65430

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ТА УДОСКОНАЛЕННЯ МЕТОДІВ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ І КРІОКОНСЕРВАЦІЇ ЕМБРІОНІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

Автореферат

Биология и генетика

За останні 30 років трансплантація ембріонів великої рогатої худоби перетворилася на міжнародну індустрію в якій щорічно одержують пересаджують і кріоконсервують понад 500 тисяч ембріонів Thibier M. Незважаючи на велике прикладне значення трансплантації ембріонів потенційні можливості...

Украинкский

2014-07-29

318.5 KB

2 чел.

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН

НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ АГРАНИХ НАУК УКРАЇНИ

ШАРАН МИКОЛА МИХАЙЛОВИЧ

УДК 636.4.32/38:581.1

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ТА УДОСКОНАЛЕННЯ МЕТОДІВ ТРАНСПЛАНТАЦІЇ І КРІОКОНСЕРВАЦІЇ ЕМБРІОНІВ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

03.00.20 – біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Львів – 2010


Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин Національної академії аграрних наук України.

Науковий консультант —  доктор сільськогосподарських наук, професор Шаловило Степан Григорович,

Львівський національний університет ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького, завідувач кафедри технології виробництва молока і яловичини

Офіційні опоненти:  доктор сільськогосподарських наук, професор, академік НААН України

Безуглий Микола Дмитрович,

Національна академія аграрних наук України,         віце-президент

доктор сільськогосподарських наук, професор               Шеремета Віктор Іванович,

Національний університет біоресурсів і природокористування України, професор кафедри розведення та генетики тварин імені М. А. Кравченка

доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

Остапів Дмитро Дмитрович,

головний науковий співробітник Сектора клінічної біохімії Інституту біології тварин НААН України

Захист дисертації відбудеться “22червня 2010 р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 Інституту біології тварин НААН України за адресою: вул. В. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин НААН України за адресою: вул. В.Стуса, 38, м. Львів, 79034.

Автореферат розісланий 21травня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                     О. І. Віщур


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За останні 30 років трансплантація ембріонів великої рогатої худоби перетворилася на міжнародну індустрію, в якій щорічно одержують, пересаджують і кріоконсервують понад 500 тисяч ембріонів (Thibier M., 2000). Незважаючи на велике прикладне значення трансплантації ембріонів, потенційні можливості методу далеко не повністю використовуються у практиці відтворення тварин (Шаловило С. Г. зі співавт., 2007; Яблонський В. А., 2004).

У технології трансплантації ембріонів індукція поліовуляції є важливою ланкою, від ефективності якої залежить кінцевий результат. У цьому напрямку накопичений значний матеріал, але до цього часу  викликання суперовуляції залишається нестабільним і маловивченим питанням (Бугров О. Д., 2008; Смолянінов Б. В. зі співавт., 2004, 2008).

Новим і перспективнішим методом кріоконсервування ембріонів є їх надшвидке заморожування у рідкому азоті в середовищах з високими концентраціями проникаючих кріпротекторів. Хоч у кріоконсервуванні ембріонів досягнуто великого прогресу, виживаність ембріонів, підданих заморожуванню, суттєво знижується. Актуальними залишаються й питання, пов’язані з забезпеченням стабільності результатів заморожування, пошук нових, менш токсичних і ефективніших кріоконсервантів, спрощення методів кріо- і деконсервування (Безуглий М. Д., 2002; Осташко Ф. І. зі співавт., 2008).

Важливе теоретичне і практичне значення у впровадженні трансплантації ембріонів у практику скотарства має з’ясування ролі окремих чинників, що впливають на їх приживлення у реципієнтів. Сучасна технологія забезпечує приживлення трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів в межах 50 %, тому проблема підвищення імплантації ембріонів залишається надзвичайно важливою і потребує додаткових досліджень (Шеремета В. І., 1997; Gouveia Nogueira M. F. et al., 2002; Сергеев Н. И. и соавт., 2008).

В останні роки дослідники у всьому світі приділяють значну увагу розробці принципово нової біотехнології, яка поєднує використання трансплантації ембріонів, культивування і запліднення ооцитів in vitro. Незважаючи на істотні результати, досягнуті в роботах з отримання ембріонів in vitro, залишаються невирішеними численні проблеми, зокрема, культивування ооцитів і зигот, значне зниження приживлюваності розвинутих ембріонів, порівняно з ембріонами, отриманими in vivo. Так, після нехірургічної трансплантації in vitro отриманих ембріонів їх рівень приживлення поки що залишається невисоким і не перевищує 40 % (Мадіч А. В., 2004; Betteridge KJ., 2006; Остапів Д. Д., 2008).

Оскільки трансплантація і кріоконсервування ембріонів дають можливість зберігати генетичні ресурси і при потребі швидко відновити поголів’я, необхідно постійно проводити поглиблені наукові дослідження з метою удосконалення вказаних біотехнологічних методів відтворення тварин.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертації є частиною науково-дослідної роботи лабораторії трансплантації ембріонів Львівського філіалу Інституту розведення і генетики тварин УААН у 1996–2000 рр. “Вдосконалити методи відбору донорів і реципієнтів та підвищити ембріопродуктивність і приживлення трансплантованих ембріонів” (№ держреєстрації 0198U009013) і лабораторії біотехнології відтворення Інституту біології тварин УААН, яка виконувалась в межах завдання 2001–2005 рр.: “Дослідити фізіолого-біохімічні процеси фолікуло-, ово- і ембріогенезу та розробити способи підвищення відтворної здатності корів і свиноматок нових генотипів” (№ держреєстрації 0101U003421) та завдання 2006–2010 рр. 28.02/021-03. “Розробити методи корекції відтворної функції сільськогосподарських тварин з використанням сучасних біотехнологій” (№ держреєстрації 0106U003045).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було на основі теоретичних узагальнень та досліджень з використанням сучасних біотехнологічних методів відтворення удосконалити технологічні елементи трансплантації і кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

  •  дослідити ефективність застосування внутрішньошкірних ін’єкцій стероїдних гормонів як тестів відбору потенційних корів-донорів і реципієнтів;
  •  вивчити ефективність застосування гонадотропінів у складі ліпосомальної емульсії для індукції суперовуляції у корів-донорів;
  •  дослідити вплив біологічно активних речовин (естрофан, інозин, унітіол, глутатіон, L-цистеїн), введених зі спермою бугаїв, на заплідненість та якість ембріонів корів-донорів;
  •  вивчити кріопротекторні властивості мембраностабілізучих речовин (інсолвіту, лінолевої кислоти та холестеролу) при надшвидкому заморожуванні ембріонів корів;
  •  встановити залежність приживлюваності ембріонів від мінерального живлення корів-донорів в умовах Західної геохімічної провінції;
  •  дослідити вплив біологічно активних речовин (БАР), фармацевтичних засобів та біотехнологічних прийомів на підвищення приживлення трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів;
  •  розробити методи підвищення приживлюваності ембріонів, одержаних in vitro.

Об’єкт дослідження: методи трансплантації і кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби.

Предмет досліджень: біотехнологічні елементи трансплантації і кріоконсервування ембріонів великої рогатої худоби.

Методи досліджень: біотехнологічні (стимуляція поліовуляції, штучне осіменіння, вимивання ембріонів, їх морфологічна оцінка і трансплантація, кріоконсервування ембріонів), біохімічні (визначення показників білкового, вуглеводного і ліпідного обміну крові і тканин статевих органів, радіоімунологічне та імуноферментне визначення стероїдних гормонів), гістологічні (висота покривного і залозистого епітелію та кількість маткових залоз) і статистичні (біометрична обробка результатів).

Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично і експериментально обґрунтовано, розроблено і апробовано в умовах виробництва нові біотехнологічні методи інтенсифікації відтворення великої рогатої худоби. Науково обґрунтовано та удосконалено основні методи технології трансплантації ембріонів (добір корів-донорів і реципієнтів, індукція поліовуляції і штучне осіменіння корів-донорів), кріоконсервування зародків.

Вперше досліджено алергічну реакцію на введення стероїдних гормонів для удосконалення добору корів-донорів і реципієнтів, а також кріопротекторні властивості мембраностабілізуючих речовин (інсолвіт, лінолева кислота, холестерол) при надшвидкому методі кріоконсервування ембріонів.

Вивчено залежність функціонування статевих органів телиць-реципієнтів та приживлення трансплантованих ембріонів від мінерального живлення в умовах Західної біогеохімічної провінції та розроблено способи його корекції.

Досліджено вплив біологічно активних речовин (БАР), фармацевтичних засобів та біотехнологічних прийомів на підвищення приживлюваності трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів і, зокрема, одержаних in vitro.

Практичне значення одержаних результатів. На основі теоретичних узагальнень та проведених досліджень удосконалено технологію трансплантації ембріонів великої рогатої худоби. Зокрема, розроблено алергічний метод добору корів-донорів і реципієнтів (Патент на корисну модель №41798 від 10.06.2009), а також спосіб гормональної стимуляції суперовуляції пролонгацією дії препаратів фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) з використанням ліпосом (Патент на корисну модель №46282 від 10.12.2009).

Для збільшення кількості ембріонів, придатних для трансплантації, розроблено спосіб підвищення ембріопродуктивності у корів-донорів застосуванням комплексу БАР (естрофан, інозин, унітіол, глутатіон, L-цистеїн) із спермою бугаїв.

На основі вивчення кріопротекторних властивостей мембраностабілізуючих речовин удосконалено надшвидкий метод кріоконсервування ембріонів (Деклараційний патент № 2003032130 від 5.05.2003).

Для підвищення приживлюваності трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів запропоновано комплекс заходів: корекція мінерального живлення, застосування аналога гонадотропін-рилізінг гормону (Гн-РГ) з БАР (інсолвіт, імукор, диметилсульфоксид (ДМСО), оптимальне поєднання седативних препаратів та міорелаксантів, бластомерів дегенерованих ембріонів.

Основні положення і практичні пропозиції викладені у «Довіднику з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби» (2004), методичних рекомендаціях «Підвищення ефективності штучного осіменіння корів і телиць», схвалених Науково-технічною радою Головного управління агропромислового розвитку Львівської облдержадміністрації (протокол № 1 від 6 квітня 2009 р.) та «Застосування трансплантації ембріонів у молочному і м’ясному скотарстві», схвалених Науково-технічною радою Міністерства аграрної політики України (протокол № 5 від15 грудня 2009 р.).

Результати наукових досліджень використовуються в роботі Львівського НВЦ «Західплемресурси» та для навчання студентів у Львівському національному університеті ветеринарної медицини та біотехнологій імені С. З. Ґжицького.

Особистий внесок здобувача полягає в підборі та аналізі наукової літератури за темою дисертаційної роботи, виконанні експериментальної частини, опрацюванні та статистичній обробці результатів, аналізі та обговоренні отриманих даних, участі у підготовці публікацій. Із спільних з співавторами експериментальних досліджень і публікацій дисертантом використано, за їх згодою, лише ті результати досліджень, у яких автор брав участь. Особистий внесок у наукові праці, опубліковані у співавторстві, визначено у списку друкованих праць. Аналіз результатів і формулювання висновків проведено разом з науковим консультантом.

Апробація результатів дисертації. Матеріали виконаної роботи викладено в доповідях на наукових конференціях, звітних сесіях Інституту біології тварин УААН (Львів, 2000–2009), науково-виробничій конференції “Теоретичні і практичні аспекти породоутворювального процесу у молочному та м’ясному скотарстві” (Київ, 1995).

Результати дисертаційної роботи доповідались на міжнародних науково-практичних конференціях: “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин” (Асканія-Нова, 1997); “Сучасні проблеми ветмедицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва” (Львів, 1997); “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи консолідації новостворених порід і типів сільськогосподарських тварин” (Київ, 1999); “Біологічні основи продуктивності та здоров’я тварин” (Львів, 2004); “Сучасні методи репродукції сільськогосподарських тварин: стан і перспективи розвитку” (Харків, 2008); “Новітні технології скотарства у ХХІ столітті” (Миколаїв, 2008); “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, 2007, 2009); “Наукове забезпечення інноваційного розвитку аграрного виробництва в Карпатському регіоні” (Чернівці, 2007; Львів, 2008; Берегово, 2009); “Інноваційність розвитку сучасного аграрного виробництва” (Львів, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009); Результати досліджень були оприлюднені під час презентації сучасних біотехнологічних методів на зарубіжних міжнародних науково-практичних виставках: 1-st Polish-Ukrainian Scientific ConferenceAnimal Sciences in the XXI century” (Krakоw, 2001); “Ведение животноводства интенсивными методами”, присвяченій 55-річчю Інституту тваринництва НАН Білорусі (м. Гродно, 2004); Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного и продуктивного здоровья животных (Воронеж, 2009); VIII Kabrtovy dieticke dny (Brno, 2009); “Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства (Горки, Беларусь, 2009).

