71728

Измерение осмотической устойчивости эритроцитов методом светорассеяния

Лабораторная работа

Физика

Виды эритроцитов в зависимости от формы. Основная функция эритроцитов заключается в транспортировке кислорода и углекислоты. во взвешенном состоянии или в изотоническом растворе соли равновесном для эритроцитов они имеют форму двояковогнутого диска и называются дискоцитами.

Русский

2014-11-11

93.5 KB

10 чел.

98

Лабораторная работа№10

Измерение осмотической устойчивости эритроцитов

методом светорассеяния

Цель работы: экспериментально познакомиться с турбидиметрическим методом светорассеяния для определения осмотической хрупкости эритроцитов

Литература

  1.  1, §§ 13.1 – 13.4, 13.5; § 29.4.
  2.  [2], стр. 124-132, 136-140, 145-147
  3.  [3], §§ 5.1-5.3, 6.1-6.3.
  4.  Ершов Ю.А., Попков В.А. и др. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов. Учебник для медицинских специальностей вузов – М: Высшая шк., 1993 – глава 2, §§ 26, 27.
  5.  Гистология. Учебник для студентов медицинских институтов. Под.    ред. В. Г. Елисеева, Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юриной, М., Медицина, 1983, стр. 143-145.

Вопросы входного контроля

  1.  Что такое эритроцит? Физические характеристики эритроцита. Виды эритроцитов в зависимости от формы.
  2.  Строение эритроцита и его основные функции.
  3.  Опишите строение клеточных биологических мембран.
  4.  Основные функции биологических мембран.
  5.  В чем состоит основное отличие пассивного и активного транспорта веществ через мембрану?
  6.  Виды и способы пассивного транспорта.
  7.  Что называется осмосом?
  8.  Что такое осмотическое давление и от каких величин оно зависит?
  9.  Какие растворы называют изотоническими?
  10.  Что такое физраствор?
  11.  Что происходит с клеткой в гипо- и гипертоническом растворах?
  12.  Какова биологическая роль осмоса в живых организмах?
  13.  Что называется рассеиванием света?
  14.  В чем заключается явление Тиндаля.
  15.  Что называется коэффициентом пропускания?


Краткая теория

Эритроциты являются форменными элементами крови. Основная функция эритроцитов заключается в транспортировке кислорода и углекислоты. Без внешних механических воздействий в плазме крови т.е. во взвешенном состоянии или в изотоническом растворе соли, равновесном для эритроцитов, они имеют форму двояковогнутого диска и называются дискоцитами. Объем дискоцита равен 87 мкм3, площадь поверхности 163 мкм2, диаметр – 7 - 8мкм и толщина от 1мкм  в центре до 2 мкм в краевой зоне. При исследовании в сканирующем электронном микроскопе было выявлено, что не все эритроциты имеют одинаковую форму: дискоциты составляют примерно 76% от общего числа эритроцитов, остальные имеют другую форму, например сферическую (сфероциты) или с зубчатыми краями (эхиноциты). Форма эритроцита зависит от изменения эластичности наружной мембраны, от содержания АТФ в эритроците, от внутреннего осмотического эритроцита, от внутреннего осмотического давления и др. факторов. Значительное изменение формы эритроцитов отмечается при движении их через кровеносные капилляры. Снаружи эритроцит окружает бислойная фосфолипидная  плазматическая мембрана, толщиной 7,5 нм, внутри находится жидкий, почти насыщенный раствор гемоглобина. Мембраны являются важным структурным компонентом всех клеток, они ограждают содержимое клетки от внешней среды и от их свойств в большей степени зависит проникновение веществ в клетку и из нее в окружающую среду.

Пусть полупроницаемая  мембрана разделяет два раствора одинакового состава, но разной концентрации. Если мембрана непроницаема для растворенного вещества, но проницаема для воды, то наблюдается явление осмоса, т.е. диффузии растворителя из области меньшей концентрации растворенного вещества в область большей концентрации этого вещества. 

С точки зрения термодинамики движущей силой осмоса является стремление системы к выравниванию концентраций, поэтому осмос - самопроизвольный процесс. Одной из важнейших характеристик этого процесса является осмотическое давление, т.е. величина, измеряемая минимальным гидравлическим давлением, которое нужно приложить к раствору, чтобы осмос прекратился.

