65592

ВПЛИВ ПОЧАТКОВИХ ОСМОТИЧНИХ ТА ТЕМПЕРАТУРНИХ УМОВ НА СТІЙКІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ ССАВЦІВ ДО ГІПЕРТОНІЧНОГО ШОКУ

Автореферат

Биология и генетика

Актуальною проблемою кріобіології є розробка нових методів зберігання еритроцитів в умовах низьких температур а також поліпшення показників збереження клітин при використанні існуючих методик зберігання. Щоб оцінити внесок висококонцентрованих розчинів солей...

Украинкский

2014-08-01

2.9 MB

2 чел.

EMBED Excel.Chart.8 \s

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Александрова Дар’я Іванівна

                                                                              УДК: 7.043:577.352.462:591.111.1

ВПЛИВ ПОЧАТКОВИХ ОСМОТИЧНИХ ТА ТЕМПЕРАТУРНИХ УМОВ НА СТІЙКІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ ССАВЦІВ ДО ГІПЕРТОНІЧНОГО ШОКУ

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

                                     Бондаренко Валерій Антонович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріофізіології клітини, м. Харків

Офіційні опоненти:   доктор біологічних наук, професор

                                     Перський Євген Ефроїмович,

                                     Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна,

                                     завідувач кафедри біохімії, м. Харків

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Гордієнко Ольга Іванівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування, м. Харків

Захист відбудеться «      »               р. о «      » годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий «      »               р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

д.б.н., професор                                                                      Л. Ф. Розанов


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Актуальною проблемою кріобіології є розробка нових методів зберігання еритроцитів в умовах низьких температур, а також поліпшення показників збереження клітин при використанні існуючих методик зберігання. У процесі заморожування на клітини негативно впливають такі несприятливі фактори: високі концентрації солей, зміна іонної сили, температури і рН середовища та ін. [Белоус А.М., Грищенко В.И., 1994]. Дослідити вплив кріопошкоджуючих факторів на клітини в реальних умовах досить складно, тому дослідники використовують модельні експерименти, які дозволяють виділити ці фактори та визначити внесок кожного з них.

На даний час вважають, що негативний вплив на еритроцити в процесі заморожування здійснюють, насамперед, високі концентрації солей, які утворюються при виморожуванні вільної води. При заморожуванні концентрація хлориду натрію в середовищі може досягати близько 4,0 моль/л [Muldren K. et all., 2004]. Щоб оцінити внесок висококонцентрованих розчинів солей у загальне кріопошкодження еритроцитів, в якості модельного експерименту використовують гіпертонічний шок – перенесення клітинної суспензії в середовище, яке містить 4,0 моль/л NaCl, при позитивних температурах [Поздняков В.В., 1989 ]. У результаті зневоднення клітин під дією високих концентрацій солей відбуваються концентрування і збільшення в'язкості внутрішньоклітинного вмісту, спостерігаються незворотні конформаційні переходи в білках цитоплазми на тлі зміни рН середовища, що викликане зменшенням розчинності солей, які входять у буферні системи клітини.

Для вивчення впливу стану окремих компонентів еритроцитів на стійкість до гіпертонічного шоку проводять модифікацію клітин, зокрема виснаження по АТФ, холестерину та ін. Ці зміни не є вузькоспецифічними і стосуються клітини в цілому. Тому для дослідження гіпертонічної чутливості клітин доцільно використовувати еритроцити різних видів ссавців, які відрізняються за складом цитоплазми (вміст води, іонний склад), здатністю мембрани до деформації, активністю транспортних шляхів, фосфоліпідним та білковим складом [Matei H. et al., 2000; Gimenez G. et al., 2007; Spengler M.I et al., 2008]. Наприклад, еритроцити бика, на відміну від еритроцитів інших видів ссавців, відносяться до високонатрієвих клітин, їх мембрани містять значну кількість сфінгомієліну при практично повній відсутності фосфатидилхоліну [Takahashi M., 1984; Contreras A., 1986]; еритроцити коня не мають білка смуги 4.2 [Guerra-Shinohara E., 1999], а для еритроцитів кролика і щура характерна вища, ніж у еритроцитів інших видів ссавців, швидкість водного транспорту [Benga G. еt al., 1995].

Розроблено підходи, які дозволяють впливати на розвиток гіпертонічного пошкодження еритроцитів. Зокрема, різні амфіфільні сполуки, які знаходяться в середовищі у момент дії стресового фактора, дозволяють значно знизити рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів людини і тварин [Шпакова Н.М. и др 2007; Писаренко Н.А. и др., 2007]. Показано, що амфіфільні сполуки при вбудовуванні в мембрану можуть викликати перерозподіл її компонентів та утворення транзиторних небішарних фаз [Hagerstrand H. et al., 1998; Шпакова Н.М. и др., 2009]. Інший підхід полягає в зміні стану еритроцитів на етапі, що передує дії гіпертонічного шоку. Так, попередня інкубація еритроцитів людини в помірно гіпертонічних електролітних та неелектролітних розчинах сприяє збільшенню стійкості клітин до гіпертонічного шоку [Поздняков В.В., 1989]. Захисну дію часткового зневоднення еритроцитів людини пов'язують зі станом цитоскелета, щільність взаємодії білків якого збільшується, що сприяє стабілізації плазматичної мембрани.

Еритроцити різних видів ссавців мають індивідуальні особливості і характеризуються різною чутливістю до гіпертонічного шоку [Єршов С.С. и др., 2004], тому становило інтерес дослідити вплив вихідного стану еритроцитів ссавців, сформованого під дією фізико-хімічних факторів і кріопротекторів, на їх чутливість до гіпертонічного шоку.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи відділу кріофізіології клітини ІПКіК НАН України за темами: "Механізми зміни осмотичної і температурної чутливості клітин при дії модифікаторів цитоскелет-мембранного комплексу, амфіфільних речовин і кріопротекторів" (шифр теми 2.2.6.15, № держ. реєстрації 0104U006437) та “Дослідження стійкості еритроцитів до дії осмотичного і температурного шоку і заморожування” (шифр теми 2.2.6.45, № держ. реєстрації 0109U000276), де автор самостійно виконував окрімі розділи, отримані результати були включені до звіту відділу.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – дослідити взаємозв'язок між зміною вихідного стану еритроцитів різних видів ссавців під дією фізико-хімічних факторів (температура, осмоляльність, модифікатори цитоскелет-мембранного комплексу, кріопротектори) та їх стійкістю до гіпертонічного шоку.

Завдання дослідження.

1. Вивчити вплив попереднього зневоднення еритроцитів ссавців (бика, коня, щура, кролика та людини) в середовищах, які містять різні концентрації NaCl і сахарози, на їх чутливість до гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaCl) при різних температурах.

2. Дослідити вплив гіпертонічних сольових середовищ NaCl на зміну гематокриту еритроцитів ссавців.