Публікації. Результати дисертації відображені у 45 публікаціях: 26 статей у фахових виданнях (з них 11 без співавторів): 8 у журналах, 9 у наукових збірниках, 9 у науково-технічних бюлетенях; довідник; 2 методичні рекомендації; 3 патенти; 2 статті в науково-популярних журналах; 6 статей в матеріалах конференцій; 5 тез доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів дослідження, їх аналізу та узагальнення, висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури та 4 додатків. Дисертація викладена на 351 сторінці комп’ютерного тексту. Загальний обсяг дисертації — 277сторінок, у тому числі 105 таблиць, 34 рисунки, які займають 62 сторінки. Список використаної літератури включає 598 джерел, у тому числі 314 латинню.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Загальна методика та основні методи досліджень. Дослідження виконано в лабораторії біотехнології відтворення тварин Інституту біології тварин НААН України, лабораторії трансплантації ембріонів Львівського філіалу Інституту розведення і генетики тварин НААН України, дослідному господарстві “Гряда”, спільному українсько-англійському підприємстві “Україна-Лайвсток”, ВАТ “Дрогобицький племзавод”, Львівському науково-виробничому центрі “Західплемресурси”, ТзОВ “Імені Шевченка”, ПГ “Молочні ріки”, селянській спілці “Галичина” Львівської області та сільськогосподарському ТзОВ “Городище” Луцького району Волинської області.

В експериментах використано 426 корів-донорів віком 4–7 років та 673 телиці-реципієнти віком 16–18 місяців, живою масою 360–380 кг української чорно-рябої молочної породи та голштинізованої худоби європейської селекції. Усі тварини перед включенням у досліди підлягали загальному та ректальному обстеженню. Використовували тільки тих тварин, які були визнані клінічно здоровими. Годівля здійснювалась груповим методом згідно з раціонами, які використовувались у господарствах.

Індукцію множинної овуляції проводили, використовуючи препарат ФСГ “Фолікотропін” (Чехія) за загальноприйнятою 4-денною схемою. Штучне осіменіння корів-донорів здійснювали ректоцервікальним методом з використанням подвійної дози сперми бугаїв голштинської породи згідно із планами селекційно-племінної роботи. Нехірургічне вимивання ембріонів проводили, застосовуючи катетери Minitüb (Німеччина) згідно з методикою, описаною у “Довіднику з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби”. Загальна схема досліджень представлена на рисунку 1.

Проведено п’ять серій експериментів, у яких вивчали: алергічний метод добору корів-донорів і телиць-реципієнтів; спосіб стимуляції поліовуляції у корів-донорів з використанням ліпосом; застосування БАР для підвищення ембріопродуктивності корів-донорів; стабілізацію мембран при надшвидкому заморожуванні ембріонів; підвищення приживлення трансплантованих ембріонів у реципієнтів.

У першій серії експериментів досліджували алергічний метод добору корів і телиць, який базується на шкірній реакції тварини при введенні гормональних препаратів. Коровам і телицям внутрішньошкірно у верхній третині шиї після санітарної підготовки одноразово, окремо вводили: 1 % розчин прогестерону, 0,1 % розчин естрадіолу-дипропіонату і 0,05 % розчин естрону (фолікуліну) по 0,02 мл. Через 25 хвилин проводили клінічне обстеження, яке полягало у візуальному і пальпаторному дослідженні місця введення гормонів: відзначали наявність чи відсутність потовщення складки шкіри, набряку, почервоніння. У цей же час клініко-гінекологічним дослідженням визначали функціональний стан яєчників з діагностикою жовтого тіла, фолікулів та найпоширеніших патологій. Паралельно проводили визначення концентрації прогестерону, естрадіолу-17β та естрону в плазмі крові піддослідних тварин.

Рис. 1. Загальна схема досліджень.

У другій серії експериментів для удосконалення методу стимуляції поліовуляції у корів-донорів з використанням ліпосом проведено чотири досліди, у яких вивчали вплив внутрішньом’язових ін’єкцій трьох препаратів ФСГ (Фолікотропін, ФСГ-п, ФСГ-супер) у складі ліпосомальної емульсії для індукції поліовуляції на кількість і якість ембріонів у корів-донорів.

У першому досліді коровам-донорам дослідних груп суперовуляцію індукували дворазовим введенням фолікотропіну (Чехія) з використанням ліпосомальної емульсії, до складу якої входили: тривіт – 4 мл, лецитин – 1 мл, твін – 0,2 мл, диметилсульфоксид (ДМСО) – до 10% концентрації. Для отримання емульсії компоненти перемішували і диспергували ультразвуком при частоті 22 Кгц впродовж 2–3 хв.

У другому досліді вивчали вплив комплексу “фолікотропін-ліпосома” на індукцію поліовуляції у корів-донорів при багаторазовому їх використанні. Для цього проводили повторні викликання суперовуляції у піддослідних корів згідно з розробленими нами схемами, що передбачали застосування методів, спрямованих на завершення інволюційних процесів у статевих органах донорів.

У третьому досліді використовували препарат “ФСГ-п” (США) у високій (50 мг) і низькій (32 мг) дозах. Коровам-донорам дослідних груп індукцію суперовуляції проводили дворазовим введенням половинних доз (25 і 16 мг) препарату “ФСГ-п” на першу і третю доби гормональної обробки з використанням вищевказаної ліпосомальної емульсії.

У четвертому досліді використовували препарат “ФСГ-супер” (Росія) у двох дозах (36  і 50 мг) за загальноприйнятою 4-денною схемою, яка передбачає дворазові щоденні ін’єкції. Коровам-донорам дослідних груп індукцію суперовуляції проводили дворазовим введенням препарату “ФСГ-супер” з використанням вищезазначеної ліпосомальної емульсії.

У третій серії експериментів для удосконалення методу штучного осіменіння корів-донорів з використанням БАР проведено чотири досліди, у яких вивчали якість спермопродукції 15 бугаїв-плідників, запліднюючу здатність сперміїв, заплідненість корів та ембріопродуктивність корів-донорів при застосуванні БАР із спермою. Експериментальну роботу проводили у лабораторії генофонду тварин ЛНВЦ “Західплемресурси”.

У першому досліді визначали залежність спермопродуктивності у бугаїв-плідників від окремих біохімічних показників крові і сперми.

У другому досліді вивчали вплив БАР (естрофан, інозин, унітіол, глутатіон, L-цистеїн) у складі розбавників сперми бугаїв на фізіологічні показники сперміїв за умов інкубації in vitro. Визначили оптимальні дози кожного компоненту за активністю сперміїв та вивчали вплив комплексу БАР (естрофан, інозин, унітіол, глутатіон, L-цистеїн) на активність і виживання деконсервованої сперми бугаїв, вираховували абсолютний показник виживання сперми.

У наступних двох дослідах вивчали вплив введення вказаних БАР із спермою бугаїв-плідників на заплідненість та якість ембріонів у корів-донорів.

У четвертій серії експериментів для удосконалення надшвидкого методу заморожування ембріонів проведено три досліди, у яких окремо вивчали кріозахисні властивості інсолвіту, лінолевої кислоти та холестеролу при вітрифікації. Використано 554 ембріони. Для визначення оптимальних доз досліджуваних речовин, вивчення їх дії на морфологічний стан ембріонів у процесі кріоконсервування спочатку провели досліди на 216 ембріонах мишей.

При заморожуванні ембріонів великої рогатої худоби та мишей надшвидким методом використовували еквілібраційне і вітрифікаційне середовища. Ембріони після промивання в культуральному середовищі від механічного забруднення поміщали на 7–10 хв. в еквілібраційне середовище, яке складалося з 10 % гліцерину (1,4 М). Далі ембріони переносили у вітрифікаційне середовище на 60с.

У першому досліді при заморожуванні ембріонів мишей дослідних груп до вітрифікаційного середовища додавали препарат «Інсолвіт» виробництва Київського вітамінного заводу у дозах від 0,1 до 0,5 мл на 10 мл середовища в 1–5 дослідних групах, відповідно.

У другому досліді при заморожуванні ембріонів мишей дослідних груп до вітрифікаційного середовища додавали лінолеву кислоту (Linoleic acid 27908, Serva) у дозах від 0,1 до 0,4 % в 1–4 дослідних групах, відповідно.

У третьому досліді при заморожуванні ембріонів мишей дослідних груп до вітрифікаційного середовища додавали різні форми холестеролу (Cholesteryl linoleat 17112 , Cholesteryl oleat 17121, Cholesterol stearat 17124, Serva) у дозах від 0,5 до 2,0 мг/мл середовища в 1–4 дослідних групах кожної форми холестеролу, відповідно.

У п’ятій серії експериментів з метою підвищення приживлюваності нативних, деконсервованих та in vitro отриманих ембріонів у телиць-реципієнтів провели сім дослідів, у яких вивчали вплив ранньої стимуляції статевого дозрівання телиць, мінерального живлення, застосування комплексу БАР, седативних препаратів і міорелаксантів, пересадки бластомерів дегенерованих зародків на імплантацію ембріонів.

Для вивчення впливу мікроелементів на функціональний стан органів розмноження телиць-реципієнтів та приживлення трансплантованих ембріонів нами проведено досліди в трьох господарствах західного регіону України: дослідному господарстві “Гряда” Жовківського району, ВАТ “Дрогобицький племзавод” Львівської області та СТзОВ “Городище” Луцького району Волинської області.

Проведення експериментів розпочали з визначення вмісту мікроелементів у ґрунті, воді, кормах, крові та шерсті піддослідних тварин. Дослідження ґрунту, води і кормів на вміст у них мікроелементів проводили в лабораторії спектрального аналізу Інституту геології і геохімії горючих копалин НАН України. Перед постановкою телиць на дослід і через 45 днів після згодовування розробленого нами преміксу досліджували кров та шерсть по 10 проб з кожної групи.

На підставі проведених досліджень кормів, аналізу раціонів перед постановкою експерименту і під час його проведення, а також досліджень крові і шерсті телицям-реципієнтам дослідних груп протягом 45 днів згодовували премікс, до складу якого входили солі мікроелементів: купруму сульфат, цинку сульфат, кобальт хлористий, калій йодистий, мангану сульфат, натрію селеніт. Визначену необхідну кількість солей мікроелементів змішували з наповнювачем (пшеничні висівки) та індивідуально щоденно згодовували телицям. Тварини контрольної групи утримувалися на основному раціоні і додатково мікроелементів не одержували.

Після згодовування дефіцитних мікроелементів телицям синхронізували статеву охоту і провели нехірургічну пересадку деконсервованих ембріонів.

Для вивчення впливу ін’єкції БАР реципієнтам на приживлюваність ембріонів під час індукованої статевої охоти телицям дослідної групи внутрішньом’язово вводили комплексний препарат, до складу якого входили: синтетичний аналог Гн-РГ (сурфагон) — 5 мл, вододисперсна форма вітамінів А, D3, E (інсолвіт) — 5 мл, імуностимулятор (імукор) — 1 г, ДМСО — 10 % від загальної кількості розчину. Контрольній групі тварин ін’єктували 0,9% розчин NaCl.

При вивченні впливу нейротропних препаратів на приживлення трансплантованих ембріонів використовували сакральну епідуральну анестезію, парасакральну блокаду тазового нервового сплетіння, матковий міорелаксант «Ханегіф» (Угорщина), нейролептик «Седазин» (Польща), а також різні комбінації препаратів.

Для підвищення приживлення in vitro отриманих ембріонів сформували за принципом груп-аналогів чотири групи телиць: контрольну і три дослідних. Телицям 1 дослідної групи в 0-й день синхронізованого статевого циклу ін’єктували БАР (сурфагон, інсолвіт, імукор, ДМСО), дози яких визначені у попередніх дослідженнях. Тваринам 2 дослідної групи впродовж одного місяця згодовували премікс, до складу якого входили вітаміни А, D3, E та мікроелементи Купрум, Цинк, Кобальт, Йод, Селен. Склад і дози преміксу визначили за результатами досліджень ґрунту, кормів і води у господарстві. Телицям 3 дослідної групи трансплантували одержані in vitro ембріони разом з бластомерами дегенерованих бластоцист.

На всіх етапах досліджень відбирали кров, отримували сироватку і визначали: вміст загального білка сироватки крові за біуретовою реакцією (Кондрахин И. П., 1985); загальну кількість імуноглобулінів -1, -2 в сироватці крові за методом В. П. Литвина та І. М. Табаря (1979); каротин за методом SYudkin в модифікації Ю. Петрунькіної, описаним С. М. Паєнок, Я. С. Гусак (1988); вільні сульфгідрильні групи за методом M. Staron et al. (1961); загальний холестерол сироватки крові за методом S. Ilka, описаним В. І. Скороход, М. Б. Стефаник (1983); глюкозу за методом Е. Hultman (Головацкий И .Д., 1961); суму цукрів за методом Хагедорн-Ієнсена (Головацкий И. Д., 1961); активність АлАТ і АсАТ за методом К.Г. Капетанакі (1962); активність глутатіонпероксидази за методом В. М. Моіна (1986); активність каталази за методом М. Л. Королюка, Л. І. Іванова (1998); ТБК-активні продукти за методом С. М. Коробейникова (1989); гідроперекиси ліпідів за методом В. В. Мирончика (1994).

