65342

ВПЛИВ ГУМОРАЛЬНИХ ФАКТОРІВ Т-ЛІМФОЦИТІВ НА ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ КЛІТИН РАКУ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЗА УМОВ СФЕРОЇДНОГО ТА МОНОШАРОВОГО РОСТУ

Автореферат

Биология и генетика

Розуміння особливостей клітинної взаємодії при пухлинному процесі залишається актуальною медико-біологічною проблемою. З огляду на це, розроблення та впровадження простих та доступних клітинних систем для діагностики та дослідження...

Украинкский

2014-07-28

208.5 KB

0 чел.

22

PAGE  2

КИЇВСЬКИЙ  НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ПЕРЕПЕЛИЦІНА ОЛЕНА МИХАЙЛІВНА

УДК: 616-006.04:618.19:615.373

ВПЛИВ ГУМОРАЛЬНИХ ФАКТОРІВ Т-ЛІМФОЦИТІВ НА ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ КЛІТИН РАКУ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЗА УМОВ СФЕРОЇДНОГО ТА МОНОШАРОВОГО РОСТУ

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в

Київському національному університеті імені Тараса Шевченка МОН України

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна,

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

директор Навчально-наукового центру «Інститут біології», завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Островська Галина Віталіївна, 

Київський національний університет імені Тараса Шевченка,

професор кафедри цитології, гістології та біології росту

 

доктор біологічних наук, професор 

Філоненко Валерій Вікторович, 

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач відділу сигнальних систем

Захист відбудеться "19" cічня 2011 року о 16.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова 2, ННЦ «Інститут біології» (біологічний факультет) корп.12, ауд. 215)

Поштова адреса: 01601, Київ, вул. Володимирська, 64, ННЦ «Інститут біології» (біологічний факультет)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01601, Київ, вул. Володимирська, 58)

Автореферат розісланий "8" грудня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради       Цимбалюк О.В.


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

 Актуальність теми. Розуміння особливостей клітинної взаємодії при пухлинному процесі залишається актуальною медико-біологічною проблемою. З огляду на це,  розроблення та впровадження простих та доступних клітинних систем для діагностики та дослідження чинників впливу мікрооточення на розвиток новоутворень є актуальним питанням.

Багатоклітинні сфероїди (БС), або 3-D культура –  це клітинна система in vitro, яка розглядається у якості моделі пухлинного росту на аваскулярній фазі формування мікровузла [Muller-Klieser W., 1997; Kearney T. еt al., 1999; Jens M. Kelm et al., 2003]. Дані літератури свідчать про те, що ця модель поєднує в собі багато властивостей пухлин, таких як: ростову кінетику, клітинну гетерогенність, індукцію проліферативних сигналів, міжклітинну взаємодію, розвиток специфічних гістологічних структур, рівень секреції сигнальних молекул та експресію антигенів [Rolf Bjerkvig, 1992; Stuschke M. et al., 1995]. Багатоклітинні пухлинні сфероїди використовуються у дослідженнях базових біологічних механізмів: регуляція проліферації, диференціація, апоптоз, інвазія, ангіогенез та клітинна імунна відповідь [Guirado D. еt al., 2003; Zhang X. et al., 2005; Azita Monazzam et al., 2007]. Показано, що 3-D культури найбільш коректно відтворюють дію клітинного мікрооточення на розвиток пухлинного мікровузла в системі in vitro [Malathy P.V. et al., 2003].

В той же час, Т-лімфоцити є активними учасниками пухлинного процесу, виступаючи в якості модуляторів умов пухлинного мікрооточення. Раніше встановлено, що Т-лімфоцити є однією з ключових ланок реалізації гуморального імунітету особливо важливого при онкогенезі. Існує багато відомостей про те, що Т-лімфоцити є продуцентами широкого спектру цитокінів та через систему рецепторів впливають на окремі пухлинні клітини та напрямок розвитку пухлинного процесу загалом [Бережная Н.М. та ін., 2004].   Аналіз даних світової літератури показав, що не дивлячись на багаторічні дослідження пухлинних процесів, а також численні роботи з імунології онкогенезу, механізми взаємодії трансформованих клітин з клітинами імунної системи в значній мірі залишаються нерозкритими.

Прогрес в цьому напрямку пов’язують з розробкою модельних систем та комплексу параметрів для оцінки стану розвитку пухлинного процесу за різних умов мікрооточення.

Таким чином, дослідження впливу гуморальних факторів, що продукуються Т-лімфоцитами на прогресію пухлинного фенотипу на різних рівнях клітинної організації є актуальним для розвитку клітинної біології та при дослідженні біології пухлин, як з експериментальної так і з практичної точки зору.  

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу було виконано на базі кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка МОН України та Відділення біотехнічних проблем діаг-ностики Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України  (лабораторія маркерних сполук) в рамках планових науково-дослідних робіт Відділення, як фрагмент теми «Дослідження морфогенетичних (регулятивних) взаємовідносин в системі "пухлина-організм" (в експерименті)» (2005-2007р.р. № державної реєстрації 0103U006657) і теми «Дослідження можливостей спрямованого впливу на морфогенез клітинних сфероїдів in vitro.» (2008-2012р.р. № державної реєстрації 0109U007089), а також в рамках цільової програми: “Наноструктурні системи, наноматеріали, нанотехнології”  за темою “Дослідження проліферації пухлинних клітин лінії раку молочної залози MCF-7 за дії фулеренів С60 на моделі сфероїдного росту” (2008-2009р.р. № державної реєстрації 01008U003518).    

Мета дослідження. Визначити основні морфологічні, кінетичні та біохімічні показники функціонування клітин MCF-7 за умов 2- D та 3-D росту та під впливом гуморальних чинників Т-лімфоцитів як клітин-ефекторів.

Задачі дослідження.

  1.  Розробити умови формування та культивування багатоклітинних пухлинних сфероїдів клітин MCF-7 в фазі експоненційного росту.
  2.  Оцінити кінетичні параметри росту, показники адгезії клітин MCF-7 в умовах 2-D та 3-D росту та їх зміни під впливом Т-лімфоцитів.
  3.   Визначити можливий вплив Т-лімфоцитів на клітини MCF-7 в різних модельних системах з точки зору розподілу за фазами клітинного циклу популяції та морфологічних особливостей клітин.
  4.  Провести порівняльний аналіз впливу клітин-ефекторів на продукцію NO та проліферативний потенціал пухлинних клітин на моношаровій та сфероїдній моделях.
  5.  Вивчити експресію естрогенового рецептора клітинами MCF-7 при співкультивуванні з Т-лімфоцитами.

