66412

АНТИКООПЕРАТИВНІСТЬ ПРИ КОМПЛЕКСОУТВОРЕННІ АРОМАТИЧНИХ СПОЛУК І ДНК У ВОДНОМУ РОЗЧИНІ

Автореферат

Физика

Енгельгардта РАН старший науковий співробітник відділу ДНКбілкових взаємодій м. Низькомолекулярні біологічно активні сполуки БАС що виявляють свою медикобіологічну дію шляхом зв’язування з ДНК є однією з найбільш перспективних груп лікарських препаратів які застосовуються...

Украинкский

2014-08-18

473 KB

0 чел.

24

СЕВАСТОПОЛЬСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

БЕШНОВА Даря Олександрівна

УДК 577.113:541.49

АНТИКООПЕРАТИВНІСТЬ ПРИ КОМПЛЕКСОУТВОРЕННІ АРОМАТИЧНИХ СПОЛУК І ДНК У ВОДНОМУ РОЗЧИНІ

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Севастополь – 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському національному технічному університеті Міністерства освіти і науки, молоді та спорту України.

Науковий керівник         доктор фізико-математичних наук,

професор Євстигнєєв Максим Павлович,

Севастопольський національний технічний

університет, професор кафедри фізики.

Офіційні опоненти:

  •  доктор фізико-математичних наук, Нечипуренко Юрій Дмитрович, Інститут молекулярної біології ім. В.О. Енгельгардта РАН, старший науковий співробітник відділу ДНК-білкових взаємодій (м. Москва);
  •  кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Духопельников Євген Володимирович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України, старший науковий співробітник відділу біофізики (м. Харків).

Захист відбудеться “_16_”_вересня _2011 р. о 14:00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради К50.052.05 у Севастопольському національному технічному університеті, 99053, м. Севастополь, 53,  вул. Університетська, 33, ауд. А-201.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Севастопольського національного технічного університету за адресою:

99053, м. Севастополь, 53, вул. Університетська, 29.

Автореферат розіслано “_9_”__серпня___ 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                                                                Рогова О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Низькомолекулярні біологічно активні сполуки (БАС), що виявляють свою медико-біологічну дію шляхом зв’язування з ДНК, є однією з найбільш перспективних груп лікарських препаратів, які застосовуються для лікування багатьох видів захворювань і активно досліджуються в даний час. Однією з ознак потенційної ефективності дії конкретного препарату, що зв’язується з ДНК, є його здатність селективно зв’язуватися з певними послідовностями основ ДНК і тим самим спрямовано блокувати певні ділянки геному. В свою чергу селективність зв’язування в багатьох випадках виявляється невід’ємно пов’язаною зі здатністю ліганду проявляти кооперативність при комплексоутворенні з нуклеїновими кислотами. Особливу значимість механізм кооперативності здобув в останнє десятиліття у зв’язку з відкриттям висококооперативного ефекту зв’язування деяких типів лігандів в малий жолобок ДНК за димерним механізмом [J.A. Parkinson et al. Helvetica Chimica Acta. 2009. V.92. P.795]. Крім того кооперативність комплексоутворення лігандів один з одним за відсутності ДНК (само- і гетероасоціація) набуває в даний час власне значення як один із механізмів стабілізації біологічно важливих нанокомплексів і надмолекулярних структур, які відіграють велику роль, зокрема, в біосенсориці та нанобіотехнології [Yu He et al. Nature. 2008. V.452. P.198].

Традиційно кооперативні ефекти при комплексоутворенні біомолекул підрозділяються на, власне, кооперативні (які протікають зі збільшенням константи зв’язування) та антикооперативні (які протікають зі зменшенням константи зв’язування). Аналіз літературних даних свідчить про те, що механізми кооперативності та антикооперативності у переважній більшості випадків розглядаються в контексті контактних або неконтактних взаємодій лігандів, в основі яких завжди полягає деякий нелінійний ефект, виникаючий в комплексі молекул (наприклад, структурні зміни ДНК при інтеркаляції, кооперативне посилення агрегації, взаємодія лігандів на біополімері та ін.). У той же час механізми “лінійної” кооперативності, зумовлені факторами чисто ентропійної природи та не пов’язані з нелінійною взаємодією лігандів, для класу сполук, що зв’язуються з ДНК, до сих пір не розглядалися.

Зв'язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках двох держбюджетних науково-дослідницьких тематик Міністерства освіти і науки України:

- «Термодинаміка комплексоутворення ароматичних лігандів з ДНК», 2007-2009 рр. (№ держ. реєстр. 0107U001331, шифр «Ліганд-3») - виконавець;

- «Термодинаміка комплексоутворення лігандів, що зв’язуються з поверхнею молекули ДНК», 2010-2012 рр. (№ держ. реєстр. 0110U001683, шифр «Комплекс») - виконавець.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є створення методики аналізу і виявлення фізичних механізмів антикооперативності при самоасоціації, гетероасоціації та комплексоутворенні з ДНК класу низькомолекулярних сполук, які проявляють свою медико-біологічну дію шляхом зв’язування з нуклеїновими кислотами.

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі:

дослідження факторів, визначаючих залежність константи самоасоціації від числа молекул в агрегаті (профіль константи). Отримання виразу для профілю константи самоасоціації та аналіз методичних наслідків урахування профілю в класичних моделях самоасоціації біомолекул. Дослідження характеру кооперативності при самоасоціації молекул ДНК-інтеркаляторів;

розробка моделі кооперативної гетероасоціації, її адаптація до експериментальних даних ЯМР-спектроскопії та аналіз кооперативності гетероасоціації ароматичних ДНК-інтеркаляторів;

урахування впливу антикооперативного характеру гетероасоціації ароматичних лігандів на оцінку інтерцепторного та протекторного механізмів зміни біологічної дії при їх спільному звязуванні з ДНК;

розробка узагальненого функціонально-аналітичного методу дослідження кооперативності зв’язування лігандів з фрагментом ДНК і його адаптація до даних ЯМР-спектроскопії;

розробка обчислювального методу аналізу кооперативності зв’язування лігандів з фрагментом ДНК і його адаптація до даних ЯМР-спектроскопії;

дослідження факторів, визначаючих залежність константи комплексоутворення від числа зв’язаних лігандів з молекулою ДНК довільної довжини. Отримання точного виразу для профілю рівноважної константи зв’язування лігандів з ДНК та вивчення методичних наслідків урахування профілю в класичних моделях комплексоутворення.

Об'єкт дослідження – нековалентне комплексоутворення низькомолекулярних лігандів, що зв’язуються з ДНК: самоасоціація, гетероасоціація та зв’язування з ДНК.

Предмет дослідження – антикооперативні ефекти при комплексоутворенні лігандів, що зв’язуються з ДНК.

Методи дослідження – методи статистичної термодинаміки; методи молекулярного моделюванняX-PLOR 3.1 та HyperChem 6 – для визначення структурних параметрів і розрахунку моментів інерції досліджуваних молекул і їх комплексів; методи нелінійної оптимізації параметрів моделі комплексоутворення з використанням даних 1H ЯМР-спектроскопії: метод Нелдера-Міда, метод “імітації відпалу”.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що самоасоціація лігандів, що зв’язуються з ДНК, в загальному випадку характеризується фундаментальним антикооперативним внеском, який виявляється в систематичному зменшенні константи самоасоціації по мірі росту агрегату і є зумовленим втратою трансляційних і ротаційних ступенів свободи, упорядкуванням молекул в комплексах та електростатичною взаємодією. Цей висновок не обмежений лише класом лігандів, що зв’язуються з ДНК, але є справедливим для будь-яких процесів нековалентної молекулярної агрегації в розчині. Вперше отримано вираз для профілю рівноважної константи самоасоціації ароматичних лігандів, що зв’язуються з ДНК.

