5798

Технологічний процес виробництва пробіотичного препарату на основі мікроорганізму Enterococcus faecium

Дипломная

Химия и фармакология

Проект виробництва пробіотичного препарату на основі мікроорганізму Enterococcus faecium в ліофільно висушеній формі складається зі вступу,чотирьох розділів,графічних матеріалів та списку використаної літератури...

Русский

2012-12-21

1.53 MB

87 чел.

Реферат

Проект виробництва пробіотичного препарату на основі мікроорганізму Enterococcus faecium в ліофільно висушеній формі складається зі вступу, чотирьох розділів, графічних матеріалів та списку використаної літератури з 27 найменувань. Загальний обсяг роботи1 сторінка, 1 рисунок, 12 таблиць, 3 кресленя формату А1, 1 креслення формату А2, 2 додатків.

У дипломному проекті дано обґрунтування та викладено технологічний процес виробництва препарату, який включає блок допоміжних робіт, стадії вирощування культури та одержання готової форми. 

Складено аналітичний огляд літератури щодо сучасного стану галузі застосування пробіотичного препарату на основі штаму Enterococcus faecium B-7050. Внесено пропозиції з використання поживного середовища та застосування на виробництві сучасної ліофільної сушки з новітньою системою охолодження на основі рідкого азоту

Ключові слова: пробіотики, Enterococcus faecium, ліофільно висушений препарат, біосинтез, поживне середовище, захисне середовище

Перелік умовних позначень

АПБ

ацилпереносний білок

КоА

коензим А

КУО

кулонієутворювальна  одиниця

НАД

нікотинамідаденіндинуклеотид

НАДН

нікотинамідаденіндинуклеотид відновлений

НАД(Ф)Н

нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат відновлений

НАД(Ф)

нікотинамідаденіндинуклеотид або нікотинамідаденіндинук- 

леотидфосфат

ШКТ

шлунково-кишковий тракт

Вступ

З найдавніших часів людина використовувала біотехнологічні процеси при хлібопекарстві, готуванні кисломолочних продуктів, у виноробстві і т.п., але лише завдяки роботам Л. Пастера в середині 19 ст., що довели зв'язок процесів шумування з діяльністю мікроорганізмів, традиційна біотехнологія одержала наукову основу [20]. 

Біотехнологія на сучасному етапі, а також на багато десятиріч вперед визначає науково-технічний прогрес і рівень життя людей. Вона є не тільки наукою, але і сферою діяльності людини, яка, використовуючи біологічні процеси, що протікають в живих організмах і системах, переносить їх на виробництво для отримання украй необхідних для людини лікарських препаратів, і відтворення тих біологічних ефектів, які не створені природою [21] . 

Подальший прогрес людства багато в чому пов'язаний із розвитком біотехнології [21] .

Важливу роль для профілактики і терапії дисбіотичних  станів грають біологічні бактерійні препарати, широко використовувані на практиці. Препарати, викликають позитивний вплив на нормальну мікрофлору, прийнято розділять на 3 групи: пробіотики, пребіотики і синбіотики [21] .

Концепція оздоровлення людини та запобігання старінню організму уведенням у харчовий раціон кисломолочних продуктів була висунута російським мікробіологом І.І. Мечниковим майже століття тому [21] .

Практичним втіленням цієї концепції стало застосування ацидофільних лактобацил з терапевтичною метою, започатковане у США у 20-і роки XX ст. Вітчизняні дослідники почали вивчати це питання у 50-х роках минулого століття. Найбільший інтерес до пробіотиків з'явився 10років тому, коли широке використання антибіотиків спричинило порушення мікробіоценозів людини та тварин.

У науковому і в повсякденному житті значного поширення набули поняття «пробіотики», «пребіотики», «пребіотичні продукти», «еубіотики» [21] .

Термін «пробіотик» був вжитий Р. Паркером у 70-х роках минулого століття для позначення живих мікроорганізмів, які уводилися у корми тварин для стимуляції росту та набуття стійкості до стресів. Пізніше, у 1989 р. у роботах Фуллера це поняття стало об'єднувати живі мікроорганізми, які надходять до шлунково-кишкового тракту та покращують якість життя хазяїна в результаті нормалізації його мікробної системи [21] .

Більшість спеціалістів і дослідників відносять до пробіотиків-еубіотиків представників нормальної мікрофлори кишечника, біфідобактерії та лакто-бацили. Їх називають класичними пробіотиками [21] .

Пробіотики поділяють на такі групи:

  •  монокомпонентні пробіотики містять тільки один вид мікроорганізмів. Наприклад, "Біфідумбактерин" - біфідобактерії, "Лактобактерин" - лактобактерії, "колібактерину" - Escherichia coli,Лактин-К” –Enterococcus faecium і т. д.;
  •  полікомпонентні пробіотики включають кілька видів мікроорганізмів. Наприклад, "Біфілонг", "Біфікол", "Окарина", "Ацілакт", "Лінекс" та ін;
  •  комбіновані пробіотики (синбіотики) - "два в одному" - містять пробіотики та пребіотики. Наприклад, "Біфідумбактерин форте", "Біфіліз", "Біфіформ", "Бактістатін", "Прімадофіліус", "Полібактерін" та ін 
  •  рекомбінантні (генно-інженерні) пробіотики - при виробництві таких препаратів, бактеріям імплантуються корисні гени, що приносять нові властивості колонії. Функціональна роль пробіотиків різноманітна, проте останнім часом велика увага приділяється підвищенню неспецифічної імунорезистентності.

Останніми роками в практику починають впроваджуватися аутопробіотики, діючою основою яких є штами нормальної мікрофлори, ізольовані від конкретного індивідуума і призначені для корекції його мікроекології [21] .

Вимоги до мікроорганізмів, використовуваних як основа пробіотиків:

  •  ізольованість із організму тих видів тварин і людини, для яких вони і будуть призначені;
  •  позитивний вплив на організм хазяїна, підтверджений лабораторними дослідженнями і клінічними спостереженнями;
  •  за тривалого використання не повинні викликати побічних ефектів;
  •  високий колонізаційний потенціал, тобто мають зберігатися в травному тракті до досягнення максимальної позитивної дії (бути стійкими до низьких значень рН, жовчних кислот, антимікробних субстанцій, що продукуються ендогенною мікрофлорою; добре адгезуватися до епітелію відповідних слизових оболонок);
  •  стабільні характеристики як у клінічному, так і в технологічному плані;
  •  висока швидкість росту і розмноження в умовах, найближчих до таких у кишковому тракті, за їхнього культивування in vitro [21] .

Актуальність. На сьогоднішній день проблема розробки пробіотиків є надзвичайно актуальною темою в медицині та у ветеринарії, що зумовлено підвищенням частоти порушень мікрофлори організму хазяїна, шкідливою дією різних антибіотиків, різних стресових ситуацій, дії важких металів, негативного впливу екологічної ситуації. Пробіотики мають позитивний вплив на організм а також інгібуючи впливають на патогенну мікрофлору, і тому зараз у всьому світі починають відмовлятися від антибіотиків на користь пробіотиків. Також при використанні пробіотику «Лактин-К» збільшується  несучість у курей-несучок, що є величезним плюсом в порівнянні з використанням інших схожих препаратів.

Новизна. При культивуванні Enterococcus faecium використовується середовище нового складу [19], що дає змогу в промислових умовах одержати більшу концентрацію біомаси та підвищити вихід пробіотику «Лактин-К». Також використовується ліофільна сушка з новітньою системою охолодження на основі рідкого азоту [23].

Розділ 1. Аналіз стану проблеми

За останні 10 років світовий попит на екологічно чисту продукцію подвоївся, і, за прогнозами експертів, ринок екологічно чистої продукції до 2020 р. може досягти обороту в $200млрд на рік. Наприклад, потреба в таких продуктах у Франції задовольняється лише на 36% [25].

Сьогодні саме екологічне сільське господарство є пріоритетом розвитку аграрної галузі в Європі. Підтримка здійснюється на державному рівні кожної країни й на рівні Євросоюзу. Однак зростання ринку біоконтролю й біотехнологій у країнах ЄС стримується твердими правилами реєстрації засобів. Процес реєстрації може зайняти до 2 років, а витрати в десятки разів вищі, ніж в Україні [11,25, 26].

Разом з тим у європейських країнах усе гостріше відчувається потреба в заміні традиційних для сільського господарства препаратів підвищення врожайності (у рослинництві) і продуктивності (у тваринництві й птахівництві) на біологічні. З 1 липня 1999 р. в ЄС заборонено застосування кількох традиційних антибіотиків, а в окремих країнах заборонено всі антибіотикистимулятори росту у тваринництві. Тому підвищився інтерес до використання живих мікроорганізмів у сільськогосподарському виробництві, які можуть стати альтернативою кормовим антибіотикам. Такими препаратами є пробіотикибіопрепарати на основі корисних для тварин бактерій, які протистоять патогенним бактеріям в організмі й забезпечують відновлення нормальної мікрофлори кишко вика [17,25].

На вітчизняних підприємствах які виробляють продукцію, що поступає на експорт змушенні рахуватися з даними тенденціями в розвитку сільського господарства у країнах ЄС. І тому змушенні відмовлятися від використання антибіотиків та впроваджувати у широке використання пробіотику [25].

Сучасну ситуацію з екологічно чистою продукцією птахівництва в Україні 

можна назвати кризовою, яка формувалась протягом тривалого періоду в результаті нехтування об’єктивними законами утворення і відтворення природних ресурсів. Економіці нашої країни притаманний високий рівень ресурсомістких та енергоємних технологій. Також якість продукції сільського господарства та продуктів харчування  постійно знижується.  Але існують також певні виробництва, які розуміють, що якісні продукти харчування захочуть купувати і тому відмовляються від використання різноманітніх хімічних сполук. Також  такі виробники спеціально відбирають зерно та інші корми, щоб вони вирощувались без внесення різноманітних хімічних сполук, бо останнім часом в Україні більше уваги споживачі приділяють тому, яку продукцію вони споживають. Більша частина такої продукції розповсюджується через мережу супермаркетів [22].

Розроблена урядова програма, яка має на меті підвищити кількість вирощуваних чистих продуктів. А саме збільшити кількість посівних площ на яких не будуть використовуватися різноманітні хімічні сполуки, також планується збільшення тваринницької продукції, що виробляється без використання хімії.

На даний момент тваринництво України не повністю забезпечено вітчизняними пробіотиками і тому наші фірми змушенні закуповувати згадані препарати закордоном. 

На жаль, підприємств, спроможних виготовляти комбікорм ідеального поживного та фізико-механічного складу в Україні небагато. Щоб забезпечити всі потрібні вимоги до якості, такі підприємства мають сучасну систему очищення й підготування компонентів комбікорму для подальшої переробки.Відмітною рисою сучасного заводу з виробництва якісних комбікормів є відносна безшумність та ефективна аспірація [17]. 

Такі заводи мають мінімальні за розміром транспортні системи компонентів, здатні переходити з виробництва одного рецепту комбікорму на інший майже миттєво й виробляти його разовими партіями від 50 кг до 50 тонн.