По закону Вант-Гоффа, осмотическое давление в разбавленных растворах численно равно давлению, которое оказывало бы растворенное вещество, если бы оно при данной температуре находилостть в состоянии идеального газа и занимало объем, равный объему раствора:

,

где - осмотическое давление;

- число молей растворенного вещества в объеме V;

С(х) – молярная концентрация;

Т – абсолютная температура раствора;

R – универсальная газовая постоянная.

Из формулы видно, что осмотическое давление раствора, содержащего 1 моль неэлектролита в 22,4 литра раствора при 00С равно одной атмосфере (0,1МПа).

Растворы, имеющие одинаковое осмотическое давление, называются изотоническими.

Если один раствор  по сравнению с другим имеет более высокое осмотическое давление, его называют гипертоническим, а имеющий меньшее давление – гипотоническим.

При помещении клеток в изотонический раствор (рис.1а) клетки сохраняют свой размер и функционируют нормально.

При помещении клеток в гипертонический раствор, вода из клеток в результате осмоса уходит в более концентрированный окружающий раствор, что ведет к уменьшению объема  клетки, т.е. ее сжатию (рис. 1б). Этот процесс называют плазмолизом.

При помещении клеток в гипотонический раствор вода в результате осмоса переходит из менее концентрированного  внешнего раствора внутрь клеток, что приводит к их набуханию (рис. 1в), а затем к разрыву клеточных мембран и вытеканию клеточного содержимого. Такое разрушение называют лизисом. (В случае эритроцитов этот процесс называют гемолизом).

Процессы плазмолиза и лизиса зависят от проницаемости мембран клеток.

Рис. 1.

Поведение клетки при помещении ее в a) изотонический, б) гипертонический и в) гипотонический растворы.

                  - Схематичное изображение молекулы воды;

                  - схематичное изображение молекулы растворенного вещества.

Стрелками показано направление осмоса.

Осмотическое давление крови человека при 370С (310 К) составляет 0,76-0,78 МПа, такое же давление имеет физиологический раствор, т.е. 0,86%-ный (0,9%-ный) водный раствор NaCl (0,15 моль/л), который будет изотоничен с кровью.  

При помещении эритроцитов в воду, содержимое эритроцита является гипертоническим по отношению к окружающей среде, клетка начинает набухать, теряя двояковогнутую форму и стремится к сферической форме. Причем, площадь поверхности клетки в процессе приобретения сферической формы не меняется, а объем возрастает. После достижения клеткой некоторого критического объема в мембране появляются механические напряжения, которые вызывают образование разрывов (пор) в слое фосфолипидов. Через эти поры в мембране и происходит вытекание гемоглобина из клетки в окружающую среду, в результате чего получаются так называемые «тени» эритроцитов. Весь процесс разрушения эритроцита занимает всего несколько секунд.

Концентрация соли, при которой лизирует данный эритроцит, характеризует индивидуальную осмотическую хрупкость данного эритроцита. Иногда в литературе используется другой термин – осмотическая устойчивость.

Для каждой отдельной клетки в суспензии величина индивидуальной осмотической хрупкости варьируется, принимая различные значения. Вариации связаны с разными факторами, наиболее существенным из которых является отношение площади поверхности мембраны к объему клетки S/V. Это отношение изменяется, например, при изменении температуры или с возрастом клетки. Кроме того, данное отношение изменяется при некоторых заболеваниях и при применении ряда фармакологических препаратов.

Поэтому в суспензии определяют обычно среднее значение осмотической хрупкости эритроцитов, равной концентрации соли, при которой лизируют 50% клеток.

В настоящее время метод определения осмотической хрупкости эритроцитов нашел широкое применение в клинике при диагностике таких заболеваний как наследственный сфероцитоз, эхиноцитоз, пойкилоцитоз и др., так как все эти заболевания связаны с изменением формы эритроцитов и прочности клеточных мембран.

Целью данной работы является определение среднего значения осмотической хрупкости (устойчивости) эритроцитов. Для этого используется турбидиметрический метод, заключающийся в регистрации мутности раствора, которая будет меняться в зависимости от состояния эритроцитов.

При прохождении света через суспензию эритроцитов происходит ослабление светового потока за счет его рассеяния. Схема установки показана на рис. 2.

 

Рис. 2.

Луч света от источника света (I), проходит через красный светофильтр (2), через кювету с суспензией эритроцитов (3) и попадает на регистрирующее устройство – фотодетектор (4).

J0 – интенсивность света, падающего на кювету с суспензией эритроцитов;

J – интенсивность света, вышедшего из кюветы с суспензией эритроцитов и попавшего на фотодедектор.

