7194

Генетика и наследственность. Конспект лекций

Конспект

Биология и генетика

Введение в генетику -предмет генетики, -виды наследственности, -виды изменчивости, -история развития генетики, -место генетики в системе биологических наук, -задачи ветеринарной генетики, -методы исследовании используемые в генетике...

Русский

2013-01-18

5.47 MB

91 чел.

1. Введение в генетику

-предмет генетики,

-виды наследственности,

-виды изменчивости,

-история развития генетики,

-место генетики в системе биологических наук,

-задачи ветеринарной генетики,

-методы исследовании используемые в генетике.

ГЕНЕТИКА – это наука о наследственности и изменчивости организмов. Наследственность- свойство организмов обеспечивать материальную и функциональную преемственность между поколениями. Изменчивость – это возникновение различий между организмами по рядку признаков. Задачей генетики является изучение передачи наследственности от родителей потомкам, а также изменчивости- способности организмов изменяться под действием наследственных и ненаследственных факторов. Историю генетики можно разделить на три этапа: 1 – этап классической генетики (1900-1930 гг.), 2- этап – клеточный(1930-1953 гг.), 3- этап – молекулярный ( начат в 1953 году).

Литература : основная – 1,2,3;  дополнительная – 7,8,9                                                              

2.Цитологические основы наследственности.

-роль основных элементов клетки в сохранении, реализации и передаче наследственной информации;

-строение хромосом и их химический состав;

-кариотипы животных;

-генетическая сущность митоза и мейоза, их патологии;

-случайность и  избирательность при  оплодотворении;

Тема лекции:     Цитологические основы наследственности  

Вопросы:  1. Роль основных элементов клетки в сохранении, реализации                                                                                                                                                      и передаче наследственности.

                   2. Хромосомы и их химический состав.

                   3. Митоз и его генетическая сущность.

                   4. Мейоз и его генетическая сущность.

                   5. Оплодотворение: случайность и избирательность при слиянии гамет.

VІІ. Внеядерная наследственность. Материнская наследственность и ее причины.

Наследственность, передаваемая только через мать, называется материнской.

Материнская наследственность характерна лишь для тех признаков на которые влияют цитоплазма и ее органоиды.

Наследование признаков через цитоплазму получило название ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ, или ВНЕЯДЕРНОЙ наследственности.

Причины осложняющие правильные решения роли цитоплазмы в наследственности:

1.Иногда в цитоплазме находятся инородные органический с ней не связанные включнения, чаще вирусы, реже бактерий. Их присутсвие ведет к изменению  жизнедеятельности клетки и развитию определенных признаков. Ложная цитоплазматическая наследственность (рак молочной железы у мышей с молоком матери, так как вирус этот находится и в семенном пузырьке самцов, переносивших их при спаривании самкам).

2.Свойство цитоплазмы яйцеклетки определяется ядром матери.

3. непосредственное влияние материнского организма на развитие зародыша также нередко ведет к известному сходству потомства с матерью, хотя оно и необусловлено с наследственностью. Питание эмбриона, недоразвитость маток, крупная самка мелкий самец и наобарот, влияние маток – рецепиент на продолжительность плодоношения; мул – от кобылицы и осла крупнее и более сходен к лошади чем лошак – гибрид ослихи и жеребца.

Типичная  внеядерная, или цитоплазматическая наследственность может быть вызвана с одной стороны, влиянием органоидов, находящихся в цитомлазме, а  с другой – некоторыми особенностями собственно плазмы, то есть гиало плазмы.

Влияние на наследственность органоидов плазмы.

Митохондрия – у животных и растений всех видов.

Пластиды – в клетках зеленых растений (в которых синтез – ся хлорофил)

У бактерии  цитоплазма содержит небольшие молекула ДНК – ЭПИСОМЫ. Тоже подвержены мутациям которые передаются в дочерние клетки.  

Влияние наследственности цитоплазмы.

Асатуров  на тутовом шёлкопряде путем замены ядра не обнаружил влияние цитоплазмы.

У амёбы разных видов установлено влияние плазмы на размер ядер и особенности псевдоподии.  

Заключение:

Действие генов может быть иногда ослаблено или полностью подавлено.

                                    VІ.

В кариотипе заложена генетическая информация особи, изменения которые влекут за собой изменения признаков и функций организма данной особи или ее потомства. Поэтому очень важно знать особенности нормального строения хоромосом, чтобы при возможности суметь выявить изменения в кариотипе.

Паталогии митоза. При делении саматических клеток могут возникнуть различные нарушения, связанные с поврождением хромосом, митотического аппарата, цитоплазмы.

К числу этих нарушений относятся: 1) задержка митоза в профазе, 2) нарушение спирализации и дестирилизации хромосом, 3) раннее разделение хроматид, 4) фрагментация и пульверизация хросом, 5) задержка митоза в метафазе, К – митоз и др.

Эти нарушения возникают под действием отдельных химических веществ, радиации, вирусных инфекций. Так при заражении свиней вирусом чумы наблюдали пульверизацию и фрагментацию (множественные разрывы) хромосом.

Патологии мейоза. Основная паталогия мейоза – нерасхождение хромосом.

Полиплоидия – триплоидия, тетраплоидия, пентаплоидия, гексоплоидия.

Анеуплоидия – (+) трисомия, полисомия, (-) моносомия, нуллисомия.

                                  V. Оплодотворение

Под оплодотворением понимается слияние ядер спермия и яйцеклетки.

Зигота имеет двойной набор хромосом – тем самым оплодотворение обеспечивает сочетание у потомка признаков и свойств его родителей.

В яйцеклетку проникает несколько или много спермиев, но оплодотворение является моноспермным, а сверхкомплекстные спермии выполняют трофическую функцию, влияя на жизни способность развивающегося организма.

И.И.Соколовская, Е.К.Меркурьева, Д.И.Генина (1950 – 1953) – проникновение спермиев в клетки половых путей самок, что указывает на их трофическую функцию, и проливает свет на значение избытка этих гамет.

Случайность

Избирательность: 1. межвидовая гибридизация

                               2. внутри одного вида

Виды наследственности и изменчивости

1. Виды наследственности

2. Виды изменчивости

Виды наследственности - Это свойство живых существ передовать свои признаки и свойства потомству.

Различают:

  1.  Ядерную (хромосомную) наследственность;
  2.  Цитоплазмическую или нехромосомную наследственность;

Ядерная наследственность-обусловлена генами локализированными в хромосомах. Или определяется большая часть признаков или свойств организма.

Внеядерная наследственность-обусловлена наличием в цитоплазме клеток органелл, имеющих собственную ДНК, а слдовательно собственные гены.

К таким органелам относятя митохондрии, пластиды высших растений и базальные тельца, расположенные в основании жгутиков и ресничек.  

Выделют: 1)истинную 2) ложную 3) переходную наследственность

  •  Истинную наследственность связано с действием собственных генов (генов хромосом и органелл)
  •  Ложная наследственность это проявление в покалениях признаков и свойств, обусловленных действием возбудителей болезни, а также симптомов, или включением в клетки тех или иных экзоченных веществ

Ложная наследственность у живых наблюдается при заражении их медленными вирусами.

Важно подчеркнуть, что собственно болезнь как комплекс признаков –симптомов заболевания-резултать действия генов «хозяйна» в ответ на активность генов возбудиться. Кроме того, и сама предрасположенность к заболеванию зависить от генов «хозяйка»

Таким образом ложная наследственность не случайна, так как в основе мррио истенная наследственность, наличие генов орорроо к действую возбудителя болезни.

Ложная наследственность проявляется у некоторых червей зеленая  окраска тела которых определяется их симбионтами –одноклеточными зелеными водорослями.

Окраска желтка яиц кур обусловлена поступлением в него каротине растительного поролдл 

При этом следует еще раз отметить, что возможность накопления в организме Вв, поступипшего губке, зависит от характера действия собственных генов организма.

  •  Переходная наследственность включает широкий круг явлений, которых трудно квалифицировать, обозначно поскольку они сочетают черты истенный и ложный наследственности.

Приобретенное «Чужое», становится элементом цельстной гентической системы «Хозяйка»

                                 ІІ Виды изменчивости

Наследственную

Ненаследственную

Индивидуальная – совокупность изменения признаков и свойств в ходе онтогенеза

Комбинативная-сочетание у потомков признаков исходных родительский форм

Мутационная-образование новых форм с измененными признаками и свойтвами, которых побыло у их предков, в результате изменения последного материала

корреллиативная

Модификационная-изменение или модификация признаков, обусловленная переменой среде. Изменения не связанные с изменение наследственного материала. Поэтому ненаследуется.

3. Закономерности наследования признаков при половом размножении

-понятия ген, аллели-аллель-ные гены, аллелеморфы- множественный аллелизм, неаллельные гены, гомо-  и гетерозиготе, генотипе и фенотипе, доминантности  и рецессивности;

-моногибридное скрещивание;

-взаимодействие аллельных генов;

-реципикорные и возвратные -   анализирующие  скрещивания;

-ди- и полигибридные скрещиваниях,

-взаимодействие  неаллельных генов

Дигибридное скрещивание

Сущность дигибридного скрещивания. Организмы различаются по многим генам и, как следствие, по многим признакам. Чтобы одновременно проанализировать наследование нескольких признаков, необходимо изучить наследование каждой пары признаков в отдельности, не обращая внимания на другие пары, а затем сопоставить и объединить все наблюдения. Именно так и поступил Мендель.

Скрещивание, при котором родительские формы отличаются по двум парам альтернативных признаков (по двум парам аллелей), называется дигибридным. Гибриды, гетерозиготные по двум генам, называют дигетерозиготными, а в случае отличия их по трем и многим генам —три- и полигетерозиготными соответственно.

Результаты дигибридного и полигибридного скрещивания зависят от того, располагаются гены, определяющие рассмотренные признаки, в одной хромосоме или в разных.

Независимое наследование (третий закон Менделя). Для дигибридного скрещивания Мендель использовал гомозиготные растения гороха, различающиеся одновременно по двум парам признаков. Одно из скрещиваемых растений имело желтые гладкие семена, другое — зеленые морщинистые (рис. 3.3).

 

Рис 3.3. Дигибридное скрещивание растений гороха, различающихся по форме и окраске семян.

Все гибриды первого поколения этого скрещивания имели желтые гладкие семена. Следовательно, доминирующими оказались желтая окраска семян над зеленой и гладкая форма над морщинистой. Обозначим аллели желтой окраски А, зеленой — а, гладкой формы— В, морщинистой— b. Гены, определяющие развитие разных пар признаков, называются неаллельпыми и обозначаются разными буквами латинского алфавита. Родительские растения в этом случае имеют генотипы АА ВВ и aabb, а генотип гибридов F1 —АаВb ,т. е. является дигетерозиготным.

Во втором поколении после самоопыления гибридов F1 в соответствии с законом расщепления вновь появились морщинистые и зеленые семена. При этом наблюдались следующие сочетания признаков: 315 желтых гладких, 101 желтое морщинистое, 108 зеленых гладких и 32 зеленых морщинистых семян. Это соотношение очень близко к соотношению 9:3:3:1.

Чтобы выяснить, как ведет себя каждая пара аллелей в потомстве дигетерозиготы, целесообразно провести раздельный учет каждой пары признаков — по форме и окраске семян. Из 556 семян Менделем получено 423 гладких и 133 морщинистых, а также 416 желтых и 140 зеленых. Таким образом, и в этом случае соотношение доминантных и рецессивных форм по каждой паре признаков свидетельствует о моногибридном расщеплении по фенотипу 3:1. Отсюда следует, что дигибридное расщепление представляет собой два независимо идущих моногибридных расщепления, которые как бы накладываются друг на друга.

Проведенные наблюдения свидетельствуют о том, что отдельные пары признаков ведут себя в наследовании независимо. В этом сущность третьего закона Менделя — закона независимого наследования признаков, или независимого комбинирования генов.

Он формулируется так: каждая пара аллельных генов (и альтернативных признаков, контролируемых ими) наследуется независимо друг от друга.

Закон независимого комбинирования генов составляет основу комбинативной изменчивости (см. § 3.4), наблюдаемой при скрещивании у всех живых организмов. Отметим также, что в отличие от первого закона Менделя, который справедлив всегда, второй закон действителен только для генов, локализованных в разных парах гомологичных хромосом. Это обусловлено тем, что негомологичные хромосомы комбинируются в клетке независимо друг от друга, что было доказано не только при изучении характера наследования признаков, но и прямым цитологическим методом. Поведение хромосом при дигибридном скрещивании показано на рис. 3.4.

Цитологические основы дигибридного скрещивания. Как известно, в профазе I мейоза гомологичные хромосомы конъюги-руют, а в анафазе одна из гомологичных хромосом отходит к одному полюсу клетки, а другая — к другому. При расхождении к разным полюсам негомологичные хромосомы комбинируются свободно и независимо друг от друга. При оплодотворении в зиготе восстанавливается диплоидный набор хромосом и гомологичные хромосомы, оказавшиеся в процессе мейоза в разных половых клетках родителей, соединяются вновь.

Предположим, что каждая хромосома содержит только один ген. Палочковидные хромосомы несут аллель A или а , сферические —В или b, т. е. эти две пары аллелей находятся в негомологичных хромосомах

Гомозиготные родители (ААВВ и aabb) формируют только один тип гамет с доминантными (АВ) или с рецессивными (ab) аллелями. При слиянии таких гамет образуется единообразное первое поколение гибридов — гибрид дигетерозиготен (АаВb), но так как у него присутствуют гены А и B, то по фенотипу он сходен с одним из родителей.

В тех случаях, когда необходимо указать, что те или иные гены находятся в гомологичных хромосомах, в генетических формулах зигот хромосомы принято изображать в виде двух черточек или одной с указанием обоих аллелей гена. Формула дигетерозиготы  может быть записана так. Поскольку гаметы содержат только по одной из гомологичных хромосом и соответственно по одному аллелю каждого гена, то их формулы могут быть записаны так:  и т. д.

В дальнейшем у гибридных организмов ло причине случайности расхождения отцовских и материнских хромосом каждой пары в процессе мейоза ген А может попасть в одну гамету с геном В или с геном Ь. Точно так же ген а может оказаться в одной гамете с геном В или с геном b. Поэтому гибриды образуют четыре типа гамет: Образование всех четырех типов гамет равновероятно, т. е. все они образуются в равных количествах. Свободное сочетание таких гамет в процессах оплодотворения заканчивается образованием 16 типов зигот, а значит, и потомков.

Они распадаются на четыре фенотипических класса: доминантные по обоим признакам — 9 частей, доминантные по первому и рецессивные по второму признаку — 3 части, рецессивные по первому и доминантные по второму — 3 части, рецессивные по обоим признакам — 1 часть. Генотипических классов 9: 1AABB, 2ААВb, 1AAbb, 1Aabb, 4AaBb, 2AaBB, 1aaBB, 2aaBb, 1aabb.

Полигибридное скрещивание. Рассуждая аналогично, можно представить расщепление при три- и полигибридном скрещивании, т. е. когда родители различаются по аллелям трех и более генов, а в F1 образуются три- и по дигетерозиготы. Соотношение генотипических и фенотипических классов в F2 три- и полигибридных скрещиваний, а также число типов гамет (и число фенотипов) у гибридов F1 определяются простыми формулами: примоногибридном скрещивании число типов гамет равно 2, при дигибридном 4(22), а при полигибридном — 2n; число генотипов равно соответственно 3,9(32) и 3n.

Опираясь на независимость наследования разных пар аллелей, можно также любые сложные расщепления представить как произведение от соответствующего числа независимых моногиб-ридиых скрещивании. Общая формула определения фенотипических классов при полигибридном скрещивании имеет вид (3:1)n, где п равно числу пар признаков, по которым идет расщепление. Для моногибрида эта формула соответственно имеет вид (3:1); дигибрида — 9:3:3:1 или(3:1)2;тригибрида — (3:1)3. Расщепление по генотипу имеет вид (1:2; 1)n, где п — число расщепляющихся пар аллелей.

Известно, что каждый организм гетерозиготен по многим генам. Если предположить, что человек, у которого отдельные пары хромосом содержат не одну, а сотни пар аллелей, гетерозиготен хотя бы по 20 генам, то число типов гамет у такой полигетерозиго-ты составит 220 = 1 048 576. Эта цифра дает определенное представление о потенциальных возможностях комбинативной изменчивости. Поэтому каждый человек обладает неповторимой индивидуальностью. На Земле нет двух людей, совершенно одинаковых по наследственности, за исключением однояйцевых близнецов.

Таким образом, третий закон Менделя (закон независимого наследования признаков) еще раз демонстрирует дискретный характер генетического материала. Это проявляется в независимом комбинировании аллелей разных генов и в их независимом дей-ствии — фенотипическом выражении.

Дискретность гена определяется тем, что он контролирует присутствие или отсутствие отдельной биохимической реакции, от которой зависит развитие или подавление определенного признака организма. Очевидно, если несколько генов определяют какое-либо одно свойство или один признак (форма гребня у кур, окраска глаз у дрозофилы, длина колоса у пшеницы и т. д.), они должны взаимодействовать между собой. Отсюда следует, что понятие «наследование признаков» употребляется, скорее всего, как образное выражение, поскольку в действительности наследуются не сами признаки, а гены. Признаки формируются в ходе индивидуального развития организма, обусловливаются генотипом и влиянием внешней среды.

4. Изучение изменчивости признаков методами вариационной статистики.

-понятия о генеральной и выборочных совокупностях,

-вариационный ряд и его графическое изоображение,

-вычисление статистических показателей большой и малой выборок,

-определение уровня вероятности статистических показателей и достоверности различии между группами животных,

-доверительнее границы и правило трёх сигм,

-критерий хи-квадрат,

-коррелятивная связь между признаками.

5. Хромосомная теория наследственности

-сцепленное наследование признаков,

-кроссинговер,

-хромосомная теория наследственности;

Хромосомная теория наследственности

Основоположник теории Томас Гент Морган, американский генетик, нобелевский лауреат, выдвинул гипотезу об ограничении законов Менделя.

В экспериментах он использовал плодовую мушку-дрозо-филу, обладающую важными для генетических экспериментов качествами: неприхотливостью, плодовитостью, небольшим количеством хромосом (четыре пары), множеством четко выраженных альтернативных признаков.

Морган и его ученики установили следующее:

1. Гены, расположенные в одной хромосоме, наследуются совместно или сцепленно.

2. Группы генов, расположенных в одной хромосоме, образуют группы сцепления. Число групп сцепления равно гаплоидному набору хромосом у гомогаметных особей и п+1 у гетерогаметных особей.

3. Между гомологичными хромосомами может происходить обмен участками (кроссинговер); в результате кроссин-говера возникают гаметы, хромосомы которых содержат новые комбинации генов.

4.Частота кроссинговера между гомологичными хромосомами зависит от расстояния между генами, локализованными в одной хромосоме. Чем это расстояние больше, тем выше частота кроссинговера. За единицу расстояния между генами принимают 1 морганиду (1% кроссинговера) или процент появления кроссоверных особей. При значении этой величины в 10 морганид можно утверждать, что частота перекреста хромосом в точках расположения данных генов равна 10% и что в 10% потомства будут выявлены новые генетические комбинации.

5. Для выяснения характера расположения генов в хромосомах и определения частоты кроссинговера между ними строят генетические карты. Карта отражает порядок расположения генов в хромосоме и расстояние между генами одной хромосомы. Эти выводы Моргана и его сотрудников получили название хромосомной теории наследственности. Важнейшими следствиями этой теории являются современные представления о гене как о функциональной единице наследственности, его делимости и способности к взаимодействию с другими генами.

Пример сцепленного наследования:

Vg — нормальные крылья дрозофилы;

vg — зачаточные крылья;

ВВ— серая окраска тела;

bb — темная окраска тела.

Запись в хромосомном выражении:

В данном случае правило единообразия гибридов первого поколения соблюдается. В соответствии со вторым и третьим законами Менделя следовало ожидать при последующем анализирующем скрещивании по 25% каждого из возможных фенотипов (серых, длиннокрылых мух, серых короткокрылых, черных длиннокрылых и черных коротко-крылых). Однако опыты Моргана не дали таких результатов. При скрещивании рецессивной по обоим признакам самки VgVgbb с гибридным самцом из F1 образовалось 50% серых мух с короткими крыльями и 50% мух с черным телом и длинными крыльями:

Если же скрещивают дигибридную самку с гомозиготным рецессивным самцом, то в образуется потомство: 41,5% — серых с короткими крыльями, 41,5% — черных с длинными крыльями, 8,5% — серых с длинными крыльями, 8,5% — черных с короткими крыльями.

Данные результаты свидетельствуют о наличии сцепления генов и кроссинговере между ними. Так как в потомстве от второго скрещивания было получено 17% рекомбинант-ных особей, то расстояние между генами Vg и В равно 17%, или 17 морганидам.