Практика комбікормового виробництва свідчить, що на заході нашої країни таким вимогам відповідає українсько-угорське підприємство ТОВ "АБО-МІКС", що в м. Коломия Івано-Франківської області, холдингу "Авангард" і "Миронівський хлібопродукт". Сучасні підприємства з виробництва якісних комбікормів є поблизу Києва, в Полтавській та Донецькій областях. Найсучасніший завод з голландською технологією виробництва і обладнанням, єдиний в Україні та другий в СНД, відкрився 2009 року в м. Роздільне Одеської області на підприємстві "Агротрейд-юг". До речі, останній спроможний забезпечити якісними комбікормами, концентратами, БВД і БВМД значні технологічні потреби будь-якої галузі тваринництва, птахівництва, хутрового звірівництва, рибного господарства [25].

Таким чином, перехід на світовий рівень якості комбікорму саме й означає перехід на рівень ефективності самого світового тваринництва.

«Лактин-К» –пробіотик, що складається з живої культури штаму Enterococcus faecium B-7050. В 1 см3 пробіотику «Лактин-К» міститься 1 х 109 КУО (кулонійутворювальних одиниць) бактерій. Не містить генетично модифікованих організмів (ГМО). Даний продукт являється однорідним порошком білого кольору, який добре розчиняється у воді, легко змішується з кормом. «Лактин-К» потрібно зберігати в сухому, захищеному від світла приміщенні при температурі від +2о до +10 оС [12]. 

Даний продукт  є дешевим біологічним препаратом та альтернативою хіміотерапевтичних засобів (в тому числі антибіотиків) при профілактиці і лікуванні, в першу чергу, інфекційних захворювань. «Лактин-К» пробіотик - адсорбент широкого спектру поглинання токсинів і мікотоксинів. Запобігає токсичному  впливу мікотоксинів на організм тварин, птиці і попереджає попадання мікотоксинів у тваринницьку продукцію: яйця та м'ясо [12].

Основною галуззю практичного використання препарату «Лактин-К» є птахофабрики та тваринницькі ферми.  «Лактин-К» є джерелом вітамінів, мікроелементів і амінокислот які позитивно впливають як на мікроорганізми-симбіонти так і на організм птиці та інших тварин загалом. Препарат є економічно вигідним за технологією виготовлення та застосування, не викликає звикання з боку патогенної мікрофлори, не нагромаджуються в органах і тканинах, не шкідливий для людини і навколишнього середовища. Профілактика інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин набула соціальної значущості, оскільки контамінація продуктів тваринництва і птахівництва сальмонелами, ешеріхіями, кампілобактеріями та іншими збудниками харчових інфекцій представляє небезпеку для здоров’я  людини [1].

Препарат визнаний на сьогоднішній день і має переваги перед іншими протиінфекційними хіміотерапевтичними засобами: 

  •  Enterococcus faecium володіє властивістю приєднуватися до епітеліальних клітин ШКТ и формувати захистний шар мікрофлори. Завдяки цьому в порівнянні з іншими засобами, «Лактин-К» має більш тривалий термін дії;
  •  при використанні «Лактину-К» культура Enterococcus faecium  продукує вітаміни, ферменти, лактат, що збільшує процент несучості у несучок, які вживали «Лактин-К»;
  •  застосування «Лактину-К» при вигодовуванні новонароджених поросят дозволило зменшити захворюваність, підвищити середньодобові прирости, провести профілактику шлунково-кишкових захворювань у поросят з 21,9 % до 5,5 %, загибель та вимушений забій з 6 % до 0,9% [8];
  •  застосування «Лактину-К» разом з антибіотиками або після антибіотиків не знижує його ефективності, дозволяє знизити об'єми використання антибіотиків, що дозволяє знизити об'єми використання антибіотиків [26];  
  •  застосування Лактину-К зменшує рівень виділення токсичних сполук - аміаку, сірководню.

У 2002 році на Інститут мікробіології з комерційною пропозицією про співробітництво вийшло ТОВ «Аллісана», яке спеціалізується на виробництві ветеринарних препаратів і білково-вітамінних добавок. Виявивши інформацію про «Лактина» в Інтернеті, компанія вирішила зайнятися цим перспективним напрямком. Інститут пішов назустріч підприємцям, і в 2004 році між розробниками і ТОВ «Аллісана» був укладений ліцензійний договір, за яким бізнесмени частину коштів за ліцензію виплатили одразу, а в подальшому будуть розраховуватися відсотками від отриманого прибутку. У перший рік промислового виробництва виплатити 4%, через рік - 5%, а через три роки - 6%. Компанія взяла на себе всі витрати, пов'язані з маркетингом, рекламою і налагодженням виробничих процесів, а також з організацією виробництва [12]. 

Промислове виробництво препарату почалося тільки в листопаді 2007 року, коли були отримані всі необхідні дозволи. Завдяки рекламі ТОВ «Аллісана» на сьогоднішній день контролює 12% ринку .

На даний момент підприємство випускає майже тонну препарату щомісяця, орендувавши для цього один промисловий цех колишнього Кременчуцького дріжджового заводу площею 270 квадратних метрів. До цих пір обсяги виробництва не дозволяють завантажити роботою навіть два ферментера, але є можливості збільшення виробництва із зростанням попиту на таку продукцію як в самій Україні, так і з виходом на ринки інших країн [12]. 

Ці прогнози мають реальне обгрунтування. Зараз препарат купують лише фабрики, які спеціалізуються на виробництві яєць. Комбінати, які вирощують птицю на м'ясо, поки використовують традиційні антибіотики, оскільки зацікавлені в швидкому зростанні птиці (повний цикл вирощування бройлера складає всього 36 діб, і антибіотики сприяють зростанню пернатих). І хоча Закон України «Про ветеринарну медицину» забороняє застосування антибіотиків для стимуляції росту тварин, в той же час він дозволяє використовувати їх для лікування захворювань. А провести межу між стимуляцією росту і лікуванням птиці складно [11,12].

Найближчим часом ТОВ «Аллісана» планує вийти на ринок Росії, препарат вже переданий на реєстрацію. Український виробник розраховує на 10% російського ринку, що дасть дохід близько одного мільйона доларів на рік. Однак просування препарату «Лактин-К» на російський ринок поки не почали. Після Росії планується вихід до країн Азії (де, за розрахунками компанії, дохід складе до 10 млн доларів щорічно), а потім можна вже завойовувати і Європу. 

Вихід на зарубіжні ринки потребують великих вкладень - у маркетингові дослідження, рекламу, розширення виробничих потужностей. Тим часом на таку кампанію у ТОВ«Аллісана» не вистачає коштів. Залучати співінвестора підприємство відмовляється з побоювань, що той зажадає занадто багато чого, а воно поки не готове ділитися своїм прибутком [1].

Для одержання пробіотику «Лактину-К» використовується глибинне культивування культури штаму Enterococcus faecium B-7050. Альтернативою йому може бути поверхневе вирощування в спеціальних ростильних установках, але оскільки даний вид культивування є не рентабельним то використовується глибинне культивування продуценту.

До основних параметрів, що впливають на результат технологічних процесів слід віднести :

  •  параметри культивування  (температура, тиск, частота перемішування, час культивування);
  •  параметри сепарування (частота обертання, час обертання);
  •  параметри ліофілізації (температура та час заморожування, температура та час ліофілізації).

При зміні часу культивування ми не отримуємо потрібну для даного препарату кількість колоніє утворювальних одиниць (КУО). Якщо  буде змінена температура вирощування то дані умови будуть не оптимальними для росту культури пробіотику, що також призведе до зниження КУО. Збільшення тиску та частоти перемішування також вплине на кількість КУО, оскільки підвищення даних параметрів відіб’ється на життєздатності клітин.

Зменшення частоти або часу центрифугування призведе до потрапляння культуральної рідини до готової продукції, збільшення ж даних параметрів призведе до зменшення кількості клітин.

Збільшення часу та температури заморожування та ліофілізації призведе до зменшення кількості клітин пробіотику, а зменшення відіб’ється на терміні зберігання готової продукції. 

Завданням даного проекту є: підбір оптимальної технологічної схеми та її апаратурне оформлення; вибір найкращого продуцента; розрахунок складу поживного середовища для виробництва вітчизняного пробіотику Лактин-К.

Розділ 2. Технологічна частина 

2.1.Характеристика кінцевої продукції виробництва

«Лактин-К» –пробіотик, до складу якого входить жива культура штаму Enterococcus faecium B-7050. В 1 см3 препарату міститься 1 х 109 КУО (кулонійутворювальних  одиниць) бактерій. Не містить генетично модифікованих організмів (ГМО). Пробіотик являє собою однорідний порошок білого кольору, добре розчиняється у воді, легко змішується з кормом. «Лактин-К» зберігають в сухому, захищеному від світла приміщенні при температурі від +2о до +10о С[12]. 

«Лактин-К» –монокомпонентний ветеринарний біопрепарат вибіркової дії з пробіотичними та імуномодулюючими властивостями [12].

 Промислово-цінний штам Enterococcus faecium B-7050 (ВКПМВ-2579), ізольований із ШКТ птахів. Штам Enterococcus faecium B-7050 повторно депоновано у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів, м. Київ. 

Пробіотик «Лактин-К»  є дешевим біологічним препаратом та альтернативою хіміотерапевтичних засобів (в тому числі антибіотиків) при профілактиці і лікуванні, в першу чергу, інфекційних захворювань. Лактин-К пробіотик - адсорбент широкого спектру поглинання токсинів і мікотоксинів. Запобігає токсичному  впливу мікотоксинів на організм тварин, птиці і попереджає попадання мікотоксинів у тваринницьку продукцію: яйця, м'ясо і молоко [12].

Препарат загальновизнаний на сьогоднішній день і має явні переваги перед іншими протиінфекційними хіміотерапевтичними засобами: 

  •  Enterococcus faecium володіє властивістю приєднуватися до епітеліальних клітин шлунково-кишкового тракту и формувати захистний шар мікрофлори. Завдяки цьому в порівнянні з іншими засобами, «Лактин-К» має більш тривалий термін дії;

  •  при використанні «Лактину-К» культура Enterococcus faecium  продукує вітаміни, ферменти, лактат, що збільшує процент несучості у несучок, які вживали «Лактин-К» [7];
  •  застосування «Лактину-К» при вигодовуванні новонароджених поросят дозволило зменшити захворюваність, підвищити середньодобові прирости, провести профілактику шлунково-кишкових захворювань у поросят з 21,9 % до 5,5 %, загибель та вимушений забій з 6 % до 0,9%.
  •  застосування «Лактину-К» разом з антибіотиками або після антибіотиків не знижує його ефективності, дозволяє знизити об'єми використання антибіотиків, що дозволяє знизити об'єми використання антибіотиків.   
  •  застосування Лактину-К зменшує рівень виділення токсичних сполук - аміаку, сірководню.

