64295

СПЕКТРАЛЬНІ ПРОЯВИ ВЗАЄМОДІЇ ІЗОХІНОЛІНОВИХ АЛКАЛОЇДІВ З ДНК

Автореферат

Биология и генетика

Взаємодія низькомолекулярних лігандів з ДНК має широкий спектр застосувань: медичні препарати зокрема протипухлинні та імуномодулюючі флуоресцентні зонди тощо.

Украинкский

2014-07-04

249.5 KB

0 чел.

PAGE  1

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Башмакова Наталія Володимирівна

УДК 535.34; 535.37

СПЕКТРАЛЬНІ ПРОЯВИ ВЗАЄМОДІЇ

ІЗОХІНОЛІНОВИХ АЛКАЛОЇДІВ З ДНК

01.04.05 – оптика, лазерна фізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Київ – 2010


Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі експериментальної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Наукові керівники: доктор фізико-математичних наук, професор

ЯЩУК Валерій Миколайович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри експериментальної фізики

фізичного факультету;

доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

ГОВОРУН Дмитро Миколайович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, заступник директора з наукової роботи, завідувач відділу молекулярної та квантової біофізики.

Офіційні опоненти: доктор фізико-математичних наук, професор

ОСТАПЕНКО Ніна Іванівна, 

Інститут фізики НАН України,

провідний науковий співробітник відділу фотоактивності;

доктор фізико-математичних наук, професор

КОРОТКОВ Павло Андрійович,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри медичної радіофізики

радіофізичного факультету.

Захист відбудеться «28» березня 2011 року о 1400 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.23 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр. Глушкова 4, фізичний факультет, ауд. 500.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано «24» лютого 2011 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.001.23,

кандидат фізико-математичних наук, доцент               Дмитренко О.П.


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Взаємодія низькомолекулярних лігандів з ДНК має широкий спектр застосувань: медичні препарати (зокрема, протипухлинні та імуномодулюючі), флуоресцентні зонди тощо. До таких протипухлинних препаратів належать алкалоїди чистотілу, які самі по собі і у складі комплексних препаратів проявляють противірусні, антизапальні, бактерицидні і протипухлинні властивості. Завдяки рослинному походженню ці алкалоїди мають відносно низьку токсичність. Широку терапевтичну дію алкалоїдів пов’язують з їхньою здатністю вбудовуватися у подвійну спіраль ДНК, порушуючи та блокуючи тим самим її функції. Створення малотоксичних препаратів з широкою терапевтичною дією є важливим завданням сучасної фармації. Його неможливо успішно реалізувати без розуміння фізичних механізмів взаємодії цих сполук з ДНК на молекулярному рівні.

В роботі проведено дослідження, спрямовані на встановлення фізичної сутності явищ, що відбуваються при взаємодії макромолекул ДНК з алкалоїдами чистотілу (Chelidonium majus) – берберином, сангвінарином і хелідоніном. Препарати берберину викликають підвищений інтерес дослідників, оскільки зафіксовано широкий спектр їхньої ефективної протипухлинної дії через вплив на метаболізм ракових клітин з незворотною їхньою руйнацією. Такі препарати мають відносно низьку токсичність, навіть здатні виробляти відповідний імунітет. Щодо сангвінарину, то доведено бактерицидну, протизапальну, а також протипухлинну дію цього біологічно активного алкалоїду. Досліджені алкалоїди входять до складу клінічно випробуваного протипухлинного та імуномодулюючого препарату “Амітозин”, отриманого шляхом алкилування суміші алкалоїдів чистотілу  тиотефом. Цей препарат проявляє антимітотичну активність, подібну алкалоїдам чистотілу, а також пригнічує синтез нуклеїнових кислот, подібно дії алкилуючих препаратів, до яких належить тіофосфамід, але його протипухлинна дія перевищує сумарний ефект дії алкалоїдів чистотілу, має вищу специфічність і меншу токсичність; – вибірково накопичується в ракових клітинах, практично не впливаючи на функцію найважливіших органів та систем [1*, CС.63, 85]. Одне із основних завдань роботи – встановлення внеску досліджених алкалоїдів у формування електронних спектрів “Амітозину” та визначення ролі кожного з них у спектральних проявах взаємодії препарату “Амітозин” з ДНК.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано на кафедрі експериментальної фізики фізичного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка в рамках держбюджетної науково-дослідної теми № 06БФ051-07 “Оптичні та електронні властивості гомогенних та гетерогенних систем на основі неорганічних та органічних сполук для фотоніки, біофотоніки та наноелектроніки” (2006-2010 рр., держ. реєстр. № 0106U006393), вона також пов’язана з науково-дослідною темою «Вплив амітозину та ізатізону та їх похідних на резистентність організму», яка розробляється в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України (2007-2011 рр., держ. реєстр. № 0106U005433).

Мета і завдання дослідження. Мета дисертаційного дослідження полягала у з’ясуванні фізичних механізмів зв’язування ізохінолінових алкалоїдів з ДНК за спектральними проявами їхньої взаємодії.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Дослідити спектри УФ-поглинання, флюоресценції та збудження флюоресценції ізохінолінових алкалоїдів та водного розчину препарату “Амітозин”. На основі проведених експериментів визначити фізичну природу центрів поглинання та флюоресценції.

2. Дослідити вплив ДНК на спектральні властивості алкалоїдів при її взаємодії з останніми. Встановити спектральні ознаки зв’язування (чи його відсутності) та визначити параметри комплексоутворення.

3. Встановити внесок досліджених алкалоїдів у формування електронних спектрів препарату “Амітозин” та визначити роль кожного із них у спектральних проявах взаємодії “Амітозину” з ДНК.

4. Отримати коливальні спектри алкалоїдів та їхніх сумішей з ДНК, провести аналіз та інтерпретацію смуг коливань; дослідити спектрально-коливальні прояви взаємодії алкалоїдів з ДНК.

Об'єкт дослідженняоптичні спектри алкалоїдів: берберину, сангвінарину і хелідоніну, препарату “Амітозин” та їхніх сумішей з ДНК.

Предмет дослідженняпрояви взаємодії ізохінолінових алкалоїдів з ДНК та препарату “Амітозин” з ДНК в оптичних спектрах.

Методи дослідження – спектрофотометричні методи; спектролюмінесцентні методи (спектри збудження флюоресценції, флюоресценції (ФЛ) та поляризованої ФЛ); методи коливальної спектроскопії – комбінаційне розсіяння світла (КРС), інфрачервоне поглинання (ІЧ) та квантово-хімічне моделювання.

