ID: 66194

Название работы: Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций

Категория: Практическая работа

Предметная область: Биология и генетика

Описание: Вирус простого герпеса – одна из самых распространенных вирусных инфекций человека, характеризующаяся лихорадочным состоянием и пузырьковыми высыпаниями, которые чаще всего локализуются на коже и слизистых оболочках.

Язык: Русский

Дата добавления: 2014-08-14

Размер файла: 186 KB

Работу скачали: 35 чел.

Методические указания для студентов к практическому занятию № 6.

 Тема: Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций.

 Цель: Изучение лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций.

Модуль 3. Общая и специальная вирусология.

Содержательный модуль 16. Специальная вирусология.

Тема 6: Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций.

Актуальность темы: 

Вирус простого герпеса – одна из самых распространенных вирусных инфекций человека, характеризующаяся лихорадочным состоянием и пузырьковыми высыпаниями, которые чаще всего локализуются на коже и слизистых оболочках. Важными особенностями герпетической инфекции являются пожизненное носительство вируса и частые рецидивы болезни.

Вирусная природа простого герпеса установлена в 1912 г. У. Грютером.

(Трёхмерное изображение вируса герпеса).

Герпесвирусы и вызываемые ими заболевания

Типы вирусов герпеса	Вызываемые заболевания
ВПГ-1 (вирус простого герпеса типа 1)	Поражение: кожи, слизистой оболочки ротовой полости, конъюнктивы или роговицы глаза, энцефалиты
ВПГ-2 (вирус простого герпеса типа 2)	Поражение слизистых оболочек гениталий, у новорожденных - центральной нервной системы
ВЗВ (вирус ветрянки)	Ветряная оспа, опоясывающий лишай, постгерпетическая невралгия; язвенно-некротическая форма опоясывающего герпеса - СПИД-индикаторный признак заболевания
ЦМВ (цитомегаловирус)	Патологии новорожденных; осложнения после трансплантации органов и костного мозга: интерстициальная пневмония, гастроинтестинальные расстройства, гепатиты
ВЭБ (вирус Эпштейна-Барра)	Инфекционный мононуклеоз, лимфома Беркитта, рак носоглотки
ВГ-6	Вирус, вызывающий фатальные интерстициальные пневмонии и инфекционные розеолы новорожденных
ВГ-7	Вирус, выделенный от больных с синдромом хронической усталости
ВГ-8	Вирус, выделенный из биоптата больного саркомой Капоши, ассоциированный с лимфопролиферативными заболеваниями
Примечание. ВГ - вирус герпеса.

Таксономия, морфология, химический состав. Возбудитель простого герпеса - ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Herpesviridae, роду Simplexvirus. По морфологии и химическому составу не отличается от вирусов ветряной оспы и опоясывающего герпеса.

Культивирование. Вирус простого герпеса (ВПГ) культивируют в куриных эмбрионах, культурах клеток и организме лабораторных животных. На хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов вирус образует мелкие белые плотные узелки-бляшки; в зараженных культурах - вызывает цитопатический эффект: образование гигантских многоядерных клеток с внутриядерными включениями.

Антигенная структура. Вирус содержит ряд антигенов, связанных как с внутренними белками, так и с гликопротеидами наружной оболочки. Последние являются основными иммуногенами, индуцирующими выработку антител и клеточный иммунитет. Существует два серотипа вируса: ВПГ типа 1 и ВПГ типа 2.

Резистентность. Вирус может выживать на поверхности предметов при комнатной температуре в течение нескольких часов, чувствителен к УФ-лучам, обычным дезинфицирующим средствам, жирорастворителям, термолабилен.

Восприимчивость животных. Вирус простого герпеса патогенен для многих животных, у которых вызывает энцефалит при введении возбудителя в мозг или местный воспалительный процесс при заражении в глаз. В естественных условиях животные не болеют.

Эпидемиология. Простой герпес - одна из самых распространенных инфекций, которая поражает различные возрастные группы людей, чаще в осенне-зимний период. Отмечаются спорадические случаи заболевания, иногда небольшие вспышки в семьях, детских коллективах, больницах. Эпидемий не наблюдается.

