72026

ДІАГНОСТИКА ЕНЗООТИЧНОЇ ПНЕВМОНІЇ СВИНЕЙ МЕТОДАМИ ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ ТА ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

Автореферат

Медицина и ветеринария

Як свідчать численні дані вітчизняних і зарубіжних авторів, труднощі, пов’язані з культивуванням мікоплазм та очищенням їх імунологічно значущих протеїнів для виготовлення специфічних діагностичних тест-систем, зумовлюють потребу в удосконаленні біотехнологічних прийомів,...

Украинкский

2014-11-16

398.5 KB

1 чел.

PAGE   \* MERGEFORMAT 2

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР
«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ
ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

БОЛОТІН

Віталій Ігорович

УДК 619:616.98:578.831.31(470):636.4

ДІАГНОСТИКА ЕНЗООТИЧНОЇ
ПНЕВМОНІЇ СВИНЕЙ МЕТОДАМИ
ПОЛІМЕРАЗНОЇ ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ
ТА ІМУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ

16.00.03 — ветеринарна мікробіологія,
епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків — 2011


Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор,
академік НААН
Стегній Борис Тимофійович,
Національний науковий центр
«Інститут експериментальної і клінічної
ветеринарної медицини», директор

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор
Білокінь Віктор Степанович,
Національний науковий центр
«Інститут експериментальної і
клінічної ветеринарної медицини»,
головний науковий співробітник
відділу вірусології;

доктор ветеринарних наук, професор
Ковальов Василь Львович,
Південний філіал Національного університету біоресурсів і природокористування України «Кримський агротехнологічний університет», завідувач кафедри мікробіології, епізоотології
і ветеринарно-санітарної експертизи

Захист відбудеться «03» листопада 2011 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий «01» жовтня 2011 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат ветеринарних наук     П. О. Шутченко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Свинарство в країнах світу зазнає значних економічних збитків через ензоотичну пневмонію свиней (ЕПС), яка спричинюється збудником Mycoplasma hyopneumoniae та характеризується переважно субклінічним перебігом у дорослих тварин і гострими респіраторними розладами у молодняка (Kobisch M. et al., 1996; Ross R. F. et al., 1999; Sirnecka E. R. et al., 1996). В умовах інтенсифікації промислового свинарства це завдає значних проблем і стримує розвиток галузі. Щорічно на ерадикацію ЕПС у країнах Західної Європи в середньому витрачають майже 500 млн. євро, а в США — більше 1 млрд. доларів (Clark L. et al., 1991; Zimmermann W. et al., 1996).

Як свідчать численні дані вітчизняних і зарубіжних авторів, труднощі, пов’язані з культивуванням мікоплазм та очищенням їх імунологічно значущих протеїнів для виготовлення специфічних діагностичних тест-систем, зумовлюють потребу в удосконаленні біотехнологічних прийомів, що стає можливим завдяки впровадженню високоефективних методів молекулярної біотехнології (Барышников П. И., 1999; Assuncao P. et al., 2006).

Існуючі засоби діагностики ЕПС базуються здебільшого на серологічних методах. Проте, літературні дані свідчать про перехресні реакції між антитілами до М. hyopneumoniaе з антигенами інших видів мікоплазм, насамперед M. flocculare та M. hyorhinis, що спотворює результати лабораторних досліджень (Freeman M. J. et al., 1984, Meens J. et al., 2006; Mori Y. et al., 1987; Nicolet J. et al., 1980).

Отже, розробка нових високоспецифічних засобів діагностики ЕПС на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та імуноферментного аналізу (ELISA) з використанням рекомбінантних антигенів набули особливого значення в усьому світі, адже вони дозволяють заощадити час і кошти в процесі виявлення мікоплазма-носіїв.

На цей час усе більше даних показують актуальність розробки методів ранньої діагностики ЕПС, що є найважливішою складовою в системі контролю поширення мікоплазма-асоційованих респіраторних хвороб у промисловому свинарстві. Розвиток новітніх технологій на основі молекулярно-генетичних методів відкриває нові перспективи щодо діагностики ЕПС, зокрема детекції мікоплазм і диференціації їх від інших збудників респіраторних хвороб свиней, проведення генотипування польових ізолятів і молекулярно-епізоотологічного моніторингу (Bousguet E. et al., 1998; Futo S. et al., 1995). Використання молекулярно-генетичних методів, які характеризуються високою специфічністю та чутливістю, є безумовно перспективним напрямом досліджень у встановленні джерела інфекції і шляхів передачі збудника на ранніх стадіях інфекційного й епізоотичного процесів та дозволяє значно скоротити термін постановки діагнозу на ЕПС (Ковалишин В. Ф. и др., 2006; Baumeister A. K. et al., 1998; Dubosson C. K. et al., 2004).

В Україні вітчизняні засоби діагностики та моніторингу мікоплазмозів свиней відсутні. Вищевикладене дає підставу визнати проведення детального епізоотологічного моніторингу щодо поширення ЕПС, визначення генетичної варіабельності штамів M. hyopneumoniae, виділених на території України, дослідження щодо філогенетичних взаємозв’язків з метою розробки ефективних систем виявлення хворих тварин і вдосконалення методів діагностики із застосуванням нових діагностичних препаратів і технологій на основі ELISA з рекомбінантними антигенами та ПЛР актуальними завданнями, виконання яких сприятиме встановленню ефективного контролю розповсюдження цієї інфекції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася впродовж 2004–2010 рр. згідно з тематичними планами наукових досліджень ННЦ «ІЕКВМ», затвердженими Національною академією аграрних наук України, за завданнями 04.04 «Розробити тест-системи для детекції збудників інфекційних захворювань за допомогою полімеразної ланцюгової реакції» (№ держреєстрації 0101U001616, 2004–2005 рр.) та 37.03004.01 «Провести дослідження господарств України щодо інфекційних пневмоній свиней мікоплазменної етіології та розробити систему контролю мікоплазмозу свиней» (№ держреєстрації 0107U003197, 2006–2010 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета досліджень — удосконалити систему лабораторної діагностики ЕПС (M. hyopneumoniae) шляхом розробки рекомбінантних антигенів для ELISA та тест-системи на основі ПЛР, провести моніторингові дослідження щодо поширення ЕПС у господарствах України та вивчити молекулярно-генетичні особливості ізолятів M. hyopneumoniae.