Наследование, сцепленное с полом

Хромосомные наборы разных полов отличаются по строению половых хромосом. У-хромосома мужчин не содержит многих аллелей, имеющихся в Х-хромосоме. Признаки, определяемые генами половых хромосом, называют сцепленными с полом. Характер наследования зависит от распределения хромосом в мейозе. У гетерогаметных полов признаки, сцепленные с Х-хромосомой и не имеющие аллеля в У-хро-мосоме, проявляются даже в том случае, когда ген, определяющий развитие этих признаков, — рецессивен. У человека У-хромосома передается от отца к сыновьям, а Х-хромосо-ма — к дочерям. Вторую хромосому дети получают от матери. Это всегда Х-хромосома. Если мать несет патологический рецессивный ген в одной из Х-хромосом (например, ген дальтонизма или гемофилии), но при этом сама не больна, то она является носительницей. В случае передачи этого гена сыновьям они могут родиться с данным заболеванием, ибо в У-хромосоме нет аллеля, подавляющего патологический ген. Пол организма определяется в момент оплодотворения и зависит от хромосомного набора образовавшейся зиготы. У птиц гетерогаметными являются самки, а гомогаметными — самцы. У пчел половых хромосом вообще нет. Самцы гаплоидны. Самки пчел диплоидны.

Пример наследования, сцепленного с полом

Основные положения хромосомной теории наследственности:

• каждый ген имеет в хромосоме определенный локус (место);

• гены в хромосоме расположены в определенной последовательности;

• гены одной хромосомы сцеплены, поэтому наследуются преимущественно вместе;

• частота кроссинговера между генами равна расстоянию между ними;

• набор хромосом в клетках данного типа (кариотип) является характерной особенностью вида.

6. Генетика пола

-наследование пола; теории определения пола;

-нарушения в развитии признаков пола, обусловленные патологиями набора половых хромосом;

-фримартинизм;

-гермофродитизм и гинандроморфизм;                             

-проблемы регулирования пола у животных и пути ее решения ;                                                             

-особенности наследования сцепленных с полом признаков;  

-ограниченные полом признаки и их наследование.

Генетика пола

                    Наследование пола.

Теории определения пола  Различают три пути, опеределяющих формирование особей того или иного пола.

1.Прогамное определение пола. Характеризируется тем что формирование особей того или иного полаопределяется еще в организме самки и зависит от размера яйцеклеток. При этом из мелких яйцеклеток (и цитоплазма ала) после оплодотворения развиваются самцы, а из крупных самки. Наблюдается у коловороток, тлей и морских червей.

2.Эпигамное определение пола наступает после оплодотворения, на последующих стадиях развития особи. Обнаружена у морского червя БОНЕЛЛИА, развитие личинки этого червя может происходить двояко:

-  если личинка свободно плавает в морской воде и позднее оседает на дно, то она становится самкой;

- если же личинка прикрепляется к хоботу взрослой самки, то под влиянием гормонов, выделяемых этой самки, из нее формируется самец.

3.Сингамное определение пола характеризуется тем, что пол будущей особи, определяется при оплодотворении гамет, в результате соответствующего сочетания половых хромосом, т.е. при образовании зиготы.

Характерна для млекопитающих, птиц, рыб, двукрылых насекомых, двудомных растений.

Сингамное определение пола объясняется двумя теориями:

А) хромосомной теорией определения пола

Б) балансовой теорией определения пола

Наблюдения, проведенные на животных разных видов, показали, что среди новорожденных 50% составляют самцы, и 50 % самки.

Р ХХ      *       ХУ       

ххху  гаметы

хххххуху

    ♀ самки          ♂самцы

       50%                  50%

Наследование пола. Половые хромосомы и аутосомы. Генотипический пол особи обусловлен различиями в хромосомном аппарате мужских и женских особей.

Начиная 1901г появились предположения и цитологические подтверждения. (гомогаметный пол, гетерогаметный пол)    

Рыбы: - самцы  - млекопитающих, большая часть насекомых (и дрозофила), малюски, нематод.

          - самки – птиц, пресмыкающихся, бабочки некоторых видов (тутовый шелкопряд).

Х и У хромосомы почти не отличаются от аутосомы: 1) в них накоплен гены признаков; 2) линейность расположения генов; 3) происходит кроссинговер(когда ХХ), поэтому составлена карта хромосом; 4) морфологическая и химическая структура.

Аутосомы и половые хромосомы

Х – ХХ ♀

Z – ZZ ♂

Y – XY ♂

W – ZW ♀

В YW тех генов, которые находятся в  Х – Z нет, большая часть их является генетический пустой то есть, состоит в основном генетический инертного материала.

Половой хроматин или тельце Барра (1949) =   – 1.

ГЕНЕТИКА   ПОЛА

Яйцеклетки

Спермии               Зиготы

фенотип

Спермии                  Яйцеклетки

молекопитающих

птиц

Х                                   х                      хх      

Х                                   у                      ху

Нормальная схема

Нормальный самец

Нормальный самец

Нормальная схема

Ху                                х                       ххх

Самка трисомией-Х

0                                  х                        х 0

Самка с синдромом

Шермевского - Тернера

Х                                  0                        х 0

Х  хухху

Самец с синдромом

клайнфельтера

Х хухху

0                                     уу 0

нежизнеспособен

   Интерсекс- это однополая особь, у который придаточные половые железы, половые органы или вторичные половые признаки изменены в направлении противоположного пола.

Такихинтерсексов иногда называют псевдогермофрадитами.

Фримартины- это гормональные интерсексы генетический женского пола из разнополых двоен.

  Среди телок из разнополых двоен 92% фримартины.

  Истинный гермофродит- это особь, который обладает как женскими так и мужскими половыми железами и продуцирует как яйцеклетки, так испермии.

Пригина:химеризм соматических клеток организма по набору половых храмосом- ХХ и ХУ.

Гинануроморф – особь, часть тела которого является генетический мужским, а другая часть – женским.

Аномалии, затрагивающие морфологические и физиологические системы.

♀ аномальные гаметы

ХХ

О

ХХХ

Синдром метасамец

ХХУ

Синдром Клайнфельтера

ХО

Синдром Тернера

УО

Не жизнеспособен

Балансовая теория определения пола. В 1919 гБриджес предложил БАЛАНСОВУЮ теорию определения пола, согласно которой у дрозофилы, у кузнечика и некоторых других насекомых пол особи определяется соотношением аутосом и Х хромосомой. При этом предполагается, что гены обуславливающие развитие мужской особи локолизированы в аутосомах, а гены – развития женской особи в Х хромосомах.

Дрозофила – по табл.плакату.

ХХУ – самка нормальная    ХХУ – самец (мужск.)  

ХО – самец бесплодный    ХО – самка (женск.)

У хромосома не определяет пол, а плодовитость.

                                                                         Набор

Аутосома Х хромосома               Аутосома Х хромосома (Х: Аутосома)

6:2                                            2:2 (1,0)      или         1:1 самка - ♀

       6:1                                            2:1 (0,5)                      2:1 самец - ♂

9:2                                            3:2 (0,67)                    интерсекс

Интерсекс (от лат. inter — между и sexus — пол)– это однополая особь, у которой в той или иной степени развиты одновременно признаки как одного, так и другого пола, то есть у которой придаточные половые железы, половые органы или вторичные половые признаки изменены в направлении противоположного пола.

Истинный гермофродит – это особь которая обладает как женскими, так и мужскими половыми железами и продуцирует как яйцеклетки, так и спермы.

Гинандоморф – часть или некоторые части его тела является генетический мужскими, а часть генетический женскими.

Фримартины – это гормональные интерсексы генетический женского пола из разнополых.

                       Проблемы регулирования пола у животных и пути ее решения

  1.  Метод разделения  Х и У сперматозоидов по удельному весу (удельный вес Х больше У) – до конца не разработан, хотя имеются некоторые положительные результаты.

1.2) Метод разделения спермиев с помощью электрофареза, Шредер – на кроликах:

             К       А

10°С -  ♂ 83%     ♂ 17%

                   =

25°С -  ♀ 20%    ♀ 75%

/Это возможность подтверждена в дальнейшем М.С.Левиным и Г.С.Гордоном.

  1.  Метод иммунизации (Шредер). Путем иммунизации хряков и свиней против спермиев определенного типа, путем инъекции им спермы с анода или с катода. Сдвиг до 75%, но полного сдвига все же не получено.
  2.  Метод разделения спермы – находящийся в состоянии температурно – кислотного анабиоза (разработан Владимирской и Харченко): сперму под кислым аминокислотой гистидином до рН = 6,0, при t= 18 – 21° и наливал и в пробирки закупорили;

♂ 31,78%

♂ 57,66%                              анабиоз, контроль       50,88% = 50,77%.

  1.  Б.Л.Асатуров на тутовом шелкопряде добился явлении гиногенеза (только самки) и андрогенеза (только самцы).

Тепловым шоком при методе задерживалось редукционные деления и образовывались диплоидные яйца с Zи W – хромосомами, развивавшееся ПАРТЕГЕНЕТИЧЕСКОЙ, то есть без оплодотворения. Таким образом получились только самки (ZW). Для получения только самцов  (ZZ) Асатуров подогреванием или действием радиации разрушал поры яйцематки. При последующем оплодотворении в яйцематку проникал не один, а два сперматазоида с Z хромосомой, и получил зиготу ZZ.

5)При увеличении количества спермы в половы путях ♀ число ♂ в потомстве кур и свиней возрастало.

6)При добавке в рацион кроликов белков животного происхождение и подкормке кур метионином увеличивается удельный вес ♀

  При избытке в рационе амикокислот метионина повышается удельный вес ♀

Аспаргина →♂

  (Г.В. Гаршутин. В.И.Михайлов)

7)При обработке петухов и хряков малыми дозами гормона метилстестостерона увеличился удельный вес ♂

8)При спаривании одновозрастных хряков и свиноматок было получено следующие количество потомков женского пола:

  Возраст родителей:               Удельн.вес потомства♀

         До 1 года                          45,7%

              2 года                           50,8%

              3 года                          50,4%

              4 года                           49,2%

              5 года                           37,2%

              6 года                           41,1%

Соотношение полов в популяциях обусловлен не только генетический.

Использование разделенного по полу семени в практике животноводства

Регуляция пола у сельскохозяйственных животных представляет значительный практический интерес, поскольку способствует ускорению генетического прогресса в селекционно-племенной работе. Ранее изучалась возможность разделения сперматозоидов, содержащих Х- или Y-хромосому следующими способами: осаждение, центрифугирование в градиенте, электрофорез, обработка специфическими антителами и т.д. (1-3).  Однако на практике не было получено убедительных доказательств эффективности этих приемов.

В последние годы во многих странах мира для разделения спермы по полу используют метод проточной цитометрии, основанный на различном содержании ДНК в сперматозоидах (4-6). В 1979 году было установлено, что Х-хромосома млекопитающих содержит большее количество ДНК по сравнению с Y-хромосомой (7). Так, у быков это различие составляет 3,8, у хряков - 3,6, у баранов - 4,2, у жеребцов - 3,7 %  (4, 8). При разделении сперматозоидов было предложено использовать специальный краситель для ДНК и аналитическую проточно-цитометрическую систему, которую дополнили приспособлением для  направленной  ориентации клеток в потоке, что способствует более четкому выявлению различий в их светоизлучении (9).

На основании результатов исследований, проведенных американскими учеными, была усовершенствована обычная аналитическая проточно-цитометрическая система и разработана Белтсвилская технология разделения спермы, которая состоит из нескольких операций (10, 11). В состав разбавленной спермы добавляют флуоресцентный витальный краситель  Hoechst 33342 и инкубируют ее при 35 °С в течение 1 ч для лучшего проникновения красителя через мембранные структуры половых клеток. Затем сперма под давлением поступает в высокоскоростной проточный цитометр, где создаются условия ориентации головки сперматозоидов при пересечении лазерного луча. Лазерное излучение инициирует флуоресценцию красителя, которая улавливается мощным световым детектором и анализируется компьютером. После идентификации сперматозоидов, содержащих Х или Y-хромосому, специальный вибратор образует в растворе микрокапельки, куда попадают половые клетки. Каждая микрокапелька содержит один сперматозоид и заряжается положительно или отрицательно в зависимости от величины  светоизлучения, обусловленной  содержанием в половой клетке Х- или Y-хромосомы. Капельки с поврежденными или не идентифицированными сперматозоидами не заряжаются. В современных установках образуется 70-80 тыс. микрокапелек в секунду (12). После этого сперматозоиды проходят через электростатическое поле и разделяются на положительно, отрицательно или нейтрально заряженные частицы, которые поступают в разные емкости. Затем сперматозоиды центрифугируют для увеличения их концентрации и разбавляют специальной средой (13-15).

В первое время после разработки описанной технологии использовали стандартную скоростную систему с рабочим давлением в пределах 0,84 кг/см2. При этом скорость разделения клеток составляла 350 тыс сперматозоидов в час (10). Позднее, когда технология была усовершенствована, в том числе за счет повышения давления в  системе до 4,22 кг/см2, стало возможным сортировать до 11 млн сперматозоидов в час и получать образцы, содержащие 90 % клеток с Х- или Y-хромосомой (8).

Были проведены углубленные исследования в области улучшения ориентации головки сперматозоидов относительно лазерного луча и оптического детектора (5, 14, 16). Вследствие плоской формы головки лишь 30 % клеток имеют правильную пространственную ориентацию при прохождении через лазерный луч, причем только половина из них содержит Х- или Y-половую хромосому. Из общего объема эякулята удается получить не более 15 % сперматозоидов с определенной половой хромосомой, что обусловливает высокую стоимость разделенного по полу семени. В настоящее время разделенная сперма быков может быть экономически выгодной производителю только если в дозе содержится пониженное число сперматозоидов (~ 2 млн подвижных клеток по сравнению с 10-15 млн сперматозоидов, применяемых при обычном осеменении крупного рогатого скота криоконсервированной спермой).   

Во время разделения с помощью высокоскоростной проточной  цитометрии сперматозоиды подвергаются действию таких неблагоприятных факторов как окрашивание, высокая степень разбавления семени, воздействие лазерного излучения и давления, электромагнитное влияние, центрифугирование (17-19), поэтому важна разработка условий для сохранения биологической полноценности половых клеток. В частности, для предохранения их от агглютинации в состав буферного раствора вводят 0,1 % бычьего сывороточного альбумина, а после разделения сперматозоиды попадают в TEST-желточный буфер (20). Показано, что лучшая подвижность сперматозоидов после оттаивания сохраняется в случае центрифугирования половых клеток сразу после разделительного процесса и добавления глицерина в состав охлажденного до 4 °С семени незадолго до замораживания (21). Для проверки чистоты разделения образцов спермы на Х- и Y- фракции применяют  полимеразную цепную реакцию (22), а также метод  флуоресцентной гибридизации (23).

В 1988 году установлено, что разделенные с помощью проточной цитометрии сперматозоиды способны к образованию пронуклеуса при введении в ооциты хомячков (24). В том же году английскими исследователями были проведены первые опыты по использованию разделенной спермы для искусственного осеменения телок и крольчих (25). Две группы телок осеменяли с помощью цервикального введения фракции сперматозоидов с Х- или Y-хромосомой. В дозе содержалось 5 млн клеток. Оплодотворяемость животных оказалась очень низкой, и телки в основном абортировали между 4-м и 5-м мес беременности. Изучение половых органов у абортированных плодов показало, что в случае осеменения Х-фракцией 8 из 11 плодов были самками, при использовании Y-фракции 12 из 20 плодов - самцами. Низкие результаты оплодотворяемости были получены и у крольчих, однако в этом случае удалось получить живых крольчат, которые нормально развивались и в дальнейшем принесли  здоровое потомство.   

В опытах американских ученых по осеменению крольчих сперму самкам вводили  внутриматочно. В группе, где использовали фракцию сперматозоидов с Х-хромосомой, получили 94 % самок, с Y-хромосомой - 81 % самцов (10). Внутритрубное введение свиньям разделенного по полу семени хряков позволило получить в потомстве 68 % самцов при оплодотворении спермой с Y-хромосомой и 74 % самок при использовании Х-фракции (20).

 Позднее были проведены успешные эксперименты по оплодотворению яйцеклеток крупного рогатого скота разделенными сперматозоидами invitro (26). С помощью проточной цитометрии получали фракции спермы, содержащие до 79 % половых клеток с Х-хромосомой и до 70 % - с Y-хромосомой. Телкам пересаживали эмбрионы предполагаемого пола, в результате чего в первой группе родилось 3 телочки, во второй - 3 бычка. В последующих опытах удалось получить до 90 % телят мужского пола (27).

Также был проведен ряд экспериментов по изучению эффективности пересадки коровам  эмбрионов, полученных  invitro с помощью разделенного семени (28). Приживляемость эмбрионов у коров со спонтанным эструсом составила 16,3, у коров с синхронизированным эструсом - 20,0, у телок - 34,2 %.  Из 40 родившихся телят 37 были телочками.

В  более поздних исследованиях изучали эффективность пересадок коровам заморожено-оттаянных эмбрионов, полученных invitro с использованием фракции Х-сперматозоидов (29). Приживляемость таких эмбрионов в опытной группе составила 40,9 %, в контрольной, где использовались обычные эмбрионы, - 41,9 %. Всего родилось 458 телят, из которых 96,8 % были самками.       

В связи с тем, что скорость разделения сперматозоидов при проточной цитометрии не позволяет получать достаточно семени для обычного искусственного оплодотворения крупного рогатого скота, была изучена возможность введения половых клеток непосредственно в рога матки (30, 31). Не разделенную сперму, содержащую 100-500 тыс. сперматозоидов,  вводили в рог матки телок с помощью инструментов для эмбриопересадки. В некоторых группах  результаты  оплодотворяемости  были довольно высокими. Затем для осеменения телок использовали разделенную фракцию не замороженной спермы, содержащей в дозе 100-200 тыс. сперматозоидов. Из 17 полученных телят 14 соответствовали предполагаемому полу (31). В  другом опыте 35 телкам в рога матки вводили по 300 тыс. не замороженных разделенных сперматозоидов, содержащих преимущественно Х-хромосому, а контрольных животных осеменяли такой же дозой не разделенной спермы. Оплодотворяемость в опытной группе составила 42 %, в контроле - 54 %. В опытной группе было получено  80 % телочек (32). В экспериментах по осеменению пониженной дозой заморожено-оттаянных разделенных по полу сперматозоидов (1 млн клеток) оплодотворяемость составила 52 %. Эти показатели сопоставимы с результатами обычного искусственного осеменения коров криоконсервированной  спермой, содержащей в дозе 15-20 млн половых клеток (33). При внутриматочном осеменении телок разделенной по полу  криоконсервированной спермой (1; 1,5 или 3 млн сперматозоидов в дозе) также удалось получить высокие показатели оплодотворяемости (43-54 %) (34).

В полевых испытаниях швейцарских ученых телкам и коровам  опытных групп внутриматочно вводили по 2 млн подвижных заморожено-оттаянных сперматозоидов с Х-хромосомой. В контрольных группах животных осеменяли аналогичной дозой не разделенных половых клеток. В опытной и контрольной группах отелилось соответственно 29,6 и 55,6 % телок; 21,9 и 23,4 % коров. При этом в опытных группах родилось 85,3 % самок, в контрольных - 58,6 % (35).

Эстонские исследователи выясняли эффективность осеменения телок разделенной спермой при введении 2,2 млн заморожено-оттаянных сперматозоидов в маточно-трубное сочленение, рога или тело матки (36). Оплодотворяемость телок во всех вариантах оказалась практически одинаковой и составила соответственно  37,7;  42,2  и  39,6 %.

В Финляндии проводились испытания по осеменению коров  голштинской породы криоконсервированной разделенной спермой (37). Во время спонтанной охоты 157 опытным коровам вводили внутриматочно 2 млн разделенных сперматозоидов, 149 контрольным коровам - 15 млн не разделенных сперматозоидов. В опытной группе отелилось 20 % коров и родилось 82 % телочек. В контроле эти показатели составили соответственно 45 и 49 %. Полученные результаты свидетельствуют о значительном снижении оплодотворяемости при использовании для осеменения пониженного числа сперматозоидов в дозе разделенной спермы.

В экспериментах итальянских ученых при введении телкам внутриматочнокриоконсервированной  разделенной  спермы, полученной  от четырех быков (1 или 2 млн сперматозоидов), оплодотворяемость составила 51 %, в потомстве было 87 % самок. Кроме того, были выявлены достоверные различия в оплодотворяющей способности семени у разных быков. По мнению авторов, необходимо проводить тщательный отбор быков перед их использованием для получения разделенной по полу спермы (38).

В полевых испытаниях, проведенных в США на 211 фермах, оплодотворяемость телок голштинской породы Х-содержащей фракцией сперматозоидов достигала 47 %, телок джерсейской породы - 53 %. В потомстве получено 89 % самок (39). Кроме того, был установлен факт более высокой мертворожденности телят мужского пола при осеменении телок  сперматозоидами с Х-хромосомой.

В специальных исследованиях изучали влияние процесса разделения спермы с помощью скоростной проточной цитометрии на состояние здоровья и развитие телят, а также на генетические  изменения у потомства (40). Используя данные по 1169 и 793 телятам, полученным соответственно при оплодотворении коров разделенной и обычной спермой, анализировали продолжительность беременности, легкость отела, частоту абортов и мертворождений, живую массу телят при рождении и отъеме, смертность телят в неонатальный и более поздний период, а также различные анатомические аномалии. Достоверных различий в изучаемых показателях  между двумя группами животных установлено не было. При использовании не разделенной спермы получили 49,2 % бычков, Х-содержащей фракции сперматозоидов - 87,8 % самок, Y-содержащей фракции - 92,1 % самцов. Разделение спермы не оказывало влияния на раннюю эмбриональную смертность у телок (34).