Источником инфекции являются больные и носители. Основной механизм передачи - контактный, аэрогенный. Заражение происходит при попадании вирусов на поврежденные кожные покровы или слизистые оболочки.

Эпидемиология герпеса, вызванного вирусами типов 1 и 2, различна. ВПГ типа 1 передается через слюну, зараженные слюной руки и предметы быта, а ВПГ типа 2 - половым путем. Возможно заражение плода через плаценту.

Патогенез и клиническая картина. По клиническим проявлениям различают первичный и рецидивирующий герпес. Входными воротами возбудителя при первичной герпетической инфекции являются поврежденные участки кожи и слизистых оболочек рта, глаз, носа, мочеполового тракта, где вирусы репродуцируются. Затем по лимфатическим сосудам вирусы попадают в кровь и заносятся в различные органы и ткани.

Инкубационный период при первичном герпесе составляет в среднем 6-7 дней. Заболевание начинается с жжения, зуда, покраснения, отека на ограниченных участках кожи и слизистых оболочек, затем на этом месте появляются пузырьковые высыпания, наполненные жидкостью. Иногда заболевание сопровождается повышением температуры тела и нарушением общего состояния. При подсыхании пузырьков рубцов не образуется. Первичный герпес у новорожденных протекает тяжело и нередко заканчивается смертью. Однако у большинства людей первичная инфекция остается нераспознанной, так как протекает бессимптомно.

После первичной инфекции (явной и бессимптомной) 70-90 % людей остаются пожизненными носителями вируса, который сохраняется в латентном состоянии в нервных клетках чувствительных ганглиев. Нередко у носителей появляются рецидивы болезни в результате переохлаждения, перегревания, менструации, интоксикации, различных инфекционных заболеваний, стрессов, нервно-психических расстройств. Для рецидивирующего герпеса характерны повторные высыпания на коже и слизистых оболочках, нередко в тех же местах. Наиболее частой локализацией рецидивирующего герпеса, вызванного ВПГ типа 1, являются губы, крылья носа, полость рта, конъюнктива глаз. ВПГ типа 2 поражает мочеполовую систему и вызывает герпес новорожденных. Доказана роль ВПГ типа 2 в развитии рака шейки матки. Сравнительно редко встречаются генерализованные формы рецидивирующего герпеса, в частности поражения нервной системы и внутренних органов.

Иммунитет. В результате первичной герпетической инфекции в организме образуются сывороточные и секреторные антитела, которые обусловливают иммунитет к первичному герпесу, но не препятствуют сохранению вируса и возникновению рецидивов. Рецидивирующий герпес возникает при высоком уровне антител к вирусу герпеса. Основное значение в развитии рецидивирующего герпеса имеет состояние клеточного иммунитета.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования являются содержимое герпетических пузырьков, слюна, соскобы с роговой оболочки глаза, кровь, цереброспинальная жидкость, в летальных случаях . кусочки головного и спинного мозга.

Экспресс-диагностика заключается в обнаружении гигантских многоядерных клеток с внутриядерными включениями в мазках-отпечатках из высыпаний, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Для дифференциации от других вирусов, принадлежащих к этому семейству, используют РИФ, ИФА, РИА, ПЦР. Выделение вируса проводят на куриных эмбрионах, культуре клеток и на лабораторных животных (мыши-сосунки), идентифицируют вирус с помощью РИФ или РН. В последние годы в диагностике простого герпеса начали применять моноклональные антитела, что дает возможность определить серотип вируса. Для серодиагностики заболевания используют РСК, РН, РИФ, ИФА.

Специфическая профилактика и лечение. Для профилактики тяжелых форм рецидивирующего герпеса в период ремиссии применяют многократное введение инактивированной, культуральной герпетической вакцины. Вакцинация, а также применение иммуномодуляторов, например реаферона, удлиняют межрецидивный период и облегчают течение последующих рецидивов. В остром периоде с лечебной целью используют химиотерапевтические препараты (виразол, ацикловир, оксолиновую, тебро-феновую, флореналовую мази, бонафтон), интерфероны и индукторы интерферона.