Вперше проведено дослідження і розроблено метод аналізу кооперативних ефектів при гетероасоціації ароматичних ДНК-інтеркаляторів. Виявлено, що гетероасоціація ароматичних лігандів, яка супроводжується утворенням міжмолекулярного водневого зв’язку в 1:1 гетерокомплексі, характеризується вираженим антикооперативним ефектом, зумовленим стереоспецифічністю H-зв’язку та виявляємому на рівні тримерних 1:1:1 гетерокомплексів. При цьому неврахування кооперативного ефекту гетероасоціації не призводить до якісної зміни співвідношення ефективності інтерцепторного і протекторного механізмів зміни біологічного ефекту при спільному зв’язуванні ароматичних лігандів з ДНК, проте в деяких випадках може призводити до суттєвої недооцінки константи гетероасоціації і, відповідно, ефективності інтерцепторного механізму дії.

Розроблено функціонально-аналітичний та алгоритмічний методи аналізу кооперативності при комплексоутворенні лігандів з фрагментами ДНК довільної довжини у рамках заданої схеми реакцій комплексоутворення будь-якої складності з урахуванням будь-яких видів кооперативних взаємодій лігандів.

Вперше вивчено вплив фактору втрати ступенів свободи на мікроскопічну константу зв’язування лігандів з полімерною ДНК і показано, що за відсутності будь-якої взаємодії між лігандами процес зв’язування є антикооперативним. Встановлено, що за умови зв’язування малих молекул з біополімером, вплив росту розмірності комплексу на константу зв’язування не є значимим, у той час як урахування даного фактору необхідно приймати до уваги при розгляданні зв’язування лігандів з короткими послідовностями ДНК. Крім того, показано, що енергетичний еквівалент втрати ступенів свободи дає значимий внесок в сумарну енергію Гіббса реакцій комплексоутворення, і повинен враховуватися в енергетичному аналізі зв’язування лігандів з оліго- і полімерною ДНК.

Практичне значення отриманих результатів.  Виявлений в даній роботі фундаментальний антикооперативний характер самоасоціації дозволяє дати інтерпретацію залежності константи самоасоціації від використовуємого в експериментальному методі концентраційного діапазону. Розроблено метод коректування розрахункової константи самоасоціації з урахуванням використовуємого концентраційного діапазону. Запропоновані в роботі моделі кооперативної самоасоціації суттєво розширюють можливості дослідження агрегації біомолекул в розчині і створюють основу для урахування ефектів агрегації при утворенні біологічно важливих надмолекулярних структур, а також при розробці біокінетичних моделей дії БАС на біосистеми різного рівня організації.

На основі запропонованої кооперативної моделі гетероасоціації показано, що параметр кооперативності гетероасоціації може виступати індикатором специфічних взаємодій в комплексі, зокрема, дозволяє виявити міжмолекулярний водневий зв’язок в гетерокомплексах біомолекул.

Запропоновані функціонально-аналітична та алгоритмічна моделі комплексоутворення лігандів з ДНК надають можливість більш глибокого аналізу кооперативних ефектів в системах “ліганд-ДНК”.

В цілому отримані результати розширюють існуючий інструментарій біофізичного дослідження кооперативності комплексоутворення біомолекул в розчині.

Особистий внесок здобувача. У опублікованих наукових роботах [1,10-12] – виведення ключових рівнянь моделей, розрахунок параметрів самоасоціації, участь в обговоренні та інтерпретації результатів; [5,6,17,18] – аналіз літературних даних, виведення рівнянь для профілю константи, аналіз та інтерпретація результатів; [2,3,13-16] – участь в розробці методики розрахунку параметрів кооперативності в реакціях гетероасоціації, проведення розрахунків, участь в інтерпретації результатів і написанні статей; [4,9,21,22] – розробка алгоритмічного методу для аналізу зв’язування в системі ліганд-олігомер, проведення розрахунків, участь в інтерпретації результатів і написанні статей; [7,8,19,20] – аналіз факторів ентропійної природи та виведення рівнянь залежності константи від числа зв’язаних з біорецептором лігандів, проведення розрахунків, участь в написанні статей.

Апробація роботи. Основні результати досліджень, що увійшли до дисертаційної роботи, були представлені та обговорені на: Міжнародній науково-технічній конференції біофізика, фізика і хімія, Севастополь, Україна в 2005, 2006, 2007, 2008, 2010 і 2011 рр.; Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих учених “Ломоносовские чтения”, Севастополь, Україна, 2005, 2006; V Харківській конференції молодих учених “Радіофізика та НВЧ електроніка” (секція біофізики), Харків, Україна, 2005; III Міжнародній конференції “Hydrogen Bonding and Molecular Interactions”, Київ, Україна, 2006; Міжнародній конференції “Нанобиофизика: фундаментальные и прикладные аспекты”, Харків, Україна, 2009; Міжнародній конференції “Physics of Liquid Matter: Modern Problems”, Київ, Україна, 2010. Тези наведених доповідей опубліковано.

Публікації. За результатами досліджень, що увійшли до дисертації, опубліковано 22 наукових роботи, в тому числі 9 статей в спеціалізованих наукових журналах і 13 тез доповідей на національних і міжнародних наукових конференціях.

Структура дисертації. Робота складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків і додатку. Повний об'єм дисертації складає 225 с., з них додатки займають 20 с., список використаних джерел – 404 найменування – 26 с. Дисертація містить 33 рисунки та 15 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми, зв'язок дисертації з науковими програмами і темами, сформульовано мету і задачі дослідження, показано новизну і практичну цінність отриманих результатів, вказано особистий внесок здобувача в опубліковані зі співавторами роботи.

В розділі 1 розглянуто біологічну значимість і фізичні механізми нековалентного комплексоутворення біологічно активних сполук, що зв’язуються з ДНК, при взаємодії лігандів один з одним (само- та гетероасоціація) і комплексоутворенні лігандів з ДНК. Показано, що важливу роль в процесах комплексоутворення грають кооперативні ефекти, які проявляються в посиленні/ослабленні звязування лігандів. При цьому механізми кооперативності та антикооперативності в переважній більшості випадків розглядаються в контексті контактних або неконтактних взаємодій лігандів, в основі яких завжди полягає деякий нелінійний ефект, виникаючий в комплексі молекул (наприклад, структурні зміни ДНК при інтеркаляції, кооперативне посилення агрегації, взаємодія лігандів на полімері та ін.). В той же час механізми “лінійної” кооперативності, зумовлені факторами чисто ентропійної природи та не пов’язані з нелінійною взаємодією лігандів, для класу сполук, що зв’язуються з ДНК, до сих пір не розглядалися.

Розділ 2 присвячений обговоренню існуючих на даний час моделей для дослідження кооперативності на рівні самоасоціації та комплексоутворення лігандів з олігомерними та полімерними молекулами нуклеїнових кислот. При цьому поняття кооперативності для реакцій гетероасоціації БАС до сих пір не вводилося.

Моделі комплексоутворення, які будуть розглянуті в даній роботі, основано на аналізі експериментальних даних та визначенні невідомих параметрів комплексоутворення з використанням відповідної обчислювальної процедури. У зв’язку з цим, в даному розділі також описано загальний алгоритм використаних в роботі методів нелінійної оптимізації параметрів моделі: групи симплексних методів і методуімітації відпалу”.

 В розділі 3 проведено аналіз антикооперативних ефектів на рівні само- і гетероасоціації біологічно активних сполук, що проявляють свою біологічну дію шляхом зв’язування з ДНК.

Аналіз самоасоціації з емпірично заданим профілем константи самоасоціації.

