5691

Генетика вирусов. Структурная организация генома клетки

Контрольная

Биология и генетика

Величайшие достижения середины XX века - открытие дискретных единиц наследственности (генов), разработка хромосомной теории наследственности, развитие биохимической генетики микроорганизмов и установление принципа один ген...

Русский

2012-12-18

138.5 KB

85 чел.

Генетика вирусов

Величайшие достижения середины XX века — открытие дискретных единиц наследственности (генов), разработка   хромосомной   теории   наследственности,' развитие биохимической генетики микроорганизмов и установление принципа «один ген — один белок», открытие регуляции активности генов прокариотов Ф. Жакобом и Ж. Моно, открытие двойной спирали ДНК Дж. Уотсоном и Ф. Криком и др. создали основу для превращения генетики классической в генетику молекулярную, где законы наследственности и изменчивости изучаются на молекулярном и субмолекулярном  уровнях.

За последние несколько лет наблюдался взрывообразный рост числа опубликованных сообщений по различным аспектам генетики эукариотических систем вообще, и системы клетка — вирус животных в частности.

Вирусы являются одним из излюбленных объектов молекулярной генетики благодаря простому строению и малой молекулярной массе их геномов, которая в 106 раз меньше массы генома эукариотической клетки. Организация генетического аппарата у ряда вирусов, например у sv40, настолько сходна с таковой генов эукариотической клетки, что пблучила название минихромосомы. Минихромосома широко используется для изучения организации и репликации ДНК.

Структурная организация генома клетки

В составе генома имеются структурные гены, кодирующие определенные* биополимеры (белки или РНК), и регуляторные гены, которые контролируют функцию структурных генов. Регуляция происходит с помощью белковых продуктов регуляторных генов — репрессоров, подавляющих активность структурных генов. Регуляторными участками генов, контролирующих транскрипцию, являются усилитель транскрипции (enhancer) и промотор — область, предшествующая структурным генам и определяющая место специфического связывания РНК-полимеразы.

Характерной особенностью генов эукариотической клетки является их мозаичная структура, т. е. прерывистость гена. В составе гена, кодирующего один белок, кодирующие участки прерываются вставочными последовательностями, которые не несут никакой кодирующей информации и не транслируются. Кодирующие участки гена называются экзонами, а вставки — нитронами (рис. 25).

При транскрипции считывается весь ген, включая экзоны и интроны. Впоследствии происходит созревание (процессинг) иРНК: из образовавшегося длинного первичного транскрипта удаляются участки, соответствующие интронам, а участки, соответствующие экзонам, «сшиваются». В результате подобной модификации из первичного транскрипта образуется зрелая иРНК. Этот процесс вырезания интронов и сшивания экзонов называется сплайсингом (от английского слова splice — соединять, сращивать концы каната). Сплайсинг был впервые описан на модели ДНК-со-держащих вирусов животных — 8У40 и аденовирусов.

Строение эукариотического гена и его транскрипция.

а строение  эукариотического  гена 8У40:  1—усилитель  транскрипции;  2—

промотор; 3— инициация репликации ДНК вируса (origin); 4— интроны; 5— экзоны (кодирующие области гена); 6— терминирующая последовательность ААТААА; стрелка обозначает участок начала транскрипции, б — схема сплайсинга при созревании иРНК: 1—экзоны, 2—интроны, 3—зрелая иРНК.

Основной особенностью вирусного генома является то, что наследственная информация у вирусов может быть записана как на ДНК, так и на РНК. Геном ДНК-содержащих вирусов двухнитевой (исключение составляют парвовирусы, имеющие однонитевую ДНК), несегментированный и проявляет инфекционные свойства. У вирусов, принадлежащих к родам Poxvirus и Hepadnavirus геном представлен двумя цепочками ДНК разной длины. Геном большинства РНК-содержащих вирусов однонитевой (исключение составляют реовирусы и ретровирусы, обладающие двунитевыми геномами) и может быть сегментированным (представители родов Retrovirus , Orthomyxovirus , Arenavirus и Reovirus ) или несегментированным.

Вирусные РНК в зависимости от выполняемых функций подразделяются на две группы. К первой группе относятся РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомы чувствительной клетки, т.е выполнять функции иРНК и мРНК. Их называют плюс-нити РНК и обозначают как +РНК (позитивный геном). Они имеют характерные окончания (`шапочки') для специфического распознавания рибосом.

У другой группы вирусов РНК не способна транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомы и функционировать как иРНК. Такие РНК служат матрицей для образования иРНК, т.е. при репликации первоначально синтезируется матрица (+РНК) для синтеза -РНК. Такой тип РНК определяют как минус-нить и обозначают -РНК (негативный геном). У вирусов этой группы репликация РНК отличается от транскрипции по длине образующихся молекул: при репликации длина РНК соответствует материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК. Молекулы +РНК проявляют инфекционность, а -РНК не проявляют инфекционные свойства и для воспроизведения должны транскрибироваться в +РНК.

Исключение составляют ретровирусы, которые содержат однонитевую +РНК, служащую матрицей для вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При помощи этого фермента информация переписывается с РНК на ДНК, в результате чего образуется ДНК-провирус, интегрирующийся в клеточный геном.

СПОСОБЫ УВЕЛИЧЕНИЯ

ИНФОРМАЦИОННОЙ ЕМКОСТИ ВИРУСНОГО ГЕНОМА

В отличие от полицистронных иРНК прокариотов, иРНК эукариотов являются моноцистронными, т. е. реализуется принцип «один ген — одна молекула иРНК — один белок». Однако у некоторых клеточных иРНК и часто у вирусных иРНК этот принцип нарушается, и иРНК может направлять синтез двух белков.