3. Дослідити вплив непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 на гематокрит і чутливість еритроцитів ссавців до гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaCl).

4. Визначити модифікуючий вплив теплової обробки (49°С) і фенілгідразину на стійкість нативних і зневоднених еритроцитів ссавців до дії гіпертонічного шоку.

5. Дослідити чутливість нативних і зневоднених еритроцитів ссавців до механічного шоку.

Об’єкт дослідження – гіпертонічний та механічний шок еритроцитів ссавців.

Предмет дослідження – температурно-осмотична чутливість еритроцитів різних видів ссавців після їх попереднього зневоднення та обробки модифікаторами цитоскелет-мембранного комплексу і кріопротекторами.

Методи дослідження – спектрофотометричний, мікрогематокритний, а також методи світлової мікроскопії, потенціометричної іонселективної іонометрії, реєстрації динаміки гіпертонічного гемолізу еритроцитів, механічного пошкодження клітин, осмометрії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що попереднє часткове зневоднення еритроцитів ссавців (бика, коня, щура) в середовищах, які містять NaCl і сахарозу, збільшує їх стійкість до подальшого гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaCl) при температурі 37, 25, 15, 0°С. Встановлено, що еритроцити ссавців (щура, коня, людини) досягають стійкого стану до гіпертонічного шоку після попереднього зневоднення в середовищах із осмоляльністю 550-800 мОсм/кг.

Вперше виявлено, що мінімальне значення гематокриту еритроцитів ссавців на етапі попередньої інкубації в гіпертонічних середовищах визначає їх максимальну стійкість при подальшому перенесенні в розчин 4,0 моль/л NaCl.

Встановлено, що універсальним фактором, який дозволяє знизити чутливість еритроцитів різних видів ссавців до гіпертонічного шоку в розчині 4,0 моль/л NaCl, є осмоляльність середовища попередньої інкубації клітин, незалежно від його якісного складу (NaCl, сахароза, ПЕО-1500).

Вперше показано, що еритроцити людини і щура найбільш чутливі до механічного шоку. Зневоднення еритроцитів ссавців в розчинах 0,4 і 0,6 моль/л NaCl призводить до підвищення їх чутливості до дії механічного шоку.

Отримано нові дані про вплив модифікації цитоскелет-мембранного комплексу (інкубація клітин при 49°С і обробка фенілгідразином) на чутливість до гіпертонічного шоку частково зневоднених еритроцитів різних видів ссавців.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі результати можуть бути використані при розробці нових підходів корекції осмотичної та температурної чутливості еритроцитів ссавців, а також при розробці середовищ гіпотермічного зберігання еритроцитів людини та тварин. Результати роботи можуть бути рекомендовані для використання в учбовому процесі в навчальних закладах, а також в різних галузях біології, зокрема кріобіології, мембранології.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним дослідженням здобувача. Автором сформульована мета і визначені завдання роботи, проведені й проаналізовані експерименти, статистично оброблені результати, проведені пошук і аналіз наукової літератури, сформульовані висновки, які грунтуються на експериментальних даних. У роботах, опублікованих у співавторстві з к.б.н. Шпаковою Н. М. і к.б.н. Орловою Н. В., відображені результати спільного планування та іх обговорення.

В опублікованих із співавторами роботах особистий вклад здобувача полягає:

- в роботах [1–3, 9–11] – в дослідженні впливу попереднього зневоднення еритроцитів ссавців в розчинах NaCl та сахарози на стійкість до гіпертонічного шоку;

- в роботах [6, 7, 12] – у визначенні впливу ПЕО-1500 та температури на розвиток гіпертонічного шоку еритроцитів ссавців;

- в роботах [4, 5] – у вивченні впливу фенілгідразину на розвиток гіпертонічного шоку еритроцитів ссавців;

- в роботі [13] – у дослідженні морфології еритроцитів ссавців у фізіологічних умовах та при збільшенні концентрації NaCl у середовищі;

- в роботах [8, 14, 15] – у вивченні особливостей стійкості нативних і зневоднених еритроцитів ссавців до механічного шоку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на III і IV Міжнародних наукових конференціях студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2007–2009 рр.); II з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007); конференції «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов–на–Дону, 2007); конференції молодих вчених ІПКіК (Харків, 2007); конференції «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008); Міжнародній науковій конференції “Біофізичні механізми функціонування живих систем” (Львів, 2008); 17 International Symposium of the European Association for Red Cell Research, EARCR 2009 (Milano, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, 5 статей – у наукових фахових журналах, 7 тез – у збірниках матеріалів конференцій, одержано 2 патенти.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 171 сторінках друкованого тексту, з яких 145 сторінок – основний зміст. Дисертація складається з наступних розділів: вступ, огляд літератури, матеріали і методи дослідження, чотири розділи власних досліджень і їх обговорення (6 підрозділів), висновки, список використаної літератури (229 джерело на 26 сторінках). Робота проілюстрована 42 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Об’єктом дослідження були еритроцити, отримані з консервованої крові людини (Нomо sapiens), бика (Bos taurus), коня (Equus caballus), кролика (Oryctolagus cuniculus) та щура (Rattus rattus), яка була заготовлена на консерванті “Глюгіцир”. Використовували кров самців, а також людини чоловічої статі.

Гіпертонічний шок здійснювали ізотермічним перенесенням еритроцитів у розчин, що містить 4,0 моль/л NaCl, після попередньої інкубації клітин у сольових або сахарозних середовищах при різних значеннях температури (37, 25, 15 і 0°С). Кінцевий гематокрит складав 0,4%.

Попередню інкубацію еритроцитів ссавців проводили в розчинах NaCl, сахарози і ПЕО-1500 (розчини сахарози і ПЕО-1500 приготовлені на фізіологічному розчині).

Вміст гемоглобіну, який вийшов у супернатант, визначали спектрофотометричним методом на СФ-4А з проточною кюветою при довжині хвилі 543 нм. За 100 %-й рівень гемолізу приймали поглинання проби, до якої додавали детергент тритон Х-100 у концентрації 0,1 %.

Реєстрацію динаміки гіпертонічного гемолізу еритроцитів проводили на установці для вимірювання розсіювання світла клітинними суспензіями при довжині хвилі 720 нм.

Кількість іонів калію, які вийшли з еритроцитів, визначали в надосаді досліджуваної проби (кінцевий гематокрит 4%) за допомогою іономіра ЕВ - 74 з використанням іоноселективного електрода ЕЛІС-121К і електрода порівняння ЕВЛ-1М3.1.

Гематокрит у суспензії еритроцитів визначали мікрогематокритним методом. Стандартний гематокритний капіляр, заповнений суспензією досліджуваних еритроцитів з гематокритом 20% на 7/8 висоти капіляра, центрифугували протягом 5 хв у мікрогематокритній центрифузі МГЦ-8. Значення гематокриту суспензії еритроцитів обчислювали по відношенню висоти стовпа осаду еритроцитів до загальної висоти стовпа рідини в капілярі.

