислять неорганические восстановленные соединения серы. У большинства из них доказана способность использовать этот процесс для получения клеточной энергии. Облигатно хемолитотрофные водородные бактерии, представленные одним родом Hydrogenobacter , выделены в третью подгруппу. В четвертую подгруппу отнесены бактерии, способные окислять и/или откладывать вне клетки окислы железа и марганца. Последние накапливаются в капсулах или во внеклеточном материале, редко – внутри клетки. Поскольку большинство бактерий этой подгруппы не получено до сих пор в чистой культуре, многие стороны их метаболизма остаются неясными.

1.2.1.1 Тионовые бактерии

         Представители данной подгруппы представляют собой серобактерии, получающие энергию за счёт окисления серы и её восстановленных неорганических соединений (сероводорода, тиосульфата и др.). Обычно данное название применяется в отношении рода Thiobacillus. Также тионовые бактерии представлены родами Thiomicrospira, Thiodendron и др.Это мелкие, палочковидные, в большинстве подвижные грамотрицательные бактерии.  Размножение тионовых бактерий происходит делением или почкованием. Для некоторых представителей рода Thiobacillus характерна развитая система внутрицитоплазматических мембран.

Тионовые бактерии – это строгие аэробы, за исключением Thiobacillus denitrificans, который может развиваться и в анаэробных условиях, используя в качестве акцептора электронов нитраты. Тионовые бактерии различаются устойчивостью к рН среды (от 0,6 до 10,0). Имеются галофильные штаммы. Оптимальная температуpa роста 28–30 °С. Среди тионовых бактерий есть облигатные хемолитоавтотрофы (Т. thioparus, Т. thiooxidans и др.) и факультативные хемолитоавтотрофы, которые могут расти автотрофно, гетеротрофно и миксотрофно (Т. intermedins, Т. perometabolis).

Для тионовых бактерий показана способность окислять с получением энергии помимо молекулярной серы многие ее минеральные восстановленные соединения: сульфиды, тиосульфаты, тритионаты, тетратионаты. Некоторые тионовые бактерии могут получать энергию за счет окисления тиоционатов, диметилсульфидов, а также сульфидов тяжелых металлов. Thiobacillus ferrooxidans получает энергию, окисляя также двухвалентное железо.

Полное ферментативное окисление тионовыми бактериями молекулярной серы и различных ее восстановленных соединений приводит к образованию сульфата. Окисление сероводорода до сульфата сопровождается потерей 8 электронов, поступающих в дыхательную цепь, при этом в качестве промежуточных продуктов образуется молекулярная сера и сульфит. Это показано в следующей схеме:

H2SS-SO3-SO42-.

На этапе окисления сульфита до сульфата, протекающего с образованием аденилированного промежуточного соединения аденозинфосфосульфата (АФС), имеет место субстратное фосфолирование, позволяющее записать освобождающуюся при этом энергию в молекулах АТФ:

SO3-  + АМФ → АФС + 2e-;

АФС + Фм SO42- + АДФ.

Далее с помощью аденилаткиназы из АДФ синтезируется АТФ:

2 АДФ → АМФ + АТФ.

Основное же количество энергии тионовые бактерии получают в результате переноса образующихся при окислении восстановленной серы электронов. Дыхательная цепь тионовых бактерий содержит все типы переносчиков, характерных для аэробных хемогетеротрофов.

Тионовые бактерии широко распространены в водоёмах, почве, рудных месторождениях. Участвуют в круговороте серы и мн. др. элементов. С их жизнедеятельностью связано бактериальное выщелачивание металлов из руд, концентратов и горных пород, аэробная коррозия металлов, разрушение бетонных сооружений и т. д.

1.2.1.2 Нитрифицирующие бактерии

Нитрифицирующие бактерии получают энергию в результате окисления восстановленных соединений азота (аммиака,азотистой кислоты). Все нитрифицирующие бактерии выделены в семейство Nitrobacteraceae и разделены на две группы в зависимости от того, какую фазу процесса они осуществляют. Первую фаза – окисление солей аммония до солей азотистой кислоты (нитритов). Данную фазу осуществляют аммонийокисляющие бактерии (роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus и др.):

NH4+ +1,5 О2NO2- + H2O + 2H+.

 Вторая фаза представляет собой окисление нитритов до нитратов. Ее осуществление происходит под воздействием нитритокисляющих бактерий, относящихся к родам Nitrobacter , Nitrococcus и др. Она протекает по следующему уравнению реакции:

NO2- + 1/2 O2NO3-.

Группа нитрифицирующих бактерий представлена грамотрицательными организмами, различающимися формой и размером клеток, способами размножения, типом жгутикования подвижных форм, особенностями клеточной структуры, молярным содержанием гетероциклических оснований ДНК, способами существования.

Все нитрифицирующие бактерии – облигатные аэробы; некоторые виды – микроаэрофилы. Большинство – облигатные автотрофы, рост которых ингибируется органическими соединениями в концентрациях, обычных для гетеротрофов.       Нитрифицирующие бактерии обнаружены в водоемах разного типа и в почвах, где они, как правило, развиваются совместно с бактериями, жизнедеятельность которых приводит к образованию исходного субстрата нитрификации – аммиака.

Процесс нитрификации, являясь важным звеном в круговороте азота в природе, имеет как положительные, так и отрицательные стороны. Переведение азота из аммонийной формы в нитратную способствует обеднению почвы азотом, поскольку нитраты легко вымываются из почвы. В то же время нитраты – хорошо используемый растениями источник азота. Связанное с нитрификацией подкисление почвы улучшает растворимость и, следовательно, доступность некоторых жизненно необходимых элементов, в первую очередь фосфора и железа.

1.2.1.3 Железобактерии

Железобактерии  – это бактерии, способные окислять двухвалентное железо до трёхвалентного и использовать освобождающуюся при этом энергию на усвоение углерода из углекислого газа или карбонатов. Окисление протекает следующим образом:

2Fe(HCO) +6HO +OFe(OH) +4HCO +4 CO

При этой реакции энергии выделяется немного, поэтому железобактерии окисляют большое количество закисного железа.

На основании морфологических характеристик все железобактерии могут быть разделены на две группы: нитчатые и одноклеточные.

К железобактериям первой группы относятся некоторые нитчатые бактерии, окруженные чехлом, из рода Leptothrix и Sphaerotilus, имеющие неподвижные или передвигающиеся скольжением нити. В чехлах, окружающих нити, накапливаются окислы железа и марганца (Leptothrix ) или только железа (Sphaerotilus). Железобактерии этой группы  – облигатные аэробы, но могут удовлетворительно расти при низком содержании кислорода в среде. Оптимальный pH для роста – 6–8.  Единственно возможный способ существования – хемооганогетеротрофия, при этом представители рода Sphaerotilus предпочитают условия с более высоким содержанием органических веществ, а многие штаммы Leptothrix – среды с низким уровнем органики.

К нитчатым железобактериям относятся также некоторые фотосинтезирующие эубактерии из группы цианобактерий и скользящих зеленых бактерий.

Вторая группа железобактерий включает одноклеточные организмы из разных таксонов. Она представлена эубактериями с грамположительным и грамотрицательным строением клеточной стенки или без нее, размножающимися поперечным делением или почкованием. Представители данной группы состоят из клеток разной формы и размеров, являющихся одиночными или формирующими скопления, окруженные капсулами, в которых откладываются окислы железа и марганца. Принадлежащие к этой группе железобактерии распадаются на две подгруппы, различающиеся типом метаболизма и отношением к кислотности среды.

Первая подгруппа объединяет железобактерии, растущие в нейтральной или слабощелочной среде и характеризующиеся хемоорганогетеротрофным типом метаболизма.  Представители подгруппы – свободноживущие микоплазмы, объединенные в роды Metallogenium, Gallionella, Siderococcus.  Им свойствен типичный для микоплазм полиморфизм: кокковидные клетки, от которых могут отходить тонкие нити, пучки переплетенных тонких нитей и т.д. На поверхности нитей откладываются окислы железа (Gallionella, Siderococcus)  или железа и марганца (Metallogenium). Бактерии растут в нейтральной или кислой среде. Некоторые из них олиготрофы. Все – аэробы или микроаэрофилы. Отложение окислов железа и марганца – результат химических реакций или функционирования перекисного пути и не имеет отношения к получению клетками энергии.

Вторую подгруппу составляют в большинстве аэробные ацидофильные формы. Оптимальный pH их роста лежит ниже  4,5 (2 – 3). В этих условиях Fe2+ в присутствии O2 устойчив к химическому окислению. Для ацидофильных железобактерий установлена способность получать энергию в результате окисления двухвалентного железа.

Железобактерии обитают в воде пресных и солёных водоёмов, играют большую роль в круговороте железа в природе. На дне водоёмов образуют тёмно-коричневые дискообразной формы конкреции, состоящие из железа и марганца [6].

1.2.2 Гетеротрофные бактерии (протеолитические, липолитические, гликолитические)

Гетеротрофные бактерии представляют собой микроорганизмы, использующие в качестве источника энергии и углерода органические, т. е. углеродсодержащие соединения. Среди гетеротрофных бактерий встречаются как аэробы, так и анаэробы. Многие виды данных микроорганизмов утилизируют сахара, спирты и органические кислоты. Однако существуют специализированные гетеротрофные бактерии, способные разлагать также целлюлозу, лигнин, хитин, кератин, углеводороды, фенол и др. вещества. Гетеротрофные бактеири широко распространены в почве, воде и грунте водоёмов, пищевых продуктах и т.д. Они также принимают активное участие в круговороте веществ в природе [7].

1.2.2.1 Протеолитические бактерии

Протеолитические бактерии – очень большая группа анаэробов, получающая энергию за счет анаэробного разрушения аминокислот. Многие из них являются строго протеолитическими организмами, неспособными сбраживать углеводы. Другие обладают слабовыраженной сахаролитической активностью. Имеются также активные протеолитические виды, способные осуществлять маслянокислое брожение сахаров. Протеолитическая активность у некоторых анаэробов (CI. histolyticum) настолько высока, что у зараженных этими микроорганизмами животных наблюдается как бы расплавление мышц, после чего остаются голые кости. Освобождающиеся после протеолиза (разрушение белков протеолитическими ферментами) аминокислоты могут сбраживаться двумя путями. К примеру, CI. sporogenes сбраживает пару аминокислот, причем одна из них окисляется, а другая восстанавливается (реакция Стикленда), т. е. одна аминокислота служит донором, а другая – акцептором водорода. Это происодит по следующей реакции: аланин + 2глицин + НО → 3уксусная кислота+СО+NH 

       Существуют виды протеолитических анаэробов, которые могут сбраживать и по одной аминокислоте, например глутаминовую кислоту (CI. tetani).

К протеолитическим относятся клостридии, имеющие активные протеолитические ферменты и поэтому способные использовать в качестве субстратов белки и пептиды, гидролизуя их до аминокислот и подвергая затем последние сбраживанию. В эту группу входят  Сlostridium putrifitcum,  Сlostridium histolyticum,  Сlostridium sporogenes и другие сапрофитные виды. Близки к этим видам и некоторые патогенные формы:  Сlostridium botulinum  – продуцент ботулина – экзотоксина, являющегося одним из самых сильных биологических ядов;  Сlostridium tetani –столбнячная палочка, образующая в организме человека столбнячный токсин.

К протеолитическим клостридиям примыкают виды, использующие в качестве источника углерода и энергии ограниченное число свободных аминокислот. Например,  Сlostridium cochlearium растет только на среде с глутаминовой кислотой, глутамином и гистидином;  Сlostridium sticklandii может сбраживать лизин, аргинин, фенилаланин, серии, а  Сlostridium propionicum – треонин, аланин, серии, цистеин.

Известны два типа сбраживания аминокислот клостридиями. Для многих клостридиев одна аминокислота может служить источником энергии и углерода, например, глутаминовая кислота – для  Сlostridium tetanomorphum , лизин – для  Сlostridium sticklandii . В этом случае ее диссимиляция приводит к возникновению метаболитов, характерных для  гликолитического пути, и в первую очередь пирувата. У  Сlostridium sticklandii сбраживание лизина приводит к образованию  масляной и  уксусной кислот и NH3, а у  Сlostridium tetanomorphum при сбраживании глутаминовой кислоты в дополнение к перечисленным выше продуктам образуется некоторое количество СО2.

Ряд аминокислот может подвергаться сбраживанию клостридиями только парами. Механизм процесса был расшифрован Л.Стиклендом в 1934 г., показавшим, что при этом происходит сопряженное окисление – восстановление пары аминокислот, одна из которых окисляется, другая – восстанавливается. Такой тип сбраживания аминокислот получил название  реакции Стикленда . Окисляемыми аминокислотами, т.е. донорами электронов, служат аспарагин, аланин, валин, серин, гистидин и др. Восстанавливаемые аминокислоты – глицин, пролин, орнитин, аргинин и др [6].

1.2.2.2 Липолитические бактерии

Липиды подвергаются гидролитическому разложению под действием липаз. Одним из примеров продуцентов липаз являются бактерии рода Clostridium и другие микроорганизмы. Для выявления липолитической активности исследуемые микроорганизмы высевают на среду, содержащую соответствующий липид. Определенная трудность при постановке таких опытов связана с тем, что жиры не смешиваются с водой. Поэтому чаще всего вместо жиров в среду вводят твины – эфиры жирных кислот и сорбита. Твин-40 содержит пальмитиновую, твин-60 – стеариновую, а твин-80 – олеиновую кислоты. Твины хорошо растворимы в воде и имеют нейтральную реакцию. Состав среды (г/л): твин – 10,0; пептон – 10,0; NaCl – 5,0; СаС12Н20 – 0,1; агар – 20,0; рН среды 7,4. Готовят среду без твина и стерилизуют ее при давлении 1 атм. Водный раствор твина соответствующей концентрации стерилизуют отдельно при 0,5 атм и добавляют к стерильной основной среде. Среду разливают в чашки Петри. Когда агар застывает, на поверхность агаровой пластинки высевают штрихом или уколом исследуемый микроорганизм. Засеянные чашки Петри выдерживают при соответствующей температуре необходимое для роста микроорганизма время. На наличие липазы указывает образование вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина [8].

Липолитические бактерии являются деструкторами защитных покрытий, приводя к разрушению молекул пластификаторов и стабилизаторов, ациклические и ароматические углеводороды, низкомолекулярные фракции покрытий, а также другие компоненты, входящие в их состав.

При изучении биостойкости нефтебитумных покрытий в агрессивных грунтах методом инфракрасной спектроскопии было установлено, что под действием бактерий происходит разрушение связей С=О и S=O, которое может привести к обрыву олигомерных цепей и, как следствие, к уменьшению прочности покрытий. Можно полагать, что такие изменения в химическом составе покрытий являются результатом действия гидролитических ферментов бактерий, в частности липазы, которая может разрушать сложные эфирные связи углеводородов, входящих в состав изоляционных материалов.