Механізм дії пробіотика  «Лактин-К» полягає в тому, що  штам, який складає основу пробіотика, спочатку приєднується до клітин ШКТ а потім вже продукує антибіотичну субстанцію з високим спектром антибактеріальної та протигрибкової дії, синтезує ліпази, лізоцим а також пектолітичні та протеолітичні ферменти, які приймають участь як  в дезинфекції  білка  від бактеріальних токсинів так і в розщепленні клітковини, полісахаридів і  підвищенні засвоєння кормів. Речовини, які виділяють бактерії, розмножуючись в кишечнику тварин, сприяють активації процесів травлення, в результаті чого збільшується середньодобовий приріст живої маси, підвищується збереження поголів’я і ефективність вирощування молодняку [11].

 Cуміш «Лактин-К» вводять тваринам перорально (методом випоювання), попередньо розчиняючи препарат у воді охолодженній  до температури 30 оС. Розчинений препарат перемішують із кормом чи водою. Суху суміш «Лактин-К» вводять у сухі сипучі корми. Препарат є безпечним для тварин в будь-яких дозах, при цьому він зберігає продукти життєдіяльності тварин безпечними для людини, на відміну від антибіотиків [7].

 

Показники якості біопрепаратуЛактин-К 

Табл. 2.1.1

Найменування 

Показників 

контролю

Установлені значення

Методи

 контролю

Опис

однорідний порошок білого або біло-

кремового кольору, добре розчиняється

у воді, легко змішується з кормом. Препарат

має специфічний запах та смак.

П.1 

Розчинність, 

прозорість, 

кольоровість

При розчиненні препарату у воді Р з

розрахунку 1 мл води на 1 дозу препарату

при ретельному перемішуванні протягом 2

хв утвориться гомогенна суміш різних

відтінків бежевого або білувато-сірого

кольору.

П.1

Вміст іонів

водню

рН (6,01+/- 0,7)

П.1

Втрата маси

при 

висушуванні

Не більше 3%

П.1

Мікробіологіч-

на чистота

Препарат не повинен містити сторонньої

мікрофлори.

П.2

Специфічна

нешкідливість

Препарат повинен бути нешкідливий.

П.3

Специфічна 

активність

Не нижче 90 °Т.

П.4

МЕТОДИ КОНТРОЛЮ

1. Опис препарату. Однорідний порошок білого або біло-кремового кольору, добре розчиняється у воді, легко змішується з кормом. Препарат має специфічний запах та смак [7].

Розчинність, прозорість, кольоровість. При розчиненні препарату у воді Р з розрахунку 1 мл води на 1 дозу препарату при ретельному перемішуванні протягом 2 хв утвориться гомогенна суміш різних відтінків бежевого або білувато-сірого кольору. Визначення проводять візуально [10].

Вміст іонів водню (рН) (6,0± 0,7). Для визначення препарат розводять водою Р з розрахунку 1 мл води Р на 1 дозу препарату. Визначення проводять на вольтметрі з вхідним опором у 100 разів більшим за опір електродів. Прилад звичайно градуюється в одиницях pH. Усі виміри проводяться при однаковій температурі у 20оС. прилад калібрують за допомогою буферного розчину калію гідрофталату (первинний стандарт) і одного з буферних розчинів з іншим значенням pH. Показання приладу для третього буферного розчину з проміжним значенням pH не мають відрізнятись більше як на 0.05 одиниць pH від табличного значення pH цього розчину. Електроди занурюють у випробуваний розчин і вимірюють pH  у тих самих умовах, що і для буферних розчинів [10].

Втрата маси при висушуванні. Втрата не більше 3,5%. 0,5 г препарату поміщають у зважений бокс. Препарат сушать при температурі від 100 до 105 оС у сушильній шафі [10].

  1.   Мікробіологічна чистота. Препарат, ліофілізований у порошку не повинен містити сторонніх мікроорганізмів. Для контролю відбирають по 4 зразки - при величині серії до трьох сотень упаковок, а при збільшенні серії - додатково по одному зразку з кожної сотні. При великій кількості відібраних зразків допускається об'єднання 3-4 зразків в одну пробу. Відбирають вміст з однієї упаковки з сухою біомасою, розводять 0,9 % розчином натрію хлориду з розрахунку 1 мл на дозу препарату і залишають на 1 годину для регідратації біомаси. З  одержаної мікробної зависі готують мазки, забарвлені за Грамом, для мікроскопії. В мазках повинні виявлятися грампозитивні поліморфні коки, які розташовуються у вигляді скупчень або окремих клітин. Для висівання на живильні середовища одержану мікробну завись по 0,5 мл засівають в пробірки за ГОСТ 25336-82Е (по 2 пробірки з кожним середовищем) із скошеними стовпчиками м'ясо-пептонного агару (МПА), агару з 0,5 % глюкозою та густого середовища «Сабуро». Відношення посівної дози до обсягу живильного середовища має становити 1:10 або 1:20 [16].

Посівний матеріал розподіляють по всій поверхні поживного середовища, покачуючи пробірку. Посіви на МПА інкубують при температурі (37±1)°С спочатку в горизонтальному (на протязі 2 діб), а потім у вертикальному положенні. Результати посівів слід враховувати через 48, 72 години і остаточно через 8 діб. Посіви на середовищі Сабуро інкубують при температурі (22±1)°С на протязі 8 діб, спочатку в горизонтальному (на протязі 2 діб), а потім у вертикальному положенні.

Після інкубації посівів на протязі зазначених термінів на середовищах МПА, живильному агарі з глюкозою не повинний бути виявлений ріст сторонньої мікрофлори, на густому середовищі "Сабуро" ріст грибів. У випадку виявлення в посівах біомаси сторонньої мікрофлори контроль повторюють на подвійній кількості зразків препарату. За відсутності росту мікроорганізмів при повторному посіві випробуваний препарат вважають таким, що задовольняє вимогам. За наявності росту сторонніх мікроорганізмів при повторному посіві зразка хоча б в одній пробірці випробуваний препарат вважають контамінованим, і ця серія препарату випуску не підлягає [16].

3. Специфічна нешкідливість. Препарат повинен бути нешкідливий для
білих мишей при введенні його перорально в кількості однієї дози.

Для визначення нешкідливості випробувані зразки розводять 0,9 % розчином хлориду натрію з розрахунку 0,5 мл на одну дозу препарату. Отриману мікробну завись по 0,5 мл вводять 5-ти білим мишам масою (15±1) г кожній по 1 дозі. Спостереження за мишами ведуть на протязі п'яти діб.

У випадку загибелі за цей строк хоча б однієї миші контроль повторюють на подвійній кількості тварин. Якщо під час повторного контролю ні одна з 10 мишей на гине, препарат вважають таким, що витримав випробування. В протилежному випадку цю серію препарату бракують.

. Специфічна активність. Для Лактину-К вона обумовлена кількістю життєздатних клітин в одній дозі препарату та активністю кислотоутворення. В одній дозі препарату повинно міститись не менше 1×109 живих клітин. Показник активності кислотоутворення виражений в градусах Тернера (°Т) має бути не нижче 90.

.1 Визначення кількості живих клітин в одній дозі препарату. Кількість живих бактерій в одній дозі препарату перевіряють паралельно з національним або міжнародним стандартним зразком Лактину-К .

Лактин-К являє собою висушену завись живих бактерій і містить в 1 мл 1×109 живих мікробних клітин. Зберігання при температурі не вище 10°С.

Для визначення кількості живих бактерій в одній дозі препарату з кожної серії випробовують по три зразки. Вміст препарату розводять 0,9 % розчином натрію хлориду з розрахунку 1 мл на одну дозу. Одержані мікробні зависі препарату по 1 мл переносять в пробірки, які містять по 9 мл модифікованого печінкового середовища Блаурокка та перемішують шляхом 12-15-кратного прокачування отримуючи при цьому 1 дозу бактерій в об'ємі 10 мл середовища. З цих пробірок роблять наступні десятикратні розведення. Пробірки з розведеннями випробуваних зразків препарату в живильних середовищах становлять в термостат при температурі (38±1)°С та інкубують на протязі 4-х    діб [10].

Після закінчення інкубації відзначають розведення, в яких є ріст колоній бактерій. Кількість живих бактерій в одній дозі обчислюють, помножуючи кількість колоній на ступінь розведення мікробної суспензії в даній пробірці[11].

Препарат вважається придатним, якщо ріст бактерій в серії десятикратних розведень випробуваного препарату відзначається не менше як в пробірці з розведенням 10× 108(8-ма пробірка), що відповідає вмісту 1× 109 живих мікробних клітин в одній дозі.

Якщо в 1 мл  міститься менше 1× 109 живих бактерій, то контроль слід повторити на новій серії середовища. 

Якщо при повторному контролі показники відповідають пред'явленим вимогам, а показники випробуваного препарату нижче, то ця серія препарату випуску не підлягає [10].

5. Контроль бактеріофагів. Відбирають пробу Enterococcus faecium з ферментера, готують серію послідовних розведення та висівають на чашки Петрі. Культивують на протязі доби на виробничому середовищі при 37ºС. Через добу перевіряємо результати посівів на наявність лізисних плям. При їх наявності робимо висновок, що дана культура уражена бактеріофагами. При «суцільному газоні» робимо висновок, що культура «чиста» від присутності бактеріофагів.

6. Пакування. По 1кг в упаковку. 1 упаковку  пакують в коробки з картону коробкового для споживчої тари за ГОСТ 7933-89Е. В коробку укладають інструкцію з застосування. В ящик фанерний посилковий згідно з ГОСТ 45-39-89 укладають 20 коробок упаковками та пакувальний лист.

7. Маркування. На упаковці українською мовою або українською та будь-якою іншою мовою вказують місто, назву препарату, кількість капсул, номер серії, термін придатності, контрольний номер ВБТК.

На коробці українською або українською та будь-якою іншою мовою вказують Україна, ТОВ «Аллісана», його товарний знак та адресу, назву препарату латинською та українською мовою, або латинською, українською та будь-якою іншою мовою, умови зберігання, реєстраційний номер, контрольний номер ВБТК, номер серії, термін придатності, штриховий код. На ящик наносять попереджувальний напис "Біопрепарати".

8. Транспортування. Всіма видами критого транспорту при температурі не вище 10 °С [24] .

9. Зберігання. В сухому темному місці при температурі не вище 10°С [24] .

10. Термін придатності. 1 рік з моменту ліофілізації.

2.2 Обгрунтування вибору технологічної схеми

2.2.1 Обґрунтування вибору ферментаційного обладнання

Всі форми та види ферментаційних систем створюються, маючи за основну мету забезпечення однакових умов для всіх компонентів, що містяться в реакторі. Біореактор повинен бути сконструйований так, щоб виключити можливість потрапляння забруднюючих мікроорганізмів, а також забезпечити збереження потрібної мікрофлори. Об’єм культивуємої суміші повинен залишатися постійним. Рівень розчинного кисню повинен підтримуватися вище критичних рівней керування культури аеробних організмів; параметри зовнішнього середовища, такі як температура, рН та інші повинні постійно контролюватися. Культура при вирощування має добре перемішуватись [2].

