68195

ПАТОГЕНЕЗ ПОРУШЕННЯ РАНОВОГО ПРОЦЕСУ ЗА УМОВ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ

Автореферат

Медицина и ветеринария

Глибокі й різноспрямовані дослідження СДС привели до розробки й впровадження ряду нових методів хірургічного лікування зокрема реваскуляризуючих операцій використання різноманітних ранових покрить та аплікацій на ранову поверхню стовбурових клітин аутофібробластів й різноманітних факторів росту...

Украинкский

2014-09-19

312 KB

0 чел.

МІНІСТЕРСТВО  ОХОРОНИ  ЗДОРОВ’Я  УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ  НАЦІОНАЛЬНИЙ  МЕДИЧНИЙ  УНІВЕРСИТЕТ

ім. М. Горького

БАРІНОВА МАРІЯ ЕДУАРДІВНА

УДК  599.323.4+591.147.7]-028.77:547.854.6+549.412

ПАТОГЕНЕЗ ПОРУШЕННЯ РАНОВОГО ПРОЦЕСУ ЗА УМОВ
ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ

14.03.04 – патологічна фізіологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Донецьк – 2011


Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Донецькому національному медичному університеті
імені М. Горького МОЗ України.

Науковий консультант:

член-кореспондент НАМН України, доктор медичних наук, професор
Єльський Віктор Миколайович
, Донецький національний медичний університет імені М. Горького МОЗ України, завідувач кафедри патологічної фізіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Абрамов Андрій Володимирович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, професор кафедри патологічної  фізіології;

доктор медичних наук, професор Клименко Микола Олексійович, завідувач кафедри патологічної фізіології Харківського національного медичного університету МОЗ України;

доктор медичних наук, професор Костенко Віталій Олександрович, завідувач кафедри патологічної фізіології ВДНЗУ «Українська медична стоматологічна академія» МОЗ України.

Захист відбудеться “18березня 2011 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.02 при Донецькому  національному медичному університеті
імені М. Горького МОЗ України (83003, м. Донецьк, проспект Ілліча, 16).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького національного медичного університету імені М. Горького (83003, м. Донецьк, проспект Ілліча, 16).

Автореферат  розісланий “07лютого 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 11.600.02

доктор медичних наук, професор       М. В. Єрмолаєва


ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) залишається однією із актуальних медико-соціальних проблем, з огляду на його поширеність і розвиток численних ускладнень, що важко піддаються лікуванню (Абрамов А.В. та співавт., 2010; Горєлов С. В. та співавт., 2009; Boulton A. J., 2008; Richard J. L. et al., 2009). Найбільш грізним наслідком ЦД, що приводить до інвалідизації й зниження якості життя пацієнтів, вважається синдром діабетичної стопи (СДС), який виявляють у 7-10% хворих на ЦД (Гришин И. Н., 2000; Демидов В. М. и соавт., 2007; Павлов Ю. И., 2005; Kalish J. et al., 2010). Глибокі й різноспрямовані дослідження СДС привели до розробки й впровадження ряду нових методів хірургічного лікування, зокрема реваскуляризуючих операцій, використання різноманітних ранових покрить та аплікацій на ранову поверхню стовбурових клітин, аутофібробластів й різноманітних факторів росту (Дужий І. Д., 2007; Коваль Б. М., 2007; Нарчаев Ж. А., 2009; Rico T. et al., 2009; Storm-Versloot M. N. et al., 2010). Проте, отримані результати не можна вважати задовільними, оскільки частота ампутацій і післяопераційна летальність у хворих із СДС залишаються високими, відповідно 25-55% й 20-30% (Кокобелян А. Р., 2006; Светухин А. М., 2006; Польовий В.П. та співавт., 2009; Ozdemir, S. 2009), а частота гнійно-некротичних післяопераційних ускладнень досягає 30-37% (Кулешов Е. В., 2001; Чернов В. Н. и соавт., 2009; ElMakki A. M., 2010). І навіть за умов успішного лікування в стаціонарі, у 50-60% хворих із СДС протягом 3-5 років розвиваються рецидиви гнійно-некротичного ураження кінцівок (Дибиров М. Д. и соавт, 2006; Snyder R. J. et al., 2010; Uccioli L. et al., 2010).

Враховуючи гнійно-некротичний характер ураження нижніх кінцівок (ГНУНК) за умов ЦД, особливу увагу привертає питання щодо зниження неспецифічної резистентності організму до інфекції (Fisher T. K., 2010; Pradhan L. et al., 2009; Ston R., 2009). Це визначає інтерес до вивчення функціональної активності лейкоцитів (Клименко Н. А. и соавт., 2008). Вірогідно, розвиток ГНУ кінцівок у хворих на ЦД пов'язаний з порушенням функції нейтрофілів (НФ), однак, конкретних фактів щодо стану НФ у хворих з різним перебігом запалення й у різні фази ранового процесу при СДС немає. Важливими диригентами ранового процесу є моноцити-макрофаги (Dinh T. L., 2005). Одним з показників функціональної активності моноцитів-макрофагів вважається активність iNOS, зміна якої сполучена з перебудовами в системі внутрішньоклітинної сигналізації (Бродяк І. В. та співавт., 2008; Darakhshan B. et al., 2007). Проте досі не вдалося наблизитися до з'ясування причин і механізмів зміни метаболізму L-аргініну в моноцитах-макрофагах, та їх ролі у порушенні загоєння дефектів шкіри за умов ЦД (Kampfer H., 2003; Morris S. M., 2004). Важливим фактором гоєння є формування грануляцій та ангіогенез, а потужними стимуляторами цих процесів вважаються тромбоцити (Барінов Е. Ф. та співавт., 2001; Gottrup F. et al., 2009; Mir K. A. et al., 2009; Lin C. D., 2008). Варто визнати, що дотепер керування тромбоцитарною ланкою запальної та репаративної реакції носить суто емпіричний характер, хоча очевидна необхідність аналізу функціональної відповіді тромбоцитів до системних і паракринних регуляторів, що відіграють свою роль у патогенезі ускладнень ЦД.

Наявна в літературі інформація стосовно морфогенезу ран шкіри у хворих із СДС також ставить більше питань, ніж існує відповідей. Дисфункція яких клітин відіграє провідну роль у детермінації неефективної репарації тканин шкіри? Які критерії порушення процесу загоєння, прогнозування перебігу ранового процесу й розвитку рецидивів дизрегенераторного синдрому за умов ЦД можуть вважатися інформативними? Які причини й механізми порушення ремоделювання шкіри за умов ЦД? Наведені питання тим актуальніші, що розробка і впровадження нових клітинних та тканинних технологій оптимізації ранового процесу (використання аутофібробластів, шкірно-жирових трансплантатів, ранових покрить з біологічно активними речовинами, що модулюють різні фази запалення) у хворих із СДС, на жаль, не гарантує загоєння ранової поверхні (Павлов Ю. И., 2007; Snyder R. J. et al., 2010). Така ситуація стимулює пошук шляхів відновлення компенсаторно-пристосувальних процесів, здатних поліпшити стан реактивності організму та перебіг морфогенетичних процесів у рані при ЦД.

Таким чином, необхідність з'ясування молекулярних і клітинних механізмів порушення регуляції ранового процесу за умов СДС, та розробки інформативних методів оцінки перебігу запально-репаративного процесу визначають актуальність представленої наукової проблеми, що має як теоретичне, так і практичне значення. Наведені факти дозволяють вважати роботу перспективним дослідженням сучасної патофізіології.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом НДР Донецького національного медичного університету МОЗ України «Вивчити роль внутрішньоклітинних сигнальних систем під час реалізації запально-репаративних процесів в органах, що забезпечують гомеостаз організму» (№ 0106U010840, шифр МК 07.01.02). У рамках даної НДР пошукувачем виконані наступні фрагменти: «Характеристика стану сигнальної системи eNOS- Протеїнкиназа G у хворих  на цукровий діабет з різним перебігом ранового процесу в шкірі стопи», «Компенсаторна роль протеїнкінази А в детермінації ранового процесу у хворих із СДС», «Динаміка активності нейтрофілів за умов запально-репаративного процесу», «Морфогенез шкіри за умов синдрому діабетичної стопи у хворих на ЦД 2-го типу». Крім того, дослідження дисертанта увійшли до НДР Донецького національного медичного університету МОЗ України «Міжтканинні та міжклітинні кооперації в реалізації репаративної регенерації органів: залежність від реактивності організму» (№ 0109U008714 шифр МК 01.10) у вигляді фрагменту «Залежність перебігу ранового процесу від метаболізму L-аргініну в моноцитах периферійної крові за умов синдрому діабетичної стопи».

Цілі і задачі дослідження: Встановити механізми порушення загоєння ран у хворих із синдромом діабетичної стопи залежно від реактивності організму та визначити перспективні напрямки цілеспрямованої корекції.

Досягнення даної мети базувалося на рішенні наступних завдань: 

  1.  Визначити лабораторні критерії оцінки реактивності організму за умов гнійно-некротичного ураження кінцівок при ЦД, їх зв'язок з клінічними характеристиками СДС та результатом ранового процесу.
  2.  Встановити параметри функціонально-метаболічного стану та цитокінової продукції нейтрофілів, що асоційовані з незагоєнням ран та прогресуванням гнійно-некротичного ураження кінцівок при СДС.
  3.  З’ясувати молекулярні детермінанти та критерії діагностики дисфункції моноцитів, їх роль у порушенні загоєння ран кінцівок за умов ЦД.
  4.  Проаналізувати рецепторні та внутрішньоклітинні сигнальні механізми дисфункції тромбоцитів за умов гнійно-некротичного ураження кінцівок у хворих із СДС (сенситивність пуринових й аденозинових рецепторів А-типу, адренорецепторів та АТ1 рецепторів до ангіотензину П, а також вплив інгібіторів протеїнкіназ А й С, гуанілатциклази й фосфодіестерази 5-типу), їх динаміку в процесі загоєння ран кінцівок у хворих із СДС.
  5.  Визначити клітинні та тканинні детермінанти реалізації гоєння ран, їх зв'язок з параметрами реактивності у хворих із СДС.
  6.  На основі комплексного аналізу функціонального стану формених елементів крові та морфогенезу ран з’ясувати молекулярні та структурні детермінанти й прогностичні критерії незагоєння ран кінцівок у хворих із СДС.
  7.  Обґрунтувати та апробувати в експерименті перспективні напрямки управління загоєнням ран шкіри при ЦД.

Об’єкт дослідження: рановий процес, цукровий діабет, реактивність організму.

Предмет дослідження: синдром діабетичної стопи, сенситивність α2-адрено- й Р2Y пуринових рецепторів, ангіотензинових рецепторів 1 типу (АТ1) й аденозинових рецепторів 2А-типу (А), стан внутрішньоклітинних сигнальних систем, метаболізм L-аргініну, функціональний стан нейтрофілів, моноцитів, тромбоцитів, морфогенез рани, стрептозотоциновий діабет.

Методи дослідження: для досягнення поставленої в роботі мети і реалізації її завдань використовували біохімічні, морфологічні, імуноцитохімічні, імуноферментні методи, що дозволило з'ясувати структурні й молекулярні детермінанти порушення перебігу ранового процесу у хворих із СДС та обґрунтувати можливості керування перебігом ранового процесу. Вірогідність отриманих результатів підтверджували статистичними методами.

Наукова новизна отриманих результатів. В роботі на підставі вивчення сенситивності рецепторів, стану внутрішньоклітинних сигнальних систем та функції клітин-учасниць запально-репаративної реакції уперше встановлені критерії реактивності організму хворих із СДС, яка визначає реалізацію компенсаторно-пристосувальних процесів загоєння ранової поверхні шкіри нижніх кінцівок. Уперше виявлені закономірності порушень бактерицидної й фагоцитарної активності НФ та зміни їх цитокінової продукції; що обумовлюють прогресування гнійно-деструктивного процесу при СДС. У хворих із СДС визначено зростання базальної активності iNOS моноцитів при підвищенні модулюючих впливів з боку АТ1 рецепторів о ангіотензину ІІ, протеїнкінази С і фосфодіестерази-5, та нівелюванні ефекту протеїнкінази А. За цих умов продемонстрована компенсаторна роль аденозинових А рецепторів, стимуляція яких сприяє оптимізації метаболізму L-аргініну у моноцитах. Доведено, що дисфункція моноцитів, яка проявляється початковим пригніченням активності iNOS та реакції на ЛПС, є фактором ризику порушення загоєння ран кінцівок у хворих із СДС. На основі методів математичного моделювання вперше доведена можливість використання параметрів сенситивності АТ1 рецепторів до ангіотензину ІІ, та оцінки стану внутрішньоклітинних сигнальних систем для прогнозування порушення механізмів загоєння ран кінцівок й ризику прогресування гнійно-некротичного процесу. Аналіз міжтканинних відносин та міжклітинних кооперацій у рані дозволив з’ясувати діагностично значущі морфологічні критерії оцінки регенераторного потенціалу тканин кінцівок при СДС. На основі співставлення цих показників з параметрами функціонального стану формених елементів крові вперше  визначено роль зміни сенситивності АТ1 рецепторів, активності iNOS й впливу ФДЕ-5 у розвитку гнійно-деструктивного процесу, та роль eNOS, А рецепторів й протеїнкінази А в реалізації репаративних процесів. Визначення молекулярних механізмів розвитку дизрегенераторного синдрому дозволило обґрунтувати спрямовану  корекцію загоєння ран шкіри при ЦД. Уперше встановлено позитивний вплив блокатору АТ1 рецепторів на обмеження альтерації та запалення в рані шкіри діабетичних щурів, продемонстровано стимулюючий ефект інгібітору ФДЕ-5 на ангіогенез, формування грануляційної тканини та епітелізацію ранової поверхні. Визначено  стимулюючий ефект агоністу А рецепторів на загоєння ран шкіри за рахунок відновлення фазності ранового процесу, протизапальної дії, оптимізації термінів формування грануляцій та ремоделювання дерми.

Практичне значення отриманих результатів. Розшифровані механізми порушень перебігу ранового процесу за умов СДС можуть стати основою розробки індивідуалізованої системи прогнозування загоєння ран шкіри. Оцінка сенситивності АТ1 і А рецепторів, стану ФДЕ-5 тромбоцитів та активності iNOS моноцитів-макрофагів можуть бути використані для діагностики реактивності організму, можливостей та шляхів відновлення компенсаторно-пристосувальних процесів, що лежать в основі репаративної регенерації тканин кінцівок. Встановлені інформативні морфологічні критерії оцінки виразності ішемії й деструкції, порушення механізмів обмеження запальної інфільтрації та наявного репаративного потенціалу тканин шкіри є підґрунтям діагностики ступеня дизрегенераторного синдрому і можуть використовуватися в клінічній практиці для визначення глибини дизрегенераторного синдрому та об’єктивізації показань для різних типів тканинної та клітинної терапії. Проведені експериментальні дослідження морфогенетичних ефектів блокатору АТ1 рецепторів, агоністу А рецепторів та селективного інгібітору ФДЕ-5 є підґрунтям для клінічної апробації розроблених заходів фармакологічного керування запально-репаративним процесом за умов ЦД.