Вирус цитомегалии

Цитомегалия - инфекционное заболевание, возбудителем которого является цитомегаловирус (ЦМВ) Cytomegalovirus hominis (от греч. cytys - клетка, megas - большой). Вирус вызывает цитомегаловирусную инфекцию человека, характеризующуюся поражением почти всех органов (преимущественно слюнных желез) с образованием в них гигантских клеток с внутриядерными включениями, протекающую в различных формах - от бессимптомного носительства до тяжелой генерализованной формы, заканчивающейся летальным исходом.

Вирус впервые выделен К. Смитом в 1956 г.

Таксономия, морфология, антигенная структура. Возбудитель цитомегалии - ДНК-содержащий вирус, относится к семейству Herpesviridae, роду Cytomegalovirus.

Морфология, химический состав типичны для семейства герпесвирусов. Диаметр вирусной частицы (вириона) около 180 нм. В центре вириона находится двенадцатигранный нуклеокапсид, содержащий генетическую информацию - двухнитевую ДНК-вируса. Установлено 2 антигенных серотипа вируса.

Культивирование. Цитомегаловирус репродуцируется в ограниченном числе первичных и перевиваемых клеточных культур, вызывая характерный цитопатический эффект - образование гигантских («цитомегаловирусных») клеток с внутриядерными включениями. Вирус патогенен для обезьян.

Резистентность. Вирус термолабилен, чувствителен к дезинфицирующим средствам и жирорастворителям.

Эпидемиология. Цитомегаловирусная инфекция широко распространена на земном шаре. Источником вируса является больной человек или носитель. Вирус выделяется со слюной, мочой, секретами организма, реже фекалиями. Предполагается, что ведущий механизм передачи инфекции - контактно-бытовой, возможны аэрогенный и фекально-оральный механизмы передачи. Цитомегаловирус обладает высокой способностью проникать через плаценту (вертикальная передача), вызывая внутриутробную патологию плода.

Патогенез и клиническая картина. Патогенез не вполне выяснен. Инфекция связана с длительным носительством вируса, который в латентном состоянии сохраняется в слюнных железах, почках и других органах. Активация латентной инфекции происходит при иммунодефицитных состояниях, иммунодепрессивной терапии. Вирус поражает ЦНС, костный мозг, почки, печень, клетки крови. У беременных женщин цитомегалия может приводить к недоношенности, мертворождению, развитию аномалий у плода.

Иммунитет. У больных независимо от клинической формы инфекции, а также у носителей образуются антитела, которые, однако, не препятствуют сохранению вируса в организме и выделению его в окружающую среду. Интенсивность развития болезни находится под контролем клеточной иммунной системы хозяина.

Лабораторная диагностика. Обследованию на цитомегалию в первую очередь подлежат дети с поражением ЦНС и врожденными уродствами, а также женщины с неблагополучно протекающей беременностью. Исследуемый материал - слюна, моча, мокрота, цереброспинальная жидкость, кровь, пунктат печени.

Диагностика основана на выявлении в исследуемом материале под микроскопом «цитомегалических» клеток, а также обнаружении антител класса IgM с помощью РИФ, ИФА, РИА. Вирус выделяют в культуре клеток, идентифицируют по морфологическим изменениям зараженных клеток и с помощью РН. Экспресс-диагностика - РИФ с моноклональными антителами. Применяют также методы генодиагностики: ПЦР и гибридизацию.

Специфическая профилактика и лечение. Разработана живая аттенуированная вакцина. Для лечения применяют химиотерапевтические препараты (ганцикловир, фоскорнет натрия), иммуномодуляторы, интерферон.

Вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса

Вирус вызывает два инфекционных заболевания: 1) ветряную оспу, возникающую преимущественно у детей в результате экзогенного заражения; 2) опоясывающий герпес (herpes zoster) - эндогенную инфекцию, развивающуюся чаще у взрослых, перенесших в детстве ветряную оспу. Заболевания различаются также по локализации пузырьковых высыпаний на коже и слизистых оболочках. Вирус открыт в 1911 г.