Головне завдання апаратів для глибинної ферментації - забезпечення високої інтенсивності масо- і енергообміну клітин із середовищем.  За структурою потоків ферментери можуть бути апаратами повного переміщування або повного витіснення.

  Конструктивні відмінності ферментерів визначаються в основному способами підвода енергії та аерації середовища:

  •   ферментер з підведенням енергії до газової фази;
  •   ферментер з підведенням енергії до рідкої фази;
  •  ферментер з комбінованим підведенням енергії [2,13].

   Ферментери з підведенням енергії до газової фази. В апаратах цього типу аерація і перемішування культуральної рідини здійснюються стисненим повітрям, яке подається в ферментер під певним тиском. До таких ферментерів відносять:

  1.  барботажні ферментери (біореактори), подача повітря в яких здійснюється через барботажні пристрої, розташовані в нижній частині апарату;
  2.  апарати з дифузором (ерліфтні аератори), що мають внутрішній циліндр-дифузор, який забезпечує перемішування вступників по розподільних трубах в нижню частину апарата субстрату і повітря;
  3.  трубчасті ферментери (газліфтниі), що складаються з реактора кожухотрубчатого типу, через який рідина потоком повітря переміщається у верхню частину апарата і, потрапляючи в сепаратор, повертається в реактор, де знову захоплюється повітрям, піддаючись таким чином циркуляції;
  4.  ферментери з форсунковим повітрярозподільником, обладнані форсунками для подачі повітря, розташованими в нижній частині апарату, і розташованим над ними дифузором, який забезпечує внутрішню циркуляцію рідини;
  5.  ферментери колонного типу, що представляють собою циліндричну колону, розділену горизонтальними перегородками (тарілками) на секції; повітря барботує через шар рідини кожної тарілки, а переміщення рідини через кільцеву щілину забезпечує протиточний рух рідкої і газової фаз [13].

Ферментери (біореактори) з підведенням енергії до рідкої фази. До таких апаратів відносять:

  •  апарати із самозасмоктувальною турбіною, що мають циліндричний дифузор і мішалку з порожнистими лопатями і валом, при обертанні якої за рахунок створюваного розрідження відбувається самовсмоктування повітря, завдяки чому відбувається підйом рідини в кільцевому зазорі між дифузором та стінками апарата з наступним її поверненням у розпилювач;
    •  ферментер з турбоежекторними пристроями, що перемішують - апарат, розділений вертикальними перегородками на секції, в кожній з яких є самовсмоктуюча мішалка турбінного типу (ежектор) і дифузор; для переміщення рідини з секції в секцію в перегородках зроблені вікна.

Ферментери з комбінованим підведенням енергії. У цих апаратах здійснено підведення енергії до газової фази для аерації й до рідкої фази для перемішування[2].

Ферментери зазвичай представляють собою герметичні циліндричні ємності, висота яких в 2-2,5 рази перевищує діаметр. Найчастіше їх виготовляють із нержавіючої сталі. Для підтримки температури в апараті є подвійний кожух або теплообмінник типу змійовика.

 Головна вимога до апаратів - збереження стерильності, тому вони повинні бути герметичними, всі лінії трубопроводів повинні бути доступні для обробки гарячою парою [13].

 Тип ферментерів (біореакторів) для кожного біотехнологічного процесу вибирають з урахуванням специфіки продуцента, властивостей середовища та економічних міркувань. Тому для культивування Enterococcus faecium ми  вибираємо ферментер в якому не відбувається аерація, оскільки продуцент є анаеробом і не потребує кисню. 

Культивування Enterococcus faecium передбачається здійснювати глибинним способом в ферментерах. В представленій роботі передбачено використання ферментеру з механічним перемішуванням. Проведення культивування E. faecium передбачає забезпечення інтенсивного перемішування середовища.

Обраний ферментер забезпечений пристосуваннями для достатнього перемішування культури, підтримки необхідної температури, а також контрольно-вимірювальним приладами [13].

Підтримання температури, оптимальної для гарного росту біомаси і прояву їм підвищеної фізіолого-біохімічної активності, забезпечується сорочкою ферментера або системою змійовиків. Змійовики використовуються також для подачі пари в процесі стерилізації або води для охолодження. 

Спостереження за основними процесами життєдіяльності організму здійснюється контрольно-вимірювальною апаратурою, що дозволяє підтримувати на заданому рівні температуру всередині ферментера, рН середовища, тиск в середині ферментера та інші параметри.
 Ферментер забезпечений пристосуваннями для перенесення інокуляту,  
внесення додаткових поживних речовин, необхідних для покращення розвитку продуцента та пристроєм для взяття проб [2,13].

Для забезпечення стерильності процесу ферментації в обраному ферментері передбачено використання торцевих ущільнень валу перемішуючого пристрою з паровим захистом. За допомогою застосування такої конструкції вдається практично повністю запобігти потраплянню атмосферного повітря в апарат, що є дуже важливим для збереження асептичних умов культивування.

2.2.2 Обгрунтування вибору способу концентрування біомаси.

Для концентрування біомаси на сьогоднішній день застосовуються такі методи:

  1.  фільтрація
  2.  флотація
  3.  центрифугування
  4.   сепарація

Фільтруваннявідділення твердої фази від рідкої шляхом проходження через фільтруючий матеріал або через полімерну сітку з відповідним діаметром отворів [13].

Принципова схема роботи фільтру проста:суспензія потрапляє на фільтруючу перегородку, при цьому рідка фаза проходить фільтруючий матеріал, а тверда фаза затримується на фільтруючому матеріалі у вигляді шару осаду.

Недоліки процесу фільтрування заключаються в великих втратах біомаси за рахунок проходження частини клітин через пори фільтруючого матеріалу, через що пори засмічуються та потребують заміни чи регенерації [13].

Флотаціявиділення з рідких твердих часток або часток іншої рідини за допомогою продування крізь неї газу. Флотація заснована на прилипанні часток, які треба виділити до пухирців газу.  Флотація поділяється на :

  •  механічнуу рідину занурюється пристрій, який дозволяє всмоктувати повітря з атмосфери за рахунок обертового руху рідини;
  •  пневматичну продування повітря крізь дрібнопористі тканини;
  •  вакуумнупухирці повітря утворюються з розчинених у воді газів при створенні розрідження;
  •  ежекційнурідинна надходить до камери ежектора з великою швидкістю, до камери також надходить повітря і відбувається розподіл часточок газу у повітрі;
  •  електролітичнув камері флотатора розташовуються 2 електроди, в результаті електролізу води утворюються газова фаза і відбувається процес флотації [13].

Недоліком флотації являються великі втрати біомаси.

Центрифугуванняпроцес зневоднення і розділення суспензій на рідку і тверду фази під дією відцентрових сил. Машини для здійснення таких операцій називаються центрифугами, які підрозділяються на фільтруючі, осаджувальні і комбіновані (осаджувально-фільтруючі) [13]. 

Метод центрифугування заснований на дії відцентрової сили на неоднорідної системи, що складається з двох та більше фаз.

В промислових установках розділення під дією відцентрових сил застосовують для розділення часточок розміром від 0,5мкм до 25 мм. При розділенні суспензі у фільтруючих центрифугах в роторі під дією відцентрових сил відбувається фільтрація рідини через фільтрувальну тканин або через металеву сітку з одночасним затриманням твердої фази; рідка фаза проходить через сито і потім через отвори в роторі викидається в кожух центрифуги, а осад відвантажується або під час обертання ротору, або після його зупинки [13].

Недоліки процесу центрифугування полягають в:

  •  меншій ефективності у порівнянні з сепаруванням.

Сепараціяпроцес відділення твердої фази від рідкої,  оснований на відділенні часточок з різними характеристиками. Рушійною силу процесу являється відцентрова сила [13].

Ефективність сепарування пропорційна частоті обертів барабану, діаметру с барабану, розміру часток, різниці густин твердої та рідкої фаз.

По технологічному призначенню сепаратори поділяються на такі типи:

  •  фільтруючі для розділення двох взаємно нерозчинних розчинів з одночасним виділенням твердої фази;
  •  осаджувальні для відділення твердої фази від рідкої;
  •  фільтруючо-саджувальні можуть налаштовуватися як фільтруючі або як очисні в залежності від положення ротору;
  •  згущюючі для підвищення концентрації зважених чи колоїдних компонентів суспензії з одночасним розділенням у випадку емульсії;
  •  розподільчі для розподілення зважених компонентів суспензії по розміру або густині часток [13]. 

Переваги:

  •  менші втрати біомаси порівняно з фільтруванням та флотацією;
  •  можливість автоматизувати процес;
  •  більша ефективність порівняно з центрифугуванням.

2.2.3 Обгрунтування вибору способу приготування кінцевої форми продукту.

Кінцевою формою препарату «Лактин-К» є ліофільно висушений порошок, оскільки при ліофілізації не інактивуються клітини та більшим є термін зберігання препарату.

Для отримання сухого концентрату можуть застосовуватися наступні операції:

  •  вакуум-випарювання
  •  сушіння 
  •  ліофілізація

Сушінняпроцес видалення вологи шляхом її випаровування. У цьому процесі  волога переходить із твердої фази  в газову чи парову і для її  випару  до матеріалу необхідно безупинно підводити тепло [13].

Розрізняють  три  принципово різних  способи  передачі  тепла: теплопровідністю,  тобто  переходом тепла усередині  матеріалу  від однієї  молекули  до  іншої,  що  знаходиться  з  нею  в  контакті; конвекцією, тобто переносом тепла від однієї точки до іншої разом з масою   речовини   теплоносія;  тепловим   випромінюванням,   тобто передачею  тепла випромінюванням, радіацією. У реальних умовах  має місце передача тепла комбінованим шляхом, але в залежності від типу сушарки  переважає  який-небудь один  спосіб.  Для  сушіння  різних матеріалів  застосовується  різне устаткування,  тому  класифікація сушарок досить багатозначна. Їх можна підрозділити: 

  •  за способами передачі  на контактні (барабанні), конвективні,           радіаційні і комбіновані; за видами на повітряні, газові і парові;
  •  за способом руху теплоносія і матеріалуна прямоточні, протиточні і перехресні;
  •  за величиною тиску теплоносія в сушильні на атмосферні, вакуумні і високого тиску;
  •  за режимом на сушарки безперервної і періодичної дії.

Недоліком даної операції являється контакт висушуваної речовини з високою температурою та як наслідок інактивація клітин мікроорганізму, що входить у продукт [13].

Випарювання –процес концентрування рідин, що заключається у видаленні рідкої фази шляхом шляхом випаровування при кипінні.

Випарні установки поділяються:

  •  по типу теплоносія  на апарати з паровим, газовим, з підігрівом високотемпературним теплоносієм під високим тиском та з електронагріванням;
  •  по тиску всередині апарату  на працюючі під вакуумом та під надлишковим тиском;
  •  по режиму роботи  на періодичні та безперервні [13];
  •  по характеру циркуляції  на апарати з однократною циркуляцією, та багатократною;
  •  по способу подачі теплоносія  на апарати з подачею теплоносія в середину трубок та з подачею в між трубний простір;
  •  по виду теплоносія  на апарати з паровими сорочками, вертикальними внутрішніми нагрівальними трубами, змійовиками та з безпосереднім змішуванням граючої пари з рідиною.