Концентрацію прогестерону і естрадіолу-17 у плазмі крові визначали радіоімунологічним та імуноферментним методами.

Проби тканин органів розмноження (матка, яєчники) для біохімічних та гістологічних досліджень готували за загальноприйнятими методиками і визначали: вміст розчинних білків за біуретовою реакцією; вміст фосфору нуклеїнових кислот за методом А. С. Спіріна (1958); вміст глікогену за методом Перлігера, описаним І. Д. Головацьким (1961); вміст вільних сульфгідрильних груп за методом М. Staron et al. (1961).

Для гістологічних досліджень препарати тканин готували за методом І. М. Афанасьєва та співавт. (1967).

Отримані цифрові дані опрацьовували статистично за допомогою програми Microsoft Excel 2003. Різницю між значеннями середніх величин вважали статистично вірогідною при:   * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Алергічний метод добору корів-донорів і телиць-реципієнтів. Аналізуючи результати шкірних реакцій на введення окремих гормонів, слід відзначити, що при персистентному жовтому тілі позитивну реакцію (виражений набряк, потовщення складки шкіри, гіперемія, свербіння) спостерігали при введенні прогестерону (80,0 %) при відсутності реакції на ін’єкції естрадіолу (88,0 %) та фолікуліну (48,0 %).

Лютеїнові кісти супроводжувались позитивною реакцією на введення прогестерону (80,0 %) і фолікуліну (60,0 %) за відсутності реакції на естрадіол (73,3 %). При фолікулярних кістах відзначали позитивні шкірні реакції на ін’єкції естрогенів (естрадіол (96,7 %) і фолікулін (66,7 %), у той час як вираженої чутливості шкіри на прогестерон не встановлено (86,7 %). При жовтому тілі у більшості випадків спостерігали позитивну реакцію на прогестерон (66,7 %) і негативну на естрадіол (58,3 %) і фолікулін (41,7 %).

Результати внутрішньошкірних проб підтверджуються дослідженнями концентрації стероїдних гормонів у крові піддослідних корів. Так, при персистентному жовтому тілі спостерігається високий рівень прогестерону (7,6±1,2 нг/мл) на фоні низького рівня естрогенів (естрадіол — 2,3±0,5 пг/мл, естрон — 0,7±0,08 пг/мл) (табл. 1). Лютеїнові кісти супроводжуються аналогічними співвідношеннями досліджуваних гормонів, однак концентрація прогестерону вища на 60,5 %, естрадіолу — на 47,8 % та естрону — в 2 рази.

Таблиця 1

Вміст статевих гормонів у плазмі крові корів, M±m, n=7

Функціональний стан яєчників

Досліджувані гормони

прогестерон,

нг/мл

естрадіол,

пг/мл

естрон,

пг/мл

Персистентне жовте тіло

7,6±1,2

2,3±0,5

0,7±0,03

Лютеїнові кіста

12,2±5,5

3,4±1,5

1,5±0,5

Фолікулярна кіста

1,5±0,5

26,3±4,0

5,6±0,5

Гіпофункція яєчників

1,2±0,05

2,2±0,05

0,4±0,01

Жовте тіло

2,6±0,14

0,9±0,12

0,5±0,08

Фолікул

1,2±0,22

8,6±0,95

3,2±0,26

Аналізуючи результати гормональної стимуляції множинної овуляції, кількісні і якісні показники ембріопродуктивності, слід відзначити, що найкращі результати одержали у корів з жовтим тілом яєчника. У цій групі корів одержано 5,55±0,72 морфологічно якісних ембріона на донора, що становить 83,3 % від загальної кількості вимитих. Це підтверджує думку ряду вчених про необхідність використання корів з жовтим тілом як донорів ембріонів (König S. et al., 2007; Сергеев Н. И., 2008).

Функціональний стан яєчників і алергічна реакція у телиць були аналогічними як у корів. Таким же був і вміст стероїдних гормонів.

У телиць з фолікулом та гіпофункцією яєчників на синхронізацію охоти прореагувало лише по 50 відсотків з них. Ще меншу кількість жовтих тіл після синхронізації охоти виявили при таких гінекологічних патологіях, як персистентне жовте тіло (40,0 %), лютеїнова кіста (44,4 %), фолікулярна кіста (45,0 %). Такий функціональний стан негативно вплинув на результати нехірургічної трансплантації ембріонів. Приживлюваність ембріонів у цих групах тварин була невисокою — від 25 до 33 відсотків, що на 13–21 % нижче, ніж у телиць-реципієнтів з жовтим тілом.

Таким чином, порушення продукції статевих гормонів залозами внутрішньої секреції і підвищена чутливість до них відіграють важливу роль в патогенезі функціональних порушень яєчників. У той же час внутрішньошкірне введення стероїдних гормонів є важливим діагностичним тестом для виявлення патологій яєчників у корів і телиць, з метою раціоналізації відбору потенційних донорів і реципієнтів ембріонів.

Стимуляція множинної овуляції гонадотропінами у корів-донорів з використанням ліпосом. Дворазова ін’єкція препарату ФСГ у складі ліпосомальної емульсії викликає множинну овуляцію у корів-донорів на рівні стандартної схеми введення “Фолікотропіну”. За кількістю одержаних ембріонів на донора суттєвих розбіжностей між групами тварин, аналогічно як і за відсотком позитивних донорів, не спостерігалося. Проте, якісна характеристика ембріонів значно відрізнялася у різних групах тварин (табл. 2).

Таблиця 2

Рівень множинної овуляції та якість ембріонів у корів-донорів при використанні препаратів ФСГ у складі ліпосомальної емульсії

Показники

Фолікотропін,

400 ІО

ФСГ-п,

50 мг

ФСГ-супер,

50 мг

К

Д

К

Д

К

Д

Кількість корів-донорів, n

12

14

14

16

15

15

Прореагувало поліовуляцією, n–%

8–66,7

9–64,3

12–85,7

13–81,2

13–86,7

12–80,0

Рівень поліовуляції, M±m

9,25±

0,85

9,00±

1,01

10,58±

1,32

9,38±

0,92

9,8±

0,95

10,7±

0,98

Одержано ембріонів на донора, M±m всього

6,75±

0,62

7,11±

0,78

7,33±

0,62

7,23±

0,86

8,1±

0,67

7,7±

0,63

доброякісних

4,00±

0,36

4,11±

0,42

5,25±

0,43

4,69±

0,38

4,9±

0,35

5,2±

0,42

дегенерованих

2,00±

0,18

2,22±

0,20

1,33±

0,12

1,62±

0,14

1,8±

0,12

1,5±

0,21

яйцеклітин

0,75±

0,09

0,78±

0,10

0,75±

0,09

0,92±

0,08

1,4±

0,13

1,0±

0,08*

Індукція поліовуляції у корів-донорів за допомогою препарату “ФСГ-п” у складі ліпосомальної емульсії дозволяє при менших стресових навантаженнях та трудових затратах забезпечити задовільні результати ембріопродукції. Хоч кількість морфологічно якісних ембріонів на донора у корів дослідної групи на 10,7 % менша, ніж у контрольних тварин, за часткою дегенерованих ембріонів і незапліднених яйцеклітин розбіжностей між групами тварин не встановлено.

Дворазова ін’єкція препарату “ФСГ-супер” у складі ліпосомальної емульсії теж викликає множинну овуляцію у корів-донорів на рівні стандартної схеми введення гормону. Кількість ембріонів відмінної якості на донора у корів дослідної групи на 7,8 % більша, ніж у контрольних тварин. У той же час кількість дегенерованих ембріонів і незапліднених яйцеклітин у донорів дослідної групи, відповідно на 16,7 та 28,5 % менша (p<0,05), порівняно з контрольними коровами.

При багаторазовому використанні корів-донорів з кожною наступною індукцією множинної овуляції кількість морфологічно якісних ембріонів зменшувалася. Так, за результатами першої і другої індукції поліовуляції одержано майже однакову кількість доброякісних ембріонів (4,00 і 4,14) та незапліднених яйцеклітин (0,71 і 0,78). Натомість після другої індукції суперовуляції у дослідних донорів одержали дегенерованих ембріонів на 12,7 %, а після третьої — на 24,9 % менше (p<0,05), порівняно з контрольними тваринами.

Після третьої індукції множинної овуляції кількість морфологічно якісних ембріонів у корів контрольної групи зменшилася на 15,5 %, а дослідної групи — не змінилася і становила 3,87±0,33. Кількість яйцеклітин у корів дослідної групи на 33,3 % менша (p<0,01), ніж після другої індукції поліовуляції. Отже, введення препарату ФСГ у складі ліпосомальної емульсії забезпечує точнішу синхронність овуляції за рахунок продовження тривалості дії гонадотропіну.

Концентрація прогестерону в плазмі крові дослідних і контрольних корів з 8-го до 11-го дня знизилася, відповідно, на 40,2 % (p<0,01) і 31,3 % (p<0,05; табл. 3).

Таблиця 3

Концентрація гормонів у плазмі крові корів-донорів під впливом індукції поліовуляції, M±m, n=10

Гормони

8-й день

11-й день

контроль

дослід

контроль

дослід

Прогестерон, нмоль/л

45,4±5,12

48,3±4,50

31,2±2,67

28,9±3,12

Естрадіол, пмоль/л

30,1±3,56

29,4±3,23

24,6±3,55

22,7±2,54

Кортизол, нмоль/л

11,2±2,43

11,4±1,91

21,2±1,55

16,2±1,12*

Аналогічно, концентрація естрадіолу-17  у крові донорів дослідної і контрольної груп зменшилася відповідно на 32,8 % і 18,3 %. Суттєвої різниці за рівнем прогестерону та естрадіолу-17 в обох групах тварин не встановлено, що свідчить про однакову стимулюючу дію як чистого препарату ФСГ, так і його комбінації з ліпосомальною емульсією. Протилежні зміни спостерігали за рівнем кортизолу, який у динаміці з 8 до 11 дня синхронізованого статевого циклу збільшився у крові корів дослідної і контрольної груп відповідно на 89,3 % (p<001) і 42,1 % (p<0,05).

На 11 день синхронізованого статевого циклу концентрація кортизолу у крові дослідних корів менша на 23,6 % (p<0,05), порівняно з контрольними тваринами. Зниження рівня кортизолу свідчить про зменшення стресового навантаження при індукції суперовуляції фолікотропіном у складі ліпосомальної емульсії.

Отже, індукція поліовуляції у корів-донорів за допомогою препаратів ФСГ у складі ліпосомальної емульсії дозволяє при менших стресових навантаженнях та трудових затратах забезпечити задовільні результати ембріопродукції.

Удосконалення методу штучного осіменіння корів-донорів з індукованою множинною овуляцією. Дослідженнями встановлено, що морфологічні та біохімічні показники сперми та крові бугаїв-плідників змінюються під впливом зовнішніх та внутрішніх факторів і тісно пов’язані з життєво важливими функціями й процесами, які відбуваються в організмі тварин, та їх продуктивністю. В осінньо-зимовий період від бугаїв одержували сперму з вищою концентрацією сперміїв (1,45±0,05 млрд/мл) та активністю, порівняно з показниками у літній та весняний періоди, хоча об’єм еякулятів був приблизно однаковий. Аналогічно змінювався показник абсолютного виживання сперміїв протягом року.

Відповідно до сезонних коливань концентрації сперміїв в еякуляті змінювались показники активності сукцинатдегідрогенази (СДГ) і цитохромоксидази (ЦО). Висока активність СДГ спостерігалась у зимовий період. Весною вона була на 21 % меншою і становила 38,30±2,9 од. Протягом літа вона коливалась у межах 35,5±3,0 од, а в листопаді досягала максимального значення і залишалась приблизно на такому ж рівні і взимку. ЦО також проявила максимальну активність взимку порівняно з весняно-літнім періодом. В еякулятах з низькою активністю ферменту найнижчі показники абсолютного виживання сперміїв. З підвищенням активності СДГ значення активності, концентрації та виживання сперміїв збільшуються..

Також виявлено зв’язки найважливіших фізіологічних і біохімічних показників сперми. Так, у спермі з кількістю живих сперміїв <70 %, що було відмічено влітку (64,8±1,1), виявлено найнижчі показники вмісту у ній глюкози, фруктози і суми цукрів. Взимку вони підвищувалися і були більші на 15–20 % порівняно з літнім періодом і на 5–12 % — порівняно з весною та незначно змінювались протягом осені.

Високий вміст білка у плазмі сперми бугаїв виявлено восени і на початку зими, найнижчий — навесні, що, очевидно, пов’язано з годівлею плідників. В осінньо-зимовий період концентрація сперміїв була на 20–40 % вищою, ніж у весняно-літній період, показник РНК був найвищим восени (63,5±4,2 мг % Р).