Наукова новизна одержаних результатів. 

1. За допомогою методів спектрофотометрії та спектрофлюорометрії визначено центри поглинання, флюоресценції та фосфоресценції досліджених алкалоїдів.

2. Показано, що характер зв’язування сангвінарину та берберину з ДНК залежить від співвідношення концентрацій пар основ ДНК та алкалоїду (CДНК/Cалк). Для берберину реалізується механізм інтеркаляції, для сангвінарину при малих значеннях CДНК/Cалк – механізм зовнішнього зв’язування алкалоїдів до полімерної матриці ДНК, при збільшенні CДНК/Cалк - інтеркаляційний механізм зв’язування.

3. У спектрах КРС суміші берберину з ДНК вперше зафіксовано резонансну взаємодію коливань в області 1000-1700 см-1, яка відповідає площинним коливанням берберину та основ ДНК. Така взаємодія вказує на інтеркаляцію молекул берберину у подвійну спіраль ДНК. За порівняльним аналізом експериментального та розрахованого методом DFT коливального спектру берберину проведено його детальну інтерпретацію.

4. Вперше визначено внесок досліджених алкалоїдів у формування оптичних спектрів препарату “Амітозин”, а також внесок у спектральні прояви взаємодії “Амітозину” з ДНК.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати, що стосуються спектральних властивостей алкалоїдів у водному середовищі та їхніх сумішей з ДНК, є важливими для розуміння процесів взаємодії ліганд-ДНК і можуть бути використані як безпосередньо при фізичних дослідженнях ДНК, так і при розробці нових спектральних процедур її детектування.

Розуміння фізичних механізмів взаємодії алкалоїдів з ДНК та визначення внеску кожного з досліджених алкалоїдів у спектральні прояви взаємодії препарату “Амітозин” з ДНК створює нові перспективи для вдосконалення існуючих медичних препаратів та синтезу нових протипухлинних препаратів з широким спектром терапевтичної дії.

Закономірності комплексоутворення сангвінарину та берберину з ДНК в залежності від співвідношення CДНК/Cалк мають враховуватися при дослідженні комплексоутворення інших алкалоїдів з нуклеїновими кислотами.

Отримана детальна інтерпретація смуг коливань берберину в області 800-2000 см-1 може бути використана для аналізу взаємодії цього алкалоїду з нуклеїновими кислотами та іншими біооб’єктами.

Особистий внесок здобувача. Основний обсяг експериментальної роботи, обробка та аналіз отриманих результатів, формулювання висновків дисертаційної роботи виконані дисертантом одноосібно. Частину експериментальних досліджень проведено у співпраці з Кутовим С.Ю. та Лосицьким М.Ю.

У роботах [1,3,6-9,11] автором були отримані та проаналізовані спектри КРС берберину. Розрахунок коливань берберину проведено у співпраці з Жураківським Р.О. З аналізу експериментальних та розрахованих коливальних спектрів берберину автором отримано інтерпретацію його коливань.

У роботах [2,5,10-13,15-17] автором отримані спектри поглинання, ФЛ та збудження ФЛ водних розчинів алкалоїдів та їхніх сумішей з ДНК. З аналізу спектрів поляризованої ФЛ визначено ступінь анізотропії розчинів алкалоїдів без та у присутності ДНК. Запропоновано моделі зв’язування берберину та сангвінарину з ДНК. Розрахунок параметрів зв’язування проведено у співпраці з Гуменюком В.Г.

У роботі [4] автором отримано та проаналізовано спектри поглинання та ФЛ препарату «Амітозин» та його суміші з ДНК, оцінено внесок окремих алкалоїдів у формування оптичних спектрів «Амітозину» та внесок у спектральні прояви його взаємодії з ДНК. 

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи представлені на ІІІ міжнародній конференції “Hydrogen Bonding and Molecular Interactions” (Київ, Україна, 2006); ІІІ міжнародній конференції з молекулярної спектроскопії (Самарканд, Узбекистан, 2006); Україно-німецькому симпозіумі “Nanobiotechnology – Current State and Future Prospects” (Київ, Україна, 2006); XII міжнародній конференції “European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules” (Париж, Франція, 2007); IV міжнародній конференції “Physics of liquid matter: modern problems” (Київ, Україна, 2008); 17-й міжнародній конференції “Week of Doctoral students” (Прага, Чехія, 2008); 3-му міжнародному симпозіумі «Method and applications of computational chemistry” (Одеса, Україна, 2009); ХІХ-й міжнародній школі-семінарі “Spectroscopy of molecules and crystals” (Берегове, Україна, 2009); V міжнародній конференції “Physics of liquid matter: modern problems” (Київ, Україна, 2010); XXII міжнародній конференції “International conference on Raman spectroscopy” (США, Бостон, 2010); міжнародному симпозіумі “Baltic polymer symposium 2010” (Литва, Паланга, 2010); 11-й міжнародній конференції “International young conference optics and high technology material science” (Київ, Україна, 2010).

Окрім того, результати дисертації доповідались і обговорювались на науковому семінарі відділу молекулярної фотоелектроніки інституту фізики НАН України.

Публікації. Зміст роботи відображено у 4 статтях у наукових фахових журналах [1-4], 1 статті у збірнику наукових праць [5] та 12 тезах доповідей на наукових конференціях [6-17].

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів (огляду літератури та трьох розділів, в яких викладено результати роботи та їхній аналіз), висновків, додатку та переліку використаних літературних джерел (132 найменування). Дисертацію викладено на 143 сторінках друкованого тексту, вона містить 10 таблиць та 72 рисунка.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У першому розділі описано спектральні властивості ізохінолінових алкалоїдів та ДНК, викладено літературний огляд експериментальних досліджень взаємодії лігандів з ДНК у водних розчинах, проаналізовано існуючі моделі їх зв’язування.

У другому розділі описано методику приготування розчинів алкалоїдів та ДНК; методики досліджень спектрів поглинання, ФЛ, спектрів збудження ФЛ, визначення ступеня анізотропії флюоресценції; методику отримання спектрів КРС, ІЧ-поглинання та їхню обробку. Також наведено методики комп’ютерного моделювання коливальних спектрів.