Об’єкт дослідження: популяція клітин раку молочної залози (MCF-7), яка має виражений клоногенний, проліферативний, метастатичний та інвазивний потенціал, в моделях сфероїдного та моношарового росту та під впливом гуморальних факторів Т-лімфоцитів периферійної крові.

Предмет дослідження: функціональна та морфологічна еволюція трансформованого фенотипу клітин раку молочної залози при спільному культивуванні з Т-лімфоцитами.

Методи дослідження: для отримання моношару клітин та генерації багатоклітинних пухлинних сфероїдів використовувалися методи клітинного культивування та співкультивування.  Рівень клітинної проліферації, життєздатність та стадій клітинного циклу визначалися за допомогою фарбування трипановим синім та підрахунку у камері Горяєва, МТТ-аналізу, протокової цитофлюорометрії; візуалізація культур клітин досягалася методами цитологічного забарвлення та мікрофотографування;  визначення рівня продукції оксиду азоту проводилося за допомогою реакції Грісса; для визначення впливу умов мікрооточення на експресію естрогенового рецептора використовували імуноцитохімічне забарвлення.

       Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено оригінальну методику отримання багатоклітинних сфероїдів (БС) на клітинних лініях епітеліального походження.  На моделі БС клітин MCF-7 було реалізовано багатофакторний аналіз для оцінки розвитку пухлинної популяції в системі співкультивування. Вперше порівняно модель багатоклітинних пухлинних сфероїдів та моношарового росту в умовах непрямого співкультивування з донорськими Т-клітинами імунної системи та лінією МТ-4 Т-клітинної лейкемії, котрі були попередньо стимульовані імуномодуляторами та ноотропними речовинами, з подальшою оцінкою проліферативних та біохімічних показників пухлинної культури. Це дозволило зафіксувати зменшення реактивності клітин MCF-7 в пухлинних мікроагрегатах, по відношенню до впливу гуморальних факторів від клітин імунної системи та підвищення виживаності клітин у БПС, порівняно з моношарової культурою MCF-7. Продемонстровано вплив Т-лімфоцитів, в системі співкультивування, на експресію естрогенового рецептору та рівень продукції оксиду азоту.

Встановлено, що під впливом Т-клітин зменшується відсоток апоптичних клітин MCF-7, тобто підвищується виживаність пухлинних клітин у сфероїдах та знижується їх чутливість до можливих зовнішніх впливів.

В експериментах in vitro вперше продемонстровано зв'язок між інтенсивністю проліферації пухлинних клітин, експресією естрогенового рецептора, рівнем продукції оксиду азоту та апоптозом клітин моношарової та сфероїдної культур та вплив на ці процеси Т-лімфоцитів.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи мають значення для створення діагностичних систем на базі багатоклітинних пухлинних сфероїдів для визначення напрямків та механізмів впливу протипухлинних лікарських засобів та імунобіологічних препаратів. Отримані данні можуть бути теоретичним підґрунтям для вдосконалення методів дослідження багатоклітинних пухлинних сфероїдів, отриманих з біоптатного клінічного матеріалу та взаємодії пухлинних мікроагрегатів з клітинами імунної системи. Суттєве значення  має розробка кількісних параметрів оцінки стану пухлинної мікропопуляції для визначення можливих наслідків лікувального впливу.  

 

       Особистий внесок здобувача. Автором, разом з науковим керівником, сформульовано мету і завдання дисертаційної роботи, підібрано методики, які застосовувалися у дослідженні. Автором зібрано та проаналізовано  літературу за темою дисертації. Особисто здобувачем проведені дослідження з генерації БС, з виділення та активація донорських лімфоцитів та клітин лінії МТ-4, спільне культивування клітин MCF-7 та Т-лімфоцитів. Також, особисто, проведено визначення проліферативного потенціалу клітинних ліній, рівня продукції оксиду азоту, цитологічне та імуноцитохімічне забарвлення клітин. Дисертантом, разом з науковим керівником, проаналізовано отримані дані, проведено їх статистичну обробку, здійснення узагальнення результатів досліджень, сформульовано висновки дисертації та основні теоретичні наукові підсумки.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені та обговорені на: Міжнародній конференції UICC, World-cancer congress (Geneva, 2008), на Міжнародній конференції «Нові кріобіотехнології для розв'язання фундаментальних і прикладних завдань медицини» (Харків, 2008), Міжнародній конференції ESMO «THE BREAST» (St. Gallen, 2009), на  XVI Російському Національному Конгресі «Человек и лекарство» (Москва, 2009),  на Міжнародній конференції «Биологически активные вещества, фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Україна, 2009), на XII З’їзді товариства мікробіологів України ім.С.М.Виноградського (Україна, 2009), X з’їзді Біохімічного товариства (Україна, 2010), Міжнародній конференції «Tumor and host» (Україна, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 статей, в тому чис-лі – 5 статей у провідних фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 11 тез доповідей у збірках матеріалів науково-практичних конференцій та з’їздів, зареєстровано 1 патент на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертації викладений на 146 сторінках машинописного тексту. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу матеріалів та методів досліджень, 9 підрозділів власних дослідів, обговорення отриманих результатів, висновків, списку літератури. Дисертація містить 55 рисунків, з них 8 – фото, 3 таблиці. Список використаної літератури включає 137 джерел, з них 109 - латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. В якості експериментальної модельної системи БС було використано  адгезивну лінію пухлинних клітин – MCF-7, яка бере своє походження з аденокарциноми молочної залози. Клітини мають епітеліоподібну морфологію. Диплоїдний набір налічує 46 хромосом, кількість поліплоїдів у клітинній популяції дорівнює 0,6%. В клітинах виявлено рецептори до естрогенів, синтезується естрадіол. Клітини культивувалися в моношаровій (2-D) культурі. Після кількох пасажів культуру стимулювали до утворення багатоклітинних мікроагрегатів – багатоклітинних пухлинних сфероїдів (БС або 3-D культура).   

У якості джерел факторів гуморального впливу використовували суспензійну лінію Т-лімфоцитів – МТ-4, а також донорські Т-лімфоцити, котрі були виділені з цільної крові донорів. За походженням лінія МТ-4 – це лімфоцити з крові серця та периферійної крові хворих Т-клітинною лейкемією. Морфологія клітинної лінії – лімфоїдна. Спосіб культивування суспензійний. Диплоїдний набір налічує 46 хромосом, кількість поліплоїдів біля 0,4%, клітини чутливі до вірусу імунодефіциту людини.

Донорські лімфоцити виділяли з цільної крові здорових донорів, розділяли на фракції Т- та В-лімфоцитів та використовували у системі співкультивування.