Применение высокоскоростной проточной цитометрии для разделения сперматозоидов быков не оказывает отрицательного влияния на структурное состояние ДНК в клетках (41). Коммерческое использование разделенной по полу спермы в зарубежных странах началось с 2000 года и к настоящему времени в мире получено более 2 млн телят (42). В основном разделенную сперму быков используют для осеменения телок. В среднем в дозе содержится не менее 2 млн подвижных сперматозоидов. Предпринимаются попытки улучшить биологическую полноценность разделенной спермы в процессе ее криоконсервации. В частности, изучено защитное влияние на половые клетки быков антиоксидантов пирувата натрия и каталазы, добавление которых в состав синтетической среды улучшало подвижность и живучесть заморожено-оттаянных сперматозоидов (43). Совместное введение в состав среды для разделения сперматозоидов бычьего сывороточного альбумина и антиоксидантов значительно повышало живучесть и оплодотворяющую способность не замороженных половых клеток (44).

Основная трудность использования разделенной спермы в свиноводстве состоит в том, что в дозе должно содержаться большее число сперматозоидов по сравнению с дозой для крупного рогатого скота. Первые поросята от разделенного семени были получены после лапароскопического введения спермы непосредственно в яйцеводы свиней (20). Позднее яйцеклетки свиней оплодотворяли invitro c использованием фракции  Х-сперматозоидов (45). Все потомки, родившиеся у свинок после пересадки им таких эмбрионов, оказались самками. В других экспериментах удалось получить потомство мужского пола при внутрицитоплазматическом введении разделенных не замороженных сперматозоидов хряка в яйцеклетки и дальнейшей их активации invitro (46).

С целью уменьшения числа сперматозоидов в дозе для осеменения свиней разработана методика глубокоматочного введения спермы через цервикальный канал с помощью гибкого катетера (47, 48). Оказалось, что для нормальной оплодотворяемости свиней достаточно ввести в верхушку рога матки 50-70 млн разделенных сперматозоидов (49, 50). Кроме того, предлагается вводить семя непосредственно в яйцеводы с помощью лапароскопа (51, 52). Использование этой методики позволило достичь высокой оплодотворяемости при дозе 0,3; 0,5 и 1 млн сперматозоидов. Анализ генетических изменений в лимфоцитах поросят, полученных от разделенного семени, не выявил мутагенного воздействия высокоскоростной проточной цитометрии на половые клетки (53). При двукратном осеменении свиней разделенной заморожено-оттаянной спермой в дозе 160 млн сперматозоидов отмечено значительное увеличение эмбриональной смертности по сравнению с контрольной группой, осемененной не разделенной  спермой (54).

В овцеводстве и коневодстве также проводятся исследования эффективности применения разделенной по полу спермы. Австралийские ученые впервые получили потомство от разделенной спермы баранов в 1996 году (55). Овцам пересаживали эмбрионы, полученные invitro, с помощью внутриплазматического введения в яйцеклетки одиночных разделенных сперматозоидов. В 1997 году были проведены успешные эксперименты по искусственному осеменению овец разделенной спермой с использованием лапароскопа (56). Эффективность лапароскопического осеменения овец заморожено-оттаянной разделенной спермой была изучена в специальных опытах (57). Овцам опытных групп внутриматочно вводили 1, 5 и 15 млн заморожено-оттаянных разделенных сперматозоидов, контрольным животным - 50 млн не разделенных сперматозоидов. Оплодотворяемость в опыте составила соответственно 61,5; 66,1 и  66,7 %; в контроле - 63,2 %.

При введении разделенной не замороженной спермы в верхушку рога матки кобылам было получено 87 % потомков желаемого пола (58). По мнению ряда ученых, более перспективный способ осеменения кобыл разделенной спермой - гистероскопическое введение семени непосредственно в верхушку рога матки (59, 60). Более высокой оплодотворяемости кобыл от разделенного семени удалось достичь при введении 20 млн сперматозоидов в маточно-трубное сочленение (61). C использованием этой технологии получено потомство и от криоконсервированной разделенной спермы жеребцов (42).

Таким образом, технология разделения сперматозоидов по полу с использованием высокоскоростной проточной цитометрии представляет  эффективный способ регуляции пола и в настоящее время находит применение в практике разведения не только крупного рогатого скота, но и других видов сельскохозяйственных животных. Дальнейшее совершенствование этой технологии позволит улучшить результативность разделения сперматозоидов и повысить эффективность искусственного осеменения животных.

7. Молекулярные основы наследственности.

- Нуклеиновые кислоты, их строение, функции и генезис.

- Основные этапы биосинтеза белков. Генетический код, его основные свойства.

-Тонкое строение гена. Регуляция экспрессии генов.

Молекулярные основы наследственности.

  1.  Свойства и биологическая роль нуклеиновых кислот.
    1.  Строение ДНК и РНК.
    2.  Репликация ДНК.
    3.  Виды РНК и их функции.
    4.  Биосинтез белка, транскрипция и трансляция.

Нуклеиновые кислоты – материальные носители наследственной информации – были открыты в 1869 году ф. Миллером.

Свойства и биологическая роль нуклеиновых кислот заключаются в следующем: ДНК и РНК являются местом сохранения наследственной информации и самовоспроизведения;

Только с прямым участием нуклеиновых кислот может происходить синтез белков; нуклеиновые кислоты являются катализаторами химических реакций; эти кислоты самые длинные и устойчивые к факторам; без этих кислот жизнь организмов  невозможна. Нуклеиновые кислоты состоят из остаток фосфорной кислоты, сахара и одного азотистого основания.   ДНК размножаются самоудвоением (репликацией).Белки синтезируются в рибосомах с участием и РНК и тРНК( транскрипция и трансляция).

Литература: основная – 1,2,3,4,6;  дополнительная – 8,9,14.

Молекулярные основы наследственности и изменчивости

1. Нуклеиновые кислоты, их строение, функции и генезис

2. Основные этапы биосинтеза белков. Генетический код, его основные свойства

3. Регуляция экспрессии генов

  1.  Нуклеиновые кислоты, их строение и функции .

Материальным носителем наследственности является молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Молекула ДНК состоит из двух нитей, закрученных друг относительно друга. Каждая из цепочек образована отдельными блоками - нуклеотидами, в последовательности которых закодирована генетическая информация. Информация считывается лишь с одной нити, вторая способствует более компактной упаковке огромной молекулы в клетке.
Клетка обладает способностью на основе ДНК строить молекулы белков. Генетический код универсален - у всех организмов, от простейших до самых высоко организованных определенная последовательность нуклеотидов "воплощается" в идентичную структуру белка. Функции белков в организме необыкновенно разнообразны, их специфика прямо или опосредованно влияет на любое свойство индивидуума


Cхема строения ДНК

Молекулы ДНК состоит из 4 типов нуклеотидов. Друг от друга они отличаются по азотистому основанию, входящему в их состав: это может быть аденин, гуанин, тимин или цитозин. В двухцепочечной молекуле азотистые основания расположены внутри спирали; они способны образовывать водородные связи друг с другом. В силу молекулярной геометрии двухцепочечный комплекс устойчив, когда напротив аденина одной цепи располагается тимин другой, а напротив гуанина - цитозин. Комплементарность цепей позволяет осуществлять два важнейших процесса. С одной стороны, она делает возможным матричный синтез - построение новой молекулы ДНК на основе уже существующей по образу и подобию материнской. Исходная молекула "расплетается" и новые цепи достраиваются по принципу комплементарности.
С другой стороны, комплементарность лежит в основе транскрипции - важнейшего этапа синтеза белков. Комплементарно к молекуле ДНК строится молекула другой нуклеиновой кислоты - рибонуклеиновой (РНК). В дальнейшем, уже в ходе трансляции, информация, заключенная в РНК, воплощается в структуре белков.
"Словом" в "языке" ДНК является последовательность из трех нуклеотидов - так называемый триплет. Каждому триплету в цепочке ДНК соответствует определенная аминокислота в составе белка.

Нуклеиновые кислоты – это линейные неразветвленные гетерополимеры, мономерами которых являются нуклеотиды, связанные фосфодиэфирными связями.

Нуклеотиды – это органические вещества, молекулы которых состоят из остатка пентозы (рибозы или дезоксирибозы), к которому ковалентно присоединены остаток фосфорной кислоты и азотистое основание. Азотистые основания в составе нуклеотидов делятся на две группы: пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (цитозин, тимин и урацил). Дезоксирибонуклеотиды включают в свой состав дезоксирибозу и одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т), цитозин (Ц). Рибонуклеотиды включают в свой состав рибозу и одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), урацил (У), цитозин (Ц).

 

В ряде случаев в клетках встречаются и разнообразные производные от перечисленных азотистых оснований – минорные основания, входящие в состав минорных нуклеотидов.

Свободные нуклеотиды и сходные с ними вещества играют важную роль в обмене веществ. Например, НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) служат переносчиками электронов и протонов.

Свободные нуклеотиды способны присоединять еще 1...2 фосфорные группы, образуя макроэргические соединения. Универсальным источником энергии в клетке является АТФ – аденозинтрифосфорная кислота, состоящая из аденина, рибозы и трех остатков фосфорной (пирофосфорной) кислоты. При гидролизе одной концевой пирофосфатной связи выделяется около 30,6 кДж/моль (или 8,4 ккал/моль) свободной энергии, которая может использоваться клеткой. Такая пирофосфатная связь называется макроэргической (высокоэнергетической).

Кроме АТФ существуют и другие макроэргические соединения на основе нуклеотидов:  ГТФ (содержит гуанин; участвует в биосинтезе белков, глюкозы), УТФ (содержит урацил; участвует в синтезе полисахаридов).

Нуклеотиды способны образовывать циклические формы, например, цАМФ, цЦМФ, цГМФ.  Циклические нуклеотиды выполняют роль регуляторов различных физиологических процессов.

Нуклеиновые кислоты

Существует два типа нуклеиновых кислот: ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота). Нуклеиновые кислоты обеспечивают хранение, воспроизведение и реализацию генетической (наследственной) информации. Эта информация отражена (закодирована) в виде нуклеотидных последовательностей. В частности, последовательность нуклеотидов отражает первичную структуру белков (см. ниже). Соответствие между аминокислотами и кодирующими их нуклеотидными последовательностями называется генетическим кодом. Единицей генетического кода ДНК и РНК является триплет – последовательность из трех нуклеотидов.

Нуклеиновые кислоты – это химически активные вещества. Они образуют разнообразные соединения с белками – нуклеопротеиды, или нуклеопротеины.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – это нуклеиновая кислота, мономерами которой являются дезоксирибонуклеотиды. ДНК является первичным носителем наследственной информации. Это означает, что вся информация о структуре, функционировании и развитии отдельных клеток и целостного организма записана в виде нуклеотидных последовательностей ДНК. 

Нуклеиновые кислоты были открыты Мишером в 1868 г. Однако лишь в 1924 г. Фёльген доказал, что ДНК является обязательным компонентом хромосом. В 1944 г. Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти установили, что ДНК играет решающую роль в хранении, передаче и реализации наследственной информации.

Существует несколько типов ДНК: А, В, Z, Т–формы. Из них в клетках обычно встречается В–форма – двойная правозакрученная спираль, которая состоит из двух нитей (или цепей), связанных между собой водородными связями. Каждая нить представлена чередующимися остатками дезоксирибозы и фосфорной кислоты, причем, к дезоксирибозе ковалентно присоединяется азотистое основание. При этом азотистые основания двух нитей ДНК направлены друг к другу и за счет образования водородных связей образуют комплементарные пары: А=Т (две водородных связи) и Г≡Ц (три водородных связи). Поэтому нуклеотидные последовательности этих цепей однозначно соответствуют друг другу. Длина витка двойной спирали равна 3,4 нм, расстояние между смежными парами азотистых оснований 0,34 нм, диаметр двойной спирали 1,8 нм. 

Длина ДНК измеряется числом нуклеотидных пар (сокращ. – пн). Длина одной молекулы ДНК колеблется от нескольких тысяч пн (сокращ. – тпн) до нескольких миллионов пн (мпн). Например, у наиболее простых вирусов длина ДНК составляет примерно 5 тпн, у наиболее сложных вирусов – свыше 100 тпн, у кишечной палочки ~ 3,8 мпн, у дрожжей ~ 13,5 мпн, у мушки дрозофилы ~ 105 мпн, у человека ~ 2900 мпн (размеры ДНК даны для минимального набора хромосом – гаплоидного). Длину ДНК можно выразить и в обычных метрических единицах длины: общая длина молекулы ДНК у кишечной палочки составляет ~ 1,3 мм, а длина молекулы ДНК в составе первой хромосомы человека ~ 16 см, а длина ДНК во всем геноме человека (в 23 хромосомах) ~ 1 метр. В эукариотических клетках ДНК существует в виде нуклеопротеиновых комплексов, в состав которых входят белки-гистоны.

Аминокислоты. Двадцать аминокислот.

Двадцать аминокислот, из которых обычно построены белки, показаны на рис. 3.6. Аминокислоты соединяются друг с другом с помощью пептидной связи, которые образуются в результате конденсации аминогруппы (NH2) одной аминокислоты с карбоксильной группой (СООН) другой аминокислоты. Последовательность аминокислот в полипептидной цепи записывают от аминокислоты со свободной NH2-гpyппoй до аминокислоты со свободной СООН-группой.

Генетический код

Наиболее неясным в синтезе белков был вопрос о том, как т-РНК находит соответствующий участок м-РНК, к которому должна быть присоединена приносимая ею аминокислота. Это зависит от последовательности нуклеотидов в цепи молекулы и-РНК, причем заранее можно было утверждать, что такого рода генетический код не может состоять из одного или двух нуклеотидов, т.к.последних только четыре, сочетаний из двух нуклеотидов 16, а аминокислот 20. Следовательно, если бы код включал даже по два нуклеотида, то это вызвало бы неизбежную путаницу в синтезе определенной белковой молекулы. Отсюда было высказано предположение, что генетический код должен включать не менее трех нуклеотидов, т.е. должен быть тригшетным.

Кодом наследственности или генетическим кодом называется процесс перевода триплетной последовательности нуклеотидов молекулы ДНК в последовательность аминокислот в белковой молекуле. Одним из важнейших свойств генетического кода является его колинеар-ность — четкое соответствие между последовательностями кодонов нуклеиновых кислот и аминокислотами полипептидных цепей.

Важное значение для раскрытия генетического кода имели исследования М.Ниренберга и ДжМаттеи, а затем С.Очоа с сотрудниками, начатые ими в 1961 г. в США. Они разработали метод и экспериментально установили последовательность нуклеотидов в кодонах м-РНК, контролирующая местоположение данной аминокислоты в полипептидной цепи.

В бесклеточную среду, содержащую все аминокислоты, рибосомы, т-РНК, АТФ и ферменты, Ниренберг и Маттеи вводили искусственно синтезированный биополимер типа м-РНК, представляющий собой цепочку одинаковых нуклеотидов - УУУ-УУУ-УУУ... Биополимер кодировал синтез полипептидной цепи, содержащей только одну аминокислоту -фенилаланин; такая цепь называется полифенилаланином. Если м-РНК состояла из кодонов, содержащих нуклеотиды с азотистым основанием цитозин, то синтезируется полипептидная цепь, содержащая аминокислоту пролин, - полипролин.

В дальнейшем исследователи получали искусственные полимеры типа м-РНК, содержавшие, помимо урацила, одно или два других основания А, Г или Ц в разных пропорциях. Они наблюдали, что в зависимости от второго основания и его соотношения с У получаемые полипептиды включали, помимо фенил аланина, какую-нибудь другую аминокислоту или даже две их. Аналогичное явление наблюдалось и при замене урацила А, Г или Ц. Из 20 аминокислот 18 оказались закодированными одним или двумя основаниями и только две требовали для включения в полипептид три основания. Следовательно, представление о триплетности кода этими опытами было доказано. Для трех нуклеотидов, обусловливающих включение той или иной аминокислоты в молекулу белка, был предложен термин «кодон»-происходящий от слова «код».

Следующим этапом расшифровки генетического кода было изучение последовательности оснований в кодоне. Ведь первыми исследованиями было установлено лишь то, какие основания входят в состав кодона, но, например, при составе кодона 2ГУ основания в нем могут располагаться в последовательности 11 У, ГУТ или УТТ, что будет влиять на включение той или иной аминокислоты.

Большие и тонкие исследования в указанном направлении были проведены Нирнбергом и его сотрудниками; они использовали для этой цели метод, основанный на том, что первая стадия синтеза белка в рибосомах заключается в присоединении т-РНК, несущих ту или иную аминокислоту, к определенному кодону м-РНК. Оказалось, что для такой связи не обязательно нужна целая молекула м-РНК: достаточно использовать состоящие их трех оснований соединения, в котором их последовательность легко точно установить.

В результате этих исследований и работ других ученых, устанавливавших последовательность оснований в кодоне путем изучения мутационных изменений в структурах белков, последовательность оснований в кодонах уже в 1965 г. была выявлена. Из 64 кодонов, возможных при комбинации трех оснований, 61 определяют включение в молекулу полипептида соответствующей аминокислоты, а три определяют конец трансляции (своего рода запятые при синтезе белков). К ним не присоединяется ни одна т-РНК, и в синтезе полипептидной цепи они не участвуют.

1.Генетический код вырожденный, т.е. одна иминокислота может кодироваться несколькими (от одного до 6) кодонами. Только две аминокислоты кодируются одним триплетом-метионин (ЛУГ) и триптофан (УП).

2.Генетический код не перекрывающийся. Нуклеотидная последовательность считывается подряд в одном направлении, триплет за триплетом, т.е. молекула т-РНК, несущая одну аминокислоту, занимает один триплет молекулы м-РНК, вторая соседний и т.д.

3.Генетический код универсален — един для всех организмов (вирусов, бактерий,растений, животных и человека), т.еу всех организмов для определенных аминокислот кодоны одинаковы

Вместе с тем следует отметить, что это не означает, что у всех организмов всегда функционируют все кодоны. Имеют ли они какой-либо «смысл» для данного вида или «бессмысленны», т.е. используются ли они или не используются при синтезе белков, зависит от состава т-РНК, который у представителей разных видов может быть неодинаковым. Дело в том, что каждому кодону соответствует определенная т-РНК, комплементарная по одному триплету, соответствующему кодону, к которому она и присоединяется, ставя в цепь полипептида соответствующую аминокислоту.

Если у данного вида отсутствует т-РНК, соответствующая по своему строению, например, кодону УГТ, то для этого вида он становится «бессмысленным», т.к. в белковом синтезе не участвует. Наряду с такими «бессмысленными» лишь для определенных видов кодонами, имеется три кодона, которые «бессмысленны» для всех видов УАА, УАГ и УГА. Они играют большую роль при синтезе полипептидной цепи на молекуле м-РНК, включающей несколько генов, являясь своего рода точками, на которых прекращается синтез одной полипептидной цепи, после чего начинается синтез другой. Возможно, что эти кодоны имеют значение и для процесса транскрипции, указывая место начала гена в молекуле ДНК.

4.Код триплетный. Местоположение каждой аминокислоты кодируется сочетанием строго определенных трех нуклеотидов в м-РНК, образующих один специфический кодон.

5.Кодон АУТ, находящийся в начале и-РНК является инициатором синтеза полипептидной цепи. Если данный кодон находится в середине м-РНК, то он кодирует аминокислоту метионин.

б.Кодоны УАГ («амбер»), УАА («охра») и УГА («опал») являются терминаторами (стоп-сигналами) синтеза. Когда считывание генетической информации в м-РНК доходит до одного из этих кодонов, дальнейший синтез прекращается и полипептидная цепь отделяется от рибосомы.

Следовательно, в каждой клетке в молекулах ДНК закодирована вся генетическая информация, которая может быть реализована в онтогенезе через биосинтез в виде биохимических процессов, физиологических свойств и морфологических признаков.