Таксономия. Вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса содержит ДНК, относится к семейству Herpesviridae (от греч. herpes - ползучая), роду Varicellavirus.

Морфология, химический состав, антигенная структура. Вирионы имеют овальную форму диаметром 120-179 нм, состоят из сердцевины, содержащей линейную двунитчатую ДНК, и наружной липопротеидной оболочки с шипиками гликопротеидной природы. Различают внутренние сердцевинные и наружные антигены. Антигенные варианты вируса не обнаружены.

Культивирование. Вирус репродуцируется в первичных и перевиваемых культурах клеток с цитопатическим эффектом (симпласты) и образованием внутриядерных включений.

Резистентность. Вирус малоустойчив в окружающей среде, термолабилен, чувствителен к жирорастворителям и обычным дезинфицирующим средствам.

Восприимчивость животных. Вирус непатогенен для лабораторных животных.

Эпидемиология. Ветряная оспа распространена повсеместно, восприимчивость к возбудителю очень высокая. Эпидемические вспышки отмечаются в осенне-зимний период, главным образом в организованных коллективах среди детей дошкольного возраста. Могут болеть взрослые. Источник инфекции - только больной человек. Механизм передачи - аэрогенный. Выделение вирусов в окружающую среду происходит при нарушении целостности пузырьковых высыпаний.

Опоясывающий герпес поражает в основном взрослых, носит спорадический характер, не имеет выраженной сезонности. Больные опоясывающим герпесом могут быть источником ветряной оспы у детей.

Патогенез и клиническая картина. Входными воротами для возбудителя является слизистая оболочка дыхательных путей, где вирусы размножаются, затем проникают в кровь, поражая эпителий кожи и слизистых оболочек (дерматотропизм).

Инкубационный период при ветряной оспе составляет 14-21 день. Заболевание характеризуется повышением температуры тела и пузырьковой сыпью на теле и слизистых оболочках рта, зева, весьма похожей на высыпания при натуральной оспе (отсюда название болезни). После отпадения корок рубцы не остаются. Осложнения (пневмонии, энцефалиты и др.) бывают редко.

Опоясывающий герпес возникает у людей, перенесших в детском возрасте ветряную оспу. Вирус может длительно сохраняться в нервных клетках межпозвоночных узлов и активизируется в результате заболеваний, травм и других факторов, ослабляющих иммунитет. Заболевание характеризуется лихорадкой, пузырьковыми высыпаниями в виде обруча по ходу пораженных (чаще межреберных) нервов, болевым синдромом.

Иммунитет. После перенесенной ветряной оспы формируется пожизненный иммунитет, который, однако, не препятствует сохранению вируса в организме и возникновению у некоторых людей рецидивов опоясывающего герпеса.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования является содержимое высыпаний, отделяемое носоглотки, кровь.

Экспресс-диагностика заключается в обнаружении под световым микроскопом гигантских многоядерных клеток - симпластов с внутриядерными включениями в мазках-отпечатках из высыпаний, окрашенных по Романовскому-Гимзе, а также специфического антигена в РИФ с моноклональными антителами. Выделяют вирус в культуре клеток, идентифицируют с помощью РН и РИФ. Для серодиагностики используют РН, ИФА, РСК.

Специфическая профилактика и лечение. Активная иммунизация не проводится, хотя разработана живая вакцина. В очагах ветряной оспы ослабленным детям показано применение иммуноглобулина. Для лечения опоясывающего герпеса используют препараты ацикловира, интерфероны и иммуномодуляторы. Элементы сыпи обрабатывают бриллиантовым зеленым или перманганатом калия.

 Вирус Эпштейна-Барр

Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) вызывает лимфопролиферативные болезни, а также инфекционный мононуклеоз, характеризующийся интоксикацией, поражением небных и глоточных миндалин, увеличением лимфоузлов, печени, селезенки, изменениями в крови.