Клітини MCF-7 культивували у повному поживному середовищі DMEM (Sigma, США). Середовище містило 10% ембріональної телячої сироватки – ЕТС (Sigma, США), 2 мМ  L-глутаміну (Sigma, США) і 40 мкг/мл сульфату ген-таміцину (Біофарма, Україна). Культивування відбувалося за стандартних умов при 37оС, 5% СО2, 100% вологості. Оптимальна щільність клітин – 2,0-4,0∙104 клітин/мл. Процедуру пересіву клітин МТ-4  повторювати кожні  3–4 дні.

Суспензійну культуру клітинної лінії МТ-4 культивували у середовищі RPMI 1640 (Sigma, США) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки – ЕТС (Sigma, США) та 2 мМ  L-глутаміну (Sigma, США) при 37оС, 5% СО2, 100% вологості. Оптимальна щільність культивування для клітинної лінії МТ-4 становила 5 – 9∙104 клітин/мл.   Процедуру пересіву клітин МТ-4  повторювати кожні 2 – 3 дні.

Для одержання БС клітини лінії MCF-7 інкубували за стандартних умов, в повному поживному середовищі, у флаконах (25 см2, Nunc, Данія). Після досяг-нення клітинами повного конфлюенту їх знімали з використанням розчину Версена (0,025 М ЕДТА, рН 7,2) з 0,25% трипсином (Chemapol, Чехія), та висад-жували на чашки з малоадгезивними властивостями з початковою щільністю 5∙104 клітин/мл. Потім додавали КМ-целюлозу до кінцевої концентрації 0,24%.

Т-лімфоцити з донорської крові виділялися за допомогою ультрацентрифугування гепаринізованої крові у градієнті щільності фіколл-урографін. Для розділення фракцій Т- та В-лімфоцитів використовували метод тонкого розділення розеткоутворюючих клітин з еритроцитами барана.

Для визначення ролі факторів мікрооточення на основні показники функціонування клітин MCF-7 за умов моношарового та сфероїдного росту Т-лімфоцити (МТ-4 та донорські лімфоцити) висаджували в нітроцелюлозні камери (Sigma, США , розмір пор 0,2мкм), котрі в подальшому переносили у лун-ки з клітинами  MCF-7 для співкультивування. Співкультивування проводили непрямим «безконтактним» способом у 6-лункових планшетах протягом 48 годин.

Кількість живих та мертвих клітин визначали у камері Горяєва після фарбування 0,4% трипановим синім  в розрахунку на 1 мл середовища.

Визначення кінетики росту клітинних популяцій та проліферативної активності при культивуванні клітин MCF-7 за умов моношарового та сфероїдного росту та в присутності Т-лімфоцитів проводили з використанням  МТТ-тесту. Це дозволяло відносити до живих усі клітини, котрі знаходилися на різних стадіях клітинного циклу, навіть в стадії реплікативного спокою.  

Для вивчення адгезивних характеристик 2-D та 3-D культур підраховували кількість клітин у суспензійній та адгезивній фракціях при співкультивуванні та без впливу Т-лімфоцитів. Для визначення розподілу клітин за фазами циклу, рівня апоптозу та проліферативної активності на всіх термінах культивування клітин використовували метод протокової цитофлуориметрії, за методикою Nicoletti et al.[Nicoletti I. et al.,  1991].

Для визначення кількості іонів міжклітинного нітриту використовували колориметричний метод Грісса [Green L.C., 1982]. Метод дозволяє отримати дані про кількість NO2- у культуральному середовищі з подальшим перерахунком на загальну кількість міжклітинного оксиду азоту. Оптичну густину зразка вимірювали за допомогою мультилункового сканеру Labsystems Multiskan MS, при довжині хвиль 540 нм. Дані оптичного поглинання співставляли зі стандар-тною калібрувальною кривою кількості нітриту.

Морфологічні особливості моношарової та сфероїдної культур фіксували за допомогою цитологічного забарвлення за методом Ван-Гізона та фотографування стадій їх росту.

Імуноцитохімічні дослідження проводили з використанням Envision G/2 System (Dako, Данія). Експресія естрогенових рецепторів вивчалася на моношаровій культурі при культивування клітин на покривних скельцях в системі співкультивування з Т-лімфоцитами.

Результати досліджень та їх обговорення.  В роботі було отримано багатоклітинні пухлинні сфероїди аденокарциноми молочної залози, лінії MCF-7 та проведено порівняння ключових характеристик 2-D та 3-D моделей клітинного росту. Для виконання цієї задачі було обрана методика Jens M. Kelm, яка, в подальшому, була модифікована та запатентована як корисна модель.

Моношарову та сфероїдну культури було порівняно за кількома параметрами: морфологія клітин, показники росту та проліферації моношарової та сфероїдної культур, розподіл клітин за фазами клітинного циклу, експресії естрогенових рецепторів та рівень міжклітинного оксиду азоту. Морфологія клітин моношару та багатоклітинних сфероїдів вивчалася за допомогою забарвлення по методу Ван-Гізона та була зафіксована на мікрофотографії. Клітини контрольних зразків моношарової культури були розпластані по поверхні субстрату, з утворенням фокальних контактів за допомогою цитоплазматичних відростків, мали оптично прозору цитоплазму з чітко визначеним ядром. На зразках можливо було спостерігати  різні фази мітозу (телофазу, анафазу). Клітини сфероїдної культури утворювали багатоклітинні агрегати діаметром від 500 до 1200 мкм, пухкої структури. Фракція суспензійних клітин  у БС складала від 53% до 67%, в залежності від якостей субстрату. В культурі спостерігалася біля 20% окремих клітин.