Також встановлено взаємозв’язок рівня загального білка та активності амінотрансфераз у сироватці крові бугаїв з вмістом білка і фруктози у плазмі сперми та їхньою спермопродуктивністю. Дані показники крові знижувалися влітку, що корелює із зниженням рівня білка і фруктози у плазмі сперми бугаїв-плідників у цей період та зниженням загальної концентрації сперміїв у їх еякулятах. Встановлено істотну позитивну кореляцію у зимовий період між концентрацією сперміїв і вмістом гемоглобіну у крові (r=0,68), між активністю сперміїв і кількістю еритроцитів (r=0,74).

У результаті проведення другого досліду визначено оптимальні дози окремих БАР, які використали у наступних експериментах. Вони становили: для унітіолу 1 мг на 1 мл 2,9% розчину цитрату натрію, інозину – 0,05 мг/мл, естрофану – 0,05 мл/мл, глутатіону – 0,5 мМ, L-цистеїну – 0,5 мМ. Кожний із досліджуваних компонентів БАР проявляв позитивний вплив на активність сперми за умов інкубації, за винятком естрофану, дія якого була не так чітко виражена. Це дає підставу для вивчення дії комплексу БАР на життєздатність сперми. Враховуючи властивість простагландину F викликати скорочення міометрію та забезпечувати овуляцію при введенні в матку корів, ми включили естрофан до складу комплексного препарату.

Додавання до деконсервованої сперми бугаїв вищевказаного комплексу БАР сприяло підвищенню активності і виживання сперміїв за умов інкубації in vitro. Так, через 3 год. інкубації активність сперміїв дослідної групи була на 30,0 % вища, через 4 год. — на 60,0 % (p<0,05), через 5 годин — на 66,7 % (p<0,05), а через 6 годин — удвічі вища за контроль.

Відсоток патологічних сперміїв через годину інкубації у контрольній групі зріс удвічі, в той час як у дослідній групі — лише на 55,4 % і становив 10,99 %. На 5 год. інкубації відсоток патологічних сперміїв у контролі становив 23,30 %, у досліді — 14,84 % (p<0,01). Отже, додавання комплексу БАР до деконсервованої сперми сприяє збільшенню кількості нормальних сперміїв та зменшенню їх патологічних форм.

У досліді на 50 коровах контрольної і 60 коровах дослідної груп показано, що введення комплексу БАР у статеві шляхи корів разом із спермою бугаїв під час осіменіння підвищило заплідненість корів дослідної групи на 11,8 %. Кількість позитивних осіменінь збільшилась на 11,1 %, при цьому індекс осіменіння зменшився на 17,0 %, кількість спермодоз на одне плідне осіменіння — на 21,8 %.

Після індукції поліовуляції кількість морфологічно якісних ембріонів у корів-донорів дослідної групи була більшою на 15,5 %, порівняно з контрольними тваринами. У той же час частка дегенерованих ембріонів у донорів дослідної групи була на 20,0 %, а кількість яйцеклітин — на 40,0 % меншою, ніж у контрольних тварин.

Збільшення кількості морфологічно якісних ембріонів з одночасним суттєвим зменшенням незапліднених яйцеклітин у корів дослідної групи, очевидно, пов’язане з дією біологічно активних компонентів, введених трансцервікально із спермою бугаїв. Про це свідчить і відсоток ембріонів відмінної якості від кількості доброякісних — у корів дослідної групи 57,7 %, що на 13,3 % більше, порівняно з контрольними тваринами.

Концентрація прогестерону у крові дослідних корів була вищою на 19,9 %, а естрадіолу — на 20,1 % нижчою, порівняно з тваринами контрольної групи, що вказує на вплив БАР, які, всмоктуючись у стінку матки, через систему матка-яєчники синхронізують овуляцію, внаслідок чого формується функціонально активне жовте тіло, здатне продукувати високий рівень прогестерону.

Таким чином, введення комплексу БАР (естрофан, інозин, унітіол, глутатіон, L-цистеїн) підвищує заплідненість корів при зменшенні індексу осіменіння та використаних спермодоз, а також кількість та якість одержаних ембріонів у корів-донорів.

Удосконалення надшвидкого методу кріоконсервування ембріонів. Інсолвіт при додаванні його у середовища для заморожування ембріонів мишей методом вітрифікації, починаючи з концентрації 0,2 мл, значно «пом’якшує» вплив надшвидкого охолодження, про що свідчить високий показник збереження деконсервованих ембріонів (80 %). Це можна пояснити захисною дією вітаміну Е щодо поліненасичених жирних кислот фосфоліпідів клітинних мембран. Крім того, вітамін Е взаємодіє з інтегральними білками ліпопротеїнових комплексів у клітинних мембранах, стабілізує та забезпечує їх нормальне функціонування.

Відсоток деконсервованих ембріонів корів з незворотними морфологічними змінами майже у всіх дослідних групах був низьким (11,1–15,4 %), порівняно з контролем (20,0 %; табл. 4). Це й зумовило підвищення збереженості деконсервованих ембріонів у всіх дослідних групах, а особливо у третій, де він становив 88,9 %, що на 8,9 % більше від контролю.

Таблиця 4

Збереженість та приживлення деконсервованих ембріонів корів залежно від концентрації інсолвіту у вітрифікаційному середовищі

Показники

Групи тварин та дози інсолвіту на 10 мл середовища

контроль

1 дослідна

0,2 мл

2 дослідна

0,3 мл

3 дослідна

0,4 мл

Заморожено ембріонів, шт.

10

14

13

9

Деконсервовані ембріони з морфологічними пошкодженнями, n–%

2–20,0

2–14,3

2–15,4

1–11,1

Збереженість ембріонів, %

80,0

85,7

84,6

88,9

Приживлюваність ембріонів, %

37,5

50,0

54,5

50,0

Вища якість деконсервованих ембріонів, зумовлена використанням інсолвіту у складі середовищ для вітрифікації та розморожування, забезпечила підвищення результативності трансплантації ембріонів. Після пересадки ембріонів їх приживлюваність у всіх дослідних групах була на рівні 50 %, а в 2-й групі становила 54,5 %, що на 17 відсотків вище від контролю.

У другому досліді додавання лінолевої кислоти у середовище для заморожування ембріонів корів методом вітрифікації у концентраціях 0,1–0,3 % підвищило збереженість деконсервованих ембріонів на 7,8–13,3 % (табл. 5).

Таблиця 5

Збереження деконсервованих ембріонів корів залежно від концентрації лінолевої кислоти у вітрифікаційному середовищі

Показники

Групи тварин та дози лінолевої кислоти

контроль

1 дослідна

0,1 %

2 дослідна

0,2 %

3 дослідна

0,3 %

Заморожено ембріонів, n

10

9

12

10

Деконсервовані ембріони з морфологічними пошкодженнями, n–%

3–30,0

2–22,2

2–16,7

2–20,0

Збереження деконсервованих ембріонів, %

70,0

77,8

83,3

80,0

Приживлюваність ембріонів, %

42,8

42,8

50,0

50,0

Результати нехірургічної пересадки ембріонів свідчать про високий рівень приживлення деконсервованих ембріонів. Так, у контрольній та 1 дослідній групах приживлюваність ембріонів становила 42,8 %, у 2 і 3 дослідних групах — на 7,2 % більше, порівняно з контрольними реципієнтами.

Додавання лінолеату і олеату холестеролу в оптимальних дозах (1 і 1,5 мг/мл) у вітрифікаційне середовище підвищило збереженість деконсервованих ембріонів мишей на 13,3–18,2 %. Це можна пояснити тим, що введення холестеролу у вітрифікаційне середовище призводить до абсорбції його мембранами ембріонів, внаслідок чого зменшується їх кріопошкодження та підвищується виживаність ембріонів після розморожування, що узгоджується з даними P. HPurdy і J. KGraham (2004).

При вивченні кріозахисних властивостей різних форм холестеролу на ембріонах великої рогатої худоби ми врахували кращі показники збереження деконсервованих ембріонів мишей і використали відповідні концентрації ефірів холестеролу. Після розморожування відсоток деконсервованих ембріонів з незворотними морфологічними змінами у 1 і 2 дослідних групах був низьким (відповідно 10,0 і 16,7 %), порівняно з контролем (30,0 %; табл. 6). Це й зумовило підвищення збереженості деконсервованих ембріонів у вказаних дослідних групах, відповідно, 90,0 і 83,3 %, що на 20,0 і 13,3 % більше від контролю. При застосуванні стеарату холестеролу збереженість відталих ембріонів майже не відрізнялася від контролю.

Таблиця 6

Збереження деконсервованих ембріонів корів залежно від форми і концентрації холестеролу у вітрифікаційному середовищі

Показники

Групи тварин та дози холестеролу

контроль

1 дослідна

1 мг/мл лінолеату

2 дослідна

1,5 мг/мл олеату

3 дослідна

0,5 мг/мл стеарату

Заморожено ембріонів, n

10

10

12

11

Деконсервовані ембріони з морфологічними пошкодженнями, n–%

3–30,0

1–10,0

2–16,7

3–27,3

Збереження деконсервованих ембріонів, %

70,0

90,0

83,3

72,7

Приживлюваність ембріонів, %

42,8

55,5

50,0

37,5

Вища якість деконсервованих ембріонів, зумовлена використанням лінолеату та олеату холестеролу у складі середовищ для вітрифікації, призвела до підвищення результативності трансплантації ембріонів. Приживлюваність ембріонів у 1 і 2 дослідних групах становила 55,5 і 50 %, що, відповідно, на 12,7 та 7,2 % більше, порівняно з контрольними реципієнтами.

Отже, введення мембраностабілізуючих речовин (інсолвіт, лінолева кислота, холестерол) у середовище для вітрифікації ембріонів в оптимальних концентраціях знижує кількість морфологічно пошкоджених клітин після деконсервування, що забезпечує високу збереженість деконсервованих ембріонів (понад 80,0 %) та підвищує їх приживлюваність на 7,2–17,0 %.

Способи підвищення приживлення трансплантованих ембріонів у реципієнтів. При згодовуванні солей мікроелементів телицям-реципієнтам дослідних господарств, розміщених у різних кліматичних зонах, значно збільшився їх вміст у крові. Так, під впливом згодовування мікроелементів телицям ДГ «Гряда» вміст Купруму зріс майже удвічі (p<0,05), Йоду в 2,25 раза (p<0,01), Кобальту у 2,35 раза (p<0,01). Вміст Селену у крові дослідних реципієнтів більший на 41,2 % (p<0,05), Цинку — на 26,3 %, Мангану — на 12,1 %, порівняно з контрольними тваринами.

Для оцінки відображення забезпечення організму мінеральними речовинами ми провели дослідження вмісту мікроелементів у шерсті, яке повністю підтвердило правильність такої закономірності. Вміст досліджуваних мікроелементів у шерсті відповідав їх концентрації у крові телиць-реципієнтів усіх господарств. Так, у шерсті дослідних телиць ДГ «Гряда» вміст Кобальту був більший майже удвічі (p<0,01), Цинку — на 54,1 % (p<0,05), Селену — на 43,1 % (p<0,05), Купруму — на 41,1 % (p<0,05), Мангану — на 30,0 %, ніж у тварин контрольної групи.

Аналіз біохімічних показників крові телиць-реципієнтів після згодовування преміксу свідчить про підвищення рівня окремих інгредієнтів білкового, ліпідного та вуглеводного обмінів у досліджуваних господарствах Західної біогеохімічної провінції. Оскільки досліджувані мікроелементи входять до складу окремих біохімічних показників та ферментів, важливого значення набуває встановлення взаємозв’язку між ними. Зокрема, Купрум входить до складу супероксиддисмутази, а Селен — глутатіонпероксидази, що і визначило позитивну кореляційну залежність між вказаними показниками (r=423–0,523, p<0,05–0,01 і r=525–0,682, p<0,05).

Забезпечення реципієнтів дефіцитними мікроелементами вплинуло і на приживлюваність трансплантованих ембріонів. Зокрема, у ДГ «Гряда» після нехірургічної трансплантації ембріонів рівень їх приживлення у дослідних реципієнтів становив 58,3 %, що на 8,3 % більше порівняно з контрольними тваринами і був найвищим серед усіх дослідних господарств (табл. 7).

Таблиця 7

Функціональний стан яєчників і приживлюваність трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів під впливом згодовування преміксу

Показники

ДГ Гряда

ВАТ Дрогобицький племзавод

СТзОВ Городище

контроль

дослід

контроль

дослід

контроль

дослід

Кількість телиць, n

14

15

14

14

12

12

Виявлено телиць з жовтим тілом, n–%

8–57,1

12–80,0

8–57,1

11–78,6

7–58,3

9–75,0

Приживлюваність ембріонів, %

50,0

58,3

50,0

54,5

42,9

55,6

Рівень приживлення ембріонів у дослідних реципієнтів ВАТ Дрогобицький племзавод був вищим на 4,5 % від контролю і становив 54,5 %. У СТзОВ “Городище” різниця у приживлюваності ембріонів між дослідною і контрольною групами телиць була найбільшою (12,7 %) і у дослідних реципієнтів становила 55,6 %.

