6632

Методы современного генетического анализа

Научная статья

Биология и генетика

Методы современного генетического анализа ДНК может быть изолирована из любого типа тканей или клеток, содержащих ядра. У человека ДНК обычно выделяют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 0,5 до 2-3 мл венозной крови. В плазме, обогащенной лейк...

Русский

2013-01-06

21.01 KB

26 чел.

Методы современного генетического анализа

ДНК может быть изолирована из любого типа тканей или клеток, содержащих ядра. У человека ДНК обычно выделяют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 0,5 до 2-3 мл венозной крови. В плазме, обогащенной лейкоцитами, с помощью детергентов производят быстрый лизис клеток. Высвобождение ДНК из хромосом достигается за счет протеолитического разрушения ассоциированных с этими молекулами ядерных белков. Наиболее часто для этого используют протеиназу К. Экстрагирование и удаление из раствора фрагментов белков, углеводов, липидов чаще всего производят с помощью фенольной, а затем хлороформной очистки. В дальнейшем молекулы ДНК концентрируют путем преципитации их в этаноле в результате чего ДНК выпадает в осадок и может длительно храниться при минусовых температурах. При необходимости использования образца ДНК ее осаждают с помощью высокоскоростного центрифугирования, сливают спирт и растворяют в буферном растворе.

Распространенным методом работы с молекулами ДНК и РНК является электрофорез в полиакриламидном или агарозном гелях. Гель помещают в камеру с буферным раствором, в котором суммарный заряд ДНК отрицателен, так что при подключении электрического тока фрагменты начинают двигаться в порах геля от катода к аноду. При этом скорость продвижения ДНК сквозь поры зависит от величины и конфигурации молекул, что и определяет их разделение. Идентификация ДНК в геле осуществляют путем специфического окрашивания, чаще всего - бромидом этидия или серебром.

Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью - рестрикционных эндонуклеаз, или рестриктаз, значительно продвинуло исследование структуры ДНК и возможности генно-инженерного манипулирования с молекулами ДНК. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз. В генетической инженерии используются в основном рестриктазы II типа. Каждый из этих ферментов узнает свою, специфическую последовательность из нескольких нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезает ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. В результате действия рестриктаз образуются фрагменты ДНК определенной длины. Количество образующихся фрагментов определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а их размер - характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Таким образом, при использовании рестриктаз можно получить фрагменты ДНК разной длины, а размеры фрагмента определяют также при электрофорезе в геле. Этот метод позволяет определить молекулярную массу фрагментов, а значит физическое расстояние между сайтами рестрикции.

Следующим этапом анализа изолированного фрагмента ДНК является определение нуклеотидной последовательности, то есть секвенирование. При этом надо получить серию комплементарных матрице молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. Чаще для секвенирования используют метод Сэнджера, когда после гибридизации праймера (искусственно синтезированная нуклеотидная последовательность) добавляют ДНК-полимеразу и другие компоненты, необходимые для репликации, а также терминирующие дидезоксинуклеотиды, и иницируют синтез ДНК фрагментов различной длины. В последующем при электрофоретическом разделении может быть определен размер этих синтезированных фрагментов и локализация дидезоксинуклеотидов, соответствующая порядку нуклеотидов в исходной молекуле ДНК. В последнее время развивается метод секвенирования путем гибридизации используемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотитов, так называемой олигонуклеотидной матрицей. С этой целью создаются наборы матриц - чипы, в ячейках которых иммобилизированы все возможные варианты перестановок из 4-х стандартных нуклеотидов.

Идентификация специфических участков в молекулах ДНК осуществляется с помощью ДНК-зондов. Зондом может служить любая однонитевая ДНК ограниченного размера, используемая для поиска комплементарных последовательностей. При добавлении такой молекулы к пулу разнообразных однонитевых ДНК и обеспечении условий для гибридизации ДНК-зонд образует двунитевую структуру только с определенной молекулой ДНК и только в том месте, где он найдет комплементарную последовательность. В ДНК-зонд может быть введена радиоактивная, биотиновая, флюоресцентная или другая метка, по которой можно следить за его месторасположением. В ряде случаев в качестве зондов используют искусственным образом синтезированные олигонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно не превышает 3-х оснований.