         Суспензия эритроцитов является мутной средой. При прохождении света через такие среды происходит рассеяние света, которое носит название явление Тиндаля. Уменьшение интенсивности света вследствие рассеивания мутной средой описывается показательной функцией:

,

где m – натуральный показатель рассеяния, который зависит от вида рассеивающего вещества, его концентрации и длины световой волны.

Отношение  называется коэффициентом пропускания и обычно выражается в процентах:

В опыте интенсивность J0 падающего света остается величиной постоянной. J – интенсивность света, зарегистрированного фотодедектором после прохождения суспензии, зависит от количества эритроцитов в суспензии. По мере развития гемолиза количество эритроцитов в растворе уменьшается, значит уменьшается и мутность суспензии, а, следовательно, увеличивается интенсивность прошедшего через суспензию света J, и увеличивается коэффициент пропускания Т.

При прохождении света через любое вещество наряду с рассеиванием происходит его поглощение, поэтому на пути светового пучка ставится красный светофильтр, чтобы все ослабление интенсивности было обусловлено только рассеянием света, а поглощение света гемоглобином свести к минимуму.

При приготовлении суспензии эритроцитов необходимо учитывать, что наибольшая точность определения осмотической хрупкости эритроцитов получается при коэффициентах пропускания более 60% , так как при этом условии Т зависит от концентрации эритроцитов линейно.

Практическая часть

Приборы и оборудование:

  1.  Фотоэлектрический колориметр (ФЭК).
  2.  Инструкция по эксплуатации приборов.
  3.  Растворы NaCl разной концентрации.
  4.  Суспенция эритроцитов в изотоническом растворе.
  5.  Пипетки определенных объемов.

Описание и принцип работы фотоэлектрического колориметра ФЭК даны в лаб. работе «Основы спектроскопии и колориметрии» этого пособия.

Задание № 1. Познакомиться с порядком выполнения измерений при помощи ФЭК.

Ход работы.

  1.  Подготовить прибор к работе. Для этого:
  •  установить переключатель прибора в положение «внутренний гальванометр»;
  •  проверить настройку стрелки микроамперметра на нулевое деление шкалы и при необходимости скорректировать;
  •  Включить лампу и дать прогреться в течение 15 минут.
  1.  Настройка на нуль. Выбрать цветной (красный) светофильтр и подключить его перед правым тубусом линзы. Заложить в правую шахту кювету, наполненную дистиллированной водой. Полностью открыть обе ирисовые диафрагмы и переставить потенциометр на диапазон «2-3». Нулевую установку стрелки выполнять уменьшением правой, а по мере необходимости также и левой ирисовой диафрагм.
  2.  Настройка на «100». Кратковременно включить затемняющую заслонку (маленький барашек на правой стороне прибора). Повторить несколько раз настройки на «0» и «100».
  3.  Измерение. Заложить в правую шахту кювету, наполненную исследуемым раствором. Совершить отсчёт отклонения стрелки (см. метод измерения по отклонению стрелки). После каждого измерения промывать кювету дистиллированной водой.

Задание № 2. Исследовать зависимость осмотического гемолиза эритроцитов от концентрации раствора NaCl.

Ход работы.

  1.  Взять вторую кювету с дистиллированной водой.
  2.  С помощью пипетки ввести в воду определенный объем суспензии эритроцитов и перемешать раствор.
  3.  Поставить кювету в правую шахту ФЭК.
  4.  Снять показания прибора по шкале для коэффициента пропускания (Т%) (шкала с равномерными делениями от 0 до 100).
  5.  Результат занести в таблицу № 1. Если показания будет меняться, что имеет место для суспензии эритроцитов от 0,31% NaCl, то надо в таблицу № 1 занести первое показание прибора.

                                                                                      Таблица 1

опыта

Концентрация

раствора NaCl %

Коэффициент

Пропускания Т%

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

  1.  Повторить опыт, помещая суспензию эритроцитов в раствор NaCl с различной концентрацией до 0,9%.
  2.  Через каждые 2-3 опыта проводить проверку настройки прибора по первой контрольной кювете с дистиллированной водой.
  3.  По данным таблицы построить график зависимости коэффициента пропускания (Т %) суспензии эритроцитов от концентрации раствора NaCl как показано на рис. 3.

Задание № 3. Определить по графику значение средней хрупкости эритроцитов и вычислить соответствующее ей осмотическое давление раствора NaCl.

Ход работы.