Таким чином, згодовування телицям-реципієнтам солей дефіцитних мікроелементів у складі комбікорму посилило обмінні процеси в організмі тварин, нормалізувало відтворювальну функцію, що забезпечило збільшення приживлюваності трансплантованих ембріонів.

У наступному експерименті, після синхронізації статевого циклу у телиць дослідної групи під впливом ін’єкції БАР в 0-й день синхронізованого статевого циклу жовте тіло яєчника утворилося у 80,6 % тварин, що на 22,5 % більше порівняно з контролем. Після нехірургічної трансплантації деконсервованих ембріонів у дослідній групі рівень приживлення становив 60,0 %, що на 15,6 % більше порівняно до контролю.

Збільшення кількості телиць з жовтим тілом яєчника та зростання приживлюваності трансплантованих ембріонів під впливом ін’єкції БАР в 0-й день синхронізованого статевого циклу підтверджується фізіолого-біохімічними та гістологічними показниками крові і тканин статевих органів піддослідних тварин. Зокрема, вміст вільних SH-груп у крові тварин дослідної групи (n=15) на 7-й день статевого циклу збільшився на 9,6 % (p0,05), порівняно з контрольними телицями. Збільшення загальної кількості імуноглобулінів у телиць дослідної групи на 12,8 % (p<0,05), очевидно, відбулося за рахунок позитивного впливу γ-глобуліну у складі препарату імукор на імунну систему.

Вміст загального холестеролу та глюкози в крові телиць дослідної групи збільшився відповідно на 26,3 % (р<0,05) і 11,1 % (p<0,05). Ймовірно, комплексний препарат шляхом змін у загальному метаболізмі впливає на рівень холестеролу в крові та на звільнення з печінки глюкози для потреб клітин.

Рівень каротину в крові телиць дослідної групи був більший на 22,2 %, ніж у тварин контрольної групи, що спостерігалося в динаміці в 0-й і 3-й дні синхронізованого статевого циклу.

Концентрація прогестерону на 3-й день статевого циклу приблизно однакова у крові телиць обох груп, а на 7-й день у дослідних тварин на 68,5 % вища (р<0,05), порівняно з контролем (рис. 2).

Зміни концентрації естрадіолу-17 у плазмі крові телиць обох груп характеризувалися вірогідним зменшенням на 3-й день та значним зростанням (на 16,4–51,5 %; p<0,05) на 7-й день статевого циклу. Однак, на 3-й день статевого циклу концентрація естрадіолу-17 у плазмі крові телиць дослідної групи нижча на 65,2 % (р<0,05), а на 7-й день циклу — на 26,5 % (р<0,05), порівняно з тваринами контрольної групи.

Суттєві розбіжності спостерігалися і за гістологічними показниками тканин статевих органів телиць-реципієнтів у динаміці перебігу статевого циклу. Так, на третій день статевого циклу у телиць дослідної групи кількість маткових залоз на 25,3 % (р<0,05), висота епітелію ендометрію — на 8,2 % більша, порівняно з тваринами контрольної групи.

Рис. 2. Концентрація прогестерону та естрадіолу-17 у сироватці крові піддослідних телиць

Дослідженнями тканин яєчників на 3-й день статевого циклу встановлено зростання вмісту вільних SН-груп у телиць дослідної групи на 40,7 % (р0,05), концентрації глікогену — 29,6 % (р0,05), каротину — на 52,3 % (р0,05), порівняно з тваринами контрольної групи. Вміст фосфору РНК у яєчниках реципієнтів дослідної групи також був на 22,8 % вищим, ніж у контролі.

Таку ж відмінність виявили на 7-й день статевого циклу. Зокрема, вміст вільних сульфгідрильних груп, глікогену, каротину та фосфору РНК в яєчниках дослідних телиць був, відповідно на 32,6, 31,9, 51,3 і 35,8 % (р<0,05) більший, ніж у тварин контрольної групи. Аналогічними були результати біохімічних досліджень стінки матки піддослідних тварин.

Таким чином, під впливом ін´єкції БАР проходить інтенсифікація обмінних процесів у статевих органах телиць-реципієнтів, яка проявляється підвищенням рівня окремих біохімічних показників стінки матки і яєчників, а також гістологічних показників ендометрію та гормонального профілю крові. Синергізм компонентів комплексу БАР проявляється у тому, що поєднання вододисперсної форми вітамінів А, D3, E з імуномодулюючим препаратом та Гн-РГ гормоном за рахунок ДМСО швидко скеровує їх в органи-мішені і проявляє стимулюючу дію на яєчники та матку телиць-реципієнтів. Формування жовтого тіла в яєчниках телиць та інтенсивні обмінні процеси в матці під впливом ін’єкції БАР забезпечили високий рівень приживлення трансплантованих ембріонів.

Дослідження з посилення ембріонально-маткового сигналу трансплантацією деконсервованих ембріонів з бластомерами дегенерованих бластоцист встановлено вищу приживлюваність ембріонів на 12,9 %. Очевидно, пересадження ембріонів з бластомерами бластоцист збільшує масу ембріонів, а відповідно і лютеотропний сигнал і стимулюють виділення імуносупресорів материнським організмом (Кауфольд М. зі співавт., 1990). Це підтверджується зміною концентрації стероїдних гормонів у плазмі крові піддослідних тварин у динаміці з 7-го по 17-й дні синхронізованого статевого циклу (рис. 3). Так, якщо на 7-й день статевого циклу або в день трансплантації ембріонів рівень прогестерону в крові тварин контрольної і дослідної груп був майже однаковим, то на 13-й день циклу концентрація гормону у дослідних реципієнтів була вищою на 25,3 % (p<0,05), ніж у телиць контрольної групи. Така ж тенденція збереглася і на 17-й день статевого циклу — концентрація прогестерону в крові тварин дослідної групи була вищою на 28,3 % (p<0,05), порівняно з контрольними реципієнтами.

Рис. 3. Концентрація стероїдних гормонів при трансплантації бластомерів бластоцист

Збільшення критичної маси ембріона за рахунок введення трофобластичних клітин посилює лютеотропний сигнал в ендометрії, який стимулює виділення жовтим тілом яєчника прогестерону. При цьому концентрація естрадіолу знижується: на 13-й день статевого циклу на 14,9 % (p<0,05), а на 17-й день — на 9,5 %.

Аналізуючи результати електрофорезу білків ендометрію телиць-реципієнтів, слід відзначити, що у тварин контрольної і дослідної груп на 13-й і 17-й дні синхронізованого статевого циклу виявлено білки з молекулярною масою 45–50 кДа, що приблизно відповідає білку – маркеру альбуміну курячого яйця, та 66–70 кДа — альбуміну сироватки крові бугая. Наявність вказаних білків свідчить про характерні зміни в ендометрії при нідації ембріона та початку його імплантації, що відповідає вказаній стадії розвитку зародка і узгоджується з даними Дж. Батлера зі співавт. (1982).

Крім того, на електрофореграмах виявлено значно більші кількості вказаних білків у тварин дослідної групи. Це, очевидно, пов’язано з тим, що під впливом збільшення критичної маси ембріона через посилення лютеотропного сигналу матки зростає концентрація прогестерону, який стимулює проліферативні процеси в ендометрії з виділенням білків із вказаною молекулярною масою. Роль цих білків до кінця не з’ясована, але існують гіпотези про їх імунодепресивні властивості (Mansouri-Attia N. Et al., 2009).

Дослідженнями ефективності застосування седативних препаратів та міорелаксантів встановлено найнижчий рівень приживлення ембріонів при використанні сакральної епідуральної анестезії — 35,0 %, а найвищий — при комбінації парасакральної блокади тазового нервового сплетіння з препаратом “Седазин” (56,3 %).

Високий рівень приживлення ембріонів спостерігався і при комплексному застосуванні парасакральної блокади з матковим релаксантом Ханегіф — 55,0 %. Використання інших комбінацій препаратів було менш успішним і становило у тварин 1, 2 і 4 дослідних груп 50,0, 52,6 та 47,4 %, однак, вище, відповідно, на 15,0, 17,6 і 12,4 %, ніж у телиць-реципієнтів контрольної групи.

Застосування досліджуваних препаратів викликало зміни вмісту окремих біохімічних показників крові телиць-реципієнтів. Нижчий рівень глюкози спостерігався у крові реципієнтів 2 і 3 дослідних, відповідно, на 18,3 і 16,1 %, а у 4 і 5 дослідних груп — на 29,8 і 24,4 % (р<0,05), порівняно з тваринами контрольної групи (табл. 8). Це вказує на те, що поєднання сакральної і парасакральної анестезії з матковим релаксантом “Ханегіф” та седативним препаратом “Седазин” запобігають виникненню і розвитку стресу, викликаного проведенням маніпуляцій з підготовки реципієнтів та трансплантації ембріонів.

Таблиця 8

Показники

Групи тварин

К

СЕА

1 Д

ПСБ

2 Д

СЕА + Х

3 Д

ПСБ + Х

4 Д

СЕА + С

5 Д

ПСБ + С

Глюкоза, мг %

61,7±

5,13

59,7±

5,44

50,4±

3,38

51,8±

3,85

43,3±

3,06*

46,5±

3,67*

Загальний холестерол, мг %

122,4±

6,7

130,6±

9,2

153,4±

10,1*

148,8±

8,5*

132,8±

6,4

139,1±

5,8

Імуноглобуліни, ум.од.

0,92±

0,06

0,96±

0,08

1,02±

0,07

1,12±

0,10

0,90±

0,08

0,92±

0,09

Кортизол, нмоль/л

17,6±

1,23

15,2±

1,27

13,1±

1,05*

12,7±

0,98**

9,6±

1,03**

9,9±

0,82***

Глутатіонпероксидаза нМ GSH/хв./мг білка

24,6±

1,65

22,1±

2,14

26,2±

1,04

23,6±

1,22

31,2±

2,35*

28,3±

2,67

Каталаза, мМ/хв./мг білка

41,7±

1,21

42,3±

3,82

47,2±

1,43*

45,1±

2,22

52,6±

3,74*

53,5±

3,45**

ТБК-активні продукти, нМ/мл

6,5±

0,20

6,1±

0,35

5,5±

0,24,**

5,3±

0,31**

4,9±

0,40**

4,7±

0,49**

Гідроперекиси ліпідів, Ех. 1000

526,5±

37,6

552,4±

26,7

418,7±

23,5*

424,4±

18,7*

358,4±

22,3**

366,7±

20,1**

Біохімічні показники крові телиць-реципієнтів при застосуванні різних міорелаксантів та седативних засобів, M±m, n=10

Примітки. 1) К — контрольна і 1, 2, 3, 4, 5 Д — дослідні групи; 2) СЕА — сакральна епідуральна анестезія; ПСБ — парасакральна блокада; Х — ханегіф; С — седазин.

Одержані результати підтверджуються і дослідженнями кортизолу, концентрація якого була нижчою у крові тварин дослідних груп: 2-ї на 15,6 % (р<0,05), 3-ї — на 17,9 % (р<0,01), 4-ї — на 45,5 % (р<0,01) і 5-ї — на 43,7 % (р<0,001).

Вміст загального холестеролу у телиць 2 і 3 дослідних груп був, відповідно, на 25,4 і 21,6 % більший (р<0,05), порівняно з тваринами контрольної групи. Це свідчить про те, що під впливом міорелаксанту “Ханегіф” знижується моторика матки і, як наслідок, пригнічується активність простагландинів — антагоністів прогестерону, попередником якого є холестерол.

У крові реципієнтів 4 і 5 дослідних груп рівень загального холестеролу зростає не так виражено — всього на 8,5 та 13,6 % порівняно з контролем. Очевидно, що седативний препарат “Седазин” та епідуральна анестезія, викликаючи пригнічення організму та органів тазової порожнини, повністю не знімають тонусу матки. Синергічна дія сакральної і парасакральної анестезії у поєднанні з міорелаксантом “Ханегіф” та седативним препаратом “Седазин” проявляється зростанням активності каталази у крові телиць-реципієнтв (2, 3, 4 і 5 дослідних груп відповідно на 13,2 % (р<0,05), 8,2 %, 26,1 % (р<0,05) і 28,3 % (р<0,01) порівняно з тваринами контрольної групи.

Оскільки стрес викликає значну активацію перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), застосування досліджуваних нейролептиків і міорелаксантів у поєднанні з блокадою тазового нервового сплетіння (яке є загальноприйнятим у ембріотрансплантації) дозволяє запобігти розвитку стресових явищ і знизити утворення продуктів ПОЛ. Так, у крові телиць 2, 3, 4, і 5 дослідних груп вміст ТБК-активних продуктів був вірогідно нижчий, відповідно на 15,4, 18,5, 24,6 і 27,7 % (р<0,01), порівняно з тваринами контрольної групи. Аналогічно, вміст гідроперекисів ліпідів у крові реципієнтів 2 і 3 дослідних груп менший, відповідно, на 20,5 і 19,4 % (р<0,05), а 3 і 4 дослідних груп — на 31,9 і 30,4 % (р<0,01), ніж у тварин контрольної групи.