Просмотров: 84 

Еще материалы

  •  Регуляция активности генов
  •  Современное представление о строении и функции гена
  •  Реализация наследственной информации
  •  Нуклеиновые кислоты

Популярные материалы

  •  Особенности анатомии собаки
  •  Желудочное пищеварение у жвачных животных
  •  Краткая история физиологии
  •  Физиологические свойства сердечной мышцы

Анонс: Тоны сердца
Работа сердца сопровождается рядом механических, звуковых, электрических и некоторых других явлений, характеризующих динамику сокращений сердечной мышцы, кровенаполнения его полостей, звукам клапанов и др.Звуковые явления, которыми сопровождается работа сердца, называют тонами сердца, их легко прослушать, если приложить к грудной клетке ухо или специальный прибор – фонендоскоп. Для прослушивания сердечных звуков и отдельных структур сердца применяют и наиболее чувствительный ультразвуковой способ.Первый тон возникает в начале систолы желудочков (систолический), он более глухой, протяжный и низкий; второй тон слышен в начале диастолы желудочков (диастолический), он более короткий и резкий, напоминающий звук «дукх» Происхождение первого тона связано с колебательными движениями натянутых створок атрио-вентрикулярных клапанов и сухожильных нитей, прикрепленных к ним, а также с сокращением всей массы мышечных волокон. Второй тон вызывается захлопыванием полулунных клапанов сердца в момент начинающейся диастолы желудочков, когда давление в них становится ниже, чем в аорте и легочной артерии.Третий тон возникает вследствие вибрации стенок желудочков в начале фазы их наполнения кровью; четвертый тон двухкомпонентный, образуется в результате расслабления предсердий и падения давления в них, когда кровь устремляется из желудочков в предсердия.Исследование тонов сердца с помощью чувствительного микрофона, соединенного с осциллографом, дает возможность графически зарегистрировать оба тона сердца. Этим способом удается уловить не только два первых тона, но также третий и четвертый тоны.В результате изменения формы сердца (от зллипсоидной до круглой) возникает сердечный толчок.Плотность стенок желудочков резко возрастает, и стенка сердца ударяет и надавливает на грудную клетку.Сердечные толчки хорошо ощущаются рукой при прикладывании ладони или пальцев к груди в области расположения сердца.У всех сельскохозяйственных животных они определяются легко, но особенно сильные толчки сердца у слонов. Изменения контуров сердца и аорты хорошо видны на экране рентгеновского аппарата (рентгеноскопия

Свойство генетического кода. Триплет. Кодоны. Структура генетического кода.

Действительно в начале 60-х годов XX в. было показано, что последовательность нуклеотидов ДНК является кодом для построения всех белков организма (в действительности не только белков, но и разных типов РНК). Были также изучены свойства генетического кода (табл. 3.1).

Сначала теоретически, а потом и экспериментально с помощью анализа мутаций у разных организмов, в том числе мутаций в гене бета-глобиновой цепи гемоглобина человека, а также биохимическими методами, установили, что код является триплетным. Это означает, что - каждая аминокислота кодируется тройкой нуклеотидов.

Действительно, так как для построения белков используется 20 различных аминокислот, то код не может быть однонуклеотидным, поскольку существует всего 4 нуклеотида. Код не может быть также динуклеотидным: так как возможно всего 16 комбинаций из 2 нуклеотидов. При 3 нуклеотидах число комбинаций возрастает до 64, и этого вполне достаточно, чтобы кодировать 20 различных аминокислот. Кроме того, из этого также следует, что генетический код должен быть вырожденным, т.е. что одна аминокислота может кодироваться более чем одной тройкой нуклеотидов.

Еще одним важным свойством генетического кода является то, что он неперекрывающийся, т.е. каждую последовательно новую аминокислоту полипептидной цепи кодирует последовательно новый триплет ДНК.

Генетический код не содержит знаков препинания, и кодирующие триплеты следуют один за другим.

Генетический код является универсальным и используется одинаково как прокариотами, так и эукариотами.

Кодирующие триплеты нуклеотидов получили название кодонов.

- Читать далее "Триплетные коды ДНК. Кодоны. Стоп-кодоны."

Репликация (самоудвоение) ДНК – это один из важнейших биологических процессов, обеспечивающих воспроизведение генетической информации. В результате репликации одной молекулы ДНК образуется две новые молекулы, которые являются точной копией исходной молекулы – матрицы. Каждая новая молекула состоит из двух цепей – одной из родительских и одной из сестринских. Такой механизм репликации ДНК называется полуконсервативным.

Реакции, в которых одна молекула гетерополимера служит матрицей (формой) для синтеза другой молекулы гетерополимера с комплементарной структурой, называются реакциями матричного типа. Если в ходе реакции образуются молекулы того же вещества, которое служит матрицей, то реакция называется автокаталитической. Если же в ходе реакции на матрице одного вещества образуются молекулы другого вещества, то такая реакция называется гетерокаталитической. Таким образом, репликация ДНК (то есть синтез ДНК на матрице ДНК) является автокаталитической реакцией матричного синтеза.

К реакциям матричного типа относятся, в первую очередь, репликация ДНК (синтез ДНК на матрице ДНК), транскрипция ДНК (синтез РНК на матрице ДНК) и трансляция РНК (синтез белков на матрице РНК). Однако существуют и другие реакции матричного типа, например, синтез РНК на матрице РНК и синтез ДНК на матрице РНК. Два последних типа реакций наблюдаются при заражении клетки определенными вирусами. Синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция) широко используется в генной инженерии.

Все матричные процессы состоят из трех этапов: инициации (начала), элонгации (продолжения) и терминации (окончания).

Репликация ДНК – это сложный процесс, в котором принимает участие несколько десятков ферментов. К важнейшим из них относятся ДНК-полимеразы (несколько типов), праймазы, топоизомеразы, лигазы и другие. Главная проблема при репликации ДНК заключается в том, что в разных цепях одной молекулы остатки фосфорной кислоты направлены в разные стороны, но наращивание цепей может происходить только с того конца, который заканчивается группой ОН. Поэтому в реплицируемом участке, который называется вилкой репликации, процесс репликации протекает на разных цепях по-разному. На одной из цепей, которая называется ведущей, происходит непрерывный синтез ДНК на матрице ДНК. На другой цепи, которая называется запаздывающей, вначале происходит связывание праймера – специфического фрагмента РНК. Праймер служит затравкой для синтеза фрагмента ДНК, который называется фрагментом Оказаки. В дальнейшем праймер удаляется, а фрагменты Оказаки сшиваются между собой в единую нить фермента ДНК–лигазы. Репликация ДНК сопровождается репарацией – исправлением ошибок, неизбежно возникающих при репликации. Существует множество механизмов репарации.

 

Рибонуклеиновая кислота (РНК) – это нуклеиновая кислота,  мономерами которой являются рибонуклеотиды.

В пределах одной молекулы РНК имеется несколько участков, которые комплементарны друг другу. Между такими комплементарными участками образуются водородные связи. В результате в одной молекуле РНК чередуются двуспиральные и односпиральные структуры, и общая конформация молекулы напоминает клеверный лист на черешке.

Азотистые основания, входящие в состав РНК, способны образовывать водородные связи с комплементарными основаниями и ДНК, и РНК. При этом азотистые основания образуют пары А=У, А=Т и Г≡Ц. Благодаря этому возможна передача информации от ДНК к РНК, от РНК к ДНК и от РНК к белкам.

В клетках обнаруживается три основных типа РНК, выполняющих различные функции:

1. Информационная, или матричная РНК (иРНК, или мРНК). Составляет 5% клеточной РНК. Служит для передачи генетической информации от ДНК на рибосомы при биосинтезе белка. В эукариотических клетках иРНК (мРНК) стабилизирована с помощью специфических белков. Это делает возможным продолжение биосинтеза белка даже в том случае, если ядро неактивно.

2. Рибосомная, или рибосомальная РНК (рРНК). Составляет 85% клеточной РНК. Входит в состав рибосом, определяет форму большой и малой рибосомных субъединиц, обеспечивает контакт рибосомы с другими типами РНК.

3. Транспортная РНК (тРНК). Составляет 10% клеточной РНК. Транспортирует аминокислоты к соответствующему участку иРНК в рибосомах. Каждый тип тРНК транспортирует определенную аминокислоту.

В клетках имеются и другие типы РНК, выполняющие вспомогательные функции.

Все типы РНК образуется в результате реакций матричного синтеза. В большинстве случаев матрицей служит одна из цепей ДНК. Таким образом, синтез РНК на матрице ДНК является гетерокаталитической реакцией матричного типа. Этот процесс называется транскрипцией и контролируется определенными ферментами – РНК–полимеразами (транскриптазами).

 

2. Основные этапы биосинтеза белков

Биосинтез белков в клетках представляет собой последовательность реакций матричного типа, в ходе которых последовательная передача наследственной информации с одного типа молекул на другой приводит к образованию полипептидов с генетически обусловленной структурой.

Биосинтез белков представляет собой начальный этап реализации, или экспрессии генетической информации. К главным матричным процессам, обеспечивающим биосинтез белков, относятся транскрипция ДНК и трансляция мРНК.

Транскрипция ДНК заключается в переписывании информации с ДНК на иРНК (информационную РНК).

Трансляция мРНК (матричной РНК) заключается в переносе информации с мРНК на полипептид. Последовательность матричных реакций при биосинтезе белков можно представить в виде схемы.

 

нетранскрибируемая цепь ДНК

А Т Г

Г Г Ц

Т А Т

транскрибируемая цепь ДНК

Т А Ц

Ц Ц Г

А Т А

транскрипция ДНК

ß

ß

ß

кодоны мРНК

А У Г

Г Г Ц

У А У

трансляция мРНК

ß

ß

ß

антикодоны тРНК

У А Ц

Ц Ц Г

А У А

аминокислоты белка

метионин

глицин

тирозин

 

На схеме видно, что генетическая информация о структуре белка хранится в виде последовательности триплетов ДНК. При этом лишь одна из цепей ДНК служит матрицей для транскрипции (такая цепь называется транскрибируемой). Вторая цепь является комплементарной по отношению к транскрибируемой и не участвует в синтезе мРНК.

Молекула мРНК служит матрицей для синтеза полипептида на рибосомах. Триплеты мРНК, кодирующие определенную аминокислоту,  называются кодоны

. В трансляции принимают участие молекулы тРНК. Каждая молекула тРНК содержит антикодон – распознающий триплет, в котором последовательность нуклеотидов комплементарна по отношению к определенному кодону мРНК. Каждая молекула тРНК способна переносить строго определенную аминокислоту. Соединение тРНК с аминокислотой называется аминоацил–тРНК.

Молекула тРНК по общей конформации напоминает клеверный лист на черешке. «Вершина листа» несет антикодон. Существует 61 тип тРНК с разными антикодонами. К «черешку листа» присоединяется аминокислота (существует 20 аминокислот, участвующих в синтезе полипептида на рибосомах). Каждой молекуле тРНК с определенным антикодоном соответствует строго определенная аминокислота. В то же время, определенной аминокислоте обычно соответствует несколько типов тРНК с разными антикодонами. Аминокислота ковалентно присоединяется к тРНК с помощью ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз. Эта реакция называется аминоацилированием тРНК.

На рибосомах к определенному кодону мРНК с помощью специфического белка присоединяется антикодон соответствующей молекулы аминоацил-тРНК. Такое связывание мРНК и аминоацил-тРНК называется кодонзависимым. На рибосомах аминокислоты соединяются между собой с помощью пептидных связей, а освободившиеся молекулы тРНК уходят на поиски свободных аминокислот.

 

Рассмотрим подробнее основные этапы биосинтеза белков.

1 этап. Транскрипция ДНК. На транскрибируемой цепи ДНК с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы достраивается комплементарная цепь иРНК. Молекула иРНК   является точной копией нетранскрибируемой цепи ДНК с той разницей, что вместо дезоксирибонуклеотидов в ее состав входят рибонуклеотиды, в состав которых вместо тимина входит урацил. 

2 этап. Процессинг (созревание) иРНК. Синтезированная молекула мРНК (первичный транскрипт) подвергается дополнительным превращениям. В большинстве случаев исходная молекула мРНК разрезается на отдельные фрагменты. Одни фрагменты – интроны – расщепляются до нуклеотидов, а другие – экзоны – сшиваются в зрелую мРНК.

Процесс соединения экзонов «без узелков» называется сплайсинг.

Сплайсинг характерен для эукариот и архебактерий, но иногда встречается и у прокариот. Существует несколько видов сплайсинга.

Сущность альтернативного сплайсинга заключается в том, что одни и те же участки исходной мРНК могут быть и интронами, и экзонами. Тогда одному и тому же участку ДНК соответствует несколько типов зрелой мРНК и, соответственно, несколько разных форм одного и того же белка.

 Сущность транс–сплайсинга заключается в соединение экзонов, кодируемых разными генами (иногда даже из разных хромосом), в одну зрелую молекулу мРНК.

 

3 этап. Трансляция мРНК. Трансляция (как и все матричные процессы) включает три стадии: инициацию (начало), элонгацию (продолжение) и терминацию (окончание). 

Инициация. Сущность инициации заключается в образовании пептидной связи между двумя первыми аминокислотами полипептида.

Первоначально образуется инициирующий комплекс, в состав которого входят: малая субъединица рибосомы, специфические белки (факторы инициации) и специальная инициаторная метиониновая тРНК с аминокислотой метионином  – Мет–тРНКМет. Инициирующий комплекс узнает начало мРНК, присоединяется к ней и скользит до точки инициации (начала) биосинтеза белка: в большинстве случаев это стартовый кодон АУГ. Между стартовым кодоном мРНК и антикодоном метиониновой тРНК происходит кодонзависимое связывание с образованием водородных связей. Затем происходит присоединение большой субъединицы рибосомы.

При объединении субъединиц образуется целостная рибосома, которая несет два активных центра (сайта): А–участок (аминоацильный, который служит для присоединения аминоацил-тРНК) и Р–участок (пептидилтрансферазный, который служит для образования пептидной связи между аминокислотами).

Первоначально Мет–тРНКМет находится на А–участке, но затем перемещается на Р–участок. На освободившийся А–участок поступает аминоацил-тРНК с антикодоном, который комплементарен кодону мРНК, следующему за кодоном АУГ. В нашем примере это Гли–тРНКГли с антикодоном ЦЦГ, который комплементарен кодону ГГЦ. В результате кодонзависимого связывания между кодоном мРНК и антикодоном аминоацил-тРНК образуются водородные связи. Таким образом, на рибосоме рядом оказываются две аминокислоты, между которыми образуется пептидная связь. Ковалентная связь между первой аминокислотой (метионином) и её тРНК разрывается.

После образования пептидной связи между двумя первыми аминокислотами рибосома сдвигается на один триплет. В результате происходит транслокация (перемещение) инициаторной метиониновой тРНКМет за пределы рибосомы. Водородная связь между стартовым кодоном и антикодоном инициаторной тРНК разрывается. В результате свободная тРНКМет отщепляется и уходит на поиск своей аминокислоты.

Вторая тРНК вместе с аминокислотой (в нашем примере Гли–тРНКГли) в результате транслокации оказывается на Р–участке, а А–участок освобождается.

Элонгация. Сущность элонгации заключается в присоединении последующих аминокислот, то есть в наращивании полипептидной цепи. Рабочий цикл рибосомы в процессе элонгации состоит из трех шагов: кодонзависимого связывания мРНК и аминоацил-тРНК на А–участке, образования пептидной связи между аминокислотой и растущей полипептидной цепью и транслокации с освобождением А–участка.

На освободившийся А–участок поступает аминоацил-тРНК с антикодоном, соответствующим следующему кодону мРНК (в нашем примере это Тир–тРНКТир с антикодоном АУА, который комплементарен кодону УАУ).

На рибосоме рядом оказываются две аминокислоты, между которыми образуется пептидная связь. Связь между предыдущей аминокислотой и её тРНК (в нашем примере между глицином и тРНКГли) разрывается.

Затем рибосома смещается еще на один триплет, и в результате транслокации тРНК, которая была на Р–участке (в нашем примере тРНКГли), оказывается за пределами рибосомы и отщепляется от мРНК. А–участок освобождается, и рабочий цикл рибосомы начинается сначала.

Терминация. Заключается в окончании синтеза полипептидной цепи.

В конце концов, рибосома достигает такого кодона мРНК, которому не соответствует ни одна тРНК (и ни одна аминокислота). Существует три таких нонсенс–кодона: УАА («охра»), УАГ («янтарь»), УГА («опал»). На этих кодонах мРНК рабочий цикл рибосомы прерывается, и наращивание полипептида прекращается. Рибосома под воздействием определенных белков вновь разделяется на субъединицы.

 

Модификация белков. Как правило, синтезированный полипептид подвергается дальнейшим химическим превращениям. Исходная молекула может разрезаться на отдельные фрагменты; затем одни фрагменты сшиваются, другие гидролизуются до аминокислот. Простые белки могут соединяться с самыми разнообразными веществами, образуя гликопротеины, липопротеины, металлопротеины, хромопротеины и другие сложные белки. Кроме того, аминокислоты уже в составе полипептида могут подвергаться химическим превращениям. Например, аминокислота пролин, входящая в состав белка проколлагена, окисляется до гидроксипролина. В результате из проколлагена образуется коллаген – основной белковый компонент соединительной ткани. 

Реакции модификации белков не являются реакциями матричного типа. Такие биохимические реакции называются ступенчатыми реакциями.

 

Энергетика биосинтеза белков. Биосинтез белков – очень энергоемкий процесс. При аминоацилировании тРНК затрачивается энергия одной связи молекулы АТФ, при кодонзависимом связывании аминоацил-тРНК – энергия одной связи молекулы ГТФ, при перемещении рибосомы на один триплет – энергия одной связи еще одной молекулы ГТФ. В итоге на присоединение аминокислоты к полипептидной цепи затрачивается около 90 кДж/моль. При гидролизе же пептидной связи высвобождается лишь 2 кДж/моль. Таким образом, при биосинтезе большая часть энергии безвозвратно теряется (рассеивается в виде тепла).

 

Генетический код, его основные свойства

В ходе реакций матричного синтеза на основании генетического кода синтезируется полипептид с наследственно обусловленной структурой. Отрезок ДНК, содержащий информацию о структуре определенного полипептида, называется ген.

Однако, ген – это не просто участок ДНК, а единица наследственной информации, носителем которой являются нуклеиновые кислоты. Установлено, что ген имеет сложную структуру.

В большинстве случаев кодирующие участки (экзоны) разделены некодирующими (интронами). В то же время, благодаря альтернативному сплайсингу, деление участка ДНК на кодирующие и некодирующие оказывается условным. Некоторые участки ДНК могут перемещаться относительно друг друга – их называют мобильными генетическими элементами (МГЭ). Многие гены представлены несколькими копиями – тогда один и тот же белок кодируется разными участками ДНК. Еще сложнее закодирована генетическая информация у вирусов. У многих из них обнаружены перекрывающиеся гены: один и тот же участок ДНК может транскрибироваться с разных стартовых точек.

Процесс экспрессии генов обладает гибкостью: одному участку ДНК может соответствовать несколько полипептидов; один полипептид может кодироваться разными участками ДНК. Окончательная модификация белков происходит с помощью ферментов, которые кодируются различными участками ДНК.

 

Общие свойства генетического кода

Отражение одних объектов с помощью других называется кодированием. Отражение структуры белков в виде триплетов ДНК называется кодом ДНК, или генетическим кодом. Благодаря генетическому коду устанавливается однозначное соответствие между нуклеотидными последовательностями нуклеиновых кислот и аминокислотами, входящими в состав белков. Генетический код обладает следующими основными свойствами:

1. Генетический код триплетен: каждая аминокислота кодируется триплетом нуклеотидов  ДНК и соответствующим триплетом иРНК. При этом кодоны ничем не отделены друг от друга (отсутствуют «запятые»).

2. Генетический код является избыточным (вырожденным): почти все аминокислоты могут кодироваться разными кодонами. Только двум аминокислотам соответствует по одному кодону: метионину (АУГ) и триптофану (УГГ). Зато лейцину, серину и аргинину соответствует по 6 разных кодонов.

3. Генетический код является неперекрывающимся:  каждая пара нуклеотидов принадлежит только одному кодону (исключения обнаружены у вирусов).

4. Генетический код един для подавляющего большинства биологических систем. Однако имеются и исключения, например, у инфузорий и в митохондриях разных организмов. Поэтому генетический код называют квазиуниверсальным.

 

3. Регуляция экспрессии генов

3.1. Общие принципы регуляции экспрессии генов

Активность генов определяется объемом генопродуктов (РНК и белков). Степень активности генов называется их экспрессией. 

Все гены клетки (и целостного организма) можно разделить на две группы: регуляторные и структурные. Регуляторные гены не транскрибируются, т.е. в обычных условиях им не соответствует ни один из типов РНК. Структурные гены способны транскрибироваться с образованием РНК (матричной, рибосомальной, транспортной). В свою очередь, структурные гены делятся на конститутивные и индуцибельные. 

Конститутивные гены постоянно включены: они функционируют на всех стадиях онтогенеза и во всех тканях. К конститутивным относятся гены, обслуживающие матричные процессы (кодирующие тРНК, рРНК, ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, рибосомальные белки), гены, кодирующие обязательные структурные компоненты клетки (например, белки-гистоны), гены, контролирующие постоянно протекающие обменные процессы (например, гликолиз). Иначе говоря, это «гены домашнего хозяйства», без которых клетки не могут существовать.

Индуцибельные гены функционируют в разных тканях на определенных этапах онтогенеза, они могут включаться и выключаться, их активность может регулироваться по принципу «больше или меньше». Это тканеспецифичные гены, или «гены роскоши». К индуцибельным генам относятся как гены, контролирующие ход онтогенеза (переключатели, или диспетчеры), так и гены, прямо определяющие структуру и функции компонентов клетки и целостного организма.

(Нужно отметить, что строгой разницы между перечисленными группами генов не существует, поскольку один и тот же участок ДНК может выполнять разные функции.)