У даному підрозділі проведено розрахунок параметрів самоасоціації різних БАС на основі раніше опублікованих експериментальних концентраційних залежностей хімічних зсувів протонів молекул, отриманих методом ЯМР. Інтерпретація експериментальних даних проводилася на основі чотирьох моделей самоасоціації (ЗТ, ВЗ, КЗТ, КВЗ), дозволяючи зробити висновок про характер агрегації (кооперативності/антикооперативності зв’язування).У даних моделях залежність константи від числа молекул (профіль константи) задається у вигляді [R.B. Martin Chem.Rev. 1996. V.96. P.3043]: ЗТ (модель з затуханням константи): Ki=K/i; КЗТ (модель з затуханням константи з урахуванням параметру кооперативності σ): K2=σK, Ki=K/i; ВЗ (модель із зростанням константи): Ki=K(i-1)/i; КВЗ (модель із зростанням константи з урахуванням параметру кооперативності σ): K2=σK, Ki=K(i-1)/i, де Ki, K - рівноважні константи агрегації; i - число молекул в комплексі; K2 - константа димерізації.

Для перерахованих вище моделей було отримано залежність хімічного зсуву δ в ЯМР-експерименті від концентрації x0 у вигляді:

ЗТ:  ,  

ВЗ:  ,  

КЗТ:  ,  

КВЗ:  ,  ,

де δm і δd – протонний хімічний зсув молекули у мономері та у складі димерного комплексу, відповідно, x1 - концентрація мономерів, - параметр кооперативності: при >1 процес утворення агрегатів вище димеру є антикооперативним, при <1 - кооперативним.

На основі отриманих виразів для розрахунку хімічного зсуву за моделями ЗТ/КЗТ/ВЗ/КВЗ було проведено розрахунки параметрів самоасоціації різних ароматичних сполук, що зв’язуються з ДНК, і встановлено характер зміни рівноважної константи асоціації в залежності від довжини агрегату. Виділено системи з кооперативною та антикооперативною самоасоціацією.

Головним недоліком розглянутих вище кооперативних моделей є відсутність фізичного обгрунтування для запису того чи іншого виду профілю константи. У зв’язку з цим далі проведено дослідження основних факторів, які можуть впливати на залежність константи від числа молекул в комплексі.

Аналіз факторів,визначаючих профіль константи самоасоціації.

Внесок у вільну енергію Гіббса реакції самоасоціації дають наступні складові: G=∆Gvdw+∆Ghyd+∆Gel+∆Gmix+∆Gtrot, де Gvdw - внесок ван-дер-Ваальсових взаємодій; Ghyd - гідрофобний внесок, зумовлений зміною структури води при утворенні комплексу молекул; Gel - внесок електростатичних взаємодій; Gmix - енергія змішування; Gtrot - енергетичний еквівалент втрати трансляційних і ротаційних ступенів свободи молекул при утворенні комплексу. Проведений аналіз дозволил встановити, що основними факторами, визначаючими профіль константи за умови відсутності нелінійних ефектів при комплексоутворенні, є: Gel, Gmix і Gtrot. Використовуючи відомі з літератури залежності Gel=f(i), Gmix=f(i), а також застосовуючи відомі в статистичній термодинаміці вирази для молярної трансляційної і ротаційної ентропій, отримано наступні вирази залежності константи самоасоціації від числа молекул в комплексі:

  (для нейтральних молекул)  (для заряджених молекул)

З отриманих рівнянь витікає, що константа самоасоціації має характер затухання і самоасоціація ароматичних молекул за умови відсутності будь-яких нелінійних ефектів комплексоутворення протікає як антикооперативний процес. Було зроблено висновок, що затухання рівноважної константи є фундаментальною властивістю будь-якої нековалентної, самоагрегуючої системи. Нижче буде показано, що даний результат має важливий методичний наслідок.

Як правило, для аналізу самоасоціації використовують некооперативну модель, в якій агрегація відбувається з однаковою константою (K2=K3=…=Ki – НК модель). Якщо реальна константа самоасоціації має затухаючий характер, то при аналізі самоасоціації за допомогою НК моделі одержуємо не реальну, а деяку усереднену за усіма можливими довжинами комплексів константу. Це означає, що одержуєма за класичною НК моделлю рівноважна константа буде залежати від використовуємого в експерименті концентраційного діапазону, а на практицівід вибору експериментального методу. На основі виведеного у даній роботі строгого виразу для профілю константи, було розроблено метод коректування розрахункової константи самоасоціації з НК моделі з урахуванням використовуємого концентраційного діапазону.

В цілому проведений в даній роботі детальний аналіз самоасоціації з ураху-ванням кооперативних ефектів служить теоретичною основою для розробки біокінетичних моделей розподілу БАС по організму з урахуванням агрегації препарату.

Кооперативність в реакціях гетероасоціації лігандів, що зв’язуються з ДНК.

Раніше в реакціях самоасоціації ароматичних молекул X, протікаючих з рівноважною константою Ki, кооперативність утворення агрегатів вводилася за рахунок параметру кооперативності σX, що відображає енергетичну вигідність формування агрегатів більш високого порядку ніж димери, при цьому K2XK, K3=K4=…=K. Аналогічний за змістом параметр кооперативності σС може бути введений і на реакцію гетероасоціації. Однак, більш доцільним виявляється використання стандартного визначення KC як константи гетероасоціації двох ізольованих молекул X і Y, та подальше послідовне нарощування на такому гетеродимері молекул з параметром кооперативності σС (рис.1). Аналогічно можуть бути визначені константи KX і KY при утворенні ізольованого гомостику молекул, при цьому , . Таким чином, усього при гетероасоціації можливо 8 параметрів кооперативності (рис.1).

Примітка: індекси s або c при параметрах σ позначають утворення гомо- або гетеростику відповідно. Індекс при s або c позначає тип молекули, що звязується з даним комплексом. Верхній індекс визначає молекулу в комплексі, наступну за тією, яка бере участь в реакції асоціації.

Рис.1. Можливі способи утворення тріади молекул і відповідні параметри кооперативності.

В даній роботі для аналізу процесу гетероасоціації на основі введених параметрів кооперативності розроблено модель кооперативної гетероасоціації. Розглянемо довільно виділену тріаду молекул IiIi+1Ii+2 (I=[X,Y]) в межах стику i заданого комплексу C. Будемо вважати, що ця тріада утворилася на етапі формування комплексу C в розчині в результаті реакції Ii+Ii+1Ii+2. Відповідний “мікроскопічний” параметр кооперативності даної реакції σ(IiIi+1Ii+2) може бути визначений відповідно з рис.1. Очевидно, що подальше нарощування агрегату можливе як зліва, так і справа від тріади, яка розглядається, причому будь-яке додавання молекул буде відповідати домноженню параметру σ(IiIi+1Ii+2) на новий параметр кооперативності, відповідаючий новоутвореній тріаді: σ(Ii-1IiIi+1) при посадці молекули зліва і σ(Ii+1Ii+2Ii+3) при посадці справа. Таким чином, кожний i-й стик можна розглядати як точку ініціації комплексу C, з якої розпочалося його утворення шляхом послідовного додавання молекул. При кількості молекул в комплексі l загальне число таких точок дорівнює l-1. Це означає, що комплекс C може бути утворений l-1 різними шляхами. Підсумовування за усіма шляхами дає результуючий (макроскопічний) параметр кооперативності σ(С) комплексу C в цілому:

  (1)

Вираз (1) дозволяє в загальному випадку розрахувати величину “макроскопічного” параметру кооперативності довільно заданого комплексу через “мікроскопічні” параметри, задані на рис.1.

Модель кооперативної гетероасоціації була реалізована алгоритмічно. Суть алгоритма полягає в можливості представлення будь-якого гетерокомплексу у вигляді довільного двійкового числа з числом бітів 0 або 1. При цьому “0” відповідає молекулі X, “1” - молекулі Y. Перебір усіх чисел від 0 до 2N-1 (N - довжина гетерокомплексу) дозволяє сформувати усі можливі типи комплексів у розчині. Подальша реалізація алгоритму вже може проводитися у відповідності з виразом (1). У такій моделі невідомими є параметри δC (протонний хімічний зсув в гетерокомплексі) і параметри .