Визначалися кінетичні показники росту моношарової та сфероїдної культур за стандартних умов культивування. Кінетика росту 2-D та 3-D культур мали достовірні розбіжності вже після першої доби культивування. При однаковій «стартовій» кількості клітин (1,2∙ 105 кл/мл), у культурі сфероїдів, після 24 годин культивування, кількість живих клітин досягала 1,75 ∙ 105 кл/мл, в той час як моношарова культура налічувала тільки 1,48 ∙ 105 кл/мл. Але, вже через добу, сфероїдна культура втрачала темпи приросту (2,52∙105 кл/мл), а моношарова суттєво приростала (2,75∙105 кл/мл). На 3 добу культивування ця різниця темпів приростання культур зберігалася: 2,87∙105 кл/мл у БС проти 3,12∙105 кл/мл у моношарі). Такі розбіжності пояснюються особливостями клітинної організації двох моделей. У моношаровій культурі всі клітини мають однаковий доступ до поживних речовин, тому виснаження культурального середовища та зниження проліферативного потенціалу на протязі перших 3 діб культивування відбувається поступово. У 3-D культурі, вже після першої доби культивування, формується внутрішній та зовнішній шари клітин з різним доступом до поживних речовин, тому ця культура, в цілому, є більш чутливою до нестачі поживних речовин у середовищі культивування. Для перевірки цього припущення  було порівняно виживаність клітин адгезивної (прикріпленої до субстрату)  та суспензійної фракцій обох моделей після 48 годин культивування.  Виявилось, що клітини у суспензійній фракції моношару та сфероїдів були менш чутливі до виснаження культурального середовища ніж у адгезивній фракції моношару. Розв’язати це протиріччя дозволило цитофлюориметричне дослідження, яке дозволило порівняти розподіл клітин за фазами клітинного циклу. На 5 добу культивування у безсироватковому культуральному середовищі спостерігається різний розподіл клітинних популяцій моношару та сфероїдів за фазами клітинного циклу. Так в S-фазі знаходилися 52% клітин моношару та тільки 37% клітин сфероїдів. А в  G2/M фазі перебували 8% клітин моношару та 22% клітин сфероїдів. До того ж збільшувався відсоток апоптичних клітин в сфероїдах, порівняно з моношаром, з 11% до 17%. При цьому перерозподіл клітин MCF-7 у сфероїдах на користь G2/M фази клітинного циклу, одночасно зі збільшенням клітин в апоптозі може свідчити про перехід клітинної популяції на знижений рівень споживання, що сприяє виживаності клоногенної субпопуляції пухлинних клітин та продовженню проліферації в умовах збіднення середовища. Знижений рівень апоптозу та підвищений відсоток клітин у синтетичній фазі моношарової культури свідчить про затримку клітин у S-фазі через нестачу ростових, або вплив рост-інгібуючих сигналів.

За допомогою реакції Грісса було вивчено кількість міжклітинного оксиду азоту в моношаровій та сфероїдній культурі за різних умов мікрооточення та порівняно з проліферативним потенціалом клітин у зразках (рис.1). Встановлено, що концентрація оксиду азоту на 1 млн. клітин складає в моношаровій культурі в середньому 3,2 пмоль, а в сфероїдній культурі – 8,5  пмоль.

               

Рис.1.  Концентрація екзогенного оксиду азоту у моношарі та сфероїдах (А) та кількість живих клітин у моно шарі та сфероїдах (Б). * р ≤ 0,01, ** р < 0,05 порівняно з моношаром.

Різниця в показниках може бути пов’язана як з морфологічними відмінностями моношарової та сфероїдної культури так і з підвищеною активністю NOS у трансформованих клітинах при прогресії пухлинного процесу. Досліди на тваринах продемонстрували підвищену швидкість росту, васкулярізації та інвазії пухлин, клітини котрих продукували підвищений рівень NO. Підвищений рівень міжклітинного NO, в свою чергу може викликати утворення вільних радикалів та незворотні порушення у генетичному матеріалі та структурах клітин мікрооточення.  

Виявлення експресії естрогенових рецепторів (ЕР) проводили методом імуноцитохімії. Естрогенові рецептори спостерігалися як в цитоплазмі так і в ядрі клітин. Наявність рецепторів вказувала на те, що пухлина є естроген-чутливою. ЕР виявлялися за допомогою антитіл та хромогену Perma Red (DAKO), який має червоний колір.

Отримані результати дозволили оцінити  основні характеристики клітинної популяції в контролі. Які в подальшому були досліджені під впливом клітин-ефекторів.

У якості клітинних джерел ефекторного впливу, посередників між організ-мом та пухлиною було обрано Т-лімфоцити. Зрілі лімфоцити виконують основ-ні захисні функції противірусного та протипухлинного імунітету. Головними клонами зрілих Т-лімфоцитів є CD4+ (Т- хелпери) та CD8+ (Т-супресори) клітини. Клітини клону CD8+ Th1 секретують INFγ, IL-2, TNFα, TGFβ, а клону CD4+ (Th2) – IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, які активують цитотоксичні лімфоцити та макрофаги, стимулюють клітинний імунітет та процеси запалення. Для посилення продукції інтерферону та інших цитокінів Т-лімфоцитами (МТ-4 та донорські лімфоцити) клітини інкубували з інтерфероногенними противірусними препаратами (тілорон, Poly(I):рoly(C)) та ноотропними препаратами (кортексин, церебролізин та церебрал) у концентраціях від 2 до 500 мкг/мл, з послідовним розведенням. В подальшому використовували препарати, які в попередніх дослідах продемонстрували найбільший вплив на Т-лімфоцити: тілорон, Poly(I):рoly(C), церебролізин та церебрал. В результаті, тілорон та Poly(I):poly(C) мали діаметрально протилежні ефекти, при однакових умовах культивування та концентраціях. Так, тілорон стимулював проліферацію МТ-4 тільки до концентрації 0,002 мг/мл, а подальше підвищення концентрації призводило до різкого (у 3 рази)  падіння кількості живих лімфоцитів. Рoly(I):poly(C) навпаки, поступово стимулював проліферацію клітин, що підтверджується підвищенням кількості МТ-4 більш ніж у 2 рази після інкубації з речовиною (концентрація 0,008 мг/мл) (рис.2).

Рис.2. Кількість живих клітин МТ-4, при інкубуванні з імуногенними та ноотропними препаратами (к- контроль, 1- церебрал, 2- кортексін, 3- церебролізин, 4- тілорон, 5- Poly(I):poly(C) (* р < 0,05, ** р ≤ 0,01).

Методом протокової цитофлюорометрії було зафіксовано перерозподіл Т-клітин за клітинним циклом під впливом препаратів. Так було встановлено, що після інкубування з імуногенним та нооторопними препаратами розподіл донорських Т-лімфоцитів та МТ-4 за фазами клітинного циклу зміщується в сторону збільшення долі клітин у синтетичній фазі. Для МТ-4, при концентрації нооторопних речовин 0,6 мг/мл, а противірусних 0,125мг/мл ці показники збільшуються, відносно контролю, для церебралу на 17,66%, для тілорону - на 40,75%, для церебролізину на 28,06% та для Рoly(I):poly(C) – на 33,31%. Перерозподіл відбувався переважно за рахунок зменшення частки клітин у фазах спокою та пресинтетичній. Таким чином, всі препарати, в тій чи іншій мірі, стимулювали Т-клітини до виходу з фази спокою та пресинтетичної та до переходу у синтетичну фазу реплікації ДНК. Одночасно кількість живих клітин різко знижувалася при інкубуванні з тілороном та збільшувалася при Рoly(I):poly(C). Оскільки імуногенні препарати в концентрації 0,125 мг/мл призводили до суттєвого збільшення проліферативної активності Т-лімфоцитів, для подальшого дослідження було обрано саме її.