У многих вирусов молекулярная масса синтезирующихся белков превышает теоретически рассчитанную. Этот феномен объясняется наличием у вирусов механизмов, позволяющих получить развернутую генетическую информацию при максимальной экономии генетического материала; подобные механизмы выработаны в процессе эволюции вирусов как генетических паразитов.

Способами увеличения генетической информации являются: 1) двукратное считывание одной и той же иРНК, но с другого инициирующего кодона; 2) сдвиг рамки трансляции; 3) сплайсинг; 4) транскрипция с перекрывающихся областей ДНК и др.

1) В составе иРНК обычно встречается несколько инициирующих кодонов. В соответствии с принятой в настоящее время гипотезой «сканирующей модели» Малая рибосомальная субъединица связывается с иРНК около 5'-конца и скользит вниз до встречи с инициирующим кодоном. Однако инициация в большинстве случаев происходит не с первого инициирующего кодона, а с последующих АУГ-кодонов. «Правильный» функционирующий АУГ-кодон узнается рибосомой благодаря окружающим его последовательностям («фланкирующим нуклеотидам»). В том случае, если первый инициирующий кодон находится в менее благоприятном окружении, чем последующие АУГ-кодоны, большинство малых рибосо-мальных, субъединиц пройдут этот кодон и начнут инициацию трансляции с последующих АУГ-кодонов, однако некоторые субъединицы начнут инициацию с первого АУГ-кодона. В этом случае одна иРНК может направить синтез двух белков разной длины. Такие иРНК имеются у многих вирусов: SV40, герпеса, аденовирусов, буньявирусов, реовирусов и др.

2) Трансляция может происходить без сдвига рамки и со сдвигом рамки. Генетический код является триплетным, это означает, что три нуклеотида, составляющих триплет, или кодон, кодируют одну аминокислоту. В том-случае, если триплеты сохранены и генетический код не изменился, то при трансляции с двух разных инициирующих кодонов будут синтезироваться полипептиды, представляющие собой укороченную копию первого полипептида (трансляция без сдвига рамки).

В том случае, если произошел сдвиг на один или два нуклеотида, образуются новые триплеты (кодоны) и появляется новый генетический код. В этом случае одна молекула иРНК может транслироваться с образованием двух уникальных белков, т. е. таких белков, у которых нет идентичных аминокислотных последовательностей.

3) Сплайсинг со сдвигом рамки широко используется у ряда вирусов (вирусы гриппа, парамиксовирусы, буньяви-русы, аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы и др.). Один и тот же ген парамиксовирусов (вирус Сендай) кодирует два уникальных белка: структурный белок Р и неструктурный белок С.

Одним из способов экономии генетического материала является нарезание полипептида-предшественника на участки разной длины, в результате чего образуются разные полипептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Таким образом, число реальных генов превосходит молекулярную массу генома. Основанный на длине генома расчет числа генов неизменно приведет к ошибочным результатам. Более точные представления о числе генов можно получить путем биохимического и генетического анализов.

В результате перекрывания генов и сдвига рамки трансляции «размываются» границы генов, и понятие «ген» в известном смысле утрачивает первоначальное значение как дискретный фрагмент генома и приобретает скорее функциональное значение.

Конечная цель генетического изучения вирусов животных — понимание деталей структуры и функции вирусного генома и каждого из генных продуктов вируса.  

Методы исследования генетики вирусов.

На раннем этапе генетические исследования вирусов животных сдерживались из-за отсутствия подходящих методов исследования индивидуального потомства при смешанном заражении. Решение этой проблемы было найдено Дульбекко [32, 33], который разработал метод бляшек для цитоцидных вирусов. Использование метода бляшек позволило точно определять количество потомства, получать чистые клональные штаммы вируса и очищать вирусы от других примесных вирусов и дефектных интерферирующих частиц того же типа вируса. С помощью этого метода была получена система, пригодная для анализа условно-летальных мутаций. Таким образом, в значительной степени генетика вирусов животных началась с введения в практику метода бляшек. В настоящее время применимость метода бляшек рассматривают как необходимое условие для начала исследований генетики новой группы вирусов подобно тому, как разработка метода фокусов трансформации для нецитолитических, трансформирующих вирусов [151] послужила ключом к развитию генетических исследований этих вирусов.

При изучении регуляции синтеза вирусных нуклеиновых кислот и белков во многих системах, например у герпесвирусов, с успехом использовали ингибиторы белкового синтеза, такие как пуромицин или циклогексимид, а также ингибиторы синтеза РНК, например актиномицин Е) Разработка электрофоретических систем с высоким разрешением для анализа белков и нуклеиновых кислот позволила провести генетические исследования вирусов с сегментированным РНК-геномом, используя в качестве маркеров полиморфизм электрофоретической подвижности РНК-сегментов и белков Применение рестрикционных эндонуклеаз сыграло аналогичную роль для ДНК-содержащих вирусов с использованием в качестве генетических маркеров полиморфизма подвижности фрагментов ДНК и белков.