У роботі використовували водні розчини алкалоїдів – берберину (дві форми – хлорид BeCl ("Alps Pharmaceutical", Японія) та сульфат BeS (ІМБГ НАН України)); сангвінарину хлориду (Sa) та хелідоніну хлориду (Che) (Львівський національний університет ім. І. Франка). Також використовувався водний розчин препарату “Амітозин” (ІМБГ НАН України [1*]). Використовували ДНК еритроцитів курчат (Chicken Erythrocyte, CE) та тимусу бика (Calf Thymus, CT) фірми «Serva» (Німеччина).

Спектри поглинання записували на спектрофотометрі «Specord UV VIS». Спектри флюоресценції, збудження флюоресценції та фосфоресценції досліджували за допомогою флюориметра «Cary Eclipse».

Для реєстрації спектрів КРС використано установку на базі подвійного монохроматора ДФС-24. Зразок збуджували лазерним випромінюванням з довжинами хвиль 514,5 нм (ЛГН-503, Ar+) та 632,8 нм (ЛГН-21, He-Ne). Спектри ІЧ-поглинання та відбивання досліджуваних алкалоїдів (мікрокристалічні порошки) отримано з використанням Фур’є-спектрометра «Nicolet NEXUS-470» методикою порушеного повного внутрішнього відбивання світла.

Коливальні спектри берберину розраховано методом функціоналу густини на рівні теорії DFT B3LYP/6-311++G(d,p) з використанням програмного пакету “Gaussian03” [2*].

У третьому розділі подано результати досліджень електронних станів вільних алкалоїдів та у присутності ДНК. Розділ складається з двох частин. У першій частині аналізуються спектри поглинання, флюоресценції, збудження флюоресценції та фосфоресценції чистих алкалоїдів та препарату “Амітозин”. Ідентифіковано центри поглинання та випромінювання у досліджуваних алкалоїдах та їхній внесок у спектральні властивості препарату “Амітозин”. На основі отриманих даних побудовано енергетичні діаграми найнижчих електронних рівнів, визначено положення перших збуджених синглетного та триплетного рівнів берберину та сангвінарину. У другій частині проаналізовано електронні стани алкалоїдів у присутності ДНК, отримано залежності змін оптичних параметрів при різних співвідношеннях ДНК та алкалоїду. Виявлено залежність механізмів зв’язування сангвінарину та берберину з ДНК від співвідношення CДНК/Cалк. Також проаналізовано внесок досліджених алкалоїдів у спектральні прояви взаємодії “Амітозину” з ДНК.

У четвертому розділі подано результати досліджень коливальних спектрів берберину та суміші берберину з ДНК. Отримано та проаналізовано експериментальні та розраховані спектри КРС та ІЧ-поглинання берберину, надано інтерпретацію смуг коливань берберину. Також отримано спектри КРС ДНК та суміші ДНК+берберин. В спектрах КРС зафіксовано резонансну взаємодію коливань ДНК та берберину в області 1000-1700 см-1.

Прояви взаємодії алкалоїдів з ДНК у спектрах електронного поглинання. Більшість алкалоїдів чистотілу належать до групи ізохінолінів. Ізохіноліновий фрагмент є базовим структурним блоком для різних типів структур – бензофенатридінів (сангвінарин, хелідонін та ін.), протоберберинів (берберин), протопінів та багатьох інших (рис.1).

Оптичні спектри поглинання ізохінолінових алкалоїдів обумовлені поглинанням їхніх π-електронних систем, зв’язаних з ауксохромними (ОСН3, ОН, ОСH2 і СН3) групами. В залежності від насиченості ароматичних кілець конкретного алкалоїду він може бути пласким (сангвінарин – імінна форма) або вигнутим (хелідонін, берберин, сангвінарин – алканоламінна форма). Пласкі ароматичні молекули утворюють систему зі спільними π-електронами, які поглинають як єдиний центр; в алканоламінній формі подвійний зв’язок в кільці В порушується. У спектрі поглинання сангвінарину проявляються смуги, характерні для двох форм (рис.2б). Молекула берберину, внаслідок частково насиченого кільця С, дещо вигнута [3*]. Її довгохвильовий край поглинання лежить в області 500 нм (рис.2а).

Спектр поглинання хелідоніну, за рахунок насичених кілець В та С, знаходиться у більш короткохвильовій області – до 320 нм (рис.2в). Спектр поглинання препарату “Амітозин” наведено на рис.2г. Як виявилось, він не є адитивною сумою спектрів поглинання його основних алкалоїдів.

При додаванні молекул ДНК до розчину берберину та сангвінарину в оптичних спектрах поглинання алкалоїдів спостерігаються такі ефекти:

  1.  Гіпохромізм смуг поглинання алкалоїдів (до 30-50 %), що виникає внаслідок дипольно-дипольної взаємодії π-електронних систем молекул. Цей ефект спостерігається при взаємодії з ДНК пласких молекул, у яких площини ароматичних кілець розміщуються компланарно, що можливо або при інтеркаляції (вбудовуванні молекул алкалоїду між парами основ ДНК), або при зовнішньому “стекінгу” (агрегації молекул на матриці ДНК).
  2.  Довгохвильовий зсув максимумів смуг поглинання алкалоїду (до 30 нм). Такі ефекти зазвичай спостерігаються в органічних макромолекулах внаслідок дипольно-дипольних та поляризаційних взаємодій дипольних моментів у впорядкованій системі біополімера [4*].

Гіпохромізм смуг поглинання берберину перевищує 30% і це вказує на щільне паралельне пакування молекул, яке можливе або при інтеркаляції, або при зовнішньому зв’язуванні. Але оскільки молекула берберину вигнута [5*], то повна її інтеркаляція у подвійну спіраль ДНК ускладнена.

Гіпохромізм смуг поглинання сангвінарину досягає майже 50% при малих CДНК/Cалк, що вказує на ще сильнішу, порівняно з берберином, взаємодію дипольних моментів молекул сангвінарину. Для ДНК гіпохромізм становить 40%.

Аналіз спектрів поглинання хелідоніну та суміші хелідонін+ДНК, а також порівняння різницевих спектрів поглинання Che+ДНК та Che зі спектром поглинання ДНК (рис.2в) вказують на те, що молекули хелідоніну не зв’язуються з ДНК.

Зміни в спектрах поглинання препарату “Амітозин” при додаванні ДНК є набагато складнішими, ніж для окремих алкалоїдів, що зумовлено його комплексним складом. Вони вказують на доволі складну перебудову електронної структури компонентів препарату (рис.2г).