При порівняльному аналізі впливу Т-лімфоцитів, як клітин-ефекторів, на функціонування моношарової та сфероїдної клітинних популяцій крім цитологічних характеристик клітинних популяцій (співвідношення кількості живих та мертвих клітин, виживаність культури, розподіл на суспензійну та адгезивну фракції, морфологічні зміни) було досліджено вплив Т-лімфоцитів на молекулярно-біохімічні клітинні процеси,  які призводять до цитологічних змін, зафіксованих при співкультивуванні (рівень міжклітинного  NO, експресія естрогенового рецептору).

Встановлено, що при співкультивуванні з Т-лімфоцитами адгезивні якості клітин MCF-7 суттєво змінюються. Після інкубування з Т-лімфоцитами, клітини втрачають більшість контактів з субстратом, стають шароподібними, оптично щільними, через що неможливо спостерігати фази мітозу. Морфологія клітин нагадує апоптичні тільця. Культура БС також змінюється. Після співкультивування з Т-лімфоцитами (інтактними) клітинні агрегати не досягають розмірів 400 мкм, розпадаються на окремі клітини. Суспензійна фракція БС збільшується на 36% за рахунок окремих клітин у суспензії.

За допомогою МТТ-тесту та підрахунку кількості живих та мертвих клітин (рис.3, 4) було продемонстровано, що показники проліферації клітин в моношаровому та сфероїдному рості суттєво залежать від присутності Т-лімфоцитів.

            

Рис.3. Кількість живих клітин у адгезійній та суспензійній фракціях сфероїдної культури в контролі (А) та при співкультивування з МТ-4 (Б) на низькоадгезивному субстраті (підрахунок з трипановим синім). *р < 0,05, **р ≤ 0,01. 

 

  

Рис.4. Залежність кількості живих клітин MCF-7 від часу інкубації при моношаровому (1) та сфероїдному (2) рості в контролі (А) та при співкультивуванні  з МТ-4 (Б) на низькоадгезивному субстраті.

Дослідження показали, що існує пряма залежність інтенсивності проліферації клітин та їх міграції від характеристик субстрату та моделі клітинного росту. Причому, якщо моношарову культуру гуморальні фактори стимулюють до інтенсивної проліферації, то сфероїдна культура, навпаки, під впливом зазначених факторів втрачає проліферативний потенціал. До того ж, моношарова модель клітинного росту більш реактивна щодо зовнішніх паракринних впливів, ніж сфероїдна.

Виживаність клітин та їх чутливість щодо умов культивування залежить переважно, від моделі культивування (рис.3, 4, 5). Було зазначено, що при спів-культивуванні з клітинами МТ-4 у БС зменшується кількість мікроагрегатів та збільшується кількість поодиноких клітин, а у моношаровій культурі збільшується суспензійна фракція клітин. При цьому МТ-4 мали протилежний вплив на виживаність пухлинних клітин у суспензійній та адгезійній фракціях. Якщо кількість живих клітин у адгезіі знижувалася, то у суспензії – збільшувалася. При високій проліферації клітин моношарової культури, це може відбуватися за рахунок активної міграції клітин з адгезії у суспензію (рис.5).

Рис.5. Виживаність клітин MCF-7 у моношарі при співкультивуванні з активованими клітинами МТ-4 (0,125 мг/мл діючої речовини).

Аналіз перерозподілу клітин за клітинним циклом (рис.6, 7) продемонстрував, що у БС під впливом активованих Т-лімфоцитів (як донорських так й МТ-4) відбувається збільшення клітин у фазі спокою та зменшення відсотку апоптичних клітин, що призводить до підвищення виживаності пухлинних клітин у сфероїдах та зниження їх чутливості до можливих зовнішніх впливів.

Рис.6. Розподіл клітин у багатоклітинних сфероїдах співкультивованих з активованими лімфоцитами (1- контроль сфероїди, 2- МТ-4+тілорон, 3- МТ-4+ Poly(I):poly(C), 4-донорські лімфоцити+тілорон, 5-донорські лімфоцити+ Poly(I):poly(C)). *р < 0,05.  

Якщо у інтактних сфероїдах відсоток клітин у синтетичній фазі досягає 36,36%, то у співкультивованих БС відбувалося зниження цього показника до 22,7% при співкультивуванні з донорськими лімфоцитами, активованими аміксином,  та 8,9% - при співкультивуванні з МТ-4, активованими Poly(I):poly(C). Таке зниження кількості клітин у синтетичній фазі може відбуватися за рахунок двох процесів: по-перше, затримка додатково біля 10% клітин на фазі спокою та пресинтетичній, по-друге, прискорене входження в мітоз, від 5% до 20% клітин. Кількість апоптичних клітин  у багатоклітинних сфероїдах під впливом клітин МТ-4 знижувалася більш ніж на 50%. Доля апоптичних клітин у сфероїдах при співкультивуванні складала від 2% до 7,5%, в залежності від умов активації Т-лімфоцитів, при контролі у 15,8% (рис.7).  

Рис.7. Відсоток клітин у апоптозі в багатоклітинних сфероїдах співкультивованих з активованими лімфоцитами (1- контроль сфероїди, 2- МТ-4+тілорон, 3- МТ-4+ Poly(I):poly(C), 4-донорські лімфоцити+тілорон, 5-донорські лімфоцити+ Poly(I):poly(C)). ** р ≤ 0,01.

 Рівень міжклітинного NO, має пряму кореляцію зі ступенем розвитку пухлинного процесу. При співкультивуванні присутність цитокінів від активованих донорських Т-лімфоцитів та МТ-4 та активація іNO-синтази у середовищі культивування змінюють інтенсивність утворення оксиду азоту епітеліальними клітинами. Це, в свою чергу призводить до пригнічення апоптозу для всіх зразків. У разі одночасного підвищення рівня NO, зниження апоптозу та активації естрогенового рецептору можна зробити висновок про несприятливий прогноз перебігу пухлинного процесу.              

Відносно ЕР, спостерігалася не тільки суттєва активація ЕР цитокінами від Т-лімфоцитів, але вона мала пряму кореляцію з кількості внесеного К-середовища (зафіксовано для Рoly(I):poly(C)) та була різною для імуногенних препаратів, які використовувалися. Активація Т-лімфоцитів інтерфероногенними препаратами та подальше внесення К-середовища до MCF-7 викликала збільшення транскрипції ЕР всередині клітини. Це, в свою чергу, призводило до підвищення чутливості  пухлинних клітин до пара- та аутокриних про-проліферативних сигналів цитокінової регуляції. В результаті, Т-лімфоцити стимулювали проліферацію MCF-7, знижували адгезію до субстрату, що в свою чергу призводило до збільшення кількості пухлинних мікроагрегатів у суспензії стимулюючи клоногенний та метастатичний потенціал пухлинних клітин.