Дані, що стосуються оцінки сенситивності адренорецепторів й ролі внутрішньоклітинних сигнальних систем в обмеженні запального процесу, на підставі яких можливе прогнозування репарації тканин шкіри, впроваджені в практику ДУ «Інституту невідкладної і відновної хірургії ім В. К. Гусака НАМН України» та Інституту травматології і ортопедії ДонНМУ МОЗ України. Отримано патент на винахід «Спосіб прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри у хронічне запалення» UA № 54087, А61 В 10/00 від 17. 02. 2003 р. (Бюл. № 2), та деклараційний патент «Спосіб прогнозування репарації шкіри» UA № 10610, МКИ А61 В 10/00 від 15. 11. 2005 р. (Бюл. № 11), що дозволяють прогнозувати перебіг ранового процесу залежно від спектра молекулярних модуляторів морфогенезу.

Результати дисертаційної роботи, що відображають патогенетичні ланки порушення метаболізму L-аргініну та роль оксиду азоту в розвитку компенсаторно-пристосувальних та патологічних змін шкіри за умов ЦД, значення моноцитів-макрофагів у порушенні регуляції фазності та обмеження ранового процесу при СДС, які впроваджені в навчальний процес на кафедрах патологічної фізіології Одеського, Кримського, Харківського, Запорізького, Луганського й Буковинського медичних університетів, ВДНЗ «Українська медична стоматологічна академія» та кафедрі гістології й ембріології Національного медичного університету ім. О. О. Богомольця (м. Київ) сприятимуть розширенню уявлень студентів щодо реактивності організму, патогенезу органних ускладнень ЦД та регуляції запально-репаративного процесу в тканинах.

Особистий внесок здобувача. Внесок здобувача в отримані результати дисертаційної роботи є основним і полягає в самостійному обґрунтуванні наукового напрямку та виборі методів дослідження, аналізі архівного матеріалу. Здобувачем самостійно проведені біохімічний, морфологічний та імуноцитохімічний аналіз матеріалу; встановлені чинники, що дозволяють проводити моніторинг ефективності гоєння ран шкіри у хворих за умов ЦД, та запропонована модель прогнозування загоєння ран кінцівок при СДС. Здобувач самостійно створила комп'ютерну базу даних, виконала їх статистичну обробку й впровадження в практику положень дисертаційної роботи. Автор самостійно виконала експериментальну частину роботи, обґрунтувала нові підходи до лікування ран шкіри, що тривало не гояться, за умов ЦД. Дисертантом не були запозичені результати й ідеї співавторів публікацій. Матеріали, положення й висновки кандидатської дисертації здобувача в даній роботі не використовувалися.

Апробація результатів дисертації. Дисертаційну роботу апробовано на спільному засіданні кафедр патологічної фізіології; гістології, цитології й ембріології, кафедри дерматовенерології та ЦНДЛ Донецького національного медичного університету
ім. М. Горького. Основні положення дисертаційної роботи представлені, обговорені й одержали позитивну оцінку на наукових форумах: «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005), V читання ім. В. В. Підвисоцького (Одеса, 2006), «Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка» (Одеса, 2007), V Національний конгрес патофізіологів України «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів» (Запоріжжя, 2008),  VIІ  читання ім. В.В. Підвисоцького (Одеса, 2008), «Сучасні проблеми патологічної анатомії» (Полтава, 2008), «Прикладні аспекти морфології експериментальних досліджень» (Тернопіль, 2008), «Актуальні проблеми сучасної морфології» (Луганськ, 2008), «Актуальні проблеми біомінералогії» (Луганськ, 2008), «Морфогенез органів і тканин під впливом екзогенних факторів» (Сімферополь-Алушта, 2008), «Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології» (Вінниця, 2008), «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008), «Новые технологии в неотложной и восстановительной медицине» (Ялта, 2008),  «Актуальні проблеми сучасної морфології» (Полтава, 2009), «Карповські читання-VIII» (Одеса, 2009), «Рани. Ранова інфекція. З’єднання тканин» (Київ, 2009), «Актуальні питання патології за умов дії надзвичайних факторів на організм» (Тернопіль, 2009), «Морфологічний стан тканин і органів систем  організму в нормі і патології» (Тернопіль, 2009),
«Прикладні аспекти морфології» (Вінниця, 2009), VIII Всеросійська конференція нейроендокринологів «Нейроэндокринология-2010» (СПб, 2010), 6-а Російська конференція «Нейроиммунопатология» (Москва, 2010), «Прикладні аспекти морфології» (Івано-Франківськ, 2010), «Інноваційні технології у експериментальній медицині та біології» (Полтава, 2010), IX читання ім. В. В Підвисоцького (Одеса, 2010), ІV міжнародні Пироговські читання (Вінниця, 2010), V Пленум наукового товариства патофізіологів України «Сучасні аспекти типових патологічних процесів» (Луганськ, 2010) та «Морфогенез органів та тканин під впливом екзогенних факторів» (Сімферополь, 2010).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 49 друкованих праць, у тому числі 35 статей, з них 32 у фахових журналах та 1 – у збірнику з переліку видань ВАК України, 2 статті – у журналах Росії (13 робіт є моноавторськими); 12 робіт опубліковано у матеріалах наукових форумів. За матеріалами дисертації отримано 2 патенти.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, шести розділів власних досліджень і обговорення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури (368 найменувань, з них 156 - кирилицею і 212 - латиницею). Текстова частина роботи викладена на 344 сторінках, дисертація містить 26 таблиць й ілюстрована 116 рисунками, з них 53 фотографії.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. В роботі проведено аналіз клініко-лабораторних показників 212 пацієнтів із СДС, які перебували у центрі діабетичної стопи м. Донецька в період з 2004 по 2010 рр. Групу порівняння склали 20 пацієнтів подібного віку, що не страждали на цукровий діабет, з опіковими ранами кінцівок, які знаходились на лікуванні в опіковому центрі ДУ «ІНВХ ім. В. К. Гусака НАМН України». До контрольної групи увійшли 20 волонтерів подібного віку без клінічно-лабораторних ознак ЦД та гострих захворювань. За клінічною формою в обстежених хворих переважала мішана форма (58,0±3,4%), у 28,3±3,1% хворих діагностовано нейропатичну, а в 13,7±2,4% випадків – ішемічну форма СДС. Всі хворі отримували комплексне лікування відповідно до ступеня важкості, клінічної форми та виразності інтоксикації (Демидов В. М., 2007; Антонюк С.М. и соавт., 2005). Для пошуку патогенетичних механізмів порушення ранового процесу за умов ЦД всіх пацієнтів з СДС було розподілено на дві групи – залежно від результату ранового процесу. До 1-ї групи увійшли 109 пацієнтів з позитивною динамікою лікування – коли мало місце загоєння ран без виконання повторних оперативних втручань та ампутацій. В 2-у групу увійшли 103 пацієнта, в яких не було відзначено позитивної динаміки лікування – тобто мало місце тривале незагоєння ран; патологічний процес носив переважно деструктивний характер, що потребувало проведення повторних оперативних втручань (повторних некректомій та ампутацій нижніх кінцівок). Вік пацієнтів (Ме±m) 1-ї групи складав 68±1,2 років (ДІ 58-72 роки), а тривалість ЦД 10,5±3,7 років (ВІ 8,5-13). У 2-й групі медіана віку пацієнтів становила 65±1,5 років (ВІ 56-70 років), а тривалість ЦД – 12±1,1 років (ВІ 9-18 років). Пацієнти 1-ї та 2-ї груп не відрізнялися (p=0,70) за частотою клінічних форм СДС, що свідчить про репрезентативність та однорідність досліджуваних груп за клінічними параметрами.

З метою визначення тканинних, клітинних та молекулярних механізмів порушення перебігу ранового процесу в хворих оцінювали клінічний аналіз крові, функціональну активність НФ, моноцитів і тромбоцитів, та біоптати крайової зони ран. НФ і моноцити виділяли з периферичної крові шляхом градієнтного центрифугування. Суспензію НФ після відмивання розводили середовищем 199 до концентрації 5106 клітин у 1 мл. Для одержання активованих НФ у пробірку вносили суспензію часток полістерольного латексу з розрахунку 108 часток на 1 мл суспензії НФ. Після інкубації з латексом протягом 1 години при 37С, проводили центрифугування, і в супернатанті визначали вміст інтерлейкіну 1 (ІЛ-1), фактора некрозу пухлин (ФНП) та інтерлейкіну 6 (ІЛ-6) імуноферментним методом (рідер «PR2100 Sanofi diagnostic pasteur», Франція) із застосуванням наборів реактивів «ProCon» (Росія) і «Bio Systems» (Іспанія). Паралельно під час цитохімічного дослідження НФ визначали активність кислої (КФ) та лужної фосфатаз (ЩФ) за модифікованим методом Gomori, використовуючи в якості субстрату -гліцерофосфат натрію. Катіонні білки (КБ) досліджували за методом Нагоєва Б. С. (1983), активність мієлопероксидази (МПО) оцінювали модифікованим методом Sato (Габрилович И. М. и соавт., 1984). Внутрішньоклітинний кисень-залежний метаболізм в НФ оцінювали за показниками НСТ-теста (Маянский Д. Н. и соавт., 1985). Кількісний облік активності ферментів та НСТ-тесту здійснювали за методом Kaplov (Зинкин В. Ю., 2004). Фагоцитарну функцію НФ оцінювали, використовуючи вбиту культуру Staphylococcus aureus (штам № 209) (Белокрылов Г. А. и соавт., 2002). Розраховували активність фагоцитозу, фагоцитарний індекс (ФІ) і число (ФЧ).

Виділені з крові моноцити відмивали забуференим ізотонічним розчином NaCl і ресуспендували у безсироваткому культуральному середовищі RPMI 1640 (ICN). Прилиплі до пластику клітини виділяли після 3-х годинної інкубації з використанням СО2-інкубатора (Крутецкая З. И. и остав., 1997). Клітини з розрахунку 106 на лунку поміщали в 96-лунковий планшет в 200 мкл середовища RPMI-1640 з 5% ембріональною телячою сироваткою (Гембицкий Е. В., 1993). В I серії досліджували провідні шляхи метаболізму L-аргініну за наступною схемою: в 1-й лунці проводили інкубацію моноцитів без додавання ЛПС (базальний рівень); у 2-й лунці клітини стимулювали ЛПС (0,3 мкг/мл; E.coli, "Calbiochem", США). В 3-ю та 4-у лунки вводили стимулятор і селективний інгібітор iNOS: відповідно L-аргінін - 200 мкМ й NG-(1-Immunoethyl)lysine (L-NIL) – 30 мкМ. В 5-у лунку додавали селективний інгібітор Аргінази-1 - L-нормпвалін (5 мМ) (Morris S. M., 2004). Після інкубації протягом 24 годин при 37С у атмосфері з 5% СО2 оцінювали накопичення в культуральному середовищі нітрит-іонів NO2- за зміною оптичної щільності при 540-570 нм на СФ-46 (Бродяк І. В. і співавт., 2008). В ІІ серії при аналізі молекулярних механізмів стимуляції й модуляції iNOS клітини попередньо інкубували з інгібіторами внутрішньоклітинних трансдукторів у наступних стандартних концентраціях: стауроспорин (інгібітор протеїнкінази С) – 500 нМ; Н-89 (інгібітор протеїнкінази А) – 20 мкМ, нордигідроуретикова кислота (НГДУК, інгібітор 5-ліпоксигенази) - 10 мкМ, індометацин (неселективний інгібітор циклооксигеназ) – 10 мкм, сілденафіл (селективний інгібітор фосфодіестерази 5 – ФДЕ-5) - 5 мкМ (Sahara M. et al., 2010), лозартан (блокатор АТ1 рецепторів) - 10 мкМ (Eskild-Jensen A., 2007). Потім у лунки додавали ЛПС, продовжували інкубацію протягом 24 годин, після чого досліджували вміст NO за описаним протоколом.

Тромбоцити використовували в тесті in vitro для оцінки сенситивності рецепторів, а також модулюючих впливів різних ланок внутрішньоклітинних сигнальних систем. Для аналізу сенситивності рецепторів у суспензію тромбоцитів вводили АДФ, адреналін чи ангіотензин ІІ (АнгII) в зростаючих концентраціях. Оцінювали зміну агрегації тромбоцитів у пробах із зростаючими концентраціями агоністів. На основі зміни отриманих даних будували криву доза-відповідь і визначали EC50 - ефективну концентрацію лігандів, що призводила до 50% агрегації тромбоцитів. Для оцінки сенситивності аденозинових рецепторів А типу, оцінювали зміну АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів за умов додавання селективного агоністу А ATL146e (0,2 нМ) та антагоністу Арецепторів – ZM 241385 (10-6 М) (Hask I. G. et al., 2008). Для оцінки функціонального стану різних ланок внутрішньоклітинної сигналізації використовували інгібіторний аналіз із застосуванням L-NAME (інгібітор eNOS) – 50 мкМ; L-аргініну (субстрат eNOS) – 200 мкМ; ОDQ (1H-[1,2,4]оксадіазоло[4,3-а]квіноксалін-1 (інгібітор ГЦ) – 10 мкМ; сідленафілу (селективний інгібітор фосфодіестерази 5) – 50 мкМ; Н89 (інгібітор протеїнкінази А) – 10 мкМ; стауроспорин (інгібітор протеїкінази С) – 50 нМ; форсколіну (стимулятор АЦ) та їх комбінації (Li H. et al., 2002; Meier M., 2000; Wyatt A., 2004). Проби інкубували протягом 8 хв., після чого визначали ступінь зміни агрегації тромбоцитів у кожній пробі на «Аналізаторі агрегації тромбоцитів АР2110» (Solar, Білорусь).