Застосування маткового релаксанту “Ханегіф” у поєднанні з двома видами анестезії значно підвищує ефективність трансплантації ембріонів і є економічно обґрунтованим. Комбінація сакральної епідуральної та парасакральної анестезії з нейролептиком “Седазин” також підвищує приживлення ембріонів та за рахунок останнього виключає трудові затрати, пов’язані з фіксацією тварин.

Використання розроблених нами чинників (ін’єкція БАР, корекція мінерального живлення, підсадження бластомерів дегенерованих бластоцист) у телиць-реципієнтів підвищує приживлюваність in vitro отриманих ембріонів на 9,1–17,4 % і наближує її до рівня приживлення нативних ембріонів (табл. 9).

Таблиця 9

Приживлення in vitro отриманих ембріонів та концентрація стероїдних гормонів плазми крові телиць-реципієнтів при використанні БАР

Показники

Групи тварин

контрольна

1 дослідна

ін’єкція БАР

2 дослідна

премікс

3 дослідна

бластомери

Відібрано телиць, n

18

20

18

17

Виявлено тварин з жовтим тілом, n–%

11–61,1

16–80,0

13–72,2

11–64,7

Приживлення

ембріонів, %

36,4

50,0

53,8

45,5

Прогестерон, нмоль/л

6,02±0,56

9,33±0,91**

7,82±0,54*

6,14±0,72

Естрадіол-17, пмоль/л

35,64±2,52

28,42±2,14*

31,40±3,72

33,28±3,96

Концентрація стероїдних гормонів у крові телиць-реципієнтів на 7-й день синхронізованого статевого циклу підтверджує позитивну дію досліджуваних БАР на органи розмноження, що виражається у підвищенні приживлюваності ембріонів, отриманих in vitro. Так, рівень прогестерону у крові телиць 1 і 2 дослідних груп вищий відповідно на 54,9 % (p<0,01) та 29,9 % (p<0,05), ніж у тварин контрольної групи. У 1 дослідній групі підвищення концентрації прогестерону викликається введенням сурфагону у складі комплексу БАР, який стимулює виділення лютеїнізуючого гормону, котрий у свою чергу посилює секрецію прогестерону і знижує рівень естрадіолу на 20,3 % (p<0,05).

Зростання рівня прогестерону у крові тварин 2 дослідної групи, очевидно, пов’язане з додатковим синтезом стероїдних гормонів під впливом вітамінів та мікроелементів, що поступали в організм реципієнтів з преміксом.

Таким чином, приживлюваність трансплантованих ембріонів, одержаних in vitro, при застосуванні комплексу БАР, згодовуванні вітамінно-мінерального преміксу, введенні бластомерів дегенерованих ембріонів підвищується аналогічно, як при пересадці нативних та деконсервованих ембріонів.

Розрахунком економічної ефективності обґрунтовано доцільність застосування досліджуваних чинників для збільшення виходу морфологічно якісних ембріонів від корів-донорів та підвищення приживлення трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів. Зокрема, при застосуванні комплексу ліпосома-ФСГ для індукції поліовуляції у корів-донорів собівартість ембріона зменшується на 52,0 грн або 13,9 %, а при використанні комплексу БАР зі спермою бугаїв при осіменінні донорів — відповідно, на 48,3 грн або 12,8 %.

Застосування мембраностабілізуючих речовин (холестерол, лінолева кислота, інсолвіт) при надшвидкому заморожуванні знизило собівартість приживленого ембріона, відповідно, на 8,7, 11,5 і 30,0 %, що у грошовому еквіваленті становить 122,0, 162 і 480 грн.

Згодовування телицям-реципієнтам дефіцитних мікроелементів знизило собівартість приживленого ембріона на 14,2–18,8 %, а ін’єкція комплексу БАР — на 24,7 %, або 347 грн.

Найбільший економічний ефект отримано при застосуванні міорелаксантів та седативних препаратів телицям-реципієнтам. Використання сакральної епідуральної анестезії або парасакральної блокади тазового нервового сплетіння у поєднанні з міорелаксантом “Ханегіф” та седативним препаратом “Седазин” знизило собівартість приживленого ембріона на 24,1–36,2 %. Найнижча собівартість приживленого ембріона становила 1100,0 грн.

Ін’єкція БАР, корекція мінерального живлення, підсадження бластомерів дегенерованих бластоцист при трансплантації ембріонів, отриманих in vitro, знизили собівартість приживленого ембріона, відповідно, на 25,4, 28,9 і 19,3 %.


ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично і експериментально обґрунтовано, розроблено та удосконалено основні технологічні елементи трансплантації ембріонів: добір корів-донорів і телиць-реципієнтів, стимуляцію поліовуляції і штучне осіменіння донорів, нехірургічну трансплантацію ембріонів реципієнтам та надшвидкий метод кріоконсервування ембріонів.

  1.  Внутрішньошкірне введення стероїдних гормонів (прогестерону, естрадіолу-дипропіонату і фолікуліну) є важливим діагностичним тестом для виявлення патології яєчників у корів і телиць з метою підвищення ефективності відбору потенційних донорів і реципієнтів. Результати внутрішньошкірних проб (потовщення шкіри, гіперемія, свербіння) відповідають окремим патологіям яєчників і корелюють з концентрацією стероїдних гормонів у крові піддослідних корів і телиць. При персистентному жовтому тілі спостерігається високий рівень прогестерону (7,6±1,2 нг/мл) на фоні низького рівня естрогенів. Лютеїнові кісти супроводжуються аналогічними співвідношеннями досліджуваних гормонів, однак, концентрація прогестерону вища на 60,5–82,4 %, естрадіолу — на 47,8–52,4 % та естрону — у 2–2,2 раза.
  2.  Дворазова ін’єкція препаратів ФСГ (Фолікотропін, ФСГ-п, ФСГ-супер) у складі ліпосомальної емульсії викликає множинну овуляцію у корів-донорів та забезпечує плавне проходження інволюційних процесів у статевих органах, що виражається в одержанні стабільних результатів ембріопродукції (понад чотири доброякісних ембріони) протягом усього періоду використання постійних донорів. Зменшення дози «Фолікотропіну» на 20,0 % і 30,0 % у складі ліпосомальної емульсії знижує кількість доброякісних ембріонів у корів-донорів відповідно на 60,0 % (p<0,01) та у 2 рази (p<0,001). Аналогічно зменшення дози «ФСГ-супер» у складі ліпосомальної емульсії знижує показники ембріопродукції у корів-донорів. Комплекс ліпосома-ФСГ проявляє поліовулюючу дію як при максимальній (50 мг), так і при мінімальній (32 мг) дозах ФСГ-п.
  3.  Встановлено суттєві відмінності фізіологічних і біохімічних показників нативної сперми залежно від сезону року. Виявлено істотну позитивну кореляцію у зимовий період між концентрацією сперміїв і вмістом гемоглобіну у крові (r=0,68), між активністю сперміїв і кількістю еритроцитів (r=0,74), відмічено зворотний зв’язок між концентрацією сперміїв і вмістом фруктози у спермі. Еякуляти бугаїв з високою активністю окисних ферментів (СДГ і ЦО) характеризуються високою запліднювальною здатністю суперовульованих корів-донорів.
  4.  Додавання комплексу біологічно активних речовин (унітіол, інозин, естрофан, глутатіон L-цистеїн) до деконсервованої сперми бугаїв-плідників продовжує її життєздатність на одну годину при зростанні активності майже удвічі (p<0,01). За умов інкубації in vitro збільшується абсолютний показник виживання сперміїв на 2 одиниці (p<0,05), кількість живих сперміїв (p<0,05) та зменшується відсоток їх патологічних форм (p<0,01).
    1.  Введення комплексу БАР у статеві шляхи корів із спермою бугаїв підвищує відсоток запліднення від першого осіменіння на 11,8 %, кількість позитивних осіменінь на 11,1 %, зменшує індекс осіменіння з 1,8 до 1,5, а кількість спермодоз на одне осіменіння з 3,2 до 2,5. Встановлено вірогідне (p<0,05) зростання вмісту загального холестеролу, вільних сульфгідрильних груп, імуноглобулінів та концентрації прогестерону у дослідних корів.
    2.  Осіменіння корів-донорів спермою бугаїв-плідників з комплексом БАР підвищує кількість доброякісних ембріонів на 15,5–19,0 %, у тому числі відмінної якості — на 13,3–17,2 %, зменшує частку незапліднених яйцеклітин на 30–40 % за однакової кількості дегенерованих ембріонів.
    3.  Введення мембраностабілізуючих речовин (інсолвіт, лінолева кислота, лінолеат та олеат холестеролу) у вітрифікаційні середовища для заморожування ембріонів мишей та великої рогатої худоби надшвидким методом значно знижує кількість морфологічно пошкоджених репродуктивних клітин після їх деконсервування, що зумовлює їх краще збереження (до 90 %) при дії низьких температур та підвищує приживлюваність трансплантованих ембріонів корів на 7,2–17,0 %.
    4.  Компенсація дефіцитних мікроелементів у раціонах (Купрум, Цинк, Селен, Кобальт, Йод) телицям-реципієнтам вірогідно збільшує їх концентрацію у крові та шерсті (p<0,05–0,01), підвищує активність глутатіонпероксидази, супероксиддисмутази, лужної фосфатази (p<0,05), які є інтегральними показниками позитивної дії, відповідно, Селену, Купруму та Цинку, а також підвищує приживлюваність трансплантованих ембріонів на 8,3–12,7 %.
    5.  Внутрішньом’язова ін’єкція БАР (сурфагон, інсолвіт, імукор, ДМСО) телицям-реципієнтам в 0-й день статевого циклу посилює інтенсивність обмінних процесів у статевих органах телиць, що проявляється вірогідним зростанням окремих біохімічних (глікоген, вільні сульфгідрильні групи, каротин) та гістологічних (кількість маткових залоз, висота епітелію маткових залоз та ендометрію) показників яєчників і матки (p<0,05–0,001). Збільшує кількість тварин з функціонуючим жовтим тілом на 22,5 %, підвищує приживлення трансплантованих ембріонів на 15,6 %.
    6.  При трансплантації деконсервованих ембріонів з додатковим введенням бластомерів дегенерованих бластоцист посилюється ембріонально-матковий сигнал, що підтверджується збільшенням кількості білків ендометрію з молекулярною масою 45–50 кДа  та 66–70 кДа, вірогідним зростанням концентрації прогестерону в крові (p<0,05) та підвищенням рівня приживлення у телиць-реципієнтів на 12,9 %.
    7.  Комплексні застосування телицям-реципієнтам сакральної епідуральної та парасакральної анестезії у поєднанні з міорелаксантом “Ханегіф” та нейролептиком “Седазин” нормалізує в крові інтенсивність перекисного окиснення ліпідів та вірогідно знижує вміст основних продуктів ПОЛ: ТБК-активних продуктів і гідроперекисів ліпідів (р<0,05 – 0,01). Також знижується концентрація в крові кортизолу (р<0,05 – 0,001), вміст глюкози (р<0,05), як основних інтегральних показників стресу, що сприяє підвищенню приживлюваності трансплантованих ембріонів на 12,4–21,3 %.
    8.  Застосування телицям-реципієнтам біологічно активних речовин (ін’єкція сурфагону, інсолвіту, імукору, димексиду), згодовування вітамінно-мінерального преміксу; трансплантація з ембріонами додаткових бластомерів) підвищує приживлюваність деконсервованих ембріонів, одержаних in vitro, на 9,1–18,9 %. Це підтверджується вірогідним підвищенням концентрації прогестерону (p<0,05–0,01), що свідчить про посилення лютеотропної дії.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