ВИСНОВКИ

Продемонстровано, що Т-лімфоцити, через систему гуморальних сигналів (цитокінів, хемокінів) здатні підвищувати проліфераційний, метастатичний та клоногенний потенціал клітин раку молочної залози в пухлинному мікровузлі.

  1.  В роботі відпрацьовано культивування та визначення параметрів розвитку клітинних моделей моношарового та сфероїдного росту, системи «безконтактного» співкультивування клітин MCF-7 та Т-лімфоцитів.
  2.  Встановлено, що проліферативна активність, виживаність клітин та адгезивна здатність клітин у 2-D та 3-D культурах in vitro мають достовірні розбіжності вже після першої доби культивування. Гуморальні фактори Т-лімфоцитів стимулюють моношарову культуру до інтенсивної проліферації, зниження адгезивних контактів з субстратом та падіння виживаності. Натомість сфероїдна культура, навпаки, під впливом зазначених факторів, втрачає проліферативний потенціал, збільшується її адгезивна фракція, а виживаність залишається на рівні контролю.
  3.  При цитофлуориметричному дослідженні було виявлено, що під впливом Т-лімфоцитів у багатоклітинних сфероїдах достовірно (р ≤ 0,01) знижується частка апоптичних клітин та клітин у S фазі (р < 0,05). На противагу, частка клітин у фазі G0/G1 збільшується. Одночасно в 2-D культурі, в контролі, спостерігається перерозподіл клітин на користь синтетичної фази (52%), а в присутності Т-лімфоцитів збільшується частка клітин у G0/G1 фазі.
  4.  Встановлено, що контрольні концентрації іонів NO для багатоклітинних сфероїдах є цитотоксичними для моношарової культури. Для сфероїдів контрольні показники вищі та знаходяться у діапазоні 17,5-18,0 нмоль/л, для моношару – 8,5-9,0 нмоль/л. Причому виживаність клітин MCF-7, у цих діапазонах, має зворотну залежність від концентрації NO. Співкультивування з Т-лімфоцитами призводить до зниження загального рівня міжклітинного NO та підвищення проліферативного потенціалу пухлинних клітин.
  5.  За результатами імуноцитохімічного фарбування відмічено суттєве посилення експресії ЕР клітинами MCF-7 в моношарі при додаванні К-середовища від МТ-4, активованих імуногенними препаратами.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

  1.  Perepelitsyna O.M. Formation of Multicellular Aggregates under Different conditions of microenvironment / Perepelitsyna O.M., Garmanchouk L.V., Sydorenko M.V., Ostapchenko L.I.// Cytology and genetics. 2010. Vol.44, №1. P. 1922.(Особистий внесок здобувача: культивування клітин у  моделі багатоклітинних сфероїдів, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)
  2.  Perepelitsyna O.M. Growth Kinetics of 2- and 3-D Cell Models as Influenced by the Microenviroment / Garmanchouk L.V., Perepelitsyna O.M., Sydorenko M.V., Ostapchenko L.I.// Cytology and genetics. 2009. Vol.43, №.5. P. 305310.(Особистий внесок здобувача: культивування 2-D та 3-D клітинних модлей, співкультивування з Т-лімфоцитами, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)
  3.  Perepelitsyna O.M. Reactivity and  sensibility of breast adenocarcinoma (MCF-7) in coculture depends on architecture of cells model / Perepelitsyna O.M.,Garmanchouk L.V., Sydorenko M.V., Ostapchenko L.I. // Physics of the Alive 2008. Vol.16, № 2. P.105111. (Особистий внесок здобувача: культивування 2-D та 3-D клітинних модлей, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)
  4.  Перепелиціна О.М. Влияние гуморальных факторов, продуцируемых Т-лимфоцитами, на пролиферацию и выживаемость клеток MCF-7 / Перепелиціна О.М., Гарманчук Л.В., Кобельська О.С.,Сидоренко М.В. // Імунологія та алергологія. –  2008. – № 2. – С.88–90. (Особистий внесок здобувача: культивування Т-лімфоцитів, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)
  5.  Перепелиціна О.М. Сравнительное изучение иммунокорригирующего действия нейропептидных препаратов при острой эксперементальной цереброваскулярной патологи /А.Е. Кульчиков, О.С. Моложавая, О.В. Скачкова, Л.В. Гарманчук, М.В. Сидоренко, Е.М. Перепелицына, Н.Н.Храновская, А.Н. Макаренко // Цитокины и воспаление. 2009. №3. С 1823. (Особистий внесок здобувача: культивування Т-клітин з імунокоригуючими препаратами, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.).
  6.  Перепелиціна О.М. Цитопротекторное действие нейропептидов на иммунокомпетентные клетки (исследование in vitro) /Гарманчук Л.В., Перепелицына Е.М., Сидоренко М.В., Макаренко А.Н., Кульчиков А.Е./ Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009. Т.79,№ 4. С 2832. (Особистий внесок здобувача: культивування імунних клітин, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.).
  7.  Перепелиціна О.М. Патент на корисну модель “Спосіб тестування біологічно активних сполук на їх придатність як лікарських засобів”/ Перепелиціна О.М., Гарманчук Л.В., Сидоренко М.В // № 35037, від 26.08.08.(Особистий внесок здобувача: культивування 2-D та 3-D клітинних модлей, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні патенту.)
  8.  Perepelytsina O.M. Development of multicellular tumor spheroids of breast adenocarcinoma (MCF-7) under influences of T-lymphocytes / Perepelytsina O., Garmanchouk L., Nepiyvoda K., Gergeliuk T., Ostapchenko L., Sydorenko M.// Int.conference “Тumor and host”.2010. – V.32, supplement, p. 32.
  9.  Perepelytsina O.M. Immunotherapy and development of the culture breast cancer / O.M. Perepelytsina, L.V. Garmanchouk, M.V. Sidorenko, O.S. Kobelska, N.J. Spivak, A.N. Makarenko // Annals of Oncology. 2009. Vol.20. supplement 2, P. 85.
  10.  Perepelitsyna O.M. Indirect influence of cocultures MT-4 on multicellular spheroids of breast adenocarcinoma (MCF-7) / Perepelitsyna O.M.,Garmanchouk L.V., Sydorenko M.V.// UICC08, World cancer congress. 2008. POS-B146.

АНОТАЦІЯ

Перепелиціна О.М. Вплив гуморальних факторів Т-лімфоцитів на особливості функціонування клітин раку молочної залози за умов сфероїдного та моношарового росту. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Київський  національний університет імені Тараса Шевченка, Київ - 2010.

