67934

Реакции иммунитета: реакция агглютинации, реакция преципитации

Практическая работа

Медицина и ветеринария

Цель: Владеть техникой постановки реакции агглютинации и реакции преципитации для диагностики инфекционных заболеваний. Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммунитет. Содержательный модуль 9. Реакции иммунитета.

Русский

2014-09-16

242 KB

19 чел.

Методическая рекомендация для студентов к практическому занятию 16

Тема: Реакции иммунитета:

реакция агглютинации, реакция преципитации.

Цель: Владеть техникой постановки реакции агглютинации и реакции преципитации для диагностики инфекционных заболеваний.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.

Содержательный модуль 9. Реакции иммунитета.

Тема 16: Реакция агглютинации. Реакция преципитации.

Актуальность темы. Под иммунитетом подразумевают невосприимчивость организма к инфекционным и неинфекционным агентам (патогенных микроорганизмов, чужеродных белков и др. веществ). Эти агенты получили названия антигенов. Иммунитет бывает врожденным и приобретенным. Врожденный – когда формируются тканевые и гуморальные защитные приспособления, обуславливающие невосприимчивость к инфекционным заболеваниям, передающимся по наследству.

Приобретенный – осуществляется иммунной системой организма в виде выработки антител или накопления сенсибилизированных лимфоцитов. Он подразделяется на естественный и искусственный. По механизму действия разделяется на активный и пассивный. Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген.

Основной функцией иммунной системы, которая состоит из лимфоидной ткани, является распознавание чужеродных агентов (антигенов) и обезвреживание их.

Антигены могут попадать в организм через дыхательные пути, пищеварительный тракт, через кожные и слизистые покровы. Каждый антиген стимулирует образование особых белковых веществ – антител.

Антигены подразделяются на полноценные и неполноценные (гаптены). Полноценные антигены вызывают полный иммунный ответ. Неполноценные антигены самостоятельно не вызывают иммунного ответа, но иногда приобретают эту способность при конъюгации с высокомолекулярными белковыми носителями. Кроме того, бывают антигены: полугаптены, проантигены, гетероантигены и изоантигены.

Антитела представляют собой иммуноглобулины сыворотки крови человека или животного. Образуются антитела после перенесенной инфекции, и в результате иммунизации ослабленными или убитыми бактериями, риккетсиями, вирусами, токсинами и другими агентами. Антитела – белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам. По структуре и иммунобиологическим свойствам иммуноглобулины подразделяются на 5 классов: IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Нормальные антитела обнаруживают у людей и животных не иммунизированных. Специфические антитела образуются в результате перенесенной инфекции или же иммунизации.

Реакции взаимодействия антитела с антигеном называются серологическими. Серологические реакции отличаются высокой специфичностью и применяются при диагностике многих инфекционных заболеваний. Различают реакции агглютинации и преципитации.

1. Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии антигена (агглютиногена) и антитела (агглютинина), при котором происходит склеивание и выпадение в осадок микробных тел в присутствии электролита. Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации.

Наибольшее значение имеют:

- Макроскопическая (развернутая) агглютинация в пробирках. К сыворотке больного добавляют взвесь микробов (диагностикум) и через 1 час в термостате при температуре 37 градусов отмечают разведение (титр) сыворотки, при котором произошла реакция. Положительной считают реакцию агглютинации тогда, когда на дне пробирки образуется осадок с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Этот осадок называется агглютинатом.

По характеру агглютината различают мелкозернистую (О) и крупнозернистую (Н) агглютинацию. Для выявления мелкозернистого агглютината пользуются агглютиноскопом. Учет результатов начинают с контрольных пробирок. Последнее разведение сыворотки, в которой наблюдается агглютинация, считают ее титром.

Цель реакции: обнаружение антител в сыворотке больного.

- Микроскопическая (ускоренная) ориентировочная агглютинация на стекле. К капле диагностической иммунной сыворотки вносят каплю бактериальной культуры и равномерно перемешивают. Реакция протекает при комнатной температуре через 5-10 минут. Затем производят учет. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают скопление бактерий в виде зернышек или хлопьев. Цель реакции: определение вида возбудителя по известной диагностической сыворотке.

- Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Сущность этой реакции заключается в том, что эритроциты барана способны адсорбировать на своей поверхности антигены. Под воздействием специфических антител, эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне гемагглютинат. Реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РНГА позволяет обнаружить минимальное количество антител и неполноценные антигены полисахаридной природы. Эту реакцию применяют при диагностики многих инфекционных заболеваний (брюшного и сыпного тифа, паратифов, туберкулеза и др.).

2. Реакция преципитации (РП) осаждение комплекса антиген-антитело. Основным отличием РП от РА является то, что  при РА применяется корпускулярный антиген, а при РП – антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы. В этой реакции антиген называется преципитиноген, а антитела – преципитины. Реакцию ставят в пробирках наслоением раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе

этих растворов образуется кольцо преципитата. Если в качестве антигена используют прокипяченные и профильтрованные экстракты органов и тканей, реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, которую ставят при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии и др.).

Широкое распространение получили реакции преципитации в агаре: метод простой диффузии, метод двойной диффузии.

Разновидностью преципитации является реакция флокуляции – для определение активности анатоксина или антитоксической сыворотки. Кроме того, можно использовать эту реакцию для определения токсигенности штаммов Corynebacterium diphtheriae.

Конкретные цели:

  •  Объяснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;
  •  Описать структуру антигенов, в том числе антигенов микроорганизмов;
  •  Описать структуру антител (разных классов иммуноглобулинов);
  •  Проанализировать механизм взаимодействия антител с антигенами;
  •  Описать механизм реакции агглютинации;
  •  Описать механизм реакции преципитации.

Уметь:

  •  Пояснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;
  •  Описать структуру антител (разных классов иммуноглобулинов);
  •  Проанализировать механизм взаимодействия антител с антигенами;
  •  Трактовать результаты реакции агглютинации;
  •  Трактовать результаты реакции преципитации;
  •  Анализировать полученные результаты.