Вплив макромолекул ДНК на флюоресценцію алкалоїдів. Зміни в спектрах флюоресценції досліджених алкалоїдів при додаванні в розчин макромолекул ДНК різні для різних алкалоїдів. Це може бути пов’язано з багатьма факторами: типом взаємодії, структурою молекули алкалоїду та ін.

Для розчину берберину з ДНК характерним є зсув максимуму ФЛ  556 нм у короткохвильову область спектра та підсилення інтенсивності випромінювання на порядки у порівнянні з власною дуже слабкою флюоресценцією вільного берберину (рис.3a). Це дозволяє, зокрема, використовувати берберин як ДНК-маркер. Зростання інтенсивності зумовлено тим, що при комплексоутворенні зменшується кількість коливальних ступенів вільності і, відповідно, – шляхів безвипромінювальної релаксації збудження.

В спектрах ФЛ сангвінарину при додаванні ДНК теж спостерігається зсув смуг ФЛ, але, на відміну від берберину, інтенсивність ФЛ сангвінарину при зв’язуванні з ДНК зменшується (рис.3б). В наших експериментах сангвінарин існує в двох формах – імінній (форма І) та алканоламінній (форма ІІ) [6*], для яких характерними є максимуми ФЛ при 587 та 420 нм, відповідно. Для форми І спостерігається «блакитний» зсув, а для форми ІІ – «червоний». Зсув максимумів ФЛ сангвінарину форми I та ІІ в протилежних напрямках може свідчити про різний характер їхнього зв’язування з ДНК. При цьому сам факт значного зсуву максимуму ФЛ 420 нм не відповідає даним [6*], де стверджується, що форма ІІ не взаємодіє з ДНК.

Інтенсивність ФЛ обох смуг в цілому зменшується, проте достатньо складною залежністю (див. далі рис.5а). Ці зміни в спектрах ФЛ також вказують на взаємодію сангвінарину з макромолекулою ДНК. Зменшення інтенсивності ФЛ може бути пов’язано зі зміною оточення флюорофора, адже зв’язуючись з ДНК, молекули алкалоїду частково ізолюються від молекул розчинника, що призводить до зменшення розчинності і гасіння флюоресценції. Всі ці ефекти стають помітними на фоні сильної власної ФЛ алкалоїду.

У спектрах ФЛ розчину хелідоніну при додаванні макромолекул ДНК суттєвих змін не спостерігалося (рис.3в), крім незначного зменшення інтенсивності спектру збудження, зумовленого поглинанням ДНК в цій області. Такі спектральні прояви свідчать про те, що хелідонін не утворює комплексів з ДНК.

Спектральні прояви взаємодії “Амітозину” з ДНК набагато складніші, ніж для окремих алкалоїдів: спектр флюоресценції суміші “Амітозин”+ДНК суттєво залежить від λзб, що проявляється в значній зміні структури спектру, появі нових максимумів у спектрі збудження та зміні квантового виходу (рис.3г). Тобто, при взаємодії з ДНК відбувається перебудова електронної структури компонентів препарату. Найхарактернішими її проявами є зростання квантового виходу флюоресценції та поява смуги 360 нм в спектрі збудження суміші. Такі зміни характерні для берберину (див. рис.3а), що вказує на визначальну роль цього алкалоїду у проявах взаємодії Амітозину з ДНК.

Анізотропія флюоресценції. Для підтвердження зв’язування між лігандами та макромолекулою ДНК отримано спектри поляризованої флюоресценції, з яких визначався ступінь анізотропії флюоресценції (r). Для розчинів вільних алкалоїдів r≈0; при додаванні ДНК ступінь анізотропії флюоресценції сангвінарину та берберину зростає, що свідчить про зв’язування молекул алкалоїдів з макромолекулою ДНК. При співвідношенні концентрацій CДНК/Cалк=2, тобто коли на одну молекулу алкалоїду припадає дві пари основ ДНК, було визначено ступінь анізотропії для розчинів досліджених алкалоїдів:

Берберин+ДНК r=0,19

Сангвінарин+ДНК r=0,25

Хелідонін+ДНК r≈0.

Зроблено висновок, що при однакових співвідношеннях концентрацій ДНК та алкалоїду, сангвінарин сильніше фіксується в подвійній спіралі ДНК, ніж берберин. Це вказує на те, що плаский сангвінарин найімовірніше повністю інтеркалює в подвійну спіраль ДНК, а вигнутий берберин – лише частково. Хелідонін взагалі не утворює комплексів з ДНК. При цьому він є одним з біологічно активних алкалоїдів у складі препарату “Амітозин”, а також основою препарату “Ukrain”. Тому перспективними є дослідження взаємодії цього алкалоїду з іншими важливими компонентами клітини (РНК, ДНК-топоізомераза тощо).

Параметри зв’язування берберину та сангвінарину з ДНК. Для кількісного аналізу комплексоутворення берберину та сангвінарину з ДНК досліджено закономірності змін в спектрах поглинання та флюоресценції в залежності від концентрації ДНК (концентраційні залежності Sa+ДНК та BeCl+ДНК). При цьому концентрація алкалоїду залишалася незмінною, а варіювалася концентрація ДНК. Співвідношення молярних концентрацій виражалося у кількості пар нуклеотидів на  молекулу алкалоїду (CДНК/Cалк).

Для визначення параметрів зв’язування берберину з ДНК було побудовано залежність інтенсивності флюоресценції берберину від співвідношення концентрацій CДНК/Cалк (рис.4). При певних значеннях CДНК/Cалк залежність виходить в насичення, що вказує на зв’язування з ДНК максимально можливої кількості молекул берберину.

Для визначення параметрів зв’язування звичайно викорис-товують рівняння Скетчарда [7*] або МакГі-фон Хіппеля [8*]. Ці рівняння не дуже зручні для аналізу, оскільки доводиться оперувати зі змінними Скетчарда (ν; , де , Сf та Сb – концентрація вільних та зв’язаних лігандів, відповідно), які досить складним чином пов’язані з експериментальними оптичними параметрами (інтенсивністю флюо-ресценції, оптичною густиною або ступенем анізотропії флюорес-ценції).