Морфологічне дослідження біоптатів з крайової зони ран шкіри проводили на момент первинної хірургічної обробки та при виконанні повторних оперативних втручань. Матеріал фіксували в нейтральному забуференому формаліні (pН 7,4). Загально морфологічну оцінку країв ран проводили при забарвленні гематоксиліном та еозином,  , толуїдиновим синім за методами Браше, ван Гізон, Харта, Маллорі (Саркисов Д. С., 1996). З метою об'єктивізації дослідження шкіри використовували морфометричний аналіз, який виконували з використанням спеціального програмного забезпечення ImageTool version 3.0. і графічного редактора Adobe Photoshop CS4 Extended v.11.0.1. Аналіз дерми та гіподерми включав оцінку питомих об’ємів (ПО) структурних елементів за допомогою квадратно-вузлової тест-системи (Автандилов Г. Г., 1991). Оцінювали питомий об’єм (ПО) ушкоджених структур, виразність ішемії за ПО судин та інтерстиційної рідини, ступінь та характер запалення - за ПО лейкоцитів та клітинним складом інфільтратів. Репаративні процеси оцінювались за наявністю й питомою площею грануляційної тканини та проявами ремоделювання матриксу. Візуалізацію та оцінку клітин різних ліній за показником питомої щільності (ПЩ) проводили за допомогою імуноцитохімічного дослідження. Після блокування ендогенної пероксидазної активності пероксидазним блоком (DAKO) і неспецифічного зв'язування білків протеїновим блоком (DAKO) наносили первинні антитіла (RTU). Для аналізу проліферації й апоптозу клітин використовували моноклональні антитіла (МАТ) до Ki-67 (Clone DO-7) і р53 (Clone MM1) відповідно. Оцінку процесу диференціювання кератиноцитів проводили на підставі експресії цитокератина 14 (Clone 34βE12). Для дослідження міофібробластів використовували МАТ до α-актина (Clone αsm-1); ендотеліальних клітин – CD31 (Clone 1A10), ферменту тирозинфосфатази – CD45 (Clone X 16/99); макрофагів – CD68 (Clone 514H12). Візуалізацію первинних антитіл проводили за допомогою полімерної системи детекції DAKO EnVision+. В якості субстрату для пероксидази хрону використовували DAB+ (DAKO). Препарати дофарбовували гематоксиліном Майєра.

Експериментальна частина дослідження була проведена на 100 білих безпородних щурах самцях вихідною масою 220±25 г, віком 10-12 міс. Тварини утримувалися у віварії на стандартному раціоні зі стабільним вмістом натрію, жирів та вуглеводів й при вільному доступі до води. В роботі дотримано етичних принципів проведення експериментальних досліджень та правил Європейської Конвенції з захисту хребетних тварин, які використовуються в експериментальних дослідженнях та з іншою метою (Страсбург, 1986), рішень Першого Національного конгресу Біоетики (Київ, 2000). До експериментальних груп увійшли 85 щурів, яким моделювали цукровий діабет 1-го типу шляхом ін'єкції стрептозотоцину (Абрамов А. В. і співавт., 2010). 15 щурів склали контрольну групу. Через 3 міс після моделювання ЦД вивчали особливості перебігу ранового процесу. В умовах ефірного наркозу на спині тварин в міжлопатковій зоні видаляли ділянки шкіри діаметром 20 мм (площею 3,14±0,31 см2). Надалі тварин розподілили на чотири групи. До 1-ї групи (n=25) увійшли щури з діабетом без корекції. Щури 2-ї групи (n=20) отримували блокатор АТ1 рецепторів до ангіотензину ІІ – Лозартан (Лозап, АТ «Зентіва» Словацька республіка). Розчинений препарат додавали у питну воду автопоїлки в дозі 10 мг/кг/день, що не викликала гіпотензивного ефекту (Manucha W. et al., 2005) протягом 3 тижнів з моменту нанесення рани. В 3-й групі (n=20) щурам під шкіру вводили Сілденафіл (9 мг/кг на день) (Pfizer, USA), а в 4-й групі (n=20) тварини отримували селективний агоніст А аденозинових рецепторів ATL 146e (Sigma, USA), який вводили в дозі 2,4 мкг/кг протягом 3 тижнів з моменту нанесення рани. Оцінку перебігу ранового процесу здійснювали візуально, фіксуючи строки очищення рани, появи грануляцій, початок і завершення епітелізації ранового дефекту. Планіметрію рани проводили за 1, 3, 7, 14, 20 і 30 діб. В ці ж терміни забирали біоптати крайової зони ран, які оцінювали морфометрично за наведеним вище протоколом. Аналіз отриманих результатів здійснювався із застосуванням методів біостатистики (Altman D. G. et al., 2003) і математичного (нейромережевого) моделювання (Хайкин С., 2006). При проведенні аналізу використовувалися статистичні пакети MedStat (Лях Ю. Є. и соавт., 2004), CIA (Bryant T., 2000) та Statistica Neural Networks (StatSoft Inc., 1999). Точкова оцінка величин, що підлягали аналізу, проводилася шляхом розрахунку середнього арифметичного ознаки () або її медіани (Me) та відповідної стандартної похибки (m). При аналізі міжгрупових розбіжностей у випадку двох груп застосовували критерій Стьюдента, критерій Вілкоксона, метод кутового перетворення Фішера. У всіх випадках відмінність вважалася статистично значущою при рівні значущості р<0,05. Для виявлення зв'язку між ознаками застосовували методи кореляційного аналізу: розраховували коефіцієнт кореляції Пірсона або показник рангової кореляції Спірмена (Лях Ю. Є. и соавт., 2004). Для встановлення виду зв‘язку результату лікування пацієнтів з показниками структурно-функціонально-метаболічного стану клітин-учасниць запально-репаративного процесу було використано методи побудови математичних моделей (Хайкин С., 2006).

Результати дослідження та їх обговорення. Використання дисперсійного аналізу при ретроспективному дослідженні історій хвороб пацієнтів з СДС, дозволило констатувати, що вік, стать, тип ЦД та його тривалість, а також наявність супутньої патології суттєво не впливають на гоєння ран. Дисперсійний аналіз не визначив достовірного впливу клінічної форми захворювання на результат ранового процесу при СДС (p=0,67), а також на тривалість перебування хворого в стаціонарі (р=0,55). За критерієм Фішера не було відзначено й статистично значущої ролі клінічної форми захворювання у детермінації глибини та площі ураження кінцівок (p=0,59). При аналізі глибини ураження кінцівок 2-й ступінь ураження за Вагнером визначали у 74 хворих (34,9±3,3%); більш частим варіантом був 3-й ступінь, який зареєстровано у 49,5±3,4% пацієнтів. Гангрена пальця чи ділянки стопи (4-й ступінь за Вагнером) мали місце в 40 випадках (18,9±2,7%), 5-й ступінь за Вагнером діагностовано у 7 пацієнтів (3,3±1,2%). При цьому ступінь ураження при ішемічній формі був статистично значуще вищим, ніж при нейропатичній (p=0,001) та мішаній формі (p=0,03). Важливе значення у детермінації результату ранового процесу відігравав показник площі ран. За умов розповсюдженого ранового процесу (площею більш 6 см2) відсоток пацієнтів із загоєнням був нижчим (p=0,047). Проведення співставлень між планіметричним дослідженням та клінічним перебігом захворювання не визначило впливу клінічної форми СДС на механізми обмеження ГНУНК (p=0,84). Проте зростання площі ран супроводжувалося підвищенням частоти незагоєння ранових дефектів та частоти виконання ампутацій майже вдвічі.

Аналіз крові хворих на СДС виявив варіабельність показників, що відбивають реакцію кровотворення на розвиток гнійно-некротичного процесу в організмі. Рівень лейкоцитів у хворих із СДС позитивно корелював з результатом ранового процесу (r=0,599; р<0,01), та негативно - з тривалістю перебування в стаціонарі (r=-0,458; р<0,01). Кількість паличкоядерних нейтрофілів у 1-й групі склала 3,0±0,33% (ВІ=2-4), а в 2-й групі – 6,0±0,43 (ВІ 4-7). У 1-й групі переважали пацієнти з нормальним 53 (48,6±4,8%) або підвищеним рівнем моноцитів 54 хворих (49,6±4,8%); лише в 2 випадках (1,8±1,3%) мала місце моноцитопенія. У 2-й групі відзначено зростання частоти моноцитопенії, яка була зареєстрована в 32 випадках (31,1±4,6%). Кореляційний аналіз щодо взаємозалежності між клінічними ознаками та кількістю формених елементів крові визначив залежність між незагоєнням ран і прогресуванням ГНУНК та кількістю паличкоядерних нейтрофілів (r=0,55; р<0,01) і моноцитів (r=-0,48; р<0,01). Багато в чому зміни реактивності крові були пов’язані з інтоксикацією. Про це  свідчило значне зростання лейкоцитарного індексу інтоксикації, який в контрольній групі складав 0,6±0,05, а у хворих із СДС дорівнював 4±1,5 в 1-й, та 10±2,9 в 2-й групах. Аналогічні зміни було зафіксовано при підрахуванні індексу зсуву лейкоцитів та індексу співвідношення лейкоцитів і ШЗЕ, що відбивають відповідно інтенсивність й тривалість запального процесу та ступінь порушення неспецифічної реактивності організму. За цих умов мало місце пригнічення специфічної ланки імунологічної реактивності – лімфоцитарний індекс у хворих з СДС був більш, ніж в 1,5 рази нижчим за показник в контролі (p<0,01). Значних змін зазнавали індекси співвідношення нейтрофілів до моноцитів та моноцитів до лімфоцитів, що були максимально змінені у пацієнтів 2-ї групи. Зафіксовані зміни лейкоцитарних індексів відбивають порушення механізмів взаємозв’язку між ефекторними клітинами неспецифічної й специфічної ланок імунітету та регуляторною ланкою, представленою моноцитами-макрофагами.

На момент госпіталізації хворих із СДС нейтрофіли периферійної крові характеризувалися змінами цитохімічних характеристик, фагоцитарної активності та кисень-залежного метаболізму. При цьому максимальні міжгрупові відміни були визначені щодо НСТ-реакції, спонтанна інтенсивність якої в 1-й групі була вищою за контроль і сягала 0,56±0,02 (p<0,01), у 2-й – даний показник був нижчим за такий у здорових осіб і дорівнював 0,26±0,01 (p>0,05). Проте, в обох групах зафіксовано обмеження індукованого кисень-залежного метаболізму. За цих умов максимального дефіциту щодо контролю набував показник функціонального резерву нейтрофілів, який в 1-й групі дорівнював 0,12±0,02, а у 2-й групі – 0,08±0,01. Обмеження підйому інтенсивності індукованої НСТ-реакції, що лімітує амплітуду кисень-залежного метаболізму та виразність респіраторного вибуху у НФ хворих із СДС, було асоційоване з певними змінами цитохімічних показників. Спільним проявом було зниження активності кислої фосфатази (КФ) – відповідно на 39,4±2,5% та 48,5±3,7% у 1-й і 2-й групі  порівняно з контролем (p<0,01); катіонних білків (КБ) – на 26,4±2,2% і 37,4±4,3% (p<0,01); та мієлопероксидази (МПО) – відповідно на 30,1% та 102% (р<0,01) в 1-й та 2-й групах. Проте, в обох групах було зафіксовано підвищення активності лужної фосфатази (ЛФ) - в 4 і 2,1 рази відповідно в 1-й та 2-й групах щодо контролю (p<0,001). Наведені дані відбивають зниження ефективності кілінгу мікробів і свідчать про комплексне зниження антимікробного потенціалу НФ.

В 1-й групі визначено значне зростання кількості фагоцитів та фагоцитарного індексу (ФІ) порівняно з контролем. Проте фагоцитарне число (ФЧ) було майже вдвічі нижчим за показник у здорових людей (р<0,001). Ситуація в 2-й групі виявилася дещо іншою. У хворих з тривалим незагоєнням ран нижніх кінцівок на момент госпіталізації було відзначене зниження ФА і ФІ (p<0,05), що значуще відрізнялося від показників в 1-й групі (p<0,01). Ще більш значущим виявилося зниження ФЧ, значення якого було в 2,2 рази меншим за контроль (p<0,001) і значуще відрізнялося від показника в 1-й групі (p<0,05). Такі дані свідчать про обмеження функціональної активності НФ, їх здібності до захоплення мікроорганізмів та фагоцитозу. Встановлено зворотний кореляційний зв’язок між ФЧ і відсотком паличкоядерних форм гранулоцитів в периферійній крові (r=-0,671, p<0,01), що може пояснювати зниження функціональної та метаболічної активності НФ. Суттєві зміни в цитохімії нейтрофілів відбувалися за 10-14 діб комплексного лікування й проявлялися значним підйомом активності КФ (p<0,01), та менш значним приростом КБ. Такі зміни супроводжувалися зниженням активності ЛФ в 2,46 рази порівняно з попереднім терміном, що може відбивати гармонізацію швидкої та повільної фаз внутрішньоклітинного бактеріолізу. Відновлювалася й потужність початкової та термінальної ланок кисень-залежної антимікробної системи НФ - функціональний резерв НСТ-реакції та активність МПО зростали (р<0,01). Фагоцитоз характеризувався зменшенням ФІ (р<0,01), на тлі підвищення ФЧ (р<0,01) у порівнянні з таким на момент госпіталізації. Ці цитохімічні зміни супроводжувалися завершенням фази альтерації в рані та активацією з 10-14 доби репаративних процесів у шкірі. Проте навіть за 20 діб лікування не відбувалося повного відновлення показників КБ і МПО, що може розцінюватися як фактор обмеження неспецифічного протимікробного захисту НФ крові хворих із СДС.

На відміну від цього, у 2-й групі протягом всього періоду спостереження не було зареєстровано значних змін цитохімічних характеристик НФ, кисень-залежних процесів, відбиваючи низьку потужність респіраторного вибуху та мікробіцидної активності НФ. Це супроводжувалося підтриманням альтеративної фази запалення у рані, формуванням нових осередків запалення та некрозу, що потребувало повторного хірургічного втручання.

Порушення функціонального стану НФ у хворих із СДС було асоційоване зі змінами їх регуляторної функції. В 1-й групі це проявлялося зростанням секреції прозапальних цитокінів ІЛ-1 і ФНП (p<0,01). В 2-й групі НФ продукували переважно ФПН, рівень якого майже в 2 рази перевищував контроль та відрізнявся від показника в 1-й групі (p<0,05). Через 3-5 діб після початку лікування продукція нейтрофілами ІЛ-1 і ФНП у хворих 1-ї групи зростала (p<0,01), внаслідок чого рівні ІЛ-1 і ФНП перевищували показники щодо контролю (р<0,001). У пацієнтів 2-ї групи на 3-5 добу лікування зміна цитокінової продукції НФ характеризувалася відсутністю приросту продукції ІЛ-1 і підйомом ФНП. За рахунок цього рівень секреції ФНП майже вдвічі (р<0,001) перевищував такий в НФ контрольної групи. За 10-14 діб після початку лікування вміст ІЛ-1 і ФНП у супернатанті НФ пацієнтів 1-ї групи знижувався (р<0,05), а продукція ІЛ-6 зростала майже в 1,5 рази (р<0,01). Виявлена динаміка, вірогідно, була спрямована на обмеження запалення, зміну клітинних кооперацій в зоні рани та активацію репаративних процесів. У хворих 2-ї групи підтримувалася продукція прозапальних цитокінів та зберігався дефіцит секреції ІЛ-6 (p<0,001) порівняно з контролем. Дискоординація продукції цитокінів нейтрофілами може розглядатися як один з факторів порушення регуляції ранового процесу у хворих на ЦД.