Методы исследования транскрипции и трансляции in vitro вирусов доказали свою эффективность при построении физических карт, особенно в системах, где отсутствует генетическая рекомбинация. В последнее время генетические приемы используют для изучения вирусного патогенеза и иммунного ответа хозяина на вирусную инфекцию, если хотят сопоставить специфические свойства вируса с индивидуальными вирусными генами и генными продуктами. Иными словами, современный генетик, изучающий вирусы животных, охотно заимствует методы у биохимика и применяет их в генетическом анализе. Наряду с этим генетики и другие специалисты используют генетический анализ для ответа на вопросы, которым традиционно не уделялось должного внимания. Такое слияние дисциплин очень помогло генетикам и в значительной мере определило быстрый прогресс этой науки в последние несколько лет.

Мутации.

Вирусам, как и всем живым организмам, свойственны наследственность и изменчивость. На раннем этапе исследования генетики вирусов животных в основном заключались в сборе и последующей генетической и физиологической характеризации вирусных мутантов. В последнее время вирусные мутанты стали использовать в качестве специфических инструментов для исследования генетических и биохимических событий, происходящих в зараженной клетке. Работы такого рода с вирусами животных в целом запаздывали по сравнению с аналогичными работами на прокариотических системах.

Спонтанная мутация

Некоторые вирусы дают значительную долю мутантов при пассировании в отсутствие каких-либо известных мутагенов. Эти спонтанные мутации накапливаются в геномах вирусов и приводят к изменчивости фенотипа, которая является объектом селективного давления в ходе эволюции вируса.

Скорость спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах значительно ниже (10 -8 - 10 -11 на каждый включенный нуклеотид), чем у РНК-геномных (10 -3 - 10 -4 на каждый включенный нуклеотид). Более высокая частота спонтанных мутаций связана с низкой точностью репликации РНК-геномов, которая вероятно связана с отсутствием у РНК-репликаз корректирующей активности, свойственной ферментам, реплицирующим ДНК. Наиболее часто спонтанные мутации наблюдаются у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции, не способных к самокоррекции.

Таким образом, в то время как геномы ДНК-содержащих вирусов относительно стабильны, этого нельзя сказать об РНК-содержащих вирусах, К сожалению для генетиков, ряд факторов стимулирует неравновесие в популяции геномов, и эти факторы часто способствуют накоплению мутантов в популяции. Из-за спонтанного мутагенеза трудно поддерживать гомогенность популяции вируса. Для того чтобы обойти эту трудность, вирусы периодически реклонируют, однако мутанты часто возникают и в ходе образования бляшки, и в ходе роста вируса, поэтому бывает трудно получить генетически однородные препараты вируса с высоким титром.

Индуцированные мутации

Индуцированные мутации у вирусов получают при действии различных химических и физических мутагенов, которые подразделяют на действующие in vivo и in vitro .

Большая часть мутантов, выделенных в ходе исследования вирусов животных, получена из популяций дикого типа, обработанных мутагенами. Мутагены обычно применяют для того, чтобы увеличить частоту мутаций в популяции, после чего мутанты подвергают скринингу с помощью подходящего селективного давления. Основной проблемой, связанной с использованием мутагенов, является подбор подходящей дозы. Как правило, желательно получить мутанты, которые отличаются от дикого типа только одной мутацией. Для этого отбор ведут при наиболее низкой дозе мутагена, дающей достаточную частоту мутаций с желаемым фенотипом.

В системах с вирусами животных было использовано множество различных мутагенов, но все они входят в небольшое число классов, определяемых по механизму мутагенеза.

Мутагены одного класса, обычно называемые мутагенами in vitro, действуют путем химической модификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в вирусной частице. Азотистая кислота дезаминирует основания, в первую очередь аденин, с образованием гипоксантина, который при последующей репликации спаривается с цитозином. В результате действия азотистой кислоты на аденин происходит транзиция от АТ-пары к GС-паре. Азотистая кислота дезаминирует также цитозин, приводя к транзиции CG—>-ТА. Другим мутагеном in vitro является гидроксиламин; он реагирует специфически только с цитозином и вызывает транзицию СG—>-ТА. Большой класс мутагенов in vitro представлен алкилирующими агентами, которые действуют на многие позиции в основаниях. Алкилирующие агенты — нитрозогуанидин, этанметансульфонат и ме-тилметансульфонат —являются мощными мутагенами.

Во второй класс входят мутагены in vivo, которые требуют для своего действия метаболически активной нуклеиновой кислоты.

Одна группа мутагенов in vivo содержит аналоги оснований, которые включаются в нуклеиновую кислоту в ходе синтеза по правилам нормального спаривания. Включившись, эти аналоги способны претерпевать таутомерные переходы, которые приводят их к спариванию с различными основаниями, вызывая таким образом транзиции и трансверсии. Часто используют аналоги: 2-аминопу-рин, 5-бромдезоксиуридин и 5-азацитидин.

В другую группу мутагенов in vivo включены интеркалирующие агенты, которые внедряются в стопку оснований, что при последующей репликации нуклеиновой кислоты приводит к вставкам или делециям.

Примерами интеркалирующих агентов являются акридиновые красители, такие как профлавин.

Ультрафиолет также иногда используют в качестве мутагена. Основным продуктом действия ультрафиолета являются димеры пиримидинов. В ДНК пиримидиновые димеры вырезаются. Для РНК механизм ультрафиолетового мутагенеза неизвестен.

Большинству мутаций присуще свойство возврата (реверсии) к дикому типу. Каждая мутация имеет характерную частоту реверсий, которую можно точно измерить.

Классификация вирусных мутаций.