Тому для аналізу експериментальних даних (рис.4) рівняння МакГі-фон Хіппеля для кооперативного зв’язування було модифіковано і застосоване у вигляді рівняння відносно змінної Сb:

(1)

де  ,

тут n – кількість пар нуклеотидів, зв’язаних з одною молекулою алкалоїду, K – константа зв’язування (асоціації),  - повна концентрація алкалоїду, СДНК – концентрація ДНК в парах нуклеотидів, ω – параметр кооперативності (якщо ω=1, то зв’язування некооперативне, ω>1 – кооперативне, ω<1 – антикооперативне). Рівняння (1) розв’язували чисельно. В результаті апроксимації експериментальних даних (рис.4) отримано такі параметри зв’язування: К= (5,2±0,8) 104 л/Моль; n=1,85±0,1; ω=1,3±0,2.

На відміну від берберину, залежність інтенсивності ФЛ (рис.5а) розчинів сангвінарину+ДНК від співвідношення концентрацій CДНК/Cалк нетривіальна.

При значеннях  спостерігається мінімум, що вказує на залежність типу зв’язування від кількості ДНК в розчині. Для такого випадку неможливо безпосередньо застосувати рівняння МакГі-фон Хіппеля. Як виявилось, експериментальні результати найкраще описуються системою рівнянь, яка враховує два залежних процеси зв’язування лігандів: зовнішнє зв’язування з фосфатами («) та інтеркаляцію у подвійну спіраль ДНК («): , де Cf – концентрація вільних лігандів, Ca – приєднаних зовні та Cb – інтеркальованих, Ka і Kb – константи зв’язування приєднаних зовні та інтеркальованих лігандів, відповідно. Такій моделі відповідає наступна система рівнянь:

(2)

Тут перше рівняння є модифікованим рівнянням Скетчарда, друге – МакГі-фон Хіппеля для некооперативного зв’язування.

Апроксимація залежності, наведеної на рис.5а, згідно системи (2) дає такі значення параметрів: Ka=(6,7±0,4)·104 л/Mоль – константа асоціації для зовнішнього зв’язування, Kb=(5,5±0,7)·105 л/Mоль – для інтеркаляції; кількість пар основ зайнятих одним алкалоїдом: nа=0,5 (фіксований параметр) – зовнішнє зв’язування, nb =3,4 ± 0,3 – інтеркаляція. Параметри зв'язування для двох форм сангвінарину з двома типами ДНК наведено в дисертації.

Залежність ступеня анізотропії флюоресценції (r) розчину сангвінарину від CДНК/Cалк (рис.5б) свідчить про незалежність r від способу зв’язування, і вказує лише на повну кількість зв’язаних молекул в розчині.

Прояви резонансної взаємодії берберину з ДНК у спектрах КРС. Ще одне підтвердження взаємодії берберину з ДНК було отримане з аналізу спектрів КРС. Зафіксовано резонансну взаємодію коливань берберину та ДНК в області перекриття їхніх спектрів (1000-1700 см-1) при збудженні лінією генерації лазера з довжиною хвилі 632,8 нм. Прояв резонансної взаємодії в даному випадку полягав у тому, що інтенсивності ліній КРС суміші берберин-ДНК зросли на порядок і більше порівняно зі спектрами окремих компонент.

Окремо було зареєстровано спектри КРС мікрокристалічного порошку берберину (при цьому ж збудженні) (рис.6а) та розчинів ДНК при збудженні 514,5 нм у діапазоні 500-1800 см-1. Концен-трація ДНК становила 40 мг/мл.

Механізм цієї „резонансної” взаємодії поки що не з’ясовано, але така взаємодія можлива тоді, коли молекули знаходяться на близькій відстані одна від одної (за даними [9*] резонансна взаємодія внутріш-ньомолекулярних коливань сусідніх оптичних центрів можлива на відстанях до ~0,6 нм).

Для детальнішої інтерпретації цієї коливальної взаємодії було отримано та проаналізовано спектри КРС (збудження 632,8 нм) та ІЧ-поглинання полікриста-лічного порошку берберину, а також розраховано у гармонійному наближенні коливальні спектри катіону берберину та отримано інтерпретацію його коливань.

Розрахунки проведено методом DFT із застосуванням гібридного обмінно-кореляційного функціоналу електронної густини в узагальненому градієнтному наближенні B3LYP. Для розрахунків використовували набір базисних функцій 6-311++G(d,p).

Значення експериментально визначених та розрахованих частот з врахуванням частотного кореляційного множника 0,985 та інших необхідних корекцій, а також детальна інтерпретація коливань представлені в тексті дисертації.

Між розрахованим та експериментальним спектрами КРС берберину в області 1000-1700 см-1 спостерігається дуже добра кореляція (рис. 6а,б).

Для спектрів ІЧ-поглинання в досліджуваній області спостерігається добра кореляція між розрахованим та експериментальним спектрами за частотами, відповідність інтенсивностей смуг дещо гірша.

На основі отриманої з розрахунку інтерпретації коливань берберину та відомої з літературних даних інтерпретації коливань ДНК [10*] було проаналізовано спектри КРС суміші ДНК+берберин. Виявилося, що підсилилася саме та область коливань ДНК та берберину, яка відповідає площинним коливанням кілець основ ДНК та ізохінолінового фрагмента молекули берберину. Все це вказує на інтеркаляційний тип зв’язування берберину з ДНК.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі досліджено спектральні прояви взаємодії ізохінолінових алкалоїдів, які є компонентами протипухлинних препаратів, з ДНК. Основні результати роботи можуть бути сформульовані у вигляді наступних висновків:

1. Встановлено природу центрів поглинання, флюоресценції і фосфоресценції берберину, сангвінарину та хелідоніну; визначено положення їхніх перших збуджених синглетного та триплетного рівнів.

2. Аналіз спектрів поглинання, флюоресценції та збудження флюоресценції розчинів алкалоїдів з ДНК показав, що із досліджених ізохінолінових алкалоїдів зв’язуються з ДНК берберин та сангвінарин. Спектральних ознак зв’язування хелідоніну з ДНК не зафіксовано.

3. Визначено параметри зв’язування берберину з ДНК (К, n, ω) з використанням модифікованого нами рівняння МакГі-фон Хіппеля для кооперативного зв’язування. Отримане значення параметра n2 свідчить про те, що одна молекула берберину займає дві пари основ ДНК, що вказує на інтеркаляційний спосіб звязування.

4. Показано, що характер зв’язування сангвінарину з ДНК залежить від співвідношення концентрацій алкалоїду та пар основ ДНК: при CДНК/Cалк ≤2 переважає зовнішнє зв’язування, при великих CДНК/Cалк – інтеркаляція. Використовуючи систему модифікованих рівнянь Скетчарда та МакГі-фон Хіппеля визначено параметри зв’язування сангвінарину (дві форми) з ДНК.

