67938

Иммунные сыворотки. Реакция нейтрализации

Практическая работа

Медицина и ветеринария

Иммунные сыворотки. Титрование антитоксической сыворотки. Иммунные сыворотки это иммунобиологические препараты содержащие готовые антитела которые имеют способность нейтрализовать действие патогенных микроорганизмов и продукты их жизнедеятельности.

Русский

2014-09-16

76 KB

3 чел.

7

Методическое указание для студентов к практическому занятию № 19

Тема: Иммунные сыворотки. Реакция нейтрализации.

 Титрование антитоксических сывороток.

Цель: Изучение иммунобиологических препаратов, которые используют с

 лечебной, профилактической и диагностической целью.

 Освоение методики постановки реакции флокуляции для титрования

 антитоксических сывороток.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция.

  Иммунитет.

Содержательный модуль 9. Реакции иммунитета. Иммунопатология.

Тема занятия № 19. Иммунные сыворотки. Реакция нейтрализации.

    Титрование антитоксической сыворотки.

Актуальность темы. Иммунные сыворотки - это иммунобиологические препараты, содержащие готовые антитела, которые имеют способность нейтрализовать действие патогенных микроорганизмов и продукты их жизнедеятельности. Иммунные сыворотки используют с лечебной, профилактической (для получения пассивного иммунитета) и диагностической целью.

Иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, получают путем многократной иммунизации (гипериммунизации) лошадей. В начале, животным подкожно вводят небольшие дозы антигена, которые постепенно увеличивают. Иммунизацию прекращают после того, как животные перестает реагировать увеличением титра антител на повторное введение антигена.

После прекращения иммунизации (через 10-12 дней) проводят кровопускание. Из крови получают сыворотку. Для удаления балластных белков (которые имеют токсичное и аллергическое действие) разработанные методы очищения сывороток с помощью сульфата аммония, электрофореза, ферментативного гидролиза и др.

Иммунные сыворотки, полученные из крови животных, называют гетеро-логичными, а из крови людей - гомологичными. По направленности действия сыворотки разделяют на антитоксические (противодифтерийная, противостолбнячная, противоботулинованя и др.), антибактериальные и противовирусные (иммуноглобулины).

Антитоксические сыворотки выпускают с определенным содержанием антитоксинов, силу которых измеряют в международных единицах (МО) или в антитоксических единицах (АЕ). Для определения силы действия антитоксических сывороток используют феномен флокуляции.

Титрование антитоксических сывороток проводят двумя методами: по Рамону и по Эрлиху.

Иммуноглобулины получают из донорской, плацентарной или абортивной крови человека, а также из сывороток гипериммунизированных животных. Иммуноглобулины человека менее реактогенны, а потому максимально безвредны; после введения циркулируют дольше гетерологичных ( 4-5 недель). Существует два вида иммуноглобулинов - нормальный (или противокоревой) и иммуноглобулины направленного действия (противогриппозный, антирабический  и др.).

При введении сывороток могут возникать аллергические реакции, такие как гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ). ГНТ обусловлена взаимодействием аллергена с IgЕ, которой сорбирован на мембранах тучных клеток и базофилов, что приводит к высвобождению гистамина, серотонина, эозинофильных и базофильных хемотаксических факторов и протеаз. Медиаторы взаимодействуют с рецепторами мышечных, секреторных и других клеток, что ведет к сокращению гладкой мускулатуры, проницаемости сосудов и отеку.

Для предупреждения анафилактических реакций сыворотки вводят дробно по методу Безредко.

Сывороточная болезнь развивается через 8-12 суток после введения сыворотки и обусловленная образованием иммунных комплексов, которые фиксируются в тканях. В норме комплексы АГ-АТ элиминируются фагоцитами. Когда комплексы удержатся в тканях, то они вызывают реакции воспаления. Макрофаги и нейтрофилы выделяют протеолитические ферменты и другие медиаторы воспаления, которые и повреждают ткани.

Диагностические сыворотки используют в серологических реакциях для определения неизвестного антигена.

В настоящее время широко используют моноклональные антитела, т.е. те антитела, которые синтезируются одним клоном антителообразующих клеток, т.е. клеток, которые возникли с одного и того же зрелого В-лимфоцита. Они узнают только один антиген и взаимодействуют только с ним. Возникновение в организме моноклональних антител было выявлено при развитии лимфоидных опухолей (плазмоцидом). В этом случае в организме больного происходит размножение одного клона лимфоцитов. Искусственное получение клеток-продуцентов моноклональних антител стало возможным после разработки методики получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридома - это гибрид нормальной антителообразующей и опухолевой клеток. Такой гибрид унаследовал от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой - бессмертие и способность к неограниченному росту.