Морфологічний аналіз еритроцитів проводили методом світлової мікроскопії на мікроскопі STUDAR E з фотографічною реєстрацією морфологічної картини крові цифровою фотокамерою CANON Powershot A510. Реакцію клітин на введення розчинів NaCl оцінювали у краплі, яку поміщали між предметним і покривним склом і рівномірно розподіляли тонким шаром.

Механічний стрес здійснювали перемішуванням на магнітній мішалці ММ-5 із швидкістю обертання 1200 об/хв клітинної суспензії у ємкості, яка заповнена пластиковими кульками діаметром 5 мм, при кімнатній температурі 22°С, при гематокриті 20%.

Модифікацію еритроцитів при 49ºС здійснювали за методом [Mosior M. et al., 1990], а фенілгідразином – за методом [Arduini A. et al., 1989].

Статистичний аналіз результатів виконували за допомогою тестів ANOVA і критерію Вілконсона-Манна-Уїтні. Кожний експеримент повторювали не менш 6 разів у двох паралельних пробах. Експериментальні дані наведені (на рисунках, в таблиці) як середнє арифметичне ± стандартне відхилення. Розбіжність між двома групами вважали статистично достовірною при Рu<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення 

Корекція чутливості еритроцитів ссавців до гіпертонічного шоку. Відомо, що для еритроцитів людини, які попередньо були інкубовани в середовищах з певними значеннями осмоляльності, спостерігається зниження рівня гемолізу при подальшому перенесенні клітин в розчин 4,0 моль/л NaСl [Поздняков В.В., 1989]. Для дослідження впливу часткового зневоднення на чутливість еритроцитів тварин до гіпертонічного шоку клітини інкубували в розчинах NaСl або сахарози, далі переносили в середовище, яке містило 4,0 моль/л NaСl, при 37°С. Зі збільшенням концентрації NaCl або сахарози в середовищах попередньої інкубації спостерігається зниження гіпертонічного гемолізу еритроцитів щура, коня і людини та подальше його підвищення (рис. 1). Винятком є еритроцити бика, для яких не спостерігається підвищення рівня гіпертонічного гемолізу (4,0 моль/л NaСl), і клітини кролика, які характеризуються початковим низьким рівнем гіпертонічного пошкодження.

Чутливість клітин до гіпертонічного шоку визначається їх вихідним станом. Використовуючи середовища різної осмоляльності, можна отримати клітини як у стабільному (стійкі до дії гіпертонічного шоку), так і в "метастабільному" (нестійкі до дії гіпертонічного шоку) стані.

Стійкий стан еритроцитів ссавців до гіпертонічного шоку формується після попередньої інкубації в середовищах, які містять NaСl в концентрації 0,3-0,4 моль/л (550-700 мОсм/кг) для клітин щура та 0,4 моль/л (700 мОсм/кг) – людини і коня. Формування стійкого стану еритроцитів до гіпертонічного шоку спостерігається після попередньої інкубації в середовищах, які містять сахарозу в концентрації 0,3-0,4 моль/л (550-650 мОсм/кг) для клітин щура, 0,4-0,6 моль/л (650-800 мОсм/кг) – коня та 0,6 моль/л (800 мОсм/кг) – людини. Отримані результати з використанням сольових і сахарозних середовищ середовищ на етапі попередньої інкубації клітин свідчать про те, що для формування стійкого стану еритроцитів щура, людини і коня важлива осмоляльність середовища, а не іонна сила розчину.

Рис. 1. Гіпертонічний гемоліз (4,0 моль/л NaCl) еритроцитів ссавців після попереднього зневоднення в розчинах NaCl (А) і сахарози (Б) при 37°С. Розчини сахарози приготовлені на фізіологічному розчині.

Для еритроцитів бика мінімальний рівень гіпертонічного гемолізу (4,0 моль/л NaСl) спостерігається після перенесення клітин з розчину 1,0 моль/л NaСl (1760 мОсм/кг) або 1,0 моль/л сахарози (1330 мОсм/кг). У роботі [Bogner Р. et al., 2005] проведено аналіз залежності осмотичної стійкості еритроцитів різних видів ссавців від вмісту осмотично неактивної води в цих клітинах. Показано [Bogner Р. et al., 1998], що еритроцити верблюда мають велику кількість осмотично неактивної води і стійкі до осмотичного стресу. Виходячи з того, що вміст неактивної води в еритроцитах бика вищий, ніж в клітинах людини і інших ссавців, можна вважати, що саме цей факт обумовлює виявлені особливості формування стійкого стану (у 1,0 моль/л NaСl) еритроцитів бика до гіпертонічного шоку.

Виявлена стійкість еритроцитів кролика до гіпертонічного шоку, можливо, пов'язана з високою проникністю їх мембран для води [Веnga G. et al., 1995], що дозволяє зменшити осмотичне навантаження на клітини і, як наслідок, шкідливу дію гіпертонічного середовища.

Формування стійкого стану до гіпертонічного шоку еритроцитів різних видів ссавців у результаті попередньої інкубації клітин у середовищах певної тонічності може бути обумовлено видаленням вільної води з клітин, що призводить до підвищення концентрації цитоскелетних білків, збільшення щільності їх взаємодії і, як наслідок, до стабілізації плазматичної мембрани.

У роботі [Єршов С.С. и др., 2004] показано, що гіпертонічна чутливість еритроцитів ссавців залежить від температури. Становило інтерес дослідити гіпертонічний гемоліз еритроцитів ссавців у розчині 4,0 моль/л NaCl після попередньої інкубації клітин у сольових середовищах при різних температурах.

З рис. 2 видно, що пошкодження еритроцитів людини, коня і бика, які перенесені із 0,15 моль/л в 4,0 моль/л NaCl при 37ºС, становить 84, 48 і 75% відповідно, що співпадає з даними роботи [Єршов С.С. и др., 2004]. При зниженні температури показники гіпертонічного пошкодження клітин зменшуються. При температурі 0°С рівень гемолізу знижується не в однаковій мірі для еритроцитів різних видів ссавців. У порівнянні з 37 при 0°С гемолітичне пошкодження еритроцитів бика менше в 4 рази, коня – в 2,4 рази, людини і щура – приблизно в 1,2 рази.

Рис. 2. Гіпертонічний гемоліз еритроцитів ссавців в розчині 4,0 моль/л NаСl після попередньої інкубації в сольових середовищах при різних температурах (M ± m, n = 6).

При зниженні температури, залежності гіпертонічного гемолізу еритроцитів ссавців від концентрації NaСl у середовищі попередньої інкубації зсуваються по осі ординат у напрямі нижчих значень (рис. 2). Для еритроцитів бика спостерігаються не лише кількісні, але й якісні зміни. При 0°С, на відміну від більш високих температур, була виявлена інша залежність гемолізу, яка подібна залежності, отриманій для еритроцитів щура і коня. Слід зазначити, що для еритроцитів щура при 0°С мінімальний рівень гіпертонічного гемолізу спостерігається при перенесенні клітин лише з розчину 0,3 моль/л NaСl, а не з 0,3-0,4 моль/л, як при інших температурних режимах.