Выделен Эпштейном с соавторами при электронной микроскопии биоптатов пациентов с лимфомами Бёркетта (1964). Распространен повсеместно.

 Таксономия. ВЭБ (вирус герпеса человека типа 4) относится к семейству Herpesviridae роду Lymphocryptovirus.

Морфология, химический состав, антигенная структура. ВЭБ имеет ядерные антигены, латентные протеины, латентные мембранные протеины и две маленькие Эпштейна-Барр-кодируемые РНК молекулы. Ядерные антигены и латентные протеины являются ДНК-связующими белками, считающимися основными для развития инфекции.

Эпидемиология. Заболевание малоконтагиозно. Источником инфекции являются больной человек и вирусоноситель. Основной путь передачи - воздушно-капельный, реже трансмиссивный или половой, при контакте через слюну. Антитела к вирусу имеются у большинства населения.

Патогенез и клиническая картина. ВЭБ вызывет размножение В-лимфоцитов и персистирует в них; обуславливает латентную инфекцию в лимфоидной ткани, эпителиальных клетках рта и глотки, слюнных желез. ВЭБ вызывает бессимптомную, хроническую или острую инфекцию, а также лимфопролиферативные болезни.

1.  Инфекционный мононуклеоз характеризуется высокой лихорадкой, недомоганием, фарингитом, лимфаденопатией, спленомегалией. Продолжительность инкубационного периода составляет 30-50 суток у взрослых и 10-40 суток у детей.
2.  Хроническая инфекция может развиваться как циклическая рекуррентная болезнь. Сопровождается низкой лихорадкой, повышенной утомляемостью, головной болью и воспалением горла.
3.  Лимфопролиферативные болезни также могут индуцироваться ВЭБ. Вирус является митогеном для В-лимфоцитов. Способствует развитию опухолей – лимфомы Бёркетта, небёркиттовские лимфомы, носоглоточная карцинома.
4.  Волосистая оральная лейкоплакия – характерное для СПИДа поражение слизистой оболочки рта.

Иммунитет. Гуморальный, клеточный, пожизненный. Повторные заболевания не описаны.

Лабораторная диагностика. До настоящего времени не разработаны методы выделения вируса в культурах клеток, и основу диагностики составляет выявление специфических антител к протеинам вируса; среди предложенных методов наиболее адекватна реакция непрямой иммунофлюоресценции (реакция Хенле), позволяющая определить наличие антител (IgM, IgG, ІgA) к капсидным, некапсидным «ранним» и ядерным антигенам. Некоторую информацию можно получить, определяя наличие гетерофильных антител (капельный тест на инфекционный мононуклеоз) и выявляя атипичные мононуклеары в периферической крови. Для выявления вирусной ДНК в трансформированных клетках применяют метод ДНК-гибридизации.

Специфические средства терапии отсутствуют; лечение симптоматическое.

Конкретне цели:

1.  Изучить общую характеристику семейства Herpesviridae.
2.  Изучить классификация семейства Herpesviridae.
3.  Ознакомиться с основными клиническими формами герпесвирусных инфекций.
4.  Изучить методы лабораторной диагностики герпесвирсных инфекций.
5.  Ознакомится с профилактикой, лечением и осложнениями герпесвирусных инфекций.
6.  Особенности течения герпесвирусных инфекций.

Уметь:

1.  Провести реакцию связывания комплемента.
2.  Владеть методикой постановки реакции нейтрализации.

Теоретические вопросы:

1.  Общая характеристика семейства Herpesviridae.
2.  Морфология и антигенные свойства вирусов семейства Herpesviridae.
3.  Классификация герпесвирусов.
4.  Клинические проявления герпесвирусной инфекции, осложнения.
5.  Лабораторная диагностика ВПГ-1 и ВПГ-2.
6.  Лабораторная диагностика ветряной оспы.
7.  Лабораторная диагностика инфекционного мононуклеоза.
8.  Лечение и специфическая профилактика герпесвирусных инфекций.