Дисертація присвячена дослідженню впливу Т-лімфоцитів на розвиток клітин MCF-7 в моделях моношарового (2-D) та сфероїдного (3-D) росту.

Встановлено що, гуморальні фактори Т-лімфоцитів стимулюють 2-D культуру до інтенсивної проліферації, зниження адгезивних контактів з субстратом та падіння виживаності. Натомість 3-D культура, навпаки, втрачає проліферативний потенціал, збільшується її адгезивна фракція, а виживаність залишається на рівні контролю.

При цитофлуориметричному дослідженні було виявлено, що під впливом Т-лімфоцитів у БС достовірно знижується частка апоптичних клітин та клітин у S фазі. Одночасно в 2-D культурі, в контролі, спостерігається перерозподіл клітин на користь синтетичної фази (52%), а в присутності Т-лімфоцитів збільшується частка клітин у G0/G1 фазі.

На модельних системах 2-D та 3-D росту встановлено, що контрольні показники концентрації NO для сфероїдів вищі та знаходяться у діапазоні 17,5-18,0 нмоль/л, для моношару 8,5-9,0 нмоль/л. Співкультивування з Т-лімфоцитами призводило до зниження загального рівня міжклітинного NO та підвищення проліферативного потенціалу пухлинних клітин.

За результатами імуноцитохімічного фарбування відмічено суттєве посилення експресії ЕР клітинами MCF-7 в моношарі при додаванні К-середовища від МТ-4, активованих імуногенними препаратами.

Ключові слова: багатоклітинні сфероїди, Т-лімфоцити, гуморальний вплив, проліферація, адгезія, рівень  NO, експресія естрогенового рецептору.

АННОТАЦИЯ

Перепелицына Е.М. Влияние гуморальных факторов Т-лимфоцитов на особенности функционирования клеток рака молочной железы в условиях монослойного и сфероидного роста.  – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. – Киевский  национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев - 2010.

 Диссертация посвящена исследованию влияния Т-лимфоцитов посредством гуморальных сигналов на функционирование клеток рака молочной железы в монослойной (2-D) и сфероидной (3-D) моделях клеточного роста. Под функционированием подразумевалось исследование процессов пролиферации, адгезии, клеточного цикла, продукции межклеточного оксида азота и экспрессии  эстрогенового рецептора (ЕР).

 Для решения поставленной задачи была модифицирована методика получения многоклеточных сфероидов Kelm JM et al., 2003 и проведено сравнительное исследование популяционных, морфологических и биохимических характеристик клеток рака молочной железы, культивируемых в двух клеточных системах.  Для исключения влияния межклеточного взаимодействия опухолевые клетки и Т-лимфоциты сокультивировались «бесконтактным» способом.

В экспериментальном исследовании установлено, что пролиферативная активность, выживаемость и адгезионные характеристики клеток 2-D и 3-D культур in vitro имеют достоверные отличия. Гуморальные факторы Т-лимфоцитов стимулируют монослойную культуру к интенсивной пролиферации, снижению адгезионных контактов с субстратом и снижению выживаемости клеток.  В то же время, сфероидная культура, наоборот, под влиянием Т-лимфоцитов теряет пролиферативный потенциал, увеличивается ее адгезионная фракция, а выживаемость остается на уровне контроля.

При цитофлюорометрическом исследовании было выявлено, что под влиянием Т- лимфоцитов в многоклеточных сфероидах достоверно (р ≤ 0,01) снижается доля апоптических клеток и клеток в S фазе (р < 0,05), а доля клеток в фазе G0/G1 увеличивается. В тоже время в 2-D культуре, в контроле, наблюдалось перераспределение клеток в пользу синтетической фазу (52%), а в присутствии Т-лимфоцитов увеличивается доля клеток в G0/G1 фазе.

На модельних системах монослойной и сфероидной культур установлено, что контрольные концентрации ионов NO для многоклеточных сфероидов являются цитотоксическими для клеток монослойной культуры. Для сфероидов контрольные показатели концентрации межклеточного  NO находятся у диапазоне 17,5-18,0 нмоль/л, для монослоя 8,5-9,0 нмоль/л. Существенная разница в показателях может быть связана с морфологическими особенностями монослойной и сфероидной систем культивирования. Причем, выживаемость клеток MCF-7 при этих концентрациях имеет обратную зависимость от концентрации  NO. По данным других авторов, концентрация межклеточного NO, имеет прямую корреляцию со степенью развития опухолевого процесса. При сокультивировании присутствие в среде цитокинов от активированных донорских Т-лимфоцитов  и клеток МТ-4, возможно, приводило к активации іNO-синтазы, что в свою очередь изменяло интенсивность образования оксида азота эпителиальными клетками. Одновременно наблюдалось угнетение апоптоза для всех клеточных образцов. В случае одновременного повышения уровня межклеточного NO, снижения апоптоза клеток и активации естрагенового рецептора можно сделать выводы о неблагоприятном прогнозе течения заболевания. Таким образом, клетки с высоким клоногенным потенциалом способны жить и пролиферировать при повышенной концентрации  NO. Высокая концентрация межклеточного NO, в свою очередь, может вызвать образование свободных радикалов, необратимые нарушения в генетическом материале и внутриклеточных структурах.  Исследования на животных подтвердили гипотезу о прямойкорреляции степени развития опухолевого процесса с уровнем межклеточного оксида азота, продемонстрировав повышенную скорость роста, васкуляризации и инвазии опухолей, клетки которых продуцировали повышенный уровень NO. Сокультивирование монослойной культуры MCF-7 с Т-лимфоцитами приводит к снижению общего уровня межклеточного NO и повышения пролиферативного потенциала опухолевых клеток, а для сфероидной культуры наблюдалась противоположная тенденция.

По результатам иммуноцитохимического окрашивания отмечено существенное усиление экспрессии эстрогенового рецептора клетками MCF-7 в монослойной культуре при инкубировании с кондиционированной (К-) средой от Т-лимфоцитов. При этом степень экспрессии ЕР зависела прямо пропорционально от количества внесенной К-среды. Таким образом, в результате исследований было отмечено стимулирование Т-лимфоцитами экспрессии ЕР клетками MCF-7. Это, в свою очередь, повышает чувствительность опухолевых клеток к про-пролиферативным сигналам цитокиновой и гормональной регуляции.  

Сокультивирование MCF-7 с активированными Т-лимфоцитами вызывало повышение количества живых клеток, снижение адгезии, стимулировало экспрессию ЕР и снижение доли апоптических клеток.  В целом, по результатам исследований можно сделать вывод про то, что Т-лимфоциты, через систему гуморальных сигналов (цитокинов и хемокинов), способны повышать пролиферационный, метастатический и клоногенный потенциал клеток рака молочной железы в опухолевом микроузле.  