Аналогічні дослідження були проведені при використанні сахарозних середовищ (рис 3). Важливо, що для еритроцитів коня і щура при температурах 25, 15, 0°С діапазон концентрацій сахарози, при якому спостерігається мінімальний рівень гіпертонічного гемолізу, розширюється в порівнянні з сольовими середовищами. Зі зниженням температури спостерігається зменшення рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів людини, коня, щура та бика після попередньої інкубації в сахарозних середовищах, так як і у випадку сольових середовищ (рис. 2).

Рис. 3. Гіпертонічний гемоліз еритроцитів ссавців в розчині 4,0 моль/л NаСl після попередньої інкубації в сахарозних середовищах при різних температурах.

Попередня інкубація в помірно гіпертонічних середовищах супроводжується зневодненням клітин, тому досліджували зміни гематокриту клітин у цих середовищах (рис. 4, крива 1) і порівнювали з рівнем гіпертонічного гемолізу цих же еритроцитів, які були перенесені в розчин 4,0 моль/л NaCl (рис. 4, крива 2).

З рис 4 видно, що для еритроцитів усіх ссавців спостерігається зниження гематокриту до мінімальних значень з наступним його підвищенням по мірі зростання концентрації солі в середовищі.

Зміна гематокриту (рис. 4, крива 1) корелює зі зміною чутливості (рис. 4, крива 2) цих клітин до гіпертонічного шоку. Мінімальне значення гематокриту еритроцитів ссавців реєструється в тих середовищах попереднього інкубування, при перенесенні з яких в розчин 4,0 моль/л NaCl відзначається мінімальне гемолітичне пошкодження клітин: для еритроцитів щура – 0,3-0,4 моль/л NaCl, коня і людини – 0,4 моль/л NaCl, бика – 1,0 моль/л NaCl.

Рис. 4. Гематокрит еритроцитів у середовищах з різною концентрацією NаСl (1) і величини гемолізу клітин при подальшому перенесенні в розчин 4,0 моль/л NаСl (2) при 37°C.

Гематокрит є сумарним відносним об'ємом еритроцитів у суспензії, в якій може вносити вклад як форма клітин, так і особливості їх упаковки. Щоб виключити вплив морфології на величину гематокриту клітин, ми досліджували форму еритроцитів ссавців (щура, коня, бика, людини) в різних середовищах. У фізіологічному розчині для еритроцитів характерний ехіноцитоз, який значно посилюється в середовищі, що містить 0,4 моль/л NaCl. У розчині 0,6 моль/л NaCl спостерігаються кренування, сплощення, скручування клітин, поява листковидних форм. Оскільки в одних і тих же середовищах для еритроцитів ссавців спостерігається однакова морфологічна картина, а мінімальне значення гематокриту клітин досягається в середовищах з різною концентрацією NaCl (для більшості еритроцитів ссавців мінімальний гематокрит спостерігається в розчині 0,4 моль/л NaCl, а бика – в 1,0 моль/л NaCl), можна вважати, що морфологічні особливості значно не впливають на величину гематокриту клітин і, отже, на їх чутливість до гіпертонічного шоку.

Вплив високої температури (49ºС) і фенілгідразину на чутливість зневоднених еритроцитів ссавців до гіпертонічного шоку. Cтан цитоскелета визначає стійкість клітин до стресових факторів [Bennett V., 1985; Білоус А.М., 1990]. Тому в роботі використовували теплову обробку еритроцитів при 49°С, яка призводить до денатурації спектрину [Mosior M. et al., 1990]. Еритроцити ссавців після інкубації протягом 10 хв при 49°С переносили в середовища зневоднення, після чого піддавали дії гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaCl).

У табл. 1 представлені дані щодо впливу теплової обробки (49ºС) на гіпертонічний гемоліз (4,0 моль/л NaCl) еритроцитів людини, бика і коня, зневоднених в сольових середовищах.

Попередня обробка при 49ºС знижує гіпертонічну чутливість еритроцитів людини і коня і не впливає на еритроцити бика (37ºС), що, можливо, обумовлено особливостями цитоскелет-мембранного комплексу досліджуваних клітин. Додаткове осмотичне навантаження (0,4 або 0,6 моль/л NaCl) призводить до підвищення рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів людини, на відміну від клітин тварин.

Таблиця 1

Вплив теплової обробки (49°С) на гіпертонічний (4,0 моль/л NaCl) гемоліз (%) зневоднених еритроцитів ссавців

37°С

NaCl (моль/л)

Людина

Кінь

Бик

контроль

49°С

контроль

49°С

контроль

49°С

0,15

78±5

60±4

47±6

32±5

68±4

72±5

0,4

26±3

34*±4

25±3

21±3

45±4

50±5

0,6

67±4

84±7

61±4

56±5

35±3

40±3

0°С

NaCl (моль/л)

Людина

Кінь

Бик

контроль

49°С

контроль

49°С

контроль

49°С

0,15

52±6

46±3

22±5

12±5

22±4

26±4

0,4

11±2

19*±3

15±2

23±2

15±2

26±3

0,6

45±6

60±4

24±2

30*±3

23±3

33±2

Примітка. * – відмінність вірогідна відносно контролю, р<0,05.

У тому випадку, коли зневоднення і гіпертонічний шок здійснювалися при 0°С, попередня теплова обробка (49ºС) викликала підвищення рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів усіх видів ссавців. Відомо, що як теплова обробка клітин при 49°С [Benga G. et al., 1986; Ivanov I. T., 2007] так і інкубація при низькій температурі [Minetti M. et al., 1984; Белоус А.М. и др., 1994] збільшують жорсткість еритроцитарних мембран. Можливо, поєднання дії двох односпрямованих чинників і визначає зростання гіпертонічного пошкодження еритроцитів ссавців. У цьому випадку температурний чинник є домінуючим, а це не дозволяє проявитися видовим особливостям досліджуваних клітин.

Обробка еритроцитів людини фенілгідразином призводить до окислення і деградації цитоскелетних білків, в першу чергу спектрину [Arduini A. et al., 1989; McMillan D.C. et al., 2005]. На рис. 5 представлені результати впливу фенілгідразину на гіпертонічний шок попередньо зневоднених еритроцитів ссавців. Незважаючи на те, що у присутності фенілгідразину контрольні клітини різних видів ссавців неоднаково реагують на гіпертонічний шок, для еритроцитів щура, коня і людини, зневоднених у розчині 0,6 моль/л NaСl, та клітин бика, зневоднених в 1,0 і 2,0 моль/л NaСl, характерне збільшення гіпертонічного пошкодження.