  1.  При доборі корів та телиць для використання їх як потенційних донорів і реципієнтів доцільно проводити алергічні проби на стероїдні гормони. Для цього внутрішньошкірно, у верхній третині шиї, одноразово, окремо вводити: 1 % розчин прогестерону, 0,1 % розчин естрадіолу-дипропіонату і 0,05 % розчин естрону (фолікуліну) по 0,02 мл. Через 25 хвилин клінічно обстежити місцеву реакцію на введення гормонів. Слід відбирати тварин з позитивною реакцією на прогестерон і негативною на естрадіол та фолікулін, що відповідає наявності жовтого тіла в яєчнику. (Патент на корисну модель №41798 від 10.06.2009).
  2.  Для отримання стабільних результатів ембріопродуктивності та зменшення стресових навантажень на корів-донорів індукувати множинну овуляцію фолікулостимулюючими гормонами (Фолікотропін, ФСГ-п, ФСГ-супер) у складі ліпосомальної емульсії (тривіт — 4 мл, лецитин — 1 мл, твін — 0,2 мл, ДМСО — до 10 % концентрації) дворазовою ін’єкцією на 8-й і 10-й дні синхронізованого статевого циклу. При осіменінні донорів з метою підвищення заплідненості, збільшення кількості та якості ембріонів необхідно до розмороженої сперми бугаїв додавати комплекс БАР (естрофан — 12,5 мкг/мл, інозин — 0,05 мг/мл, унітіол — 1 мг/мл, глутатіон — 0,5 мМ, L-цистеїн — 0,5 мМ). (Патент на корисну модель №46282 від 10.12.2009).
  3.  Для забезпечення високого і стабільного рівня приживлення трансплантованих ембріонів в умовах Західної біогеохімічної провінції необхідно проводити балансування раціонів телиць-реципієнтів за дефіцитними мікроелементами (Купрум, Цинк, Йод, Кобальт, Манган, Селен). Мікроелементи у вигляді солей доцільно включати в комбікорми у дозах (мг): цинку сульфат — 490–690, мангану сульфат — 110–290, купруму сульфат — 120–140, кобальту хлорид — 16–17, натрію селеніт — 2–3, калію йодид — 1–2 і згодовувати впродовж 45 днів перед трансплантацією ембріонів.
  4.  Для підвищення приживлюваності нативних, деконсервованих та in vitro одержаних ембріонів під час індукованої статевої охоти телицям-реципієнтам доцільно ін’єктувати комплекс БАР, який включає: синтетичний аналог Гн-РГ (сурфагон) — 5 мл, вододисперсний препарат вітамінів А, D3, E (інсолвіт) — 5 мл, імуностимулятор (імукор) — 1 г, ДМСО — 10% від загальної кількості розчину, а перед нехірургічною пересадкою телицям-реципієнтам проводити парасакральну анестезію (150 мл 0,7 % розчину новокаїну) у комбінації з седативним препаратом «Седазин» (0,1 мл на 100 кг маси) чи матковим релаксантом «Ханегіф» (10–20 мл), або сакральну епідуральну анестезію (5 мл 2% розчину новокаїну) в поєднанні з матковим релаксантом «Ханегіф» (10–20 мл).


СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Довідник з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби /В. П. Буркат, В. В. Влізло, Р. Й. Кравців, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький, А. В. Мадіч, А. А. Гамота, Л. В. Мадісон, В. В. Мадісон, І. М. Яремчук, В. О. Дудчак/ Львів: Нові перспективи, 2004. — 150 с. (Дисертант висвітлив розділи з добору корів-донорів і реципієнтів, індукції суперовуляції, надшвидкого методу кріоконсервації та трансплантації ембріонів ВРХ).

Статті у наукових фахових виданнях

  1.  Шаран М. М. Добір корів-донорів ембріонів шляхом визначення функції яєчників шкірною алергічною реакцією /М. М. Шаран // Біологія тварин. — 2007. — Т 9, № 1–2. — С. 257–262.
  2.  Шаран М. М. Добір телиць-реципієнтів за алергічним методом визначення функції яєчників /М. М. Шаран // Наук.-тех. бюл. Ін-ту тваринництва УААН. — Харків, 2008. — № 96. — С. 454 –459.
  3.  Шаран М. М. Ефективність застосування фолікотропіну у складі ліпосомальної емульсії для індукції поліовуляції у корів-донорів при багаторазовому їх використанні /М. М. Шаран // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. — 2008. —Т. 10, № 2 (37), ч. 1. — С. 407–411.
  4.  Шаран М. М. Застосування комплексу біологічно активних речовин для підвищення приживлення ембріонів у телиць-реципієнтів /М. М. Шаран // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. — Львів, 2008. — Вип. 9, № 4. — С. 202–208.
  5.  Шаран М. М. Застосування ліпосомальної емульсії для введення гонадотропіну при індукції поліовуляції у корів-донорів /М. М. Шаран // Наук.-тех. бюл. Ін-ту тваринництва УААН. — Харків, 2008. — № 97. — С. 157–161.
  6.  Шаран М. М. Підвищення заплідненості у корів застосуванням біологічно активних речовин із спермою бугаїв /М. М. Шаран // Сільський господар. — 2009. — № 1–2. — С. 12–15.
  7.  Шаран М. М. Застосування седативних препаратів та міорелаксантів при трансплантації ембріонів /М. М. Шаран // Сільський господар. — 2009. — № 3–4 — С. 29–32.
  8.  Шаран М. М. Стабілізація мембран ембріонів при кріоконсервуванні надшвидким методом /М. М. Шаран // Біологія тварин. — 2009. — Т. 11, № 1–2. — С. 348–355.
  9.  Шаран М. М. Посилення ембріонально-маткового сигналу у телиць-реципієнтів з використанням БАР /Шаран М. М. // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. — 2009. — Т. 11, № 2 (41), ч. 3. — С. 247–251.
  10.  Шаран М. М. Застосування лінолевої кислоти у середовищі для надшвидкого заморожування ембріонів тварин /М. М. Шаран // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. — Львів, 2009. — Вип. 10, № 3. — С. 287–292.
  11.  Шаран М. М. Кріопротекторні властивості холестеролу при надшвидкому заморожуванні ембріонів /М. М. Шаран // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. — 2009. — Т. 11, № 3 (42), ч. 2. — С 190–194.
  12.  Шаран М. М. Вплив біологічно активних речовин на функціональний стан репродуктивних органів і приживлення ембріонів у реципієнтів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило, М. Д. Пасіцький // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН. — Львів, 2004. — Вип. 5, № 3. — С. 218–222. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, провів трансплантацію ембріонів та визначення стероїдних гормонів, підготував текст до друку).
  13.  Шаловило С. Г. Перспективи застосування нових біотехнологічних методів відтворення у племінному скотарстві /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Наук. вісник Львівської нац. акад. вет. медицини ім. С. З. Ґжицького. — 2007. — Т. 9, № 2 (33), ч. 3. — С. 94–98. (Дисертант висвітлив перспективи застосування трансплантації, кріоконсервації та одержання in vitro ембріонів).
  14.  Використання білих мишей як біологічної моделі в проведенні експериментальних досліджень для тестування гормональних препаратів /О. Б. Андрушко, М. М. Шаран, С. Б. Корнят, А. Р. Корбецький, Ю. Р. Балабан, В. О. Дудчак, З. С. Топурко // Біологія тварин. — 2007. — Т. 9, № 1–2. — С. 269–274. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, сформулював висновки, відредагував статтю).
  15.  Шаран М. М. Біологічні показники деконсервованої сперми бугаїв при інкубації з окремими біологічно активними речовинами /М. М. Шаран, І. М. Яремчук // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок.— Львів, 2008. — Вип. 9, № 3. — С. 231–237. (Дисертант розробив програму досліджень, брав участь у проведенні експериментів, сформулював висновки, відредагував статтю).
  16.  Шаран М. М. Взаємозв’язок біохімічних показників крові і сперми бугаїв-плідників з якістю спермопродукції /М. М. Шаран, І. М. Яремчук, С. Г. Шаловило // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. — 2008. — Т. 10, № 3 (38), ч. 2. — С. 263–268. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, виконав експеримент з комплексом БАР, проаналізував результати, підготував статтю до друку).
  17.  Шаран М. М. Ефективність застосування комплексу ліпосома-ФСГ для індукції множинної овуляції у корів-донорів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило // Сільський господар. — 2008. — № 7–8. — С. 7–8. (Дисертант теоретично обґрунтував дослідження, виконав експериментальну частину роботи, підготував текст до друку).
  18.  Шаран М. М. Кріозахисна ефективність вододисперсної форми жиророзчинних вітамінів при додаванні їх у середовища для надшвидкого заморожування ембріонів тварин /М. М. Шаран, І. М. Яремчук // Біологія тварин. — 2008. — Т. 10, № 1–2. — С. 328–333. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, виконав дослід на ембріонах корів, підготував текст до друку).
  19.  Шаран М. М. Заплідненість та якість ембріонів у корів-донорів при застосуванні біологічно активних речовин із спермою бугаїв /М. М. Шаран, І. М. Яремчук // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН і ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. — Львів, 2009. — Вип. 10, № 1–2. — С. 370–375. (Дисертант теоретично обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).
  20.  Шаран М. М. Підвищення приживленості ембріонів, одержаних in vitro, застосуванням біологічно активних речовин /М. М. Шаран, О. Є. Гузєватий, С. Г. Шаловило // Наук. вісник Львівського нац. універ. вет. медицини та біотехнологій ім. С. З. Ґжицького. — 2009. — Т. 11, № 2 (41), ч. 2. — С. 327–331. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, трансплантації ембріонів, сформулював висновки, підготував статтю).
  21.  Шаловило С. Г. Вплив аналогів гонадоліберину на вихід повноцінних ембріонів /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Вісник аграрної науки. — 1999. — № 3. — С. 44–46. (Дисертант провів підготовку донорів, вимивання ембріонів, сформулював висновки, підготував статтю).
  22.  Шавкун В. Ю. Регуляція гормональної функції жовтого тіла у телиць-реципієнтів /В. Ю. Шавкун, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран // Зб. “Розведення і генетика тварин”. — 1999. — № 30. — С. 108–112. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, визначенні функції яєчників, підготував статтю).
  23.  Шаран М. М. Вплив багаторазового використання корів-донорів на функціональний стан репродуктивних органів та вихід ембріонів /М. М. Шаран, І. М. Яремчук, З. В. Татомир // Наук.-тех.бюл. Ін-ту землеробства і біології тварин УААН. — 1999. — Вип. 1 (3). — С. 236–238. (Дисертант теоретично обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).
  24.  Шаловило С. Г. Ембріопродуктивність корів-донорів залежно від віку і породи /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Тваринництво України. — 2001. — № 1. — С. 13–15. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, підготовці статті).
  25.  Взаємозв’язок між запліднюючою здатністю сперми бугаїв-плідників та ембріопродуктивністю корів-донорів /В. О. Дудчак, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Наук.-тех.бюл. Ін-ту біології тварин УААН. — 2001. — Вип. 1–2. — С. 255–258. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, вимиванні та оцінці ембріонів, відредагував статтю).
  26.  Дудчак В. О. Запліднення яйцеклітин та якість ембріонів у корів-донорів під впливом гонадотропін рилізинг-гормону при осіменінні спермою з різною активністю окисних ферментів /В. О. Дудчак, М. М. Шаран,С. Г. Шаловило // Наук.вісник Львівської нац. акад. вет. медицини ім. С. З. Ґжицького. — 2005. — Т. 7, № 2, ч. 1. — С. 25–28. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, редагуванні статті).

Патенти

  1.  Пат. 62361 А Україна, МПК А 61 D 19/04. Спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів заморожених надшвидким методом /І. М. Яремчук, С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький; заявник і патентовласник Ін-т біології тварин УААН. — 2003032130 заяв. 11.03.03; опубл. 15.12.2003. Бюл. № 12 (Дисертант брав участь у підготовці методики, узагальнення результатів експериментів, редагуванні тексту).
  2.  Пат. 41798 Україна, МПК А 01 К 67/02 А 61 К 31/07. Спосіб відбору корів-донорів і телиць-реципієнтів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило, О. Б. Андрушко; заявник і патентовласник Ін-т біології тварин УААН. — u 2008 14844; заяв. 23.12.08; опубл. 10.06.2009. Бюл. № 11 (Дисертант підготував методику, узагальнення результатів експериментів, відредагував текст).
  3.  Пат. 46282 Україна, МПК А 01 К 15/00. Спосіб індукції поліовуляції у корів-донорів /М. М. Шаран, С. Г. Шаловило, О. Б. Андрушко; u 2009 07633; заяв. 20.07.09; опубл. 10.12.2009. Бюл. №23. (Дисертант підготував методику, узагальнення результатів експериментів, відредагував текст).

Статті у науково-популярних журналах

  1.  Шаловило С. Г. Диспансеризація корів-донорів — важливий захід підвищення ефективності трансплантації ембріонів /С. Г. Шаловило, М. М. Шаран, М. Д. Пасіцький // Ветеринарна медицина України. — 1998. — № 3. — С. 17. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, сформулював висновки, підготував статтю).
  2.  Біотехнологія відтворення у скотарстві /С. Г. Шаловило, А. В. Мадіч, М. М. Шаран, М. Й. Бец // Сільські обрії. — 1997. — № 10–12. — С. 35. (Дисертант висвітлив можливості застосування трансплантації і кріоконсервації ембріонів у скотарстві).