Недоліком даного процесу являється можлива інактивація клітин [13].

Ліофілізація - спосіб м'якого висушування речовин, при якому висушуваний препарат заморожується, а потім вміщюється у вакуумну камеру, де і відбувається сублімація розчинника [13]. 

Метод ліофілізації дозволяє отримувати сухі тканини, препарати, продукти тощо без втрати їх структурної цілісності та біологічної активності. При ліофілізації більшість білків не піддається денатурації і може довго зберігатися при помірному охолодженні (близько 0 ° C). Ліофілізовані тканини і препарати при зволоженні відновлюють свої первинні властивості.

Недоліками ліофілізації є необхідність ретельної підготовки препарату до сушки, створення високого вакууму для повноти висихання, тривалість сушіння і досить високі енерговитрати.

Ліофілізацію застосовують при необхідності тривалого зберігання і консервування різних продуктів біологічного походження, для одержання сухої плазми донорської крові, сухих сироваток і вакцин, при трансплантації органів і тканин, у фармацевтичній і харчовій промисловості. У системах життєзабезпечення космічного корабля ліофілізація застосовується як один з перспективних способів регенерації води з вологозберігаючих матеріалів.

Переваги ліофілізації

  •  живі клітини, які поступають на ліофілізацію не інактивуються в процесі;
  •  збереження дисперсної фази препарату;
  •  висушену продукт можна зберігати досить тривалий термін;
  •  відсутність впливу високих температур.

У запропонованій технології виробництва пробіотичного препарату використовуються наступні операції :

  1.  сепарування;
  2.  ліофілізація.

2.2.4 Обґрунтування вибору складу поживного середовища

Для синтезу всіх клітинних компонентів мікроорганізмам потрібні поживні речовини  розчинні у воді сполуки, з яких мікроорганізми будують свою клітину. Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, повинні відповідати таким мінімальним вимогам: в них повинні бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, причому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати. До складу бактеріальної клітини входять такі елементи, % до маси сухої речовини: вуглець —; кисень —;азот-14;водень —;фосфор —;сірка, калій, натрій —; кальцій, магній, хлор,5;  залізо,2;  решта елементівблизько 0,3 [20]. 

На простих поживних середовищах не ростуть, потребують додавання глюкози, сироватки та крові, оскільки не здатні синтезувати амінокислоти, пурини, вітаміни [18].

2.2.5 Розрахунок складу поживного середовища

Розраховуємо поживне середовище для вирощування Enterococcus faecium концентрацією 10 г/лпробіотику Лактин-К за 18 год культивування.

        Розрахунок вмісту в середовищі джерела вуглецевого живлення

Потреби для синтезу біомаси. 

1.Розрахунок вмісту глюкози

У біомасі міститься 50% вуглецю, отже вміст вуглецю у 10 г біомаси становить 35 × 0,5 = 5 г. Ця кількість вуглецю міститься у 

(5 × 100) / 40 = 12,5 г

Враховуючи 40% втрат субстрату нахолосте окислення, для одержання  10  г/л біомаси у середовище необхідно внести 17,5 г глюкози.

2.Розрахунок вмісту панкреатичного гідролізату казеїну 

В казеїні міститься 55% С.Для накопичення 10 г біомаси необхідно:

(5× 100) / 55 = 9 г/л

Враховуючи 40% втрат субстрату нахолосте окислення, для одержання  10  г/л біомаси у середовище необхідно внести 12,6 г глюкози.

3. Розрахунок вмісту екстракту хлібопекарських дріжджів.

У дріжджах міститься 47% вуглецю тому кількість екстракту хлібопекарських дріжджів, що необхідна:

(5× 100) / 47 = 10,6 г/л

Враховуючи 40% втрат субстрату нахолосте окислення, для одержання  10  г/л біомаси у середовище необхідно внести 15 г екстракту хлібопекартських дріжджів.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живленняПотреби для синтезу біомаси. Припустимо, що у біомасі міститься 10 % азоту. Таким чином, у 10 г біомаси вміст азоту (за елементом N) становить (5 × 0,10) = 0,5 г. 

. Амоній лимоннокислий  є джерелом органічного азоту, який засвоюється продуцентом Лактину-К.

Така кількість азоту міститься у 0,5×100 / 20 = 2,5г/л

2. В казеїні міститься 17% N. Для накопичення 10 г біомаси необхідно:

0,5×100 / 17 = 2,9 г/л

3. У дріжджах міститься 10%  азоту, тому необхідно:

0,5×100/ 10 = 5 г/л

Джерелами інших елементів, що необхідні для клітинного росту є екстракт хлібопекарських дріжджів; КН2РО4  ; NaCl  ; MgSO4×7H2O; цистеїн.

Відомо [19] наступний склад поживного середовища для культивування Enterococcus faecium :

панкреатичний гідролізат казеїну   20; екстракт пекарських дріжджів 5,0; глюкоза  5,0; КН2РО4  2,0; амоній лимоннокислий  2,0; NaCl  3,0; MgSO4 × 7H2O 1,2; цистеїн 0,3; вода дистильована. 

Дане поживне середовище повністю задовольняє ріст культури Enterococcus faecium, що підтверджується наведеними розрахунками.

2.3 Характеристика біологічного агента

Таксономічне положення штаму Enterococcus faecium B-7050

 Рід Enterococcus не наведений в «Berdeys Manuae of Systematic Bacteriology».  Enterococcus faecium (ентерококус  фаеціум) - вид ентерококів, що входить до складу нормальної мікрофлори травного тракту людини, а також деяких ссавців. За прийнятою раніше класифікації ентерококи ставилися до стрептококів класу D і Enterococcus faecium називалися Streptococcus faecium [18].          

  Згідно з дев’ятим виданням керівництва Бергі з систематики бактерій

Enterococcus faecium належить: 

Домен: Bacteria

Відділ B: Firmicutes

Підвіділ: Бактерії з низьким вмістом ГЦ

Клас: Bacili

Порядок: Lactobacillales

Родина: Enterococcaceae

Рід: Enterococcus

Морфолого-культуральні ознаки

Ентерококи - молочнокислі бактерії грампозитивні, слабо фарбуються метиленово-синім, по краям клітини спостерігаються округлі гранули, але чіткі капсули відсутні. Інколи рухливі за рахунок небагатьох джгутиків. Не утворюючі спор та капсул, факультативні анаероби (здатні використовувати енергію                                                                                 Рис.1.Enterococcus faecium                  

бродіння, і, тому, жити і при великих , і при незначних кількостях кисню).Форма клітин сферична або овальна, розміри від 0,6 до 2,0-2,5 мкм. Розташовуються попарно або утворюють короткі ланцюжки в рідкому поживному середовищі[18].

На простих поживних середовищах не ростуть, потребують додавання глюкози, сироватки та крові, оскільки не здатні синтезувати амінокислоти, пурини, вітаміни. На щільних поживних середовищах утворюють мілкі, напівпрозорі, сіруваті колонії; на рідкихспостерігається природний ріст з утворенням осаду з пластівцями без поверхневої плівки [18].

Фізіолого-біохімічні ознаки

Е. faecium є хемоорганотрофи; метаболізм бродильного типу. Зброджують різноманітні вуглеводи з утворенням в основному L(+) –молочної кислоти, але не газ, знижуючи  рН до 4,2- 4,6. Дана культура є каталазонегативною, не містять дихальних систем з цитохромом, не утворюють газ із глюкози. Факультативні анаероби. Оптимальна температура культивування ентерококів від 35 до 37 ° С при слабко-кислих рH, концентрація NaCl 6,5% та жовчі%. В деяких випадках відновлюють нітрат. Як правило, відносяться до серологічної групи Lancefield D. Утворюють аміак з аргініну. Всі культури каталазонегативні, не містять дихальних систем з цитохромом, не утворюють газ із глюкози [6]. 

Гідролізують аргінін та гіпурат. Володіють сахаролітичною активністю по відношенню до глюкози, лактози, маніту, зброджуючи їх до кислоти без утворення газу. Не відновлюють нітрати до нітритів, не розріджують желатини, звертають молоко і розчиняють фібрин. Даний мікроорганізм сквашує молоко через 24 години, утворюючи щільний згусток. Кінцева кислотність у молоці через 14 діб культивування складала від 80 до 142 градусів Тернсра (°Т) [6].

Ентерококи високорезістентни до різних факторів зовнішнього середовища і дезінфікуючих засобів, можуть тривалий час зберігати життєздатність на предметах домашнього вжитку, витримують нагрівання до 60 ° С протягом 30 хвилин [4].

Ентерококи E. faecium колонізують переважно тонку кишку. Вони володіють високою ферментативною активністю, вираженим антагонізмом по відношенню до умовно-патогенних мікробів (виробляють ентероціни), виживають в жовчі. З одного боку, він необхідний для організму мікроорганізмом (в дослідах на тваринах було доведено, що відсутність E. faecium в кишечнику може призвести до загибелі тварини від інфекції), але, з іншого, може бути причиною різних захворювань [11]. 

Ентерококи проявляють антагоністичні властивості щодо референс-штамів умовно патогенних мікроорганізмів. Досліджувані штами виявили активність по відношенню до грампозитивних і грамнегативних умовно патогенних мікроорганізмів. E. faecium  пригнічує ріст Pseudomonas aeruginosa, Кlebsiella Pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus та Proteus vulgaris[5]. 

Було доведено, що компоненті поживного середовища впливають на антагоністичну активність ентерококів. Відсутність окремих компонентів у середовищі на якому культивується культура впливає на прояв антагонізму ентерококів щодо умовно патогенних мікроорганізмів. Антагоністична активність щодо К. Pneumoniae і S. entérica - на середовищі з глюкозою, щодо S. aureus —за присутності органічних солей [5]. 

Протягом останніх десятиліть відзначено зростання резистентності ентерококів до ванкоміцину. Частота резистентності до ванкоміцину у штамів Enterococcus faecium досягає 50%, що набагато вище, ніж у штамів найбільш часто зустрічається у людини Enterococcus faecalis (5%). До складу лікарських засобів-пробіотиків (біфіформ, линекс, лактин-к та інші) входять спеціально підібрані, що відрізняється високим рівнем антибіотикорезистентності і непатогенних штам Enterococcus faecium SF68 та    B-7050. У геномі цих штамів відсутні відомі для патогенних клінічних ізолятів ентерококів гени вірулентності: gelE (gelatinize), sprE (serine protease), esp (extracellular surface protein), fsrB (virulence factor regulator), asa1 (aggregation substance). Enterococcus faecium В-7050 чутливий до ампіциліну, піперациліну, хлорамфенікол, еритроміцин, ципрофлоксацину і фузидієвої кислоті і стійкий до метициліну, цефуроксіну, азтреонаму, міпраміну, тобраміцину, стрептоміцину[3].