Рис. 5. Вплив фенілгідразину (1,0 ммоль/л) на рівень гіпертонічного гемолізу (4,0 моль/л NaCl) еритроцитів ссавців після попередньої інкубації в середовищах з різною концентрацією NaCl (25ºС): 1 – контроль; 2 – фенілгідразин.

Примітка * – відмінність вірогідна відносно контролю, р<0,05.

Гіпертонічний шок еритроцитів характеризується не лише рівнем гемолізу, але й швидкістю розвитку гемолітичного пошкодження. Значення швидкості гіпертонічного пошкодження (4,0 моль/л NaCl) модифікованих фенілгідразином і зневоднених еритроцитів ссавців представлені на рис 6.

На рис 6 видно, що попереднє зневоднення еритроцитів людини, коня і щура в середовищі, яке містить 0,6 моль/л NaСl, приводить до збільшення швидкості гіпертонічного гемолізу клітин, однак при зневодненні еритроцитів бика спостерігається значне зменшення швидкості гіпертонічного гемолізу. Обробка клітин фенілгідразином викликає підвищення швидкості гіпертонічного гемолізу контрольних еритроцитів людини, коня і щура.

      Людина                                                                       Бик

                                                                       

 

       Щур                                                                           Кінь

Рис. 6. Вплив фенілгідразину і попереднього зневоднення на відносну швидкість гемолізу еритроцитів ссавців у розчині 4,0 моль/л NaCl (25ºС): 1  контроль; 2фенілгідразин. За одиницю була прийнята швидкість гемолізу контрольних еритроцитів в розчині 4,0 моль/л NaCl.

Примітка.* - відмінності вирогідні відносно швидкості гемолізу контрольних клітин при Рu<0,05.

Поєднана дія фенілгідразину і середовища зневоднення, в якому формується "метастабільний" стан клітин, супроводжується підвищенням відносної швидкості гіпертонічного гемолізу, що особливо виражено для еритроцитів коня (рис. 6).

Механічний шок еритроцитів різних видів ссавців. Виходячи з того, що попередня інкубація в середовищах певної осмоляльності супроводжується формуванням стійкого стану еритроцитів різних видів ссавців до подальшої дії гіпертонічного шоку, становило інтерес дослідити реакцію цих осмотично стійких клітин до іншого виду стресу – механічного шоку. Чутливість еритроцитів до механічного шоку оцінювали по виходу з них іонів калію і гемоглобіну.

Найбільша втрата іонів калію під дією механічного шоку характерна для клітин бика, людини і щура в ізотонічному середовищі (рис. 7 А). Осмотичне навантаження (0,4 моль/л NaCl) збільшує вихід іонів калію з еритроцитів усіх ссавців. У цих умовах найбільша втрата калію виявлена у еритроцитів людини, бика і щура, для яких характерна значна втрата калію в ізотонічних умовах. У середовищі, яке містить 0,6 моль/л NaCl, вихід іонів калію з еритроцитів усіх видів ссавців складає більше 90%. Механічний шок викликає гемоліз еритроцитів ссавців у фізіологічному середовищі на рівні 20-30% залежно від їх видової приналежності.

Рис. 7. Вплив механічного шоку на вихід К+ ) і рівень гемолізу (Б) еритроцитів ссавців у сольових середовищах (0,15; 0,4; 0,6 моль/л NaCl). Час інкубації 60 хв. 

Збільшення концентрації солі до 0,4 і 0,6 моль/л NaCl призводить до достовірного підвищення гемолізу еритроцитів ссавців, найбільш високий рівень пошкодження спостерігається у еритроцитів бика і щура. Таким чином, попереднє зневоднення клітин, яке забезпечує стійкість до гіпертонічного шоку, не є універсальним чинником, яке дозволяє захистити клітини від механічного шоку.

Вплив кріопротектора ПЕО-1500 на чутливість еритроцитів ссавців до гіпертонічного шоку. При заморожуванні клітин широко застосовують непроникаючий кріопротектор поліетиленоксид з молекулярною масою 1500 (ПЕО1500). Використання непроникаючих кріопротекторів пов'язане з певними труднощами, які полягають у виборі умов еквілібрації клітин з кріопротектором (концентрація, швидкість введення кріопротектора, температура).

Еритроцити ссавців інкубували з ПЕО-1500 при різних температурах (37 і 0°С), далі ізотермічно переносили в середовище, яке містить 4,0 моль/л NaCl. Отримані результати представлені на рис. 8-10.

Для еритроцитів ссавців спостерігається зниження гіпертонічного гемолізу по мірі збільшення концентрації ПЕО-1500 на попередньому етапі. Якщо при 37°С мінімальні значення гемолізу спостерігаються у присутності 20%-го ПЕО-1500, то при 0°С захисні концентрації кріопротектора знижуються до 10-15%.

Рис. 8. Вплив ПЕО-1500 на гематокрит (1) еритроцитів людини і гемоліз цих клітин при подальшому перенесенні в розчин 4,0 моль/л NaCl (2) при температурі 37 і 0°C. Гематокрит клітин у розчині 0,15 моль/л NaCl при 37°С прийнято за 100%.

Примітка. * – відмінність вірогідна відносно контролю 1, р<0,05

**  відмінність вірогідна відносно контролю 2, р<0,05

Рис. 9. Вплив ПЕО-1500 на гематокрит (1) еритроцитів коня і гемоліз цих клітин при подальшому перенесенні в розчин 4,0 моль/л NaCl (2) при температурі 37 і 0°C. Гематокрит клітин у розчині 0,15 моль/л NaCl при 37°С прийнято за 100%. Примітка. * – відмінність вірогідна відносно контролю 1, р<0,05

**  відмінність вірогідна відносно контролю 2, р<0,05

Гематокрит еритроцитів ссавців знижується по мірі підвищення концентрації кріопротектора. Видно, що зниження гематокриту еритроцитів ссавців у розчинах ПЕО-1500 приблизно співпадає з динамікою гіпертонічного шоку. Захисний ефект кріопротектора в умовах гіпертонічного шоку краще виражений при 0°С, ніж при 37°С для еритроцитів усіх видів ссавців.

Рис. 10. Вплив ПЕО-1500 на гематокрит (1) еритроцитів бика і гемоліз цих клітин при подальшому перенесенні в розчин 4,0 моль/л NaCl (2) при температурі 37 і 0°C. Гематокрит клітин у розчині 0,15 моль/л NaCl при 37°С прийнято за 100%. Примітка. * – відмінність вірогідна відносно контролю 1, р<0,05

**  відмінність вірогідна відносно контролю 2, р<0,05

Раніше була продемонстрована доцільність застосування ПЕО-1500 в якості кріопротектора для еритроцитів ссавців [Денисова О. М., 2006]. У роботі [Денисова О. М., 2006] показано, що ПЕО-1500 у концентрації 15% захищає еритроцити людини і бика при заморожуванні. При цьому результат заморожування був кращим, коли кріопротектор додавали при температурі, близької до нуля, ніж при вищій.