При изучении влияния различных доз нефти и нефтепродуктов на активность липазы серой лесной почвы, было установлено, что углеводороды активизируют липолитическую активность почвы. Параллельно с активацией липолиза наблюдалось увеличение численности углеводородокисляющих бактерий. В нефтезагрязненных почвах присутствует значительное количество битумов, которые являются одним из стимуляторов активности липаз в почве. Некоторые исследователи  предлагают использовать активность липазы в качестве одного из показателей биодеструкции нефти и нефтепродуктов [9].

1.2.2.3 Гликолитические бактерии

Ферментативное расщепление и окисление глюкозы называют гликолизом (греч. glycos – сладкий, lysis – расщепление). Ферменты, окисляющие глюкозу, составляют своего рода ферментативный "конвейер". Гликолиз происходит в цитоплазме. При этом одна шестиуглеродная молекула глюкозы С6Н12О6 ступенчато расщепляется и окисляется при участии ферментов до двух трехуглеродных молекул  пировиноградной кислоты в этом превращении глюкозы последовательно участвуют девять ферментов. Если сравнить число атомов в двух молекулах пировиноградной кислоты СН3СОСООН и в молекуле глюкозы С6Н1206, то станет ясно, что в процессе гликолиза молекула глюкозы не только расщепляется на две трехуглеродные молекулы, но и теряет четыре атома водорода, т. е. происходит ее окисление. Акцептором водорода (и электронов) в этих реакциях служат молекулы никотинамидадениндинуклеотида ( НАД ), которые похожи по структуре на НАДФ и отличаются только отсутствием остатка фосфорной кислоты при молекуле рибозы. В процессе аэробного гликолиза происходит восстановление окисленного НАД+ в НАДН. За счет энергии окисления глюкозы до пировиноградной кислоты фосфорилируются также четыре молекулы АДФ в  АТФ. Что касается молекул  НАДН, то запасенная ими энергия используется далее для получения АТФ.

На этапе окисления глюкозы кислород еще не участвует непосредственно, однако присутствие его в клетке обеспечивает дальнейшее окисление пировиноградной кислоты.

Последовательность биохимических реакций, лежащих в основе гомоферментативного молочнокислого брожения, получила название фруктозодифосфатного пути, или пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса.

Данный путь доминирует у большинства аэробных и анаэробных бактерий. Характерная реакция гликолиза – расщепление фруктозо-1,6-дифосфата альдолазой, в результате чего образуется смесь триозофосфатов, состоящая из дигидрооксиацетонфосфата и глицероальдегидтрифосфата, которые затем превращаются в пируват (рисунок 1). Фермент обратной связи, лимитирующий скорость процесса, – фруктозо-6-фосфат дегидрогеназа (фосфофруктокиназа). В этом процессе образуется 2 моля АТФ и 2 моля восстановленного НАД (НАДН+) на 1 моль глюкозы.

Рисунок 1 – Гликолитический путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса

Гомоферментативное молочнокислое брожение, в основе которого лежит  гликолитический путь разложения глюкозы, является единственным способом получения энергии для группы  эубактерий , которые при сбраживании углеводов превращают в молочную кислоту от 85 до 90% сахара среды. Бактерии, входящие в данную группу, морфологически различны. Это кокки, относящиеся к родам  Streptococcus и  Pediococcus, а также длинные или короткие палочки из рода  Lactobacillus . Последний подразделяется на три подрода. Бактерии, включенные в два из них ( Thermobacterium,  Streptobacterium ), также осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение. Все бактерии этой группы положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны. Группа весьма гетерогенна в отношении нуклеотидного состава ДНК: молярное содержание ГЦ-пар оснований колеблется от 32 до 51 %. Значительные колебания по этому признаку характерны и для бактерий, объединенных в роды и даже подроды.

Лактатдегидрогеназа, катализирующая превращение  пирувата в  лактат , стереоспецифична. У разных видов она содержится в виде определенных оптических изомеров; в зависимости от этого бактерии продуцируют D- или L-форму  молочной кислоты. Те из них, которые образуют смесь D- и L-форм, содержат или две формы фермента, различающиеся стереоспецифичностью, или лактатрацемазу.

У этой группы эубактерий молекулярный кислород не включается в энергетический метаболизм, но они способны расти в присутствии О2, т.е. являются аэротолерантными анаэробами. (Некоторые авторы представителей рода  Lactobacillus относят к  микроаэрофилам ). В их клетках в значительном количестве содержатся флавиновые ферменты, с помощью которых происходит восстановление молекулярного кислорода до Н2О2. Из-за неспособности молочнокислых бактерий синтезировать гемовую группу у них отсутствует каталаза – фермент, катализирующий разложение перекиси водорода, поэтому последняя может накапливаться в клетке.

Особенностями конструктивного метаболизма гомоферментативных молочнокислых бактерий являются слабо развитые биосинтетические способности, что выражается в большой зависимости их роста от наличия в питательной среде готовых органических веществ (аминокислоты, витамины группы В, пурины, пиримидины). В качестве источника углерода молочнокислые бактерии используют  лактозу (молочный сахар) или  мальтозу (растительный сахар, образующийся при гидролизе крахмала). Они могут также использовать некоторые пентозы, сахароспирты и органические кислоты.

Из всех известных непатогенных прокариот молочнокислые бактерии отличаются наибольшей требовательностью к субстрату. Зависимость этих бактерий от наличия готовых органических веществ среды указывает на примитивность в целом их конструктивного метаболизма.

Молочнокислые бактерии распространены там, где они могут обеспечить свои высокие потребности в питательных веществах и где имеются большие количества углеводов, переработка которых дает им необходимую для роста энергию. Их много в молоке и молочных продуктах, на поверхности растений и в местах разложения растительных остатков; обнаружены они в пищеварительном тракте и на слизистых оболочках животных и человека.

Скисание сливок, необходимое для получения сливочного масла, также вызывают бактерии рода  Streptococcus. Помимо молочной кислоты некоторые из них образуют ацетоин и диацетил, придающие сливочному маслу характерный запах и вкус. Субстратом служит лимонная кислота, содержание которой в молоке может достигать 1 г/л. Реакции, ведущие к образованию этих веществ, начинаются с расщепления лимонной кислоты, которая впоследствии переходит в уксусную и щавелевоуксусную кислоты.

Уксусная кислота выделяется в среду, а  щавелевоуксусная кислота (ЩУК) декарбоксилируется, что приводит к образованию пирувата.

Дальнейшее метаболизирование пирувата осуществляется по трем различным путям: часть молекул восстанавливается до молочной кислоты; другая часть подвергается декарбоксилированию, приводящему к возникновению разных С2-интермедиатов ( ацетил-КоA и "активный" ацетальдегид) и взаимодействию между ними, заканчивающемуся синтезом молекулы диацетила.

Ферменты гликолитического пути обнаружены также в разных условиях роста в клетках С. Aurantiacus.

С. aurantiacus может быть охарактеризован как факультативный анаэроб и фототроф. На свету он растет в аэробных и анаэробных условиях в присутствии разнообразных органических соединений: сахаров, спиртов, органических кислот и аминокислот. Некоторые штаммы этого вида способны к анаэробному фотоавтотрофному росту, используя Н2 или H2S в качестве донора электронов. Окисление H2S приводит к образованию молекулярной серы и отложению ее в среде в виде аморфной массы. Молекулярная сера в очень незначительной степени затем окисляется до сульфата.  Хемогетеротрофный рост также возможен в аэробных и для отдельных штаммов в анаэробных условиях.

Гликолитическое брожение может протекать также под действием бактерий, относящихся к роду Clostridium, осуществляющих сбраживание углеводов по гликолитическому пути с накоплением  масляной кислоты в качестве одного из основных продуктов.

Гликолитическое расщепление глюкозы с образованием в качестве обязательного промежуточного соединения  пировиноградной кислоты является основным путем разложения глюкозы для пропионовокислых бактерий. В эту группу, объединяемую в род  Propionibacterium, входят грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, размножающиеся бинарным делением. В зависимости от условий культивирования и цикла развития форма клетки может меняться до кокковидной, изогнутой или булавовидной. Типовой вид –  Propionibacterium freudenreichii .

Большинство пропионовокислых бактерий – аэротолерантные  анаэробы, получающие энергию в процессе  брожения , основным продуктом которого является  пропионовая кислота. Аэротолерантность их обусловлена наличием полностью сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода). У пропионовокислых бактерий обнаружены супероксиддисмутазная, каталазная и пероксидазная активности. Внутри группы отношение к О2 различно. Некоторые виды могут расти в аэробных условиях.

Гликолитический путь катаболизма органических соединений отмечен также у несерных пурпурных бактерий.  Пурпурные несерные бактерии имеют склонность к фотоорганогетеротрофному образу жизни, предпочитая в качестве доноров электронов и источников углерода в процессе фотосинтеза простые органические соединения: жирные кислоты, спирты, сахара, аминокислоты. Многие виды способны расти фотолитоавтотрофно, используя молекулярный водород в качестве донора электронов для восстановления СО2.

Некоторые типичные несерные пурпурные бактерии растут при освещении на минеральной среде, используя в качестве донора электронов  H2S,  тиосульфат или молекулярную серу. В большинстве случаев сульфид окисляется только до молекулярной серы, никогда не откладывающейся в клетке, но в отдельных случаях возможно последующее окисление моноксида серы до сульфата.

Для некоторых клостридиев (Сlostridium aceticum,  Сlostridium thermaceticum,  Сlostridium formicaceticum и др.) характерно сбраживание сахаров, приводящее практически к образованию только одного конечного продукта – уксусной кислоты (гомоацетатное брожение); из 1 молекулы сброженной гексозы синтезируется 3 молекулы ацетата. Изучение последовательности биохимических реакций, приводящих к этому, показало, что сбраживание 1 молекулы гексозы по  гликолитическому пути приводит к образованию только 2 молекул ацетата. Одновременно образуются и 2 молекулы СО2. Третья молекула ацетата синтезируется из 2 молекул СО2 принципиально иным путем. Фиксация углекислоты у гомоацетатных клостридиев происходит по нециклическому механизму, получившему название  ацетил-КоA-пути , поскольку его ключевым метаболитом является ацетил-КоA. Виды, осуществляющие гомоацетатное брожение, называют также  ацетогенными.

Активность ферментов  гликолиза обнаружена у разных представителей тионовых бактерий. Что касается цианобактерий, то у некоторых видов найдены все ферменты, необходимые для сбраживания глюкозы до молочной кислоты, однако образование последней, а также активности гликолитических ферментов низки [10].

1.2.3 Метаногенные бактерии и их характеристика

Метаногенные бактерии включают три рода микроорганизмов:

– представители первого рода имеют форму прямых или изогнутых палочек размером307 мкм, которые образуют нити, большинство из них неподвижны;

– представители 2 рода имеют сферические клетки размером 0,5–10 мкм неправильной формы. Клетки могут быть одиночными, располагаться попарно или в виде скоплений. Есть неподвижные и подвижные формы;

– третий род – неподвижные бактерии, состоящие из крупных сферических клеток размером 1,5–2,5 мкм. Все метаногенные бактерии – облигатные анаэробы, чувствительные к окислительно-восстановительным реакциям среды. Оптимальное значение рН для них ограничено узким интервалом 6,8–7,5.

Почти все метаногенные бактерии принадлежат к мезофилам. Оптимальная температура составляет 35–40 °С. Половина метанообразующих бактерий в качестве источника углерода используют углекислый газ. Сложные органические соединения метаногенные бактерии потреблять не могут. Источником азота для метанобразующих бактерий служат аммонийные соединения. Наиболее характерной особенностью метаногенных бактерий является специфичность отдельных видов по отношению к донору водорода. Большинство этих бактерий способно потреблять водород.

Процесс биохимического окисления веществ в анаэробных условиях.

1. Стадия кислого брожения.

Ее осуществляют кислотообразующие бактерии. Благодаря им все органические компоненты осадков подвергаются деструкции. Анаэробный ил обладает гидролитической активностью. В нем обнаружены гидролитические ферменты: протеазы, глюкозидазы, липазы. Под действием этих ферментов исходные вещества осадка и активного ила, подвергаясь внеклеточному гидролизу, превращаются в соединения, которые доступны клеткам бактерии.

Внутриклеточные превращения простых сахаров приводит к образованию ПВК – ключевого промежуточного продукта метаболизма (углеводов, глицерина, аминокислот). В результате разложения аминокислот бактериями появляется аммиак, а в случае серосодержащих аминокислот – сероводород.

Продукты гидролиза жиров используются многими видами кислотообразующих бактерий. В ходе ферментативных реакций глицерин превращается в фосфоглицериновый альдегид, который затем включается в обмен углеводов.

Таким образом, кислотообразующие бактерии превращают белковые соединения, жиры и углеводы осадков сточных вод в низшие жирные кислоты, спирты, аммиак, водород и сероводород.

2. Стадия щелочного брожения.

Данная стадия осуществляется метанообразующими бактериями. При ферментации уксусной кислоты и метилового спирта метан синтезируется в результате восстановления метильной группы. Это осуществляется путем следующих реакций:

1 СНСООН →С + С0;

2 4СНОН → ЗС + СО +2НО.

Иной механизм образования метана характерен для тех видов метаногенных бактерий, которые не способны утилизировать уксусную кислоту и метанол. Это бактерии синтезируют метан в результате восстановления диоксида углерода по реакции:

3 4АН + СО→С + 2НО + А

В процесс метанообразования вовлекаются и более сложные вещества, такие как масляная, пропионовая, капроновая кислоты. Превращение их осуществляется по типу реакции (3), в которой вместо молекулярного водорода участвуют перечисленные органические субстраты. Например, при использовании этилового спирта он окисляется до СНзСООН с одновременным восстановлением диоксида углерода по типу реакции:

2СНСНОН+ СО → С+ 2СНСООН

Метанобразующие бактерии содержатся в растениях, экскрементах животных и в воде. Обычно большое количество этих микроорганизмов можно встретить в болотах, где ощущается недостаток кислорода и имеются в наличие различные органические соединения. Они являются неотъемлемой частью анаэробного разложения органических веществ. Для переработки биологической массы в специальных установках не требуется специального насаждения бактерий, поскольку они уже содержатся в ней. Экскременты животных содержат полный комплекс необходимых для их разложения микроорганизмов, поэтому для их переработки требуется лишь создать и поддерживать оптимальные условия для развития процесса брожения [6].

1.3 Методы обнаружения бактерий и идентификации микроорганизмов

1.3.1 Методы обнаружения бактерий и определения их численности

Существует большое количество классических и инструментальных методов оценки содержания и активности микроорганизмов, однако почти все из них предназначены для анализа клеток в жидких средах, и только немногие методы позволяют характеризовать численность и состояние микроорганизмов на поверхности материалов. В этих условиях одним из традиционно используемых подходов для оценки микробной загрязненности объектов является взятие смывов микроорганизмов с поверхностей с последующим их анализом прямыми и косвенными методами.

Прямые способы анализа дают абсолютное значение содержания микроорганизмов. Они, как правило, не характеризуют активность клеток. Среди прямых методов анализа в лабораторной практике широко применяются способы посева и культивирования микроорганизмов на поверхности агаризованных питательных сред. Данные методы просты, высокочувствительны, не требуют измерительного оборудования, поэтому используются на производстве и в арбитражных случаях. Основные недостатки способов культивирования связаны с высокой длительностью трудоемкостью, большим расходом питательных, сред и экономической неэффективностью при большом количестве микробиологических испытаний. Поэтому наблюдается тенденция их замены на инструментальные методы.