2.4 Опис технологічного процес  біосинтезу 

Стадія ДР 1 Санітарна підготовка виробництва

ДР 1.1  Підготовка персоналу 

При влаштуванні на роботу та щорічно персонал, який безпосередньо зайнятий у виробництві мікробіологічних препаратів, повинен пройти медичний огляд, пройти систематичне навчання щодо санітарно-гігієнічних вимог, а також дотримуватися правил особистої гігієни.

Кожен працівник виробничого цеху повинен бути забезпечений 4 комплектами санітарного одягу, заміна одягу проводиться щоденно і у міру забруднення. Працівники перед початком роботи  повинні одягти чистий санітарний одяг, підібрати волосся під хустинку або ковпак, зняти з себе прикраси, змити лак з нігтів, ретельно вимити руки теплою водою з милом і продезінфікувати їх.

Кожен працівник на підприємстві несе відповідальність за виконання правил особистої гігієни, за стан робочого місця, за виконання технологічних і санітарних вимог на своїй ділянці.

ДР 1.2  Підготовка миючих, дезинфікуючих та миючо-дезинфікуючих розчинів

Всі мийні, дезінфікуючі розчини і суміші готує блок стерилізації, або співробітник, призначений начальником цеху, ділянки, підрозділу за наказом.

В реактори  через вимірювач об’єму (дозатор), який встановлено на трубопроводі , надходить потрібна кількість дезинфекційного або миючого розчину (каустична сода, пероксид водню, дексоцид) та змішується з водою, яка дозується через датчик об’єму. Після 10хв перемішування отримуємо розчини для миття і дезинфекції обладнання та комунікацій .

ДР1.2.1 Дезинфікуючий розчин перекису водню використовують для потреб робочого персоналу . Він є достатньо ефективним і недорогим.

Приготування 3% розчину пероксиду водню.

 На 24 л свіжої очищеної води беруть 3 л пероксиду водню (30-35 %) по ГОСТ 177-88Е і ретельно перемішують у змішувачі Зм-23.

Приготування 1 % розчину пероксиду водню.

На 24 л свіжої очищеної води беруть 1 л пероксиду водню (30-35 %) по ГОСТ 177-88Е і ретельно перемішують у змішувачі Зм-23.

ДР1.2.2 Дексоцид

Препарат дексоцид використовують для дезінфекції та ополіскування. Для приготування  дексоциду небхідно розбавити концентрований препарат водою до потрібної концентрації. Для 5 % розчину беруть 40 г дексоциду та 750 мл води, перемішують у змішувачі Зм-24. Зберігати готовий розчин слід не більше 7 діб.

ДР 1.2.3   Каустична сода

Використовується для ручного миття технологічного обладнання, приміщень, інвентарю 0.5% розчином з температурою 40°-50°С, циркуляційного промивання комунікацій та обладнання 1-2% розчином з температурою 50°-60°С. Готують у полімерних або нержавіючих ємкостях  (неприпустимо застосування ємкостей з алюмінію, тому що каустична сода викликає його корозію) . Готується в розрахунку 1,5г діючої речовини на 1л води у у змішувачі Зм-25.

ДР 1.3  Підготовка виробничих приміщень

Виробничі приміщення повинні мати між собою технологічний зв’язок і розташовуватися за ходом технологічного процесу, не допускаючи перехрещення потоків сировини та готових виробів, чистого та використаного посуду, а також повинні бути створені відповідні умови для дотримання виробничої та особистої гігієни працюючим персоналом. 

Для дотримання чистоти у виробничих приміщеннях встановлюють металеві або педальні бачки з кришками, а також корзини із полімерних матеріалів для збору санітарного браку та сміття. Бачки та корзини повинні щоденно очищатися, промиватися та дезінфікуватися дезінфікуючими засобами.

Забороняється зберігати у виробничих приміщеннях миючі, дезінфікуючі засоби, відходи, інвентар, які не мають безпосереднього відношення до виробничого процесу. Зберігання протирального інвентарю, миючих та дезінфікуючих засобів здійснюється в окремих приміщеннях. Інвентар (відра, щітки тощо) повинен бути маркірований і закріплений за виробничими, допоміжними і підсобними цехами.

ДР 1.3.1 Щоденне прибирання.

Щоденне прибирання приміщень проводять після кожної зміни вологим способом: із приміщень видаляють готову продукцію, напівпродукти, відходи виробництва, невикористані матеріали.  Вологе прибирання приміщень проводять миючим засобом, цим же розчином миють підлогу. Особливо дуже ретельно протирають дезрозчином ручки і нижні частини дверей. Обробку ведуть в гумових рукавичках, чоботах, фартусі. Зовнішні двері промивають по мірі необхідності, але не рідше 1 разу в тиждень. Вологе прибирання приміщень проводять за 1,5-2 години до початку роботи або за 30 хвилин до закінчення роботи.

Після закінчення вологого прибирання для знезараження повітря вмикають настінні або настельні бактерицидні лампи встановлені з розрахунку 2,5 Вт на 3 приміщення (за відсутності людей)  та за 30 хвилин до початку роботивиключити їх. Кількість ламп розраховують, виходячи із загальної площі і об’єму приміщення. Про заміну і режим роботи ламп ведуть запис в журналі. 

Матеріали: вода, миючий розчин.

ДР 1.3.2 Генеральне прибирання.

Генеральне прибирання приміщень проводять 1 раз на  5 днів (в день профілактики обладнання) або негайно на вимогу бактеріолога у випадку виявлення мікробної контамінації. Для обробки використовують 0,5 % розчин дексоциду. Якщо протягом місяця в приміщенні невиявлена спороутворюча мікрофлора та гриби, масову долю дексоциду  знижують до 0,3 %. Перед обробкою обезточують все обладнання та електроприлади. Стелю, стіни, двері, вікна, перегородки та обладнання оброблюють шляхом орошення із гідропульта.         Після закінчення орошення приміщення закривають на 30-40 хвилин, після чого залишки дезрозчину видаляють шляхом протирання чистою безворсовою серветкою. Для знезараження  повітря після генерального прибирання вмикають бактерицидні лампи. Проводиться прибирання і наведення порядку в шафах, стелажах. 

Матеріали: вода, р-н дексоциду приготований заздалегідь.

ДР 1.4 Підготовка технологічного обладнання

          Інвентар, що застосовується для миття і очищення, слід вибирати і використовувати так, щоб він не став джерелом контамінації. При очищенні технологічного обладнання, використовують засоби (каустична сода, «Дексоцидом» та дезинфікуючий розчин перекису водню) та інвентар призначені виключно для цих цілей.

ДР 1.4.1 Миття обладнання

Змішувачі в яких готуються захисне середовище та середовище для культивування, а також виробничий ферментер та інокулятор з посівним апаратом миють водою, розчином з масовою долею каустичної соди 2% після закінчення кожного технологічного циклу.

 При підготовці обладнання до тривалого простою, ураховуючи періодичність виробництва, після виведення продукту і знезараження всіх його залишків, ретельному промиванню підлягає обладнання всього технологічного ланцюжка.

ДР 1.4.2 Дезинфекція та ополіскування

Дезінфекцію обладнання та комунікацій проводять лише після ретельної обробки миючим розчином каустичної соди. Обладнання спочатку оброблюють розчинами «Дексоциду» та пероксду водню. А далі обполіскують водою при температурі 20°С. 

ДР 1.4.3 Перевірка на герметичність

Перевірку на герметичність проводять подаючи пару, яка створює надлишковий тиск. Значення тиску контролюють по датчику, якщо тиск падає це означеє що обладнання має дефекти. Апарат з прилеглими трубопроводами перед загрузкою середовища перевіряють на герметичність під дією повітряного тиску (0,15,19) МПа. Нещільність в фланцевих з'єднаннях, зварювальних швах знаходяться за допомогою мильної води. Знайдені пропуски усувають і проводять повторну перевірку. 

ДР 1.4.4 Стерилізація обладнання

Стерилізацію ферментера, інокулятора та посівного апарату проводять при температурі 140+2°С і тиску 0,27-0,30 МПа не менше 20 хвилин. Контроль температури проводиться в "слабкій точці" - на лінії зливу з ферментеру, інокулятора та посівного апарату. Після стерилізації конденсат, що утворився подається до знешкодження.

Стадія ДР 2 Приготування захисного середовища 

ДР2.1 Дозування сировини

 На цьому етапі відбувається дозування всіх компонентів захисного середовища,до якого входять сахароза, пептон та желатина.

ДР2.2 Приготування та стерилізація сахарози

ДР2.2.1 Приготування розчину сахарози

 Cпочатку до змішувача Зм-15 вноситься вода, а потім сахароза до концентрації 70 %  у воді для подальшої стерилізації.

ДР2.2.2 Стерилізація розчину сахарози

 Стерилізація розчину сахарози  відбувається глухою парою у змішувачі 

Зм-15, яка подається у рубашку змішувача, при 100°С вродовж 1 години та при Р = 1 атм. 

ДР2.2.3 Охолодження стерильного розчину сахарози

 Простерилізований розчин сахарози у змішувачі Зм-15 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача.

ДР2.3 Приготування та стерилізація пептону

ДР2.3.1 Приготування розчину пептону

Спочатку до змішувача Зм-17 вноситься вода, а далі при перемішуванні додається пептон до концентрації 60%, розчин залишається у змішувачі для подальшої стерилізації.

ДР2.3.2 Стерилізація розчину пептону

Стерилізація розчину пептону відбувається глухою парою змішувача Зм-17, яка подається у рубашку змішувача, при 100°С, Р = 1 атм та Т = 1 год.

ДР2.2.3 Охолодження стерильного розчину пептону

 Простерилізований розчин пептону у змішувачі Зм-17 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача. 

ДР2.4 Приготування та стерилізація желатини

ДР2.4.1 Розчинення желатини

Спочатку до змішувача Зм-19 заливається вода,а потім желатина розчиняється у внесеній воді температурою 55°С до концентрації 65% та подається на стерилізацію.

ДР2.4.2 Стерилізація розчину желатини

Приготования розчин желатини стерилізуєтся в змішувачі Зм-19 глухою парою, яка подається у рубашку змішувача,  в таких умовах : t = 100°С, T = 1 год та Р = 1 атм.

ДР2.2.4 Охолодження стерильного розчину желатини

 Простерилізований розчин желатини у змішувачі Зм-19 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача.

 ДР2.5 Змішування компонентів захисного середовища

Змішування всіх компонентів захисного середовища відбувається у змішувачі Зм-21 при 30°С.

Стадія ДР3 Приготування поживного середовища

ДР3.1 Дозування сировини

Відбувається попереднє дозування всіх компонентів поживного середовища. Доскладу поживного середовища входять наступні компоненти г/л: панкреатичний гідролізат казеїну   20; екстракт пекарських дріжджів 5,0; глюкоза  5,0;КН2РО4  2,0; амоній лимоннокислий  2,0; NaCl  3,0;MgSO4×7H2O 1,2; цистеїн 0,3. 