Ключевые слова: многоклеточные сфероиды, Т-лимфоциты, гуморальное влияние, пролиферация, адгезия, уровень  NO, экспрессия эстрогенового рецептора.

SUMMARY

Perepelytsina O.M. Influence of T-lymphocytes humoral factors on function of breast adenocarcinoma cells in monolayer and spheroids growth. –Manuscript.

Thesis for the Degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Biology, speciality 03.00.11.- Cytology, cell biology and histology.- Taras Shevchenko Kiev national university, Kiev - 2010.

The dissertation investigates the impact of T-lymphocytes in the development of MCF-7 cells in monolayer (2-D) and spheroid (3-D) models.

It’s found that T-cells humoral factors stimulated the monolayer culture to intensive proliferation, reduced adhesive contacts with the substrate and the fall of survival. Instead spheroid culture under the influence of these factors lost proliferate capacity, increasing its adhesive fraction, and survival remains on the control level.

Cytofluorymetry study revealed that under the influence of T-lymphocytes in 3-D model reduced the share of apoptotic cells and cells in S phase. In contrast, the proportion of cells in G0/G1 phase increases the powering. At the same time 2-D culture, in control, there cells redistribution in favor of synthetic phase (52%) and in the presence of T lymphocytes increases the powering proportion of cells in G0/G1 phase.

For spheroids control concentration of NO ion benchmarks are higher and were in zone 17,5-18,0 nМ, for monolayer – 8,5-9,0 nM. Cocultivation with T-lymphocytes leads to decreasing overall level of intercellular NO and increased proliferate capacity of tumor cells.

As a result of immunocytochemical staining seen a significant strengthening of ER expression by MCF-7 cells in 2-D after adding a conditioned medium from MT-4 culture which were activated by immunogenic preparations.

Key words: multicellular spheroid, T lymphocytes, humoral influence, proliferation, adhesion, the level of NO, expression estrogen receptors.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

28834. Французская социологическая школа 46.5 KB
  Говорил о существовании коллективного сознания – совокупность общих у членов одного и того же общества интересов верований убеждений чувств ценностей. исследовал структуру сознания и личности Изучая структуру сознания Жане подчеркивал что все высшие проявления духа строятся на основе низших где действие чувство и разум слиты воедино. Трехуровневая структура сознания: элементарные ощущения затем память а на ней базируется Я или личность. Ввёл в психологию понятие – поле сознания это наибольшее число простых или относительно...
28835. Генетическая психология 54.5 KB
  Генетическая психология Швейцарский психолог Жан Пиаже 18961980 – один из наиболее известных ученых чьи работы составили важный этап в развитии генетической психологии. Научные интересы Пиаже еще с юности были сосредоточены на биологии и математике. Пиаже начинает читать лекции в Женевском университете и работать в Женевском доме малютки. В середине 20 в Пиаже создает свой основной труд Введение в генетическую эпистемологию возглавляет Международный центр по генетической эпистемологии в составе Женевского университета.
28836. Гуманистическая психология 47.5 KB
  Гуманистическая психология как альтернатива психоанализу и бихевиоризму: представления о природе человека экзистенциальная философия предмет и методы исследований Основные методологические принципы и положения гуманистической психологии: а человек целостен и должен изучаться в его целостности; б каждый человек уникален поэтому анализ отдельных случаев case study лучше чем статистические обобщения; в человек открыт миру переживание человеком мира и себя в мире главная психологическая реальность; г человеческая жизнь должна...
28837. Когнитивная психология 54 KB
  психологии порождено скорее общим направлением и логикой развития психологии чем открытиями конкретных ученых тем не менее деятельность двух психологов в наибольшей степени способствовала её возникновению. Миллер создал первый научный Центр когнитивной психологии и начал разрабатывать новые методы изучения познавательных процессов восприятия памяти мышления речи и проводили анализ их генезиса. Положительное в метафоре компьютера то что интеллект не рассматривается как набор последовательных малосвязанных этапов переработки информации...
28838. Естественно-научная парадигма в русской психологии 74 KB
  Роль психологии вооружить общество знаниями о психических явлениях и о законах деятельности души направить развитие нравственности морального поведения человека. Когда рефлекс обрывается не перейдя в движение не получив внешнего выражения завершающая часть рефлекса а она несет в качестве движения познавательную нагрузку уходит вовнутрь превращается в мысль хотя и незримую но продолжающую служить организатором поведения. Поэтому в механизме поведения реализуемом по типу рефлекса действует рефлекторное кольцо. Павлова: предмет и...
28839. Русская философская психология 74 KB
  Предмет психологии это наука о явлениях духа а не о его сущности – сущность человек понять не может давалось обоснование исследовательского метода интроспективный анализ и индуктивное – из частного общее обобщение описывались основные психологические законы законы ассоциаций по сходству смежности и причинности предлагалась классификация разделов психологии и давался очерк истории психологии. В лекциях Троицкого по психологии обнаруживается сочетание разнообразных подходов к психическому: вопреки эмпирической установке которая в...
28840. Развитие экспериментальной психологии в дореволюционной России 73.69 KB
  Развитие экспериментальной психологии в дореволюционной России. Формирование современной объективной психологии было основной целью которой посвящены практически все сочинения Введенского. Главный свой труд он так и назвал – Психология без всякой метафизики 1917 подчеркивая этим и необходимость и возможность построения объективной психологии. Работы Введенского имели большое значение для отечественной психологии соединяя воедино европейскую и российскую традиции в понимании задач и предмета психологии а также различных способов...
28841. Развитие отечественной психологии в 20-40-е годы ХХ века 51.5 KB
  Развитие отечественной психологии в 2040е годы ХХ века Октябрьская революция оказала значительное влияние на развитие российской науки в целом и психологии – в частности. С другой стороны молодое Советское государство начало последовательно оказывать помощь психологической науке – создаются институты с исследовательскими лабораториями Двадцатые годы стали временем рождения советской психологии.задачи психологии: 1. вычленяются два основных методологических принципа марксистской психологии: материализм психика продукт деятельности...
28842. Педология в Советской России: основные направления работы достижения 44.5 KB
  Генетический принцип означал принятие во внимание динамики и тенденции развития. Ребенка можно изучать лишь с учетом его социальной среды которая оказывает влияние не только на психику но часто и на антропоморфические параметры развития. Наука о ребенке должна быть не только теоретической но и практической Общие моменты развития педологии В россии начала распространяться в нач 20 в. Разница между этими подходами была не только во взглядах на роль наследственности и среды но и насколько биологические механизмы лежащие в основе психического...