Теоретические вопросы:

  1.  Определение понятия «антигены», «антитела».
  2.  Роль антигенов как индукторов иммунного ответа.
  3.  Структура антител (разных классов иммуноглобулинов).
  4.  Механизм взаимодействия антител с антигенами.
  5.  Реакции иммунитета, их роль в иммунном ответе и диагностике инфек-ционных болезней.
  6.  Механизм реакции агглютинации.
  7.  Механизм реакции преципитации.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

  1.  Постановка реакции агглютинации для выявления антител в сыворотке больного.
  2.  Постановка реакции микроагглютинации на стекле с диагностическими сыворотками для идентификации чистой культуры бактерий.
  3.  Оценка результатов реакции агглютинации.
  4.  Постановка реакции преципитации для выявления антигена бактерий.
  5.  Оценка результатов  реакции преципитации.
  6.  Оценка результатов реакции непрямой гемагглютинации.
  7.  Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и имму-нологией.– Киев: Высшая школа, 1992.- 431с.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.- М.: Медицина, 1998.- 336с.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.

5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.- 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983.- 512с.

6. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Титов М.В. Инфекционные болезни.- К., 1995.– 321с.

2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.– М.: Медицина, 1990.- 559с.

3. БМЭ, Т. 1,2,7.

Краткие методические указания для работы на практическом занятии.

В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из:

а) постановки реакции агглютинации для выявления антител в сыво-ротке больного и оценки результатов реакции;

б) постановки реакции микроагглютинации на стекле и оценки резуль-татов реакции;

в) постановки реакции преципитации и оценки результатов реакции;

г) оценки результатов реакции непрямой гемагглютинации.

После анализа результатов реакций, записывают в протокол.

В конце занятия проводится оформление протокола, тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каждого студента.

Технологическая карта проведения практического занятия

№ п\п

Этапы

Время в мин.

Способы обучения

Оборудования

Место проведения

1.

Проверка и кор-рекция выходно-го уровня подго-товки к занятию

20

Тестовые задания выходного уровня

Тесты по теме «Ан-тигены. Антитела. Реакции иммуните-та»

Учебная комната

2.

Самостоятель-ная работа

35’

Граф

логичной структуры

Штативы, пробирки. Ингредиенты для постановки реакции агглютинации и пре-ципитации (диагно-стикумы, диагности-ческие сыворотки, сыворотка больно-го), термостат.

3.

Самоконтроль и коррекция усвоенного материала

15

Целевые обучающие программы

4.

Тестовый контроль

15

Тесты

5.

Анализ резуль-татов работы

5

Алгоритм лабораторной работы:

1. Постановка реакции агглютинации для выявления антител в сыворотке больного.

2. Оценки результатов реакции агглютинации.

3. Постановка реакции микроагглютинации.

4. Оценка результатов реакции микроагглютинации на стекле.

5. Постановки реакции преципитации.

6. Оценка результатов реакции преципитации.

7. Оценка результатов реакции непрямой гемагглютинации.

8. Запись схем реакций и выводов в протокол.

9. Оформление протокола.

10. Тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каж-дого студента.


Целевые учебные задания:

1. На кожно-обрабатывающий завод доставили кожу животных из района, где регистрируется сибирская язва. Какая из приведенных реакций используется для выявления термостабильного антигена возбудителя сибирской язвы в кожном и меховом сырье?

А. РА

В. РСК

С. РП

D. РП

Е. РГА

2. При исследовании иммунологического состояния определяется наличие в сыворотке всех классов иммуноглобулинов. Каких из перечисленных иммуноглобулинов встречается больше в сыворотке здорового человека?

А. IgA

В. IgD

С. IgG

D. IgE

Е. IgM

3. На базаре гражданин А. продавал колбасу под названием «свинная домашняя». В госсанинспекции возникло подозрение на фальсификацию колбасы. С помощью какой серологической реакции иммунитета можно идентифицировать пищевой продукт?

А. РСК

В. РНГА

С. Преципитации

D. РА

Е. Иммунофлюорисценции

4. С целью серологической диагностики коклюша поставлена реакция с коклюшным и паракоклюшным диагностикумами. На дне пробирок, в  которые был внесен диагностикум из Bordetella parapertusis, образовался зернистый осадок. Какие антитела выявила эта реакция?

А. Антитоксины

В. Опсонины

С. Агглютинины

D. Преципитины

Е. Бактериолизины

5. Чтобы определить токсигенность выделенных от пациентов возбудителей дифтерии, культуры высевали на чашку Петри с питательной средой с двух сторон от расположенной в центре полоски фильтровальной бумаги, смоченной противодифтерийной антитоксической сывороткой. После инкубации посевов в агаре между отдельными культурами и полоской фильтровальной бумаги обнаружены участки помутнения среды. Какую серологическую реакцию было проведено?

А. Преципитации в геле

В. Кумбса

С. Агглютинации

D. Кольцепреципитации

Е. Опсонизации

6. Из организма больного выделен возбудитель заболевания. Его следует идентифицировать по антигенной структуре. Какую серологическую реакцию необходимо использовать?

А. Преципитации

В. Связывания комплемента

С. Нейтрализации

D. Агглютинации

Е. Опсонизации

7. Серологическая диагностика инфекционных заболеваний основыва-ется на специфическом взаимодействии антител с антигенами. Как называ-ется серологическая реакция, которая состоит в склеивании микроорганизмов под действием на них специфических антител при наличии электролита?

А. Гемадсорбции

В. Преципитации

С. РСК

D. Агглютинации

Е. Нейтрализации

8. Серологическая диагностика инфекционных заболеваний основыва-ется на специфическом взаимодействии антител с антигенами. Как называ-ется серологическая реакция, при которой высокодисперсные антигены адсорбированы на эритроцитах?