Оптимальні концентраційні (15%, 700 мОсм/кг) і температурні (0°С) умови обробки клітин ссавців ПЕО-1500 для гіпертонічного шоку узгоджуються з розробленими умовами еквілібрації клітин ссавців з кріопротектором, які забезпечують їх ефективне кріоконсервування [Денисова О. М., 2006].

Таким чином, запропонований в роботі гіпертонічний шок як модельний експеримент заморожування, можна використати для підбору оптимальних умов обробки клітин кріопротектором, які забезпечать високе збереження еритроцитів при заморожуванні.

ВИСНОВКИ

Зберігання біологічного матеріалу при низькій температурі є актуальною проблемою, що обумовлює пошук і розробку нових теоретичних і практичних підходів для її розв'язання. У дисертаційній роботі представлені теоретичне, експериментальне узагальнення та нове рішення наукового завдання, спрямованого на вивчення основних чинників пошкодження еритроцитів при заморожуванні, а також розробка методів підвищення стійкості клітин до осмотичного і температурного впливу. Встановлено, що початковий стан еритроцитів ссавців, сформований внаслідок комбінованої дії температури, осмоляльності і кріопротекторів визначає стійкість клітин до подальшого осмотичного і температурного впливу.

1. Формування стійкого стану еритроцитів щура, людини і коня до гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaCl, 37°С) визначається осмоляльністю середовища, а не іонною силою розчину, оскільки він формується в умовах попередньої інкубації клітин як у сольових, так і в сахарозних середовищах, осмоляльність яких складає 550-700 і 550-800 мОсм/кг відповідно. Формування стійкого стану еритроцитів бика спостерігається в середовищах з більш високою осмоляльністю сахарози (1330 мОсм/кг) і NaCl (1760 мОсм/кг).

2. Попередньо зневоднені еритроцити щура, коня, людини і бика, які мають мінімальне значення гематокриту, характеризуються мінімальним рівнем гіпертонічного гемолізу (4,0 моль/л NaCl).

3. Гіпертонічна чутливість (4,0 моль/л NaCl) еритроцитів ссавців, частково зневоднених в розчинах NaCl або сахарози, залежить від температури. При зниженні температури спостерігається зменшення гіпертонічного гемолізу еритроцитів людини, коня й бика, виражене різною мірою.

4. У присутності непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 спостерігаються зниження гематокриту еритроцитів людини, бика і коня і зменшення рівня гемолізу цих клітин при подальшому перенесенні у розчин 4,0 моль/л NaCl. При 0ºС максимальна стійкість еритроцитів людини і коня до гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaCl) формується в кріопротекторному (ПЕО-1500) середовищі, осмоляльність (700 мОсм/кг) якого відповідає значенням осмоляльності сольових і сахарозних середовищ, після інкубації в яких клітини стають максимально стійкими до подальшого гіпертонічного шоку.

5. Попередня інкубація еритроцитів бика і коня при 49ºС збільшує чутливість частково зневоднених клітин до гіпертонічного шоку при 0ºС і не змінює при 37ºС, у той час як для еритроцитів людини спостерігається збільшення гіпертонічної чутливості при обох температурних режимах.

6. Модифікація за допомогою фенілгідразину (1,0 ммоль/л) приводить до підвищення рівня і швидкості гіпертонічного гемолізу еритроцитів людини, коня і щура, зневоднених у розчині 0,6 моль/л NaСl, і бика – у розчині 1,0 і 2,0 моль/л NaСl.

7. Еритроцити людини і щура, на відміну від клітин бика, кролика і коня, характеризуються високою чутливістю до механічного шоку. Додаткове осмотичне навантаження (0,4 і 0,6 моль/л NaCl) призводить до більш інтенсивного виходу іонів калію і гемоглобіну з клітин ссавців. Найбільший рівень гемолізу спостерігається для еритроцитів щура та бика, а найменшийкролика і коня.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Александрова Д. И. Влияние предварительного обезвоживания эритроцитов человека и быка на устойчивость к гипертоническому шоку при разных температурах / Д. И. Александрова, Н. М. Шпакова // Вісник проблем біології і медицини. – 2007. – № 1. – С. 73–77.
  2.  Александрова Д. І. Сравнительное исследование чувствительности предварительно обезвоженных эритроцитов человека и быка к гипертоническому стрессу / Д. І. Александрова, Н. В. Орлова., Н. М. Шпакова // Проблемы криобиологии. – 2007. – Т. 17, № 4. – С. 327–334.
  3.  Александрова Д. І. Влияние прединкубации эритроцитов человека и быка в растворах сахарозы на устойчивость клеток к гипертоническому шоку / Д. І. Александрова, Н. В. Орлова, Н. М. Шпакова // Вестник Харьковского университета. Серия: биология. – 2007. – № 788. – С. 110–115.
  4.  Вплив фенілгідразину на гіпертонічну чутливість попередньо зневоднених еритроцитів ссавців / Н. М. Шпакова, Д. І. Александрова, О. О. Олійник, В. А. Бондаренко // Біологія тварин. – 2008. Т. 10, № 1 – 2. – С. 156–163.
  5.  Александрова Д. И. Исходное состояние эритроцитов – фактор, определяющий их чувствительность к гипертоническому стрессу: Роль ПЭО-1500 и температуры / Д. И. Александрова, Н. В. Орлова, Н. М. Шпакова // Проблемы криобиологии. – 2009. – № 4. – С. 406–412.
  6.  Влияние фенилгидразина на чувствительность эритроцитов млекопитающих к гипотоническому и гипертоническому шоку / Н. М. Шпакова, Е. Е. Нипот, О. А. Олейник, Д. И. Александрова // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини. – 2009.- Випуск 19, частина 2, том 2. – С. 160-165.
  7.  Шпакова Н. М., Орлова Н. В., Александрова Д. І. Пат. 50069 Україна, МПК G 01 N 33/48. Спосіб визначення температурних умов інкубування еритроцитів з ПЕО-1500 // заявник і власник патенту Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України. – № u 2009 11892; заявл. 20.11.2009; опубл. 25.05.2010, Бюл. № 10
  8.  Шпакова Н. М., Орлова Н. В., Александрова Д. І. Патент 52701 Україна, МПК G 01 N 33/48. Спосіб деструкції еритроцитів // заявник і власник патенту Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України. – № u 2010 00983; заявл. 01.02.2010; опубл. 10.09.2010, Бюл. № 17.
  9.  Александрова Д. І. Вплив попереднього обезводнення еритроцитів людини та бика в сольовому середовищі на чутливість до гіпертонічного шоку / Д. І. Александрова, Н. М. Шпакова // Матеріали III міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів “Молодь та поступ біології”. Львів, 23-27 квітня, 2007. С. 454.
  10.  Александрова Д. І. Порівняльне вивчення осмотичної чутливості еритроцитів людини і коня / Д. І. Александрова, О. О. Олійник // Матеріали II з’їзду українського товариства клітинної біології. Київ, 23-26 жовтня, 2007. С. 49.
  11.  Гиперосмотический шок эритроцитов лошади / Д. І. Александрова, О. А. Олейник, Н. М. Шпакова // Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине: междунар. науч.-практ. конф., 10-12 окт. 2007г.: тезисы докл. Ростов-на-Дону, 2007. С. 47.
  12.  Александрова Д. І. Влияние криопротекторов на гипертоническую устойчивость эритроцитов млекопитающих / Д. І. Александрова, Н. М. Шпакова, Н. В. Орлова // Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия: междунар. науч.-практ. конф. – Пущино, 28-30 октября, 2008. – С. 9–10.
  13.  Єршов С. С. Морфологія еритроцитів людини та тварин у фізіологічних умовах та при збільшенні тонічності середовища / С. С. Єршов, Д. І. Александрова, О. Є. Ніпот // Молодь та поступ біології: IV міжнар. наук. конф. студентів і аспірантів, 7-10 квіт. 2008р.: тези допов. Львів, 2008. С. 2728.
  14.  Александрова Д. І. Механічний стрес еритроцитів людини, щура, кроля / Д. І. Александрова, Н. В. Орлова, Н. М. Шпакова // Молодь та поступ біології: міжнар. наук. конф. студентів і аспірантів, 16-18 жовт. 2008р.: тези допов. Львів, 2008. С. 2930.
  15.  Shpakova N. Comparative analysis of mammalian erythrocyte resistance to mechanical stress / N. Shpakova, D. Alexandrova, N. Orlova // 17 International Symposium of the European Association for Red Cell Research, 23-27 April 2009. – Milano (Italy), 2009. – P. 67.