Важливим диригентом аутохронності запально-репаративного процесу є макрофаги, що модулюють характер і виразність запалення, його фазність і результат – загоєння ранової поверхні та ремоделювання тканин. Одним з ключових чинників регуляції функціональної активності і фенотипу моноцитів-макрофагів є метаболізм L-аргініну, який динамічно змінюється за умов ранового процесу. Дослідження метаболізму L-аргініну в динаміці ранового процесу у хворих з опіковими ранами кінцівок дозволили визначити, що моноцити (Мц) периферійної крові є репрезентативною моделлю, що відбиває характер та зміну морфогенетичних процесів в рані. Протягом першої доби після опікової травми (фаза альтерації й судинної реакції) підвищується базальна й ЛПС-стимульована активність iNOS (за рахунок зростання ролі переважно 5-ЛОГ і ФДЕ-5), що досягає максимуму через 3-4 дні. Через 10 діб – у фазу формування грануляцій й епітелізації ранової поверхні – зареєстровано підвищення модулюючих ефектів ЦОГ, ПкС і ПкА. Ці зміни в системі внутрішньоклітинної сигналізації супроводжувалися зниженням базальної активності iNOS моноцитів й обмеженням їхньої реакції на ЛПС, а також підвищенням ролі Аргінази-1 у конкуренції за субстрат з iNOS. Через 18-20 діб – ремоделювання  сполучної тканини в області рани відбувалося на фоні відновлення базальної активності iNOS до контрольного рівня, збереження ролі ЦОГ й ПкС, та максимального підвищення модулюючого впливу ПкА, що було асоційовано з підтримкою функціонування шляху Аргінази-1.

У хворих із СДС було визначено значне варіювання базальної активності iNOS - від 9,4 до 62,5 нмоль NO2-/мл на 106 клітин. Проте у всіх випадках реакція Мц in vitro на ЛПС була зниженою. Значення показників та особливості регуляції продукції нітритів моноцитами при СДС мали виразні міжгрупові розбіжності. У 1-й групі відзначене значне підвищення базальної продукції нітритів (p<0,001) стосовно контролю за рахунок зростання активності iNOS: введення до інкубаційного середовища L-NIL супроводжувалося зниженням продукції нітритів Мц майже втричі. Проте реакція Мц на додавання в інкубаційну суміш L-аргініну та інгібітору Аргінази 1 була меншою, ніж у контролі та групі порівняння (p<0,01). За цих умов визначалася помірна реакція на ЛПС, який підвищував продукцію нітритів лише на 44,4±3,2% (p<0,01), що було значно нижче за показник у групі порівняння (p<0,01). Аналіз стану внутрішньоклітинних сигнальних систем Мц за умов стимуляції бактеріальним ЛПС виявив зміну співвідношення шляхів метаболізму арахідонової кислоти. Ефект інгібітору 5-ЛОГ зріс до 55,3±3,5% (р<0,01) і значно перевищував контрольний показник (p<0,01). У той же час ефект інгібітору ЦОГ був значно нижчим за такий в контролі та в опікових хворих (p<0,01). Даний факт певною мірою пояснює розвиток ГНУНК у хворих із СДС. Інкубація моноцитів з інгібітором ПкС визначила зростання амплітуди ефекту на стауроспорин більш, ніж вдвічі щодо групи порівняння (р<0,001) та майже в три рази порівняно з контролем (р<0,001). На цьому фоні мало місце зниження модулюючого впливу інгібітору ПкА (р<0,01). Дані зміни супроводжувалися порушенням внутрішньоклітинного рівню цГМФ. Про це свідчило значне зростання ефекту інгібітору ФДЕ-5 (p<0,01). Відсутність динаміки ранового процесу протягом першого тижня була обумовлена стійкими порушеннями метаболізму арахідонової кислоти й балансу ПкС і ПкА на фоні гіперсенситивності АТ1 рецепторів. Активація процесу загоєння ран кінцівок за 10-14 діб лікування супроводжувалася обмеженням базальної активності iNOS, що відбувалося на тлі зростання ролі А рецепторів і ПкА та зниження ефектів інгібіторів 5-ЛОГ і ФДЕ-5.

У 2-й групі на момент госпіталізації відзначене значне пригнічення базальної активності iNOS моноцитів (Ме±m=14,2±0,9 нмоль NO2-/мл на 106 клітин). Цей показник був нижчим, ніж в контролі (p<0,001) і значно відрізнявся від такого в пацієнтів 1-ї групи (p<0,001). Використання інгібіторів iNOS і Аргінази-1 підтвердило факт пригнічення метаболізму L-аргініну в Мц. Під впливом ЛПС продукція нітритів зростала лише до 17,4±1,7 нмоль NO2-/мл. Наведені дані можуть свідчити про виразне зниження  функціональної активності моноцитів-макрофагів у хворих 2-ї групи, що може бути вагомим чинником патогенезу порушення загоєння ран нижніх кінцівок та прогресування ГНУНК. Дійсно методами кореляційного та дисперсійного аналізу було підтверджено зв'язок (r=-0,635; р<0,001) і роль (F=3,24, p<0,001) пригнічення базальної і ЛПС-стимульованої активності iNOS в детермінації результату захворювання. У структурі порушення відповіді моноцитів на ЛПС було відзначено зростання негативного впливу ПкС та підтримання значної реакції на інгібітор ФДЕ-5. Демонстративною уявляється відсутність модулюючого впливу ПкА, якщо порівнювати з контролем та 1-ю групою – Н89 майже не змінював продукцію нітритів моноцитами (ефект складав лише 3-5%). Позитивний ефект на метаболізм L-аргініну мав агоніст А рецепторів, що може відбивати компенсаторно-пристосувальну роль даних рецепторів у регуляції функціонально-метаболічного стану моноцитів. Для прогнозування результату ГНУНК за даними аналізу дисфункції моноцитів, був використаний метод побудови математичних моделей прогнозування. З метою визначення факторів, більшою мірою пов'язаних з результатом, було проведено селекцію найбільш значимих ознак за допомогою генетичного алгоритму відбору. У результаті застосування такого алгоритму було визначено 2 ознаки: рівень ЛПС-стимульованої продукції нітритів (іNOSLPS) (X1) і модулюючий ефект/вплив  інгібітору ПкА (X2) на ЛПС-стимульовану продукцію нітритів. Отримана модель описується рівнянням:

Y= -0,032 X1 -0,0029   X2  +1,630;

при критичному значенні Ycrit=0,281. У випадку, коли в результаті розрахунків у рамках побудованої моделі значення – Y<Ycrit прогнозується позитивний результат – загоєння ран стопи, у протилежній ситуації – незагоєння ран і прогресування ГНУНК.

Визначені параметри дисфункції лейкоцитів потребують більш ретельного аналізу інших клітин-учасниць запально-репаративного процесу – тромбоцитів, які не тільки можуть модулювати функціонування нейтрофілів та моноцитів, але й є віддзеркаленням гомеостазу судинної стінки з огляду на паритетні відносини з судинним ендотелієм. У пацієнтів із СДС 1-ї і 2-ї груп на момент госпіталізації визначено зміну агрегаційної відповіді тромбоцитів на різні ліганди. В обох групах відзначено значне зниження ЕС50 АДФ, що складала 2,1±0,4 мкМ. Навіть за умов низьких доз АДФ (0,5 і 1 мкМ) агрегація тромбоцитів хворих із СДС була незворотною, що може відбивати зростання сенситивності P2Y рецепторів. Проте аналіз відповіді тромбоцитів на АДФ в динаміці спостереження хворих із СДС визначив наявність міжгрупових відмін. В 1-й групі зареєстровано суттєвий підйом ЕС50 АДФ (р<0,01) за 10-14 днів перебування у стаціонарі. Надалі цей показник змінювався не суттєво і на момент виписки із стаціонару був дещо нижчим, ніж у контролі (р<0,05). У пацієнтів 2-ї групи протягом усього періоду спостереження ЕС50 АДФ підтримувалася на рівні 2,0±0,3  мкМ, і навіть за 24-30 днів після госпіталізації даний показник був значно нижчим за контроль (р<0,001) та значення в 1-й групі (р<0,01). Аналіз відповіді тромбоцитів на зростаючі концентрації адреналіну визначив значну варіабельність агрегації у пацієнтів 1-ї та 2-ї груп. Однакові концентрації адреналіну (2,5 мкМ) викликали у різних хворих агрегаційну відповідь, що варіювала від 10 до 80%. Проте загальна оцінка ЕС50 визначила в 1-й групі значення Ме=1,5±0,2 мкМ, а в 2-й – Ме=1,2±0,2 мкМ. Проведення дисперсійного аналізу не визначило статистично значущої ролі адренореактивності тромбоцитів у детермінації результату захворювання (F=1,41, p=0,22). Це може відбивати варіабельність індивідуальної реактивності організму за показникам  сенситивності клітин до катехоламінів.

За умов відсутності міжгрупових розбіжностей адренореактивності тромбоцитів на момент госпіталізації, динаміка ЕС50 адреналіну була різною в 1-й і 2-й групах. Так, в 1-й групі ЕС50 адреналіну мало змінювалася протягом перших 3-5 діб, проте за 10-14 діб було відзначено зростання показника щодо початкового рівня (р<0,05) з подальшою стабілізацією, що може свідчити про відносне зниження сенситивності α-адренорецепторів, які опосередкують проагрегантний вплив адреналіну на тромбоцити. У 2-й групі  визначені різноманітні зміни відповіді тромбоцитів на адреналін: у 54 пацієнтів (52,4%) зареєстровано підтримання ЕС50 на початковому рівні; у 37 хворих (35,9%) відбувалося подальше зниження ЕС50 адреналіну; а в 12 випадках (11,7%) мало місце парадоксальне підвищення даного показника до контрольного рівня і вище.

Цікаві факти були отримані за умов аналізу чутливості тромбоцитів до АнгІІ. Якщо в контролі ЕС50 АнгІІ складала 0,95±0,05 мкМ, то в хворих із СДС даний показник становив 0,72±0,03 мкМ та 0,56±0,04 мкМ відповідно у 1-й та 2-й групах. Причому гіперсенситивність АТ1 рецепторів у пацієнтів 2-ї групи була пов’язана із ризиком незагоєння ран кінцівок (F=4,89, p<0,01). Не менш важливим фактором можна вважати аналіз стану компенсаторно-пристосувальних механізмів, одним із індукторів яких є аденозин, що реалізує свої позитивні (цитопротекторні) ефекти переважно через Арецептори. За умов СДС зафіксовано відсутність значущого ефекту антагоністу А рецепторів на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів у пацієнтів 1-ї та 2-ї груп. Проте, агоніст А рецепторів мав значний антиагрегаційний ефект, причому даний показник відрізнявся за характером розподілу ознаки (2=41,98) в пацієнтів 1-ї та 2-ї груп. Амплітуда антиагрегантного ефекту агоністу А рецепторів в 1-й групі склала 16,5±2,3%, а в 2-й – 24,3±3,2%, що статистично значуще перевищувало показник в контролі (p<0,001) та в групі порівняння (p<0,01). У 1-й групі мало місце поступове зростання ефекту антагоністу Арецепторів (ZM 241385) на індуковану АДФ агрегацію тромбоцитів протягом ранового процесу, що може відбивати відновлення сенситивності А рецепторів. Підвищення реакції тромбоцитів на блокаду А рецепторів під час загоєння ран у діабетичних хворих може підтверджувати їх роль у відновленні регуляції запально-репаративного процесу. На відміну від цього ефекти агоністу та блокатору А рецепторів на індуковану АДФ агрегацію тромбоцитів у пацієнтів 2-ї групи виявилися стабільними і мало змінювалися протягом всього періоду спостереження. Враховуючи проагрегантний стан тромбоцитів у хворих із СДС, можна припустити порушення Са2+-сигналізації та механізмів, що лімітують зростання внутрішньоклітинний рівень Са2+. До них, в першу чергу, відноситься система оксиду азоту, що активується за умов стимуляції eNOS, та ланцюг Ац-цАМФ-ПкА.

У хворих із СДС зареєстровано зниження ролі еNOS в регуляції агрегації тромбоцитів. Так, у 1-й групі інкубація тромбоцитів з L-аргініном і L-NAME викликала значно меншу амплітуду змін АДФ-індукованої агрегації, ніж в контролі (р<0,01). В 2-й групі ефект L-NAME був майже в 1,5 рази нижчим за контроль (p<0,01), хоча й перевищував показник у 1-й групі  (p<0,05); додавання L-аргініну не викликало значущої зміни АДФ-індукованої агрегації тромбоцитів. Важливим є факт зменшення відповіді тромбоцитів на дію інгібітору гуанілатциклази, амплітуда ефекту якого складала у 1-й групі 13,4±2,2%, а в 2-й групі – 11,2±2,1%. Ці показники мало відрізнялися один від одного, а також від ефекту L-NAME, проте виявилися значно нижчими, ніж у контролі (р<0,01). За умов обмеження ефектів модуляторів eNOS і ГЦ в хворих із СДС визначено підвищення антиагрегантного ефекту сілденафілу, що може відбивати зростання ролі фосфодіестерази 5 в розвитку проагрегантного стану тромбоцитів. Зрушення Са2+-гомеостазу в тромбоцитах підтверджувалося також підвищенням ефектів інгібітору ПкС та зниженням впливу інгібітору ПкА на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів. Тим не менш, наявність стимулюючого впливу форсколіну відбиває можливості корекції проагрегантного стану шляхом стимуляції даної ланки сигнальної системи. Проведення кореляційного аналізу визначило, що ефект інгібітору eNOS пов’язаний із сенситивністю АТ1 рецепторів до ангіотензину ІІ (r=0,744; р<0,001). В 1-й групі відзначено кореляційний зв'язок між модулюючим ефектом eNOS в тромбоцитах та активністю іNOS моноцитів (r=-0,661; р<0,01). Підвищення дії інгібітору ФДЕ-5 на агрегаційну відповідь тромбоцитів корелювало з розвитком рецидивів ГНУНК (r=0,776; р<0,001) та ЕС50 АнгІІ (r=0,728; р<0,01). Проте, кореляції між станом ФДЕ-5 тромбоцитів та іNOS моноцитів були різноспрямованими в хворих 1-ї (r=0,563; р<0,01) та 2-ї груп (r=-0,771; р<0,001). Вірогідно, даний факт пов'язаний із різним ступенем підвищення внутрішньоклітинного Са2+ та виразністю оксидативного стресу за умов ГНУНК. Тим більше, що схожа закономірність була виявлена при аналізі зв’язків стану ФДЕ-5 тромбоцитів та кисень-залежного метаболізму НФ. Кореляційний зв'язок між ефектом інгібітору ФДЕ-5 та інтенсивністю НСТ-реакції нейтрофілів в 1-й групі складав r=0,457 (р<0,01), проте в 2-й групі зв'язок був негативний (r=-0,552; р<0,01). У пацієнтів 2-ї групи зростання ролі ФДЕ-5 в регуляції функціональної відповіді формених елементів крові, вірогідно, веде до значного підвищення Са2+ й супроводжується оксидативним ураженням клітин із зниженням їхньої активності та життєздатності. Цікавим також є факт зв’язку ролі ФДЕ-5 тромбоцитів із продукцією ФНПα нейтрофілами  (r=0,606; р<0,001).