Вирусные мутации классифицируют по изменениям фенотипа и генотипа. По фенотипическим проявлениям мутации вирусов разделяют на четыре группы:

  •  Мутации, не имеющие фенотипического проявления.
  •  Летальные мутации, т.е. полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков и приводящие к утрате способности к репродукции.    Мутация является летальной, если вследствие ее нарушается, например, синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.
  •  Условно летальные мутации, т.е. мутации с потерей способности синтезировать определенный белок или с нарушением его функции только в определенных условиях. В некоторых случаях мутации являются условно летальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (temperature sensitive) – ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39—42° С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36—37° С).
  •  Мутации, имеющие фенотипическое проявление, например изменение размеров бляшек под агаровым покрытием или термостабильности, по изменению спектра хозяев, устойчивости к ингибиторам и химиопрепаратам.

Генетические взаимодействия между вирусами

Основным методом исследования генетических взаимодействий между вирусами служит смешанное заражение клеток куль туры тканей.

Заражение вирусами чувствительных клеток носит множественный характер, т.е. в клетку проникает сразу несколько вирионов. При этом вирусные геномы в процессе репликации могут кооперироваться или интерферировать. Кооперативные взаимодействия между вирусами представлены генетическими рекомбинациями, генетической реактивацией, комплементацией и фенотипическим смешиванием.

Тесты иа комплементацию и рекомбинацию являются двумя наиболее полезными приемами, доступными генетикам.

Эти исследования позволили, во-первых, осуществить функциональное группирование мутантов,  во-вторых, обозначить мутации на линейных картах или поместить их в группы рекомбинации (рекомбинация).

Генетическая рекомбинация

Рекомбинация — это физическое взаимодействие между вирусными геномами в смешанно-зараженной клетке приводящее к обмену генетическим материалом между родительскими вирусами.  Возможен как обмен полными генами (межгенная рекомбинация), так и участками одного и того же гена (внутригенная рекомбинация). У вирусов животных это взаимодействие может происходить двумя различными способами в зависимости от физической организации вирусного генома. У вирусов, имеющих одну геномную молекулу, включая все ДНК-содержащие вирусы и часть РНК-содержащих вирусов, рекомбинация включает разрыв и воссоединение ковалентной связи в нуклеиновой кислоте с образованием дочерних геномов неродительского типа (внутримолекулярная рекомбинация).

Образующийся вирус-рекомбинант обладает свойствами, унаследованными от разных родителей.

Обычно рекомбинируемые штаммы обладают характерными признаками, которые обозначаются как маркеры. Например, были получены рекомбинанты между вирусами полиомиелита, обладающие повышенной устойчивостью и повышенной чувствительностью к гуанидину, разной ней-ровирулентностью, разной устойчивостью к повышенной температуре, разной чувствительностью к ингибиторам сывороток лошадей и коров и т. п. Для получения рекомбинантов используют штаммы, содержащие два или большее число маркеров.

Тест рекомбинации применяют для генетических исследований вирусов. С его помощью возможно построение генетических карт вирусов, в которых определяется, в каких участках генома произошли мутации, а также в условных единицах измеряется расстояние между разными мутациями.

Пересортировка генов наблюдается при генетических взаимодействиях между вирусами, имеющими сегментированный геном.. У вирусов с сегментированным геномом, включая вирусы гриппа, в ходе рекомбинационного процесса ковалентные связи не разрываются. Вместо этого сегменты генома перемешиваются случайным образом при помощи механизма, называемого перетасовыванием, или реассортацией. Образующиеся при этом гибридные формы вирусов называют реассортантами. Реассортанты вирусов гриппа получают при совместном культивировании вирусов с разными генами гемагглютинина и нейраминидазы. В этом случае из общего потомства путем нейтрализации соответствующих антигенов можно выделить интересующие исследователя варианты.

Существуют определенные группировки (констелляции или созвездия) генов, которые в данной системе клеток более стойки и делают вирус более жизнеспособным.

Сходные процессы пересортировки генов имеют место у вирусов гриппа типов А, В и С и у других вирусов с фрагментарным геном — у буньявирусов, аренавирусов (однонитчатые РНК) и реовирусов (ротавирусов) (двунит-чатая РНК). Однако эти процессы не столь интенсивны и доступны изучению, как у вирусов гриппа.

Генетическая реактивация

Генетическая реактивация представляет собой частный случай рекомбинации или обмена сегментами, когда один или оба партнера неинфекционны, однако при смешанном заражении дают потомство, которое несет признаки обоих родителей. Генетическая реактивация наблюдается между геномами родственных вирусов с мутациями в разных генах. При перераспределении генетического материала формируется полноценный геном.

Это инфекционное потомство представляет собой рекомбинанты, в которых инактивирующие повреждения неинфекционного родителя элиминированы. Реактивацию между инфекционным и неинфекционным родителями называют кросс-реактивацией, или спасением маркера. Кросс-реактивация у вирусов животных была использована в различных ситуациях. Например, у вируса гриппа скрещивание между небляшкообразующим, но инфекционным вирусом с бляшкообразующим, но ивактивированным облучением вирусом облегчало получение бляшкообразующих рекомбинантов, содержащих маркеры от небляшкообразующего родителя [139]. Кросс-реактивация показана также для ДНК-содержащих вирусов, ре-комбинирующих по механизму разрыв — воссоединение

В условиях, когда оба партнера неинфекционны, реактивацию называют «множественной». Множественная реактивация может осуществляться только в том случае, если инактивирующие повреждения локализованы в различных участках генома, так что обмен сегментами или рекомбинация могут дать жизнеспособное потомство.

Множественная реактивация обнаружена в ряде вирусных систем Обычно она происходит между вирусами, инактивированными УФ-светом. Множественная реактивация наблюдалась как между различными штаммами одного и того же вируса, так и между вирусами различных серотипов [90], а также между неродственными вирусами, например аденовирусом типа 12 и SV40.