На основі раніше опублікованих експериментальних даних ЯМР з використанням кооперативної моделі (1) було проведено розрахунок параметрів гетероасоціації антибіотику дауноміцину (DAU), вітаміну флавин-мононуклеотиду (FMN) та кофеїну (CAF) з різними ароматичними БАС: акридиновим оранжевим (AO) і профлавином (PF); фенантридиновими барвниками йодистим пропидієм (PI), бромистим етидієм (EB) і його азидо-аналогами – моно- (EMB) і диазидом етидія (EDC); антибіотиками мітоксантроном (NOV), ногаламіцином (NOG) і актиноміцином D (AMD). Для досягнення надійного результату число невідомих параметрів при розрахунках було навмисно зменшено шляхом фіксації наступних коефіцієнтів: .  Такий підхід представляється можливим, тому що найбільш яскраво ефект кооперативності реакцій гетероасоціації проявляється саме в тріадах молекул з двома гетеростиками: XYX () і YXY (). Таким чином, розрахунок гетероасоціації проводився за трьома параметрами: δC, KC, . Результати розрахунків наведено в табл.1.

Таблиця 1

Розрахункові параметри кооперативності гетероасоціації дауноміцину, флавин-мононуклеотиду і кофеїну з ароматичними молекулами

Ліганд

AO

PF

PI

EB

EMB

EDC

NOV

NOG

AMD

FMN

DAU

DAU

1.16

2.17*

1.33

1.82*

1.43

1.20

2.27*

1.41

FMN

1.59*

1.89*

2.33*

1.41

1.20

1.23

CAF

0.74

0.99

1.20

1.23

0.79

1.32

1.20

1.41

1.23

Примітка. Символом * позначено системи, які додатково стабілізуються в розчині міжмолекулярним водневим зв’язком згідно літературним даним.

Аналіз розрахункових значень дозволяє виділити системи з яскраво вираженою антикооперативною гетероасоціацією (σС>1.8): DAU+EB/PF/NOV. Раніше було показано, що в зазначених системах має місце додаткова стабілізація 1:1 гетерокомплексу за рахунок утворення міжмолекулярного водневого зв’язку (H-зв’язок). Відмінною рисою просторової структури 1:1 гетерокомплексів цих молекул є можливість утворення тільки одного міжмолекулярного H-звязку. Це означає, що посадка другої молекули, наприклад, PF або DAU на гетерокомплекс PFDAU (з утворенням комплексу PF-DAU-PF або DAU-PF-DAU) не супроводжується водневим зв’язуванням (внаслідок стереоспецифічності H-зв’язку донорно-акцепторні групи виявляються уже задіяними у водневому зв’язуванні) і тому повинна характеризуватися значно меншою константою гетероасоціації, ніж попереднє утворення 1:1 гетерокомплексу. Таким чином, молекулярні системи з міжмолекулярним водневим зв’язком (DAU+EB/PF/NOV) орієнтовно повинні відрізнятися різкою антикооперативністю реакцій гетероасоціації вище димерізації, що дійсно витікає з табл.1.

Наявність слабкої антикооперативності в системах, що не утворюють з DAU водневих зв’язків: DAU+AO/EDC/PI/FMN (σС<1.5, див. табл.1), пов’язана зі стеричними перешкодами, які виникають при формуванні комплексів.

Як і у випадку розглянутої вище гетероасоціації DAU з ароматичними молекулами, розрахункові параметри гетероасоціації FMN+ліганд (табл.1) можна розбити на дві групи: сильноантикооперативна (FMN+PF/EB/NOV) і слабкоантикооперативна (FMN+AMD/DAU) гетероасоціація. Наявність сильноантикооперативної агрегації також пояснюється стереоспецифічністю H-звязку в гетерокомплексах молекул.

Аналіз отриманих значень дозволяє зробити висновок, що процес гетероасоціації з CAF більшості з розглянутих ароматических сполук CAF+PI/AMD/EB/DAU/NOG/FMN має слабко виражений антикооперативний характер, що, очевидно, пов’язано зі стеричними перешкодами, виникаючими під час взаємодії молекул, які містять масивні бічні групи. Також слід зазначити, що в жодній з раніше досліджених систем “CAF+Ароматичний ліганд” не було виявлено додаткової стабілізації гетерокомплексів міжмолекулярним водневим зв’язком.

Далі в даному підрозділі було досліджено вплив виявленого антикооперативного характеру гетероасоціації на оцінку інтерцепторного і протекторного механізмів при спільному зв’язуванні ароматичних БАС з ДНК.

Згідно сучасним уявленням, механізм біологічної дії ліганду-інтерцептору на зв’язування ароматичних БАС з ДНК полягає в двох молекулярних процесах: інтерцепторна (гетероасоціація) і/або протекторна (конкуренція X і Y за місця посадки на ДНК) дія. Кількісний аналіз інтерцепторного і протекторного механізмів проводиться за допомогою наступних факторів [M.P. Evstigneev Lambert Academic Publishing, 2010 – 96 p.]: RD=KYN/KXN,  AD=/KXN, де KXN, KYN - константи комплексоутворення молекул X і Y з дуплексом ДНК відповідно, KXY  - константа гетероасоціації молекул X і Y без урахування кооперативності. Очевидно, що виявлений в даній роботі антикооперативний характер гетероасоціації для комбінацій лігандів, додатково стабілізуємих міжмолекулярним H-зв’язком, може вплинути на точність оцінки KXY  і, відповідно, факторів RD і AD. З урахуванням фізичного змісту введеного на рис.1 мікроскопічного параметру кооперативності гетероасоціації, коректування константи KXY можна надати у вигляді: , де KC - реальна константа утворення 1:1 гетерокомплексу з урахуванням кооперативності,  - мікроскопічний параметр кооперативності з табл.1. Аналіз співвідношень RD, розрахованих з урахуванням і без урахування кооперативності (дані не наведено) дозволив зробити висновок, що помилка неврахування кооперативності під час розрахунку факторів RD і AD може досягати 50% для систем, гетерокомплекси яких додатково стабілізуються міжмолекулярним H-зв’язком. Це вказує на важливість урахування кооперативності гетероасоціації під час аналізу спільної дії ароматичних лігандів на ДНК.

В розділі 4 досліджено кооперативне комплексоутворення лігандів з фрагментами нуклеїнових кислот на основі функціонально-аналітичного і алгоритмічного підходів. В якості біорецептору використовувалися олігонуклеотиди ДНК. Олігомери містять кінечне число сайтів посадки, що дозволяє у явному вигляді задати як мікроскопічні константи зв’язування з кожним сайтом, так і параметри кооперативності при взаємодії лігандів.

Функціонально-аналітичний підхід.

Розглянемо реакцію нековалентної інтеркаляції деякого ароматичного ліганду в олігонуклеотид ДНК (НК) довжиною L пар основ. В загальному випадку інтеркалятор має L-1 потенційних сайтів посадки на олігомер. Введемо наступні параметри: Ki – мікроскопічна константа зв’язування з i-м сайтом при утворенні 1:НК комплексу; набір таких констант при i1..L-1 утворює вектор [K] (2); Si – номер сайту, в який сідає i-а молекула при утворенні i:НК комплексу, Si1..L-1; ωij – параметр кооперативності, який показує, як впливає інтеркальований в j-й сайт ліганд на процес зв’язування іншого ліганду з i-м сайтом. Враховуючи полярність олігонуклеотидного ланцюга (5′→3′) для гетерополімера в загальному випадку ωij  ωji, що рівносильно залежності умов зв’язування ліганду від напрямку зв’язування вздовж ланцюга (5′→3′≠3′→5′). Параметр кооперативності при i=j фізичного змісту не містить, тому покладемо ωii = 0. Зручно охарактерізувати кооперативність зв’язування ліганду з НК за допомогою матриці кооперативності розмірності LxL, елементами якої є параметри кооперативності ωij, які приймають нульові значення на діагоналі (2).