Косвенные методы микробиологического анализа характеризуют содержание и активность микроорганизмов. Они быстры, точны, имеют низкие трудозатраты и экономически эффективны при увеличении количества измерений. Эти способы нуждаются в инструментальных средствах измерений и дают относительное значение показателей, что требует проведения процедуры калибровки средств измерений с помощью прямых методов микробиологического анализа [11].

Рассмотрим методы обнаружения бактерий и определения их численности на примере бактерий, вызывающих порчу пищевых продуктов.

1.3.1.1 Методы культивирования

В традиционных методах исследования пищевых продуктов на присутствие специфической микробиоты порчи используется методология культирования на соответствующих средах. Образец пищевого продукта размачивают или гомогенизируют, используя гомогенизатор или блендер, и приготавливают соответствующие разбавления, которые высевают на селективные или полуселективпые среды для последующего выделения и идентификации колоний. Численность ассоциируемых с порчей молочнокислых бактерий (МКБ) обычно оценивают путем подсчета колоний.

Ряд ограничений этой методологии не всегда позволяет обнаружить микроорганизмы, ответственные за изменение органолептических свойств продукта, что может привести к ошибочной идентификации или недооценке бактерий порчи. Результаты зависят от нескольких факторов: правильного выбора культуральной среды, физиологического состояния бактерий и применяемого способа их иден-тификации.

Для определения численности молочнокислых бактерий (МКБ), присутствующих в испорченном пищевом продукте, предложены самые разные культуральные среды, в том числе MRS  и агар Rogosa. Для улучшения роста МКБ и предотвращения роста дрожжей среду MRS можно модифицировать путем добавления 0,1% цистеингидрохлорида и 0,02% сорбата калия. Кроме того, можно изменить значение рН до 5,7; предпочтительнее использовать анаэробное культивирование. Последняя среда успешно используется для анализа микробиоты МКБ порчи в копченых сосисках в вакуумной упаковке. Другие модификации  MRS-агара используются для идентификации карнобактерий, участвующих в порче мясного сырья, мяса птицы и морепродуктов в вакуумной упаковке.

Для селективного обнаружения карнобактерий пригодны к использованию агар CTAS (крезоловый красный – таллий – ацетат – сахароза) и агар EBRER. Кроме того, в качестве селективной среды для подсчета карнобактерий может быть использован агар CTSI (крезоловый красный – таллий – сахароза – инулин), представляющий собой модификацию CTAS-агара. Альтернативой MRS-агару является агар NAP (нитрит – ацетоин – полимиксин), первоначально созданный для обнаружения МКБ мяса. Он позволяет выявлять лактобациллы, энтерококки и карнобактерии, причем последние были идентифицированы как доминирующие МКБ порчи и в том и в другом продукте.

После культивирования предполагаемых бактерий порчи на соотвествующих культуральных средах необходимо их идентифицировать. В большинстве случаев колонии отбираются из чашек Петри и после пересева (субкультивирования) штаммов применяют несколько процедур идентификации. В качестве альтернативы для определения принадлежности колоний к тому или иному виду микроорганизмов можно использовать методы гибридизации колоний. Существенную роль для результата анализа играет отбор изолятов из серии разбавлений испорченного пищевого продукта,. Если необходима характеризация доминирующей популяции МКБ, то в целях идентификации вида должны отбираться только колонии из наивысших разбавлений.

1.3.1.2 Фенотипические методы

Классическая идентификация МКБ основывается на морфологических, физиологических и биохимических характеристиках. В большинстве идентификационных ключей используются такие характеристики, как морфология клетки, рост при определенных температурах, газообразование при утилизации глюкозы и тип продуцируемого изомера молочной кислоты, а также спектр ассимилируемых или сбраживаемых углеводов и источников азота. В настоящее время доступны малогабаритные тест-наборы для фенотипического фингерпринтинга, в которых для получения фенотипического «отпечатка» используются набор дегидрированных реагентов и добавка унифицированного инокулята. Данные, получаемые с помощью этих автоматизированных систем, должны тщательно интерпретироваться, так как этим системам и присущи ряд ограничений. Качество результатов существенно зависит от надежности базы данных. Как правило, эти фенотипические методы характеризуются довольно низкой воспроизводимостью и низким таксономическим разрешением, что зачастую не позволяет различать близкородственные микроорганизмы.

Более надежный метод идентификация МКБ – это полный анализ клеточных белков. Сравнение состава клеточных белков, получаемого с помощью унифицированного метода SDS-PAGE (натрийдодецилсульфат-полиакриломидный гель- электрофорез), помогает идентифицировать МКБ, вызывающих порчу вин , сыров  и МКБ, вызывающих порчу морепродуктов.

Для ускоренной идентификация МКБ порчи может использоваться инфракрасная спектроскопия на основе преобразования Фурье (FFIR). 

1.3.1.3 ДНК-методы

Для обнаружения и идентификации бактерий порчи применяются различные ДНК-методы, разработанные, в основном, за последние 20 лет. Одним из их преимуществ является независимость от изменения условий роста микроорганизмов. Эти методы идентификации включают секвенирование последовательностей 165 или 235 рДНК, ПЦР-анализы с применением родо- или видоспецифических прай- меров, а также методы ДНК-фингерпринтинга, основанные на структурах ПЦР-амплифицированиых фрагментов ДНК или на рестрикционных анализах всей ДНК или ампликонов, полученных с помощью селективной ПЦР (полиморфизм длины фрагментов рестрикции, RFLP).

1.3.1.3.1 ПЦР-методы

В настоящее время не существует специфических олигонуклеотидных праймеров для обнаружения с помощью ПЦР-методов отдельных видов Pseudomonas (например, P. fluorescens, P. lundensis и P.fragi). Тем не менее для различения видов Pseudomonas, выделяемых из различных окружающих сред, ПЦР-методы и RFLP-анализ (RFLPполиморфизм длины фрагментов рестрикции) могут использоваться совместно. Для обнаружения и определения количества псевдомонад в мясе и молоке также может использоваться ПЦР в сочетании с методом ELISA (иммуносорбентный анализ с ферментной меткой).

1.3.1.3.2 Риботипирование

Одним из ускоренных методов идентификации бактерий является риботипирование с гибридизацией зондов специфических генов рРНК и геномных ДНК-дайджестов с последующим компьютерным анализом сохраненных профилей генов рРНК для каждого вида Pseudomonas. Риботипирование может выполняться вручную или с помощью автоматизированной системы. Этот метод успешно используется для описания признаков псевдомонад, выделенных из сырого молока.

1.3.1.3.3 Секвенирование рРНК

Популярным средством идентификации P. fragi, S. putrefaciens и Р. fluorescens  становится прямое секвенирование сегмента последовательности 16S РНК. Применение автоматизированного тест-набора для секвенирования последовательности 16S рРНК ускорило и облегчило идентификацию видов Pseudomonas и Shewanella.

1.3.1.3.4 Импедиметрия

Рост и активность бактерий порчи можно также оценить, анализируя изменения импеданса в культуральной среде или в пищевых продуктах под влиянием метаболизма бактерий. К сожалению, попытки отслеживания изменений численности псевдомонад в сыром молоке методами импедиметрии оказались успешными лишь частично.

Использование специфических праймеров для ПЦР-реакции с бактериальной ДНК, экстрагированной из образца – это самый быстрый независящий от культу- ральной среды метод родо-, видо- или штаммоспецифического обнаружения  в пищевой матрице. Он позволяет обнаружить определенные микроорганизмы порчи, присутствующие в пищевом продукте во время технологического процесса, без применения продолжительных процедур культивирования.

1.3.1.4 Методы, применяемые без предварительного культивирования

Еще один не зависящий от культуральной среды подход включает применение методов гибридизации in situ, в которых искусственно созданные олигонуклео- тиды присоединяются к специфическим последовательностям – мишеням (обычно 165 рДНК) бактериальной ДНК. Наиболее часто применяется флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), особенно для обнаружения бактерий в напитках, в том числе в вине. Этот метод позволяет за несколько часов произвести прямую идентификацию и количественный микроскопический анализ МКБ без предварительного культивирования. Бактериальные клетки образца, проницаемые для флуоресцентно меченного олигонуклеотида, фиксируют и иммобилизуют на предметных стеклах или мембранных фильтрах, гибридизируют in situ с зондом, а затем подсчитывают под эпифлуоресцентным микроскопом. Гибридизацияю in situ можно также сочетать с проточной цитометрией.

Эпифлуоресцентная микроскопия (DEFT), включающая захват бактериальных клеток на поверхности мембранных фильтров и окрашивание флуорохромом, нашла применение в молочной и винной промышленности.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) и температурно- временной градиентный гель-электрофорез (TGGE) могут применяться как не зависящие от культуральной среды методы обнаружения и анализа МКБ, вызывающих порчу пищевых продуктов. В этих методах изменяющийся участок гена 165 рРНК амплифицируется посредством ПЦР, и фрагменты ДНК одинакового размера разделяются на полиакриламидном геле в соответствии с их денатурирующим профилем. Полученные полосы можно оцифровывать и нормализовать, используя эталонные структуры, с последующей идентификацией расположения полос путем их сравнения со структурами из базы данных эталонных штаммов. Данный подход использовался для идентификации лактобацилл, участвующих в брожении дрожжевого теста, и для изучения микробиоты сыров. Метод PCRDGGE, включающий идентификацию полос с помощью секвенирования, применяется для анализа порчи мясных продуктов под действием МКБ на мясоперерабатывающем заводе.

1.3.1.5 Тесты на ассимиляцию углеводов, жирнокислотные профили и моноклональные антитела

Классическими, стандартными процедурами идентификации псевдомонад являются физиологическая характеризация и тесты на ассимиляцию углеводов. Необходимые тесты могут выполняться вручную или с помощью автоматизированных тест-наборов.  

Вид псевдомонад, вызывающих порчу пищевых продуктов, можно определить также с помощью анализа жирнокислотного состава бактериальных клеток.

В качестве белка-мишени для обнаружения псевдомонад могут использоваться белки внешней мембраны Pseudomonas. Для различения флуоресцентных и нефлуоресцентных псевдомонад используют липопротеин I и ген, кодирующий этот белок. Белок OprF внешней мембраны и антитело к этому белку используют для обнаружения псевдомонад из группы  I подобия рРНК. Поликлональные антитела по отношению к белку внешней мембраны (F) и живым клеткам P. fluorescens используют для обнаружения псевдомонад в охлажденном мясе. В настоящее время разработаны также моноклональные антитела для специфического белка внешней мембраны Pseudomonas, которые используются для обнаружения псевдомонад в охлажденном мясе непрямым методом ELISA.

1.3.1.6 Методы обнаружения, идентификации и количественного определения спорообразующих бактерий

1.3.1.6.1 Аэробные и факультативные анаэробные спорообразующие бактерии

Представителей рода Bacillus и близкородственных им родов выделяют по их характеристикам роста или типу порчи. В методах количественного определения микроорганизмов, вызывающих порчу сильнокислых, кислых, подкисленных и слабокислых пищевых продуктов, используют значения рН и температурный диапазон роста, а также тип порчи (например, плоскокислая) под действием конкретных групп микроорганизмов. Общим тестом для представителей рода Bacillus является тест на «аэробные мезофильные спорообразующие бактерии», причем В. cereus –единственный вид, для которого имеется специфическая селективная среда. Подсчет аэробных спор может производиться разными методами, но обычно используют триптоновый агар с декстрозой или глюкозой. Для психротрофных микроорганизмов разработан модифицированный метод Миколайчика с применением теплового шока при 75 °С в течение 20 мин, хранения образцов при 7,2 ° С в течение 8–10 суток и последующим посевом на стандартный агар. Метод, который обычно используют для выделения мезофильных аэробных спорообразующих бактерий, включает посев на чашки с глюкозо-триптоновым агаром после нагревания до 80 °С в течение 30 мин с последующим аэробным культивированием при 35 °С.

После этого для идентификации изолятов можно использовать различные методы, включая молекулярные и более традиционные, основанные на биохимических или фенотипических свойствах. К сожалению, традиционные методы характеризуются довольно ограниченной способностью различения видов и зачастую не согласуются с результатами идентификации, полученными с использованием таких относительно новых методов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) и ДНК-ДНК-гибридизация. Кроме того, отсутствуют селективные культуральные среды, позволяющие обнаруживать виды микроорганизмов, относящиеся к данной группе. Тем не менее классические методы все еще остаются полезными, особенно в тех случаях, когда оказываются недостаточными или неудовлетворительными такие методы, как секвенирование последовательности 165рРНК/ДНК. Альтернативным подходом, применяемым для различения видов Bacillus, для их идентификации и таксономии, является профилирование белков методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight, матричная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия).  Для В. pumilus этот метод хорошо коррелирует с секвенированнем gyrB и ДНК-ДНК гибридизацией. Идентификация аэробных спорообразующих бактерий всегда была трудной задачей, и хотя в настоящее время появился ряд тонких методов, не всегда пригодных для повседневного применения, фенотипическая характеризация по-прежнему остается важным инструментом идентификации.

Способы идентификации Alicyclobacillus spp. отличаются по различающей способности и сложности; в некоторых из них используются ПЦР-методы, гомология ДНК-ДНК и сравнительный анализ рибосомных последовательностей или анализ случайно амплифицированной полиморфной ДНК а в других – более практичные методы, например метод прямого эпифлуоресцентного фильтра, образование в чашках постороннего запаха  или стандартные биохимические и морфологические тесты.

Для идентификации В. coagulans, а также других видов этого рода и близкородственных родов обычно применяют биохимические тест-наборы  совместно с микроскопией, гидролизом казеина и характеристиками роста (температура и анаэробный рост). Для их диффенциации используют и другие методы, в том числе анализ состава жирных кислот, состава оснований ДНК, секвенирование гена последовательности 165 рРН, подходы, основанные на RAPD или их комбинации. Для ряда аэробных спорообразующих бактерий порчи, включая P. macerans, разработаны ПЦР-методы обнаружения, использующие праймеры, мишенями которых являются видоспецифические последовательности гена 165рРНК.

1.3.1.6.2 Анаэробные спорообразующие бактерии

Подсчет анаэробных бактерий может производиться с использованием десятичных разбавлений и RCM-агара или методом наиболее вероятного количества (MPN) с использованием пробирок со средой DRCM.

Идентификацию клостридий обычно проводят путем оценки фенотипических свойств изолятов, включая разжижение желатина, продуцирование индола, проверки подвижности, положения спор, востановления нитрата и сбраживания углеводов. Для анализа конечных продуктов брожения может применяться газожидкостная хроматография. В качестве альтернативы могут также использоваться профили биохимических реакций, имеющимися в тест-наборах. Для идентификации и харакгеризации анаэробных микроорганизмов, Bacillus и других близкородственных аэробных спорообразующих бактерий разработаны новые методы, в том числе с использованием антител, например ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, твердофазный иммуноферментный анализ) и ДНК-методы. Разработанные ДНК-зонды и ПЦР-методы, основанные на специфических последовательностях 165 рРНК, успешно применяются для идентификации различных клостридиальных видов, в частности С. tyrobutyricum.