Для визначення патохімічних факторів, в найбільшому ступені пов’язаних з результатом ранового процесу у хворих із СДС, був проведений відбір найбільш значущих ознак з загального спектру. В результаті застосування генетичного алгоритму відбору було визначено 2 ознаки: ЕС50 АнгІІ (Х1) та модулюючий ефект інгібітора ФДЕ-5 (X2) на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів. На визначеному наборі ознак побудована модель  прогнозування, яка описується рівнянням:

Y= -0,03Х1-0,082Х2-1,652.

У пацієнтів із СДС 1-ї групи Y коливався в межах від 0,102 до 0,515, в 2-й групі значення даного показника зростали вище за 0,515. Причому за умов пролонгування запально-репаративного процесу та порушення формування грануляцій значення Y не досягали 0,86, тоді як у пацієнтів з прогресування гнійно-некротичного ураження кінцівок даний показник знаходився в межах 0,8-1,2. Розроблена математична модель не тільки дозволяє прогнозувати порушення механізмів загоєння ран шкіри у хворих на СД 2-го типу, але й диференційовано відбиває ризик ускладненого перебігу ранового процесу - чим більшим є показник Y, тим вищим є ризик прогресування ГНУНК.

При морфологічному дослідженні біоптатів крайової зони ран шкіри у хворих з СДС визначено, що рановий процес розвивається на тлі передіснуючого хронічного запалення, ендотеліальної дисфункції, ішемії, та підвищеного рекрутування нейтрофілів, що визначає гнійно-деструктивне ураження тканин. Крім ознак гострої зміни структури епідермісу, асоційованої з запаленням та порушенням трофіки, у крайовій зоні ран пацієнтів з СДС мала місце зміна кінетики кератиноцитів, яка визначала специфіку репаративних процесів у тканині. У пацієнтів 1-ї групи аналіз експресії Ki-67 продемонстрував зростання кількості проліферуючих клітин на гребінцях та гальмування поділу в зоні над сосочками дерми. Гетерогенність експресії Ki-67 в епідермісі при СДС супроводжувалася  змінами розподілу р53+ клітин. Якщо в контролі позитивна реакція на цей проапоптоген визначалася переважно в клітинах базального шару, то в за умов СДС експресія р53 розповсюджувалася на остистий та зернистий шари. Зміна швидкості утворення й загибелі клітин в епідермісі пацієнтів 1-ї групи супроводжувалася порушенням їх диференціації – позитивна реакція на кератин 14 охоплювала частину клітин остистого шару, а в деяких випадках поширювалася до зернистого шару. В 2-й групі потоншення та гомогенність товщини епідермісу були зумовлені зміною структури  клітин в усіх шарах. Характерною ознакою було зниження проліферації кератиноцитів базального шару. Питома щільність (ПЩ) Ki-67+ клітин була вдвічі нижчою за таку в контролі (p<0,001) й у пацієнтів 1-ї групи (p<0,01), та була асоційована з порушенням трофіки в клітинах всіх шарів епідермісу. Зменшення кількості клітин та товщини епідермісу в 2-й групі пов'язане не тільки зі зміною проліферації, але й з посиленням апоптозу кератиноцитів: р53+ клітини виявлялися в усіх шарах епідермісу. Підсилення елімінації кератиноцитів супроводжувалося порушенням механізмів кератинізації, про що свідчила відсутність зернистого й рогового шарів в більшості біоптатів шкіри та зменшення експресії цитокератинів. Зміни кінетики кератиноцитів були сполучені зі зниженням в епідермісі кількості внутрішньоепідермальних макрофагів.

Морфологічне дослідження дерми виявило виражені порушення кровоплину: спазм артеріальних судин у поверхневому й глибокому сплетеннях дерми та дилатацію вен, що супроводжувалося явищами набряку й десквамації ендотелію, крайовим стоянням лейкоцитів і розвитком периваскулярної інфільтрації. Сумарна ПЩ ендотеліоцитів в сосочковому шарі дерми країв рани 1-й групі виявилася на 25% нижчою (p<0,01), а в сітчастому шарі - на 43,1% меншою за контроль (p<0,01), що може бути морфологічним проявом ендотеліальної дисфункції. Особливого розвитку вазодилятація та набряк набували у зонах скупчення тучних клітин, кількість яких набагато перевищувала контрольний показник. Порушення мікроциркуляції в дермі були асоційовані з наявністю периваскулярної лімфоцитарної інфільтрації. Розподіл макрофагів (Мф) у крайовій зоні рани відповідно до шарів шкіри мав наступні особливості: сітчастий шар >гіподерма > сосочковий шар > епідерміс. Численні CD68-позитивні клітини виявилися на межі сосочкового і сітчастого шарів, де розташовувалися лімфоцитарні інфільтрати. У сітчастому шарі Мф  візуалізувалися  периваскулярно разом з нейтрофілами, а також вільно в інтерстиції, а за умов розвитку грануляцій – вздовж ділянок проліферації міофібробластів та ангіогенезу. Міофібробласти (α-SMA+ клітини) визначалися в зоні епідермо-дермального з’єднання та в сосочковому шарі дерми навколо судин. Аналіз ПЩ клітин визначив наявність позитивного кореляційного зв’язку між кількістю ендотеліоцитів та клітин, позитивних на α-SMA (r=0,655, p<0,001), та негативний зв'язок між ПЩ α-SMA+ й ПО судин (r=-0,491, p<0,01).

Пошук причинно-наслідкових зв’язків при СДС дозволив визначити, що ПЩ ендотеліоцитів та фібробластів негативно, а ПЩ нейтрофілів - позитивно корелювали з тяжкістю перебігу (r1=-0,42; r2=-0,513; r3=0,562 p<0,01) та вірогідністю рецидивів й прогресуванням ГНУНК (r1=-0,417; r2=-0,589; r3=-0,425; p<0,01). При цьому зниження кількості ендотеліоцитів та фібробластів дерми пов’язане із зростанням чисельності НФ крові (r1=-0,532; r2=-0,651; p<0,01). Певні зв’язки були визначені й in situ - між різними клітинними популяціями в межах крайової зони ран кінцівок діабетичних хворих. Позивний зв'язок відзначено між ПЩ ендотеліоцитів та клітин фібробластичного ряду (r=0,465; p<0,01), а також ПЩ цих клітин та ПО волокон сітчастого шару дерми (r=0,463; p<0,01). Проте між ПЩ клітин-резидентів та ПЩ нейтрофілів визначено помірний негативний зв'язок (r=-0,43; p<0,01).

У дермі крайової зони ран пацієнтів 2-ї групи визначався виразний набряк глибокої дерми, місцями – зони некрозу колагенових волокон. Сумарний ПО судин перевищував показники  в контролі й 1-й групі, проте ПЩ СD31+ клітин виявилася відповідно на 62,5% й 44,4% нижчою (p<0,01), а відношення ПЩЕц/УОсуд досягло максимальної різниці у порівнянні з контролем (80,1%; p<0,001). Величина відношення ПЩЕнд/ПОсуд корелювала з товщиною епідермісу (r=0,623; p<0,05) та мітотичним індексом (r=0,768; p<0,01). Особливістю інфільтратів в пацієнтів 2-ї групи також була схильність до дифузної розповсюдженості – ПО інфільтратів виявився на 33,8% вищим, ніж в 1-й групі (p<0,01). Найбільш виразна нейтрофільна інфільтрація була визначена в глибоких шарах дерми, максимально - навколо судин глибокого сплетення та в гіподермі. Домінування нейтрофілів мало й кількісне відображення, їх відсоток у складі інфільтратів досягав 69-80%. Поруч з НФ у складі інфільтратів визначалися плазмоцити, лімфоцити, макрофаги, дегранулюючі тучні клітини. Не менш цікавою знахідкою було зменшення кількості макрофагів в усіх шарах дерми. Даний факт був зв’язаний з  проявами дизрегенераторного синдрому, оскільки чисельність МФ позитивно корелювала з товщиною епідермісу (r=0,627, p<0,01), проліферацією клітин (мітотичним індексом; r=0,583; p<0,01), ПЩ ендотеліоцитів (r=0,712, p<0,001) і негативно з ПЩ нейтрофілів в дермі (r=-0,677, p<0,001). Причиною феномену ареактивності макрофагів дерми може бути зміна функціонального стану клітин-попередників – моноцитів периферійної крові. Кількість дермальних Мф корелювала з активністю iNOS моноцитів периферійної крові (r=0,816, p<0,001). Наслідком зміни клітинних кооперацій у запальну фазу можна вважати відсутність проявів формування грануляційної тканини як на момент госпіталізації, так і протягом перших двох тижнів лікування. Сумарна ПЩ міофібробластів в крайовій зоні ран шкіри пацієнтів 2-ї групи була більш, ніж вдвічі меншою за показник в 1-й групі (p<0,001). Визначено позитивний кореляційний зв'язок ПЩ міофібробластів й макрофагів (r=0,609; p<0,01), що може відбивати важливість кооперації даних видів клітин у реалізації репарації.

Отже, порушення загоєння ран шкіри за умов СДС обумовлено передіснуючим хронічним запаленням й формуванням дизрегенераторного синдрому, що характеризується: а) зниженням неспецифічної реактивності організму та реакції клітин, що забезпечують репарацію тканин шкіри: б) ангіопатією, максимально вираженою в судинах глибокого дермального сплетення, з проявами ендотеліальної дисфункції; в) порушенням міжтканинних відносин й міжклітинних кооперацій; г) альтерацією структур сітчастого шару дерми і гіподерми. Розвиток гнійно-деструктивного процесу був пов'язаний із змінами імунологічної функції шкіри, яка була асоційована з гіпер- чи ареактивністю макрофагів, що визначало порушення їх регуляторної функції й механізмів обмеження запалення. Наслідком цього було порушення процесів ангіогенезу, утворення міофібробластів грануляційної тканини, проліферації й диференціювання й апоптозу кератиноцитів епідермісу та.

Для визначення найбільш інформативних факторів оцінки морфогенезу ранової поверхні було проведено математичний аналіз даних (генетичний алгоритм відбору) з використанням всіх облічених морфометричних критеріїв. В результаті застосування алгоритму було відібрано три ознаки: ПЩ Фбл (X1), ПЩ Міофібробластів (X2) та ПО інтерстиційної рідини (X3); на визначеному наборі ознак побудована модель прогнозування. Після навчання моделі проведена оптимізація порогу прийняття–вилучення рішень й отримано значення Ycrit= 0,306. Якщо значення Y<Ycrit прогнозується позитивний результат – активація репаративних процесів і загоєння ран,  в протилежному випадку внаслідок дефіциту тканинних елементів та порушень мікроциркуляції прогнозується ризик не загоєння ран. Отримана модель виражається рівнянням:

Y= –0,018×X1 –0,020×X2 – 0,026×X3  + 0,444

Таким чином, проведений морфологічний аналіз крайової зони ран хворих із СДС свідчить про наявність структурних детермінант порушення перебігу ранового процесу за умов ЦД. Визначене порушення аутохронності запалення та фазності перебігу ранового процесу при СДС  потребує розробки методів патогенетично обґрунтованої корекції запально-репаративного процесу. З цією метою проведене експериментальне дослідження можливостей керування гоєнням ран шкіри  за умов моделювання ЦД 1 типу шляхом ін’єкції стрептозотоцину.

Оцінка перебігу ранового процесу у експериментальних щурів за 3 міс ЦД виявила порушення фазного характеру та пролонгування ранового процесу до 33-38 діб. Протягом 3-х діб не визначено зміни площі рани порівняно з початковим значенням, а в деяких тварин відбувалося розширення ранової поверхні. На 7-у добу площа рани у діабетичних щурів дещо зменшилася, проте була майже втричі більшою, порівняно з контролем. Терміни формування грануляцій пролонгувалися до  12,9±1,6 діб, а початок епітелізації зафіксовано – за 13,9±1,7 діб. Гальмування репаративних процесів відбивалося й на площі ран протягом 2-3 тижнів. З 7-ї до 14-ї доби скорочення площі  рани порівняно з початковим показником становило 55,5% (p<0,01). За 3-й тиждень площа рани скоротилася на 77,2% щодо до початкового показника (p<0,01). Проте повного загоєння ран за 1-й місяць – не відбувалося. Проведення морфологічних досліджень дозволило з’ясувати  причинно-наслідкові зв’язки в розвитку феномену тривалого не загоєння ран за умов експериментального ЦД, які багато в чому були спільними з феноменом дизморфогенезу, зафіксованим у хворих із СДС. Пролонгування загоєння ран у діабетичних щурів пов’язано зі змінами гістофізіології шкіри. Розвиток ЦД супроводжується ангіопатією, дегенерацією придатків шкіри й хронічним запаленням в глибоких шарах дерми. Судинна реакція розвивалася на фоні ендотеліальної дисфункції і проявлялася пролонгуванням мікроциркуляторних зрушень, зростанням судинної проникливості, розвитком ішемії та альтерації структур шкіри крайової зони ран. Гостра запальна відповідь на ушкодження  характеризувалася порушенням механізмів обмеження й розширенням зони інфільтрації, що визначило виразність вторинної альтерації, гальмування розвитку грануляцій, пригніченням проліферації й секреторної активності фібробластів. Пролонгування епітелізації рани пов’язано  з десинхронізацією процесів проліферації, міграції й диференціювання кератиноцитів на фоні обмеження трофіки та впливів з боку лейкоцитів.