Практические задания, выполняемые на занятии:

1.  Изучение и зарисовка демонстрационных препаратов.
2.  Разбор схемы лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций.
3.  Заполнение протокола.

Дополнительная литература:

1.  Воробьев А.В., Биков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология.– М.: Медицина, 1998.– 336с.
2.  Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією.– Київ.: Вища шк., 1992.– 431с.
3.  Медицинская микробиология /Под ред. В.И. Покровского.– М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.– 768с.
4.  Гайдаш І.С., Флегонтова В.В. Медична вірологія.– Луганськ, 2002.– 357 с.
5.  Конспект лекции.

Короткие методические указания к практическому занятию:

В начале занятия проводится проверка уровня знаний студентов по теме. Самостоятельная работа состоит из изучения демонстрационных препаратов и разбора схем лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций, заполнения протокола.

В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итоговых результатов самостоятельной работы каждого студента.

Технологическая карта проведения практического занятия

№ п\п	Этапы	Время мин.	Способы обучения	Оборудования	Место проведения
1.	Проверка и кор-рекция выходного уровня подготов-ки к занятию	20’	Тестовые задания исходного уровня	Таблицы, коллекция вакцин, демонстраци-онные препараты	Учебная комната
2.	Самостоятельная работа	35’	Граф логичес-кой структуры	Иммерсионный мик-роскоп, демонстраци-онные препараты
3.	Самоконтроль и коррекция усвоен-ного материала	15’	Целевые обучающие программы
4.	Тестовый контроль	15’	Тесты
5.	Анализ резуль-татов работы	5’

Целевые обучающие задания:

1. В детском саду наблюдалось несколько случаев заболеваний детей. Клиническая картина характеризовалась повышением температуры и появлением в зеве и на коже везикулярной сыпи. Предварительный диагноз – ветряная оспа. Какой материал необходимо направить в вирусологическую лабораторию для проведения экспресс-диагностики?

A. Мокроту;

B. Мочу;

C. Смыв из зева и носа;

D. Кровь;

E. содержимое везикул.

2. У студента из Африки обнаружена лимфома Беркитта. Какой из перечисленных герпесвирусов наиболее вероятно является этиологическим фактором заболевания?

A.ВПГ-1;

B. ВПГ-2;

C. ЦМВ

D. Вирус Эпштейна-Барра;

E. Вирус опоясывающего лишая.

3. У студента, госпитализированного в инфекционное отделение в первые дни заболевания, заподозрили инфекционный мононуклеоз. Назовите результат лабораторного исследования, который подтвердил диагноз в день госпитализации?

A. Выявление антител к ЦМВ;

B. Выявление IgM к ЦМВ;

C. Выявление 4-х разового увеличения титра антител к вирусу Эпштейна-Барра;

D. Выявление IgM к вирусу Эпштейна-Барра;

E. Выявление вируса простого герпеса.

4. В культуре клеток фибробластов эмбриона человека был выделен вирус, который идентифицировали как varicella-zoster. Какая серологическая реакция была применена для идентификации?

A. РА;

B. РСК;

C. РГА;

D. РТГА;

E. ИФА.

5. Для подтверждения инфекции вызванной ВПГ-2 проводят микроскопирование исследуемого материала с определением крупных многоядерных клеток. Как называется данный вид диагностики?

A. Непрямая РИФ;

B. Проба Цанка;

C. Проба Пирке;

D. ПЦР;

E. цветная проба.

6. Какие из приведенных ниже реакций применяют для серологической диагностики ВПГ -2?

A. РСК;

B. РТГА;

C. РА;

D. РНГА;

E. верно все.

Алгоритм лабораторной работы:

Изучение общей характеристики и классификации семейства Herpesviridae.

Ознакомление с основными клиническими формами герпесвирусных инфекций.

Изучение методов лабораторной диагностики герпесвирсных инфекций.

Ознакомление с особенностями течения, профилактикой, лечением и осложнениями герпесвирусных инфекций.

Изучение и зарисовка демонстрационных препаратов.

Разбор и зарисовка схемы лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций.

Оформление протокола.