А. Нейтрализации

В. Преципитации

С. РСК

D. Гемадсорбции

Е. Непрямой (пассивной) гемагглютинации

9. Серологическая диагностика инфекционных заболеваний основыва-ется на специфическом взаимодействии антител с антигенами. Как называ-ется серологическая реакция осаждения с раствора антигена под влиянием на него иммунной сыворотки и электролита?

А. Нейтрализации

В. Агглютинации

С. РСК

D. Гемадсорбции

Е. Преципитации


Граф логической структуры темы: “РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА:

реакция агглютинации, реакция преципитации”

Методическое указание для студентов к практическому занятию 17

Тема: Реакции иммунитета:

  реакция связывания комплемента, реакция лизиса.

Цель: Овладение техникой постановки реакции связывания компле-мента и реакции лизиса.

Модуль1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.

Содержательный модуль 9. Реакции иммунитета.

Тема 17. Реакция связывания комплемента. Реакция лизиса.

Актуальность темы.

Несмотря на значительное количество общепринятых методов диагностики, большинство из них по точности, надежности и чувствительности не в полной мере отвечают современным требованиям. Это связано с биологическими особенностями ряда возбудителей, что ограничивает применение бактериологических и вирусологических методов, и заставляет исследователей вести разработку новых более эффективных диагностических методов.

В связи с этим в последние годы разработан ряд иммунологических тестов, которые отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, а также быстротой получения результата. К таким исследованиям относятся ЦПР, иммуноферментный анализ, реакция иммуноблотинга, иммунохроматографический анализ и др.

Успех серологической диагностики зависит от специфичности реакции и соблюдения временных условий взятия крови, необходимых для синтеза организмом антител.

Взаимодействие антигена с антителом вызывает ряд строго специфических явлений в виде феноменов, доступных для наблюдения в пробирках и нашедших практическое применение в лабораторной диагностике в виде иммунологических реакций.

Широкое применение в лабораторной диагностике инфекционных болезней имеют, на ряду с другими, классические реакции: реакция связывания комплемента, реакции лизиса.

Реакции иммунитета используются при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические исследования (от лат. serum – сыворотка + logos – учение) – методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген-антитело в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

К основным серологическим реакциям относятся реакции агглютинации, преципитации, лизиса, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный). Перечисленные реакции отличаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов.

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента в результате присоединения его к антителам, находящимся в комплексе с антигеном.

 Реакцию связывания комплемента (РСК) проводят в две фазы:

1-я фаза – инкубация смеси искомого антигена (или антитела) с диагностической сывороткой (или антигеном-диагностикумом) и комплементом;

2-я фаза – индикаторная – определение наличия в смеси свободного комплемента добавлением гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к эритроцитам барана. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов отсутствует (реакция положительная). При отрицательной реакции, если антиген и антитело не соответствуют друг другу, комплемент остается свободным и во 2-й фазе реакции он присоединяется к комплексу эритроцит-антиэритроцитарное антитело гемолитической сыворотки, вызывая гемолиз.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).

 Реакцией лизиса называется растворение антигена, соединенного с антителами, в присутствии комплемента. Лизины (антитела, участвующие в реакции) проявляют действие только в присутствии комплемента.

Специфические антитела взаимодействуют с различными клетками, в том числе бактериями и простейшими, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и последующему лизису клеток. Среди них известны реакции вибриолиза и реакции гемолиза.

Большинство микроорганизмов, за исключением холерного вибриона и трепонем, устойчивы к литическому действию антител. Поэтому реакция лизиса не нашла широкого применения в лабораторной практике.

Реакцию лизиса используют в качестве индикаторной системы в реакции связывания комплемента.

Для постановки реакции лизиса и РСК используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских свинок.

Конкретные цели:

  •  Объяснить ценность реакции связывания комплемента (РСК) в диагностике инфекционных болезней.
  •  Объяснить ингредиенты, необходимые для постановки РСК.
  •  Объяснить механизм РСК.
  •  Объяснить учет РСК.
  •  Отметить особенности реакции Вассермана при сифилисе и РСК в модификации Физе при риккетсиозах).
  •  Объяснить реакцию бактериолиза (феномен Исаева-Пфайфера).

Уметь:

  1.  Поставить РСК.
  2.  Пояснить механизм РСК.
  3.  Провести учет реакции.
  4.  Пояснить феномен Исаева-Пфейфера.

Теоретические вопросы:

1. Сущность РСК. Необходимость использования индикаторной системы.

2. Характеристика и подготовка ингредиентов РСК.

3. Механизм РСК.

4. Практическое использование РСК, реакции бактериолиза.

 

Практические задачи, которые выполняются на занятии:

Титрация комплемента для РСК с помощью реакции гемолиза (титр комплемента, рабочая доза).

Постановка РСК.

Учет РСК.

Изучение реакции бактериолиза Исаева-Пфейфера (по таблице).

Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и имму-нологией.– Киев: Высшая школа, 1992.- 431с.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.- М.: Медицина, 1998.- 336с.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.

5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.- 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983.- 512с.

6. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Титов М.В. Инфекционные болезни.- К., 1995.– 321с.

2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.– М.: Медицина, 1990.- 559с.

3. БМЭ, Т. 1,2,7.

Краткие методические указания для работы на практическом занятии.

В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа заключается в:

а) постановке реакции связывания комплемента, оценке результатов реакции;

б) разборе реакции бактериолиза Исаева-пфайфера (по таблице).

После анализа результатов реакций, записывают в протокол.

В конце занятия проводится оформление протокола, тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каждого студента.

Технологическая карта проведения практического занятия

№ п\п

Этапы

Время в мин.

Способы обучения

Оборудования

Место проведения

1.

Проверка и кор-рекция выходно-го уровня подго-товки к занятию

20’

Тестовые задания выходного уровня

Тесты по теме

Учебная комната

2.

Самостоятель-ная работа

35’

Граф

логичной структуры

Таблицы. Штативы, пробирки. Ингредиенты для постановки РСК и реакции лизиса, термостат.

3.