Комплементация.

Комплементацией называют взаимодействие генных продуктов вируса в смешанно-инфицированных клетках, которое приводит к увеличению выхода одного или обоих вирусов, в то время как их генотип остается неизменным. Это определение отражает тот факт, что один или оба вируса (мутанта) предоставляют белковый продукт, по которому другой партнер дефектен, что позволяет одному или обоим мутантам расти в смешанно-инфицированных клетках. Принцип комплементации заключается в том, что вирус снабжает партнера недостающими компонентами, обычно белками, структурными или неструктурными.

Следовательно, если оба «родителя» дефектны по одному и тому же генному продукту (функции), то ни один из них не способен обеспечить недостающую функцию, и комплементации не происходит. Таким образом, тест на комплементацию можно использовать для классификации и объединения вирусных мутантов в различные функциональные группы. Полагают, что два мутанта, неспособные комплементировать друг друга, имеют дефект в одном и том же гене и генном продукте, тогда как мутанты, способные ко взаимной комплементации, имеют дефект в различных генах и генных продуктах. Теоретически возможно столько же комплементационных групп, сколько и генов. Однако абсолютная летальность некоторых мутаций или несущественная функция других часто приводит к тому, что число комплементационных групп меньше числа генов.

Комплементация может быть односторонней и двусторонней. Двусторонняя комплементация заключается в репродукции обоих партнеров, каждый из которых не способен к самостоятельной репродукции. При односторонней комплементации один из партнеров обеспечивает другого необходимыми для его репродукции продуктами. Вирус, стимулирующий репродукцию другого вируса, называется «вирус-помощник», а вирус, репродуцирующийся только в присутствии помощника, называется «вирус-сателлит».

Существуют два типа комплементации.

Наиболее типична - неаллелъная, или межгенная, комплементация, при которой мутанты, дефектные по различным функциям, помогают друг другу в репликации, предоставляя функцию, дефектную у другого вируса.

Аллельная, или внутригенная, комплементация наблюдается намного реже и происходит в том случае, если генный продукт, дефектный у обоих партнеров, образует мультимерный белок. В этом случае различные партнеры имеют дефект в разных доменах одного и того же белка. Если мультимерный белок состоит из субъединиц одного партнера, то он функционально неактивен. Однако, если мультимер состоит из субъединиц от обоих партнеров, он может принять функционально активную конформацию, и будет наблюдаться комплементация.

Комплементация встречается и у неродственных вирусов, принадлежащих к разным семействам. Одним из семейств, вирусы которого наиболее часто участвуют в комплементации, является семейство аденовирусов. В одних системах аденовирусы могут действовать как дефектные вирусы, в других — как помощники. Например, в культуре клеток почек макак резусов аденовирусы могут репродуцироваться только в присутствии 8У40, который является в данном случае вирусом-помощником.

Тест на комплементацию легче всего проводить с мутантами условно-летального типа. Для постановки такого теста клетки заражают совместно двумя мутантами, а в качестве контроля используют клетки, зараженные этими мутантами по отдельности. Зараженные клетки инкубируют в непермиссивных условиях (при высокой температуре в случае ts-мутантов). По истечении времени, достаточного для роста вируса, определяют суммарный выход при смешанной и раздельной инфекции, титруя вирус при пермиссивных условиях (низкой температуре в случае ts-мутаций) . Индекс комплементации рассчитывают как отношение урожая вируса при смешанном заражении к сумме урожаев в раздельно зараженных контролях. Комплементацию измеряют по увеличению урожая при смешанной инфекции. Индекс комплементации >2,0 указывает на комплементацию.

Комплементация наблюдается в ряде природных ситуаций в системах с вирусами животных. При пассировании ряда вирусов при высокой множественности заражения спонтанно возникают делеционные мутанты. Такие мутанты характерны для препаратов вирусов, которые интерферируют с диким типом и другими мутантами. Делеционные мутанты не способны расти самостоятельно, но поддерживаются в популяции благодаря комплементации, которую обеспечивает небольшое 'количество вируса с полноценным геномом, присутствующее в популяции (вирус-помощник). Комплементация была обнаружена также у РНК-со-держащих трансформирующих опухолеродных вирусов.

Негенетические взаимодействия между вирусами

Между вирусами наблюдаются негенетические взаимодействия, которые могут влиять на результаты генетических исследований. Эти негенетические взаимодействия часто приводят к фенотипическому маскированию истинного вирусного генотипа.

Гетерозиготность 

При совместном культивировании двух штаммов вируса может происходить формирование вирионов, содержащих в своем составе два разных генома или по крайней мере один полный геном и часть второго генома. Это явление названо гетерозиготностью. У некоторых вирусов с гаплоидным геномом гетерозиготность обусловлена неправильной упаковкой геномов при созревании, приводящей к возникновению мультиплоидных частиц. Например, у вируса ньюкасльской болезни более 10% потомства, проанализированного при пассировании после скрещивания, содержало оба родительских типа; это указывает на то, что клоны получены из гетерозиготных мультиплоидных частиц. Действительно, в этих вирусных популяциях наблюдалось значительное число мультиплоидных частиц. Комплементация между геномами в гетерополиплоидных частицах была ошибочно интерпретирована как рекомбинация. Мультиплоидных частиц не наблюдали у вирусов без внешней оболочки, у которых структурные ограничения при упаковке делают маловероятным попадание двух геномов в один капсид. Соответствено гетерозиготность у этих вирусов  не обнаружена.