5. В спектрах КРС суміші берберину з ДНК зафіксовано значне (на порядки) зростання інтенсивності смуг в області 1000-1700 см-1, що відповідають площинним коливанням молекули берберину та основ ДНК. Така «резонансна» взаємодія коливань вказує на близьке паралельне розташування основ ДНК та молекул берберину, що свідчить на користь інтеркаляційного механізму зв’язування. За порівняльним аналізом коливального спектру берберину, визначеного експериментально та розрахованого методом DFT, проведено детальну інтерпретацію смуг його коливань.

6. З порівняння оптичних спектрів препарату “Амітозин” зі спектрами досліджених алкалоїдів випливає, що найбільший внесок у спектральні прояви взаємодії “Амітозину” з ДНК вносить берберин. Це вказує на можливість створення нових протипухлинних препаратів на основі берберину.

7. Зроблені в роботі висновки про фізичні механізми зв’язування берберину та сангвінарину з ДНК проливають світло на можливий механізм терапевтичної дії препаратів, а саме – блокування пухлинної ДНК.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Прояв у спектрах фотолюмінесценції та КРС впливу препарату берберину на ДНК / В.М. Ящук, С.Ю. Кутовий, В.Г. Пащенко, Н.В. Башмакова, О.В. Дудко, Л.А. Заїка // Наукові записки НаУКМА. Серія: фізико-математичні науки (Національний університет "Києво-Могилянська академія"). – 2006. – Т.51, – С.42-28.
  2.  Спектроскопічні дослідження взаємодії деяких рослинних алкалоїдів з двоспіральною ДНК у водному розчині / Н.В. Башмакова, С.Ю.Кутовий, В.М. Ящук, Д.М. Говорун, М.Ю. Лосицький, Л.А. Заїка // Український фізичний журнал. – 2009. – Т.54, №5. – С.470-479.
  3.  Раманівський спектр берберину та його інтерпретація квантово-механічним методом функціоналу густини / Н.В. Башмакова, С.Ю.Кутовий, Д.М. Говорун, Р.О Жураківський, В.М. Ящук // Доповіді НАН України – 2009. – №9 – С.781-787.
  4.  Башмакова Н.В. Порівняльне дослідження біологічно активної рідини (БАР) “Чистотіл” та препарату “Амітозин” методами оптичної спектроскопії / Н.В. Башмакова // Вісник Київського національного університету. Cерія: фізика. – 2009. – №10. – C.17-22.
  5.  The DNA influence on spectral properties of the berberine, chelidonine and sanguinarine alkaloids / N.V. Bashmakova, Hovorun D.M., Kutovyy S.Yu., Losytskyy M.Yu., Yashchuk V.M., Zaika L.A. // 17th Annual conference of Doctoral students, 3-6 June. 2008: proc. of contributed papers, Part III. – Prague, 2008. – P.163-167.
  6.  The manifestation in Raman and photoluminescence spectra of the DNA-Berberine interactions / V.M. Yashchuk, S.Yu. Kutovyi, V.G. Pashchenko, N.V. Bashmakova, O.V. Dudko, L.A. Zaika // III Int.Conf. on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions: int.conf., 15-21 May 2006: book of abstracts. – K., 2006. – P. 80.
  7.  The study of the DNA-berberine interactions by the optical spectroscopy methods / S.Yu. Kutovyi, V.G. Pashchenko, N.V. Bashmakova, O.V. Dudko, V.M. Yashchuk, L.A. Zaika // ІІІ Международная конференция по молекулярной спектроскопи: междунар. конф., 29-31 травня 2006 р.: тезисы докл. – Самарканд, 2006. – C.178. 
  8.  The study of the DNA-berberine interactions by the optical spectroscopy methods / N.V. Bashmakova, S.Yu. Kutovyy, V.M Yashchuk, V.G. Pashchenko, L.A. Zaika // Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology: int. symposium, 14-16 December 2006: book of abstracts.– K., 2006. – P. 38.
  9.  The DNA-berberine interactions: manifestation in Raman and photolumi-nescence spectra / S.Yu. Kutovyi, N.V. Bashmakova, V.G. Pashchenko, O.V. Dudko, V.M. Yashchuk // XII European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules: int. conf., 1-6 september 2007: book of abstracts. – Paris, 2007. – P.112.
  10.  The manifestation in fluorescence and absorption spectra of interactions of amitozine alkaloids with DNA // V.M. Yaschuk, S.Yu. Kutovyi, N.V. Bashmakova, D.M. Hovorun, M.Yu. Losytskyi, L.A. Zaika // Physics of Liquid Matter: Modern Problems: int. conf., 23-26 May 2009: book of abstracts. – K., 2008. – P.198.
  11.  Berberine Raman spectra: experiment and quantum-mechanical interpretation by the DFT method / N.V. Bashmakova, R.O. Zhurakivsky, S.Yu. Kutovyy, D.M. Hovorun, V.M. Yashchuk, L.A. Zaika // Method and applications of computational chemistry: int. symposium, 28 June-2 July 2009: book of abstracts. – Odesa, 2009. – P.112.
  12.  The DNA-sanguinarine binding in an aqueous solution / N.V. Bashmakova, S.Yu Kutovyy., V.M. Yashchuk, D.M. Govorun, M.Yu Losytskyy // 19 International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals: int. conf., 20-27 September 2009: book of abstracts. – Beregove, 2009. – P.209-210.
  13.  Spectroscopic characteristics of sanguinarine-DNA complexation in aqueous solution / N.V. Bashmakova, D.M. Hovorun, S.Yu. Kutovyy, V.M. Yashchuk, L.A. Zaika // Physics of Liquid Matter: Modern Problems: int. conf., 21-24 May 2010: book of abstracts.– K., 2010. – P.248.
  14.  Experimental and calculated by the DFT method vibration spectra of berberine / N.V. Bashmakova, S.Yu. Kutovyy, M. Kornienko, V.M. Yashchuk, D.M. Hovorun R.O. Zhurakivsky // XXII International conference on Raman spectroscopy: int. conf., 8-13 August 2010: book of abstracts. – Boston, 2010. – PP.426-427.
  15.  The spectral manifestation of the alkaloid-DNA lattice binding / N.V. Bashmakova, V.M. Yashchuk, V.G. Gumenyuk, S.Yu Kutovyy, M.Yu. Losytskyy, D.M. Govorun // Baltic polymer symposium 2010: int. symposium, 8-11 September 2010: book of abstracts – Palanga, 2010. – P.146.
  16.  Analysis of the spectral manifestation of berberine-DNA lattice interaction in aqueous solution / V.G. Gumenyuk, N.V. Bashmakova, V.M. Yashchuk, S.Yu Kutovyy, D.M. Govorun // 11-th International young conference optics and high technology material science: int. conf., 21-24 October 2010: book of abstracts. – K., 2010. – P.230.
  17.  Parameters of the DNA-sanguinarine binding / N.V. Bashmakova, V.G. Gumenyuk, V.M. Yashchuk, S.Yu Kutovyy // 11-th International young conference optics and high technology material science: int. conf., 21-24 October 2010: book of abstracts. – K., 2010. – P.231.