Самоконтроль и коррекция усвоенного материала

15’

Целевые обучающие программы

4.

Тестовый контроль

15’

Тесты

5.

Анализ резуль-татов работы

5’

Алгоритм лабораторной работы:

1. Титрация комплемента для РСК с помощью реакции гемолиза (титр комп-лемента, рабочая доза).

2. Постановка РСК.

3. Оценка результатов РСК.

4. Изучение бактериолиза на примере реакции Исаева-Пфейфера (по таб-лице).

5. Запись схем реакций и выводов в протокол.

6. Оформление протокола.

7. Тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каждого студента.


Целевые учебные задания:

1. Гемолитическая сыворотка против эритроцитов барана необходима для работы в лаборатории, где проводится серологическая диагностика инфекционных болезней. Для чего ее используют?

А. Для определения видовой принадлежности эритроцитов в судебно-медицинской экспертизе

В. Для реакции непрямой гемагглютинации

С. Для диагностики гемолитической болезни новорожденных при резус-конфликте

D. Для реакции торможения гемагглютинации

Е. Как компонент гемолитической системы в реакции связывания комплемента

2. Для серологической диагностики сифилиса с использованием реакции Вассермана врач-лаборант подготовил следующие реактивы: кардиолипиновый антиген; спиртовой экстракт липидов с сердечной мышцы быка с холестерином; антиген из трепонем, разрушенных ультразвуком; гемолитическую систему; изотонический раствор натрия хлорида; исследуемые сыворотки. Какой еще компонент необходим для постановки этой реакции?

А. Эритроциты барана.

В. Антиглобулиновая сыворотка.

С. Комплемент.

D. Живые трепонемы.

Е. Диагностическая преципитирующая сыворотка.

3. В женскую консультацию пришла женщина на 8 неделе беременности. При обследовании у нее взяли кровь для проверки на наличие специфических антител к трепонемам. Какие из перечисленных ниже серологических реакций могут быть использованы для выявления антител к трепонемам?

А. Кожная проба Манту.

В. Реакция Райта.

С. Реакция Видаля.

D. Кожная проба Бюрне.

Е. Реакция Вассермана.

4. В дермато-венерологическом диспансере в целях диагностики сифилиса применяется реакция Вассермана. К какому из приведенных типов реакций она принадлежит?

А. РА.

В. РП.

С. РСК.

D. РН.

Е. РГА.

5. При добавлении гемолитической (индикаторной) системы к пробиркам с бактериальной системой в последних произошел гемолиз. О какой реакции идет речь в данном случае?

А. РГА.

В. РА.

С. РСК.

D. РН.

Е. РП.

6. При постановке РСК в пробирке с исследуемой сывороткой больного в системе образовался комплекс антиген-антитело-комплемент, не определяемый визуально. Каким образом можно выявить этот комплекс антиген-антитело-комплемент?

А. Используя индикаторную тест-систему.

В. Заразив кролика.

С. Добавив 3%-ую взвесь эритроцитов.

D. Добавив гемолитическую сыворотку.

Е. Добавив физраствор.

7. При постановке РСК с сывороткой больного с подозрением на хроническую гонорею, она оказалась положительной на 4 креста во всех разведениях сыворотки (от 1:5 до 1: 160). Как можно определить визуально феномен положительной РСК на 4 креста?

А. Наличие осадка и бесцветной надосадочной жидкости.

В. Образование пленки.

С. Образование «зонтика».

D. Образование «пуговки».

Е. Образование хлопьев.

8. Известно, что на каждый возбудитель болезни в организме человека образуются антитела: агглютинины, преципитины, опсонины, лизины, комплементсвязывающие и другие. В какой серологической реакции можно выявить комплементсвязывающие?

А. РА на стекле.

В. РП в агаре.

С. РСК.

D. РГА.

Е. РНГА.

9. После проникновения в организм бактерии фагоцитируются макро-фагами. Какую роль играют макрофаги в кооперации иммунокомпетентных клеток на первом этапе формирования иммунного ответа?

A. Активируют NK-клетки

B. Активируют Т-киллеры

C. Обеспечивают процессинг и презентацию антигена Т-хелперам

D. Продуцируют иммуноглобулины

E. Обеспечивают процессинг и презентацию антигена Т-киллерам

10. У больной, 37 лет, на протяжении года периодически возникали инфекционные заболевания бактериального генеза. Их течение было длительным, ремиссии – кратковременными. При обследовании обнаружена гипогаммаглобулинемия. Нарушение функций каких клеток может быть прямой ее причиной?

A. Нейтрофилов

B. В-лимфоцитов

C. Фагоцитов

D. Макрофагов

E. Т-лимфоцитов

11. Наиболее важным центральным органом иммунной системы человека есть тимус, к которому относиться часть стволовых клеток крови для их дальнейшего дозревания. Какие клетки иммунной системы человека дифференцируются в этом органе?

A. Т-лимфоциты

B. Плазматические

C. Макрофаги

D. В-лимфоциты

E. Микрофаги


Методическая рекомендация для студентов к практическому занятию 18

Тема: Учение об иммунитете. Серологические реакции с меткой.

Цель: Изучить механизм постановки серологических реакций с метками и ПЦР для экспресс - диагностики инфекционных заболеваний.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.

Содержательный модуль 9. Реакции иммунитета. Иммунопатология.

Тема 18. Серологические реакции с меткой. Полимеразная цепная реакция.

Актуальность темы. Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды. Индикация образующегося комплекса антиген-антитело может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные и др. метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность классических иммунохимических методов анализа в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких минут.

Исторически первым среди них был радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов прошлого века. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 125I, в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл).

Радиоиммунный метод, является наиболее информативным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образованием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или антитело) введена радиоактивная метка. Наибольшее распространение получил метод конкуренции за специфические антитела меченного радиоактивным изотопом антигена и такого же антигена, но свободного от радиоактивной метки, количество которого необходимо определить в исследуемой биологической среде. С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие антигена, добавляют известное количество такого же меченного антигена и стандартное количество антисыворотки с соответствующими антителами.