1.3.2 Методы-выделения микроорганизмов-деструкторов

Рассмотрим методы выделения микрооганизмов-деструкторов на примере бактерий, приводящих к порче пищевых продуктов.

1.3.2.1 Выделение Pseudomonas

Для выделения псевдомад широко используется метод агаровых сред. К селективным веществам, обычно использующимся для ингибирования роста непсевдомонадной микробиоты, относятся цетримид, красители (фуксин, кристаллический фиолетовый или фуцидин) и антибиотики (эритромицин, хлорамфеникол, налидиксовая кислота, циклогексимид, новобиоцин или пенициллин). Эти антимикробные препараты обычно добавляют в концентрации, достаточной для подавления роста непсевдомонадной микробиоты. В качестве диагностических сред для обнаружения штаммов, продуцирующих флуоресцентный пигмент флуоресцеин (в частности, P. fluorescens), или штаммов, продуцирующих нефлуоресцентный пигмент пиоцианин (в частности, P. aeruginosa), как правило, используют среды Кинга В и А, которые промышленно выпускаются под названием Difco (Pseudomonas agar F и P). Для улучшения обнаружения P. fluorescens, P. aeruginosa и других псевдомонад в воде, почве, пищевых продуктах и клинических образцах в указанные среды Кинга и другие базальные среды для обнаружения Pseudomonas (Oxoid) можно добавлять цетримид или налидиксовую кислоту.

Агар CFC, содержащий цетримид, фуцидин и цефалоридин, представляет собой селективную среду, обычно используемую для выделения психротрофных псевдомонад из молока, мяса, рыбы и птицы. Он предотвращает рост подавляющего большинства представителей непсевдомонадной микробиоты, включая Enterobacteriaceae и грамположительные виды Bacillus и Lactobacillus, и оказывает минимальное влияние на размножение вызывающих порчу псевдомонад, включая P. fluorescens, P.fragi, P. lundensis, P. aerugionos и P. putida.

Применение для выделения псевдомонад селективных агаровых сред – широко используемый способ оценки санитарно-гигиенического состояния пищевого технологического оборудования и микробиологического качества пищевых продуктов.

Тем не менее не следует недооценивать недостатки этого метода, в том числе недостаточную избирательность этих сред и невозможность восстановления жизнеспособных, но непригодных к культивированию (VBNC) или сублетально поврежденных псевдомонад.

1.3.2.2 Выделение Xanthomonas

Представители рода Xanthomonas, способные вызвать порчу овощей и фруктов, могут расти на пектатных агаровых средах, которые обычно используются для выделения вызывающих мягкую гниль Pseudomonas и Erwinia. Тем не менее штаммы ксантомонад легко отличить от псевдомонад по их способности продуцировать окрашенный желтым пигментом ксантомонадин и слизеподобную ксантамовую смолу. Подобно другим ксантомонадам,  Xanthomonas, вызывающие мягкую гниль, не способны размножаться в культуральной среде без органических добавок. Ксантомонады чувствительны к антимикробным препаратам, добавляемым в псевдомонадные селективные агары (например, к тетразолия трифенилхлориду и др.). Для выделения фитопатогенных Xanthomonas зачастую применяют ряд антимикробных препаратов, в частности циклогексимид-метиловый зеленый и ванкомицин. Кроме того, для выделения специфических видов или патогенных вариантов Xanthomonas выпускается ряд селективных агаровых сред, однако неизвестно, пригодны ли эти агары для выделения штаммов ксантомонад, вызывающих мягкую гниль.

1.3.2.3 Выделение Shewanella

Представители рода Shewanella (семейства Vibrionaceae) широко распространены в природе и выделяются из свежих и испорченных пищевых продуктов, отходов переработки нефти, холодной воды, из морских глубоководных отложений и клинических образцов. Установлено, что типовой вид этого рода, S. putrefaciens, вызывает порчу многих пищевых продуктов, включая мясные, молочные и рыбные, а также продукты из мяса птицы. При культивировании на тиосульфате или полисульфиде  S. putrefaciens продуцируют сероводород (H2S). Эта бактерия также может утилизировать нитрат серы и оксид железа в качестве акцепторов электронов для дыхательного роста. Тем не менее, S. putrefaciens не способны использовать для своего размножения гликолиз или брожение, а также утилизировать лактат, пируват, формиат и аминокислоты в качестве источников углерода, и эти особенности метаболизма могут служить диагностическими признаками для обнаружения S. putrefaciens. Кроме того, продуцирование H2S является важным признаком для обнаружения на рыбе сульфидпродуцирующих бактерий. Степень продуцирования сероводорода при хранении охлажденной рыбы может использоваться в качестве показателя роста S. putrefaciens и для прогнозирования срока ее годности.

1.3.2.4 Выделение пектолитических и протеолитических бактерий

Пектолитические штаммы P. fluorescens и P. viridiflava считаются основной причиной порчи свежих продуктов, хранящихся в присутствии воздуха и при ходильных температурах. Наиболее распространенной пектатной средой, разработанной для выделения пектолитических микроорганизмов, является среда СУР (кристаллический фиолетовый + пектат). Для выделения пектолитических псевдомонад из почвы или ризосфер также используется среда Pseudomonas CFC, дополненная пектатом . Для выделения протеолитических псевдомонад, вызывающих болезни растений и порчу пищевых продуктов, применяют базальную среду для псевдомонад, дополненную селективными антимикробными препаратами и желатином (или обезжиренным молоком).

1.3.2.5 Выделение спорообразующих бактерий

Для выделения термофильных бактерий используют культивирование при 50–55 °С в течение 2–3 сут на декстрозо-триптоновом агаре после более жесткой тепловой обработки (например, при 100 °С в течение 5 мин). Для G. stearothemophilus стандартной процедурой является 30-минутное нагревание при 100 °С (или 10–минутное при 110 °С) с последующим быстрым охлаждением. Для выделения спорообразующих бактерий, вызывающие картофельную болезнь хлеба, в вышеупомянутых неселективных агарах могут использоваться соли тетразолия.

После этого для идентификации изолятов можно использовать различные методы, включая молекулярные и более традиционные, основанные на биохимических или фенотипических свойствах.

Для выделения Alicyclobacillus spp., единственных спорообразующих бактерий, способных портить сильнокислые продукты, применяют методы, основанные на использовании культуральных сред или фильтрации. Эти микроорганизмы не способны расти на стандартных агаровых средах (питательном агаре, сердечно-мозговой вытяжке, триптиказо-соевом агаре), даже если они подкислены до более низких значений рН. Как и в других методах выделения спорообразующих бактерий, здесь также присутствует начальный этап нагревания, в ходе которого образец выдерживают при температуре 80 °С в течение 1–10 мин. Обычно применяют следующие культуральные среды: среда Alicyclobacillus acidocaldarius (ААМ) или среда Bacillus acidocaldarius (ВАМ;, агар с апельсиновым соком (OSA, orange serum agar), дополненный сахарозой; картофельный агар с декстрозой (PDA, potato dextrose agar), обычно используемый для культивирования дрожжей и плесеней, ацилированный до рН 3,5; дрожжевой крахмало-глюкозный агар (YSG, yeast-starch-glucose), ацилированный до рН 3,7; среда HGYE; а также iC-arap. Из фильтрационных методов обычно используют фильтрацию через фильтр с размером пор 0,45 мм. Этот способ улучшает восстановление по сравнению чашечными методами и в настоящее время его широко применяют при переработке фруктов.

Выделение анаэробных спорообразующих бактерий зачастую затрудняется жесткими требованиями к споруляции некоторых из этих видов, и многие из них остаются необнаруженными, если не используются правильные условия восстановления/выделения. По этой причине бывает необходимо использовать селективно- диагностические среды. На начальном этапе выделения используется бульон из среды для Clostridium (RCM), дифференциальная улучшенная среда для выявления клостридий (DRCM), среда, продуцирующая H2S или среда на мясном бульоне.

Многие клостридии в содержащих железо средах при анаэробных условиях восстанавливают сульфит до сульфида и образуют черные колонии. Рост Enterobacteriасеае можно подавить путем включения полимиксина, а восстанавливающие сульфит Bacillus spp. можно распознать по чувствительности к метронидазолу. Возможность использования газ-пакетов и мешков, непроницаемых для кислорода, значительно облегчает культивирование анаэробов в последние годы.

Масляные анаэробы можно выделить путем выдерживания продукта при температуре 76,6  °С в течение 10 мин и использования агара для термо- и кислотостойких микроорганизмов, покрытого слоем тиогликолатового агара. Рост, сопровождаемый газообразованием, свидетельствует о присутствии масляных анаэробов. Среды, используемые для выделения анаэробов, можно сделать более специфическими для С. tyrobutyricum путем замены глюкозы лактатом и доведения значения рН до 5,3–5,5.

Для выделения D. nigrificans разработаны различные среды. Среди них можно отметить агар BETI (Beef Extract Tryptone Iron, мясной экстракт–триптон–железо), бульон Baars и соя-метабисульфит натрия-железистый цитрат аммония.

Для выделения термофильных анаэробов, не продуцирующих сероводород, например Т. thermosaccharolyticum, рекомендуется использовать среду РЕ-2. В этих целях используется также печеночный бульон, хотя он труднее в приготовлении и может ингибировать восстановление микроорганизмов, чувствительных к антибиотикам [12].

1.3.3 Методы определения активности микроорганизмов и продуктов их метаболизма

Рассмотрим методы определения метаболической активности микроорганизмов на примере участвующих в биобрастании аэробных и анаэробных бактерий под действием биоцидов.

На сегодняшний день существует только один стандартизированный количественный метод оценки устойчивости материалов к воздействию бактерий. Его суть заключается в инкубировании аэробных бактерий на поверхности образца биозащищенного материала в течение определенного времени с последующим смывом и определением числа сохранивших жизнеспособность клеток.

Однако, реализация этого метода с опытными образцами показала, что данные материалы обладают очень развитой пористой поверхностью и хорошими адсорбционными свойствами, в результате, сохранившие жизнеспособность клетки остаются адсорбировавшимися на поверхности образца и не образуют колонии при высеве. Таким образом, возникает существенная погрешность в определении концентрации выживших клеток, что делает данный метод непригодным для достижения указанных целей.

В то же время, известны подходы к определению степени биозащищенности материалов, основанные на сопоставлении метаболической активности прикрепленных к поверхности образца бактерий. Эти методы обладают преимуществами при анализе антимикробных свойств пористых материалов с развитой поверхностью.

Для оценки метаболической активности анаэробных бактерий разработан количественный анаэробно–суспензионный метод оценки устойчивости материалов к анаэробной биокоррозии. В качестве тест-культур в нем используются облигатно анаэробные сульфатредуцирующие бактерии, осуществляющие специфический способ запасания энергии сульфатное дыхание, при котором происходит диссимиляционное восстановление соединений серы с образованием сероводорода и сульфидов. Суть этого метода заключается в определении содержания сероводорода в культуральной жидкости после совместного инкубирования сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) с образцом в среде, не содержащей ионов железа, в специальном анаэробном биореакторе. Регистрацию количества сероводорода проводят фо- токолориметрически на основе цветной реакции образования метиленового синего. Схематически данный анализ представлен на рисунке 2.

Рисунок 2 – Схема анаэробно-суспензионного метода определения антибактериальных свойств биозащищенных материалов

Проверку полученных в результате анализа результатов можно осуществлять при помощи стандартного качественного метода, основанного на инкубировании СРБ в питательной среде, содержащей железо, с последующей визуальной регистрирацией образования черных зон сульфида, которые и учитываются при оценке бактерио- стойкости по трехбалльной шкале.

Для оценки антибактериальных свойств образцов биозащищенного материала по отношению к аэробным бактериям Pseudomonas fluoresceins был разработан метод оценки дыхательной активности клеток.

Для этого необходимо провести совместное инкубирование культуры бактерий, находящейся в log-фазе роста, с опытными образцами в течение суток. Для интенсификации дыхательного процесса необходимо создать благоприятные условия, поместив данную суспензию с образцом в свежий питательный бульон с последующим динамическим измерением в нем остаточного содержания растворенного молекулярного кислорода. Схема данного анализа приведена на рисунке 3.

Рисунок 3 – Схема метода определения дыхательной активности бактерии

 В основу принципа измерения положен  амперометрический метод анализа. На рисунке 4, представленном ниже, отображены графики зависимости содержания кислорода в культуральных жидкостях от длительности процесса дыхания.

Рисунок 4 – Динамика изменения содержания кислорода в культуральной жидкости

Чтобы повысить разрешающую способность метода, в качестве основного показателя антимикробных свойств образцов используется скорость потребления кислорода К, мг/л·мин:

                                        К = ∆С / t,                                                (1)

где ∆С – изменение концентрации кислорода за время t, мг/л;

t время измерения, мин.

Описанные методы позволяют получить схожие результаты и демонстрируют зависимость между концентрацией биоцида в составе материала и его устойчивостью к биообрастанию: чем больше концентрация биоцида, тем большей бактериостойкостью характеризуется материал.

Описанные количественные методы, основанные на измерении метаболической активности аэробных и анаэробных бактерий являются более объективными по сравнению со стандартными методами для оценки устойчивости к биообрастанию образцов биозащищенных материалов. Результаты анаэробно-суспензионного метода и метода определения дыхательной активности аэробных бактерий рода P. fluorescens коррелируют между собой, что дает основание судить о сходной чувствительности к биоцидным добавкам наиболее распространенных аэробных и анаэробных бактерий, участвующих в биобрастании [13].

1.4 Способы защиты материалов и изделий от биоповреждений м/о

1.4.1 Использование защитных покрытий

Эффективным средством против микробиологических повреждений являются специальные защитные покрытия.

Так, к грибостойким покрытиям относятся 25%-ный акрилатный лак АГС-4 (ТУ 40.01.72), хлоркаучуковая тиксотропная эмаль КЧТС-2 (ВТУ НИИ АБ-72), пентафталевая эмаль ПФ-115 (ГОСТ 6465-63), фторопластовые покрытия, герметики типа ВИКСИНТ, ЭЗК-6, К-30-100, К-1, резина МБС, эпоксидные ЛКП и др.

Грибостойкость лакокрасочных покрытий можно повысить введением фунгицидных добавок на стадии их приготовления перед применением. Так, в грунт ВА-01ГИСИ вводят катапин в количестве 0,5 % (по массе) и препарат БАМ в количестве 1,0% (по массе).

Латексы АГП-10 и АГП-40 хорошо совмещаются с промышленными поливинилацетатными и полиакрилатными водными дисперсиями и водно-дисперсионными красками на их основе и в количествах от 1 до 2 % (по массе) обеспечивают их защиту от повреждений микроорганизмами.