В 1975 году Г.Келер и К. Мильштейн осуществили слияние лимфоцитов селезенки мыши, иммунизированной бараньими эритроцитами, с культивированными клетками миеломи и определили, что некоторые гибридомы секретируют антитела к бараньим эритроцитам. Для получения гибридом были использованные такие штаммы миеломних клеток, которые не содержат фермент гипоксантинфосфорибозилтрансферази и поэтому гибнут в селективной среде - ГАТ (содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин); лимфоциты в такой среда не гибнут. Возникающие при слиянии клеток гибридомы наследуют от В-лимфоцитов способность к синтезу специфических иммуноглобулинов и способность размножаться в селективной среде ГАТ, а от миеломной клетки - способность к бесконечному размножению.

Процесс получения гибридом включает следующие стадии:

  1.  получение линии миеломных клеток. Чаще с этой целью применяют мышиные или крысиные клеточные линии;
  2.  получение иммунных В-лимфоцитов (антителообразующих клеток) из селезенки иммунизированных соответствующим антигеном животных;
  3.  выделение гибридом и отбор из них интересующего клона;
  4.  накопление клеток полученного клона для его практического использования.

Преимуществом гибридом является то, что с их помощью возможно получение неограниченного количества антител, которые сохраняют свою специфичность и чувствительность.

Моноклональные антитела широко используют для определения белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и др. Моноклональные антитела, благодаря своей высокой специфичности, стандартности и технологичности получения вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.

Конкретные цели:

  1.  Ознакомление с этапами получения антитоксических сывороток в производственных условиях.
  2.  Ознакомление с принципами и стадиями получения гаммаглобулинов.
  3.  Ознакомление с принципами постановки реакции нейтрализации и титрованием антитоксических сывороток.
  4.  Ознакомление с механизмом аллергических реакций и сывороточной болезни, которые возникают на введение сывороток.

Уметь:

  1.  Проводить реакцию нейтрализации.
  2.  Проводить расчет титра сыворотки в поставленном опыте.

Теоретические вопросы:

  1.  Классификация иммунных сывороток.
  2.  Лечебные и профилактические сыворотки и их применение.
  3.  Диагностические сыворотки и их применение в серологических реакциях.
  4.  Получение иммунных сывороток от животных и людей.
  5.  Получение гаммаглобулинов.
  6.  Антитоксины. Механизм их действия.
  7.  Титрование антитоксических сывороток.
  8.  Классификация реакций гиперчуствительности.
  9.  Осложнения, которые могут возникать при введении иммунных сывороток. Механизм их возникновения.
  10.  Получение моноклональних антител.

Практические задачи, которые выполняются на занятии:

  1.  Постановка реакции флокуляции для титрования антитоксической сыворотки (дифтерийной) по схеме.
  2.  Учет реакции.
  3.  Оформление протокола (запись схемы постановки реакции и вычисление титра сыворотки).

Дополнительная литература:

  1.  Воробьев А.В., Биков А.С., Пашков Э.П., Рыбакова А.М. Микробиология.- М.: Медицина, 1998.- 336с.
  2.  Попов М.М., Циганенко А.Я., Мінухін В.В. Основы иммунологии: Учебник.- Харьков: Вид-во “Основа”, 2005.- 276с.
  3.  Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией.- Киев.: Высшая шк., 1992.- 431с.
  4.  Медицинская микробиология /Под ред. В.И. Покровского.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.- 768с.
  5.  Конспект лекции.

Короткие методические указания к работе на практическом занятии:

В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию.

Самостоятельная работа состоит из проведения реакции нейтрализации для определения титра антитоксической сыворотки по Рамону. Для этого в пробирках (in vitro) используют токсин и сыворотку, которая содержит антитела к этому токсину. При их смешивании образуется легкое помутнение, потом появляется мелкая взвесь, которая в конце оседает на дно пробирки. Осадок называется  флокулянт, поэтому реакция называется реакция флокуляции. Помутнение, прежде всего, появляется в того пробирке, где количество токсина эквивалентно количеству антител. Эта особенность была использована в производстве антитоксических сывороток для определения количества антитоксических (международных) единиц в 1 мл изготовленной сыворотки.