Если в исследуемой жидкости отсутствует искомый специфический антиген, то около 70–80% меченного антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность образующегося преципитата. Если же в биологической среде присутствует искомый антиген, он конкурирует с меченным антигеном и связывает часть антител. В результате радиоактивность преципитата падает по сравнению с контролем. На этом принципе основано количественное определение антигенов или антител. Так как меченый антиген добавляется в определённой дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая осталась не связанной в результате конкуренции с выявляемым не меченым антигеном. При определённых концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. После взаимодействия антигенов с антителами образовавшийся комплексы антиген – антитело отделяют от свободного меченого антигена. Способы отделения: 1.Электрофорез; 2. Гель – фильтрации; 3.Фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом и др. Отделив меченый антиген от комплекса антиген – антитело определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе по количеству импульсов (сцинтилляционным счетчиком). Уменьшение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с антисывороткой, в результате чего антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген – антитело.

В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузных и иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях.

На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение. Наибольшее распространение получили гетерогенные методы иммуноферментного анализа, основанные на использовании полистироловых планшетов для иммобилизации антител или антигенов, специфическом связывании определяемого вещества на стенках лунок планшета и последующем выявлении образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами компонентов.

Иммуноферментный метод основан на учете реакции антиген-антитело, причем в качестве метки, позволяющей обнаружить иммунный комплекс, используют ферменты, например пероксидазу, щелочную фосфатазу. Одним из распространенных вариантов таста ИФА является твердофазный метод «Сэндвич – метод»: вначале на стенках полистироловых пробирок сорбируют антитела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемый биологический образец. Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. После этого в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количественной оценки этих комплексов в пробирку добавляют перекись водорода (Н2О2) и хромогены. Фермент (пероксидаза) разлагает Н2О2 с выделением кислорода. Последний окисляет хромоген, который приобретает желтый цвет. Интенсивность окрашивания и, соответственно, количество искомого антигена оценивают фотометрически.

Этапы проведения ИФА:

  1.  Инокуляция биоматериала и реактивов в лунки полистироловых планшетов микротест системы (на которых сорбированы Ат против определенного Аг и фермент).
  2.  Термостатирование и встряхивание на шейкере для равномерного перемешивания реакционной смеси в лунках планшета.
  3.  Промывка лунок планшета на вошере (автоматический промыватель планшетов) – для отмывки не связавшихся субстанций (Ат, конъюгата и др.).
  4.  Добавление окрашенного субстрата (хромогена).
  5.  Регистрация результата на ридере (спектрофотометре, фотоколориметре для определения оптической плотности исследуемого раствора в лунках планшета).

В последние годы для количественного радиоиммунного и иммуноферментного определения различных антигенов и антител в биологических средах все чаще используют так называемые моноклональные антитела. Последние получают не путем иммунизации животных, а искусственно, путем синтеза так называемых моноклонов, т. е. культуры клеток, происходящих из одного сенсибилизированного лимфоцита. Моноклональные антитела отличаются от обычных антител, полученных с помощью классической иммунизации животных, очень высокой специфичностью и реагируют только на определенный антиген.

Самым распространенным тестом обнаружения аутоантител в исследуемой сыворотке является реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - люминисценция в ультрафиолетовом свете микроскопа биологического объекта, содержащего излучаемый антиген после его предварительной обработки специфическими антителами, меченными флюорохромом.

Суть метода заключается в том, что локализация антигена в препарате обнаруживается по специфической флюоресценции в месте реакции антиген – антитело. Метод основан на использовании явления люминисценции для выявления реакции антиген – антитело, происходящей на поверхности клеток или на срезах ткани. При этом антитела, связанны с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. Большое преимущество метода заключается в его простоте, высокой чувствительности, а так же в быстроте получения результатов. Метод был предложен в 1942 г. Кунсом. Специфический белок метят флюорохромами – это такие красители, которые способны поглощать свет и излучать его через короткий промежуток времени (10-6 – 10-9сек). Интенсивность флюоресценции пропорциональна интенсивности возбуждающего излучения, и при малых концентрациях вещества возможно количественно определить флюоресцирующее вещество на микроскопическом или цитологическом препарате.

Механизм реакции:  происходит конъюгация белка с флюорохромом, которая является по своей сути химической реакцией, в результате чего образуется новое соединение, в котором краситель присоединяется к белку ковалентной связью. В реакции участвуют в основном ε – аминогруппы лизина и концевые аминогруппы белковой молекулы.

Метод применяется в трёх основных модификациях:

1. При прямом методе (Кунс и Каплан)  на препарат, содержащий искомый антиген,  наносят специфическую люминисцентную сыворотку (антитело). После реакции препарат промывают и изучают в люминисцентном микроскопе. Таким образом, реакция протекает одноэтапно.

2. При непрямом варианте РИФ (Уэллер и Кунс). Раствор немеченных антител наносят на срез (ткань различных органов животных, содержащих известные антигены), а затем выявляют их при помощи меченных флюорохромом антииммуноглобулиновых антител.

3. Непрямой метод с комплементом (Гольдвассер, Шепард). Этот вариант метода разработан для определения комплемент – связывающих антител. После обработки среза антителами на него наносят в качестве источника комплемента свежую сыворотку. Комплемент связывается в участках, где фиксированы антитела. В результате эффекта усиления при активации комплемента по классическому пути одна молекула антител может вызывать связывание многих С3 – молекул на срезе; их выявляют, обрабатывая срез флюоресцентно меченными антителами анти-С3. Препараты изучают в люминисцентном микроскопе (ЛЮМАМ).