Существуют индуцибельные гены, в норме включенные, и гены, в норме выключенные. Включение нормально выключенных индуцибельных генов называется индукцией, выключение нормально включенных – репрессией. 

Регуляцию активности генов осуществляют молекулярно-генетические системы управления. На индукцию и репрессию могут влиять самые разнообразные факторы, которые называются эффекторами. Одни из них прямо закодированы в геноме организма (например, белки теплового шока; см. ниже), другие образуются как промежуточные продукты обмена веществ, третьи поступают в клетку извне в готовом виде из внешней среды или из других клеток (тканей) организма, четвертые образуются в клетке под влиянием физических факторов (экстремальных температур, ультрафиолета) и т.д. Особую группу эффекторов составляют белки теплового шока, которые синтезируются в клетке при различных видах стресса (при повышении температуры, при воздействии других неблагоприятных факторов). Эти белки эволюционно консервативны, они обнаружены у самых различных организмов; вероятно, они являются универсальными эффекторами.

Именно регуляцией активности генов объясняется тот факт, что, несмотря на идентичность генотипов клеток многоклеточного организма, они значительно различаются по строению и функции. Переключение синтеза с одних белков на другие лежит в основе всякого развития, будь то репродукция вирусов в зараженных клетках, рост и спорообразование у бактерий, развитие эмбрионов или дифференцировка тканей. На каждом этапе этих процессов синтезируются специфичные белки.

Известно несколько типов механизмов, с помощью которых один и тот же набор генов в неодинаковых условиях жизнедеятельности организма и на разных стадиях развития детерминирует синтез белков. Регуляция экспрессии (выражения) генов может осуществляться на нескольких уровнях: генном, транскрипционном, трансляционном и функциональном. Первый из них связан с изменением количества или локализации генов, контролирующих данный признак. Второй определяет, какие и сколько мРНК должны синтезироваться в данный момент. Третий обеспечивает отбор мРНК, транслирующихся на рибосомах. Четвертый связан с аллостерической регуляцией активности ферментов. Наконец, контроль действия генов может осуществляться путем посттрансляционной модификации полипептидов, посттранскрипционной модификации мРНК, и другими путями.

Прежде чем детально проанализировать перечисленные механизмы регуляции экспрессии генов, рассмотрим подробнее транскрипционный уровень регуляции, в отношении которого имеется большое число данных, полученных главным образом на бактериях.

 

3.2. Регуляция экспрессии генов у прокариот

Переключение генов лучше всего изучено у прокариот (бактерий). Рассмотрим механизмы регуляции активности генов на примере лактозного оперона кишечной палочки (Escherichia coli) – классического объекта генетики микроорганизмов. Единицей регуляции экспрессии генов у прокариот является оперон.

Оперон – это участок бактериальной хромосомы, включающий следующие участки ДНК:  Р – промотор, О – оператор, Z, Y, А – структурные гены, Т – терминатор. (В состав других оперонов может входить до 10 структурных генов и более.)

Промотор – это регуляторный участок ДНК, который служит для присоединения РНК-полимеразы к молекуле ДНК. В лактозном опероне присоединение РНК-полимеразы происходит с помощью комплекса CAP-цАМФ (CAP – это специфический белок; в свободной форме является неактивным активатором, цАМФ – циклоаденозинмонофосфат – циклическая форма аденозинмонофосфорной кислоты).

Оператор – это регуляторный Структурные гены кодируют три фермента, необходимые для расщепления лактозы (молочного сахара) на глюкозу и галактозу. Молочный сахар лактоза – менее ценный продукт питания, чем глюкоза, поэтому в присутствии глюкозы сбраживание лактозы является невыгодным для бактерии процессом. Однако при отсутствии глюкозы бактерия вынуждена переходить на питание лактозой, для чего синтезирует соответствующие ферменты Z (β-галактозидазу), Y (галактозидпермеазу), А (тиогалактозидтрансацетилазу).

Терминатор – это регуляторный участок ДНК, который служит для отсоединения РНК-полимеразы после окончания синтеза мРНК, соответствующей ферментам Z, Y, А, необходимым для усвоения лактозы. 

участок ДНК, который способен присоединять белок-репрессор, который кодируется соответствующим геном lac. Если репрессор присоединен к оператору, то РНК-полимераза не может двигаться вдоль молекулы ДНК и синтезировать мРНК.

Для регуляции работы оперона необходим ген cya, кодирующий белок CYA, который катализирует образование цАМФ из АТФ, Если в клетке имеется глюкоза, то белок CYA вступает с ней в реакцию и переходит в неактивную форму. Таким образом, глюкоза блокирует синтез цАМФ и делает невозможным присоединение РНК-полимеразы к промотору. Следовательно, глюкоза является репрессором лактозного оперона.

Если же в клетке имеется лактоза, то она взаимодействует с белком-репрессором и превращает его в неактивную форму. Белок-репрессор, связанный с лактозой, не может присоединиться к оператору и не преграждает путь РНК-полимеразе. Таким образом, лактоза является индуктором лактозного оперона.

Предположим, что первоначально в клетке имеется только глюкоза. Тогда белок-репрессор присоединен к оператору, а РНК-полимераза не может присоединиться к промотору. Оперон не работает, структурные гены выключены.

При появлении в клетке лактозы и при наличии глюкозы белок-репрессор отщепляется от оператора и открывает путь РНК-полимеразе. Однако РНК-полимераза не может присоединиться к промотору, поскольку глюкоза блокирует синтез цАМФ. Оперон по-прежнему не работает, структурные гены выключены.

Если же в клетке имеется только лактоза, то белок-репрессор связывается с лактозой, отщепляется и открывает путь РНК-полимеразе. В отсутствии глюкозы белок CYA катализирует синтез цАМФ, и РНК-полимераза присоединяется к промотору. Структурные гены включаются, РНК-полимераза синтезирует мРНК, с которой транслируются ферменты, обеспечивающие сбраживание лактозы.

Таким образом, лактозный оперон находится под двойным контролем индуктора (лактозы) и репрессора (глюкозы).

Общие принципы регуляции активности генов

Кроме лактозного оперона, у кишечной палочки хорошо изучены и другие опероны: триптофановый (trp), гистидиновый (his) и другие.

Общие принципы регуляции активности генов в оперонах разработали Франсуа Жакоб и Жак Моно (1961; Нобелевская премия 1965). Согласно концепции Жакоба–Моно, единицей регуляции активности генов у прокариот является оперон. Транскрипция группы структурных генов, регулируется двумя элементами – геном-регулятором и оператором. Оператор часто локализуется между промотором и структурными генами; ген-регулятор может локализоваться рядом с опероном или на некотором расстоянии от него.

Если продуктом гена-регулятора является белок-репрессор, его присоединение к оператору блокирует транскрипцию структурных генов, препятствуя присоединению РНК-полимеразы к специфичному участку – промотору, необходимому для инициации транскрипции. Напротив, если белком-регулятором служит активный апоиндуктор, его присоединение к оператору создает условия для инициации транскрипции. В регуляции работы оперонов участвуют также низкомолекулярные вещества – эффекторы, выступающие как индукторы либо корепрессоры структурных генов, входящих в состав оперонов.

Различают индуцируемые (включаемые) и репрессируемые (выключаемые) опероны в зависимости от типа влияния на их работу молекул-эффекторов.

У индуцируемых оперонов эффектор присоединяется к белку-репрессору и блокирует его связывание с оператором, препятствуя транскрипции структурных генов. Такой тип регуляции работы оперона называют негативным. При негативном контроле эффектор, являющийся корепрессором, присоединяется к неактивному репрессору и активирует его. В результате репрессор приобретает способность присоединяться к оператору и тем самым блокировать транскрипцию оперона. Таким образом, при негативном контроле эффектор связывается с репрессором, что приводит к его инактивации либо активации и соответственно индуцирует либо репрессирует транскрипцию оперона.

Наряду с этим, индуцируемые опероны могут находиться под позитивным контролем регуляции, при котором эффектор связывается с регуляторным белком и активирует его. Активный апоиндуктор присоединяется к оператору, что обеспечивает возможность транскрипции оперона. Оба типа контроля регуляции действуют и в отношении репрессируемых оперонов. При позитивном контроле функционирования репрессируемого оперона корепрессор связывается с активным апоиндуктором. Такой комплекс не может присоединяться к оператору, и структурные гены не транскрибируются. При позитивном контроле эффектор присоединяется не к репрессору, а к апоиндуктору, что разрешает, или, напротив, блокирует транскрипцию в зависимости от того, какую форму (активную или неактивную) приобретает апоиндуктор в результате связывания с эффектором. Поскольку при транскрипции оперона, состоящего из нескольких структурных генов, образуется один общий транскрипт в виде молекулы полицистронной мРНК, все эти гены экспрессируются координировано.

 

Особые типы регуляции активности генов

У прокариот процессы транскрипции (синтез мРНК на матрице ДНК с помощью РНК-полимеразы) и трансляции (синтеза белка на матрице мРНК при участии рибосом и тРНК) тесно связаны между собой: синтез матрицы мРНК еще не закончен, а синтез белка на этой матрице уже начинается. Таким образом, мРНК одновременно связана и с РНК-полимеразой, и с рибосомой.

В результате регуляция активности некоторых оперонов (например, his-оперона) часто связана с активностью специального контролирующего элемента – аттенюатора (от англ. attenuate – ослаблять), представляющего собой лидерный участок ДНК, локализованный в случае his-оперона между оператором и первым структурным геном. В присутствии корепрессора (особым образом модифицированной гистидиновой тРНК) аттенюатор обеспечивает терминацию (обрыв синтеза) мРНК в начале оперона и, таким образом, транскрипции структурных генов не происходит.

Аттенюаторы широко распространены среди прокариот. Однако наряду с аттенюаторами, выполняющими функцию негативно действующего регулятора транскрипции, существует и позитивный регулятор his-оперона, присутствие которого облегчает присоединение РНК-полимеразы к промотору.

Следует добавить, что транскрипция может осуществляться с разных промоторов. Различают сильные промоторы, к которым РНК-полимераза присоединяется сравнительно легко, и слабые промоторы, к которым РНК-полимераза присоединяется только с помощью вспомогательных частиц (их обычно обозначаются символом σ). Чем больше промоторов задействовано в процессе транскрипции, тем больше образуется РНК. Точно также существуют терминаторы с различной степенью сродства к РНК-полимеразе. От одних терминаторов РНК-полимераза отсоединяется без особых затруднений, а от других – с помощью вспомогательных частиц (их обычно обозначают символом ρ).

 

Биологическое значение оперонов.

С одной стороны, оперонная организация дает преимущество с точки зрения регуляции генов, объединенных функционально. Однако оперонная организация не отражает генезиса генов, так как гены в оперонах не являются родственными по происхождению. Поэтому для клетки проблема скорее заключается в том, чтобы дифференцировать действие единой регуляторной системы на каждый отдельный ген.

Объединение функционально близких генов в опероны, видимо, постепенно сложилось в эволюции бактерий по той причине, что у них перенос генетической информации обычно осуществляется небольшими порциями (например, при трансдукции или посредством плазмид). Значение имеет само по себе сцепление функционально родственных генов, что позволяет бактериям приобретать необходимую функцию в один этап.

 

3.3. Регуляция экспрессии генов у высших эукариот

Важнейшая особенность функционально-генетической организации эукариот – отсутствие у них оперонов, подобных оперонам бактерий. Однако промоторные и терминаторные участки у эукариот имеются; более того, они более разнообразны, чем у прокариот. Однако структурные гены, контролирующие последовательные этапы метаболического процесса, могут находиться у эукариот в разных участках одной хромосомы или даже в разных хромосомах. Физико-химический и электронно-микроскопический анализ вновь синтезированной РНК показывает, что она состоит из огромных молекул длиной в несколько десятков тысяч нуклеотидов. Поэтому правильнее говорить о функциональной генетической единице у эукариот как о транскриптоне (Г.П. Георгиев), т. е. участке ДНК, с которого считывается единая непрерывная молекула РНК. Доказано, что в ответ на действие указанных индукторов активируется целая батарея структурных генов, среди которых находятся как гены, кодирующие определенные белки, так и гены рРНК и тРНК.

Наряду с обычными нуклеотидными последовательностями промоторной и терминаторной областей транскрипции у эукариот обнаружены такие специфические элементы регуляции, как усилители (энхансеры), и глушители (сайленсеры).

Энхансеры – это участки ДНК, которые действуют как усилители транскрипции, находясь на расстоянии нескольких сот и даже тысяч пар нуклеотидов от регулируемого гена; в других случаях энхансеры находятся в самих структурные генах в составе интронов. Вероятно, механизм действия энхансеров связан с изменением нуклеосомной структуры хроматина. Сайленсеры – это участки ДНК, которые, располагаясь в нескольких сотнях пар нуклеотидов до или после регулируемого гена, выключает транскрипцию, изменяя структуру хроматина. Существуют мутации, которые не затрагивая сам глушитель, делают его неактивным и тем самым «разрешают» транскрипцию с промотора регулируемого гена.

Существенная особенность генетической регуляции в клетках эукариот заключается в том, что процесс транскрипции зависит от состояния хроматина. В частности локальная компактизация ДНК в её отдельных участках полностью блокирует синтез РНК. Вероятно, это связано с тем, что в такие области не может проникнуть РНК-полимераза.

Сам факт тотальной регуляции действия генов в настоящее время не вызывает сомнений. Активность генов оценивается по числу типов генных продуктов (РНК-вых копий) в цитоплазме. Этот вопрос был исследован на клетках человека линии HeLa – «стандартной» раковой ткани, культивируемой in vitro в течение десятков лет. Геном клеток HeLa считается сильно дерепрессированным, т. е. в них функционирует значительно большее (около 35 тыс.) число генов, чем в обычных соматических клетках, хотя это не означает, что клетки HeLa производят столь же большое количество конечных генных продуктов – полипептидов. Оказалось, что по функциональной активности гены клеток HeLa могут различаться почти на четыре порядка. Так, существует около 10…12 генов, представленных 12…13 тыс. РНК-вых копий, и несколько десятков генов, которым в цитоплазме соответствуют единичные молекулы мРНК.

 

Регуляция активности генов в ходе онтогенеза у эукариот

Клетки различных тканей растений и животных отличаются друг от друга главным образом тем, что в них происходит синтез различных групп белков, что и определяет их структурную и функциональную специфику. Таким образом, проблема генетического контроля индивидуального развития тесно связана с проблемой дифференциальной экспрессии генов. Экспрессия генов зависит от факторов внешней и внутренней среды и, в то же время, находится под контролем генотипа. Например, известны особые гомеозисные гены, контролирующие экспрессию других генов.

Экспрессия генов закономерно изменяется в ходе онтогенеза. В качестве примера рассмотрим изменение структуры гемоглобина у человека. Гемоглобин – тетрамерный белок, в состав которого входят четыре полипептидных цепи и четыре молекулы гема. Каждая молекула гема содержит один атом железа, связывающий одну молекулу кислорода или молекулу углекислого газа. Две полипептидных цепи, входящие в состав одного тетрамера, носят общее название α, а две – общее название β. В целом структура тетрамера описывается формулой α2β2. Однако эта общая формула нуждается в уточнении. Полипептиды типа α представлены двумя подтипами – ζ и а. Оба подтипа кодируются дуплицированными генами, локализованными в 16-й хромосоме, однако гены ζ экспрессируются в раннем эмбриогенезе, а гены α – преимущественно у плодов и у взрослых организмов. Полипептиды типа β представлены подтипами ε, γ, δ, β. Кодирующие их гены расположены в 11-й хромосоме в указанном порядке, который соответствует порядку их экспрессии: ген ε экспрессируется на ранних стадиях развития эмбрионов, γ – у плода, δ – у новорождённых, β – у взрослых. В целом «взрослый» гемоглобин состоит из четырех цепей (двух цепей α и двух цепей β) и описывается формулой α2β2. Однако экспрессия гена δ у взрослого человека полностью не прекращается, и около 1% β-цепей замещено на гемоглобин δ (детский гемоглобин).

 

Регуляция экспрессии генов в ходе онтогенеза осуществляется на различных уровнях: генном, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном (функциональном).

 

1. Регуляция на генном уровне

1.1. Модификация ДНК (замена мажорных «обычных» азотистых оснований – аденина, гуанина, цитозина и тимина – на минорные «редкие» азотистые основания, обычно на метил-цитозин или метил-гуанин). Доказано, что метилирование цитозина существенно влияет на экспрессию генов. Например, активные гены гемоглобина менее метилированы, чем неактивные.

1.2. Увеличение объема ДНК в клетке путем дифференциальной амплификации ДНК или за счет образования политенных хромосом.

Дифференциальная (избирательная, или селективная) амплификация ДНК, которая заключается в многократном копировании отдельных генов, например, генов рРНК. Это явление наблюдается у прокариот, а также у эукариот, например, в ооцитах многих животных, в частности, у амфибий. Амплификация связана с увеличением объема яйца в сотни и тысячи раз. Чтобы заполнить такой огромный объем клетки рибосомами, гены рДНК сами увеличиваются в числе настолько, что, например, у шпорцевой лягушки по окончании амплификации содержание рДНК почти равно количеству ДНК, заключенному в диплоидном наборе хромосом. Число ядрышек (органоидов, контролирующих образование рибосом) возрастает с 2 единиц до 1,5 тыс. Амплификация рРНК происходит и при мегаспорогенезе у растений. (Замечательная особенность молекулярного механизма амплификации заключается в том, что он осуществляется по принципу катящегося кольца – как у прокариот. Одна из копий гена рДНК покидает хромосому, превращается в экстрахромосомную копию, затем замыкается в кольцо, из которого как бы вытягивается хвост длиной в несколько десятков микрометров. Затем эта структура вновь циклизуется, образуя большое кольцо, на основе которого формируется ядрышко.)

Другим механизмом увеличения объема ДНК в клетке является образование политенных хромосом, например, в слюнных железах личинок двукрылых насекомых, в клетках зародышевого мешка Покрытосеменных растений. Частичная политения обнаружена и у млекопитающих: происходит многократное удвоение не всей молекулы ДНК, а только некоторых ее участков.

1.3. Различные случаи программированных количественных изменений ДНК. Примером регуляции, обусловленной транспозицией, служит феномен смены фаз (типа жгутиков) у сальмонелл. Действующий в клетках сальмонелл переключатель содержит промотор, который может изменять свою пространственную ориентацию. В одной ориентации промотор обеспечивает транскрипцию гена Н2, кодирующего синтез жгутиков одного типа, с одновременной репрессией гена H1, кодирующего синтез жгутиков другого типа. В противоположной ориентации промотора ген Н2 не экспрессируется, в то время как экспрессия гена H1 становится возможной.

1.4. Сплайсинг ДНК. Регуляция, связанная со сплайсингом ДНК, изучена на примере генов, кодирующих синтез антител.

Известно, что разнообразные чужеродные вещества – антигены, попадающие в наш организм, – связываются особыми белками – антителами, или иммуноглобулинами. Млекопитающие могут продуцировать до миллиона различных антител, которые вырабатываются Т- и В-лимфоцитами иммунной системы. Существует особый раздел генетики – иммуногенетика,– который изучает генетический контроль иммунного ответа. Основу молекул иммуноглобулинов составляет сложный белок, состоящий из четырех полипептидных цепей – двух тяжелых (Н) и двух легких (L), – связанных дисульфидными мостиками. Оба типа цепей имеют константные (С) и вариабельные (V) участки. Центр связывания антигена образуют вариабельные участки Н- и L-цепей. Механизм объединения константных и вариабельных участков в одной и той же полипептидной цепи подробно изучен. Доказано, что у эмбрионов фрагменты ДНК, кодирующие V- и С-участки, пространственно разделены. При развитии системы иммунитета у позвоночных животных и человека происходит дифференцировка лимфоцитов, в ходе которой гены, кодирующие V- и С-участки, перестраиваются таким образом, что в итоге они оказываются частями одного и того же гена, транскрибируемого как целое. Таким образом, сплайсинг ДНК обеспечивает сшивание консервативных (т.е. постоянно присутствующих) районов этих генов с различными варьирующими. В результате появляется большое число типов антител, поскольку любая консервативная область может быть присоединена к любой варьирующей.

Сплайсинг ДНК можно представить в виде схемы:

 

 

L

I1

V

 

 

J

I2

C

 

ß

 

L

I1

V

J

I2

C

 

 

1.5. Диминуция хроматина. У некоторых организмов (у аскарид, циклопов) в соматических клетках происходит необратимая утрата части генетического материала (от 20 до 80% ДНК). В полном объеме исходная генетическая информация сохраняется только в клетках зародышевого пути, т. е. в клетках, которые дадут в дальнейшем начало половым клеткам. Именно гаметы содержат всю полноту генетической информации данного вида и составляют непрерывный, потенциально бессмертный зародышевый путь. Смертны соматические клетки индивидуумов, представляющих собой как бы ответвления от зародышевого пути, возникающие после оплодотворения. А. Вайсман считал диминуцию хроматина универсальным механизмом дифференцировки клеток и тканей, однако в дальнейшем было показано, что этот способ дифференцировки встречается довольно редко. Например, подобное явление наблюдается у инфузорий: в диплоидном микронуклеусе полностью сохраняется исходный набор генов, а в полиплоидном макронуклеусе ~10% генов (правда, за счет полиплоидизации оставшаяся информация многократно дублируется).