За 1 МЕ принимают то наименьшее количество сыворотки, которая может нейтрализовать 100 смертельных доз токсина (100 Dlm).

 Методика постановки реакции:

  1.  в стерильные сухие пробирки наливают по 2 мл токсина;
  2.  в первую пробирку вносят 0,1 мл сыворотки, в другую - 0,2 мл, в третью - 0,3 мл и так дальше;
  3.  пробирки ставят в термостат на 1 час при температуре 37°С.
  4.  проводят оценивание реакции по помутнению. В той пробирке, где помутнения появится раньше за все и находится 1 МЕ.

В конце лабораторной работы студенты проводят анализ результатов реакции и вносят их в протокол.


Технологическая карта проведения практического занятия

№ п\п

Этапы

Время в мин.

Способы обучения

Оборудования

Место проведения

1.

Проверка и кор-рекция выходно-го уровня подго-товки к занятию

20

Тесты исходного уровня

Таблицы

Учебная комната

2.

Самостоятель-ная работа

35’

Графы

логической структуры

Пробирки с опытом реакции нейтрализа-ции, коллекция ле-чебных, профилакти-ческих и диагности-ческих сывороток.

3.

Самоконтроль и коррекция усвоенного материала

15’

Целевые учебные задачи

4.

Тестовый контроль

15’

Тесты

5.

Анализ резуль-татов работы

5

Алгоритм лабораторной работы:

  1.  Определение понятия “иммунные сыворотки”.
  2.  Классификация иммунных сывороток.
  3.  Ознакомление с примерами применения сывороток для профилактики, лечение и диагностики.
  4.  Методы получения иммунных сывороток, гаммаглобулинов и моноклональних антител.
  5.  Определение титра антитоксической сыворотки в реакции нейтрализации.
  6.  Оформление протокола.


Целевые учебные задачи:

1. Больному дифтерией ребенку возрастом 10 лет была введенная большая доза противодифтерийной сыворотки. На 10 сутки после введения сыворотки у него повысилась температура до 38,5°С, появилась сыпь на коже, зуд, отечность и боль в суставах. Укажите причину возникновения данных симптомов.

А. Анафилактическая реакция.

В. Аллергический дерматит.

С. Сывороточная болезнь.

D. Действие эндотоксина возбудителя.

Е. Крапивница

2. При практическом использовании лечебных антитоксических сывороток больному всегда вводят точно определенные дозы. В каких единицах определяется активность антитоксической противодифтерийной сыворотки?

А. Международных.

В. Флокуляционных.

С. Летальных

D. Бактериостатических.

Е. Инфекционных.

3. Мальчик 1,5 лет, не получавший плановые прививки контактировал с больным корью. С целью экстренной специфической профилактики мальчику был введен донорский гамма-глобулин. Какой вид иммунитета было создан при этом?

А. Пассивный.

В. Антитоксический.

С. Естественный.

D. Поствакцинальный.

Е. Местный.

4. Женщина, 54 лет, обратилась к врачу с жалобами на непереносимость куриных яиц, которая появилась недавно. Антигистаминные препараты, назначенные врачом, несколько улучшили состояние больной. Какие антитела оказывают содействие в развитии данной реакции?

A. IgA;

B. IgM;

C. IgD;

D. IgG;

Е. IgЕ.

5. У женщины, 37 лет, на протяжении года периодически возникали инфекционные заболевания бактериального генеза. Болезнь была продолжительна, ремиссии кратковременны. При обследовании выявлено гипогаммаглобулинемия. Нарушение функции каких клеток может быть прямой ее причиной?

A. Нейтрофилов.

B. Эозинофилов.

C. В-Лимфоцитов.

D. Макрофагов.

Э. Базофилов.

6. Больная, 27 лет, закапала в глаза капли, в состав которых входил пенициллин. Через несколько минут появились зуд и жжение кожи, отек губ, кашель со свистом, снизилось артериальное давление. Какие иммуноглобулины принимают участие в развитии данной аллергической реакции?

A. IgA, IgM;

B. IgM, IgG;

C. IgD, IgM;

D. IgG, IgD;

Е. IgЕ, IgG.

7. После введения 100000 МЕ противодифтерийной сыворотки на 10-и день у больного возникла сывороточная болезнь. Иммуноглобулины каких классов обуславливают основные механизмы развития сывороточной болезни?

A. IgA, IgЕ;

B. IgM, IgЕ;

C. IgD, IgA;

D. IgG, IgЕ;

Е. IgM, IgG.