В современной медицинской практике с каждым годом возрастает роль лабораторной диагностики как основного инструмента постановки диагноза и мониторинга терапии. Одним из бурно развивающихся и востребованных методов лабораторной диагностики является иммунохроматографический анализ (ИХА) - метод одноэтапного быстрого качественного определения наличия антител к возбудителям заболеваний in-vitro в биологических материалах (моча, цельная кровь, сыворотка или плазма крови, слюна, кал и т.д.). Данный вид анализа осуществляется при помощи индикаторных полосок, палочек, панелей или тест-кассет, которые обеспечивают быстроту проведения тестирования. ИХА - метод сухой иммунохимии, стрип-тест, экспресс-тест или экспресс-анализ. Эти названия связаны с быстротой проведения этого метода анализа.

Принцип действия ИХА с помощью полосок состоит в том, что при погружении теста в физиологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Подвижной фазой в данном случае является физиологическая жидкость. Вместе с жидкостью движутся и антитела с красителем. Если в этой жидкости присутствует исследуемый антиген (гормон, инфекционный или онкологический маркер), то происходит его связывание, как с первым, так и со вторым типом антител, что является уже иммунологическим методом анализа. При этом происходит накопление антител с красителем вокруг антител, жестко иммобилизованных в тест-зоне ИХА-полоски, что проявляется в виде яркой темной полосы. Несвязавшиеся антитела с красителем мигрируют далее вдоль полоски и неизбежно взаимодействуют со вторичными антителами в контрольной зоне, где и наблюдается вторая темная полоса. Взаимодействие (и темная полоса) в контрольной зоне должны проявляться всегда (если анализ проведен правильно), независимо от присутствия исследуемого антигена в физиологической жидкости. Результаты определяются визуально или компьютерной обработкой отсканированного изображения. В ИХА- тестах используется три типа антител:

1. Растворимые моноклональные антитела к исследуемому антигену или антителу, конъюгированные ("сшитые") с коллоидным золотом - красителем, который можно легко идентифицировать даже в самых малых концентрациях. Эти антитела нанесены вблизи участка погружения тест-полоски в физиологическую жидкость (мочу, кровь).

2. Поликлональные антитела к исследуемому антигену или антителу, жестко иммобилизованные в тест-зоне полоски.

3. Вторичные антитела к моноклональным антителам, жестко иммобилизованные в контрольной зоне тест-полоски.

Принцип действия ИХА с помощью тест - кассет, состоит в том, что  исследуемый образец абсорбируется поглощающим участком планшета. При наличии в анализируемом образце антител к возбудителю заболевания последние вступают в реакцию с протеином А, конъюгированным с частицами коллоидного золота, образуя окрашенный комплекс. Этот комплекс движется по мембране и связывается с рекомбинантным антигеном, иммобилизованным на мембране в тестовой зоне планшета, образуя полоску розово-фиолетового цвета на уровне маркировки Т (Test). Остальные компоненты образуют полоску розово-фиолетового цвета в тестовой зоне на уровне маркировки С (Control). Результаты реакции оцениваются визуально в течение 10 минут. В том случае, когда концентрация антител к возбудителю заболевания в анализируемом образце сыворотки крови равна пороговому уровню или превышает его, в тестовой зоне выявляются две полоски розово-фиолетового цвета на уровне маркировок Т и С.

Основными преимуществами использования иммунохроматографического анализа являются:

  •  Простота и удобство - позволяет получить результат (анализ и первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных навыков
  •  Надежность - достоверность тестов достигает 92-99,8%, при этом каждый тест имеет встроенный внутренний контроль
  •  Экономичность - минимальные затраты на приобретение теста и экономия времени на проведение обследования. В рознице стоимость одного ИФА-исследования в 5-10 раз дороже ИХА и получение результата минимум на следующий день
  •  Анонимность - что особенно важно при выявлении заболеваний, передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также выявлении фактов употребления наркотических веществ
  •  Независимость - не требует предварительной медицинской консультации и рецепта врача

Высокочувствительным методом, основанном на сочетании электрофореза и ИФА (или РИА) является иммуноблоттинг (Вестерн-блонттинг) с помощью которого проводится идентификация исследуемых антител после электрофоретического разделения их и последующего тестирования с помощью меченных антивидовых антител.

1. Иммуноблот с РИА. Антигены возбудителя (исследуемые антигены) сначала разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Полученные фракции переносят (блоттинг – от англ. blot – пятно) электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану, которая помещается в специальную камеру. Затем эти блоты обрабатывают специальными Ат к специфическому Аг, отмывают и добавляют радиоактивно меченный конъюгат для определения связавшихся с Аг Ат. Блоты помещают в кассету с рентгеновской пленкой и на проявленной пленке при положительной реакции видны полосы локализации Аг, связавшего меченные Ат.

2. Иммуноблот с ИФА. Фирмы выпускают коммерческие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации, отмывают от несвязавшихся Ат больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

При наличии в исследуемой сыворотке крови специфических антител к индивидуальным белкам возбудителя образуется видимый преципитат. Положительные реакции выглядят в виде ИФА – пятен, каждое из которых соответствует дискретной паре антиген – антитело. Единственное пятно позволяет усомниться в истиности результата.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это амплификация специфических последовательностей нуклеиновых кислот, с помощью которой в течение нескольких часов можно размножить нужную последовательность в миллионы раз. ПЦР позволяет осуществить такую амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы из 4 дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, являющихся структурными элементами любой ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20-30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3´-концевым последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена.

ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации - изолированное умножение гена или его фрагмента) специфической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров. Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий ДНК в исследуемом материале. Данный метод основан на выявлении в исследуемом образце специфического фрагмента ДНК возбудителя и на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное достраивание обеих нитей.

 Достоинство:

1. Высокая чувствительность, позволяющая выявить даже единичные клетки возбудителя, независимо от их природы за 1-2 часа.

2. Высокая специфичность – выявляется характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

3. Быстрота получения результата – весь процесс занимает 3-4 часа.

4. Использование при определении возбудителя непосредственно клинического материала, без специального выделения чистой культуры возбудителя и его подращивания.

5. Диагностика не только свежих, но и хронических форм инфекций. Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых и персистирующих форм патогенных микроорганизмов.