ДР3.2 Стерилізація панкреатичного гідролізату казеїну

ДР3.2.1 Стерилізація панкреатичного гідролізату казеїну

Розчин панкреатичного гідролізату казеїну у кількості 277,2 кг подається у  змішувач Зм-5 де стерилізується глухою парою, що подається у рубашку змішувача,  при 120°С впродовж 1 години та тиску в 1 атм. 

ДР3.2.2 Охолодження панкреатичного гідролізату казеїну

 Простерилізований розчин панкреатичного гідролізату казеїну у змішувачі Зм-5 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача.

ДР3.3 Приготування та стерилізація амонію лимонно-кислого, NaCl, MgSO4×7H2O

ДР3.3.1 Приготування розчину амонію лимонно-кислого, NaCl, MgSO4×7H2O

Спочатку до змішувача Зм-7 подається вода, потім поступають солі у к-ті 85.412 кг та при перемішуванні відбувається розчинення солей для подальшої стерилізації.

ДР3.3.2 Стерилізація розчину амонію лимонно-кислого, NaCl, MgSO4×7H2O

Приготований розчин солей впродовж 30 хвилин та при 100°С стерилізуєтся у змішувачі Зм-7 глухою парою, що подається у рубашку змішувача, при зниженому тиску, який досягається відкачуванням повітря насосом.

ДР3.3.3 Охолодження стерильного розчину амонію лимонно-кислого, NaCl, MgSO4×7H2O

 Простерилізований розчин амонію лимонно-кислого, NaCl, MgSO4×7H2O у змішувачі Зм-7 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача.

ДР3.4 Приготування та стерилізація глюкози

ДР3.4.1 Розчинення глюкози

В змішувач Зм-1 подається вода, потім 69,3 кг глюкози і при перемішуванні відбувається розчинення глюкози для подальшої стерилізації.

ДР3.4.2 Стерилізація розчину глюкози

Приготований розчин глюкози піддається стерилізації у Зм-4 глухою парою, що  подається у рубашку змішувача,  упродовж 1 години при 100°С та тиску в 1 атм.

ДР3.4.3 Охолодження стерильного розчину глюкози

 Простерилізований розчин глюкози охолоджується у змішувачі  Зм-1 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача.. 

ДР3.5. Стерилізація та охолодження екстракту хлібопекарських дріжджів

ДР3.5.1 Стерилізація екстракту хлібопекарських дріжджів

Екстракт хлібопекарських дріжджів кількістю 69,3 кг подається в змішувач Зм-3  та стерилізується глухою парою,що подається у рубашку змішувача, при 100 °С  Р = 1 атм та Т = 30 хв.

ДР3.5.2 Охолодження стерильного екстракту хлібопекарських дріжджів

 Простерилізований екстракту хлібопекарських дріжджів охолоджується  у змішувачі Зм-3 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача.

ДР3.6 Приготування та стерилізація дигідрофосфату калію

ДР3.6.1 Пригтування розчину дигідрофосфату калію

Спочатку в змішувач Зм-11 подається вода, потім 27,2 кг дигідрофосфату калію та відбувається  розчинення. Розчин залишається у цьому ж змішувачі  для подальшої стерилізації.

ДР3.6.2 Стерилізація розчину дигідрофосфату калію 

Приготований розчин дигідрофосфату калію за 40 хвилин стерилізують у змішувачі Зм-11 гострою парою, що подається у рубашку змішувача, при Т=126°С  та Р = 1,5 атм.

ДР3.6.3 Охолодження стерильного розчину дигідрофосфату калію

 Простерилізований розчин дигідрофосфату калію охолоджується у змішувачі  Зм-11 охолоджують до t=30°С подачею захолодженої води у рубашку змішувача.

ДР3.7 Приготування та стерилізація цитеїну

ДР3.7.1 Пригтування розчину цистеїну

Спочаку в змішувачі Зм-9 подається вода, потім 4,158 кг цистеїну які розчиняється у воді для подальшої стерилізації у автоклаві. 

ДР3.7.2 Стерилізація розчину цистеїну

Приготований розчин цистеїну за 1 годину стерилізують в Ав-10 при Т=100°С  та Р = 1 атм. 

ДР3.8 Змішування компонентів поживного середовища

Змішування всіх компонентів поживного середовища відбувається у Зм-13 при 30°С.

Стадія ДР4 Приготування посівного матеріалу

ДР4.1 Підтримка музейного штаму

Культура продуцента періодично пересівається і робиться контроль за за морфологічними та фізіолого-біохімічними показниками

ДР4.2 Вирощування посівного матеріалу у чашках Петрі

Вирощування відбувається на МПА з наступним технологічним та мікробіологічним контролем.Температура культивування 32° С,рH 6,0+/-0,5

ДР4.3 Вирощування посівного матеріалу в колбах на качалках

Вирощування відбувається  на середовищі наступного складу г/л: панкреатичний гідролізат казеїну   20; екстракт пекарських дріжджів 5,0; глюкоза  5,0;КН2РО4  2,0; амоній лимоннокислий  2,0; NaCl  3,0;MgSO4×7H2O 1,2; цистеїн 0,3; вода дистильована.вирощується при наступних умовах: температура 370 С, рH 6,0.

ДР4.4 Вирощування посівного матеріалу в інокуляторі

Вирощується в апараті обємом 0,2 м3 . Провадиться на середовищі: панкреатичний гідролізат казеїну   20; екстракт пекарських дріжджів 5,0; глюкоза  5,0;КН2РО4  2,0; амоній лимоннокислий  2,0; NaCl  3,0;MgSO4×7H2O 1,2; цистеїн 0,3; вода дистильована.З наступними показниками : температура 37° С, перемішування 200 об/хв, надлишковий тиск Р = 0,05 МПа.

ДР4.5 Вирощування посівного матеріалу в посівному апараті      Вирощується в апараті обє’мом 2 м3 . Провадиться на середовищі: панкреатичний гідролізат казеїну   20; екстракт пекарських дріжджів 5,0; глюкоза  5,0;КН2РО4  2,0; амоній лимоннокислий  2,0; NaCl  3,0; MgSO4×7H2O 1,2; цистеїн 0,3; вода дистильована. З наступними показниками : температура 37° С, перемішування 200 об/хв, надлишковий тиск Р = 0,05 МПа.

Стадія ТП 5 Виробничий біосинтез

ТП 5. 1  Виробниче культивування

         Для культивування у даному виробництві використовують ферментері Фм-30 V= 20 м3. 

Спочатку до ферментера подається  вода у кількості 10500-11000 л. Завантажену в ферментер воду стерилізують разом  з апаратом: ферментер герметизують і подають пару Р=0,05 МПа до сорочки ферментатора,вмикають електронагрівальний елемент і відбувається прогрівання  внутрішньої маси до t=105°-110° С протягом 1 години.

        Компоненти середовищае завантажуєть у ферментер. При цьому здійснюється контроль рН  рН-метром. Для визначення ступеня стерильності середовища його перевіряють висівом на МПА (Км).

Процес культивування проходить за наступних умов : температура 370 С, обертання валу мішалки 200 об/хв., надлишковий тиск у ферментері 0.05 МПа, культивування відбувається до концентрації клітин 1×109.

Стадія ТП 6 Відділення біомаси

ТП 6. 1  Концентрування культуральної рідини 

По закінченню культивування культуральну рідину за допомогою азоту пережимають до проміжного збірника. А далі за допомогою насосу Н-32 культуральна рідина перекачується до сепаратора. Сепарування відбувається упродовж 15 хвилин , у сепараторі Сп-33 при частоті обертання 3000. Фугат після центрифугування подається до знешкодження рідких відходів. Тверда фракція поступає до змішувача для подальшої обробки.

ТП 6. 2  Змішування з захисним середовищем

Після сепарування тверда фракція насосом Н-34 перекачується до змішувача Зм-35, де тимчасово знаходить до змішування з приготованим захисним середовищем у змішувачі Зм-37 куди натходить через насос Н-36. Змішування з захисним середовищем відбувається на протязі 30 хв, при перемішуванні та при температурі t = 34-35° С. Розливається у піддони П-39 для подальшої передачі у ліофільну сушку.

ТП 6. 3  Заморожування

Заморожування відбувається у ліофільній сушарці Лс-40 до температури -35° С на протязі 24 годин. 

ТП 6. 4  Ліофілізація

Випаровування проводиться за рахунок самовипаровування вологи поступовому підвищенні температури від t заморожування (-35°С) до температури у 22+/-3°С, на протязі 48 годин. Після ліофілізації продукт подається на подальшу фасовку.

ТП 7  Фасування препарату

Фасування відбувається у полімерну плівку по 1кг в упаковку. Фасування здійснює фасовочноупаковочний автомат з шнековим дозатором ФУ-41. Наповнення продукту в тару здійснюється за допомогою шнекового механізму. Дискретне обертання шнека з певною частотою, всередині бункера, забезпечує ущільнення та подачу необхідної дози продукту. Обєм порції продукту залежить від шагу та частоти обертання шнека. Для підвищення точності дозування проводиться контрольне зважування: після автомата встановлюється обладнання, яке зважує пакети з продуктом та відбраковує їх при відхиленні маси дози. При відхиленні в більшу або меншу сторону ваги трьох пакетів підряд на дозатор подається сигнал на зміну кількості обертів шнека. Для автоматизації подачі продукту в бункер встановлений датчик рівняоптимальна швидкість обертання шнека залежить від кількості продукту, що загружається.  

ТП 8. Фасування в ящики

1 упаковку  пакують в коробки з картону коробкового для споживчої тари за ГОСТ 7933-89Е, дану операцію здійснює апарат для фасування у коробки Па-42. В коробку укладають інструкцію з застосування, потім ці коробки обклеюють стрічкою на апараті для обклеюваня стрічкою Обо-43. В ящик фанерний посилковий пакує апарат для пакування у деревяні ящики Овп-44 згідно з ГОСТ 45-39-89 укладають 20 коробок упаковками та пакувальний лист.

ЗВ 9 Знешкодження відходів

До стадії подаються речовини та матеріали наступного походження:

  •  складові миючих та дезінфікуючих розчинів, що застосовуються на стадії санітарної підготовки обладнання та приміщень;
  •  компонентами вихідної сировини та напівпродуктів, що переробляються на стадіях.

Апаратурне оформлення виробництва не забезпечує 100%-вого використання сировини, напівпродуктів, матеріалів. Наявні втрати їх обумовлюють утворення твердих та рідких промислових відходів.

ЗВ 9.1Знешкодження рідких відходів

Виробничі стоки  на ділянці виробництва готових лікарських препаратів утворюються на стадії санітарної підготовки та промивки обладнання та разом з загальнозаводськими стоками  скидаються в міську каналізацію. Вміст специфічних речовин в стічних водах обумовлений регламентними втратами та не перевищує значення санітарно-гігієнічних нормативів.

ЗВ 9.2Знешкодження твердих відходів

Тверді некондиційні відходи виробництва збираються та направляються на полігон твердих побутових відходів.