Препарат АГП-100 вводят в лакокрасочные и пленкообразующие материалы на основе органических растворителей (растворы, эмали, органодисперсии) в качестве биоцидной добавки. Он хорошо совмещается с хлорвиниловыми, перхлорвиниловыми, алкидно-стирольными, меламино-алкидными, алкидными, пентафталевыми, мочевинными, эпоксидными, масляными лаками, эмалями, олифами. Минимальная концентрация биоцида, обеспечивающая защиту основного материала, не превышает 1%. Возможно введение АГП-100 в некоторые герметики, смазочные масла и др.

Для ряда бактерий питательной средой являются дизельное топливо, бензин, моторное масло, в особенности при высоком содержании серы, органические соединения, находящиеся в воде системы охлаждения. Для борьбы с бактериями в таких случаях могут применяться хлор, хлорамин, перхлорат натрия, перманганат калия, а также органические соединения: дихлорбензол, формальдегид, алкилтриметил аммонийхлорид.

Аналогичное воздействие оказывают сальварсан и пенициллин. Поэтому перед остановкой двигателя на длительное хранение рекомендуется добавлять эти вещества в масло, топливо, охлаждающую воду.

Для защиты пластмасс от поражения в их состав добавляют антисептические и иногда ароматические вещества [14].

1.4.2 Полимерные материалы с антимикробными свойствами

Очевидно, что биообрастания значительно сокращают срок службы материалов и изделий за счет биокоррозии, обусловленной ферментативными системами микроорганизмов. Решить проблему биообрастаний и предотвратить биокоррозию часто удается путем введения в состав материалов биоцидных веществ или при использовании защитных покрытий с антимикробными свойствами. Расширение спектра биостойких материалов и сфер их использования диктует необходимость адекватной оценки антимикробной активности. Однако на сегодняшний день не существует простого и надежного метода для определения способности изделий и материалов противостоять микробной колонизации и деструкции.

Для изучения антимикробных свойств материалов используется ряд методов, среди которых можно выделить следующие:

1 Суспензионный метод, дающий возможность различить материалы с биоцидными добавками по степени выраженности их антимикробных свойств. Однако данный метод имеет существенный недостаток: в нем оцениваются антимикробные свойства только тех веществ, которые выщелачиваются из образца в раствор. Таким образом, материалы, прочно удерживающие биоциды, могут показать в этом методе низкую антимикробную активность, несмотря на то что их поверхность может оставаться защищенной от колонизации микроорганизмами.

2 Адсорбционный метод, позволивший выявить закономерность  снижения концентрации свободно суспендированных бактерий при увеличении длительности адсорбции клеток на волокне.

3 Модифицированный метод, позволяющий изучать способность к размножению клеток, адсорбированных на красителе.

Представленные методы дают возможность количественно оценивать степень антимикробной активности материалов, прочно удерживающих биоцидные добавки, а также изделий сложного профиля и с разным характером поверхности [15].

В настоящее время в целях защиты продукции от биоповреждений упаковочные материалы изготавливают, как правило, на основе полиолефинов: полиэтилена низкой плотности (ПЭНП), полиэтилена высокой плотности (ПЭВП), полипропилена (ПП), сополимеров этилена с винилацетатом (СЭВА), полиамидов (ПА), соэкструдатов на их основе, или с использованием других компонентов.

В промышленности используют пленки из сополимеров винилиденхлорида, а также металлизированные материалы. Комбинируя различные полимерные слои, получают материалы с требуемыми паро-, газо-, влагопроницаемостью, хорошей формуемостью, прозрачностью, высокой прочностью на разрыв, термосвариваемостью, способностью хорошо герметизироваться. Такие пленки имеют как один, так и два, три и более слоев, что придает им дополнительные свойства жесткости, газонепроницаемости, способности к вакуум упаковке. При этом слой, непосредственно контактирующий с продуктом, выполняют преимущественно из полиолефинов для обеспечения необходимых технических и гигиенических характеристик. Кроме полимерной составляющей в композицию этого слоя входят также специальные добавки (противостарители, скользящие агенты и т.д.).

Весь этот ассортимент упаковочных материалов предназначен для сохранения первоначального качества продуктов, сокращения их потерь при транспортировке и хранении, для обеспечения гигиенической безопасности продукции, а также для эффективной защиты от биоповреждений.

В настоящее время перечисленные полимерные пленочные материалы используются в виде пакетов (вакуумных и вакуумных термоусадочных) для упаковывания, хранения и реализации. Они могут также применяться в качестве покровного компонента в комбинированных пакетах с нижним слоем из металлизированных картона, бумаги и т.д.

Перспективно использование этих материалов для порционной упаковки сухих пряностей, смесей специй, функциональных добавок, сухих кормов для животных и т.д.

В настоящее время внедрена промышленная технология изготовления таких продуктов, как ветчина и окороки,  в пленочных пакетах; во многих странах выпускаются консервы в термоформируемой таре из одно- и многослойных соэкструзионных термостойких материалов на основе ПА и сополимера этилена с поливиниловым спиртом.

Происходят серьезные изменения и в области использования упаковочных материалов – из инертного защитного барьера между пищевым продуктом и окружающей средой упаковка превращается по существу в технологический фактор производства.

Расширение функций упаковки достигается путем придания традиционным материалам дополнительных признаков, например, селективной проницаемости к парам воды и газам, антимикробной активности по отношению к нежелательной микрофлоре, противоокислительного действия по отношению к жировым компонентам продуктов.

Активные полимерные материалы получают путем введения модификаторов (активных добавок) на стадии синтеза традиционно используемых полимеров или в композиции на стадии переработки их в изделия. Активные добавки могут также наноситься на поверхность изделия в виде дополнительных специальных слоев (покрытий). В зависимости от целевого назначения материала в качестве таких добавок используются консерванты, антиокислители, адсорбенты влаги и экотоксикантов, витаминные комплексы, коптильные или биологически активные препараты и т.д.

Проблема создания упаковочных полимерных материалов, обладающих антимикробной активностью, стала весьма актуальной. Это связано с резко ухудшившейся в последние годы экологической ситуацией и с существенным увеличением вследствие этого нежелательной микробной нагрузки в воздухе рабочих зон предприятий. На поверхности незащищенного продукта всегда имеется микрофлора, продуцирующая развитие болезнетворных микроорганизмов с поверхности в объем продукта. Вот почему так важно защитить продукцию соответствующей упаковкой на стадии ее производства сразу же после изготовления . Однако и внутри упаковки на обсемененных продуктах могут развиваться микроорганизмы, например, внутри вакуумных упаковок – анаэробные, при неполном вакууме – также и аэробные, а кроме того, и некоторые виды плесеней. Очень важно придать слою, контактирующему с продуктом, антисептические свойства.

В мировой практике широко применяется стерилизация поверхности пленок непосредственно перед их использованием (фасовкой продукции ) различными физическими методами или химическими агентами, например, ультразвуком, обработкой перегретым воздухом или перекисью водорода. Однако эти методы обеспечивают только обеззараживание исходного материала и не гарантируют антимикробную защиту упаковки при локальном нарушении ее целостности (проколе).

Устранение этого недостатка и одновременное улучшение комплекса защитного действия новых активных упаковочных материалов может быть достигнуто путем введения антимикробных компонентов непосредственно в полимерный слой материала на стадии его получения.

Разработанные новые однослойные и многослойные пленочные упаковочные материалы отличаются противоплесневой, антидрожжевой и антигрибковой активностью при общей санитарно-гигиенической доброкачественности. Эффект длительно сохраняющегося антимикробного действия пленок был достигнут путем введения в упаковочный материал специальных добавок – композиций оптимальной рецептуры на основе натриевой соли дегидрацетовой кислоты, антиоксидантов, пищевых кислот.

Высокая антимикробная активность и длительно сохраняющееся антисептическое действие материалов связаны с реализацией синергетического эффекта действия сбалансированной по составу антимикробной композиции. Пленочные материалы с антимикробными свойствами могут быть получены в виде однослойных и многослойных упаковочных материалов соэкструзией, кашированием, ламинированием.

При этом антисептическими свойствами может обладать либо один из слоев, непосредственно прилегающих к продукту, либо все слои в зависимости от целевого использования нового материала [16].

1.5 Методы оценки биостойкости материалов и защитных покрытий

1.5.1 Почвенный метод

Существует множество лабораторных методов оценки биостойкости промышленных материалов и товаров, классификация которых может быть проведена по различным признакам.

Методы различаются:

- по применяемым биофакторам (почвенная микрофлора, спонтанная микрофлора, микроскопические грибы, бактерии, насекомые, грызуны);

- по условиям экспонирования (влажность, температура, эксикаторы, климатические камеры, чашки Петри, колбы, сроки экспонирования);

- по способу оценки результатов (потеря механической прочности, потеря массы образцов, изменение структуры материалов, по типу оценки (визуальная четырех- или пятибалльная), численности микрофлоры на материалах, приросту биомассы и другим физико-химическими методам).

Один из достоверных и распространенных способов исследования биостойкости текстильных материалов, пластиков, резин и других неметаллических материалов – это почвенный метод. Он предназначен для испытания биостойкости тканей в лабораторных условиях. Но его можно приспособить и для испытания других материалов. Для проведения почвенных испытании готовят почву следующего состава: песок, конский навоз, садовая земля в соотношении 1:1:1 с рН 6–7,5.

Определяют коэффициент биологической активности почвы а, который должен находиться в пределах 0,65–1,5, путем сравнения активности приготовленной почвы с активностью эталонной. Эталонной активностью считают активность почвы, в которой прочность образна непропитанной хлопчатобумажной ткани массой 100—150 г/м2 после испытания в течение 120 ч снижается на 50%.

Коэффициент биологической активности рассчитывают по формуле (2):

                                                 a=ТaТэ  ,                                                           (2)

где a − коэффициент биологической активности;

Тa  – время контакта с испытуемой почвой, в течение которого разрывная нагрузка ткани уменьшилась на 50%;

Тэ – время контакта с эталонной почвой, в течение которого разрывная нагрузка ткани уменьшилась на 50% (в нашем случае 120 ч).

На образец испытуемого материала наносят слой приготовленной почвы толщиной 25 см с влажностью 28% и помещают во влажную камеру на определенный промежуток времени, где выдерживают при 24–26 °С. Затем определяют прочность на разрыв по формуле (3):

                                             П=РтР0∙100 % ,                                                   (3)

где П − коэффициент устойчивости к микробиологическому разрушению (прочность на разрыв), %;

Рт – разрывная нагрузка испытуемой пробной полоски, г;

Р0 −  разрывная нагрузка исходной пробной полоски, г.

Стандартный почвенный метод имеет ряд преимуществ перед другими, требующими выдерживания образцов в почве от 2 недель до нескольких месяцев. Полученные при таких испытаниях результаты имеют большой разброс и плохую воспроизводимость, поэтому их лучше использовать для определения биостойкости какой-то определенной партии, а для сравнения с результатами испытаний, полученными другими исследователями, надо использовать стандартный метод [17].

1.5.2 Метод агаровых сеток

Метод «агаровой сетки» был разработан» с целью оптимизации и стандартизации условий роста микроскопических мицелиальных грибов на поверхности бетона, древесины,бумаги, лакокрасочных покрытий, других природных и синтетических материалов с фунгицидными добавками. Сущность метода заключается в том, что на поверхность испытуемых образцов, помещенных в чашки Петри, наносят небольшое количество стандартной агаризованной питательной среды (среда Чапека, Чапека-Докса и др.), которая при застывании была тщательно перемешана и смешана со спорами тест-культуры гриба.

Инокулированную среду равномерно распределяют по поверхности образца в присутствии сетчатого шаблона. После снятия шаблона на образце остается так называемая «агаровая сетка», представляющая собой разделенный на миниатюрные блоки сетью борозд слой агаризованной среды, высота которого равна толщине сетчатого шаблона. Чтобы избежать высыхания среды образцы помещают на увлажненные бумажные фильтры или слой агарового геля («голодный агар»). Чашки

Петри инкубируют в термостате с оптимальной для роста гриба температурой.

Через определенные промежутки времени, не реже чем 1 раз в сутки, несколько ячеек агаровой сетки снимают с образцов, помещают на предметные стекла в каплю воды и микроскопируют в проходящем свете.

В качестве критерия фунгитоксичности может выступать длительность лаг-фазы (время от нанесения агаровой сетки до начала массового прорастания спор). Данный параметр хорошо коррелирует с концентрацией биоцидных препаратов в пропиточных растворах или лакокрасочных покрытиях. Исследования показали нецелесообразность проведения испытаний более 10 суток. Данного срока достаточно для выявления, способности материалов ингибировать рост плесневых грибов (частичного или полностью) или отсутствие у них фунгитоксичности.

Для удобства определения степени прорастания спор лучше использовать быстрорастущие виды с крупными темными спорами, у которых лаг-фаза в оптимальных условиях составляет 12–18 часов.

Изучение влияние биоцидных препаратов с различной концентрацией на развитие микромицетов различной видовой и штаммовой принадлежности, проведенное автором,  выявило, что одни культуры чутко реагируют на повышение концентрации биоцида удлинением лаг-фазы, другие – отличаются высокой устойчивостью к антисептикам, заметная задержка прорастания спор у них наблюдается при сравнительно высокой токсичности материала.

В качестве тест-культуры можно использовать оба типа грибов. При необходимости быстрого отбора из большого количества образцов вариантов антисептической обработки, придающих материалам высокую фунгицидную активность, лучше использовать культуры, устойчивые к неблагоприятным воздействиям. Например, на 1 этапе отбора оставить варианты, где лаг-фаза резистентной культуры превышает 2 суток. При отработке технологических режимов, оценке устойчивости к внешним воздействиям и в других аналогичных исследованиях целесообразно использовать культуры, чувствительные к антисептикам.

Метод «агаровой сетки» позволяет количественно охарактеризовать фунгицидную активность материалов и в тех случаях, когда содержание антисептического препарата превышает минимальные ингибирующие концентрации. На практике антисептик нередко вносят с «запасом прочности», и выявить остаточную фунгицидную активность в том случае, когда рост и развитие грибов полностью ингибируется, довольно сложно. Химические методы могут определить лишь количество вещества, которое может находиться в активной или неактивной по отношению к живым организмам форме. В таких случаях критерием фунгитоксичности будет служить минимальное время контакта агаровой сетки с образцом вызывающее потерю жизнеспособности спор [18].

1.5.3 Метод агаровых блоков

Метод агаровых блоков чаще всего применяется при изучении антагонистических свойств микроорганизмов. Его преимуществом является возможность культивирования микроорганизмов-антагонистов и тест-культур на разных по составу плотных питательных средах. Исследуемый на антагонистическую активность микроорганизм засевают на поверхность агаризованной среды в чашке Петри так, чтобы в процессе роста сформировался сплошной газон. Для этого можно использовать, к примеру, суточные культуры бактерий или дрожжей, споровые суспензии мицеллиальных грибов или актиномицетов (бактериологической петлей споры переносят в 1 мл стерильной воды), распределяя по 0,1–0,2 мл этих суспензий шпателем по всей поверхности среды. Посевы инкубируют при подходящей температуре 8–10 суток.