На фоні блокади АТ1 рецепторів відбувалося більш швидке очищення рани та прискорення появи грануляцій, ніж у групі порівняння (гоєння ран у діабетичних щурів без корекції). Схожий характер розвитку мав процес епітелізації – його початок було зареєстровано через 8-10 діб, проте термін завершення мало відрізнявся від групи порівняння і сягав 28,7±3,2 діб. Тобто найбільш виразним позитивний ефект блокади АТ1 рецепторів  був протягом перших двох тижнів, після чого ефект Лозартану на загоєння ран зменшувався. Блокада АТ1 рецепторів  клітин-учасниць запально-репаративного процесу  сприяє оптимізації перебігу судинної та запальної фаз ранового процесу. Це визначило обмеження альтерації структур крайової зони ран, так ПО ушкоджених елементів шкіри був майже на третину (р<0,01) нижчим за такий в групі порівняння. Даний факт обумовлений зменшенням вазоконстрикції та ішемії країв рани за умов блокади АТ1 рецепторів, а ПЩ ендотеліоцитів виявилася на 20% вищою за таку в групі порівняння (р<0,01). За 3-5 діб у крайовій зоні ран визначено обмеження розповсюдженості запальної інфільтрації та чисельності нейтрофілів. За 7 діб перебудова крайової зони рани полягала в зменшенні ПО альтерованих структур шкіри (майже в 2 рази порівняно з попереднім терміном) на фоні зниження ПЩ лейкоцитів (на 30,3%; р<0,01), та стимуляції проліферації клітин-резидентів сполучної тканини. ПЩ ендотеліоцитів та фібробластів зростала майже в 1,5 рази порівняно з попереднім терміном дослідження (р<0,01). У наступні терміни спостереження зберігався протизапальний ефект Лозартану, що відбивалося на ПО інфільтратів. Після 14-ї доби визначалося зменшення міжгрупових розбіжностей у відношенні ПЩ ендотеліоцитів та фібробластів. Визначене уповільнення темпів синтезу колагенових волокон, вірогідно, пов’язане з виключенням фіброгенного ефекту ангіотензину II, який реалізується саме через АТ1 рецептори. Отже, блокада АТ1 рецепторів може обмежувати накопичення міжклітинної речовини та ремоделювання матриксу в зоні ран. Таким чином, використання блокатору АТ1 рецепторів  дозволило, по-перше, довести роль АнгII й АТ1 рецепторів у порушенні гоєння ран шкіри за умов експериментального ЦД. По друге, хронологічний контроль стану рани продемонстрував позитивний ефект блокади АТ1 рецепторів переважно в ранні терміни ранового процесу. Морфологічне дослідження дозволило деталізувати механізми лікувального  морфогенезу, що полягали в обмеженні мікроциркуляторних порушень, ішемії та деструкції країв рани, гальмуванні гострої запальної реакції та розповсюдженості лейкоцитарної інфільтрації.

Аналіз ефектів інгібітору ФДЕ-5 на перебіг ранового процесу дозволив визначити, по перше, незначний вплив препарату у ранні терміни загоєння за умов ЦД. Значущі морфологічні зміни в рані під впливом лікування були зареєстровані за 7-14 діб. Наприкінці 2-го тижня площа ранової поверхні зменшилася на 41,7% (р<0,01) порівняно з початковим значенням. Подібною була й динаміка епітелізації рани протягом 3-го тижня площа рани до 20-ї доби скоротилася ще на 50%, а повне закриття ранового дефекту зареєстроване за 25,3±2,0 діб, що статистично значуще відрізнялося від цього терміну в групі порівняння (р<0,01). Морфологічне дослідження встановило, що основними мішенями інгібітору ФДЕ-5 є клітини судинної стінки, резидентні клітини сполучної тканини та кератиноцити шкіри; в меншій мірі препарат впливав на виразність запалення. Ефекти селективного інгібітору ФДЕ-5 проявлялися вазодилятацією, стимуляцією ангіогенезу та проліферацією фібробластів. Результатом дії інгібітору ФДЕ-5 було прискорення формування грануляційної тканини і епітелізації рани, проте ремоделювання дерми затримувалося. В період грануляцій у щурів значно зросли ПЩ ендотеліоцитів (на 44,6±2,2%; р<0,01) й фібробластів (на 47,6±3,1%; р<0,01) порівняно з попереднім терміном. Зростання щільності ендотеліоцитів судинного русла дерми супроводжувалося формуванням нетипових судин з хвилястим ходом та великим діаметром. Відзначена значна стимуляція проліферації клітин епідермісу та його похідних, хоча епідерміс був тонким, а стимуляція поділу кератиноцитів не супроводжувалася їх повним диференціюванням. Отже, інгібування ФДЕ-5 та зростання рівня цГМФ забезпечувало значущу стимуляцію проліферації клітин дерми та епідермісу, проте диференціювання клітин було обмеженим. Зокрема, проявом цього була динаміка ПО волокон у сітчастому шарі дерми – до 20-ї доби чисельність волокон не суттєво змінювалася у порівнянні з діабетичними щурами без корекції. Таким чином, інгібітор ФДЕ-5 проявив себе як потужний стимулятор формування грануляцій під час ранового процесу, проте мало впливав на ремоделювання дерми.

Найбільш потужний та універсальний (щодо ранового процесу) морфогенетичний ефект був характерний для агоністу А рецепторів, який забезпечував відновлення фазності процесу загоєння. Візуальне дослідження ран у щурів, що отримували селективний агоніст А рецепторів, визначило раннє очищення поверхні та появу грануляцій за 8,6±1,2 діб після початку ранового процесу. Проте, найсуттєвішим було скорочення термінів повної епітелізації – до 24,3±2,8 діб. Проведення планіметричного дослідження свідчило, що за 3 доби мало місце скорочення площі рани на 9,7% (р<0,05), а за 7 діб – ще на 37,6% (р<0,01). Протягом 2-го тижня залишкова площа рани  зменшилася ще на 55,5% (р<0,01) порівняно з попереднім терміном. Проте максимальна стимуляція скорочення рани під впливом агоністу А рецепторів зафіксована протягом 3-го тижня – до 20-ї доби площа рани зменшилася на 70,8% порівняно з 14-ю добою (р<0,001), що визначило двократну різницю показника від такого у щурів без корекції. Агоніст А рецепторів обмежував мікроциркуляторні порушення й виразність ішемії країв рани, гальмував запальну реакцію та зменшував вторинну альтерацію тканин рани. Відзначено стимуляцію ангіогенезу, проліферації та секреторної активності фібробластів, що проявлялося зростанням ПЩ цих клітин в грануляційній тканині та кількості волокон у дермі у фазу ремоделювання. Агоніст А рецепторів також сприяв прискоренню епітелізації ранової поверхні, вірогідно, завдяки прямій дії на кератиноцити, в яких відзначено активацію проліферації й відновлення диференціювання.

Таким чином, результат ранового процесу шкіри нижніх кінцівок у хворих із СДС  залежить від реактивності організму, яка визначає розвиток компенсаторно-пристосувальних процесів та забезпечує проліферацію, диференціювання й функціонування клітин-учасниць запально-репаративного процесу. Важливою детермінантою не загоєння ран шкіри у хворих з СДС  є стійке порушення функції нейтрофілів, що зумовлено зростанням кількості незрілих форм та їх рекрутуванням до зони ранового дефекту, пригніченням фагоцитарної активності із зменшенням мікробіцидного потенціалу й кисень-залежного метаболізму, та дискоординацією продукції цитокінів (превалює секреція ІЛ-1 й ФНП). Зниження реакції моноцитарно-макрофагальної системи хворих проявлялося порушенням механізмів обмеження запалення, що, на тлі значного рекрутування та дифузної інфільтрації рани нейтрофілами, визначало деструктивний характер запалення та його прогресування. Причому молекулярна регуляція й активність iNOS моноцитів відбивають ступінь дисфункції системи моноцитів-макрофагів та детермінують порушення перебігу ранового процесу. Пригнічення активності iNOS та аргінази 1 у хворих з незагоєнням ран кінцівок пов’язане із зростанням впливів АТ1 рецепторів, протеїнкінази С і фосфодіестерази 5 (ФДЕ-5), нівелюванням модулюючого ефекту протеїнкінази А та порушенням балансу між ЦОГ і 5-ЛОГ, що визначало ареактивність моноцитів крові, зміни регуляції запалення та реакції міофібробластів дерми. Порушення ранового процесу та прогресування гнійно-некротичного ураження  кінцівок при СДС супроводжувалися  змінами індукованої агрегації тромбоцитів та механізмів її реалізації. Детермінантами проагрегантного стану тромбоцитів при ЦД є зростання сенситивності АТ1 рецепторів, порушення адренореактивності та нівелювання впливів А2А рецепторів; за цих умов спостерігається обмеження ефективності функціонування системи циклічних нуклеотидів, зниження модулюючих ефектів протеїнкіназ А й G та зростання впливу ФДЕ-5. Відновлення з 10-14 діб компенсаторно-пристосувальних процесів при загоєнні ран шкіри, супроводжувалося підвищенням фагоцитозу та його ефективності, зростанням функціонального резерву НСТ-реакції та активності мієлопероксидази нейтрофілів, зниженням продукції ІЛ-1 й ФНП та посиленням продукції ІЛ-6. Це визначало відновлення аутохронності запального процесу із завершенням альтерації, обмеженням запалення, зміною клітинних популяцій в рані та стимуляцією репарації шкіри. Активація репаративних процесів в шкірі характеризувалася просторовим перерозподілом та зростанням протизапальної активації макрофагів, що пов’язано з обмеженням активності іNОС, зростанням сенситивності  А2А рецепторів та ефектів протеїнкінази А. Загоєння ран у хворих із СДС супроводжувалося в тромбоцитах обмеженням сенситивності АТ1 рецепторів, відновленням сенситивності А2А рецепторів й функціональної ролі системи аденілатциклаза – цАМФ – ПкА, та оптимізацією балансу між гуанілатциклазою та ФДЕ-5, що визначає відновлення пулу цГМФ, забезпечує антиагрегантний ефект та цитопротекцію, стимуляцію ангіогенезу та проліферацію клітин фібробластичного ряду. Результати, що отримані в експериментальній частині  не тільки підтверджують роль АТ1 рецепторів, ФДЕ-5 та А рецепторів у патогенезі порушення ранового процесу за умов ЦД, але й визначають можливість цілеспрямованої корекції перебігу різних фаз ранового процесу. Зрозуміло, що вибір оптимальної траєкторії корекції повинен базуватися на попередньому аналізі факторів реактивності організму та визначенні провідних молекулярних механізмів порушення міжклітинних кооперацій в рані у кожного окремого хворого.

ВИСНОВКИ

У дисертації здійснено теоретичне узагальнення і досягнуто розв’язання актуальної наукової проблеми – на підставі клініко-лабораторних, біохімічних, імуноферментних, морфологічних та експериментальних методів дослідження встановлені патогенетичні механізми порушення загоєння ран у хворих із синдромом діабетичної стопи (СДС) залежно від реактивності організму і визначені напрямки корекції компенсаторно-пристосувальних процесів, що забезпечують відновлення фазності та клітинних детермінант перебігу ранового процесу за умов ЦД.