                              (2)

Враховуючи залежність ωij від напрямку зв’язування ліганду по відношенню до полярності ланцюга, матриця кооперативності [ω] набуває зміст тензору кооперативності. В окремих випадках тензор кооперативності приймає наступні значення: в моделі “виключеного сусіда” усі елементи, які примикають до діагональних і включаючи їх, дорівнюють нулю: ωij=0 при |i-j|<2 (3); в моделі “найближчого сусіда” усі елементи, модуль різності між індексами яких перевищує два, дорівнюють одиниці: ωij=1 при |i-j|>2 (3).

                   (3)

Розглянемо процес утворення комплексу 1:НК. Концентрація комплексів з лі-гандом, інтеркальованим в S1-й сайт, визначиться виразом: , де D і N – концентрації мономерів ліганду і незв’язаної лігандом НК. Сумарна концентрація комплексів 1:НК визначиться підсумовуванням концентрацій  за усіма припустимими сайтами S1: . Утворення 2:НК комплексу в загальному випадку буде залежати від того, з яким сайтом S1 звязалася перша молекула і з яким сайтом S2 відбувається на даний момент реакція. Крім цього необхідно врахувати вплив молекули в S1 сайті на константу зв’язування  другої молекули з S2 сайтом. Мікроскопічна константа зв’язування з S2 сайтом зміниться і стане рівною : . Сумарна концентрація 2:НК комплексів:

Розмірковуючи подібним чином можна визначити сумарну концентрацію i:НК комплексів:

               (4)

Вираз (4) є базовим в моделі інтеркаляційного комплексоутворення. На його основі може бути повністюмежах модельних обмежень) описана динамічна рівновага ліганду, що зв’язується з олігомером НК довільної послідовності основ і довжини ланцюга. Розглянемо застосування цієї моделі до ДНК-інтеркалюючих лігандів.

В залежності від динуклеотидного сайту для кожного конкретного інтеркалятору можливі 16 різних значень мікроскопічних констант Ki і 256 параметрів кооперативності:

                        (5)

Якщо елементи матриць (5) визначені, то для послідовності будь-якого нуклеотидного складу можуть бути розраховані концентрації i:НК комплексів (4) і макроскопічні константи. Таким чином, даний підхід в принципі дозволяє передбачити спорідненість ліганду до будь-якої наперед заданої олігонуклеотидної послідовності.

В даній роботі запропонований вище функціонально-аналітичний підхід було використано для аналізу комплексоутворення дауноміцину з гексамером 5′-d(CGCGCG) на основі даних ЯМР. Для інтеркаляторів ДНК, як правило, характерно зв’язування згідно моделівиключеного сусіда” інайближчого сусіда”. Враховуючи також, що для гексамеру d(CGCGCG) (L=6) можливі лише два різних типи сайтів посадки CG і GC, тензор кооперативності і матриці мікроскопічних констант і хімічних зсувів набудуть вигляду:

,   ,   (6)

де ωf1 – вплив першого (третього) CG сайту на зв’язування DAU з третім (або п’ятим) CG сайтом у напрямку 5′→3′; ωf2 – вплив другого GC сайту на зв’язування  DAU з четвертим GC сайтом у тому ж напрямку; параметри ωb1, ωb2 мають аналогічний зміст, але при зв’язуванні DAU у зворотньому напрямку 3′→5′. Максимальна кількість лігандів на гексамері дорівнює 3.

Припускаючи для спрощення аналізу однаковість параметрів кооперативності в різних напрямках ωf1=ωb1=ωCG, ωf2=ωb2=ωGC, отримуємо кінцеві вирази для аналізу даних ЯМР:

         

         

Аналіз результатів розрахунків за отриманими формулами дозволив зробити висновок про те, що значення мікроскопічних констант KCG і KGC за величиною близькі до констант, які одержуються для синтетичних полімерів poly[dGC]: poly[dGC] згідно стандартної моделі МакГі-фон Хіппела, при цьому DAU є більш специфічним до GC-сайтів ДНК, ніж CG. Зв’язування другої молекули антибіотику з гексамерною послідовністю “через сайт” за моделлювиключеного сусіда” суттєво антикооперативне (ω<1), що узгоджується з відомим уявленням про характер звязування DAU з олігомерними послідовностями ДНК.

Алгоритмічний метод аналізу кооперативного зв’язування лігандів з фрагментом ДНК.

Слід відзначити, що в описаному вище функціонально-аналітичному підході кінцеві аналітичні вирази отримуються достатньо складним чином, що пов’язано з необхідністю урахування повного набору кооперативних взаємодій і усіх можливих розподілів зв’язаних лігандів (конфігурації) по решітці. У зв’язку з цим, в даному підрозділі було розроблено обчислювальний алгоритм BP-STOCH, який не потребує вводу аналітичних виразів, але в явному вигляді задає усі можливі конфігурації з прийнятним часом розрахунку і дозволяє аналізувати зв’язування в системі ліганд-олігомер для схеми реакцій будь-якої складності.

Основна ідея алгоритмічного методу полягає в можливості представлення решітки, яка містить N сайтів, у вигляді масиву з N біт, кожний з яких може   приймати наступні значення: “0” - поточний сайт вільний, “1” - поточний сайт зайнятий лігандом. Звідси витікає, що масив з N біт може бути представлений як деяке бінарне число “Complex (рис.2).

Перебір усіх можливих бінарних чисел від 0 до максимального 2N-1 означає послідовне генерування усіх можливих типів комплексів в розчині між лігандом і олігомером. Відзначимо,  що  область значень  [0..2N-1]   містить  усі  можливі можливих зайнятих лігандом комплексів тільки у випадку простого 1:1 звязування. Далі згідно зображеному на рис.2 випадку алгоритмічно визначається загальна концентрація молекул ліганду D0 і олігомеру N0.

 Рис.2. Просте 1:1 звязування ліганду з олігомером.

Розроблений алгоритм дозволяє визначити деякий експериментально вимірюваний параметр  окремо по ліганду і нуклеотидам згідно рис.3:

Рис.3. Визначення експериментально вимірюваного параметру  для даного комплексу k-того типу. , , ,  - внески в  від лігандів, звязаних з 1-, 4-, 6- і 8-им сайтами відповідно.  і  - експериментально спостерігаємі параметри для вільного і зайнятого сайтів олігомеру в позиції Nbase решітки.

Описаний алгоритм було адаптовано під аналіз деяких розповсюджених в молекулярній біофізиці схем звязування лігандів з олігомерами ДНК: комплексоутворення лігандів з фрагментами ДНК з урахуванням моделей “найближчогоівиключеного сусіда”, розрахунок параметрів кооперативності, аналіз звязування великих лігандів (блокуючих поспіль декілька мономерів решітки) з ДНК. Інша важлива задача, що відноситься до проблеми моделювання комплексоутворення ліганд-біорецептор - це розрахунок розподілу звязаних лігандів по олігомеру. В даній роботі на основі алгоритму BP-STOCH була реалізована відповідна процедура, яка дозволяє розраховувати розподіл звязаних лігандів заданої довжини len і з заданою спорідненістю звязування на олігонуклеотидній матриці заданої первинної структури. Тестування даної процедури було проведено на основі експериментальної діаграми футпринтингу для звязування антибіотику дауноміцину з 21-мірним фрагментом ДНК [A. Skorobogaty et al. FEBS Lett. 1988. V.227. P.103].

Антикооперативне звязування лігандів з полімерною ДНК.

Найбільш широко розповсюдженими підходами для аналізу звязування лігандів з біополімерами є аналіз Скетчарда і модель МакГі-фон Хіппела. Обидва підходи використовують мікроскопічну константу звязування, яка не залежить від числа вже звязаних лігандів i. Однак, як було показано в розділі 3, на константу звязування можуть впливати такі фактори як втрата числа ступенів свободи при утворенні комплексів. Тому в даному підрозділі було проведено урахування впливу даних факторів на рівноважну константу звязування лігандів з полімерною ДНК.