Затем стерильным пробочным сверлом (диаметр 6–8 мм) из слоя среды вырезают агаровые блоки и переносят их на поверхность агаризованной среды, только что засеянной тест-организмом. Тест-организм в виде суточной культуры чаще также засевают шпателем на поверхность плотной среды (метод Коха), но для улучшения диффузии антимикробного вещества можно использовать и глубинный посев в полужидкую агаризованную среду. Агаровые блоки размещают ростом (газоном) вверх, на равном удалении друг от друга и от краев чашки, плотно прижимая к агаровой пластинке. На агаровой пластинке в одной чашке Петри можно разместить 4–5 агаровых блоков с различными продуцентами антимикробных веществ.

Посевы выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре для диффузии антимикробных веществ в агар, а затем помещают в термостат для инкубирования тест-культур. Если тест-культура чувствительна к антимикробному веществу, которое продуцирует микроб-антагонист в составе агарового блока, то после инкубирования вокруг этого блока сформируется зона задержки (ингибирования, отсутствия) роста. Чем больше выделяется антимикробного вещества и чем оно активнее, тем будет больше ширина зоны задержки роста тест-организма. Тест-культура, не чувствительная к антимикробному веществу данного продуцента, растет в непосредственной близости от агарового блока продуцента.

Данный метод позволяет в одной чашке Петри исследовать чувствительность одной тест-культуры по отношению к нескольким антагонистам в составе агаровых блоков. Однако при необходимости можно модифицировать условия эксперимента с тем, чтобы получить возможность определения чувствительности нескольких тест-организмов по отношению к одному антагонисту. Для этого, например, в центр агаровой пластинки в чашке Петри помещают агаровый блок с газоном антагониста (ростом вверх), а через 30–60 минут (это время необходимо для диффузии антимикробного вещества в агар) по радиусам равномерными штрихами подсевают тест-культуры [19].  

1.5.4 Методы оценки адаптации бактерий к антимикробным веществам

Выделение активируемых форм клеток и контроль за изменением уровня их чувствительности и устойчивости к антимикробным веществам обеспечивается использованием методов выращивания микроорганизмов в агаре.

Для достижения вышеизложенной цели зачастую используются методы культивирования микроорганизмов в жидких и агаризованных средах в присутствии антисептиков. Для реализации данных методов в суспензию клеток микроорганизмов в питательном бульоне вносят антимикробные вещества. Далее суспензию помещают в термостат при 30°С и культивируют в течение 3 сут. Каждые сутки отбирают образцы и высевают их на ПА для определения количества выживших клеток.

При выращивании микроорганизмов на агаризованных средах с антисептиками проводят последовательный пересев колоний клеток, появившихся на питательном агаре (ПА) с биоцидными веществами умеренной концентрации, на среды с возрастающей концентрацией антисептика. Для этого готовят чашки Петри с плотной агаризованной средой с содержанием биоцидов и контрольные чашки без биоцидов. В каждую чашку вносят суспензию микроорганизмов и культивируют в термостате при 30°С в течение 3 суток, а затем подсчитывают количество выросших колоний клеток, устойчивых к биоцидам.

Для получения вторичной и последующих культур клеток из чашек Петри, на которых был отмечен рост микроорганизмов, отбирают отдельные колонии клеток, вносятих в физиологический раствор, выравнивают концентрации по оптической плотности и высевают разведения на чашки с ПА, содержащими такие же и возрастающие концентрации биоцидов.

Полученные на разных стадиях пересевов клетки используют для оценки чувствительности и устойчивости микроорганизмов к биоцидным веществам. Эти измерения проводят с помощью метода диффузии веществ в агар. На поверхность застывшего ПА наносят суспензию тест-культуры микроорганизмов и равномерно распределяют с помощью стерильного шпателя по поверхности агара. Затем укладывают стерильные диски фильтровальной бумаги диаметром 8 мм, пропитанные в растворах биоцидов. Чашки помещают в термостат при температуре (30 ± 1)°С на 24 ч. После инкубирования изменют диаметры зон задержки роста клеток вокруг дисков.

При оценке чувствительности и устойчивости клеток микроорганизмов к биоцидам используют также метод реплик. Выросшие колонии клеток переносят из чашек без биоцидов на питательный агар с возрастающим содержанием антисептика и определяют предельные концентрации, при которых не наблюдалось образование видимых колоний клеток.

В качестве антисептиков применяют препараты полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ), хлоргексидин биглюконат (ХГ).

Для обработки результатов измерения используют статистические методы.

Скорость адаптации клеток на популяционном уровне можно оценить по тангенсу угла наклона полученных в ходе анализа зависимостей изменения логарифма численности клеток от времени их культивирования по формуле:

                                            v = d (log N) / dt,                                             (4)

где N – численность культивируемых микроорганизмов, устойчивых к биоциду;

t – время культивирования клеток.

Предложенные методы устанавливают, что длительность периода адаптации клеток к биоциду ПГМГ зависит от его содержания в среде. При увеличении концентрации биоцида ПГМГ наблюдается задержка роста численности популяции клеток (лаг-фаза) более чем на двое суток до появления культивируемой формы микроорганизмов. Этот период задержки роста характеризует физиологический уровень адаптации клеток.

Как известно, жизнеспособность микроорганизмов при воздействии неблагоприятных факторов среды характеризуется чувствительностью и устойчивостью клеток к этим факторам. О чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам можно судить по минимальной концентрации вещества, вызывающей задержку роста клеток. Торможение жизненной активности клеток рассматривается как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов.

Полученные на разных стадиях адаптации клетки могут быть использованы для оценки их чувствительности и устойчивости к биоцидам.

Существует максимальная концентрация антисептика, выше которой физиологическая адаптация микроорганизмов к нему невозможна ввиду превышения адаптационных возможностей клеток. Данная концентрация характеризует границу физиологической устойчивости микроорганизмов к биоциду.

Вместе с тем для микроорганизмов возможна генетическая адаптация, связанная со случайной комбинацией полезных мутаций, приводящая к повышению устойчивости к биоциду. Этот процесс требует значительно более длительных периодов времени и может растягиваться на десятки лет.

Данные методы позволяют установить, что адаптация микроорганизмов к биоцидам сопровождается увеличением численности выживших форм клеток, снижением их чувствительности и повышением устойчивости. Чем ниже концентрации септика, тем выше скорость адаптации микроорганизмов к неблагоприятному фактору. Существуют максимальные концентрации антимикробных веществ, выше которых клетки физически не адаптируются. Основными параметрами, характеризующими адаптационные свойства микроорганизмов, являются: скорость адаптации, период времени адаптации, чувствительности микроорганизмов к антисептикам, содержание устойчивых форм клеток.

Использование методов выращивания микроорганизмов в агаре позволяет выделят культивируемые формы клеток и следить за изменением их уровня чувствительности и устойчивости к антимикробным веществам, а также определять содержание устойчивых форм клеток. Однако эти методы длительны, трудоемки и не позволяют анализировать некультивируемые формы клеток, содержание которых может достигать в природных условиях 90% всей численности популяции микроорганизмов.

Это вызывает необходимость разработки более эффективных инструментальных методов анализа адаптационных свойств микроорганизмов и определения содержания некультивируемых форм клеток [20].

2 Экспериментальная часть

2.1 Материалы и оборудование

Для осуществления экспериментальных исследований были использованы:

Стерильная посуда: чашки Петри, пробирки, пипетки.

Лабораторное оборудование: спиртовка, штатив для пробирок, термостат, микроскоп, микрокалориметр МКМ-Ц, водяная баня, стерильные бумажные фильтры, микробиологические шпатели, спички.

Испытуемые материалы: металлическая пластинка, пленкообразующие вещества, молоко 3,2 % жирности, кондитерские изделия (шоколад, конфеты, пряники).

Химические вещества: стерильная вода, спирт, метиленовый синий, антисептические вещества.

Культуры бактерий  Bacillus subtilis и грибов  Aspergillus niger.

Питательные среды по 2.2.1.

2.2 Микроорганизмы и питательные среды

2.2.1Питательные среды для культивирования грибов

При составлении питательных сред для микроорганизмов необходимо учитывать их потребность в элементах питания. По составу питательные среды подразделяются на две группы: естественные (натуральные) и синтетические.

Естественными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав.

На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, обычно, все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны, выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов. Это связано с тем, что состав естественных сред очень сложен; кроме того, он не является постоянным, так как существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей.

Для грибов, наиболее широко используют полноценные среды, приготовленные на основе солодового сусла. В состав сусла входят глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза, небольшое количество пентоз – арабиноза, ксилоза, рибоза. Эти вещества и являются основными источниками углерода и энергии для грибов. В сусле имеются также аминокислоты, витамины и минеральные вещества. Для культивирования грибов в питательных средах обычно устанавливают рН 5–6, поскольку грибы в большинстве своем являются ацидофильными микроорганизмами.

Синтетические среды − это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды следует готовить на дистиллированной воде. Для разработки синтетических сред, обеспечивающих нормальный рост изучаемого микроорганизма или максимальный биосинтез какого-либо продукта его жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и его потребности в источниках питания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным средам неизвестного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой  набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена.

Для курсового проекта были использованы следующие питательные среды:

- питательный агар (ПА) готовят из коммерческого препарата «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой», который содержит панкреатический гидролизат кильки, хлорид натрия и агар-агар. Обычно для приготовления плотной среды требуется вносить в среду дополнительное количество агар-агар. Поскольку эта среда содержит агар-агар, который растворяется в воде только при температуре 98оС, навески порошка вносят во флаконы, заливают нужным объемом воды и стерилизуют автоклавированием при 1 ати 20-30 мин;

- сусло-агар (СА). Поскольку основой служит сусло-бульон с кислой среды, для получения плотных агаризованных сред берут небольшой избыток агар-агар в расчете на то, что в процессе стерилизации часть его подвергнется температурно-кислотному гидролизу. Во флаконы  с сусло-бульоном вносят агар-агар до концентрации 2–2,5% для плотной среды и 1,0-1,5% для полужидкой. Стерилизуют при 0,5 ати 30 мин.

- питательный бульон (ПБ) готовят из коммерческого препарата «Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой», который содержит панкреатический гидролизат кильки и рыбной муки и хлорид натрия. Растворяют навеску порошка в воде в пропорции, обозначенной на этикетке. Контролируют рН, разливают по флаконам и стерилизуют автоклавированием при 1 ати 20-30 мин;

- питательный агар для грибов (агар Чапека)

Для приготовления агара Чапека берут 20−30 г агар-агара, заливают его 1000 мл дистиллированной воды и вымачивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Воду сливают и измеряют ее объем для определения количества воды, впитавшейся агаром. Затем агар промывают 2−3 раза дистиллированной водой.

Взвешивают остальные компоненты среды (сахароза − 30,0 г, азотнокислый натрий −3,0 г, фосфорнокислый однозамещенный калий −1,0 г, сернокислый магний − 0,5 г, хлористый калий − 0,5  г, сернокислое закисное железо−0,01 г) и растворяют в дистиллированной воде, которую берут в объеме, равном количеству воды, слитой при вымачивании агара. К раствору добавляют отмытый агар, после чего среду варят в автоклаве текучим паром в течение часа.

Полученную среду фильтруют, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют в автоклаве при температуре 110−112°С (под давлением 0,05 МПа по показанию манометра) в течение 20 мин.

- среда Сабуро

Для ее приготовлении к 100 см3 дистиллированной воды добавляют 1,8 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем добавляют 4 г мальтозы или глюкозы и 1 г пептона, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Стерилизуют среду при температуре 115 0С в течение 15 минут.

Для повышения селективности, т.е. подавления развития посторонних микроорганизмов, в среду Сабуро добавляют растворы антибиотиков – пенициллина (50 ЕД/см3), левомицетина (10 мкг/см3). [6]

Кроме того, в курсовом проекте был использован физиологический раствор (ФР). Для его приготовления 8,5 г хлористого натрия растворяют в 1 л дистиллированной воды. Стерилизуют при 0,15 МПа в течение 20 минут [19].

2.2.2 Выделение чистых культур бактерий

Чистой культурой микроорганизмов называют культуру одного вида, выращенного как потомство одной клетки. Методы выделения чистых культур микроорганизмов основаны на изоляции одной микробной клетки от массы микроорганизмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.

Выделение чистых культур осуществляется в несколько стадий. Первая стадия – отбор и подготовка проб. На данной стадии может осуществляться количественный анализ содержания требуемых микроорганизмов в материале.

Второй стадией является получение элективной культуры. Необходимо отметить, что для достижения наилучших результатов при выделении микроорганизмов обычно добиваются при сочетании нескольких элективных факторов. К числу факторов относят физические (температуру, электромагнитные излучения, концентрация молекулярного кислорода, активность воды),  химические (состав питательной среды, которую используют в качестве элективной,  наличие в ней ингибиторов роста и биоцидов, а также реакцию среды) и биологические факторы (живые питательные среды, использование симбиотических партнеров).

Третья стадия – получение чистых культур микроорганизмов, в данном случае – бактерий. Чтобы из смешанной элективной культуры получить требуемый микроорганизм в виде чистой культуры, необходимо добиться разобщения клеток, после чего обеспечить условия, в которых образуется их потомство.

Существуют методы прямого выделения одной клетки при микроскопировании (их обычно применяют для относительно крупных микроорганизмов) и косвенные методы, основанные на плотных средах (с последующим формированием колоний) либо в жидких средах (с последующим формированием суспензий). Наиболее простым и чаще других используемым способом получения чистой культуры является чашечный метод Коха, который состоит в физическом разобщении клеток на плотной среде, в результате чего одна клетка формирует одну колонию, состоящую из генетически однородных особей – потомков единственной клетки.

Для разобщения клеток аэробных микроорганизмов используют следующие методы:

- посев методом Коха на поверхность плотной среды в одной чашке Петри. Для получения изолированных колоний элективную культуру следует развести. При этом бывает трудно предсказать относительное содержание в суспензии требуемых микроорганизмов, и поэтому обычно делают высевы из нескольких серийных разведений (чаще из разведений 10-4–10-6);

- посев методом Коха на плотные среды в трех чашках Петри. Этот способ обычно дает наилучшие результаты при высеве смешанных культур, то есть позволяет выявить наибольшее разнообразие морфологических типов колоний;

- посев истощающим штрихом. Данный метод выбирают в тех случаях, когда существует уверенность, что требуемый организм находится в элективной культуре в достаточно высокой концентрации.

Для получения изолированных колоний анаэробов выбирают:

- глубинный посев. Здесь требуется провести разведение элективной культуры. Обычно производят засев разведений 10-4–10-6;

- разведение суспензий в плотных питательных средах. Данный метод используют для облигатных анаэробов. Его суть состоит в том, что в пробирки для разведения элективной культуры вместо физиологического раствора вносят расплавленную агаризованную питательную среду, охлаждают ее до 45–46оС, после чего совершают все манипуляции по разведению суспензии. Делают 6–10 последовательных разведений с шагом 10. Затем среду с пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (в соотношении 3:1) для защиты среды от проникновения воздуха.