Зондами также могут служить выделенные из генома клонированные последовательности ДНК. В качестве векторов для клонирования широко применяют плазмидную ДНК, фаги (бактериальные вирусы), или искусственные дрожжевые хромосомы. Идентификацию с помощью ДНК-зондов специфических участков в геномной ДНК проводят после ее рестрикции и электрофоретического разделения образовавшихся фрагментов. Эта технология, получила название блот-гибридизации по Саузерну в честь автора, предложившего его в 1975 г. Блот-гибридизация - высокочувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. Однако необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применения меченых радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость всей процедуры делают её весьма дорогостоящей, и ограничивает ее применение. Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре - округлой или продолговатой формы. Метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозерн-блот-гибридизации, тогда как связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с мечеными антителами, получил название Вестерн-блот.

Гибритизацию возможно проводить на гистологических или хромосомных препаратах, используя методы гибридизации in situ. Гибридизация in situ на хромосомных препаратах является одним из наиболее эффективных методов картирования комплементарных зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-зондами, проводимая на гистологических препаратах, является одним из наиболее эффективных методов молекулярного анализа тканеспецифической экспрессии генов. Метод гибридизации in situ с ДНК-зондами позволяет определять не только тканеспецифическое распределение, но и внутриклеточную локализацию мРНК на гистологических срезах.

Набор клонированных фрагментов ДНК, полностью отражающих исходную молекулу ДНК, выделенную из какого-либо специфического источника, называют "библиотекой генов". В зависимости от происхождения ДНК различают геномные и ДНК-овые, обычно тканеспецифические, библиотеки генов. Для конструирования геномных библиотек используют тотальную ДНК, выделенную из лейкоцитов периферической крови, из культур клеток, эмбриональных тканей и других биологических источников. Разработаны методы сравнительного анализа различных тканенеспецифических библиотек, с тем чтобы выявить группы генов, экспрессирующихся только в одной ткани или одновременно в двух или нескольких разных тканях.

Гибридизация с ДНК-зондами и клонирование - очень трудоемкие методы, требуют большого количества ДНК и имеют ряд существенных недостатков и ограничений. Особых затрат требует создание зондов и дальнейшая инактивация меченных изотопом реагентов. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) или специфической амплификации ДНК, изобретенный К. Мюллисом (удостоен за это Нобелевской премии), позволил избирательно синтезировать in vitro более миллиона копий любого участка ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов. При этом в качестве матрицы могут быть использованы любые образцы ДНК с частично или полностью известной нуклеотидной последовательностью. Огромное количество копий синтезируемого или амплифицируемого, фрагмента ДНК и небольшие его размеры позволяют проводить прямое молекулярное исследование этого участка. Конкретные методы анализа амплифицированных фрагментов и составляют основу современной клинической ДНК-диагностики, то есть оценки состояния определенного участка гена. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности, фланкирующей амплифицируемую область ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляется путем гибридизации матричной ДНК с двумя праймерами - искусственно синтезированными молекулами ДНК, размером обычно от 15 до 30 пар оснований, комплементарных 3'-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул.

ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы - амплификаторы. Такой прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры. В техническом исполнении ПЦР достаточно проста. Все компоненты реакции (матричную ДНК, праймеры, смесь дезокситрифосфатов и термофильную ДНК-полимеразу) добавляют в специфический буфер, помещают в амплификатор и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каждого шага реакции. Для проведения реакции не требуется большого количества ДНК. Метод ПЦР позволяет проводить прямую диагностику мутаций в генах для сотен моногенных наследственных заболеваний. Этот метод является ключевым для расшифровки генетических основ предрасположенности к наиболее частым мультифакториальным болезням. На ПЦР основаны современные методы диагностики бактериальных и вирусных инфекций, позволяющие обнаруживать присутствие инфицирующих агентов вне зависимости от их активности.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