Внесок складових втрати трансляційних і ротаційних ступенів свободи в сумарну енергію Гіббса можна визначити згідно виразу: Gtrot=∆Gtr+∆Grot, де Gtr і Grot - енергетичні еквіваленти втрати трансляційних і ротаційних ступенів свободи, відповідно.

Кінцеві вирази зміни вільної енергії Гіббса за рахунок втрати трансляційних і ротаційних ступенів свободи можуть бути записані як:

де mD - маса ліганду, m1 - середня маса мономеру біополімеру, NP - число мономерів в біополімері,  - моменти інерції відповідно головних осей молекули ліганду, dвідстань між парами основ вздовж осі z, n - довжина ліганду, NA=6.02·1023 М-1 - це число молекул, які займають об’єм V=10-3 м3, k і h  - константи Больцмана і Планка, відповідно; T - абсолютна температура.

Якщо число дозволених сайтів для зв’язування ліганду достатньо велике, тобто коли  (умова “малого” ліганду у порівнянні з біополімером) загальна зміна вільної енергії Гіббса, , набуває вигляд:

.    (7)

Рівняння (7) не містить числа зв’язаних лігандів, i, отже, якщо умова “малого” ліганду виконується, то залежність вільної енергії Гіббса і рівноважної константи зв’язування може не враховуватися, і якої-небудь систематичної погрішності немає в таких широко розповсюджених підходах, як моделі Скетчарда і МакГі-фон Хіппела для аналізу комплексоутворення в системі ліганд-біополімер. Разом з тим виникає питання про значимість процесу втрати ступенів свободи при зв’язуванні лігандів з фрагментами ДНК. Проведений аналіз для типічних ДНК-інтеркалюючих лігандів дозволив встановити критичну довжину олігомеру, нижче якої урахування факторів втрати ступенів свободи є необхідним. У той же час, для більш довгих олігомерів припустимо використання стандартної моделі 1:НК комплексоутворення і спрощеної формули (7) для розрахунку ΔGtrot. Показано, що ΔGtrot вносить значимий внесок в сумарну енергію комплексоутворення, і повинен враховуватися в енергетичному аналізі зв’язування лігандів з оліго- і полімерною ДНК.

ВИСНОВКИ

В роботі вперше проведено систематичне дослідження антикооперативних ефектів при нековалентному комплексоутворенні біологічно важливих низькомолекулярних сполук (лігандів), що проявляють свою біологічну дію шляхом зв’язування з нуклеїновими кислотами, на рівнях їх самоасоціації, гетероасоціації і зв’язування з ДНК.

1. Встановлено, що самоасоціація лігандів, що призводить до утворення комплексів більш високого порядку, ніж димери, в загальному випадку характеризується фундаментальним антикооперативним внеском, який виявляється в систематичному зменшенні константи самоасоціації по мірі росту агрегату і є зумовленим втратою трансляційних і ротаційних ступенів свободи, упорядкуванням молекул в комплексах і електростатичною взаємодією. З використанням даних ЯМР-спектроскопії вперше проведено розгорнутий аналіз характеру кооперативності агрегації молекул класу ароматичних ДНК-інтеркаляторів.  

2. Встановлено, що виявлений фундаментальний антикооперативний ефект агрегації молекул є одним з факторів, визначаючих спостерігаєму в деяких випадках систематичну розбіжність результатів експериментального визначення константи самоасоціації в суттєво різних концентраційних діапазонах. Запропоновано метод коректування розрахункової константи самоасоціації в залежності від використовуваного концентраційного діапазону.

3. Вперше проведено дослідження і розроблено метод аналізу (модель і обчислювальний алгоритм) кооперативних ефектів при гетероасоціації молекул ароматичних ДНК-інтеркаляторів в розчині. Введено поняття мікроскопічного параметру кооперативності гетероасоціації і встановлено, що даний параметр може виступати індикатором специфічних взаємодій в комплексі, зокрема, бути маркером утворення міжмолекулярного водневого зв’язку (H-зв’язку) в гетерокомплексах  

біомолекул. З використанням даних ЯМР-спектроскопії, для класу ароматичних лігандів, що зв’язуються з ДНК, показано, що додаткове зміцнення 1:1 гетерокомплексів H-зв’язком супроводжується антикооперативним ефектом при утворенні комплексів більш високої розмірності, що зумовлено стереоспецифічністю H-зв’язку.

4. Для класу ароматичних лігандів, що зв’язуються з ДНК, показано, що неврахування антикооперативного ефекту гетероасоціації не призводить до якісної зміни співвідношення інтерцепторного і протекторного механізмів зміни біологічної активності при спільному зв’язуванні ароматичних лігандів з ДНК, однак в деяких випадках може приводити до суттєвої недооцінки величини константи гетероасоціації і, відповідно, ефективності інтерцепторного механізму дії.

5. Запропоновано узагальнений функціонально-аналітичний метод аналізу кооперативних ефектів при зв’язуванні лігандів з фрагментами ДНК довільної довжини. Ключовими об’єктами в даному подході є тензор кооперативності і матриця мікроскопічних констант, які в окремому випаду можуть бути зведені до класичних моделей, які використовуються в молекулярній біофізиці для аналізу зв’язування лігандів з ДНК. Адаптація моделі до експерименту реалізована на прикладі дослідження методом ЯМР класичного антикооперативного звязування антибіотику дауноміцину з гексамером ДНК.

6. Розроблено новий обчислювальний підхід “BP-STOCH”, який дозволяє визначати параметри комплексоутворення в системі “ліганд-олігомер ДНК” в межах заданої схеми реакцій комплексоутворення будь-якої складності з урахуванням будь-яких видів кооперативних взаємодій лігандів. Адаптація “BP-STOCH” підходу до експерименту реалізована на прикладі рішення класичних біофізичних задач по зв’язуванню лігандів з ДНК.

7. Вперше вивчено вплив факторів втрати трансляційних і ротаційних ступенів свободи на мікроскопічну константу звязування в системі “ліганд-полімерна ДНК”. Показано, що за умови звязування малих молекул з біополімером, вплив вказаних ентропійних факторів на константу звязування по мірі росту розмірності комплексу не є значимим, отже, в традиційних підходах Скетчарда і МакГі - фон Хіппела систематична помилка від неврахування ентропійних факторів несуттєва. У той же час урахування цих факторів необхідно приймати до уваги при розгляданні звязування лігандів з короткими послідовностями ДНК, а також в енергетичному аналізі звязування лігандів з оліго- і полімерною ДНК.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Бешнова Д. А. Анализ самоассоциации ароматических молекул с использованием различных модельных подходов / Д. А. Бешнова, Л. В. Глобина, С. Г. Осетров [и др.] // Вестник СевГТУ (серия “Физика и математика”). – 2005. – Вып. 70. – С. 96–104.
  2.  Бешнова Д. А. Кооперативность гетероассоциации как фактор межмолекулярной водородной связи / Д. А. Бешнова, И. Т. Овсянников // Вестник СевГТУ (серия “Физика и математика”). – 2007. – Вып. 85. – С. 43–47.

Евстигнеев М.П. Кооперативность в реакциях гетероассоциации ароматических молекул / М. П. Евстигнеев, Д. А. Бешнова, А. О. Розвадовская // Хим. физика – 2007. – Т. 26, №9. – С. 46–52.