Получение чистых культур прямым выделением клеток при микроскопировании. Методы данной категории требуют специального оборудования и не применимы для выделения очень мелких клеток и неклеточных существ:

- капельный метод Линднера позволяет выделять крупные клетки цианобактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, водорослей, простейших. Разводят элективную культуру в стерильной питательной среде с тем расчетом, чтобы в небольшом объеме (0,01 мл) содержались одиночные клетки (обычно получают разведения

10-6–10-8). На поверхность нескольких стерильных покровных стекол бактериологической петлей наносят микрокапельки разведенной суспензии. Готовят препараты «висячая капля» и просматривают под микроскопом. Отбирают те препараты, в которых присутствует по одной клетке, и инкубируют их во влажных камерах 12–24 ч. Затем вновь  микроскопируют и растущие культуры бактериологической петлей переносят в жидкие или плотные питательные среды.

- выделение клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой устройство, которым оснащают микроскоп, позволяющее с помощью специальной микропипетки извлекать из суспензии одну клетку. Все действия осуществляются под микроскопом [19].

2.3 Методы анализа

2.3.1 Определение общего количества бактерий методом культивирования

Применение метода культивирования микроорганизмов может осуществляться для достижения следующих целей:

1) накопления клеток;

2) обогащения смешанной популяции представителями определенной группы;

3) получения чистой культуры;

4) получения целевого продукта;

5) перевода клеток в нужную фазу роста и т. д.

Культивирование микроорганизмов сопровождается увеличением их количества и массы.

Для реализации метода культивирования на практике осуществляют получение суточной культуры, представляющей собой суспензию клеток в жидкой питательной среде. В ней достигается максимальная концентрация микроорганизмов и популяция обычно находится в стационарной фазе роста.

Обязательным условием получения суточной культуры является подготовка контроля за соблюдением правил асептики. Для получения суточной культуры бактерий поступают следующим образом. В две стерильные пробирки вносят по 2 мл питательного агара. Затем в одну из них бактериологической петлей засевают изолированную колонию бактерий. Помещают посевы в термостат и инкубируют 16–18 часов [19].

Результаты, полученные при определении общего количества бактерий методом культивирования, представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты определения бактерий

а

f

v

  Ni, кл/мл

Ncp, кл/мл

СКО, кл/мл

ε, %

75

60

0

1

75

60

6,8*101

7,5

11,1

62

50

1

1

6,2*102

5,0*102

5,6*102

60

10,7

43

38

2

1

4,3*103

3,8*103

4,1*103

250

6,2

2.3.2 Построение калибровочных зависимостей микроорганизмов по спектру мутности

На рисунке 5 представлена  калибровочная зависимость бактерий.

Рисунок 5 – Калибровочная зависимость бактерий по спектру мутности

2.3.3 Анализ физиологической активности бактерий редуктазным методом

Анализ физиологической активности бактерий можно осуществлять редуктазным методом.

Сущность данного метода заключается в установлении физиологической активности бактерий, продуцирующих фермент редуктазу, которая способна обесцвечивать некоторые краски, в частности метиленовую синь. Этой способностью обладают также лейкоциты, аскорбиновая кислота и некоторые другие вещества, содержащиеся в молоке. В основу метода положено определение времени, необходимого для обесцвечивания метиленовой сини. Для постановки редуктазной пробы в пробирку 20 мл молока добавляют 1 мл рабочего раствора метиленовой сини и плотно закрывают пробкой. После перемешивания пробирку помещают в водяную баню при температуре 37–40 °С, наблюдая за временем обесцвечивания метиленовой сини через 20 мин, 2 и 5,5 ч. Для приготовления рабочего раствора берут 5 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и добавляют 195 мл дистиллированной воды.

Молоко относят к I классу, если обесцвечивание метиленовой сини происходит через 5,5 ч. В молоке II класса обесцвечивание происходит за 2-5,5 ч. Молоко III класса обесцвечивается в период от 20 мин до 2 ч. Время наступления обесцвечивания содержимого пробирки указывает на приблизительное количество в исследуемом молоке микроорганизмов, продуцирующих фермент редуктазу.

Проведенные исследования позволили отнести испытуемое молоко к I классу.

Преимущество редуктазной пробы в сравнении с прямым бактериологическим методом состоит в быстроте получения результате (примерно через 5,5 ч). Однако не все микроорганизмы обладают редуцирующей активностью. В большей степени это свойство имеют молочнокислые стрептококки, кишечные палочки, маслянокислые и гнилостные бактерии, несколько меньше - сальмонеллы и стафилококки, а возбудители мастита стрептококковой этиологии лишены этой способности. Поэтому молоко может содержать большое количество стрептококков, вызывающих мастит, а по редуктазной пробе оно будет отнесено к первому классу. Кроме того, эта проба дает завышенные результаты летом и почти бесполезна зимой. Другими словами, молоко II и III класса после двухсуточного охлаждения при 4–5 °С по редуктазной пробе дает показатели I класса. Следовательно, редуктазная проба с метиленовой синью дает весьма неточное представление о степени бактериальной обсемененности молока и его санитарном качестве. Поэтому показатели редуктазной пробы необходимо учитывать в комплексе с другими результатами исследований.

2.3.4 Метод определения эффективных концентраций биоцидов

В качестве метода определения эффективных концентраций биоцида может быть использован метод диффузии веществ в питательном агаре. Для его реализации на поверхность застывшего питательного агара наносят по 0,1 см3 суспензии тест-культуры бактерий в концентрации 107 кл./см3 и равномерно распределяют с помощью стерильного шпателя по поверхности агара. Затем укладывают стерильные диски фильтровальной бумаги, пропитанные в растворах биоцидов в диапазоне концентраций 0,001–0,1 %. Чашки помещают в термостат при температуре (301)°С на 24 часа. После инкубирования измеряют диаметры зон задержки роста клеток вокруг дисков.

Ростовую активность бактерий в присутствии различных концентраций биоцидов оценивают по изменению оптической плотности D600 от времени. Для спектрофотометрического измерения оптической плотности к 9 см3 суточной культуры бактерий, содержащих 107 кл./см3, добавляют 1 см3 различных антисептиков. В качестве контрольных образцов служат клетки с добавками физиологического раствора вместо антисептиков. Через каждые 30 минут необходимо отбирать пробы и измерять оптическую плотность растворов при λ=600 нм в течение 8 ч.

Измерение тепловыделения микроорганизмов на поверхности исследуемых материалов выполняют на микрокалориметре МКМ-Ц. На образцы исследуемых материалов наносят чистые культуры бактерий Bacillus subtilis в питательном бульоне в концентрациях 104–108 кл./см2. Образцы обрабатывают антисептиком в концентрациях 0,1–  0,5 % или физиологический раствор. После загрузки проб в микрокалориметр регистрируют мощность тепловыделения поверхностной микрофлоры на протяжении 2–3 часов.

Оценка активности биоцидов, а также определение их эффективных концентраций, данным методом проводиться по диаметру зоны подавления роста микроорганизмов на поверхности питательного агара.

Анализ по данному методу позволяет установить, что, чем меньше концентрация веществ и выше диаметр зон отсутствия роста микроорганизмов, тем более активен препарат. О повышении резистентности клеток на поверхности материалов к применяемому антимикробному веществу можно судить по снижению диаметра зон подавления роста бактерий после посева смывов с поверхности на питательном агаре в присутствии дисков с той же рабочей концентрацией биоцида.

Достоинствами метода являются простота, наглядность, низкие затраты. К недостаткам способа следует отнести относительную длительность (сутки и более), невозможность анализировать полимерные антисептики.

Другим методом оценки активности антимикробных веществ и их эффективной концентрации в лабораторных условиях является спектрофотометрический способ. В данном случае биоцидную активность и эффективность препарата можно оценить по увеличению лаг-фазы задержки роста клеток и уменьшению количества жизнеспособных микроорганизмов по сравнению с контрольным образцом, регистрируемому по снижению величины (D/D0)600 от времени обработки.

Данный метод достаточно быстр и удобен, однако не всегда применим в случае слишком мутных сред и относительно низкого содержания микрооргпнизмов (ниже 106 кл./см3), а также не подходит для непосредственного анализа поверхностной микрофлоры [21].

2.3.5 Оценка защитного действия биоцидных веществ методом «агаровой сетки» и «агаровых блоков»

Метод «агаровой сетки» был разработан» с целью оптимизации и стандартизации условий роста микроскопических мицелиальных грибов на поверхности бетона, древесины,бумаги, лакокрасочных покрытий, других природных и синтетических материалов с фунгицидными добавками. Сущность метода заключается в том, что на поверхность испытуемых образцов, помещенных в чашки Петри, наносят небольшое количество стандартной агаризованной питательной среды (среда Чапека, Чапека-Докса и др.), которая при застывании была тщательно перемешана и смешана со спорами тест-культуры гриба.

При реализации данного метода инокулированную среду равномерно распределяют по поверхности образца в присутствии сетчатого шаблона. В качестве исследуемого образца был выбран пленкообразователь, в который вносили расчетное количество биоцида. Критерием фунгитоксичности служила лаг-фаза тест-культуры Aspergillus niger), т. е. время от посева до начала активного роста гриба. Данный параметр хорошо коррелирует с концентрацией биоцидных препаратов в лакокрасочных покрытиях.

После снятия шаблона на образце остается так называемая «агаровая сетка», представляющая собой разделенный на миниатюрные блоки сетью борозд слой агаризованной среды, высота которого равна толщине сетчатого шаблона. Чтобы избежать высыхания среды образцы помещают на увлажненные бумажные фильтры или слой агарового геля («голодный агар»).

Через определенные промежутки времени, не реже чем 1 раз в сутки, несколько ячеек агаровой сетки снимают с образцов, помещают на предметные стекла в каплю воды и микроскопируют в проходящем свете [18].

Метод агаровых блоков чаще всего применяется при изучении антагонистических свойств микроорганизмов. Его преимуществом является возможность культивирования микроорганизмов-антагонистов и тест-культур на разных по составу плотных питательных средах.

При проведении анализа исследуемые на антагонистическую активность мицелиальные грибы засевают на поверхность агаризованной среды в чашке Петри так, чтобы в процессе роста сформировался сплошной газон. Для этого бактериологической петлей переносят споры грибов  в 1 мл стерильной воды. 0,1–0,2 мл полученной суспензии распределяют шпателем по всей поверхности среды. Инкубируют посевы при температуре 20 0С 8–10 суток.

Затем стерильным пробочным сверлом (диаметр 6–8 мм) из слоя среды вырезают агаровые блоки и переносят их на поверхность агаризованной среды с испытуемым материалом. Агаровые блоки размещают ростом (газоном) вверх. Схема проведения испытания по экспресс – методу оценки грибостойкости материалов приведена на рисунке 6.

                                                                              

                                                                                                         

                                                                                                           Водный агар в чашке Петри

                                                      Образец материала с покрытием

            а

                                                               Агаровый блок с мицелием

                                                                                      Зона обрастания блока мицелием

Рисунок 6 – Схема проведения испытания по экспресс – методу оценки грибостойкости материалов (покрытий)

Посевы инкубируют в оптимальных для развития  используемого микромицета условиях в течение 14 суток. После этого учитывают ширину зоны обрастания агарового блока мицелием и стадию развития гриба [19].

2.3.6 Оценка защитного действия биоцидных веществ микрокалориметричеким методом

Микрокалориметрия относится к теплометрическим методам анализа. Биокалориметрия изучает энергетические процессы, протекающие в макро- и микроорганизмах. Обмен энергии с окружающей средой является универсальным свойством всех живых организмов, поэтому биокалориметрия рассматривается как универсальный метод исследования их жизнедеятельности.

Микроорганизмы обладают высоким уровнем тепловой активности и выделяют 104 10-14   Вт/кл, что позволяют регистрировать 104 105  кл/см3 в течение часа. Величина выделяемого микроорганизмами тепла зависит от количества клеток , их вида, особенностей метаболизма и их физиологической активности. При внесении исследуемых проб с живыми микроорганизмами в микрокалориметр выделяемыми клетками тепло передается через теплопроводящую стенку кюветы к тепломерам микрокалориметра, а также частично рассеивается в окружающую среду. Так как скорость тепловыделения микроорганизмов значительно ниже скорости распространения тепла к тепломерам, то через определенное время устанавливается термодинамическое равновесие. Количество тепла, регистрируемое микрокалориметром, пропорционально количеству микроорганизмов и их физиологической активности.

Для анализа жизнедеятельности микроорганизмов используются термограммы (дифференциальные и интегральные). Количественное определение микроорганизмов методом микрокалориметрии основано на экспериментально установленной зависимости между количеством выделенного тепла (или мощностью тепловыделения) и численностью (биомассой) микроорганизмов.

При выполнении измерений необходимо вначале записать показание базовой линии прибора для изучаемых образцов. Для этого в рабочий и контрольный канал калориметра устанавливаются проточные кюветы и в них заправляется по 1 см3 контрольной пробы с подавленным метаболизмом микроорганизмов. На втором этапе измерений из рабочего канала микрокалориметра помещается контрольная проба и в кювету заправляется рабочая проба объемом 1 см3 с активной микрофлорой. На табло высвечивается измеренные значения мощности теплового потока и количество выделенного тепла для анализируемой микрофлоры.

Микрокалориметрия позволяет быстро охарактеризовать ростовую и биохимическую активность клеток, а также проанализировать влияние различных факторов внешней среды на метаболизм микрофлоры, чего не может сделать классический микробиологический анализ.

Микрокалориметрия находит практическое применение в медицине, биологии, биотехнологии, экологии [22].

Действие биоцидов обусловлено наличием в составе химических элементов или соединений, угнетающих жизнедеятельность микроорганизмов или отравляющих их. Следовательно, чем меньше количество микроорганизмов определено микрокалориметрическим методом, тем лучше защитное действие биоцидного вещества. Количественное определение микроорганизмов методом микрокалориметрии основано на экспериментально установленной зависимости между количеством выделенного тепла (или мощностью тепловыделения) и численностью (биомассой) микроорганизмов.

2.4 Результаты исследований и их обсуждение

2.4.1 Оценки биостойкости материалов по ГОСТ 9.048

Существующие и используемые в настоящее время стандартные методы испытания изделий и покрытий на устойчивость к воздействию плесневых грибов основаны на обработке изделия суспензией спор грибов с последующим выдерживанием в оптимальных для развития гриба условиях. При этом оценку степени грибостойкости материала проводят визуально по интенсивности развития грибов.

При проведении испытаний целесообразно учитывать только качественные показатели: наличие проросших спор, развитие мицелия. Для осуществления метода требуется обязательное использование световой микроскопии, которая, как известно, не может применяться для исследования непрозрачных, крупных объектов, например металлических пластин  большой площади. 

Испытания на стойкость к плесневым грибам описаны в [23]. В стерильные чашки Петри наливают питательную среду, после застывания на поверхность помещают испытуемый образец и обрабатывают (инокулируют) суспензией спор набора текст-культур (или одной культурой), выдерживают в термостате 29+1 °С в течение 14 суток. В данном случае были использованы тест-культуры Aspergillus niger. Результаты испытаний практически определяются на шестые сутки. Образцы осматривают визуально и оценивают грибостойкость в баллах по интенсивности развития. Для этого используют таблицу 3.