В генетике высших организмов гетерозиготность означает состояние,  при  котором  диплоидные  хромосомы   различаются по аллельным маркерам в одном или нескольких локусах. У вирусов животных гетерозиготность этого типа обычно не встречается, поскольку, за небольшими исключениями, геномы этих вирусов гаплоидны. Однако геномы ретровирусов полностью диплоидны — они состоят из двух молекул геномной РНК. Ретро-вирусы могут быть гетерозиготны по всем маркерам, и гетерозигота постулируется в качестве промежуточного этапа при рекомбинации.

Частично диплоидны ДНК-содержащие вирусы, в ДНК которых встречаются повторяющиеся последовательности. Возможна также гетерозиготность по диплоидным локусам. Гетерозиготность наблюдается в геноме НSV, у которого концевые и внутренние повторяющиеся последовательности допускают существование некоторых аллелей в двух копиях. Хотя аллели в диплоидных участках обычно идентичны, найдены области облигатной и необлигатной гомологии последовательностей. Выделены рекомбинанты НSV -1 и НSV -2, содержащие гетерозиготные концевые повторы. Гетерозиготность по концевым участкам влияет на изомеризацию генома, которая обычно происходит у герпесвирусов.

Фенотипичеокое смешивание

Фенотипическим смешиванием называют процесс, в результате которого индивидуальная вирусная частица, образовавшаяся при смешанной инфекции, получает структурные белки (капсида или оболочки), происходящие от обоих родительских вирусов. В крайнем варианте дочерний геном, генотипичеоки идентичный геному одного из родителей, упаковывается в капсид или оболочку, определяемую другим родителем. Смешивание геномов и структурных белков приводит к образованию вирусных частиц, в которых фенотипические свойства вирусов не отражают фенотипических потенций генома. Тем не менее при последующем заражении экспрессия генома приводит к образованию потомства, в котором фенотип соответствует генотипу. Таким образом, фенотипичеокое смешивание представляет собой преходящий феномен.

Фенотипическое смешивание довольно широко распространено у вирусов без оболочки, близкородственных между собой. Способность капсидных белков смешиваться и давать урожай инфекционного вируса предполагает, что смешанные белки должны играть весьма сходную структурную роль в вирионе.

Фенотипическое смешивание наблюдается при смешанной инфекции,многими вирусами, причем эти вирусы могут быть как близкими друг другу (например, вирусы гриппа А и В или разные серологические подтипы вируса гриппа А), так и весьма далекими (онковирусы и рабдовирусы).

Фенотипическое смешивание структурных антигенов наблюдали между близкородственными вирусами, такими как вирусы полиомиелита типов 1 и 2 и между более отдаленными родственниками, такими как вирусы ЕСНО 7 и Коксаки А9.

В некоторых случаях фенотипичеокого смешивания большая часть потомства имела полностью гетерологичный капсид (гранскапсидация). Патогенные вирусы, например вирус ящура и бычий энтеровирус или вирус полиомиелита и вирус КоксаКи , дают транскапсидацию in vitro, что может иметь эпидемиологические последствия в том случае, если транскапсидация происходит также и in vivo.

Фенотипическое смешивание свободно протекает у ряда РНК- и ДНК-сбдержащих вирусов с оболочкой. У этих вирусов фенотипическое смешивание часто происходит таким образом, что нуклеокапоид данного вируса оказывается заключенным в оболочку, определяемую другим вирусом; это явление получило название «образование псевдотипа». Комплементация, наблюдаемая между дефектными по репликации РНК-содержащими опухолеродными вирусами и их помощниками (см. выше), приводит к образованию псевдотипов, поскольку поверхностные гликопротеины обычно кодируются вирусом-помощником. Вирус везикулярного стоматита образует псевдотипы с рядом других вирусов, имеющих оболочку, включая вирус чумы птиц, группы птичьих и мышиных РНК-содержащих опухолеродных вирусов, и НSV. Тем не менее в процессе образования вирусов с оболочкой одних вирусов и нуклеокапсидами других существуют ограничения, на что указывает отсутствие фенотипического смешивания между вирусом везикулярного стоматита и вирусом Синдбис [12]. Не все фенотипичеоки смешанные частицы вирусов с оболочкой представляют собой псевдотипы. Может происходить также смешивание белков оболочки, что приводит к образованию вирионов, нейтрализуемых антисыворотками к обоим родителям.

Интерференция

У вирусов животных найдено несколько типов интерференции. Наибольший интерес для генетиков представляет гомологичная интерференция, которая проявляется только по отношению к гомологичному вирусу или к близкородственным вирусам.

Одной из форм хорошо изученной гомологичной интерференции является интерференция, наблюдающаяся при серийных пассажах вируса при высокой множественности заражения [65]. В этих условиях суммарный урожай вирусных частиц остается относительно постоянным, однако урожай инфекционного вируса снижается по мере пассирования. Таким образом, наблюдается интерференция в отношении роста инфекционной части вирусной популяции. Изучение этих интерферирующих вирусных популяций показало, что они содержат значительную долю вирусных геномов (геномных сегментов) с делециями.

Выдвинуто предположение, что делеционные мутанты интерферируют с ростом полного вируса, эффективно конкурируя за компоненты репликационного аппарата, например за полимеразу [65], что приводит к образованию все увеличивающейся доли дефектного интерферирующего вируса. В последнее время предполагают, что хотя дефектный интерферирующий вирус может конкурировать с полным вирусом за компоненты репликационного аппарата, он не обязательно мешает репродукции полного вируса. Гомологичная интерференция наблюдается не только с делеционными мутантами, но и с мутантами других типов.