6. Возможность выделения ДНК не только живых, но и убитых микроорганизмов.

Стадии метода ПЦР:

І. Выделение ДНК возбудителя из биологического материала.

ІІ. Амплификация ДНК (многократное копирование специфического фрагмента ДНК) – проводится в термоциклерах «Терцик – Украина» - специальный прибор с определенным температурным режимом для проведения циклов ПЦР, каждый из которых состоит из 3-х этапов:

1. Денатурация – нагревание реакционной смеси до 93-950С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2. Отжиг (присоединение) – при наличии искомой ДНК-мишени праймеры отжигаются (присоединяются) к ДНК-мишени при температуре 600С. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа (напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина – цитозин). Когда отжиг праймеров произошел, Таq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК.

3. Синтез (элонгация) – доводят температуру в реакционной смеси до оптимума работы фермента (720С). Синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью. В дальнейшем этап денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются до 30 и более раз. На каждом температурном цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается. Таким образом, данный метод основан на способности ДНК-полимеразы достраивать одноцепочечную ДНК с образованием двухцепочечной молекулы.

Праймеры – короткие искусственно синтезируемые молекулы ДНК, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.

Taq-полимераза – фермент, обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК

ІІІ. Детекция продуктов амплификации. Продукты ПЦР (ампликоны) идентифицируют при помощи гелевого электрофореза и результат реакции учитывают по свечению искомой ДНК возбудителя в УФ свете с помощью прибора - трансиллюминатора.

Конкретные цели:

  •  Объяснить преимущества применения серологических реакций с метками как экспресс – методов диагностики инфекционных заболеваний;
  •  Объяснить суть реакций и механизм проведения серологических реакций с метками;
  •  Проанализировать механизм проведения иммуноферметного анализа и сравнить с иммунохроматографическим анализом;
  •  Сравнить преимущества и недостатки ИФА и ИХА;
  •  Описать механизм проведения полимеразной цепной реакции ;
  •  Изучить этапы проведения ПЦР;
  •  Перечислить достоинства ПЦР.

Уметь:

  •  Пояснить необходимость проведения серологических реакций с метками;
  •  Описать этапы проведения реакций с метками;
  •  Проанализировать механизм проведения РИА, ИФА и ИХА;
  •  Трактовать результаты серологических реакций с метками;
  •  Трактовать результаты ПЦР;
  •  Анализировать полученные результаты.

Теоретические вопросы:

  1.  Определение понятия «серологические реакции с метками».
    1.  Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение.
    2.  Иммуноферментный анализ, иммуноблотинг. Механизм, компоненты, применение.
    3.  Механизм проведения радиоиммунного анализа.
    4.  Иммунохроматографический анализ. Принцип проведения.
    5.  Механизм полимеразной цепной реакции. Этапы проведения. Учет.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

  1.  Разбор схемы постановки ИФА.
  2.  Разбор схемы постановки ИХА.
  3.  Оценка результатов реакций.
  4.  Разбор схемы постановки иммуноблоттинга.
  5.  Разбор схемы постановки РИА и РИФ.
  6.  Оценка результатов реакций.
  7.  Разбор схемы постановки ПЦР.
  8.  Оформление протокола.

Литература:

1. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с анг. – М.: Мир, 2000.– 592с., с ил.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник /Под ред. А.А. Воробъева.– М.: МИА, 2004.– 691с.: ил.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.

5. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов /Под ред. А.А. Воробъева, А.С. Быкова.– М.: МИА, 2003.– 236с.: ил.

    6. Сучасні методи лабораторної діагностики інфекційних захворювань: Навч. посібник /За ред. акад. А.Я. Циганенка. Харків: Вид-во “Основа”, 2003.– 88 с.

7. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

  1.  Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: М.: Медицинское информационное агенство, 2001. – 736 с.
  2.  Вершигора А.Е. Общая иммунология. - К.: Вища шк., 1990. - 635 с.
  3.  Воробьёв С.М., Северина Т.А. Создание иммуноферментной системы для определения гликопротеинов с использованием моноклональных антител // Биотехнология. - 1991.- № 4.- С. 82 - 85.
  4.  Егоров А.М., Осипов А.П. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высшая шк., 1991. - 288 с.
  5.  Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология: Руководство для врачей. - СПб: Питер, 2001. - 576с.
  6.  Иммунологические методы исследований /Швейцария. Базельский ин-т иммунологии; Под ред. И. Лефковитса, Перниса П.; Пер. с англ. - М.: Мир, 1988.- 527с.

Краткие методические указания для работы на практическом занятии.

В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию. Самостоятельная работа состоит из:

а) Разбора схемы постановки ИФА и оценки результатов реакции;

б) Разбора схемы постановки ИХА и оценки результатов реакции;

в) Разбора схемы постановки иммуноблоттинга и оценки результатов реакции;

г) Разбора схемы постановки ПЦР.

После анализа результатов реакций, записывают в протокол.

В конце занятия проводится оформление протокола, тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каждого студента.

Технологическая карта проведения практического занятия

№ п\п

Этапы

Время в мин.

Способы обучения

Оборудования

Место проведения

1.

Проверка и кор-рекция выходно-го уровня подго-товки к занятию

20’

Тестовые задания выходного уровня

Тесты по теме «Серологические реакции с метками. ПЦР»

Учебная комната

2.

Самостоятель-ная работа

35’

Графы

логической структуры

Таблицы. Ингредиенты для постановки серологических реакций с метками (диагностические тест – системы для ИФА), термостат.

3.

Самоконтроль и коррекция усвоенного материала

15’

Целевые обучающие программы

4.

Тестовый контроль

15’

Тесты

5.

Анализ резуль-татов работы

5’

Целевые учебные задания:

1. Для выявления антител к возбудителю сифилиса врач-лаборант использовал тест-кассеты набора для проведения иммуно-хроматографического анализа. Учитывая результат через 10 мин, врач обнаружил одну полоску розово-фиолетового цвета на уровне маркировки С (контроль). О чем говорит полученный результат?