СПИСОК ЦИТОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

  1.  Потопальский А.И. Препараты чистотела в биологии и медицине / А.ИПотопальский – К.: Наукова думка, 1992. – 300  с.
  2.  Gaussian 03, Revision C.02 / [Frisch M. J., Trucks G. W., Schlegel H. B. et. al.] - Wallingford:Gaussian, Inc., 2004.
  3.  Berberine alkaloid: quantum chemical study of different forms by the DFT and MP2 methods / V.I. Danilov, V.V. Danilidonis, D.M. Hovorun [et al.] // Chemical Physics Letters. – 2006. – V.430. – P. 409-413.
  4.  Ящук В.М. Динаміка електронно-коливальних збуджень в макромолекулярних системах : автореф. дис. на здобуття наук. ступеня докт. фіз.-мат. наук : спец. 01.04.05 „Оптика, лазерна фізика” / В.М. Ящук. — Київ, 2000. — 44 с.
  5.  Раманівський спектр берберину та його інтерпретація квантово-механічним методом функціоналу густини / Н.В. Башмакова, С.Ю.Кутовий, Д.М. Говорун [та ін.] // Доповіді НАН України – 2009. – N9 – P.781-787.
  6.  Influence of DNA structures on the conversion of sanguinarine alkanolamine form to iminium form / M. Maiti, S. Das, A. Sen [et al.] // Journal of biomolecular structure and dynamics. – 2002. – V.20, №3. – P.455-464.
  7.  Scatchard G. The attractions of proteins for small molecules and ions / Scatchard G. // Annals of the New York Academy of sciences. – 1949. – V.51, Molecular interaction. – P.660-672.
  8.  McGree J.D. Theoretical aspects of DNA-protein interactions: co-operative and non-co-operative binding of large ligands to a one-dimensional homogeneous lattice / J.D.McGree, P.H.von Hippel // Journal of molecular biology. – 1974. – Vol.86, Is.2. – P.469-489.
  9.  Gorban I.S. Effect of intrachain spreading of the vibrational excitations on phosphorescence of carbazole-based macromolecules / I.S. Gorban, Yu.P. Pyryatinsky, V.M. Yaschuk // Molecular materials. – 1992. – V.1. – P.241-246.
  10.  Dependence of the Raman signature of genomic B-DNA on nucleotide base sequence / H. Deng, V.A. Bloomfield, J.M. Benevides, G.J. Thomas // Biopolymers. – 1999. – V.50 – P.656-666.

АНОТАЦІЯ

Башмакова Н.В. Спектральні прояви взаємодії ізохінолінових алкалоїдів з ДНК. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 01.04.05 – оптика, лазерна фізика. Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено експериментальному дослідженню спектральними методами взаємодії алкалоїдів берберину, сангвінарину та хелідоніну і препарату “Амітозин” з ДНК у водних розчинах. Отримано та проаналізовано спектри поглинання, люмінесценції, збудження люмінесценції розчинів алкалоїдів та препарату “Амітозин” без та у присутності ДНК. Показано, що берберин та сангвінарин зв’язуються з ДНК. З апроксимації експериментальних залежностей згідно рівнянь зв’язування отримано параметри комплексоутворення берберину та сангвінарину з ДНК. Спектральних проявів взаємодії хелідоніну з ДНК не зафіксовано. Взаємодія “Амітозину” з ДНК досить складна внаслідок багатокомпонентного складу препарату. Найбільший внесок в цю взаємодію з досліджених алкалоїдів вносить берберин. Отримано та проаналізовано спектри ІЧ-поглинання та КРС берберину. В спектрах КРС суміші берберину з ДНК вперше зафіксовано резонансну взаємодію коливань берберину та ДНК в області 1000-1700 см-1. За порівнянням розрахованих та експериментальних коливальних спектрів берберину отримано детальну інтерпретацію його внутрішньомолекулярних коливань в області 800-1700 см-1.

Ключові слова: спектри електронного поглинання, флюоресценція, берберин, сангвінарин, хелідонін, “Амітозин”, ДНК, інтеркаляція, спектри КРС, спектри ІЧ-поглинання.

АННОТАЦИЯ

Башмакова Н.В. Спектральные проявления взаимодействия изохинолиновых алкалоидов с ДНК. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 01.04.05 – оптика, лазерная физика. Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2010.

Диссертация посвящена экспериментальному исследованию спектральными методами взаимодействия алкалоидов берберина, сангвинарина, хелидонина и препарата «Амитозин» с ДНК в водных растворах. Получены и проанализированы спектры поглощения, люминесценции и возбуждения люминесценции растворов алкалоидов и препарата “Амитозин” без и при добавлении ДНК. Установлена природа центров поглощения и флюоресценции, определено положение первых возбужденных синглетного и триплетного уровней, построены диаграммы нижних энергетических уровней молекул исследованных алкалоидов и переходов между ними. На основании анализа спектрофотометрических и спектролюминесцентных данных показано, что берберин и сангвинарин связываются с ДНК. Способ связывания берберина – частичная интеркаляция; сангвинарина – интеркаляция в двойную спираль ДНК и внешнее связывание с фосфатами. В результате аппроксимации экспериментальных данных согласно уравнениям связывания получены параметры комплексообразования берберина и сангвинарина с ДНК; изучена зависимость механизмов связывания алкалоидов с ДНК от соотношения количества пар основ ДНК и молекул алкалоида (CДНК/Cалк). Показано, что при малых значениях CДНК/Cалк преимущественно реализуется механизм внешнего связывания алкалоидов на матрице ДНК, при больших значениях CДНК/Cалк - механизм интеркаляции. Получены значения степени анизотропии флуоресценции алкалоидов без и при добавлении ДНК. Спектральных проявлений связывания хелидонина с ДНК не обнаружено. Изучены спектральные проявления взаимодействия “Амитозина” с ДНК. Из исследуемых алкалоидов наибольший вклад в это взаимодействие вносит берберин.