Картирование вирусных геномов

Генетическое картирование

Генетические карты, в которых вирусные мутации расположены в определенном линейном порядке с указанием относительных расстояний между ними, получают путем рекомбинационного анализа.

На генетической карте можно видеть относительное положение специфических мутаций в геноме, но она не дает никакой информации о генах (и генных продуктах, кодируемых в них), расположенных в соответствующих участках генома. Кроме того» некоторые РНК-содержащие вирусы не рекомбинируют со сколько-нибудь заметной частотой, так что их мутации не картируются. Для картирования мутаций, генов и генных продуктов на физических картах геномов разработан ряд методов. Эти методы, основанные скорее на биохимических, чем на генетических приемах, можно использовать для создания карт геномов без рекомбинации и без мутаций.

Рестрикционные карты

Создание физических карт геномов ДНК-содержащих вирусов началось после того, как в практику вошли рестрикционные эндонуклеазы. Рестриктазы или эндодезоксирибонуклеазы — это просто организованные белки, являющиеся ферментами, широко распространенными среди прокариотов расщепляют молекулу ДНК изнутри, обычно — в местах, где преобладают пиримидиновые основания. Рестриктазы характеризуются высоковыраженной специфичностью, распознавая строго определенные последовательности нуклеотидов в двунитчатой ДНК.

Сайты расщепления могут служить контрольными точками в геноме, расстояния между которыми известны. Стратегия рестрикционного картирования состоит в расщеплении хромосомной ДНК подходящим ферментом и последующем определении размера и порядка расположения образующихся фрагментов в хромосоме. После этого контрольные точки, представляющие собой сайты расщепления на рестрикционной карте, можно использовать для картирования разнообразных молекулярных маркеров, например точки начала репликации ДНК и кодирующих областей специфических мРНК. Использование разных рестриктаз позволяет получать фрагменты разной величины, которые затем разделяются и анализируются путем электрофореза в агарозных или полиакриламидных гелях.

Физические карты

Сочетание рестрикционного анализа с другими методами позволяет составить физические карты геномов вирусов. Физические карты вирусных геномов обозначают взаимное расположение генов, их границы, локализацию начала репликации, промоторов, лидеров, экзонов и интронов, сигнальных последовательностей и других генетических элементов.

В настоящее время полностью расшифрованы нуклеотидные последовательности отдельных генов и целых геномов Если речь идет о РНК-содержащих вирусах, то предварительным условием для дальнейшего их анализа является переписка РНК на ДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскрип-тазы), после чего генетический материал может быть подвергнут рестрикционному анализу.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Разработка новых приемов для манипуляции с нуклеиновыми кислотами, обычно называемых «генной инженерией», открыла новые возможности для генетических исследований вирусов животных. В отличие от классической и молекулярной генетики, генная инженерия имеет своим объектом не клетки, не вирусы, а гены или их группы, оперируя с ними не как с биологическими объектами, а как с молекулами или фракциями молекул. Целью генной инженерии является пересадка генов в гетерогенные системы, их экспрессия для получения кодируемых генами белков — гормонов, ферментов, антигенов и других биологически активных веществ.

Основным инструментом генноинженерных работ являются некоторые ферменты и в первую очередь рестрик-тазы. С их помощью удается получить необходимые фрагменты геномов или отдельные гены. В большинстве случаев рестриктазы образуют «липкие концы» в местах разреза молекул ДНК, что дает возможность соединять концы разных генов или генетических элементов. В тех же случаях, когда «липкие концы» не образуются, их создают искусственно, используя ферменты — концевые нуклеотидил-трансферазы. Для ковалентных сшивок нитей ДНК применяются ферменты ДНК-лигазы. Для переноса в клетку вновь образованной генетической структуры в принципе могут быть использованы следующие методы: гибридизация соматических клеток, пересадка ядер и хромосом, трансформация клеток с помощью ДНК путем введения чужеродной ДНК в зародышевые и соматические клетки животных и прямая микроинъекция ДНК в ядро клетки. Чужеродный генетический материал можно вводить в клетку с помощью вектора. Вектор — это молекула ДНК, способная к автономной репликации и используемая для переноса чужеродной генетической информации в клетку. Векторами могут быть бактериальные плазмиды либо искусственные образования (би- и тривалентные плазмиды, космиды — производные фагов и плазмид). Удобными векторами для эукариотических клеток являются некоторые ДНК- и РНК-содержащие вирусы животных благодаря их способности к репродукции и существенному накоплению продуктов транскрипции и трансляции. К ним относятся вирусы полиомы, папилломы, 8У40, герпеса, аденовирусы, а среди РНК-со-держащих — ретровирусы. Одной из наиболее перспективных векторных систем является крупный ДНК-содержащий вирус — вирус осповакцины.

Генная инженерия создает новые возможности для получения вирусных вакцин, и эти возможности заключаются в создании вакцин, состоящих из протективных (вызывающих образование защитных антител) белков. Такие вакцины могут быть получены в прокариотических (бактериальных) системах и в системах низших эукариотов (например, в дрожжах). Однако большинство протективных антигенов вирусов человека являются продуктами сложных внутриклеточных модификаций, которые обычно не могут осуществить клетки прокариотов и низших эукариотов (антигены вирусов полиомиелита, гепатита А, гриппа и др.), и в этом случае для получения вакцин необходимо использовать клетки высших эукариотов, что делает ген-ноинженерные вакцины против ряда инфекций нерентабельными. Однако для вирусов, которые плохо культивируются в лабораторных условиях (например, вирус гепатита А и ряд кишечных вирусов — возбудителей гастроэнтеритов) этот путь остается единственно приемлемым.