  1.  Справа на графике (см. рис. 3) провести еще одну вертикальную ось. Это ось отношения (m/n) или вероятность того, что при данной концентрации соли NaCl не лизирует определенное количество эритроцитов, т.е. m – число не лизированных клеток, n – общее число эритроцтов в данном объеме.

    На этой вертикальной оси обозначим точку, соответствующую коэффициенту пропускания первого опыта  (0 % концентрации), а точку, соответствующую коэффициенту пропускания  последнего опыта (0,9 % раствор NaCl).

Рис. 3.

График зависимости коэффициента пропускания (Т %) суспензии эритроцитов от концентрации (С %) раствора NaCl со значением средней хрупкости эритроцитов (С0,5).

  1.  Отрезок между 0 и 1 разделить пополам. Получить положение числа 0,5, т.е. точку 50% гемолиза. Из точки 0.5 провести горизонтальную линию до пересечения с графиком в точке Д и опустить перпендикуляр вниз до пересечения с осью концентрации соли NaCl.
  2.  Записать полученный результат – С0,5 – это будет средняя осмотическая хрупкость эритроцитов.

  Например, на рис. 3. С0,5 = 0,38 (% NaCl).

  1.  Вычислить осмотическое давление раствора NaCl, соответствующего средней осмотической хрупкости эритроцитов.

Вопросы выходного контроля

  1.  Объясните принципиальное устройство фотоэлектрического  колориметра (ФЭК).
  2.  В чем заключается суть турбидиметрического метода исследования мутных сред?
  3.  Что называется коэффициентом пропускания?     
  4.  Что такое осмотическая хрупкость (устойчивость) эритроцита?
  5.  Почему для суспензии эритроцита используется понятие среднего значения  осмотической хрупкости эритроцитов?
  6.  Почему при изменении формы эритроцита изменяется прочность мембран?
  7.  В чем заключается процесс гемолиза эритроцитов? Чем отличается гемолиз от плазмолиза?
  8.  Для чего в опыте световой пучок, падающий на кювету с исследуемым раствором, пропускается через красный фильтр?                                        


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

5879. Основы безопасности жизнедеятельности в сфере государственно-правовых отношений 452.5 KB
  Брак и семья, основные понятия. Условия и порядок заключения брака. История создания Вооруженных Сил РФ, ее связь с историей и становлением Российского государства. Вопрос 1 Семья - это группа людей, связанных браком, кровным...
5880. Теоретические основы земельного управления 135.5 KB
  Шпора к экзамену по предмету Теоретические основы з/у 1. Каково экономическое значение земли в общественном производстве. Место и роль земли в общественном производстве, бесспорно, огромная, но к различных ее отраслях она выполняет неравнозначную ро...
5881. Международные валютные отношения 113 KB
  Международные валютные отношения Эволюция международной валютной системы. Валютный рынок и валютное регулирование. Основные формы конвертируемости валют и условия их формирования Цель темы - раскрыть сущность международной валютной системы в пр...
5882. Особенности управления оборотными средствами 101 KB
  В данной курсовой работе на основании различных литературных источников я раскрыла понятие и экономическая сущность оборотных средств, их значение для деятельности предприятия, особенности управления оборотными средствами, а также пути пов...
5883. Рынок труда и особенности организации занятости населения Российской Федерации 193.5 KB
  Преобладающая общность интересов товара рабочей силы и ее потребителей - экономики и государства – является важнейшей социально-экономической чертой рыночной экономики, создающий прочную гуманистическую основу развития народного...
5884. Миграция рабочей силы 206.5 KB
  Моя курсовая работа касается такой проблемы как миграция рабочей силы. Это явление было известно еще в Х веке. На протяжении всего времени оно претерпевало изменения в связи с тем, что менялся общественный строй, а следовательно и мир...
5885. Государственный долг и дефицит бюджетных средств 294 KB
  На современном этапе проблема бюджетного дефицита в России не является главной проблемой экономики Российской Федерации, но сохраняет свою актуальность, поскольку большинство экономических проблем ведут именно к ней. И то, что сейчас по офи...
5886. Сестринское дело в хирургической медицине 165.5 KB
  Философия сестринского дела Постановление правительства Российской Федерации от, №1387 О мерах по стабилизации и развитию здравоохранения и медицинской науки в Российской Федерации предусмотрено осуществление реформы, направл...
5887. Рынка ссудных капиталов в условиях децентрализованной экономики 258 KB
  Целью данной курсовой работы является раскрытие сущности рынка ссудных капиталов, так как в условиях децентрализованной экономики рынок ссудных капиталов играет важную роль, поскольку создание, функционирование и развитие любого...