Получены и проанализированы спектры ИК-поглощения и КРС берберина. В спектрах КРС раствора берберина с ДНК впервые зафиксировано значительное (на порядки) возрастание интенсивности колебаний полос берберина и ДНК в области 1000-1700 см-1. Изменение интенсивности в этой области, которая соответствует плоскостным колебаниям молекул берберина и пар основ ДНК, указывает на близкое их расположение, что свидетельствует в пользу интеркаляционного механизма связывания. Модельные колебательные спектры берберина рассчитаны методом функционала плотности на уровне теории B3LYP/6-311++G(d,p) с помощью программного пакета “Gaussian03”. На основании сравнения рассчитанных и экспериментальных колебательных спектров берберина приведена детальная интерпретация его внутримолекулярных колебаний в области 800-1700 см-1.

Ключевые слова: спектры электронного поглощения, флуоресценция, берберин, сангвинарин, хелидонин, “Aмитозин”, ДНК, интеркаляция, спектры КРС, спектры ИК-поглощения.

ABSTRACT

Bashmakova N.V. Spectral manifestations of the interaction of the izoquinoline alkaloids with DNA. – Manuscript.

Dissertation pursuing a scientific degree of Candidate in Physics and Mathematics: speciality 01.04.05 – optics, laser physics. – Taras Shevchenko National University of Kyiv, Kyiv, 2010.

The dissertation is devoted to an experimental study of interaction of izoquinoline alkaloids – berberine, sanguinarine, chelidonine and “Amitozine” drug with DNA in aqueous solution by the optical spectroscopy methods. The absorption, luminescence and excitation spectra of the alkaloids with and without DNA have been obtained and analyzed. It was shown that the berberine and sanguinarine bind with DNA. From an approximation of the experimental data according to the modificated binding equations, complexation parameters of berberine and sanguinarine with DNA have been obtained. Spectral manifestations of the chelidonine+DNA complexation were not found. The DNA-amitozine interaction is very complicated because of the multicomponent composition of a drug. The berberine makes a main contribution to this interaction. The IR-absorption and Raman spectra of berberine were also obtained. In the Raman spectra of berberine+DNA solution resonance interaction of the berberine and DNA vibrations in region 1000-1700 сm-1 was first detected. Calculated vibration spectra of berberine were received using the DFT method at the B3LYP/6-311++G(d,p) level. Based on correlation between experimental and calculated spectra the berberine vibration spectra have been interpreted in detail in the frequency range of 800-1700 cm-1. 

 

Key words: absorption spectra, fluorescence, berberine, sanguinarine, chelidonine, “Amitozine”, DNA, intercalation, Raman spectra, IR-absorption spectra.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

42362. Electric power start up of aviation engines 689 KB
  Electric power strt up of vition engines The purpose of work is fmiliriztion with the equipment intended for ircrft onbord power circuit supply for engine strt up nd power delivery of onbord consumers. Brief theoreticl dt To supply the prticulr electric power proper to the ircrft onbord power circuit when the min engines nd uxiliry power unit re not running specil selfpropelled or towed Ground Power Units re pplied for tht purposes. It lso llows performing n electricl power strt up of min ircrft jet engines by spinning the high...
42363. Technologies of towbar towing of aircraft 2.32 MB
  Technologies of towbr towing of ircrft The purpose of work is fmiliriztion with the bsic technologicl fetures of ircrft towing nd pushbck procedure sfety of towing procedure lbour precution issues. Filure to do so cn result in dmge to the ircrft cncelltion of flight delys or disruption of trvel for our customers pssengers s well s potentil dngerous dmge to other ircrft or vehicles. Fmiliriztion with the equipment nd towbrs being used including prctice with the pushbck vehicle nd ttched towbr to chieve necessry control to follow...
42365. Двумерные графики. Дифференцирование. Интегрирование функции одной переменной. Интегрирование функции многих переменных. Действия с матрицами 218 KB
  Построить на отдельных рисунках графики функций Бесселя первого рода Jn(x) для различных ее номеров n в интервале. Функции Бесселя вызываются командой BesselJ(n,x), где n – номер функции Бесселя, x – независимая переменная. Построить первые 6 функций Бесселя для. Как они выглядят и чем отличаются друг от друга Сделать подписи осей курсивом
42366. Разработка программного обеспечения управления технической системой 694.5 KB
  Необходимо разработать алгоритм и программу управления угловым движением спутника по углу тангажа в процессе поддержания нулевых угловых отклонений относительно заданного положения. Для обеспечения проверки правильности и отладки этих алгоритмов необходимо разработать имитационную математическую модель внешней среды. Алгоритм управления должен быть реализован в управляющей БЦВМ. Она эмулируется в ПК. В рамках этой эмуляции реализуется заданная дискретная во времени работа управляющего алгоритма. В рамках данной работы недостижима отладка на системной ЦВМ.
42367. Побудова лексичного аналізатора 370 KB
  Граматика створена під впливом мов Pascal та C , зокрема аналогічно першій програма починається з ключового слова program, для початку оголошення використовується слово var. Від мови С було перейнято дужки, що позначають початок і кінець програми, ключове слово main, конструкції умови, циклу та присвоєння.
42368. Побудова синтаксичного аналізатора 198.5 KB
  Синтаксичний аналізатор отримує послідовність лексем з лексичного аналізатора і перевіряє чи може ця послідовність бути утворена за заданим алогритмом граматикою. оп ввід вивід присвоєння цикл...
42370. ВИЗНАЧЕННЯ ВІДНОШЕНЬ ПЕРЕДУВАНЬ ЗА ПРАВИЛАМИ ГРАМАТИКИ 142.5 KB
  Задачею висхідного розбору є зведення вхідного термінального ланцюжка до аксіоми. Для висхідного розбору критичним є тип виводу. Вивід зліва направо визначається таким чином, що на кожному кроці замінюється основа поточної синтенсійної форми. Тоді ланцюжок справа від основи завжди буде складатися лише з термінальних символів. Ключовим питанням при висхідному розборі є питання – як знайти основу та на який не термінал її замінити? Це питання легко вирішується для граматик простого передування.