8. Для постановки туберкулиновой пробы ребенку внутрикожно введен туберкулин. Через 24 часа на месте введения были отмечены гиперемия и уплотнение тканей. Какой механизм лежит в основе развития данных изменений?

A. Цитотоксичность реагинового типа;

B. Клеточная цитотоксичность;

C. Иммунокомплексная цитотоксичность;

D. Образование гранулем;

Е. Антительная цитотоксичность.

9. При проведении лабораторной диагностики у больного с подозрением на сальмонеллез врачом-лаборантом была проведена реакция аглютинации с выделенной чистой культурой микробов. С помощью какого компонента реакции был подтвержден диагноз?

A. диагностикум эритроцитарный;

B. убитые культуры сальмонелл;

C. бактериофаг сальмонеллезный;

D. агглютинирующая поливалентная сыворотка;

Е. антитоксин диагностический.

10. Больному дифтерией была введенная антитоксическая сыворотка дробным методом. Как по автору называется этот метод?

A. Шика;

B. Манту;

C. Безредко;

D. Пирке.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

69077. ПРОМІЖНЕ ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ 144.91 KB
  Важливу роль у створенні кросплатформних програмних систем відіграють додаткові загальносистемні програмні засоби, які вирішують завдання взаємодії та інтеграції компонентів. Ці засоби розміщуються між рівнем операційної системи (ОС) і рівнем прикладного програмного забезпечення...
69078. РОЗПОДІЛЕНІ МОДЕЛІ ПРОМІЖНОГО РІВНЯ ДЛЯ WINDOWS 254.25 KB
  Друга рання модель, про яку говорилося в лекції 2, заснована на віддалених викликах процедур (Remote Procedure Calls, RPC). У цій моделі акцент робиться на приховуванні мережевого обміну за рахунок того, що процесу дозволяється викликати процедури, реалізація яких знаходиться на віддаленій машині.
69079. КОМПОНЕНТНА МОДЕЛЬ CORBA 118.86 KB
  CORBA (Common Object Request Broker Architecture) - це набір відкритих специфікацій інтерфейсів, що визначає архітектуру технології міжпроцесної взаємодії і незалежного маніпулювання об'єктами. Розробниками технології інтерфейсів є OMG і X/Open.
69080. Технологія EJB для побудови розподілених систем 66.54 KB
  JavaBeans забезпечують основу для багаторазово використовуваних і модульних компонентів ПЗ. Компоненти JavaBeans можуть приймати різні форми, але найбільш широко вони використовуються в елементах графічного інтерфейсу користувача (на стороні клієнта).
69081. КОМПОНЕНТНА ІДЕОЛОГІЯ 207.5 KB
  Крос-платформними можна назвати більшість сучасних мов програмування високого рівня. Наприклад, C, С++ і Object Pascal — крос-платформні мови на рівні компіляції, тобто для цих мов є компілятори під різні платформи. Java і C# — крос-платформні мови на рівні виконання, тобто їх виконувані файли...
69082. СТРАТЕГІЇ ІНТЕГРАЦІЇ ПРОГРАМНОГО ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ 174.41 KB
  Модульність — принцип організації великих систем у вигляді наборів підсистем, модулів або компонентів. Цей принцип наказує організовувати складну систему у вигляді набору простіших систем — модулів, що взаємодіють один з одним через чітко визначені інтерфейси.
69083. Розробка та збирання компонентів типу Windows Forms 148.18 KB
  Для компілятора – це збірка (Assembly). Рішення може складатися з одного або кількох проектів. Кожний проект може складатися з кількох форм і інших файлів, рисунків, ресурсів, маніфесту (опису збірки). Відкомпільована збірка є готовим до використання компонентом.
69084. Клас BUTTONBASE і його нащадки: Кнопки, прапорці та перемикачі 45.41 KB
  Клас ButtonBase в ієрархії класів .NET забезпечує загальні можливості для групи похідних від нього класів: Button, CheckBox і RadioButton. Деякі властивості класу ButtonBase описані в табл.4.1. Крім спільних властивостей кожний з класів має власні властивості.
69085. Списки. Види списків. Загальні властивості і методи роботи зі списками 100.93 KB
  Списки є похідними класами від абстрактного класу FormatControl. До членів сімейства списків відносяться ListBox (список), ComboBox (випадаючий список), CheckedListBox (список з прапорцями) i ListView (відображає елементи в одному з 5 режимів).