  1.  Евстигнеев М. П. “Микроскопическая” модель комплексообразования интеркаляторов с ДНК: анализ данных ЯМР-спектроскопии / М. П. Евстигнеев, Д. А. Бешнова, А. О. Розвадовская // Биофизика. – 2008. – Т. 53. – С. 55–60.
  2.  Beshnova D.A Profiles of equilibrium constants for self-association of aromatic molecules / D. A. Beshnova, A. O. Lantushenko, D. B. Davies et al. // J. Chem. Phys. – 2009. – Vol. 130. – Art.No. 165105 8p.
  3.  Бешнова Д. О. Аналіз залежності константи самоасоціації ароматичних молекул від довжини агрегату / Д. О. Бешнова, А. О. Лантушенко, М. П. Євстигнєєв // Укр. фіз. журнал. – 2009. – Т. 54, №4. – С. 355–360.
  4.  Beshnova D. А. Does the Ligand-Biopolymer equilibrium binding constant depend on the number of bound ligands? / D. А. Beshnova, A. O. Lantushenko, M. P. Evstigneev // Biopolymers. – 2010. – Vol. 93, № 11. – P. 932–935.
  5.  Бешнова Д. А. Зависимость свободной энергии комплексообразования лигандов с ДНК от длины молекулы ДНК и количества связанных лигандов / Д. А. Бешнова // Вестник СевНТУ (серия “Физика биологических систем и молекул”). – 2011. – Вып. 113 – С. 72–78.
  6.  Beshnova D. А. A novel computational approach “BP-STOCH” to study ligand binding to finite lattice / D. А. Beshnova, E. G. Bereznyak, A. V. Shestopalova et al. // Biopolymers. – 2011. – Vol. 95, № 3. – P. 208–216.
  7.  Евстигнеев М.П. Анализ кооперативной агрегации ароматических молекул с использованием различных моделей самоассоциации / М. П. Евстигнеев, Д. А. Бешнова, Л. В. Глобина // Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики. Физика. Биофизика–2005: всеукр. науч.-техн. конф., 4-9 апр. 2005 г. : тезисы докл. – Изд-во СевНТУ, 2005. – С. 103–104.
  8.  Бешнова Д. А. 1Н-ЯМР исследование самоассоциации ароматических молекул с использованием различных моделей / Д. А. Бешнова, Л. В. Глобина, А. А. Мосунов и др. // Ломоносовские чтения: межд. науч. конф., 4-5 мая 2005 г.: тезисы докл. – Изд-во НЦП “ЭКОСИ-Гидрофизика”, 2005. – С. 157–158.
  9.  Глобіна Л. В. Модель випадкової агрегації для аналізу даних ЯМР самоасоціації біологічно активних ароматичних молекул / Л. В. Глобіна, Д. О. Бешнова, М. П. Євстигнєєв // Біологічні дослідження молодих вчених в Україні: V всеукр. наук. конф., 15-16 вер. 2005: тези доп. – Київ, 2005. – С. 20–21.
  10.  Бешнова Д. А. Кооперативные эффекты при агрегации дауномицина с ароматическими молекулами / Д. А. Бешнова, М. П. Евстигнеев // Радіофізика та НВЧ-електроніка (секція біофізики): п’ята Харк. конф., 14-16 груд. 2005 г.: тези  доп. – Х., 2005. – С. 5455.
  11.  Beshnova D. A. Cooperativity of the hetero-association as a probe for intermolecular H-bonding / D. A. Beshnova, A. O. Rozvadovska, M. P. Evstigneev // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions – Kyiv, Ukraine, May 15-21, 2005. : тезисы докл. К., – 2006. – P. 142.
  12.  Бешнова Д. А. Кооперативность в реакциях гетероассоциации ароматических молекул / Д. А. Бешнова, М. П. Евстигнеев // Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика - 2006”: II всеукр. научн.-техн. конф., 17-22 апр. 2006 г.: тезисы докл. – С., 2006. – С. 54–55.
  13.  Бешнова Д. А. Введение микроскопического параметра кооперативности в модели комплексообразования ароматических лигандов с ДНК / Д. А. Бешнова // Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики “Физика. Биофизика - 2007”: Третья всеукр. научн.-техн. конф., 23-28 апр. 2007 г.: тезисы докл. – С., 2007. – С. 110-112.
  14.  Бешнова Д. А. Анализ факторов, ответственных за самоассоциацию ароматических молекул / Д. А. Бешнова, М. П. Евстигнеев // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2008”: IV всеукр. научн.-техн. конф., 21-26 апр. 2008 г.: тезисы докл. – С., 2008. – С. 130-131.
  15.  Бешнова Д. А. О влиянии концентрационного диапазона на величину константы самоассоциации ароматических биологически активных соединений / Д. А. Бешнова, М. П. Евстигнеев // Nanobiophysics: fundamental and applied aspectsNBP-2009”: межд. конф., Kharkov, Ukraine, October 5-8, 2009.: тезисы докл. Х., – 2009. – P. 37.
  16.  Beshnova D. А. Analysis of the factors originating from the loss of degrees of freedom on Ligand-DNA complexation / D. А. Beshnova, A. A. Hernandez Santiago, A. M. Cervantes Tavera et al. // Physics of liquid matter: modern problemsPLM MP-2010”: межд. конф., Kyiv, Ukraine, May 21-24, 2010.: тезисы докл. К., – 2010. – P. 39.
  17.  Бешнова Д. А. Вклад потери трансляционных и ротационных степеней свободы молекул в суммарную энергию комплексообразования в системе Лиганд-ДНК / Д. А. Бешнова // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2010”: VI межд. научн.-техн. конф., 26-30 апр. 2010 г.: тезисы докл. – С., 2010. – С. 98-99.
  18.  Бешнова Д. А. Алгоритмический поход для исследования комплексообразования лигандов с фрагментами биополимеров / Д. А. Бешнова, М. П. Евстигнеев // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2010”: VI межд. научн.-техн. конф., 26-30 апр. 2010 г.: тезисы докл. – С., 2010. – С. 97-98.
  19.  Бешнова Д. А. Антикооперативность при комплексообразовании ароматических соединений и ДНК в водном растворе / Д. А. Бешнова, М. П. Евстигнеев // Актуальные вопросы биологической физики и химии “БФФХ - 2011”: VII межд. научн.-техн. конф., 26-30 апр. 2011 г.: тезисы докл. – С., 2011. – С. 163-164.

АНОТАЦІЯ

Бешнова Д.О. Антикооперативність при комплексоутворенні ароматичних сполук і ДНК у водному розчині. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Севастопольський національний технічний університет, м. Севастополь, 2011.

В дисертаційній роботі вперше проведено систематичне дослідження антикооперативних ефектів при нековалентному комплексоутворенні біологічно важ ливих низькомолекулярних сполук (лігандів), які проявляють свою біологічну дію шляхом зв’язування з нуклеїновими кислотами, на рівнях їх самоасоціації, гетероасоціації і зв’язування з ДНК. Показано, що для будь-якої самоагрегуючої системи, а також зв’язування лігандів з ДНК, процес комплексоутворення носить антикооперативний характер, зумовлений втратою ступенів свободи при утворенні комплексів. Вперше проведено дослідження і розроблено інструмент аналізу кооперативних ефектів при гетероасоціації ароматичних ДНК-інтеркаляторів. Виявлено, що гетероасоціація ароматичних лігандів, яка супроводжується утворенням міжмолекулярного водневого зв’язку, характеризується вираженим антикооперативним ефектом.

Розроблено функціонально-аналітичний і алгоритмічний методи аналізу кооперативності при комплексоутворенні лігандів з олігомерами ДНК будь-якої довжини в межах заданої схеми реакцій комплексоутворення будь-якої складності з урахуванням будь-яких видів кооперативних взаємодій лігандів.

Ключові слова: ліганди, що зв’язуються з ДНК; само- і гетероасоціація; комплексоутворення; антикооперативність; втрата ступенів свободи молекул; міжмолекулярний водневий зв’язок.

АННОТАЦИЯ

Бешнова Д.А. Антикооперативность при комплексообразовании ароматических соединений и ДНК в водном растворе. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Севастопольский национальный технический университет, г. Севастополь, 2011.

В диссертационной работе впервые проведено систематическое исследование антикооперативных эффектов при нековалентном комплексообразовании биологически важных низкомолекулярных соединений (лигандов), проявляющих свое биологическое действие путем связывания с нуклеиновыми кислотами, на уровнях их самоассоциации, гетероассоциации и связывания с ДНК.