  1.  Розвиток гнійно-некротичного процесу у хворих із СДС асоційований з зниженням неспецифічного антимікробного захисту, обумовленого порушенням функціонально-метаболічного стану нейтрофілів; зміною активності та механізмів регуляції iNOS моноцитів; дизрегуляцією функціональної відповіді тромбоцитів внаслідок зміни сенситивності рецепторів й стану внутрішньоклітинних сигнальних систем; та супроводжується патоморфозом шкіри, що проявлявся ангіопатією, зростанням кількості тучних клітин, атрофією епідермальних похідних, дискоординацією кінетики клітин епідермісу, дерми й гіподерми.
  2.  Перебіг та результат ранового процесу за умов ЦД залежить від реактивності організму, яка визначає розвиток компенсаторно-пристосувальних процесів і проявляється зміною: в тромбоцитах сенситивності адрено- і пуринових рецепторів, ангіотензинових рецепторів I типу й аденозинових рецепторів 2А-типу, та стану сигнальних систем (eNOS-протеїнкіназа G й аденілатциклаза-протеїнкіназа А); в моноцитах – метаболізму L-аргініну, механізмів внутрішньоклітинної регуляції iNOS; в нейтрофілах – продукції цитокінів, мікробіцидної й фагоцитарної активності.
  3.  Морфологічними передумовами незагоєння ран кінцівок є зниження кількості клітин-резидентів сполучної тканини (міофібробластів, фібробластів, адипоцитів, ендотеліоцитів), анергія макрофагальної системи шкіри та порушення кінетики кератиноцитів. Репрезентативними показниками, що дозволяють прогнозувати перебіг ранового процесу є виразність набряку тканин, та питома щільність фібробластів й міофібробластів, що відбивають репаративний потенціал шкіри.
  4.  Гнійно-некротичне ураження шкіри при СДС сполучене з вираженою  альтерацією дерми й гіподерми внаслідок дисфункції нейтрофілів, що зумовлена зростанням кількості в крові й рекрутуванням до рани їх незрілих форм, зниженням активності лізосомальних ферментів (кислої фосфатази, катіонних білків), гальмуванням кисень-залежного метаболізму (активності мієлопероксидази, спонтанної та індукованої НСТ-реакції), пригніченням їх фагоцитарної активності та зміною спектру продукованих цитокінів (переважання секреції ІЛ-1 і ФНП).
  5.  Відновлення з 10-14 діб компенсаторно-пристосувальних процесів при загоєнні ран шкіри у пацієнтів із СДС супроводжувалося підвищенням фагоцитарної активності нейтрофілів, пов’язаним з відновленням функціонального резерву НСТ-реакції, активності лізосомальних ферментів, а також зниженням секреції ІЛ-1 й ФНП, та посиленням продукції ІЛ-6, що визначало завершення альтерації, зміну клітинних популяцій в рані та стимуляцію репарації шкіри.
  6.  Динамічним та діагностично значущим показником перебігу запального процесу є стан іNОS моноцитів. Дисфункція моноцитів у хворих із СДС проявлялася різноспрямованими змінами метаболізму L-аргініну та обмеженням реакції іNОS на ЛПС, що відбувалося на фоні підвищення сенситивності АТ1 рецепторів, ролі протеїнкінази С і ФДЕ-5 та порушення балансу між 5-ЛОГ й ЦОГ. Гіперактивність іNОS моноцитів визначає зростання кількості макрофагів і лімфоцитів в дермі й гіподермі. Стимуляція ангіогенезу й проліферації міофібробластів в шкірі сполучені з обмеженням активності іNОS моноцитів (r=0,816, p<0,001) і підвищенням ролі аргінази 1.
  7.  Молекулярними детермінантами не загоєння ран кінцівок у хворих з СДС є зниження спонтанної та ЛПС-індукованої активності іNОS, сполучене  зі зменшенням кількості макрофагів у дермі, порушенням механізмів обмеження гнійного запалення, гальмуванням ангіогенезу та реакції  міофібробластів дерми й гіподерми. Прогностичними критеріями незагоєння ран є пригнічення реакції iNOS на ЛПС та ефекту протеїнкінази А.
  8.  Загоєння ран за умов СДС супроводжувалося змінами індукованої агрегації тромбоцитів внаслідок обмеження сенситивності АТ1 рецепторів, відновлення стану А2А рецепторів та ролі внутрішньоклітинних систем (аденілатциклаза – протеїнкіназа А й eNOS-протеїнкіназа G), що асоційоване зі стимуляцію ангіогенезу, проліферацією клітин фібробластичного ряду та кератиноцитів шкіри.
  9.  Детермінантами дисфункції тромбоцитів у хворих із незагоєнням ран є гіперсенситивність АТ1 рецепторів, порушення адренореактивності та нівелювання ролі А рецепторів на фоні зниження модулюючих ефектів eNOS, гуанілатциклази, аденілатциклази і протеїнкінази А та зростання впливу протеїнкінази С й ФДЕ-5. Розроблена математична модель із врахуванням ЕС50 ангіотензина ІІ та ефекту інгібітору ФДЕ-5 на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів дозволяє прогнозувати незагоєння ран кінцівок і ризик прогресування гнійно-некротичного процесу при СДС.
  10.  У діабетичних щурів блокада АТ1 рецепторів проявлялась обмеженням ішемії та запальної інфільтрації країв рани, однак супроводжувалась антифіброгенним ефектом і гальмуванням епітелізації ран. Інгібітор ФДЕ-5 посилював проліферацію ендотеліоцитів, фібробластів і кератиноцитів, стимулював формування грануляцій та початок епітелізації рани, проте пролонгував ремоделювання дерми. Використання агоністу А рецепторів обмежувало мікроциркуляторні порушення та гостру запальну реакцію в рані, стимулювало формування грануляцій та підвищувало секреторну активність фібробластів.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Баринова М. Э. Состояние регуляторной функции нейтрофилов крови у больных сахарным диабетом при гнойно-некротическом поражении стопы / М. Э. Баринова // Медицина сьогодні і завтра. – 2007. – № 1. – С. 6872.
  2.  Баринова М. Э. Тирозиновое фосфорилирование белков в тромбоцитах больных сахарным диабетом при заживлении ран стопы / М. Э. Баринова // Таврический медико-биологический вестник. – 2007. – Т. 10, № 1.– С. 9-11.
  3.  Баринова М. Э. Внутриклеточный метаболизм и фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов при заживлении ран у больных сахарным диабетом / М. Э. Баринова // Травма. – 2007. – Т. 8, № 2. – С. 160-164.
  4.  Барінова М. Е. Регуляція активності тирозинфосфатаз метаболітами арахідонової кислоти в динаміці запально-репаративного процесу за умов цукрового діабету 2 типу / М. Е. Барінова // Галицький лікарський вісник. – 2007. – № 1. – С. 1719.
  5.  Барінова М. Е. Адренергічна реактивність і перебіг ранового процесу за умов цукрового діабету: діагностична значущість і патогенетична інтерпретація / М. Е. Барінова // Клінічна хірургія. – 2008. – № 2. – С. 4042.
  6.  Баринова М. Э. Роль внутриклеточной сигнальной системы eNOS-Протеинкиназа G в развитии дизрегенераторного синдрома у больных сахарным диабетом / М. Э. Баринова // Архив клинической и экспериментальной медицины. – 2008. – Т. 17, № 1. – С. 6669.
  7.  Барінова М. Е. Кількісна оцінка репарації дерми в динаміці ранового процесу за умов синдрому діабетичної стопи / М. Е. Барінова // Світ медицини та біології. –2008. – № 4. – С. 3539.
  8.  Баринова М. Э. Структурно-функциональное состояние моноцитов-макрофагов кожи при синдроме диабетической стопы / М. Э. Баринова // Вестник неотложной и восстановительной медицины. – 2008. – Т. 9, № 3. – С. 329331.
  9.  Баринова М. Э. іNOS моноцитов крови при заживлении ран у больных с синдромом диабетической стопы / М. Э. Баринова // Актуальні проблеми сучасної медицини. – 2009. – Т. 9, вип. 3. – С. 109113.
  10.  Баринова М. Э. Зональная характеристика сосудистого русла кожи при синдроме диабетической стопы / М. Э. Баринова // Медицина сьогодні і завтра – 2009. – № 1. – С. 3538.
  11.  Баринова М. Э. Исход раневого процесса при сахарном диабете 2 типа – роль тирозинового фосфорилирования в клетках / М. Э. Баринова // Світ медицини і біології. – 2009. – № 3. – С. 2630.
  12.  Барінова М. Е. Стан систем внутрішньоклітинної сигналізації за умов ендотеліальної дисфункції / М. Е. Барінова, О. М. Сулаєва // Фізіологічний журнал. – 2007. – Т. 53, № 6. – С. 67–73 (дисертант проаналізувала стан різних ланок внутрішньоклітинної сигнальної системи).
  13.  Барінова М. Е. Взаємозв’язок між тирозиновим фосфорилюванням і продукцією цитокінів нейтрофілами при різних варіантах перебігу ранового процесу за умов інсулінової резистентності / М. Е. Барінова, О. М. Сулаєва // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. – 2007. – Т. 6, № 3. – С. 2326 (дисертант виконала біохімічні дослідження, провела аналіз та статистичну обробку результатів).
  14.  Баринова М. Э. Цитохимическая характеристика и фагоцитарная активность нейтрофилов у больных сахарным диабетом при длительно незаживающей ране стопы / М. Э. Баринова, Н. В. Свиридов, О. Н. Сулаева // Вестник неотложной и восстановительной медицины. – 2007. – Т. 8, № 1. – С. 98–101 (дисертант виконала цитохімічне дослідження активності ферментів нейтрофілів).
  15.  Барінова М. Е. Цитохімія нейтрофілів у прогнозуванні перебігу ранового процесу / М. Е. Барінова, М. В. Свиридов, О. М. Сулаєва // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. – 2007. – № 2. – С. 20–22 (дисертант виконала цитохімічне дослідження активності ферментів нейтрофілів та статистичний аналіз результатів).
  16.  Баринова М. Э. Функциональная активность нейтрофилов крови больных сахарным диабетом при гнойно-некротическом поражении стопы / М. Э. Баринова, О. Н. Сулаева, Б. П. Терещук // Актуальні проблеми сучасної медицини. – 2007. – Т. 7, вип. 1-2. – С. 17–20 (дисертант виконала цитохімічне дослідження ферментів нейтрофілів).
  17.  Моноцит-модулирующие эффекты нейтрофилов крови больных сахарным диабетом при длительно незаживающей ране стопы / М. Э. Баринова, Н. В. Свиридов, О. Н. Сулаева, Б. П. Терещук // Український морфологічний альманах. – 2007. – Т. 5, № 1. – С. 7–9 (дисертант сформулювала мету дослідження, провела культуральне дослідження лейкоцитів).
  18.  Влияние ингибитора ПкС на состояние внутриклеточного сигнального пути eNOS-Протеинкиназа G тромбоцитов крыс при сахарном диабете / М. Э. Баринова, Х. В. Григорян, О. Н. Сулаева, Л. И. Хламанова // Актуальні проблеми сучасної медицини. – 2008. – Т. 8, вип. 3. – С. 197–200 (дисертант проаналізувала стан різних ланок внутрішньоклітинної сигнальної системи; проаналізувала отримані результати).
  19.  Структурные проявления дизрегенерации при синдроме диабетической стопы / М. Э. Баринова, О. И. Николенко, О. Н. Сулаева, Н. В. Свиридов // Український морфологічний альманах. – 2008. – Т. 6, № 1. – С. 52–53 (дисертант провела аналіз отриманих результатів та визначила критерії дизрегенерації ран шкіри).
  20.  Модулирующие эффекты протеинкиназ А и С на активность различных звеньев сигнального пути eNOS-Протеинкиназа G при сахарном диабете / Э. Ф. Баринов, Х. В. Григорян, Н. Н. Канана, М. Э. Баринова // Проблеми ендокринної патології. – 2008. – № 3. – С. 43–48 (дисертант виконала та проаналізувала біохімічні дослідження).
  21.  Барінова М. Е. Активність iNOS моноцитів периферійної крові в динаміці експериментального цукрового діабету у щурів з різною сенситивністю АТ1 рецепторів / М. Е. Барінова, Н. М. Канана, О. М. Сулаєва // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. – 2008. – Т. 9, № 2. – С. 27–29 (дисертант сформулювала мету, задачі дослідження та висновки).
  22.  Ингибирование протеинкиназы С как метод коррекции ренальных дисфункций при диабетической нефропатии / Э. Ф. Баринов, О. Н. Сулаева, М. Э. Баринова и др. // Медицина сьогодні і завтра. – 2008. – № 3. – С. 27–31 (дисертант проаналізувала стан різних ланок внутрішньоклітинної сигнальної системи тромбоцитів).
  23.  Барінов Е. Ф. Взаємозв’язок між активністю iNOS моноцитів та еNOS тромбоцитів в динаміці експериментального цукрового діабету / Е. Ф. Барінов, Н. М. Канана, М. Е. Барінова // Архів клінічної і експериментальної медицини. – 2008. – Т. 17, № 2. – С. 127–129 (дисертант виконала біохімічні дослідження та провела аналіз стану сигнальних систем).
  24.  Баринова М. Э. Роль нейтрофилов в детерминации морфогенеза кожи при заживлении ран у больных с синдромом диабетической стопы / М. Э. Баринова, О. И. Николенко, О. Н. Сулаева // Таврический медико-биологический. вестник. – 2008. – Т. 11, № 3. – С. 20–23 (дисертант провела цитохімічні й морфологічні дослідження біоптатів шкіри, проаналізувала отримані результати).
  25.  Баринова М. Э. Гетерогенность реакции макрофагов при заживлении ран нижних конечностей у больных сахарным диабетом / М. Э. Баринова, О. Н. Сулаева // Морфологія. – 2009. – Т. ІІІ, № 1. – С. 22–27 (дисертант виконала морфологічне дослідження ран шкіри).
  26.  Єльський В. М. Залежність перебігу ранового процесу від метаболізму L-аргініну за умов СДС / В. М. Єльський, М. Е. Барінова, О. М. Сулаєва // Клінічна хірургія. – 2009. – № 11-12. – С. 8–9 (дисертант виконала експерименти, провела морфологічні дослідження, статистичну обробку та аналіз отриманих даних).
  27.  Єльський В. М. Кінетика кератиноцитів епідермісу шкіри хворих на синдром діабетичної стопи / В. М. Єльський, М. Е. Барінова // Патологія. – 2009. – Т. 6, № 3. – С. 56–58 (дисертант провела морфологічні дослідження та аналіз отриманих даних).
  28.  Міофібробласти шкіри та слизової оболонки – від біології клітини до молекулярної регуляції репарації тканин / В. М. Єльський, Е. Ф. Барінов, О. М. Сулаєва,
    М. Е. Барінова // Журнал АМН України. – 2009. – Т. 15, № 4. – С. 653–669 (
    дисертант підготувала розділ стосовно ефектів і функціонального значення міофібробластів).
  29.  Динаміка ранового процесу за умов експериментального цукрового діабету / В. М. Єльський, М. Е. Барінова, О. Г. Ніколенко, О. М. Сулаєва // Галицький лікарський вісник. – 2010. – Т. 17, № 2, част. 2. – С. 54–56 (дисертант виконала експерименти, проаналізувала результати морфологічного дослідження, провела статистичну обробку даних).
  30.  Критерії оцінки перебігу ранового процесу в шкірі інтактних щурів: від морфології рани до інтеграції механізмів загоєння / Е. Ф. Барінов, О. М. Сулаєва, М. Е. Барінова, І. П. Кліщенко // Актуальні проблеми сучасної медицини. – 2010. – Т. 10, вип. 1. – С. 4–6 (дисертант виконала експерименти, створила концепцію загоєння ран при ЦД).
  31.  Єльський В. М. Вплив блокади ангіотензинових рецепторів I типу на загоєння ран шкіри за умов експериментального цукрового діабету / В. М. Єльський, М. Е. Барінова, О. Г. Ніколенко // Вісник морфології. – 2010. – Т. 16, № 2. – С. 257–260 (дисертант виконала експерименти, проаналізувала морфогенетичні ефекти блокатора ангіотензинових рецепторів І типу щодо ранового процесу).
  32.  Барінов Е. Ф. Молекулярні механізми порушення регуляції iNOS моноцитів у хворих при синдромі діабетичної стопи / Е. Ф. Барінов, О. М. Сулаєва, М. Е. Барінова // Клінічна хірургія. – 2010. – № 4. – С. 40–44 (дисертант провела біохімічне дослідження та аналіз отриманих результатів).
  33.  Барінова М. Е. Стимуляція загоєння ран шкіри у діабетичних щурів за допомогою агоністу А рецепторів до аденозину / М. Е. Барінова, В. М. Єльський, Е. Ф. Барінов // Загальна патологія та патологічна фізіологія. – 2010. – Т. 5, № 3. – С. 36–41 (дисертант виконала експерименти, провела планіметрію ран та морфологічне дослідження шкіри).
  34.  Барінова М. Е. Роль АТ1 рецепторів до ангіотензину в порушенні репарації дерми у хворих на синдром діабетичної стопи / М. Е. Барінова // Проблемы достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения. – 2010. – Т. 146, часть II. – С. 43–46.
  35.  Пат. 54087 Україна, МКИ А 61 В 10/00 Спосіб прогнозування переходу гострого запалення внутрішніх органів і шкіри у хронічне запалення / Барінов Е. Ф.; заявник і патентовласник Донецький державний медичний університет. – № 2002053799; заявл. 08. 05.2002; опубл. 17.02.2003, Бюл. № 2 (дисертант виконала інгібіторний аналіз та статистичну обробку результатів).
  36.  Пат. 10610 Україна, МКИ А 61 В 10/00 Спосіб прогнозування репарації шкіри / Барінова М. Е.; заявник і патентовласник Донецький державний медичний університет. – № 200504994; заявл. 26. 05. 2005; опубл. 15.11.2005, Бюл. № 11. (дисертант провела інгібіторний аналіз та статистичну обробку результатів).
  37.  Баринова М. Э. Модулирующие эффекты протеинкиназы А на внутриклеточные сигнальные системы в динамике заживления ран кожи у больных сахарном диабетом / М. Э. Баринова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2008. – № 3. – С. 8–12.
  38.  Баринов Э. Ф. Изменение метаболизма L-аргинина в моноцитах крови при синдроме диабетической стопы / Э. Ф. Баринов, О. Н. Сулаева, М. Э. Баринова // Клиническая лабораторная диагностика. – 2010. – № 5. – С. 16–19 (дисертант проаналізувала стан різних ланок внутрішньоклітинної сигнальної системи).
  39.  Баринова М. Э. Состояние внутриклеточной сигнальной системы NO-Протеинкиназа G при нарушении заживления ран у больных сахарным диабетом / М. Э. Баринова, О. Н. Сулаева, Н. В. Свиридов // Дизрегуляционная патология: объединенный пленум Российского и Московского научных обществ патофизиологов, 13-14 ноября 2007 г. : тезисы докладов. – Патогенез. – 2007. – Прил. 1. – С. 6.
  40.  Баринова М. Э. Молекулярные механизмы регуляции iNOS моноцитов / М. Э. Баринова, О. Н. Сулаева // Матеріали конференції. – Патологія. – 2008. – Т. 5, № 3. – С. 152–153.
  41.  Баринова М. Э. Взаимосвязь между активностью eNOS тромбоцитов и функциональным состоянием нейтрофилов периферической крови у больных с синдромом диабетической стопы / М. Э. Баринова // Гипоксия: механизмы., адаптация, коррекция: научно-практическая конференция, 9-11 октября 2008 г., Москва : тезисы докладов. – Патогенез. – Т. 6, № 3. – С. 46.
  42.  Баринова М. Э. Низкая активность iNOS моноцитов - фактор нарушения репаративного процесса при синдроме диабетической стопы / М. Э. Баринова, О. Н. Сулаева // Бюлетень VII читань ім. В. В. Підвисоцького : матеріали конференції. – Одеса, 2008. – С. 60–61.
  43.  Барінова М. Е. Патоморфоз епідермісу за умов синдрому діабетичної стопи / М. Е. Барінова, О. Г. Ніколенко // Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень : науково-практична конференція: збірник матеріалів. – Тернопіль, 2008. – С.13–14.
  44.  Баринова М. Э. Апоптоз клеток краевой зоны длительно незаживающих ран у больных сахарным диабетом 2 типа / М. Э. Баринова, О. Н. Сулаева, Т. Л. Скочиляс // Прикладні аспекти морфології : науково-практична конференція: праці. – Вінниця, 2009. – С. 2729.
  45.  Єльський В. М. Активність тирозинфосфатаз в клітинах крайової зони ран шкіри за умов цукрового діабету 2-го типу / В. М. Єльський, М. Е. Барінова // Морфологічний стан тканин і органів й систем організму в нормі та патології: наукова конференція : збірник матеріалів. – Тернопіль, 2009. – С. 57–59.
  46.  Експериментальне обґрунтування нових шляхів фармакологічної корекції гоєння ран шкіри за умов цукрового діабету / М. Е. Барінова, В. М. Єльський, Е. Ф. Барінов, О. М. Сулаєва // IV Міжнародні Пироговські читання: науковий конгрес, 25 червня 2010 р. : матеріали. – Вінниця, 2010. – С. 8–9.
  47.  Барінова М. Е. Рецептори тромбоцитів у хворих на синдром діабетичної стопи (СДС) / М. Е. Барінова, В. М. Єльський, Е. Ф. Барінов // Бюлетень IX читань ім. В. В. Підвисоцького : матеріали конференції. – Одеса, 2010. – С. 108.
  48.  Барінова М. Е. Сенситивність аденозинових рецепторів тромбоцитів крові у хворих на цукровий діабет з гнійно-некротичним ураженням стопи / М. Е. Барінова, В. М. Єльський, Е. Ф. Барінов // Актуальні проблеми морфології: науково-практична конференція : збірник матеріалів. – Тернопіль, 2010. – С. 15–16.
  49.  Баринова М. Е. Нейрогуморальные детерминанты нарушения иммунологической реактивности у больных с синдромом диабетической стопы / М. Е. Барінова, О. М. Сулаєва // Нейроиммунопатология : 6-я Российская конференция, 1-2 июня 2010 г., Москва: тезисы докладов. – Патогенез. – 2010. – № 1. – С. 30–31.