Таблица 3 – Шкала грибостойкости по интенсивности развития

Балл

Характеристика балла

0

Под микроскопом прорастания спор и конидий не обнаружено

1

Под микроскопом видны проросшие споры и незначительно развитый мицелий

2

Под микроскопом виден развитый мицелий, возможно спороношение

3

Невооруженным глазом мицелий и (или) спороношение едва видны, но отчетливо видны под микроскопом

4

Невооруженным глазом отчетливо видно развитие грибов, покрывающих менее 25 % испытуемой поверхности

5

Невооруженным глазом отчетливо видно развитие грибов, покрывающих менее 25 % испытуемой поверхности

Образец, исследуемый для оценки грибостойкости, по степени обрастания заслуживает оценку – 4 балла, так как невооруженным глазом отчетливо видно развитие грибов, покрывающих менее 25 % испытуемой поверхности.

2.4.2 Анализ биостойкости материалов по методу «агаровой сетки»  и агаровых блоков

В качестве объекта исследования при проведении метода «агаровых сеток» был выбран пленкообразователь, который смешивался с расчетным количеством биоцида. Критерием фунгитоксичности служила лаг-фаза тест-культуры Aspergillus niger, т. е. время от посева до начала активного роста гриба. За ростом микроорганизмов наблюдали под микроскопом при увеличении 60°.

Проведенные исследования позволили обнаружить, что используемый пленкообразователь проявил способность тормозить на некоторое время прорастание грибных спор. Лаг-фаза составила 5 суток.

Результаты испытания представлены на рисунке 7.

Рисунок 7 – Длительность, сут, лаг-фазы (L) гриба на агаровой сетке, нанесенной на пленкообразующее вещество с различным содержанием биоцида

Из данных рисунка 7 видно, что рост гриба на поверхности пленки полностью ингибировался при добавлении 0,2 % биоцида.

При изучении биостойкости эмали на основе исследуeмого пленкообразователя биоцид вводили в эмаль в тех же количествах. Результаты испытаний показали, что в  пигментном лакокрасочном материале на основе испытуемого пленкообразователя фунгитоксичность снижается (на пленкообразователе лаг-фаза составила 5 сут, а на эмали – 1).

Проведенные исследования показали, что пигменты и наполнители могут оказывать как положительный, так и отрицательный эффект на биозащитные свойства покрытия. Так, эмаль по сравнению с используемым пленкообразователем  менее фунгитоксична. Кроме того необходимо отметить, что при создании биоцидных композиций необходимо учитывать не только активность биоцидных добавок, но и биозащитные свойства самого лакокрасочного материала.

Для испытаний на биостойкость методом «агаровых блоков» были выбраны металлические квадратные пластины площадью 16 см2, на поверхности которых нанесены покрытия на основе эпоксидных композиций.

В результате исследования особенности развития Aspergillus niger в составе агаровых блоков на эпоксидных покрытиях были получены следующие результаты:

Ширина зоны обрастания блока мицелием: а=0 мм

Особенности развития гриба: мицелий погиб за 24 часа.

На основании полученных результатов можно предположить, что причиной данного явления могло служить проникновение биоцидного вещества в толщу агарового блока, в результате чего происходило быстрое отмирание мицелия. Это наблюдение может служить дополнительной характеристикой свойств покрытия, содержащего биоцид, и может свидетельствовать о способности биоцидного вещества относительно легко выщелачиваться из состава покрытия. Данное качество, по-видимому, является скорее отрицательным для покрытий, призванных защищать материалы длительное время, поскольку их срок службы должен быть ограничен запасами биоцида в них.

2.4.3 Характеристика биостойкости материалов микрокалориметрическим методом

Оценку биостойкости материалов и изделий можно проводить инструментальным методом с использованием микрокалориметра МКМ-Ц.

В качестве объектов исследования были выбраны пищевые продукты: пряники, конфеты, шоколад.

В процессе жизнедеятельности микроорганизм в пищевых продуктах потребляют питательные вещества и выделяют определенное количество тепла. Количество выделенного тепла пропорционально содержанию клеток и их активности.

Согласно основному динамическому уравнению микрокалориметров типа Тиана-Кальве, связь между истинным и регистрируемым тепловыми патоками описывается формулой 6:

                                       F(t)=q·(t-τ)+K· ƒ q·(t- τdt,                                              (5)

где     К – постоянная величина, характеризующая скорость теплообмена между ячейкой и термоблоком,

q- зарегистрированное значение теплового потока;

f - истинное значение;

τ - время запаздывания.

Скорость выделения тепла при жизнедеятельности микроорганизмов обычно ниже, чем скорость распространения тепловой энергии к теплометру.

Поэтому для микробных клеток реализуется условие, описанное формулой 7:

                                                    q·(t-τ)=f,(t)/K,                                                      (6)

Между удельным тепловым потоком и концентрацией клеток N0 микроорганизмов наблюдается зависимость, выраженная через формулу 8:

                                          f(t)=F·N0·exp(m·t)+B·N0,                                             (7)

где     F - среднее значение удельной тепловой активности делящихся клеток;

B - среднее значение удельной тепловой активности не делящихся клеток;

m - удельная константа скорости размножения клеток.

Результаты микробиологического анализа кондитерских изделий представлены в таблице 4.

Таблица 4 − Результаты микробиологического анализа кондитерских изделий

Вид продукта

t, ч

q, мкВт/см3

Шоколад

Конфеты

Пряники

0

2

4

0

2

4

0

2

4

-2382

-2636

-3823

-4975

-3653

-3485

-1944

-2458

-3770

По данным таблицы 4  построим графики зависимостей N от t и lnN от t для каждого вида продукции.

Рисунок 8 – Зависимость зарегистрированного значения теплового потока от времени

Рисунок 9 –Зависимость логарифма зарегистрированного значения теплового потока от времени

Таким образом, по термограммам можно быстро определить как численность микроорганизмов, так и один из основных кинетических параметров их жизнедеятельности – удельную скорость размножения. При этом значительно сокращается длительность анализа, а также расход реактивов и вспомогательных материалов по сравнению с другими методами.

Данный метод позволяет произвести подсчет и изучить активность микроорганизмов, что открывает возможность его использования с целью оценки биостойкости материалов и изделий.

Заключение

В ходе выполнения курсовой работы было осуществлено ознакомление с понятием «биоповреждение», его видами и механизмами возникновения, подробное изучение методов анализа бактериостойкости материалов и изделий, а также способов их защиты от биоповреждений.

Актуальность выполнения курсовой работы объясняется  разрушающим действием микроорганизмов-деструкторов на сырье, материалы, изделия и конструкции, необходимостью борьбы с ними с целью предотвращения потерь, связанных с биоповреждениями.

Для выполнения курсовой работы потребовалось следующее:

1сбор литературных сведений в соответствии с темой курсовой работы с последующим осмыслением и систематизацией;

2 проведение экспериментальных исследований с целью оценки биостойкости материалов различными методами и определения защитного действия биоцидных веществ на материалы и изделия;

3 проведение оценки результатов исследований и составление их характеристики.

Выполнение курсовой работы позволило закрепить и расширить знания, полученные при изучении курса микробиологии, приобрести практические навыки и опыт работы в микробиологической лаборатории.

Используемая литература

1 Единая система защиты от коррозии и старения. Воздействие биологических факторов на технические объекты. Термины и определения: ГОСТ 9.102–91. – Введ. 01.07.1991. – М.: Государственный комитет СССР по управлению качеством продукции и стандартам, 1991. – 6 с.

2   Биоповреждения: Учеб. пособие для биол. спец. вузов/В.Д. Ильичев [и др.]; под общ. ред. В.Д. Ильичева. – М.: Высш. шк., 1987. – 352 с.

3 Актуальные вопросы биоповреждений. – М.: Наука, 1983. – 265 с.

4 Заиков Г. Е. Горение, деструкция и стабилизация полимеров/ Г. Е. Заиков, С. А. Семенов, К. З. Гумаргалиева. – М. изд-во «НОТ». – 422 с.

5 Биоповреждения полимерных материалов [Электронный ресурс]. – 2006. – Режим доступа: http://plastinfo.ru/information/articles/276/.– Дата доступа: 03.03.2011.

6 Гусев, М.В., Минеева, Л.А. Микробиология/ М. В. Гусев. – М.:Изд-во МГУ, 1992. – 448 с.

7 Имшенецкий, А. А. Большая советская энциклопедия/ А. А. Имнешецкий. – М.: Советская энциклопедия, 1974. – 667 с.

8 Руководство к практическим занятиям по микробиологии/ М. Н. Пименова [и др.]; под общ. ред. М. Н. Пименовой. – 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во МГУ, 1995. – 224 с.

9 Вышемирский Ф. А., Пояркова, Г. С. Совершенствование производства и улучшение качества масла/ под общ. ред.  Ф. А. Вышемирского. – М. : Пищивая  промышленность, 1978. – 103 с.    

10 Гликолитические бактерии [Электронный ресурс]. – 2010. – Режим доступа: http://meduniver.com/Medical/Microbiology. – Дата доступа: 15.04.2011.

11 Метод анализа численности и активности микроорганизмов на поверхности материалов / А. В. Игнатенко // Труды БГТУ. Серия IV. Химия, технология органических веществ и биотехнология. – 2009.– № 7. – С.  158–161.

12 Клив де В. Блэкбери. Микробиологическая порча пищевых продуктов. – С-П.: Изд-во «Профессия», 2008. – 781 с.

13 Сопоставительный анализ метаболической активности участвующих в биобрастании аэробных и анаэробных бактерий под действием биоцидов / С. В, Шевеленко, А. А, Кучко, Н. А. Белясова // Труды БГТУ. Серия IV. Химия, технология органических веществ и биотехнология. – 2010. – № 8. – С.  290–293.

14 Биоповреждения, методы защиты. Сборник докладов – Полтава: Научный совет по биоповреждениям АН ССР, 1985 – 182 с.

15 Совершенствование методов оценки антимикробных свойств материалов и изделий / Л. И. Антоновская, А. С. Жих, И. С. Петреня, Н. А. Белясова// Труды БГТУ. Серия IV. Химия, технология органических веществ и биотехнология. – 2007. – № 5. – С.  212–214.

16 Антимикробные добавки к полимерным материалам [Электронный ресурс]. – 2008. – Режим доступа: http://www.polymerbranch.com/publ/view/61.html. – Дата доступа: 02.04.2011.

17 Единая система защиты от коррозии и старения. Ткани. Метод лабораторных испытаний на устойчивость к микробиологическому разрушению: ГОСТ 9.080-75. . – Введ. 01.01.1977. – М: Стандартинформ, 1979. – 12 с.

18 Гончарова, И. А., Мицкевич, А. Г., Робвель, Н. М. Экспресс оценка эффективности защиты материалов от плесневых грибов / И. А. Гончарова / Материалы третьего всероссийского конгресса Национальной Академии Микологии, Минск, 7 июня 2005 г.: / изд-во Москва Национальная Академия Микологии 2005, – с. 61–63.

19 Белясова, Н. А. Микробиология. Лабораторный практикум: учеб. Пособие для студентов специальностей «Биотехнология», «Биоэкология», «Биология». – Минск: БГТУ, 2007. – 160 с.

20 Методы анализа адаптационных свойств микроорганизмов / А. В, Игнатенко // Труды БГТУ. Серия IV. Химия, технология органических веществ и биотехнология. – 2008. – № 6. – С.  184–186.

21. Анализ влияния биоцидных веществ на поверхностную микрофлору/ А. В. Игнатенко // Труды БГТУ. Серия IV. Химия, технология органических веществ и биотехнология. – 2009.– № 7. – С.  162–165.

22 Игнатенко, А. В, Гриц, Н. В. Микробиологические, органолептические и визуальные методы контроля качества пищевых товаров. Лабораторный практикум.– Минск: БГТУ, 2003. – 114 с.

23 Изделия технические. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов: ГОСТ 9.048-89. – Взамен ГОСТ 9.0480-75; введ. 01.07.91. – Государственный комитет СССР по стандартам, 1989. – 22 с.

PAGE   \* MERGEFORMAT 2


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

67036. Проект «Герб і прапор класу» 236.5 KB
  Мета: Сприяти формуванню особистісних якостей, виховувати особистість, якій притаманні демократична громадянська культура, готовність до компетентної участі у житті суспільства. Розвивати національну свідомість. Вивчення геральдики країни, області, міста, гімназії Виховувати патріотизм, повагу до української державної символіки.
67037. День Рождения. Покупки. Mein Geburtstag. Einkaufen 56 KB
  Цель урока: Развитие навыков говорения по теме. Формирование навыков культуры поведения, соблюдение правил этикета во время праздника. Оборудование: учебник, рабочая тетрадь, схема супермаркета, картинки с рисунками товаров, поздравительные открытки, приглашение на день рождения.
67038. Johann Wolfgang von Goethe – das Gesicht der deutschen Literatur 3.79 MB
  Літературознавчий матеріал розрахований для використання на уроках в старших класах, для проведення позакласних заходів під час шкільних предметних тижнів іноземної мови, для роботи гуртків та факультативів з німецької мови. За допомогою тематичної лексики, тематичних текстів...
67039. План-конспект уроку здоров’я та фізичної культури у початковій школі 81 KB
  Мета уроку: Сприяти зміцненню здоров’я учнів; виховувати свідоме ставлення до занять фізичною культурою та ведення здорового способу життя; формування навичок самостійних занять фізичними вправами; профілактика захворювань: сколіоз плоскостопість; формування ключових компетентностей.
67040. Кольорові сни 11.09 MB
  Ознайомити учнів з основами кольорознавства; формувати в учнів відчуття і розуміння художніх засобів виразності колориту палітри колірної гами; засвоїти мистецьку термінологію; визначити значення кольорів в народно-прикладному мистецтві; дослідити вплив кольорів на настрій людини; кольоромузика...
67041. Обобщение знаний по теме «Глагол» (урок-аукцион) 52.5 KB
  В городе в данное время очень много больных скарлатиной. Время глагола Письмо от друга-иностранца. Однажды на уроке после объяснения новой темы Время глагола учитель вызвал ученика и спросил: Если я говорю я умываюсь ты умываешься он умывается мы умываемся вы умываетесь они умываются то какое это время...
67042. О самом главном 89 KB
  Цель. Повысить готовность учащихся к самозащите в случае бедствий или аварий, научить организовывать жизнеобеспечение в чрезвычайных ситуациях. Развивать чувство ответственности, творческого самостоятельного обучения. Воспитывать чувство милосердия, интерес к полученной информации.
67043. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПОВЫШЕНИЯ КВАЛИФИКАЦИИ КАДРОВ В ОРГАНИЗАЦИИ 1.11 MB
  Изучить теоретические основы системы повышения квалификации; провести анализ исследуемого предприятия и действующей системы обучения персонала; выявить основные проблемы, связанные с эффективным повышением квалификации сотрудников; разработать методические рекомендации по совершенствованию системы повышения квалификации персонала...
67044. Вмій дружбою дорожити 132 KB
  Тип заходу: метод проектів створення колективної творчої роботи сюжетного малюнка на дошці по сценарію заходухлопчик з дівчинкою друзі під сонцем з написом ДРУЖБА промені якого містять Золоті правила спілкування хмаринки уточнення поняття дружби в небі птахи на крилах яких поради...