2.5 Матеріальний баланс

Матеріальний розрахунок Лактин-К потужністю 42 тонн/рік.

Cхема виробництва

Підготовка поживного середовища

Підготовка посівного матеріалу

Ферментація

Сепарування

                                                    ↓  Підготовка захисного середовища

↓        ↓

Змішування з захисним середовищем

Ліофілізація

Фасування

  1.  Добова потужність виробництва при кількості робочих днів у році, складе :

=42/340=0,123 т

  1.  Визначення втрат Лактину-К по стадіях виробництва

Втрати на стадії ферментації-10%, під час сепарування%, на стадії ліофілізації - 3%.

Загальні втрати складуть 10+3+3=16%.

  1.  Річні втрати Лактину-К 

G(втр)р= 42×0,16=6,72

  1.  Добові втрати Лактину-К  

G(втр)д=0,123×0,16=0,019 т/добу

  1.  Річна потужність з урахуванням втрат

=42+0,36=48,72 т/рік

  1.  Добова потужність з урахуванням втрат

=0,123+0,019=0,132 т/добу

  1.  Розрахунок річного об’єму культуральної рідини з урахуванням того, щоб кінцева концентрація Лактину-К в культуральній рідині складала 10 г/л= 10 кг/м3.

=42×10³/10=4,2×10³ м3.

  1.  Добовий об’єм культуральної рідини з урахуванням того, щоб кінцева концентрація Лактину-К в культуральній рідині складала 10 г/л= 10 кг/м3 складе:

=0,134×10³/10=13,4 м3.

  1.  Розрахунок кількості ферментаційних апаратів.

Для розрахунку необхідно знати тривалість циклу роботи аппарату

Таблиця 2.5.1.

Стадія циклу

Час,год (τ)

Мийка та перевірка апарату на герметичність

,5

Стерилізація та охолодження апарату

Заповнення поживним середовищем

4

Передача посівного матеріалу

,5

Ферментація

Злив культуральної рідини

Всього

31

Обираємо виробничий ферментер об’ємом 20 м3, коефіцієнт заповнення,7, коефіцієнт запасу виробничої потужності,1. (Кз=0,7, Кзап=1,1). Обраховуємо кількість ферментерів :

= (×τ×Кзап)/(24××Кз) = (13,4×29×1,1)/(24×20×0,7) =

= 1,3=2  ферментери. Також на виробництві має бути 1 запасний ферментер.

  1.  Кількість зливів на добу ( кількість ферментацій)

Nзл =  Vд/( ×Кз) = 13,4/(20×0,7) = 1

  1.  Розрахунок завантаження сировини на одну виробничу ферментацію.

11.1)  Кількість посівного матеріалу 

Vпм = ×Кз ×0,1 = 1,4 м3.

.2) Об’єм  поживного середовища, який завантажується у ферментер становитиме :

V пс = 14 1,4 = 12,6 м3

.3) Витрати сировини на 1 ферментацію 

Таблиця 2.5.2.

Компоненти

Вміст у ПС,г/л

Витрати на ферментацію, кг

панкреатичний гідролізат казеїну   

20

252

екстракт пекарських дріжджів

5

63

глюкоза

5

63

КН2РО4

2

25,5

амоній лимоннокислий

2

25,2

NaCl

3

37,8

MgSO4×7H2O

1,2

15,12

цистеїн

0,3

3,78

Всього

485,1кг = 0,4851т = 0,4851м3

11.4) Об’єм води, що необхідно внести у поживне середовище 

= 12,60,4851 = 12,1149 м3.

) Розрахунок посівної ферментації

.1) Тривалість робочого циклу посівного аппарату

Таблиця 2.5.3.

Стадія циклу

Тривалість, год

Миття та перевірка герметичності

Стерилізація та охолодження апарату

Заповнення поживним середовищем

,5

Внесення посівного матеріалу

,5

Ферментація (посівна)

Передача посівного матеріалу у ферментер

,5

Усього

14,5

Обираємо посівний апарат об’ємом 2 м3, коефіцієнт заповнення складе 0,7, а коефіцієнт запасу,1.

.3) Розрахунок кількості посівного матеріалу. Об’єм посівного матеріалу становить 10 % від добового об’єму культуральної рідини.

Vпм = Vдоб×0,1 =   13,4 м3 × 0,1 = 1,34

12.3) Розрахунок кількості посівних апаратів

Nпа = (Vпм× τ×Кзап)/(24×Vпа×Кз) = (1,34×14,5×1,1)/(24×2×0,7) = 0,74= 1.

) Розрахунок завантаження сировини на 1 посівну ферментацію.

.1) Корисний об’єм посівного апарату

Vкор = 2 × 0,7 = 1,4 м3.

.2) Кількість посівного матеріалу, яку необхідно внести 

Vпм = 1,4×0,1 = 0,14 м3.

.3) Об’єм поживного середовища у посівному апараті

Vпс = 1,4 - 0,14 = 1,26 м3.

.4) Витрати сировини на 1 посівну ферментацію

Таблиця 2.5.4.

Компоненти

Вміст у ПС,г/л

Витрати на ферментацію, кг

панкреатичний гідролізат казеїну   

25,2

екстракт пекарських дріжджів

6,3

глюкоза

6,3

КН2РО4

2,52

амоній лимоннокислий

2,52

NaCl

3,78

MgSO4×7H2O

,2

1,512

цистеїн

,3

0,378

Всього

48,51кг = 0,04851т = 0,04851 м3

13.5) Кількість води для посівного апарату

= 1,26 - 0,04851 = 1,2149 м3.

) Розрахунок вихіду Лактину-К з однієї ферментації 

Gкс= 20 × 0,7× 10  = 140 кг,

Фактичний вихід Лактину-К :

Gкс(ф) = 140  140 × 0,1 = 126 кг.

15)Розрахунок стадії сепарування 

.1)Розрахунок втрат на стадії сепарування

Х= 126 × 0,03 = 3,78 кг.

15.2)Кількість Лактину-К після сепарування 

Gц= 126 - 3,78 = 122,22 кг.

16)Розрахунок стадії ліофілізації

.1)Розрахунок втрат на стадії ліофілізації

Х= 122,22 × 0,03 = 3,6666 кг.

.2)Кількість Лактину-К після ліофілізації

Gл= 122,22,6666 = 118,5534 кг.

Таблиця 2.5.5.

Підготовка поживного середовища

Надійшло

Кількість, кг 

Отримано

Кількість, кг

панкреатичний гідролізат казеїну   

277,2

Стерильне ПС

532,94

екстракт пекарських дріжджів

69,3

MgSO4×7H2O

16,632

глюкоза

69,3

Втрати :

  •  Залишок у системі

(0,5 %)

2,66

КН2РО4

27,2

амоній лимоннокислий

27,2

NaCl

41,58

цистеїн

4,158

Всього                             535,61

Всього                                            535,61

Таблиця 2.5.6.

Одержання інокуляту

Надійшло

Кількість, м³

Отримано

Кількість, м³

Культура з колб

,00014

Інокулят

,0014

Стерильне ПС

0,00126014

Втрати 1 %

,0000014

Всього                           0,0014014

Всього                         0,0014014

Таблиця 2.5.7.

Одержання ПМ в інокуляторах

Надійшло

Кількість, м³

Отримано

Кількість, м³

Інокулят

,0014

Інокулят

,14

Стерильне ПС

,1386014

Втрати 1 %

,00014

Всього                     0,14014

Всього                    0,14014

Таблиця 2.5.8.

Одержання ПМ в посівних апаратах

Надійшло

Кількість, м³

Отримано

Кількість, м³

Посівний матеріал

,14

Посівний матеріал

1,4

Стерильне ПС

1,3614

Втрати 1%

,014

Всього                     1,4

Всього                   1,414

 

Таблиця 2.5.9.

Виробниче культивування у ферментері

Надійшло

Кількість, м³

Отримано

Кількість, м³

Посівний матеріал

1,4

Культуральна рідина

12,6

Стерильне ПС

12,6

Втрати  10 %

1,4

Всього                            14

Всього                            14

Таблиця 2.5.10.

Стадія сепарування 

Надійшло

Кількість, кг

Отримано

Кількість, кг

Культуральна рідина

Біомаса

,22

Втрати  3 %

3,78

Всього                            126

Всього                            126

Таблиця 2.5.11.

Стадія ліофілізації

Надійшло

Кількість, кг

Отримано

Кількість, кг

Біомаса

122,22

Висушена культура

,5534

Втрати  3 %

3,6666

Всього                            122,22

Всього                            122,22

2.5.1 Розрахунок обладнання 

1.Розрахунок основного обладнання.

1.1. Виробничі ферментери.

  1.  Обсяг виробництва препарату за добу (Q1):

Q1.= Q/ τ, т/добу,

Q1.= 48,72/340=0.134 т/добу,

де Q - обсяг виробництва препарату за рік;

τ - кількість робочих днів на рік. Кількість робочих днів на рік розраховується з врахуванням витрат часу на ремонти (планові , капітальні).

.2. Кількість культуральної рідини за добу, (Q2) що необхідна для забезпечення річного обсягу виробництва 

Q2.= Q1/ q, м3

 Q2.= 0.134/0.01=13,4 м3

де Q1 - обсяг виробництва за добу;

q - вихід препарату з 3 культуральної рідини.

Для розрахованої кількості культуральної рідини за добу вибирають ферментер, об'єм (V) якого при коефіцієнті заповнення 0,7 близький до об'єму Q2. 

.3. Кількість культуральної рідини з однієї ферментації з врахуванням втрат під час ферментації (10%) становитиме:

Q3 = V × 0,7 × О,9 м3.

Q3 = 20 × 0,7 × О,9 =13,46  м3.

де Q3 кількість культуральної рідини з одної ферментації;

V - геометричний об'єм ферментера, м3;

,5 - коефіцієнт заповнення ферментера

,9 - коефіцієнт, що враховує вихід культуральної рідини з урахуванням 10 % втрат.

1.4. Кількість ферментацій за добу (n):

n = Q2 /Q3.

n = 13,4 /13,46=0,99.

де Q2 - необхідна кількість культуральної рідини за добу;

Q3 - кількість культуральної рідини з одної ферментації.

.5. Кількість культуральної рідини в рік (Q4):

Q4 = 48,72/0,01=4872 м3

де Q - обсяг виробництва препарату, т/рік;

q - - вихід препарату з 1 м3 культуральної рідини, т/ м3.

.6. Тривалість циклу (обороту) одного ферментера (τ ) Повний цикл роботи одного ферментер складається з блоків стандартних робіт підготовчого характеру та основного виробництва:

  •  тривалість виробничої ферментації (18) години;
  •  злив (вивантаження) культуральної рідини (1) годин;
  •  миття ферментеру(3) години;
  •  перевірка ферментеру на герметичність (0,5) години;
  •  стерилізація ферментеру (4) години;
  •  заповнення ферментеру поживним середовищем (4) годин;
  •  засів посівним матеріалом (0,5) годин;