Анотація

Александрова Д. І. "Вплив початкових осмотичних та температурних умов на стійкість еритроцитів ссавців до гіпертонічного шоку". – Рукопис.

Дисертаційна робота на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2011.

Вивчали взаємозв'язок між зміною вихідного стану еритроцитів різних видів ссавців (людини, бика, коня, кролика і щура) і їх стійкістю до гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaСl).

Встановлено, що вихідний стан еритроцитів ссавців, сформований у результаті комбінованої дії температури, осмоляльності і кріопротекторів, визначає стійкість клітин до подальшого осмотичного та температурного впливу. Формування стійкого стану еритроцитів різних видів ссавців до гіпертонічного шоку визначається осмоляльністю середовища, а не іонною силою розчину. Мінімальне значення гематокриту еритроцитів щура, коня, людини і бика в розчинах попереднього зневоднення відповідає мінімальному рівню гемоліза при перенесенні цих клітин в 4,0 моль/л NaСl. Зі зниженням температури спостерігається зменшення гіпертонічного гемолізу еритроцитів людини, коня і бика, виражене різною мірою. У присутності непроникаючого кріопротектора ПЕО–1500 спостерігається зниження гематокриту еритроцитів людини, бика і коня і зменшення рівня гемолізу цих клітин при подальшому перенесенні в 4,0 моль/л NaСl. При 0°С максимальна стійкість еритроцитів людини і коня до гіпертонічного шоку (4,0 моль/л NaСl) формується у кріопротекторному (ПЕО1500) середовищі, осмоляльність якого (700 мОсм/кг) відповідає значенням осмоляльності сольових і сахарозних середовищ, після інкубації в яких клітини стають максимально стійкими до подальшого гіпертонічного шоку.

Ключові слова: гіпертонічний шок, температура, модифікатори цитоскелет-мембранного комплексу, еритроцити ссавців, зневоднені клітини, кріопротектори.

Аннотация

Александрова Д. И. «Влияние начальных осмотических и температурных условий на устойчивость эритроцитов млекопитающих к гипертоническому шоку».Рукопис.

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2009.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния частичного обезвоживания (NaCl, сахароза, ПЭО-1500) эритроцитов млекопитающих (человека, быка, лошади, кролика и крысы) на их чувствительность к последующему гипертоническому шоку, а также исследованию устойчивости обезвоженных эритроцитов к действию механического шока. Целью работы было изучить взаимосвязь между изменением исходного состояния эритроцитов разных видов млекопитающих под действием физико–химических факторов (температура, осмоляльность, модификаторы цитоскелет–мембранного комплекса, криопротекторы) и их устойчивостью к гипертоническому шоку.

Показано, что устойчивое состояние эритроцитов млекопитающих к гипертоническому шоку (4,0 моль/л NaCl) формируется в условиях предварительного инкубирования клеток как в солевых, так и в сахарозных средах. При 37°С осмоляльность сахарозы и NaCl этих сред составляет для клеток крысы – 550-650 мОсм/кг сахарозы и 550-700 мОсм/кг NaCl; человека – 650 мОсм/кг сахарозы и 700 мОсм/кг NaCl; лошади – 650-800 мОсм/кг сахарозы и 700 мОсм/кг NaCl. Таким образом, для формирования устойчивого состояния эритроцитов крысы, человека и лошади важна осмоляльность среды, а не ионная сила раствора. Формирование устойчивого состояния эритроцитов быка наблюдается в средах с более высокой осмоляльностью сахарозы и NaCl – 1330 и 1760 мОсм/кг соответственно.

Выявлено, что минимальные значения гематокрита эритроцитов крысы, лошади, человека и быка в растворах предварительного обезвоживания соответствуют минимальному уровню гемолиза при перенесении этих клеток в 4,0 моль/л NaCl. Характер морфологических изменений эритроцитов млекопитающих в средах предварительного обезвоживания не отражает их минимальную чувствительность к гипертоническому шоку.

Установлено, что предварительное инкубирование эритроцитов быка и лошади при 49ºС увеличивает чувствительность частично обезвоженных клеток к гипертоническому шоку при 0ºС и не изменяет при 37ºС, в то время как для эритроцитов человека наблюдается увеличение гипертонической чувствительности при обоих температурных режимах. Показано, что модификация фенилгидразином (1,0 ммоль/л) приводит к повышению уровня и скорости гипертонического гемолиза эритроцитов человека, лошади и крысы, обезвоженных в 0,6 моль/л NaCl, и клеток быка – в 1,0 и 2,0 моль/л NaCl.

Выявлено, что эритроциты человека и крысы, в отличие от клеток быка, кролика и лошади, характеризуются высокой чувствительностью к механическому шоку. Дополнительная осмотическая нагрузка (0,4 и 0,6 моль/л NaCl) приводит к более интенсивному выходу ионов калия и гемоглобина из клеток млекопитающих. Наибольший уровень гемолиза наблюдается для эритроцитов крысы и быка, а наименьший – кролика и лошади. Таким образом, предварительное обезвоживание клеток, которое обеспечивает устойчивость к гипертоническому шоку, не является универсальным фактором, позволяющим защитить клетки в условиях механического шока.