Статті на конференціях

  1.  Шаран М. М. Застосування комплексу ліпосома-ФСГ для індукції множинної овуляції у корів-донорів /М. М. Шаран // Матеріали Міжнар. наук.-практ. конф. «Новітні технології скотарства у ХХІ столітті» — Миколаїв, 2008. —С.199–203.
  2.  Шаран М. М. Застосування комплексу ФСГ-ліпосома для індукції поліовуляції у корів-донорів при багаторазовому їх використанні /М. М. Шаран // Материалы ХІІ Межд. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства» — Горки, 2009. — С. 27–32.
  3.  Shalowylo S. The influence of the biological active substances in grafting of dekoncervated embryos. /S. Shalowylo, M. Sharan, M. Pasitsky, W. Dudchak // 1-st Polish-Ukrainian Scientific Cоnference Animal Sciences in the XXI century”. — Krakоw, 2001. — Р. 197201. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, сформулював висновки, відредагував статтю).
  4.  Šaran M. Induction of superovulation in cows-donors with use of FSH with liposomal emulsion /M. Šaran, A. Korbetskyy, M. Samek // VIII Kabrtovy dieticke dny. — Brno, 2009. — P. 66–70. (Дисертант обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).
  5.  Шаран Н. М. Эмбриопродуктивность коров-доноров при использовании биологически активных веществ со спермой быков /Н. М. Шаран, И. М. Яремчук, С. Г. Шаловило // Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных — Воронеж: Истоки, 2009. — С. 384–388. (Дисертант теоретично обґрунтував програму досліджень, проаналізував результати, підготував статтю до друку).
  6.  Яремчук И. М. Усовершенствование среды для размораживания эмбрионов крупного рогатого скота /И. М. Яремчук, С. Г. Шаловило, Н. М. Шаран // Сб.науч.трудов «Зоотехническая наука Беларуси». — Гродно, 2004. — С. 170–173. (Дисертант брав участь у розробці програми досліджень, проведенні експериментів, редагуванні статті).

Методичні рекомендації

  1.  Шаран М. М. Підвищення ефективності штучного осіменіння  корів і телиць. Методичні рекомендації. Львів, 2009. — Тираж 150 — 38 с.
  2.  Шаран М. М. Застосування трансплантації ембріонів у молочному і м’ясному скотарстві. Методичні рекомендації. Львів, 2009. — Тираж 200 — 60 с.

АНОТАЦІЇ

Шаран М. М. Експериментальне обґрунтування та удосконалення методів трансплантації і кріоконсервації ембріонів великої рогатої худоби – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 — біотехнологія. — Інститут біології тварин НААН України. —– Львів, 2010.

У дисертаційній роботі на основі теоретичних узагальнень розроблено і удосконалено основні методи технології трансплантації ембріонів великої рогатої худоби: добір корів-донорів і реципієнтів, стимуляцію поліовуляції і штучне осіменіння донорів, кріоконсервацію ембріонів і їх приживлюваність після пересадки реципієнтам.

Досліджено алергічну реакцію на введення стероїдних гормонів, що дозволило удосконалити добір корів-донорів і реципієнтів. Розроблено спосіб гормональної стимуляції суперовуляції пролонгацією дії препаратів ФСГ з використанням ліпосом, який дає можливість одержувати стабільні результати ембріопродукції (понад чотири доброякісних ембріони) протягом усього періоду використання постійних донорів.

Для збільшення кількості ембріонів, придатних для трансплантації, розроблено спосіб підвищення ембріопродуктивності у корів-донорів застосуванням комплексу БАР (естрофан, інозин, унітіол, глутатіон, L-цистеїн) із спермою бугаїв.

На основі вивчення кріопротекторних властивостей мембраностабілізуючих речовин (інсолвіт, лінолева кислота, холестерол) удосконалено надшвидкий метод кріоконсервування ембріонів, який забезпечує краще збереження (до 90 %) за дії низьких температур та підвищує їх приживлюваність на 7,2–17,0 %.

Досліджено залежність функціонування статевих органів телиць-реципієнтів і приживлення трансплантованих ембріонів від мінерального живлення в умовах Західної біогеохімічної провінції та розроблено способи його корекції.

Вивчено вплив біологічно активних речовин, фармацевтичних засобів та біотехнологічних прийомів на підвищення приживлюваності трансплантованих ембріонів у телиць-реципієнтів і, зокрема, одержаних in vitro.

Ключові слова: велика рогата худоба, ембріон, трансплантація, кріоконсервація, приживлюваність, біологічно активні речовини.


Шаран Н.М. Экспериментальное обоснование и усовершенствование методов трансплантации и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 — биотехнология. — Институт биологии животных НААН Украины. — Львов, 2010.

В диссертационной работе на основе теоретических обобщений разработаны и усовершенствованы основные методы технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота: отбор коров-доноров и реципиентов, стимуляция полиовуляции и искусственное осеменение доноров, криоконсервация эмбрионов и их приживаемость после пересадки реципиентам.

Исследована аллергическая реакция на введение стероидных гормонов, что позволило усовершенствовать отбор коров-доноров и реципиентов. Внутрикожное введение стероидных гормонов (прогестерона, эстрадиола-дипропионата и фоликулина) является важным диагностическим тестом для выявления патологии яичников у коров и телок с целью повышения эффективности отбора потенциальных доноров и реципиентов.

Разработан способ гормональной стимуляции суперовуляции пролонгацией действия препаратов ФСГ с использованием липосом, позволяющий получать стабильные результаты эмбриопродукции (свыше четырех доброкачественных эмбрионов) в течение всего периода использования постоянных доноров при меньших стрессовых нагрузках и трудовых затратах.

Для увеличения количества эмбрионов, пригодных для трансплантации, разработан способ повышения эмбриопродуктивности у коров-доноров применением комплекса биологически активных веществ (БАВ) (эстрофан, инозин, унитиол, глутатион, L-цистеин) со спермой быков. Осеменение коров-доноров спермой быков-производителей с комплексом БАВ повышает количество доброкачественных эмбрионов на 15,5–19,0 %, в том числе отличного качества — на 13,3–17,2 %, уменьшает долю неоплодотворенных яйцеклеток на 30–40 % при равенстве дегенерованих эмбрионов.

На основе изучения криопротекторных свойств мембраностабилизирующих веществ (инсолвит, линолевая кислота, холестерол) усовершенствован сверхбыстрый метод криоконсервирования эмбрионов, который обеспечивает лучшее сохранение (до 90 %) при воздействии низких температур и повышает их приживаемость на 7,2–17,0 %.

Исследована зависимость функционирования половых органов телок-реципиентов и приживление трансплантированных эмбрионов от минерального питания в условиях Западной биогеохимической провинции и разработаны способы его коррекции. Компенсация дефицитных микроэлементов в рационах (Купрум, Цинк, Селен, Кобальт, Йод) телкам-реципиентам увеличивает концентрацию указанных микроэлементов в крови и шерсти (p<0,05–0,01), повышает активность глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, щелочной фосфатазы (p<0,05), которые являются интегральными показателями положительного действия, соответственно, селена, меди и цинка, а также повышает приживаемость трансплантированных эмбрионов на 8,3–12,7 %.

Изучено влияние БАВ, фармацевтических препаратов и биотехнологических приемов на повышение приживаемости трансплантированных эмбрионов в телок-реципиентов и, в частности, полученных in vitro. Внутримышечная инъекция БАВ (сурфагон, инсолвит, имукор, ДМСО) телкам-реципиентам в 0-й день полового цикла усиливает интенсивность обменных процессов в половых органах телок, что проявляется увеличением количества животных с функционирующим желтым телом на 22,5 %, повышением приживления трансплантированных эмбрионов на 15,6 %.

Применение телкам-реципиентам БАВ (инъекция сурфагона, инсолвита, имукора, димексида), скармливание витаминно-минерального премикса; трансплантация с эмбрионами дополнительных бластомеров) повышает приживаемость деконсервованих эмбрионов, полученных in vitro, на 9,1–18,9 % .

Комплексные применения телкам-реципиентам сакральной эпидуральной и парасакральной анестезии в сочетании с миорелаксантом "Ханегиф" и нейролептиком "Седазин" нормализует в крови интенсивность перекисного окисления липидов, снижает концентрацию основных интегральных показателей стресса, способствует повышению трансплантированных эмбрионов на 12,4–21,3 %. 

Ключевые слова: крупный рогатый скот, эмбрион, трансплантация, криоконсервация, приживаемость, биологически активные вещества.

Sharan M. Experimental justification and improvement of methods of transplantation and cryopreservation of cattle embryos — Manuscript. 

Thesis for Doctor's degree in agricultural sciences, specialty 03.00.20 — biotechnology. — Institute of Animal Biology NAAN of Ukraine. — L’viv, 2010.

On the basis of theoretical generalizations in the thesis were developed and improved the basic methods of embryo transplantation technology in cattle: the selection of cows-donors and recipients, inducing poliovulation and artificial insemination in donors, embryo cryopreservation and their implantation rate after transplantation to recipients.

Skin allergic reaction to the introduction of steroids, allowing us to improve the selection of cow-donors and recipients has been investigated. Also was developed the method of hormonal inducing of poliovulation by prolongation of FSH preparations action with liposomes which can get positive results of embryoproduction (over four good quality embryos) during the whole period of regular donors usage.

To increase the number of embryos suitable for transplantation developed a way to increase embryoproduction in cows-donors using complex of biologically active compounds or BAC (estrofan, inozyn, unitiol, glutathione, L-Cysteine) with bull semen at AI.

On the basis of cryoprotectoral properties and membrane stabilisating effect of substances (insolvit, linolenic acid, cholesterol) was improved the ultrafast method of embryo cryopreservation, which provides better recovery (90%) under the action of low temperatures and increases their implantation rate by 7,2-17,0% .

The dependence of genital function of heifer-recipients and implantation rate of transplanted embryos after mineral nutrition in conditions of Western biogeochemical region has been studied, and also developed ways to its correction.

Was explored the influence of biologically active compounds, pharmaceuticals and biotechnological techniques on improvement of implantation rate of transplanted embryos in heifer-recipients and, in particular, obtained in vitro.

Keywords: cattle, embryo transfer, cryopreservation, implantation rate, biologically active compounds.




Підписано до друку 17.05.2010. Формат 60х901/16

Папір офсетний. Тираж 100 прим.

Умовн. друк. арк. 1,9. Замовлення № 234

м.Львів, вул. Драгоманова, 14/16, к. 3

ПП «Арк-сервіс», тел. 261 13 80



 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

49241. Сущность прибыли, ее роль в деятельности организации СООО «Ингман мороженое» 232 KB
  Величина прибыли зависит от производственной, снабженческой, сбытовой и финансовой деятельности организации. Поэтому при новых условиях хозяйствования, перехода организаций промышленности к рыночной экономике одним из важнейших показателей оценки эффективности их деятельности является прибыль.
49242. Учет вакантных должностей по предприятию 359.63 KB
  Рассылка писем 6 Исходные данные На листе Справочники переименованный Лист1 создаём таблицы Фамилия работника Коэффициент и День недели Рисунок 1 Основная таблица На листе Выходные дни переименованный Лист2 создаем основную рабочую таблицу. Рисунок 3. Ввод данных в виде списка в столбцы Фамилия работника и День недели обеспечиваем с помощью команды Проверка данных...
49243. Комбинированная газопаротурбинная установка 2.96 MB
  Схема представляет собой одноконтурную ТУК без промперегрева, в которую дополнительно введены элементы судового пропульсивного комплекса. В данной схеме на пропульсивной комплекс (т.е. на винт) работает ГТД и паровая турбина (ПТ1). Вторая паровая турбина (ПТ2) работает на электрогенератор и поэтому называется турбогенератором.
49246. Взаємозвязок рівня емпатії та самоставлення особистості 47.58 KB
  Вплив батьківського відношення на розвиток самоставлення у дитини. З перших днів життя дитини соціальне середовище представлена їй як система сімейної взаємодії. На перших порах саме батьки дитини є єдиними носіями соціальних відносин і єдиною ланкою яка опосередковує всі інші зв'язки дитини зі світом. Зупинюсь на особливостях взаємин батьки дитя що мають вирішальне значення в становленні особистості дитини її самооцінки і самоставлення.
49247. Програма пошуку оптимального варіанту купівлі нерухомості 2.26 MB
  Моя головна сторінка буде складатися з чотирьох блоків які реалізовуватимуться за допомогою тегу div. Тег div це так званий контейнер блок який може містити форматований текст зображення та ін Важливою особливістю блоків є їх здатність накладатися один на одного при верстці. Верстка div активно використовує CSS для гнучкого й зручного форматування елементів вебсторінок.Застосування тегу div Другий блок складатиметься з двох частин які будуть розміщенні вертикально одна відносно іншої.
49249. ПЛАНИРОВАНИЕ ТЕХНИЧЕСКОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ ТРАКТОРОВ И АВТОМОБИЛЕЙ 79.83 KB
  ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА МТП И ПЛАНИРОВАНИЕ ТЕХНИЧЕСКОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ ТРАКТОРОВ ПЛАНИРОВАНИЕ ТЕХНИЧЕСКОГО ОБСЛУЖИВАНИЯ ТРАКТОРОВ РАСЧЕТ ТРУДОЕМКОСТИ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ПРОСТОЕВ ТРАКТОРОВ НА ТО Усвоить методику и приобрести...