Среди новых направлений по созданию генноинженер-ных вакцин весьма перспективным является использование крупных вирусов животных для введения в их геном генов протективных белков вирусов. Наиболее удачной моделью для этих манипуляций является вирус осповакцины. Этот вирус имеет громадный геном (187 кб), в который без ушерба для репродукции вируса можно встроить до 25 ко чужеродного генетического материала, т. е. несколько генов, кодирующих протективные белки вирусов. Получены  штаммы вируса осповакцины со встроенным в область ранних генов гена НВ8-антигена. При внутрикожной прививке такой вакцины происходит размножение вируса осповакцины и развитие вакцинального процесса, : характерного для осповакцины. Одновременно происходят синтез НВ8-антигена вируса гепатита В, секреция его из очага вакцинации и индукция специфического иммунитета к гепатиту В. При этом реактогенность рекомбинантного  штамма вируса осповакцины не только не повышается, но даже снижается по сравнению с исходным вакцинным штаммом.

Несмотря на большие успехи генной инженерии, трудности, стоящие перед ней, далеко еще не преодолены. Если принять за 100% путь от начала исследований до промышленного, коммерчески выгодного продукта, будь то вакцина, интерферон или гормон, то можно следующим образом оценить каждый из трех основных этапов этой задачи: получение рекомбинантных молекул на. основе про-кариотного или эукариотного вектора—10%, получение экспрессии интересующего исследователей гена — 30 %, выход на экономически выгодную технологию—60%. И тем не менее, несмотря на все эти трудности, генная инженерия стала ядром современной биотехнологии и с каждым годом вклад ее в производсто будет возрастать.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

78439. Цифрова система комутації Alcatel 1000 E-10 862.5 KB
  Ця система побудована на відкритій архітектурі, в якій функції розділені між програмними та апаратними модулями, що зв’язані жорстко визначеними інтерфейсами. Програмні та апаратні модулі повністю незалежні один від одного.
78440. Цифрова система комутації МТ-20/25 162 KB
  Для зв’язку з різними АТС та вузлами необхідні спеціальні комплекти з’єднувальних ліній. В АТСЕ типу МТ20 25 можуть включатися наступні типи ліній: абонентські лінії; лінії таксофонів міських і міжміських; з’єднувальні лінії з установчо-виробничими АТС УВАТС; лінії від кабінних комутаторів міжміських переговорних пунктів із серійним шуканням по вихідному зв’язку; з’єднувальні лінії з іншими АТС які існують на мережі. В АТСЕ забезпечується автоматична перевірка всього обладнання вимірювання електричних параметрів...
78441. Гасіння пожеж у театрально-видовищних установах 93.5 KB
  Особливості гасіння пожежі в сценічній частині. Особливості гасіння пожежі в глядацькому залі. ВСТУП Гасіння пожеж у видовищних установах пов’язане з необхідністю проведення рятувальних робіт особливо під час вистав.
78442. Гасіння пожеж у дитячих дошкільних та навчальних закладах 72 KB
  Особливості розвитку пожежі у дитячих та навчальних закладах. Гасіння пожеж у дитячих дошкільних та навчальних закладах. Будівлі шкіл шкілінтернатів та інших навчальних закладів будують з неспалимих матеріалів і П ступенів вогнестійкості висотою 35 поверхів.
78443. Гасіння пожеж у лікувальних закладах 75 KB
  Оперативнотактична характеристика лікувальних закладів Обстановка на пожежах у лікарнях зумовлюється конструкційними особливостями плануванням та ступенем вогнестійкості будівель горючим завантаженням а також наявністю великої кількості хворих людей різного віку їх фізичного та психічного стану. У багатоповерхових будівлях та будівлях підвищеної етажності влаштовують сходоволіфтові вузли де експлуатуються не тільки пасажирські ліфти але й ліфти для перевозу хворих на ношах операційних столах та возиках. На поверхах розміщуються...
78444. Гасіння пожеж у сільських населених пунктах 71.5 KB
  Особливості розвитку та гасіння пожеж у житловій зоні сільських населених пунктів. Вимоги безпеки праці під час гасіння. Основними вододжерелами для гасіння пожеж тут є річки ставки озера свердловини колодязі і т.
78445. Порядок розрахунку необхідної кількості сил та засобів для гасіння пожежі при недостатній кількості води 84 KB
  Способи організації подачі води при її недостатній кількості для пожежегасіння. Вихідні дані та способи організації перекачки води. Розрахунок необхідної кількості автоцистерн для організації перекачки води.
78446. Гасіння пожеж у торгових та складських приміщеннях 73 KB
  Гасіння пожеж у торгових та складських приміщеннях. Вимоги безпеки праці під час гасіння. Гасіння пожеж у торгових та складських приміщеннях.
78447. Гасіння пожеж на об’єктах зберігання і переробки деревини 94 KB
  Обстановка на пожежі. Під час пожежі постраждав один робітник 1982 року народження з опіками різного ступеня тяжкості його доставили до лікарні невідкладної допомоги. Газозварювальник нехтуючи елементарними правилами пожежної безпеки не підготував місце проведення робіт не вилучив спалимі матеріали що призвело до виникнення пожежі в цеху. Пожежі було надано підвищеного номеру виклику.