Показано, что в присутствии непроникающего криопротектора ПЭО–1500 наблюдается снижение гематокрита эритроцитов человека, быка и лошади и уменьшение уровня гемолиза этих клеток при последующем перенесении в 4,0 моль/л NaCl. При 0С максимальная устойчивость эритроцитов человека и лошади к гипертоническому шоку (4,0 моль/л NaCl) формируется в криопротекторной (ПЭО-1500) среде, осмоляльность (700 мОсм/кг) которой соответствует значениям осмоляльности солевых и сахарозных сред, после инкубации в которых клетки становятся максимально устойчивыми к последующему гипертоническому шоку. Таким образом, предложенный в работе гипертонический шок как модельный эксперимент замораживания можно использовать для подбора оптимальных условий обработки клеток криопротектором, обеспечивающих высокую сохранность эритроцитов при замораживании.

Ключевые слова: гипертонический шок, температура, модификаторы цитоскелет-мембранного комплекса, эритроциты млекопитающих, обезвоженные клетки, криопротекторы.

Annotation

D.I. Aleksandrova “Influence of initial osmotic and temperature conditions on mammalian erythrocyte resistance to hypertonic shock”. – Manuscript.

Dissertation for the candidate of biological sciences degree іn speciality – 03.00.19 – cryobiology. – Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2011.

There was investigated the correlation between the change of different mammalian (human, bovine, equine, rabbit and rat) initial erythrocyte state and their resistance to the hypertonic shock (4.0 mol/l NaCl).

It has been established the mammalian initial erythrocyte state formed in the result of a combined temperature effect, osmolality and cryoprotectants determines the cell resistance to the following osmotic and temperature influence. Formation of resistant erythrocyte state of different mammals to the hypertonic shock is determined by medium osmolality, not by ionic strength of solution. The minimal hematocrit index of rat, equine, human and bovine erythrocytes in the preliminary dehydrated solutions corresponds to the minimal hemolysis level during transportation of these cells into 4.0 mol/l NaCl. While temperature lowering the decrease of human, equine and bovine erythrocyte hypertonic hemolysis manifested in various degree is observed. In the presence of non-penetrating cryoprotectant PEO-1500 there is observed the decrease of human, bovine and equine erythrocyte hematocrit and the decrease of cell hemolysis level during the following transfer into 4.0 mol/l NaCl. At 0ºC maximal human and equine erythrocyte resistance to the hypertonic shock (4.0 mol/l NaCl) is formed in cryoprotectant (PEO-1500) medium, the osmolality (700 mOsm/kg) of which corresponds to the osmolality indices of the saline and sucrose media, in which after incubation cells become maximally resistant to the following hypertonic shock.

Key words: hypertonic shock, temperature, modificators of cytoskeleton-membrane complex, mammalian erythrocytes, dehydrated cells, cryoprotectants.

Відповідальний за випуск академік НАН України,

д.мед.н., проф. А. М. Гольцев

1


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

34611. История Нью Йорка 34.5 KB
  История Нью Йорка Считается что первые люди появились на территории современного НьюЙорка более 11 тысяч лет назад. Тихий и размеренный этап истории НьюЙорка продолжался до 1524 года когда в гавань НьюЙорка прибыл Джованни Верразана.Таким образом город НьюЙорк получил свое современное название. После начала войны за независимость к НьюЙорку подошли 500 английских кораблей с 32тысячной армией под командованием генерала Уильяма Хоу.
34612. Пуритане в Америке 13.69 KB
  Пуритане надеялись построить в Новой Англии Град на холме идеальное общество. Пуритане считали что государство должно насаждать религиозную мораль. Хотя сами они искали религиозной свободы пуритане отличались крайней нетерпимостью в вопросах морали.
34613. Америка в XVIII веке: Просвещение, иммиграция, предпосылки Войны за независимость 16.84 KB
  Основным проводником просветительских идей в колониальной Америке XVIII в. в Америке возникают университеты. Предпосылки войны за независимость Война североамериканских колоний за независимость 1775 1783 явилась закономерным результатом тех сложных процессов которые происходили как в Америке так и в самой Англии. когда английский главнокомандующий в Америке генерал Гейдж распорядился захватить склад оружия устроенный патриотами недалеко от Бостона и арестовать лидеров заговорщиков.
34614. Война за независимость 24.47 KB
  Ход войны 17 апреля 1775 года произошло первое вооруженное столкновение между британскими войсками и американскими сепаратистами. Британские войска заперлись в Бостоне. Однако британские войска отразили вторжение. Британские войска перешли в наступление.
34615. Образование Демократической и Республиканской партий в США 21.76 KB
  Республиканская политическая партия является более консервативной чем демократическая не имеет постоянного членства 23 избирателей США считают себя республиканцами. После победы северян и их лидера Авраама Линкольна в классовой борьбе республиканцы почти 40 лет непрерывно правили США. Люди из команды Рональда Рейгана правили США до 2009года.
34616. Реформистское движение при президентах Т. Рузвельте и В. Вильсоне. Американский империализм 18.72 KB
  В своей политике Рузвельт исходил из необходимости увеличения роли государства считая что огромной власти корпораций необходимо противопоставить еще большую власть правительства. Реформаторская деятельность Рузвельта была начата шумной кампанией против злоупотреблений трестов. За ним пришла очередь судебных процессов против треста скотобоен Чикаго табачного и сахарного трестов и других крупных монополистических объединений. Рузвельт добился ускорения судопроизводства по делам о нарушении антитрестовского законодательства и открытие дел...
34617. Ревущие двадцатые 19.76 KB
  Экономика: фермеры и горнорудная промышленность переживали трудные времена после войны но экономика США быстро перестроилась на мирное производство Америка стала самой богатой страной мира промышленность обеспечивала массовое производство общество привыкло к потребительству солдаты после войны получили жалованье за службу прекращение заказов поначалу вызвало в экономике депрессию но по мере возвращения демобилизованных солдат в мирную жизнь она прекратилась предложение превышало спрос низкие цены на товары стимуляция продаж...
34618. «Новый курс» Ф.Рузвельта 18.18 KB
  В принятом Чрезвычайном законе о банках предусматривалось возобновление функций и получение правительственных кредитов займов из федеральной резервной системы хотя это разрешалось только наиболее крупным банкам. был принят один из двух наиболее важных законов закон о восстановлении национальной промышленности НИРА. Закон о восстановлении промышленности вводил систему государственного регулирования этого подразделения экономики. Во втором и третьем разделах закона...
34619. Историко-литературная концепция Белинского и ее эволюция 32.5 KB
  Вся литература до Пушкина – пересаженное иноземное растение. В слово натуральная он вкладывал понятие литература для народа а так же литература философствующая. Он понимал что есть литература как зеркало общества Гоголь НШ и литература как зеркало человека бытийственность.