А. Об отрицательном результате анализа

В. О положительном результате анализа

С. О ложноположительном результате

D. О ложноотрицательном результате

Е. Необходимо провести дополнительный тест или повторить ИХА

2. При постановке реакции прямой флюоресценции используют:

А. Помеченные флюорохромом антитела к исследуемому антигену

В. Непомеченные антитела к исследуемому антигену

С. Помеченные флюорохромом антигены

D. Непомеченные флюорохромом антигены

Е. Гемолитическую систему

3. При постановке реакции непрямой флюоресценции используют:

А. Помеченные флюорохромом антииммуноглобулины

В. Помеченные флюорохромом антитела к исследуемому антигену

С. Непомеченные антитела к исследуемому антигену

D. Помеченные флюорохромом антигены

Е. Непомеченные флюорохромом антигены

4. В качестве маркера при ИФА можно использовать:

А. Щелочную фосфатазу

В. Каталазу

С. Супероксиддисмутазу

D. Лизоцим

Е. Комплемент

5. Специфическую диагностику каких заболеваний обеспечивает ПЦР?

А. Венерических заболеваний

В. Заболеваний, вызываемых ДНК-содержащими вирусами

С. Бактериальных инфекций

D. ВИЧ-инфекции

Е. Всех перечисленных заболеваний

6. При прямой иммунофлюоресцентной идентификации специфическо-го инфекционного агента флюорохром связан с:

А. Микроорганизмами (исследуемым антигеном)

В. Эритроцитами барана

С. Специфическими антителами к человеческому Ig

D. Специфическими антителами к комплементу

Е. Специфическими антителами к микроорганизму

7. Детекцию ДНК проводят с помощью:

А. Электрофореза в геле, свечение в УФ трансиллюминатора

В. Амплификации специфического фрагмента ДНК

С. Денатурации ДНК

D. Элонгации ДНК

Е. Отжига праймеров

8. Амплификация ДНК возбудителя проходит этапы:

А. Денатурации, присоединения праймеров, синтез новых копий ДНК

В. Элонгации, присоединения праймеров, синтез новых копий ДНК

С. Денатурации, присоединения праймеров, детекции ДНК возбудителя

D. Денатурации, присоединения праймеров, отжига и детекции

Е. Присоединения праймеров, электрофореза, детекции

Алгоритм лабораторной работы:

1. Разбор схемы постановки ИФА и оценка результатов реакции;

2. Разбор схемы постановки ИХА и оценка результатов реакции;

3. Разбор схемы постановки иммуноблотинга и оценка результатов реакции;

4. Разбор схемы постановки РИФ и РИА и оценка результатов реакции;

5. Разбора схемы постановки ПЦР.

6. Запись схем реакций и выводов в протокол.

7. Оформление протокола.

8. Тестовый контроль и анализ результатов самостоятельной работы каж-дого студента.


Граф логической структуры темы «СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С МЕТКАМИ. ПЦР».

S-зон


Граф логической структуры темы «Серологические реакции с метками. ПЦР».

30


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

82759. Поняття атмосфери у сценічний творчості та в роботі актора над роллю 35.82 KB
  Цій меті режисер сягає лише в тому разі якщо в процесі створення творчого колективу в наслідку створення цілісного художнього твору присутній сприятлива атмосфера. Немає більш загадкового і невловимого поняття в режисерській технології ніж атмосфера.
82760. Понятие культуры. Функции культуры 40.85 KB
  Несмотря на многообразие научных взглядов на культуру как систему, существуют и общие (традиционные) положения, поддерживаемые большинством исследователей. Многие ученые рассматривают культуру как сложное многокомпонентное явление, связанное с многообразием жизни и деятельности человека.
82761. Развитие прокуратуры в переходный период. Упразднение прокуратуры СССР Постановлением Президиума ВС РСФСР от 28.12.1991 года 27.19 KB
  С распадом СССР в начале 90-х годов прошлого века органы военной прокуратуры как и вся страна переживали непростые времена: трудности в экономике резко осложнили финансирование вооружённые конфликты в различных регионах лавинообразный всплеск преступности многочисленные реорганизации вызвали...
82762. Расходы бюджетной системы 592 KB
  В современных условиях бюджетные кредиты предоставляются в основном в форме связанных кредитов иностранных государств зарубежных банков фирм и международных финансовых организаций. Таким образом сумма налога на имущество физических лиц в следующем финансовом году составит...
82763. Биологический возраст человека 41.42 KB
  Определение биологического возраста. Понятие биологического возраста возникло в результате осознания неравномерности развития зрелости и старения. Биологический возраст может опережать либо отставать от хронологического возраста.
82764. Білінгвізм як психолінгвістичний феномен 43.01 KB
  Двомовність привертає увагу лінгвістів, психологів, педагогів відповідно до динаміки когнітивних підходів до опису мовних явищ та мовленнєвих процесів. У вивченні й оволодінні іноземною мовою надзвичайно велику роль відіграють різноманітні нейро- та психолінгвістичні аспекти.
82765. Типическое и индивидуальное в образах Онегина и Ленского 38.77 KB
  Цели: Формировать у учащихся представление об эпохе, в которой жил и создавал свои произведения А.С. Пушкин; Раскрыть причину недуга времени - равнодушия, разочарования во всем; Воспитывать чувство прекрасного и уважение к русской культуре.
82766. Давление и сила давления 67.5 KB
  Как вы считаете какие задачи нам нужно решить что нужно узнать о давлении чтобы разгадать всю тайну Учащиеся называют что нужно узнать о давлении что такое давление чем оно характеризуется от чего зависит как его рассчитать где применяется.
82767. Царство Грибов. Плесневые грибы 40.08 KB
  Дидактическая цель: Создать условия для осознания и осмысления блока новой учебной информации средствами критического мышления. Тип урока: комбинированный( изучения нового материала и первичное закрепление); Методы обучения: частично – поисковый, репродуктивный...