 

1.6. Изменение активности целых хромосом.

Известно, что у самок млекопитающих в кариотипе присутствует две X-хромосомы, а у самцов одна X- и одна Y-хромосома.  Несмотря на то, что женские особи млекопитающих имеют две Х-хромосомы, а мужские – только одну, экспрессия генов Х-хромосомы происходит на одном и том же уровне у обоих полов. Это объясняется тем, что у самок в каждой клетке полностью инактивирована одна Х-хромосома. Эту хромосому можно видеть в интерфазе в форме гетерохроматинового тельца, названного тельцем Барра. Х-хромосома инактивируется на ранней стадии эмбрионального развития, соответствующей времени имплантации. При этом в разных клетках отцовская и материнская Х-хромосомы выключаются случайно. Состояние инактивации данной Х-хромосомы наследуется в ряду клеточных делений. Таким образом, женские особи, гетерозиготные по генам половых хромосом, представляют собой мозаики. Широко известный пример проявления такой мозаичности — черепаховые кошки, имеющие черные и желтые пятна. Эти кошки гетерозиготны по гену СYB (CY – желтый мех, СB – черный мех). Желтые и черные пятна у них развиваются в результате случайной инактивации в раннем эмбриогенезе Х-хромосомы с аллелью СB или CY. Черепаховую окраску почти всегда имеют кошки, если же изредка обнаруживаются коты такой окраски, то они имеют хромосомную конституцию XXY.

 

2. Регуляция на уровне транскрипции

Во многих случаях дифференцировка происходит путем регуляции транскрипции мРНК. Интенсивное функционирование отдельных генов или их блоков соответствует определенным этапам развития и дифференцировки.

При изучении гигантских политенных хромосом (в слюнных железах личинок дрозофил) и петель в хромосомах типа «ламповых щеток» (в ооцитах на стадии профазы I) было установлено, что мРНК синтезируется с разной скоростью в разных участках хромосом, в частности, образование пуфов и петель связано с повышением интенсивности синтеза мРНК.

Динамика образования пуфов. В гигантских политенных хромосомах часто наблюдаются вздутия определенных районов хромосом, обусловленные декомпактизацией отдельных дисков и интенсивным синтезом в них РНК. Эти вздутия называются пуфы (или кольца Бальбиани). Пуфы представляют собой места интенсивного синтеза мРНК. Динамика образования пуфов на гигантских хромосомах в процессе развития двукрылых является отражением смены активности генов. Формирование комплексов пуфов, характерных для клеток отдельных тканей и органов дифференцированного организма, является показателем общего уровня наиболее интенсивно протекающих метаболических процессов в данных клетках. При снижении синтетической активности петли синтезированная мРНК отделяется от хромосомы и пуфы политенных хромосом исчезают.

Установлена роль стероидных гормонов (в частности, экдизона – гормона окукливания) в индукции пуфов, а также роль белков, синтезированных ранними пуфами, в индукции поздних пуфов. Таким образом, стероидные гормоны и белки, вероятно, не единственные факторы, ответственные за переключение генов в онтогенезе, а, следовательно, и за смену фаз индивидуального развития организма. Механизм образования пуфов показан на рис. _____. Доказано, что после введения этого гормона молодым личинкам довольно быстро возникают специфические пуфы, причем продолжительность их образования зависит от количества введенного гормона.

Последовательность образования пуфов изменяется также при воздействиях различными химическими агентами или температурными условиями. Некоторые антибиотики, влияющие на обмен РНК (например, актиномицин), подавляют образование пуфов, а антибиотики, ингибирующие синтез белка (например, пуромицин), не влияют на этот процесс. Следовательно, активность пуфов находится под контролем гормональных факторов (закодированных в генотипе) и факторов внешней среды.

Особенно велика роль стероидных гормонов в регуляции генной активности у животных. Известно, что гормоны синтезируются в специализированных клетках желез внутренней секреции и циркулируют по всему организму. Однако отдельные гормоны активируют гены не во всех клетках, а только в клетках-мишенях, которые содержат специальные рецепторные белки, с которыми специфически связываются молекулы гормона. Это связывание происходит в цитоплазме, а затем образовавшийся комплекс проникает в ядро, где он взаимодействует с определенными негистоновыми белками хромосом. В отсутствие гормонов эти белки блокируют либо промоторные, либо иные, пока неизвестные регуляторные участки определенных генов. Комплекс «гормон – рецепторный белок» снимает блокирующее действие негистонового белка-репрессора, следствием чего являются транскрипция данного гена, созревание мРНК, транспорт ее в цитоплазму и синтез белка.

Образование и функционирование хромосом типа «ламповых щеток». Связь синтетической активности с морфологическими преобразованиями хромосом была установлена при изучении оогенеза у амфибий, в ходе которого образуются хромосомы типа «ламповых щеток» (рис. _____ в конце лекции). Эти хромосомы получили свое название за сходство со щетками, которыми когда-то чистили керосиновые лампы. Они имеют отчетливо выраженное хромомерное (узелковое) строение. Из хромомеров в виде петель вытянуты ДНК-вые оси хромосом. Поскольку хромосомы типа ламповых щеток существуют в диплотене и состоят из четырех хроматид, каждый участок таких хромосом представлен четырьмя хромомерами и четырьмя петлями. Окружение петель представляет собой гранулы и фибриллы, состоящие из вновь синтезированной РНК и белков. Таким образом, петли – это участки хромомера с интенсивной транскрипцией. Обычно в них легко различают тонкий конец, где начинает свое движение РНК-полимераза, и толстый конец, где транскрипция заканчивается. При снижении синтетической активности петли синтезированная РНК отделяется от хромосомы и петля спадает.

Число петель близко к числу типов РНК, присутствующих в цитоплазме. Эта РНК частично используется для синтеза рибосом и белков цитоплазмы яйца. Однако большая часть молекул мРНК, синтезированных хромосомами типа ламповых щеток, используется позже во время раннего эмбриогенеза.

Цитохимическое изучение хромосом типа «ламповых щеток» выявило их функциональное сходство с политенными хромосомами.

 

3. Регуляция на посттранскрипционном уровне: модификации (сплайсинг) мРНК

Регуляция на уровне процессинга РНК обеспечивает возможность образования различных типов зрелой, функционально активной мРНК. Процессинг РНК регулируется с помощью рибозимов (катализаторов рибонуклеиновой природы) и ферментов матураз.

Одной из форм сплайсинга является альтернативный сплайсинг, при котором одному участку ДНК и одному первичному транскрипту (пре-мРНК) может соответствовать несколько типов зрелой мРНК и, соответственно, несколько изотипов (т.е. разных форм) одного и того же белка, например, мышечного белка тропонина. Твердо установлено, что некоторые генетические заболевания человека (фенилкетонурия, некоторые гемоглобинопатии) обусловлены нарушением сплайсинга.

Сплайсинг РНК открыт сравнительно недавно, поэтому достоверных данных по регуляции активности генов на этом уровне недостаточно. Наиболее подробно изучена регуляция генов, контролирующих усвоение галактозы у дрожжей. Показано, что эти системы регуляции действуют как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне. При этом осуществляется многоступенчатая, или каскадная, регуляция, в которой участвуют элементы позитивного и негативного контроля, последовательно регулирующие активность друг друга.

 

4. Регуляция на уровне трансляции

Регуляция на уровне трансляции обусловлена различной активностью разных типов мРНК. Например, у прокариот некоторые мРНК транслируются только в присутствии эритромицина. У эукариот регуляция генной активности на уровне трансляции хорошо прослежена на примере морского ежа. Его неоплодотворенные яйца содержат большое количество «замаскированной» (нетранслируемой) мРНК. У дрозофилы подобные мРНК, кодирующие белки оболочки яйцеклетки, накапливаются в цитоплазме.

 

5. Регуляция на уровне посттрансляционной модификации белков.

Экспрессия генов на уровне посттрансляционной модификации полипептидов регулируется путем посттрансляционной модификацией белков (фосфорилированием, ацетилированием, расщеплением исходной полипептидной цепи на более мелкие фрагменты и т.д.). Например, белковый гормон инсулин, синтезирующийся в клетках поджелудочной железы, образуется в форме препроинсулина, из которого затем путем отщепления «лишних» пептидов образуется проинсулин. Из проинсулина вырезаются две субъединицы, представляющие собой А- и В-цепи инсулина. Эти две цепи сшиваются между собой с помощью дисульфидных мостиков. Четыре образовавшиеся АВ-структуры соединяются в белковый тетрамер, который присоединяет два иона Zn2+, и в результате образуется зрелый инсулин.

Широко распространен механизм регуляции активности ферментов, основанный на присоединении к ним молекул-эффекторов. Чаще всего в роли эффекторов выступают конечные продукты цепей биосинтеза, которые связываются с первым или с одним из первых ферментов данного метаболического пути и подавляют его активность, тем самым выключая всю цепь синтеза. Это ингибирование конечным продуктом, благодаря которому регулируются сразу несколько этапов метаболизма. Конечный продукт связывается с ферментом не в его активном центре, а в аллостерическом центре, и такое взаимодействие индуцирует изменение (инактивацию) активного центра фермента.

© Афонин Алексей Алексеевич  

Доктор с.-х. наук, профессор кафедры зоологии и анатомии Брянского государственного университета

Зав. лабораторией популяционной цитогенетики НИИ ФиПИ БГУ

главная страница сайта ОБЩАЯ И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ http://afonin-59-bio.narod.ru 

e-mail: afonin.salix@gmail.com

дополнительные web-ресурсы

http://afonin-59-salix.narod.ru 

http://darwin200.narod.ru 

http://lib-58-timob.narod.ru 

последнее обновление страницы 28.10.2010

Молекулярные основы наследственности составляют нуклеиновые кислоты - ДНК (у всех микробов, одноклеточных, растительных организмов, насекомых, животных) и РНК (у некоторых вирусов, в частности онкогенных). Именно в этих крупных биополимерах с помощью единого языка, алфавит которого составляют 4 буквы - нуклеозиды, записана генетическая информация живых существ. В ДНК информация изложена чередованием аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), которые образуют определенные последовательности, связываясь остатками дезоксирибозы и фосфором в одноцепочечных молекулу.

Потом два комплементарные друг другу цепи образуют водородные связи: аденин-тимин (AT) и гуанин-цитозин (ГЦ), которые закручиваются и образуют двойную спираль, преимущественно правовинтовую, одновременно биологическое и информационную, "змеиные лестница"). Молекула РНК имеет односпиральну структуру. В ее состав вместо тимина входит урацил (У), а вместо остатка дезоксирибозы - рибоза (химически несколько иная пентоза).

Молекула нуклеиновой кислоты (НК) имеет способность к размножению, удвоение или репликации. Размножаются, тиражируются не белки, а нуклеиновые кислоты. При наличии необходимых компонентов и соответствующих ферментов на матрице каждой нити двуспиральной ДНК (после их разъединения) синтезируется комплементарный цепь новой ДНК. Репликация должна полуконсервативной, матричный характер. В каждой двуспиральные молекуле содержится и материнский (старый), и дочерний (новый) цепь нуклеотидов.

На уровне одноклеточных организмов нет смерти от старости. Этот механизм обеспечивает стабильность генетической информации, ее сохранность при процессе передачи потомкам.

При реализации генетической информации происходит декодирование: речь нуклеиновых кислот (четыре буквы А, Т, Г, Ц) должна быть переведена на язык белков (20 аминокислот, условно 20 букв). Это возможно благодаря кодовому принципу: одной аминокислоте соответствует запись из трех нуклеотидов в нуклеиновой кислоте. Например, последовательность аденин, аденин, аденин (ААА) кодирует фенилаланин, а АТТ - лизин. Поэтому генетический код - триплетных. Но с 4 букв (А, Т, Г, Ц) можно получить 64 различные комбинации по 3 буквы (43 = 64), а в природе существует только 20 аминокислот.

Другие триплеты (кодоны) - сочетание трех нуклеотидов - не лишние. Три из них (АТЦ АЦТ, АТТ) - терминуючи, они свидетельствуют о конце синтеза, знаки препинания (как в языке - точка, запятая и т.д.). Другие обеспечивают запас прочности генома, так кодирующих те же аминокислоты, что и основные триплеты. Поэтому генетический код - вырожденный: одна аминокислота может быть закодирована в ДНК 2-4 триплетами. В одном гене кодоны расположены друг за другом, как слова в предложении, не перекрываются, что упрощает запись и делает его стабильным.

Генетический код не перекрывается. У всех живых организмов на Земле в генетической программе те же триплеты кодируют те же аминокислоты. Генетический код еще и в н и ве реальный. Имеем запомнить признаки генетического кода / триплетных, вырожденный, не перекрывается, универсальный. Но в каждом правиле существуют исключения. В последние ЗО лет исследователи изучали и собирали такие исключения, их оказалось много, возникли новые гипотезы и теории, что и привело к возникновению современной мобильной генетики, которая пришла на смену генетике классической. Сейчас мы знаем, что:

  1.  генетическая программа не совсем стабильной: существуют мобильные диспергированные гены, или элементы, меняющие свое положение, прыгают с места на место;
  2.  внутри гена существуют участки с содержанием (Экзоны) и без него (интроны);
  3.  большое количество информации имеет регуляторные функции;
  4.  ген - обладает свойством делиться;
  5.  в геноме имеют место не только уникальные кодирующие последовательности, но и огромное количество повторов информации;
  6.  запись генетической информации УЮЖЕ отличаться от универсального.

Информационные молекулы содержатся в клетках не только в ядре (основная, самая программа), но и в некоторых органеллах цитоплазмы: митохондриях, плазмидах, других ДНК-или РНК-носителях. Так в митохондриях код отличается от универсального.

Реализация генетической информации, а именно синтез белка, осуществляется в цитоплазматических структурах - рибосомах. Для того чтобы план строения белка донести от ДНК к рибосом, клетка имеет специальные механизмы и подвижные молекулы. Из того, что знаем сейчас, механизм называется транскрипцией, а молекулы - это различные виды РНК. Транскрипция означает переписывание информации с ДНК на РНК. Главным же в синтезе белка является трансляция - перевод информации с одного языка на другой.

Кодовый запись о структуре белковой молекулы переносится с ДНК на информационную (матричную) РНК (она же РНК-переносчик, лат. "Мессенджер", синонимы: иРНК, мРНК, т-РНК) путем комплементарного, матричного синтеза РНК на ДНК, сравнимый с репликацией (синтез ДНК на ДНК). Молекула РНК копирует весь ген эукариот вместе с незначимыми интроны. Такие временные молекулы называются пре-иРНК.

Молекулы пре-иРНК перемещаются из ядра к цитоплазме, а именно к рибосом, состоящие из рибосомных РНК (рРНК) и белков. По пути пре-иРНК модифицируются, из них удаляются незначащие участки кода (интроны). Значение интронов, видимо, очень важное, но еще полностью не расшифровано.

Третий вид РНК составляют относительно маленькие (десятки нуклеотидов) молекулы транспортных РНК (тРНК), которые приносят к рибосом специфические активированные аминокислоты, ставят их на соответствующее место в полипептидной цепи, определенное кодоном иРНК. Только молекула тРНК имеет в своем составе антикодон, комплементарный к кодону иРНК.

Мы уже определили, чем РНК отличается от ДНК. Белок синтезируется по плану иРНК, поэтому и триплеты, кодирующие аминокислоты, чаще записываются комплементарной языке РНК, для фенилаланина это будет УУУ, терминуючи кодоны УАГ, УГА, УАА.

Таким образом процесс реализации наследственной информации от гена к фену (синтез белка - один из них) имеет вид ДНК> РНК> белок. Долгое время эта формула считалась центральной догмой генетики.

В наше время мобильной генетики установлено существование процесса переноса информации от РНК к ДНК. Обратная транскрипция была предусмотрена И открыта С.М Гершензоном и экспериментальное окончательно доказана лауреатом Нобелевской премии Г. М. Темин. Если к этому добавить репликацию ДНК на ДНК и РНК на РНК (возможно, существует в некоторых вирусов), то окончательный запись потока информации будет иметь такой вид:

Синтез нуклеиновых кислот на матрице белка пока не доказан и, наверное, блокирован законами термодинамики. Для его проблематичного существования необходимыми должны быть неизвестны нам энергоснабжающие источники.

В конце XX в. стало известно, что в генотипе человека содержится 50-100 тыс. различных генов. Они кодируют продукты, необходимые для существования клетки (кухонные гены), организму (гены роскоши), или, по нашему мнению, не кодирующие ничего. Последние сейчас называются эгоистичными генами, избыточной генетической информацией, который может содержать или память о прошлой эволюции, или быть резервом (планом) будущей эволюции.

Весь объем генетической информации находится под строгим контролем регуляторных механизмов. Все гены взаимодействуют между собой, образуя единую систему. Регуляция их активности происходит как за относительно простой схеме - продукт гена изменяет активность того или иного гена, так и путем сложного многоуровневого механизма. Он включает процессы регуляции активности генов на этапах транскрипции (до, во время и после нее), трансляции (до, во время и после нее), согласованной, каскадной групповой регуляции трудовой генов (их экспрессия), участия в этом процессе гормонов (общие сигнальные вещества), химической модификации ДНК и других общих модификаторов экспрессии генов. Экспрессия отдельного гена зависит от того, в каком составе (генотипе) этот ген находится. Поэтому существует разная пенетрантнисть (проявка) и экспрессивность (выражение) генов как нормальных (дикий тип), так и мутантных аллелей.

Эти понятия впервые введены в генетику М.В.Тимофеевим-Ресовский. Конкретный генотип человека определяет степень пенетрантности и экспрессивности определенных болезней, даже в отсутствии клинической картины патологии при наличии, казалось бы, необходимого количества мутантных генов.

8. Генетика микроорганизмов.

- Особенности строения наследственного материала микроорганизмов.

-Явление лизогении.

-Особенности обмена генетическим материалом у вирусов и бактерии.

-Трансформация и гибридизация в культурах клеток высших организмов.

-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ     микроорганизмов.

Тема:    ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Вопросы: 1. Особенности строения наследственного материала.

                    2. Изменчивость.

                    3. Генетические рекомбинации.

                        4.  Плазмиды.

                         5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ     микроорганизмов.

      Микроорганизмы обладают выраженной морфологией, которую можно изучать визуально при помощи светового микроскопа. Микроорганизмы биохимически активны, что легко учитывать при использовании специальных питательных сред.

      Способность микроорганизмов изменять свои свойства при воздействии различных факторов (температура, ультрафиолетовое и рентгеновское излучение и др.) позволяет широко использовать их в качестве модели при изучении наследственности и изменчивости.

Первым объектом генетических исследований была кишечная палочка, которая хорошо культивируется в лабораторных условиях. Важное значение имело также то, что морфологические, культуральные и биохимические свойства этой бактерии хорошо изучены. В дальнейшем объектом генетических исследований стали и другие бактерии, а также вирусы.

       Исследования генетики микроорганизмов показали, что у них роль носителя генетической информации играет ДНК (у некоторых вирусов РНК).

Молекула ДНК в бактериях состоит из двух нитей, каждая из которых спирально закручена относительно другой. При делении клетки нитчатая спираль удваивается— каждая из нитей служит как бы шаблоном или матрицей, на которой строится новая нить. При этом каждая нить, возникшая в процессе деления клеток, содержит вновь образовавшуюся двунитчатую молекулу ДНК.

В состав ДНК входят четыре азотистых основания — аденин, гуанин, цитозин и тимин, порядок расположения в цепи у разных организмов определяет их наследственную информацию, закодированную в ДНК.

       Функциональной единицей наследственности является ген, который представляет собой участок нити ДНК. В генах записана вся информация, касающаяся свойств клетки.

Полный набор генов, которым обладает клетка, называется генотипом. Гены подразделяются на структурные, несущие информацию о конкретных белках, вырабатываемых клеткой, и гены-регуляторы, регулирующие работу структурных генов. Например, клетка вырабатывает те белки, которые необходимы ей в данных условиях, однако при изменении условий гены-регуляторы изменяют свойства клетки, приспосабливая их к новым условиям.

                                 ИЗМЕНЧИВОСТЬ

Изменения морфологических, культуральных, биохимических и других свойств микроорганизмов, возникающие под действием внешних факторов, взаимосвязаны. Например, изменения морфологических свойств сопровождаются обычно изменениями физиологических особенностей клетки.

В процессе изучения изменчивости микроорганизмов была обнаружена особая форма изменчивости — диссоциация. Этот вид изменчивости был описан П. де Крюи и Дж. Аркаерайтом и выражтся в том, что при посеве некоторых бактериальных культур на плотные питательные среды происходит разделение колоний на два типа:

-гладкие, круглые, блестящие колонии с ровными краями — S-форма (от англ. smooth — гладкий), и

-плоские, непрозрачные колонии неправильной формы, с неровными краями — R-форма (от англ. rough— шероховатый).

Существуют также

-переходные формы: - М-формы (слизистые) и

                                               - g-формы (карликовые).