Показано, что для любой нековалентной самоагрегирующей системы процесс самоассоции носит антикооперативный характер, обусловленный влиянием потери степеней свободы молекул при образовании комплексов. Выявленный фундаментальный антикооперативный эффект агрегации молекул является одним из факторов, определяющих наблюдаемое в некоторых случаях систематическое расхождение результатов экспериментального определения константы самоассоциации в существенно различных концентрационных диапазонах. Предложен метод корректировки расчетной константы самоассоциации в зависимости от используемого концентрационного диапазона.

Впервые проведено исследование и разработан инструмент анализа кооперативных эффектов при гетероассоциации ароматических ДНК-интеркаляторов. Введено понятие микроскопического параметра кооперативности гетероассоциации и установлено, что данный параметр может служить индикатором специфических взаимодействий в комплексе, в частности, являться маркером образования межмолекулярной водородной связи (H-связи) в гетерокомплексах биомолекул. С использованием данных ЯМР-спектроскопии, для класса ДНК-связывающихся ароматических лигандов показано, что дополнительное упрочнение 1:1 гетерокомплексов H-связью сопровождается антикооперативным эффектом при образовании комплексов более высокой размерности, что обусловлено стереоспецифичность H-связи. Установлено, что неучет антикооперативного эффекта гетероассоциации не приводит к качественному изменению соотношения интерцепторного и протекторного механизмов изменения биологической активности при совместном связывании ароматических лигандов с ДНК, однако в некоторых случаях может приводить к существенной недооценке величины константы гетероассоциации и, соответственно, эффективности интерцепторного механизма действия.

Предложен обобщенный функционально-аналитический метод анализа кооперативных эффектов при связывании лигандов с фрагментами ДНК произвольной длины. Ключевыми объектами в данном подходе являются тензор кооперативности и матрица микроскопических констант, которые в частном случае могут быть сведены к стандартным моделям, используемым в молекулярной биофизике для описания связывания лигандов с ДНК. Адаптация модели к эксперименту реализована на примере исследования методом ЯМР классического антикооперативного связывания антибиотика дауномицина с гексамером ДНК.

Разработан новый вычислительный подход “BP-STOCH”, позволяющий определять параметры комплексообразования в системе “лиганд-олигомер ДНК” в рамках заданной схемы реакций комплексообразования любой сложности с учетом любых видов кооперативных взаимодействий лигандов. Адаптация “BP-STOCH” подхода к эксперименту реализована на примере решения классических биофизических задач по связыванию лигандов с ДНК.

Впервые изучено влияние факторов потери трансляционных и ротационных степеней свободы на микроскопическую константу связывания в системе “лиганд-полимерная ДНК”. Показано, что при условии связывания малых молекул с биополимером, влияние указанных энтропийных факторов на константу связывания по мере роста размерности комплекса не является значимым. В то же время учет этих факторов необходимо принимать во внимание при рассмотрении связывания лигандов с короткими последовательностями ДНК.

Ключевые слова: ДНК-связывающиеся лиганды, само- и гетероасоциация, комплексообразование, антикооперативность, потеря степеней свободы молекул, межмолекулярная водородная связь.

SUMMARY

Beshnova D.A. Anticooperativity on complexation of aromatic compounds and DNA in aqueous solution. – Manuscript.

Thesis for a Candidates degree of Physical and Mathematical Sciencies in Biophysics - Speciality 03.00.02, Sevastopol National Technical University, Sevastopol, 2011.

In thesis the systematic investigation of the anticooperativity effects on noncovalent complexation of low molecular weight biologically important compounds (ligands) exerting their biological action by complexation with nucleic acids has been accomplished on the levels of their self-association, hetero-association and complexation with DNA. It was shown that for any self-aggregating system, as well as for complexation of the ligands with DNA, the process of complexation is anticooperative resulting from the loss of degrees of freedom during the complex formation. For the first time the investigation has been accomplished and the tool for analysis of cooperativity of hetero-association of aromatic DNA-intercalators is developed. It was shown that the hetero-association of aromatic ligands, accompanied by formation of intermolecular H-bond, features a pronounced anticooperativity.

The functional-analytic and algorithmic approaches for analysis of cooperativity on complexation of ligands with DNA oligomers of any length for reaction scheme of any complexity and including any kinds of cooperativity interactions of ligands were developed.

Key words: DNA interacting ligands, self- and hetero-association, complexation, anticooperativity, the loss of degrees of freedom, intermolecular H-bond.


Наукове видання

БЕШНОВА Даря Олександрівна

Антикооперативність при комплексоутворенні ароматичних сполук і ДНК у водному розчині

Підписано до друку 29.07.2011 г. Формат 60×90 1/16

Друк офсетний. Умов. друк. арк. 0.8

Тираж 100 прим. Замовлення № 12

Видавництво «СевНТУ», Севастополь, вул. Університетська, 33, НМЦ


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

65102. Погребальные памятники центральных областей Улуса Джучи (к вопросу об исламизации населения Золотой Орды) 169.5 KB
  Привлечение такого источника как погребальные памятники для изучения проблемы исламизации населения Золотой Орды с точки зрения археологии позволило бы не только рассмотреть этот процесс с политической стороны хорошо освещённой в письменных источниках но и детально изучить...
65103. УТВЕРЖДЕНИЕ ИСЛАМА КАК ГОСУДАРСТВЕННОЙ РЕЛИГИИ В ЗОЛОТОЙ ОРДЕ 163.5 KB
  Стремление задобрить служителей культа всех известных монголам религий создавало у современников-монотеистов мусульман и христиан впечатление будто завоеватели принадлежат всем верам. Усманов ранние чингизиды демонстрируя свою верность шаманизму исконной вере предков...
65104. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ИСЛАМА В ЗОЛОТОЙ ОРДЕ (НА МАТЕРИАЛАХ ПОГРЕБАЛЬНЫХ ПАМЯТНИКОВ) 2.13 MB
  Халикова также разбирает проблему идентификации исламских погребений и делает попытку выделить типично мусульманские признаки в погребальном обряде опираясь на предписанные шариатом правила и на анализ археологических материалов...
65105. К ВОПРОСУ О РОЛИ СУФИЗМА В ИСЛАМИЗАЦИИ ЗОЛОТОЙ ОРДЫ 71 KB
  Однако проникновение ислама в Золотую Орду началось намного раньше ещё с момента её образования поэтому связывать исламизацию лишь с волевыми решениями ханской администрации было бы ошибочно.
65106. ГОРОДИЩЕ АК-САРАЙ 43.5 KB
  На восток охранная зона памятника включающая городище и мавзолеи протянулась на расстояние около 2250 метров от берега р. В природном отношении территория занимаемая городищем и комплексом мавзолеев представляет собой всхолмлённую слабозадернованную песчаную полупустыню.
65107. ИСЛАМ В ЗОЛОТОЙ ОРДЕ (ИСТОРИКО-АРХЕОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 4.28 MB
  С течением времени уменьшается число как богатых так и бедных погребений с признаками всадничества. Однако при соблюдении ряда основных признаков мусульманской погребальной обрядности по остальным признакам данные захоронения часто мало...
65109. Кыпчаки и Кимакский каганат. Йемеки 47 KB
  Легендарные сведения подтверждают указанное направление движения кыпчаков: согласно легенде о предке уйгуров Огузкагане последний послал кыпчаков чтобы они поселились между страной итбараков предположительно киргизов. Повидимому более раннее или параллельное название кыпчаков сиры.
65110. КНЯЗЬЯ КАЗАНСКИЕ, КНЯЗЬЯ БОЛГАРСКИЕ 103 KB
  Осенью этого года великий князь суздальский и нижегородский Дмитрий Константинович послал рать на Болгарского князя Асана вариант написания: Блъгарского князя Осана 4. высказана следующим образом: на Болгарского князя Асана еже ныне глаголются Казанцы выделено нами.