АНОТАЦІЯ

Барінова М. Е. Патогенез порушення ранового процесу за умов цукрового діабету. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Донецький національний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, Донецьк, 2011.

Дисертаційна робота присвячена вирішенню актуальної проблеми патофізіології – встановленню механізмів порушення загоєння ран шкіри у діабетичних хворих і визначенню нових напрямків корекції дізрегенерації тканин. Клініко-лабораторні, біохімічні, імуноферментні та морфологічні дослідження у 212 хворих із синдромом діабетичної стопи (СДС) показали, що загоєння ран залежить від реактивності організму і проявляється зміною сенситивності рецепторів й стану внутрішньоклітинних сигнальних систем клітин-учасниць запалення. Детермінантою незагоєння ран за умов СДС є пригнічення фагоцитарної активності, кисень-залежного метаболізму нейтрофілів, дискоординація їх цитокінової продукції. Дисфункція моноцитів у хворих з незагоєнням ран обумовлена зниженням активності iNOS та відповіді на ЛПС, що визначало порушення механізмів обмеження запалення, прогресуючу альтерацію тканин шкіри, пригнічення ангіогенезу і реакції міофібробластів. Зміна функціонального стану тромбоцитів за умов СДС пов’язана з гіперсенситивністю АТ1 рецепторів, посиленням ефектів протеїнкінази С і фосфодіестерази 5 (ФДЕ-5), нівелюванням модулюючого ефекту протеїнкінази А та ролі аденозинових А рецепторів. В експериментах, виконаних на 100 щурах з моделлю стрептозотоцинового діабету, доведено, що блокада АТ1 рецепторів обмежує альтерацію та інфільтрацію дерми. Основний морфогенетичний ефект інгібітору ФДЕ-5 полягав у стимуляції проліферації ендотелію, фібробластів, кератиноцитів епідермісу. Введення агоністу А рецепторів знижувало ступінь ішемії країв рани і гострої запальної реакції, стимулювало ангіогенез і секреторну активність фібробластів, прискорюючи формування грануляцій та епітелізацію поверхні рани.

Ключові слова: цукровий діабет, загоєння ран, реактивність, системи внутрішньоклітинної сигналізації.

АННОТАЦИЯ

Баринова М. Э. Патогенез нарушения раневого процесса при сахарном диабете. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.04 – патологическая физиология. – Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького МЗ Украины, Донецк, 2011.

Диссертационная работа посвящена решению актуальной проблемы современной патофизиологии – установить механизмы нарушения заживления ран кожи у больных сахарным диабетом (СД) в зависимости от реактивности организма, и определить перспективные направления целенаправленной коррекции дизрегенерации тканей. В работе проведен анализ клинико-лабораторных данных 212 пациентов с синдромом диабетической стопы (СДС). Для оценки реактивности организма и функционального состояния клеток-участниц раневого процесса использованы биохимические, морфологические, иммуногистохимические и иммуноферментные методы исследования, методы биостатистики с использованием нейросетевого анализа и построением моделей прогнозирования исхода раневого процесса. В экспериментах на 100 крысах со стрептозотоциновым диабетом апробированы новые методы коррекции раневого процесса с использованием блокатора АТ1 рецепторов к ангиотензину II, ингибитора фосфодиэстеразы 5 (ФДЭ-5) и селективного агониста А  рецепторов к аденозину.

Развитие раневого процесса при СДС ассоциировано с дисфункцией тромбоцитов, нейтрофилов ((Нф) и моноцитов (Мц) крови. Важной детерминантой незаживления ран кожи при СДС является стойкое нарушение фагоцитарной активности Нф, их кислород-зависимого метаболизма, при дискоординации продукции цитокинов. Дисфункция Мц у пациентов с незаживающими ранами проявлялась угнетением iNOS и роли аргиназы 1, что было связано с нарушением механизмов ограничения воспаления, прогрессирующей альтерацией тканей кожи, подавлением ангиогенеза и реакции миофибробластов (МФБ). Факторами нарушения функционального состояния тромбоцитов при СДС были гиперсенситивность АТ1 рецепторов, снижение роли системы оксида азота и ПкА при повышении эффектов ФДЭ-5. Блокада АТ1 рецепторов у диабетических крыс проявляется ограничением альтерации и воспалительной инфильтрации дермы. Основным эффектом ингибитора ФДЭ-5 была стимуляция пролиферации эндотелия, фибробластов, кератиноцитов эпидермиса. Агонист А рецепторов снижал ишемию и воспалительную инфильтрацию краев раны, стимулировал формирование грануляций и эпителизацию раневой поверхности.

Ключевые слова: сахарный диабет, заживление ран, реактивность, системы внутриклеточной сигнализации.

ANNOTATION

Barinova M. E. Pathogenesis of wound process impairment under conditions of  diabetes mellitus. – Manuscript.

Thesis submitted for the Doctor of Medicine Degree in speciality 14.03.04 - pathological physiology. - Donetsk National Medical University, HM of Ukraine, Donetsk, 2011.

The thesis is devoted to establishment of pathogenesis of non-healed wounds in diabetic patients depending on reactivity and introduction of new ways of dysregeneration correction. Clinical, laboratory, biochemical, and morphological methods were used in 212 patients with diabetic foot syndrome (DFS). Deep neutrophil dysfunction, with inhibition of phagocytotic activity, microbicidic potential, oxygen-dependent metabolism and cytokine production dyscoordination, was one of the determinants of DFS. Impaired wound healing was associated with dysfunction of monocytic-macrophage system, determined by reducion of iNOS activity and response to LPS, which resulted in violation of inflammation limitation, progressive cutaneous tissue alteration, inhibition of angiogenesis and response of myofibroblasts. Alteration of platelets functions was caused by the hypersensitivity of AT1 receptors, enhancement of protein kinase C and phosphodiesterase 5 (PDE-5) effects and decline of modulating role of protein kinase A and A2A receptors to adenosin. In experiments on 100 rats with streptozotocine diabetes it was shown that blockade of AT1 receptors improves the early circulatory and inflammatory events in wound, restricts alteration and infiltration of dermis. PDE-5 inhibitor accelerated development of granulations and epithelial restitution. Administration of A2A receptors agonist reduced the degree of ischemia and inflammation in wound edges, stimulated angiogenesis and secretory activity of fibroblasts, accelerating wound healing.

Key words: diabetes mellitus, wound healing, reactivity, intracellular signaling systems.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

АДФ

АнгII

АТ1

АЦ

ГЦ

ГНУНК

ІЛ-1

ІЛ-6

5-ЛОГ

МФБл

Мф

Мц

НФ

ПкА

ПкС

ПО

ПЩ

СДС

ФДЕ

ФНП

цАМФ

цГМФ

ЦД

ЦОГ

  •  аденозиндифосфат
  •  ангіотензин II
  •  рецептори до ангіотензину 1-го типа
  •  аденілатциклаза
  •  гуанілатциклаза
  •  гнійно-некротичне ураження нижніх кінцівок
  •  інтерлейкін 1
  •  інтерлейкін 6
  •  5-ліпоксігеназа
  •  міофібробласти
  •  макрофаги
  •  моноцити
  •  нейтрофіли
  •  протеїнкіназа А
  •  протеїнкіназа С
  •  питомий об’єм
  •  питома щільність
  •  синдром діабетичної стопи
  •  фосфодіестерази
  •  фактор некрозу пухлин
  •  циклічний аденозинмонофосфат
  •  циклічний гуанозинмонофосфат
  •  цукровий діабет
  •  циклооксигеназа

СD

EC50

eNOS

iNOS

L-NAMЕ

NO

-SMA

  •  кластер диференціювання
  •  концентрація ліганду, яка викликає 50% агрегацію тромбоцитів
  •  ендотеліальна ізоформа синтази оксиду азоту
  •  індуцибельна ізоформа синтази оксиду азоту
  •  NG-нітро-L-аргінін-метил-ефір
  •  оксид азоту
  •  -актин гладких міоцитів


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

24217. Важнейшие факторы экономического роста предприятия 44 KB
  Сущность и основные факторы экономического роста предприятия; 2. Показатели эффективности деятельности предприятия и методика их расчета; 3. Экономический рост тенденция изменения совокупных показателей развития предприятия за определенный промежуток времени обычно за год.
24218. Трудовые ресурсы и производительность труда. Организация, нормирование и оплата труда 66 KB
  Отличие трудовых ресурсов от других видов ресурсов в том, что каждый наемный работник может отказаться от предложенных ему условий и потребовать изменения условий труда, переобучения, уволиться по собственному желанию.
24219. Экономическая сущность основных фондов 72.5 KB
  Кроме основных производственных фондов в состав основных фондов промышленности входят и основные непроизводственные фонды. В практике учета и планирования воспроизводства основных фондов промышленности используются как денежные так и натуральные показатели поскольку основные фонды в производственном процессе выступают не только как носители стоимости но и как совокупность определенных средств труда. Денежная оценка основных фондов необходима для учета их динамики планирования расширенного воспроизводства установления снашиваемости...
24220. Источники формирования собственных оборотных средств предприятия 52 KB
  Деление оборотных средств на оборотные производственные фонды и фонды обращения определяется особенностями их использования и распределения в сферах производства продукции и ее реализации. Оборотные средства обслуживающие процесс обращения продукции представляют собой фонды обращения. Расходы будущих периодов это невещественные элементы оборотных фондов включающие затраты на подготовку и освоение новой продукции которые производятся в данном периоде квартал год но относятся на продукцию будущего периода например затраты на...
24221. Компетенция преподавателя 34 KB
  В общении необходимо проявлять активность которая в свою очередь вызывается следующими способами: 1 интересная тема 2 актуальные для возраста темы 3 личностнозначимые темы 4 интересное задание 5 разнообразное задание 6 система поощрений и наказаний. специфика среднего этапа: большие трудности с возрастом учащихся личностнозначимые темы играют гораздо большую роль преподаватель должен быть очень осторожен в подборе тем большое колво речевых упражнений 3.
24223. Речевая деятельность в школе 72.5 KB
  Научить учащихся понимать звучащую речь – одна из важнейших целей обучения. Структура письма как и говорения состоит из 3х частей: 1 побудительномотивационная появляется мотив потребн6ость вступить в общение чтото передать письменно сообщить инфу возникает замысел высказывания; 2 аналитикосинтетическая формируется и реализуется само высказывание: отбор слов распределение предметных признаков в группе предложения смысловая организация связей между предложениями; 3 исполнительная фиксация продукта с помощью графических...
24225. Содержание обучения ин. Яз., его основные компоненты 30 KB
  Цель: ознакомиться с общим содержанием текста газеты библиотечный материал. Цель: изучить содержание текста с целью его дальнейшего применения извлекается до 80 инф. Цель: проанализировать тщательно содержание текста извлекается до 100. В зарубежной методике:1 scheming наше ознакомительное чтение2 scanning поисковое чтение3 reading for detail Аналитическое и Изучающее чтение Критерии отбора текстов: 1 объем текста 2 тематичность 3 тема урока 4 интересная тема 5 возможность обсуждения 6 проблематика проблематика в тексте...