 

             Колонии, относящиеся к гладкой S-форме, могут при определенных условиях переходить в R-форму и обратно, однако переход R-формы в S-форму происходит труднее.

Диссоциация наблюдается у ряда бактерий, в частности у возбудителей сибирской язвы, чумы и др.

                        Характеристика S- и R-форм колоний

 

S-форма

Колонии гладкие, блестящие, правильной выпуклой "формы

При росте в бульоне — равномерная муть

У подвижных бактерий имеются жгутики

У капсульных бактерий имеется капсула

Биохимически активны

Болезнетворны

Выделяются чаще в остром периоде заболевания

 

R-форма

Колонии неправильной формы, мутные, шероховатые

Растут в бульоне в виде осадка

У подвижных бактерий жгутики могут отсутствовать

Капсулы отсутствуют

Биохимические свойства выражены слабо

Большинство   бактерий   менее болезнетворны

Выделяются обычно при хронической форме заболевания

Болезнетворные бактерии чаще бывают в S-форме. Исключением являются возбудители туберкулеза, чумы, сибирской язвы, у которых болезнетворной является R-форма .

Изменения, возникающие в бактериальных клетках могут быть:

- ненаследуемые — фенотипическая изменчивость и

- наследуемые — генотипическая изменчивость.

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ (МОДИФИКАЦИЯ)

Модификация микроорганизмов возникает как ответ клетки на неблагоприятные условия ее существования. Это адаптивная реакция на внешние раздражители. Модификация не сопровождается изменением генотипа, в связи с чем возникшие в клетке изменения по наследству не передаются. При восстановлении оптимальных условий возникшие изменения утрачиваются. Модификация может касаться разных свойств микроорганизмов — морфологических, культуральных, биохимических и др.

Морфологическая модификация выражается в изменениях формы и величины бактерий. Например, при добавлении пенициллина к питательной среде клетки некоторых бактерий удлиняются. Недостаток в среде солей кальция вызывает у палочки сибирской язвы повышенное спорообразование. При повышенной концентрации солей кальция способность образовывать споры утрачивается и т. д. При длительном росте бактерий в одной и той же среде возникает полиморфизм, обусловленный влиянием накопившихся в ней продуктов их жизнедеятельности.

Культуральная модификация состоит в изменении культуральных свойств бактерий при изменении состава питательной среды. Например, при недостатке кислорода у стафилококка утрачивается способность образовывать пигмент. Чудесная палочка при комнатной температуре образует ярко-красный пигмент, но при 37 °С способность образовывать этот пигмент утрачивается и т. д.

Биохимическая (ферментативная) модификация. Каждый вид бактерий имеет определенный набор ферментов, благодаря которым они усваивают питательные вещества. Эти ферменты вырабатываются на определенных питательных субстратах и предопределены генотипом.

В процессе жизнедеятельности бактерий обычно функционируют не все гены, ответственные за синтез соответствующих ферментов. В геноме бактерий всегда имеются запасные возможности, т. е. гены, определяющие выработку адаптивных ферментов. Например, кишечная палочка, растущая на среде, не содержащей углевод лактозу, не вырабатывает фермент лактазу, но если пересеять ее на среду с лактозой, то она начинает вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты позволяют приспособляться к определенным условиям существования.

Таким образом, модификация — это способ приспособления микроорганизма к условиям внешней среды, обеспечивающий им возможность расти и размножаться в измененных условиях. Приобретенные свойства не передаются по наследству, поэтому они не играют роли в эволюции, а способствуют в основном выживанию микробных популяций.

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ (НАСЛЕДУЕМАЯ) ИЗМЕНЧИВОСТЬ

Генотипическая изменчивость может возникать в результате мутаций и генетических рекомбинаций.

Мутации (от лат.  mutatioизменять) — это передаваемые по наследству структурные изменения генов.

Крупные мутации (геномные перестройки) сопровождаются выпадением или изменением относительно крупных участков генома — такие мутации, как правило, необратимы.

Мелкие (точковые) мутации связаны с выпадением или добавлением отдельных нуклеотидов ДНК. При этом изменяется лишь небольшое число признаков. Такие измененные бактерии могут полностью возвращаться в исходное состояние (ревертировать).

Бактерии с измененными признаками называются мутантами. Факторы, вызывающие образование мутантов, носят название мутагенов.

Бактериальные мутации делят на спонтанные и индуцированные. Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают под влиянием неконтролируемых факторов, т. е. без вмешательства экспериментатора. Индуцированные (направленные) мутации появляются в результате обработки микроорганизмов специальными мутагенами (химическими веществами, излучением, температурой и

др.).

В результате бактериальных мутаций могут отмечаться: а) изменение морфологических свойств; б) изменение культуральных свойств; в) возникновение у микроорганизмов устойчивости к лекарственным препаратам; г) потеря способности синтезировать аминокислоты, утилизировать углеводы и другие питательные вещества; д) ослабление болезнетворных свойств и т. д.

Если мутация приводит к тому, что мутагенные клетки обретают по сравнению с остальными клетками популяций преимущества, то формируется популяция из мутантных клеток и все приобретенные свойства передаются по наследству. Если же мутация не дает клетке преимуществ, то мутантные клетки, как правило, погибают.

                                                  Генетические рекомбинации.

Трансформация. Клетки, которые способны воспринять ДНК другой клетки в процессе трансформации, называются компетентными.

Трансдукция — это перенос генетической информации (ДНК) от бактерии донора к бактерии реципиенту при участии бактериофага. Трансдуцирующими свойствами обладают в основном умеренные фаги. Размножаясь в бактериальной клетке, фаги включают в состав своей ДНК часть бактериальной ДНК и передают ее реципиенту.

Различают три типа трансдукции: общую, специфическую и абортивную.

1. Общая трансдукция — это передача различных генов, локализованных на разных участках бактериальной хромосомы. При этом бактерии доноры могут передать реципиенту разнообразные признаки и свойства— способность образовывать новые ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам и т. д.

2. Специфическая трансдукция — это передача фагом только некоторых специфических генов, локализованных на специальных участках бактериальной хромосомы. В этом случае передаются только определенные •признаки и свойства.

3. Абортивная трансдукция — перенос фагом какого-то одного фрагмента хромосомы донора. Обычно этот фрагмент не включается в хромосому клетки реципиента, а циркулирует в цитоплазме. При делении клетки реципиента этот фрагмент передается только одной из двух дочерних клеток, а второй клетке достается неизмененная хромосома реципиента.

С помощью трансдуцирующих фагов можно передать от одной клетки другой целый ряд свойств, таких как способность образовывать токсин, споры, жгутики, продуцировать дополнительные ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам и т. д.

Конъюгация — это передача генетического материала от одной бактерии к другой при непосредственном контакте клеток. Клетки, передающие генетический материал, называются донорами, воспринимающие его — реципиентами. Этот процесс носит односторонний характер — от клетки донора к клетке реципиента.

Бактерии донора обозначаются F+ (мужской тип), а бактерии реципиента — F — (женский тип). При тесном сближении клеток F+ и F- между ними возникает цитоплазматический мостик. Образование мостика контролируется фактором F (от англ.Fertility— плодовитость). Этот фактор содержит гены, ответственные за образование половых ворсинок (sex-pili). Функцию донора могут выполнять только те клетки, которые содержат фактор F. Клетки реципиента лишены этого фактора. При скрещивании фактор F передается клеткой донора реципиенту. Получив фактор F, женская клетка сама становится донором (F+).

Процесс конъюгации можно прервать механическим способом, например встряхиванием. В этом случае реципиент получает неполную информацию, заключенную в ДНК.

Перенос генетической информации путем конъюгации лучше всего изучен у энтеробактерий.

Конъюгация, как и другие виды рекомбинации, может осуществляться не только между бактериями одного и того же вида, но и между бактериями разных видов. В этих случаях рекомбинация называется межвидовой.

ПЛАЗМИДЫ

Плазмидыэто сравнительно небольшие внехромо-сомные молекулы ДНК бактериальной клетки. Они расположены в цитоплазме и имеют кольцевую структуру. В плазмидах содержится несколько генов, функционирующих независимо от генов, содержащихся в хромосомной ДНК.

Типичным признаком плазмид служит их способность к самостоятельному воспроизведению (репликации).

Они могут также переходить из одной клетки в другую и включать в себя новые гены из окружающей среды. К числу плазмид относятся:

Профаги, вызывающие у лизогенной клетки ряд изменений, передающихся по наследству, например способность образовывать токсин (см. трансдукцию).

F-фактор, находящийся в автономном состоянии и принимающий участие в процессе конъюгации (см. конъюгацию).

R-фактор, придающий клетке устойчивость к лекарственным препаратам (впервые R-фактор был выделен из кишечной палочки, затем из шигелл). Исследования показали, что R-фактор может быть удален из клетки, что вообще характерно для плазмид.

К-фактор обладает внутривидовой, межвидовой и даже межродовой трансмиссивностью, что может явиться причиной формирования трудно диагностируемых атипичных штаммов.

Бактериоциногенные факторы (col-факторы), которые впервые были обнаружены в культуре кишечной палочки (E.coli), в связи с чем названы колицинами. В дальнейшем они были выявлены и у других бактерий: холерного вибриона — вибриоцины, стафилококков — стафилоцины и др.

Соl-фактор — это маленькая автономная плазмида, которая детерминирует синтез белковых веществ, способных вызывать гибель бактерий собственного вида или близкородственного. Бактериоцины адсорбируются на поверхности чувствительных клеток и вызывают нарушения метаболизма, что приводит клетку к гибели.

В естественных условиях только единичные клетки в популяции (1 на 1000) спонтанно продуцируют колицин. Однако при некоторых воздействиях на культуру (обработка бактерий УФ-лучами) количество колицинпродуцйрующих клеток увеличивается.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИЗМЕНЧИВОСТИ микроорганизмов

Еще Пастер искусственным путем получил необратимые изменения у возбудителей бешенства, сибирской язвы и приготовил вакцины, предохраняющие от этих заболеваний. В дальнейшем исследования в области генетики и изменчивости микроорганизмов позволили получить большое число бактериальных и вирусных штаммов, используемых для получения вакцин.

Результаты исследования генетики микроорганизмов с успехом были использованы для выяснения закономерностей наследственности высших организмов.

Большое научное и практическое значение имеет также новый раздел генетики — генная инженерия.

Методы генной инженерии позволяют изменять структуру генов и включать в хромосому бактерий гены других организмов, ответственных за синтез важных и нужных веществ. В результате микроорганизмы становятся продуцентами таких веществ, получение которых химическим путем представляет очень сложную, а иногда даже невозможную задачу. Этим путем в настоящее время получают такие медицинские препараты, как инсулин, интерферон и др. При использовании мутагенных факторов и селекции были получены мутанты-продуценты антибиотиков, которые в 100—1000 раз активнее исходных.

9. Генетика иммунитета

-генетическая детерминированность иммунной реакции организма высших животных;

-механизм синтеза моноспецифических антител и иммунная память;

-наследуемость уровня иммунной реакции организма и возможности селекции животных по устойчивости к инфекциям.

Иммунитет – это невосприимчивость организма к инфекционным агентам и генетически чужеродным веществам антигенной природы. Главная функция иммунитета – иммунологический надзор за внутренним постоянством (гомеостазом) организма.

Следствием этой функции является распознавание, а потом блокирование, нейтрализация или уничтожение генетически чужеродных веществ (вирусов, бактерий, раковых клеток и т.д.). За сохранение генетически обусловленной биологической индивидуальности отвечает иммунная система организма – совокупность всех лимфоидных клеток (специфический фактор защиты ). К неспецифическим факторам защиты относят кожные и слизистые покровы. Иммунный ответ, или иммунологическая реактивность – форма реакций организма на чужеродные вещества (антигены). Главной функцией антител является их способность вступать в быструю реакцию с антигеном в виде реакции глютинации, преципитации, лизиса, нейтрализации.

10. Группы крови и биохимический полиморфизм.

-понятие о группах крови;

-наследуемость групп крови;

-практическое применение групп крови в животноводстве;

-полиморфные системы белков и их связь с продуктивностью животных;

-методы определения групп крови  и полиморфных систем белков.

Группы крови были открыты в 1900 г. (у человека) и объяснены в 1924 г. А в 1936 году использован термин иммуногенетика. В пределах вида особи различаются по ряду охимических, генетически детерминируемых признаков, которые могут быть выявлены иммуногенетически в виде антигенов (генетически чужеродные вещества, при введении их в организм вызывают  иммуногенетических реакций). Антитела – иммуноглобулины (белки), образующие в организме под воздействием антигенов, различия в групповой принадлежности крови определяются антигенами, расположенными на поверхности эритроцитов. Антигенные факторы иногда называют кровяными факторами, сумму всех групп крови одной особи – типом крови. После рождения группы крови у животных не меняется.. Генетические системы групп крови и антигены обозначают прописными и строчными буквами – А,В,С и т.д. Количество антигенов много, поэтому пишут со значками А, В, С,  и  с подстрочными индексами А1, А2 и т.д.

У всех видов животных большинство аллелей  генетических систем групп крови наследуется по типу кодоминирования, т.е. в гетерозиготе фенотипически проявляются оба гена. Все известные системы групп крови у с/х животных локализованы в аутосомах. Можно выделить три правила наследования групп крови:1) каждая особь наследует по одному из двух аллелей от матери и отца по каждой системе групп крови;

2) Особь с антигенами, не обнаруженными хотя бы у одного из родителей, не может быть потомком данной пары родителей;

3) Гомозиготная особь по одному антигену, например F/F, не может быть потомком гомозиготной особи с противоположным антигеном, например V/V. В настоящее время у крупного рогатого

Контроль  достоверности происхождения животных возможен благодаря: 1) кодоминантному  наследованию антигенных факторов;2) их неизменности в течение онтогенеза; 3) огромному числу комбинации групп крови, которые в пределах вида не бывают одинаковыми у двух особей, за исключением монозиготных близнецов.

Полиморфизм – это одновременное присутствие двух или более генетических форм одного вида. Термин генетический (биохимический) полиморфизм применяется тогда, когда локус хромосомы в популяции имеет два или более аллелей. Ген, представленный более, чем одним аллелем , называют полиморфным геном.

11. Генетическая инженерия.

-генная инженерия: получение рекомбинантных молекул, внедрение рекомбинантных молекул, производство продуктов с помощью ГеноМодифицированных клеток и Организмов;

-клеточная инженерия: получение моноклональных антител на основе гибридом; использование  мезенхимальных  и  эмбриональ-ных  стволовых клеток в лечении болезней и аномалии; выращивание культур клеток  и  клонирование низших организмов и высших животных. 

Раздел "Генная инженерия"

Введение в генетическую инженерию

Возможности генной инженерии

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативныйдвухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.
Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Читать дальше ► методы генной инженерии

Другие главы раздела:

Ферменты, используемые в генетической инженерии

Классификация, номенклатура и характеристика рестриктаз

Построение рестрикционных карт

Конструирование рекомбинантных ДНК

Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК

Гибридизация как высокочувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов

Методы клонирования ДНК

Введение гена в клетку

Генетические манипуляции с бактериальными клетками

Введение генов в клетки млекопитающих

Генная инженерия растений

Литература к разделу



Реклама

© 1995-2010 Наталья Кузьмина

Методы генной инженерии

Генетическая инженерия - конструирование invitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию,  диагностировать генетические заболевания,  создавать  ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

  •  специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
  •  быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
  •  конструирование рекомбинантной ДНК;
  •  гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;
  •  клонирование ДНК: амплификация invitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
  •  введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

История генной инженерии

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа.

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК invitro. Эти работы касаются получения гибридов между различнымиплазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

Читать дальше ► ферменты для манипуляций с ДНК и РНК

Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.

Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Рестриктазы

Рестриктазы (рестрицирующиеэндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) - это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).

Еще в 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В - в клетки штамма С) не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты.

В 1966 году было показано, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК - она содержит несколько метилированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК, причем метилирование (добавление к основанию метильной группы) происходит уже после завершения репликации. Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся «чужеродной» именно по типу ее модификации. За «метку» отвечают метилирующие ферменты модификации, так называемые ДНК-метилазы. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрицирующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах.

Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий; их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения.

Рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК была выделена в 1968 г. Мезельсоном и Юанем. Этот фермент был высокоспецифичен по отношению к определенной последовательности ДНК, но расщеплял молекулы неспецифически, в другом месте, на некотором удалении от участка узнавания. Вскоре, в 1970 г. Смит и Вилькокс выделили из Haemophilusinfluenzae первую рестриктазу, которая расщепляла строго определенную последовательность ДНК (Hind III). Поскольку разные бактерии по-разному метят свою ДНК, то и рестриктазы должны узнавать разные последовательности. И действительно, с тех пор выделены рестриктазы, узнающие более 150 сайтов рестрикции (мест расщепления ДНК).

Полимеразы

Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из E. coli.

ДНК-полимераза I E. coli (Pol I) не связывается с молекулами двухцепочечной кольцевой ДНК. Однако, если такие молекулы денатурировать и получить одноцепочечные формы, то с последними полимераза связывается в количествах, пропорциональных длине этих участков — примерно одна молекула на 300 нуклеотидных остатков. Pol l связывается с одноцепочечными участками двойной спирали ДНК, в местах одноцепочечных разрывов с З'-гидроксилом и 5'-фосфатом, а также с концами двухцепочечных молекул ДНК.

Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 103 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5’ - 3’ полимеразной, 3’ - 5’ экзонуклезной, 5’ - 3’ экзонуклеазной.

1. 5'— 3' полимеразная активность. Для реакции необходимо наличие одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи фрагмента — праймера (затравки) с З'-ОН концом.

2. 3'- 5' экзонуклеазная активность. Гидролизуетодноцепочечную или двухцепочечную ДНК с З'-ОН конца. 3'—5' нуклеаза расщепляет диэфирную связь только в неспаренных участках ДНК. Известно, что при полимеразной реакции с определенной частотой возможно включение в растущую цепь некомплементарного нуклеотида. Однако полимераза не может присоединять нуклеотид к неправильно спаренному концу, образовавшемуся при ее участии. На помощь приходит 3'—5' экзонуклеаза, убирающая ошибочный нуклеотид, на место которого затем присоединяется правильный нуклеотид-предшественник. 3'—5' экзонуклеолитическая активность проявляется в направлении, обратном синтезу ДНК (см. рис. 34). Таким образом, 3'—5' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы играет важную роль в точности полимеризации, направляемой матрицей. Эффективность, или число оборотов, данной экзонуклеазы в оптимальных условиях составляет 2% от числа оборотов субъединицы с полимеразной активностью.

3. 5'— 3' экзонуклеазная активность. Деградирует одну цепь двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца. В отличие от 3'—5' экзонуклеазы 5'—3' экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК. Более того, в то время как 3'—5' нуклеаза отщепляет одномоментно только один нуклеотид, 5'—3' нуклеаза может вырезать с 5'- конца олигонуклеотиды длиной до десяти остатков (около 20% продуктов гидролиза): Скорость нуклеазного отщепления увеличивается на порядок при одновременно протекающей реакции полимеризации. При этом увеличивается относительное количество олигонуклеотидов в продуктах гидролиза ДНК.

Такое сочетание ферментативных активностей позволяет ДНК-полимеразе I E. coli играть активную роль в репарации повреждений ДНК invivo. N - концевой домен соединен с соседним петлей из аминокислотных остатков и легко отделяется с помощью протеолитических ферментов. Оставшаяся часть бифункциональна, так как состоит из полимеразы и 3’ - 5’ экзонуклезы. Она названа фрагментом Кленова (по фамилии одного из авторов, описавших ее). Фрагмент Кленова (Pol IK) обычно используют для достройки одноцепочечных 5'-концов на двухцепочечной ДНК, часто генерируемых рестриктазами, до тупых; для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК, а также для гидролиза одноцепочечных З'-концов на двухцепочечных молекулах ДНК.

Обратная транскриптаза

Обратная транскриптаза используется для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.

Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц — a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК - ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза, по-видимому, важна для интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах. Чтобы начать синтез, ревертазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухцепочечный участок (праймер). Праймером может служить одноцепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтезированной цепью ДНК.

Рис. 35. Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК

 Обратную транскриптазу преимущественно используют для транскрипции матричной РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию обратной транскрипции проводят в специально подобранных условиях с использованием сильных ингибиторов РНКазной активности. При этом удается получать полноразмерные ДНК-копии целевых молекул РНК. В качестве праймера при обратной транскрипции поли (А)-содержащих мРНК используют олигo (dT), а для молекул РНК, не имеющих З'-поли (А) концов, — химически синтезированные олигонуклеотиды, комплементарные З'-концу изучаемой РНК. После синтеза на мРНК комплементарной цепи ДНК и разрушения РНК (обычно применяют обработку щелочью) осуществляют синтез второй цепи ДНК. При этом используют способность ревертазы образовывать на 3'-концах одноцепочечныхкДНКсамокомплементарные шпильки, которые могут выполнять функции праймера.