75314. Периодизация истории средних веков и феодализма в отечественной и зарубежной историографии 34.5 KB
  Западной Римской империи. Встреча двух миров античного грекоримского и варварского германского кельтского славянского стала началом глубокого переворота который открыл новый средневековый период в истории Западной Европы. В практике преподавания пока принято считать условным концом средневековья первую буржуазную революцию общеевропейского значения английскую революцию 1640-1660х годов положившую начало господству капитализма в Западной Европе и совпавшую с окончанием первой общеевропейской Тридцатилетней войны 16181648 гг....
75315. Источники по истории средних веков (V-XV вв) 41.5 KB
  Источники по истории средних веков VXV вв. Законодательные и документальные источники по истории средних веков. Они являлись ценными источниками по истории VI в. Источники по истории XI XV вв.
75317. Понятие “феодализма” в западноевропейской историографии 39.5 KB
  Понятие феодализма в западноевропейской историографии. Понимание феодализма в историографии XVIII в. Главными чертами феодализма некоторые из них считали политическую раздробленность и как следствие ее господство в средние века папской теократии. в определении сущности феодализма недалеко ушли от историков эпохи Просвещения хотя в отличие от них оценивали феодализм как положительное историческое явление: реакционные романтики потому что видели в нем свой политический идеал...
75318. Проблема генезиса феодализма в отечественной и зарубежной историографии 46.5 KB
  Проблема генезиса феодализма в отечественной и зарубежной историографии. Проблема генезиса феодализма и связанный с нею вопрос о путях складывания феодально зависимого крестьянства представляет трудность и с источниковедческой и с теоретической точек зрения. В советской историографии становление феодализма рассматривалось в первую очередь в аспекте вскрытия сдвигов в производительных силах в отношениях собственности...
75319. Образование государства и возникновение писаного права у франков 38.5 KB
  Образование государства и возникновение писаного права у франков. В исторических памятниках имя франков появилось начиная с III в. Франки распадались на две большие ветви приморских или салических франков от латинского слова slum что значит море живших у устья Рейна и прибрежных или рипуарских франков от латинского слова rip что значит берег живших южнее по берегам Рейна и Мааса. Из вождей франков известен Меровей при котором франки сражались против Аттилы на Каталаунских полях 451 г.
75320. Рост крупного землевладения и ослабление центральной власти у франков при преемниках Хлодвига. Объединение страны майордомами Австразии 33.5 KB
  После смерти Хлодвига началось дробление королевства. намечается обособление самостоятельных политических единиц в составе Франкского королевства: Нейстрии СевероЗападной Галлии с центром в Париже; Австразии северовосточной части Франкского королевства включавшей исконные франкские области по обоим берегам Рейна и Мааса; Бургундии территории бывшего королевства бургундов. В Нейстрии которая к моменту франкского завоевания была сильно романизована галлоримляне составлявшие и после завоевания большинство населения раньше чем в...
75321. Франция в IX-XI веках 39.5 KB
  В начале этого периода в стране имелось еще много крестьян не находившихся в какойлибо зависимости от частных лиц и подчинявшихся непосредственно короне. Вместе с тем возрастало число крестьян находившихся в личнонаследственной зависимости сервов и колонов а также жителей иммунитетных территорий. В результате все жители округи будь они в личной либо поземельной зависимости от данного или какогонибудь другого феодала или нет становились его людьми в судебноадминистративном отношении. Для по земельно и лично зависимых крестьян...
75322. Англия в XI-XII вв. Завершение феодализации английского общества 47 KB
  в Англии в основном уже господствовали феодальные порядки но процесс феодализации еще не завершился. Вильгельм со своим войском на больших ладьях переплыл ЛаМанш и высадился на юге Англии в бухте Павенси. Во главе последнего выступил избранный советом мудрых новый король Англии Гарольд. Герцог Нормандский же двинулся к Лондону захватил его и стал королем Англии под именем Вильгельма I Завоевателя.