Матрицей служит первая цепь кДНК. Данная реакция может катализироваться как ревертазой, так и ДНК-полимеразой I E. coli. Показано, что сочетание этих двух ферментов позволяет повысить выход полноценных двухцепочечных молекул кДНК. По окончании синтеза первая и вторая цепи кДНК остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей праймером при синтезе второй цепи. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S1, специфически разрушающейодноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующиеся при этом концы не всегда оказываются тупыми, и для повышения эффективности последующего клонирования их репарируют до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Полученную двухцепочечнуюкДНК можно затем встраивать в клонирующие векторы, размножать в составе гибридных молекул ДНК и использовать для дальнейших исследований.

Лигазы

В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.

Иными словами, ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК.

В генной инженерии используются  2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще.

 

ДНК-лигаза, фото с сайта ru.wikipedia.org

Терминальная трансфераза, поли-А - полимераза

Терминальная трансфераза (концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза) была обнаружена Боллумом в 1962 году в тимусе теленка.

Субстратом терминальной трансферазы при использовании в качестве кофактора ионов Mg2+ является одноцепочечная ДНК с З'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с выступающим одноцепочечным З'-ОН концом. Если в качестве кофактора используются Co2+, этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами.

При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 1-цепочечные 3'-концы. Таким же образом можно достроить другим молекулам ДНК гомополимерные 3'-концы, комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при определенных условиях может приводить к формированию гибридных молекул ДНК.

Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 г. был выполнен первый эксперимент по рекомбинации молекул ДНК invitro.

Поли (А) - полимераза E. coli была открыта Сиппелом в 1973 году. Она катализирует присоединение к 3’-ОН концу одноцепочечных молекул РНК поли (А) последовательностей. Применяется при подготовке молекул РНК к копированию с них комплементарной ДНК для введения радиоактивной метки в 3’-конец РНК.

Классификация, номенклатура и характеристика рестриктаз

Классификация рестрицирующихэндонуклеаз

Общепринято термины "рестриктаза", "эндонуклеаза рестрикции" и "сайт специфическаяэндодезоксирибонуклеаза" считать синонимами.

Все рестрикционныеэндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием молекулы ДНК либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Наряду с рестрикционной активностью бактериальный штамм обладает способностью метилировать ДНК; для этого процесса характерна такая же специфичность в отношении последовательностей ДНК, как и для рестрикции. Метилаза добавляет метильные группы к адениновым или цитозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции. Следовательно, метилирование защищает ДНК от разрезания.

 Различают 3 основных класса рестриктаз.

Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности, но рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Ферменты типов 1 и 3 имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.

Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующейэндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах магния в качестве кофакторов.

В настоящее время выделено более 500 рестриктаз класса 2, однако среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию, когда ферменты узнают одну и ту же последовательность нуклеотидов и разрывают ДНК в одних и тех же точках, и ложную, когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта.

 Большинство рестриктаз класса 2 узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящиерестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 пар оснований, отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой R1 из E. coli.

К мелкощепящим относятся рестриктазыHpa II и Alu (из Arthrobacterluteus), к крупнощепящим - Eco R I (из Escherichiacoli) и Hind III. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований. Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК-рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящимирестриктазами и незначительна при применении крупнощепящихэндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящимирестриктазами, либо применяют прием "недорестрикции", т.е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте.

Раздел "Генная инженерия"

Классификация, номенклатура и характеристика рестриктаз

Номенклатура и характеристика рестриктаз

В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз, включающую следующие пункты:

1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида.
Streptomycesalbus - Sal, Escherichiacoli-Eco

2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B.

3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilusinfluenzae).

4. Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III).  

Открытие новых рестриктаз заставило Робертса в 1978 году внести дополнения в систему рациональных обозначений ферментов: если сокращенное название совпадает для нескольких ферментов, то 2 первые буквы аббревиатуры остаются неизменными, а третья берется из последующих букв видового названия:
Haemophilusparainfluenzae - Hpa I
Haemophilusparahaemolyticus - Hph I.

Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК (рис. 36).

Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности (Hpa I, Ssp I).

Другие - со сдвигом, со  "ступенькой" (Pst I).

В первом случае образуются так называемые "тупые" концы, а во втором - "липкие", то есть фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК.

Читать дальше ► механизм действия рестриктаз

Генная инженерия, методы молекулярной биологии и генетики, связанные с целенаправленным конструированием новых, не существующих в природе сочетаний генов. Возникла в начале 70-х гг. 20 в. Основана на извлечении из клеток какой-либо организма гена (кодирующего нужный продукт) или группы генов, на соединении их со специальными молекулами ДНК (так называемыми векторами), способными проникать в клетки другого организма (главным образом микроорганизмов) и размножаться в них. Наряду с клеточной инженерией лежит в основе современной биотехнологии. Открывает новые пути решения некоторых проблем генетики, медицины, сельского хозяйства. С помощью генной инженерии был получен ряд биологически активных соединений - инсулин, интерферон и др.



В основе Г. и. лежат достижения молекулярной биологии и прежде всего установление универсальности генетического кода (у всех организмов включение одних и тех же аминокислот в строящуюся полипептидную цепь белка кодируется одними и теми же последовательностями трех нуклеотидов в цепи ДНК). Возможность получения и направленного использования фрагментов нуклеиновых кислот, выделения отдельных участков полинуклеотидной цепи с точностью до одного нуклеотида и осуществления invitro синтеза нуклеиновых кислот с новыми сочетаниями нуклеотидных звеньев, появилась у генетической инженерии благодаря успехам энзимологии.
Изменение наследственных свойств организма с помощью Г. и. состоит в конструировании из различных фрагментов ДНК нового генетического материала, введении этого материала в организм реципиента, создании условий для функционирования введенного генетического материала и его стабильного наследования.
Гены или фрагменты ДНК могут быть получены путем химического синтеза. Однако этот процесс трудоемок и требует знания последовательности нуклеотидов, составляющих <<Ген>>. Более эффективен метод синтеза структурного гена на информационной РНК (иРНК) как на матрице с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Однако структурные гены в организме составляют функциональный комплекс с регуляторными элементами, нуклеотидные последовательности которых не воспроизводятся в молекуле иРНК. Поэтому указанный способ не позволяет осуществить синтез структурной и регуляторной области гена в совокупности, т.е. функционирующего гена в целом.
Методы получения целого функционирующего гена были впервые разработаны на бактериальных клетках. Их основой является способность некоторых плазмид — небольших молекул ДНК, способных реплицироваться независимо от бактериальной хромосомы, — внедряться в хромосому бактериальной клетки, а затем спонтанно или под воздействием индуцирующих агентов, например УФ-излучения, снова переходить в цитоплазму, захватывая при этом прилегающие гены хромосомы клетки-хозяина. В цитоплазме эти гены реплицируются (размножаются) в составе захвативших их плазмид. Фрагмент генетического материала хромосомы бактериальной клетки может быть отделен от плазмиды. Использование плазмид позволяет получать в изолированном виде практически любые бактериальные гены (см. <<Плазмиды>>).
Успеху Г. и. способствовала разработка техники объединения генов, выделенных из различных источников, в одну молекулу ДНК. Решающим в конструировании таких гибридных, или рекомбинантных, молекул invitro явилось обнаружение и получение особых ферментов — рестриктаз, которые сейчас служат основным инструментом Г. и. Рестриктаза «разрезает» молекулу ДНК в участке (сайте), строго определенном для каждой конкретной рестриктазы.
К середине 80-х гг. 20 в. в мировой коллекции рестриктаз насчитывалось более 400 ферментов, «узнающих» около 100 различных по структуре участков в молекулах ДНК. С помощью рестриктаз стало возможным выделение практически любого гена в виде одного или нескольких фрагментов ДНК. Появилась возможность снабжать синтезированные, «сконструированные» и природные гены различными регуляторными нуклеотидными последовательностями, заменять, вставлять, удалять нуклеотиды в строго заданных участках гена, укорачивать или достраивать его. Для создания гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК полученные фрагменты соединяют с ДНК вектора. С этой целью используют фермент, соединяющий фрагменты ДНК. Функциональную полноценность гибридной молекулы ДНК определяют с помощью ее переноса в клетку-реципиент по последующему размножению в ней (амплификации) и функционированию. Перенос чужеродного генетического материала в реципиентные клетки и его размножение в них обеспечивает векторная часть гибридной молекулы, а синтез специфического белка — встроенный фрагмент.
Прогресс Г. и. во многом обусловлен получением новых специализированных векторов. Для клонирования (размножения) сравнительно небольших фрагментов ДНК длиной до 10 тыс. пар нуклеотидов используют плазмидные векторы.
Фрагменты ДНК длиной до 10—25 тыс. пар нуклеотидов клонируют с помощью векторов, полученных на основе фага лямбда. Гибридный геном такого фага, содержащий фрагмент чужой ДНК, искусственным путем «упаковывают» в белковую оболочку и этим реконструированным фагом заражают бактерии. Гибридный фаг приразмножении лизирует клетку, образуя несколько тысяч копий, которые выделяются в культуральную среду. Для клонирования фрагментов ДНК длиной до 35—45 тыс. пар нуклеотидов используют космидные векторы, представляющие собой гибрид фага лямбда и плазмиды. Космиды содержат так называемые COS-последовательности ДНК фага, необходимые для упаковки геномов фага в белковую оболочку, и участок ДНК плазмиды, позволяющий космидным векторам размножаться в бактериях, не лизируя их. Для клонирования небольших фрагментов ДНК длиной до 300—400 пар нуклеотидов в качестве векторов используют производные геномов фагов с однонитевой молекулой ДНК. Вектор, несущий чужеродную ДНК, вводят в бактериальную клетку, где эти гибридные фаги размножаются, не лизируя клетку-хозяина, и «отпочковываются» в культуральную среду как вирусные частицы с однонитевой молекулой ДНК.
Сравнивая структуру фрагментов геномной ДНК и соответствующей клонированной ДНК-копии (кДНК), получают важную информацию об организации генетического материала, а в случае наследственных болезней — о характере аномалий в клонированном генетическом материале, следствием которых и является это заболевание. Созданы полные библиотеки генов многих микроорганизмов, растений и животных (вплоть до млекопитающих и человека). Клонировано и в той или иной мере изучено около 1000 генов и других последовательностей нуклеотидов ДНК человека.
Возможности Г. и. не ограничиваются клонированием гена и получением большого числа его копий. Часто
необходимо обеспечить экспрессию гена в клетке, т.е. реализовать заключенную в нем генетическую информацию. Если вводимый в бактериальную клетку ген получен из бактерий той же (или близкой) видовой принадлежности, то достаточно выделить ген с его собственными регуляторными элементами, контролирующими экспрессию. Однако, если не считать нескольких исключений, регуляторные нуклеотидные последовательности эволюционно далеких друг от друга организмов не являются взаимозаменяемыми. Поэтому, чтобы добиться, например, экспрессии гена высших организмов в клетках Е, coli, у него удаляют регуляторную область, а структурную часть такого гена присоединяют (на определенном расстоянии) к регуляторной области бактериального гена. Существенный прогресс в разработке этой методики был достигнут после открытия фермента нуклеазы BAL31, которая обладает уникальным свойством удалять с конца фрагмента ДНК «лишние» последовательности нуклеотидов любой протяженности. В настоящее время структурную и регуляторную области выделяют порознь с помощью тех рестриктаз, участки «узнавания» которых расположены наиболее удачно на полинуклеотидной цепи. Затем убирают «лишние» нуклеотидные последовательности и соединяют структурную область гена высшего организма (эукариотического гена) с регуляторной областью бактериального гена. Таким путем удается добиться не только экспрессии генов эукариотов в бактериальных клетках, но и, наоборот, бактериальных генов в клетках высших и низших эукариотов. В качестве реципиентов эффективно используют не только бактериальные клетки, но и клетки высших организмов.
С помощью методов Г. и. были обнаружены отклонения в строении определенных участков генов человека, которые являются причиной наследственных болезней. Чаще всего таким методом служит так называемый
блот-анализ. Выделенную клеточную ДНК подвергают расщеплению рестриктазой, полученные фрагменты разделяют по величине с помощью электрофореза. Однотипные фрагменты ДНК инкубируют с ранее клонированным геном (или его частью) либо с полученной путем химического синтеза последовательностью нуклеотидов, содержащих радиоактивную метку. Меченая ДНК связывается только с теми фрагментами анализируемой клеточной ДНК, которые имеют комплементарные ей последовательности нуклеотидов (см. <<Нуклеиновые кислоты>>). Изменение распределения и количества фиксированной метки по сравнению с нормой позволяет судить о перестройках в анализируемом гене или в близлежащих к нему последовательностях нуклеотидов.
Участки «узнавания» определенных рестриктаз в молекуле ДНК располагаются неравномерно, поэтому при расщеплении этими ферментами молекула ДНК распадается на ряд фрагментов различной длины (так называемые
рестрикционные фрагменты). Перестройка структуры ДНК, в результате которой исчезают имевшиеся или появляются новые участки «узнавания».приводит к изменению набора этих фрагментов, т.е. к появлению полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Перестройки в молекуле ДНК могут вызывать или не вызывать изменения в процессе синтеза или в структуре кодируемого белка; перестроек, не вызывающих изменений, большинство, и они служат причиной нормального ПДРФ. Выяснилось, что ПДРФ является четким генетическим признаком. Для ряда наследственных болезней описаны формы ПДРФ, прямо свидетельствующие о наличии заболевания или о носительстве патологически измененного гена. В настоящее время анализ ПДРФ стал одним из наиболее точных методов, используемых в генетике человека и медицинской генетике (<<Медицинская генетика>>).
Г. и. положила начало новому направлению исследований, получившему название
«генетиканаоборот». Традиционный генетический анализ проводят в следующей последовательности: выбирается признак, устанавливается связь признака с генетической детерминантой и локализация этой детерминанты по отношению к уже известным. В «генетике наоборот» все происходит в обратном порядке. Из набора клонированных участков генома (или кДНК) с неизвестной функцией, характеризующихся определенным ПДРФ, выделяют те из них, которые наиболее тесно сцеплены с конкретным признаком. Если признаком является наследственное заболевание, с помощью выявления тесно сцепленного с ним полиморфного фрагмента можно осуществить диагностику этого заболевания по наличию той или иной формы ПДРФ. Этот подход позволил разработать методы ранней пренатальной диагностики, выявления носителей патологического гена в семьях даже для таких заболеваний, как хорея Гентингтона, болезнь Дюшенна, муковисцидоз, природа генетических дефектов при которых была абсолютно не известна. Затем можно точно определить положение соответствующего гена на хромосоме, выделить и проанализировать не только ген, но и продукты его так называемой экспрессии (мРНК и белок) в норме и при патологии. Полностью принципиальная схема «генетики наоборот» успешно реализована в случае болезни Дюшенна, муковисцидоза.
На пути внедрения в медицинскую практику методов, используемых в Г. и., еще много трудностей технического порядка. Во многих лабораториях мира активно ведется разработка практически пригодных генно-инженерных диагностических методов, и можно надеяться, что такого рода методы уже в ближайшем будущем найдут применение для выборочного обследования групп повышенного риска в отношении наследственных болезней.
Практическое значение Г. и. для медицины связано с перспективами исправления наследственных дефектов у человека, создания и использования микроорганизмов, потерявших свою патогенность, но сохранивших способность к формированию иммунитета. Разработаны методы синтеза антибиотиков, аминокислот, гормонов, витаминов, ферментов и т.д., основанные на использовании микроорганизмов, включивших соответствующие гены.
Г. и. позволяет не только копировать природные соединения и процессы, но и модифицировать их, делать их более эффективными. Примером этого может служить новое направление исследований, названное белковой инженерией. Расчеты, производимые на основании данных об аминокислотной последовательности и пространственной организации молекул белков, показывают, что при определенных заменах некоторых аминокислотных остатков в молекулах ряда ферментов возможно значительное усиление их ферментативной активности. В изолированном гене, кодирующем синтез конкретного фермента, методами Г. и. проводят строго контролируемую замену определенных нуклеотидов. При синтезе ферментного белка под контролем такого модифицированного гена происходит заранее спланированная замена аминокислотных остатков в полипептидной цепи, что вызывает повышение ферментативной активности модифицированного фермента во много раз по сравнению с активностью природного прототипа.
Из практических достижений Г. и. наиболее важными являются создание продуцентов биологически активных белков — инсулина, интерферона, гормона роста и др., а также разработка способов активизации звеньев обмена веществ, которые связаны с образованием низкомолекулярных биологически активных соединений. Таким путем получены продуценты ряда антибиотиков, аминокислот, витаминов, во много раз более эффективные, чем их продуценты, выведенные традиционными методами генетики и селекции.г и. разрабатываются способы получения чисто белковых вакцин против вирусов гепатита, гриппа, герпеса, ящура, реализована идея использования для вакцинации комбинированного вируса осповакцины, в геном которого встроены гены, кодирующие синтез белков других вирусов (например, вирусов гепатита или гриппа). В результате прививки таким вирусом организм получает возможность выработать иммунитет не только против оспы, но и против гепатита, гриппа или другого заболевания, вызываемого тем вирусом, синтез белка которого котируется встроенным геном.
Как и любое достижение науки, успехи Г. и. могут быть использованы не только на благо, но и во вред человеку. Специально проведенные исследования показали, что опасность неконтролируемого распространения гибридных (рекомбинантных) ДНК не так велика, как представлялось ранее. Гибридные ДНК и несущие их бактерии оказались очень неустойчивыми к влияниям окружающей среды, нежизнеспособными в организме человека и животных при случайном проникновении. Известно, что в природе и без вмешательства человека имеются условия, которые обеспечивают обмен генетической информацией (так называемый поток генов). Однако на пути случайного проникновения в организм чужеродной генетической информации природа создала много эффективных барьеров. При работе с большинством гибридных молекул ДНК вполне достаточно обычных мер предосторожности, которые применяют, например, микробиологи при работе с инфекционным материалом. Для особых случаев разработаны эффективные способы биологической защиты и физической изоляции экспериментальных объектов от человека и окружающей среды.
Библиогр.: Маниатис Г., Фрич Э. и Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование (методы генетической инженерии), пер. с англ., М., 1984; Уотсон Дж., Туз Дж. и Кури Ц. Рекомбинантные ДНК, пер. с англ., М., 1986.

История генной инженерии

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа.

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК invitro. Эти работы касаются получения гибридов между различнымиплазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

3841. Математический и физический маятник 42.5 KB
  Цель: изучение зависимости периода колебаний от параметров маятников и измерение на этой основе величины ускорения свободного падения. Оборудования: секундомер, математический маятник (шарик на нити на штативе), физический маятник (кольцо и обруч на...
3842. Перевірка основного рівняння динаміки обертального руху за допомогою маятника Обербека 159 KB
  Перевірка основного рівняння динаміки обертального руху за допомогою маятника Обербека Мета роботи: Експериментальна перевірка основного рівняння динаміки обертального руху. Ознайомлення на дослідах з поняттями момент інерції, кутове прискорення, но...
3843. Принцип действия полупроводникового транзистора 121 KB
  Цель работы: ознакомиться с принципом действия полупроводникового транзистора. Задача: получить выходные характеристики транзистора по напряжению в схеме с общей базой, рассчитать коэффициент усиления транзистора по напряжению. Приборы и прин...
3844. ИЗУЧЕНИЕ МАЯТНИКА МАКСВЕЛЛА 62.5 KB
  ИЗУЧЕНИЕ МАЯТНИКА МАКСВЕЛЛА Цель работы: определение момента инерции маятника Максвелла. Краткая теория. Маятником Максвелла называют однородный диск с валом (тонким стержнем кругового сечения), проходящим через центр масс диска перпендикулярно его ...
3845. Закон сохранения момента импульса 159 KB
  Закон сохранения момента импульса. Закон сохранения момента импульса. Гироскоп. Работа и кинетическая энергия при вращательном движении. Закон сохранения момента импульса. Согласно основному уравнению динамики вращательного движени...
3846. Определение отношения удельных теплоемкостей воздуха методом адиабатного расширения 190.5 KB
  Определение отношения удельных теплоемкостей воздуха методом адиабатного расширения Приборы и принадлежности Закрытый стеклянный баллон с краном, манометр, насос рис. 1 Теория работы и описание прибора Для вещества в любом агрегатном состоянии харак...
3847. Определение коэффициента вязкости жидкости методов стокса 207.5 KB
  Определение коэффициента вязкости жидкости методов стокса Приборы и принадлежности: Стеклянный цилиндр с исследуемой жидкостью, шарики малого диаметра, микрометр, секундомер, пинцет, масштабная линейка. Теория работы и описание приборов При движении...
3848. Исследование характеристика приборов и назначения шунтов и дополнительных сопротивлений к приборам 185.5 KB
  Цель работы: Приобрести навыки в чтении технических характеристик приборов, понять назначении шунтов и дополнительных сопротивлений к приборам, научится их рассчитывать. Приборы и принадлежности: Исследуемый электроизмерительный прибор (V-A), контро...
3849. Абсолютна та відносна похибка 78.27 KB
  Абсолютна та відносна похибка. Мета роботи: вивчити і засвоїти поняття абсолютної й відносної похибки та методи їх оцінювання. Короткі теоретичні відомості. Зв'язок між кількістю точних десяткових знаків і відносною похибкою наближеного числа дається у наведеній далі теоремі.