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

  1.  Провести біоінформатичний пошук та дослідити висококонсервативні гени основних антигенів M. hyopneumoniae.
  2.  Розробити систему клонування генів та отримати рекомбінантні клони E. coli на їх основі.
  3.  Отримати рекомбінантні протеїни M. hyopneumoniae та дослідити їх антигенні особливості за допомогою імуноблотінгу та ELISA.
  4.  Розробити видоспецифічну тест-систему для виявлення ДНК M. hyopneumoniae на основі ПЛР.
  5.  Провести епізоотологічний моніторинг свинарських господарств України з метою виявлення таких, у яких циркулює M. hyopneumoniae, та визначити діагностичну цінність молекулярно-генетичних і серологічних методів у системі контролю ензоотичної пневмонії свиней.
  6.  Виділити польові ізоляти M. hyopneumoniae та дослідити їх філогенетичні особливості.

Об’єкт дослідження: ензоотична пневмонія свиней.

Предмет дослідження: молекулярна епізоотологія ЕПС, засоби діагностики ЕПС, M. hyopneumoniae, методи виділення ДНК, тест-система для виявлення генетичного матеріалу M. hyopneumoniae за допомогою ПЛР, виділення польових ізолятів M. hyopneumoniae, філогенетичні зв’язки, рекомбінантні протеїни.

Методи дослідження: робота виконана з використанням клініко-епізоотологічних, бактеріологічних, молекулярно-генетичних, молекулярно-біотехнологічних, біоінформатичних, у тому числі математично-статистичних, методів досліджень.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні розроблено видоспецифічну тест-систему для детекції M. hyopneumoniae за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, встановлено її діагностичну ефективність і здійснено порівняльну оцінку розробленого методу з існуючими комерційними тест-системами ELISA.

Теоретично обґрунтовано та проведено біоінформатичні дослідження з пошуку імунологічно-значимих протеїнів M. hyopneumoniae. За результатами охарактеризовано ліпопротеїни Mhp366 та Mhp377, проведено клонування генів, що кодують ці протеїни у складі рекомбінантних плазмід, отримано трансформовані культури E. coliносіїв генів mhp366 та mhp377.

Уперше отримано імунологічні ф’южн-протеїни GSTMhp366 та GSTMhp377, які виявились придатними для застосування в якості антигенів для ELISA.

Досліджено філогенетичні взаємозв’язки 19 штамів та ізолятів M. hyopneumoniae, на підставі чого встановлено нові дані щодо спорідненості трьох з них, виділених у свинарських господарствах Харківської області, з ізолятами, що виділені від свиней в Данії.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень використано для розробки нормативної документації щодо виготовлення, контролювання та застосування тест-системи для виявлення ДНК M. hyopneumoniae методом полімеразної ланцюгової реакції «SuiDNAtestM. hyo» (ТУ У 24.400497087110:2010) та її впровадження в лабораторну практику.

Розроблено та впроваджено у лабораторну практику спосіб виявлення ДНК M. hyopneumoniae за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (деклараційний патент України на корисну модель № 31897, 2008 р.) та спосіб отримання трансформованої культури E. coli штаму DHα5F’, яка є носієм генів mhp366 та mhp377 та продукує рекомбінантний протеїн збудника ензоотичної пневмонії свиней (деклараційний патент України на корисну модель № 32904, 2008 р.). Розроблено «Методичні рекомендації щодо виявлення M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, A. pleuropneumoniae, H. parasuis, B. bronchiseptica, P. multocida та S. suis за допомогою полімеразної ланцюгової реакції», які затверджені науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 1 від 23–24 грудня 2009 р.).


Особистий внесок здобувача.
Особистий внесок дисертанта полягає в самостійному виконанні методичних, аналітичних і експериментальних робіт. Досліди з використанням таких методів, як культивування, клонування генів, отримання рекомбінантних клонів E. coli, експресія генів, отримання й очищення рекомбінантних протеїнів виконано під час стажування під патронажем професора G. Gerlach та за участю доктора J. Meens у лабораторії мікробіології Ветеринарного університету (м. Ганновер, Німеччина) у рамках гранта, що був наданий німецькою службою академічних обмінів (DAAD).

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені, обговорені та схвалені на: звітних сесіях вченої ради ННЦ «ІЕКВМ» у 2004–2010 рр.; міжнародних науково-практичних конференціях: «Ветеринарна медицина 2005: сучасний стан та актуальні проблеми забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва» (м. Ялта, 2005 р.) та «Ветеринарне забезпечення свинарства: сучасний стан і шляхи розвитку» (м. Харків, 2006 р.); щорічному симпозіумі «Zentrum für Infektionsmedizin» (м. Ганновер, Німеччина, 2007 р.); міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні проблеми патології, імунології та морфології», присвяченій 80-річчю доктора ветеринарних наук, професора, академіка НААН України Г. А. Краснікова (м. Харків, 2008 р.); міжнародному ветеринарному конгресі, присвяченому 85річчю з дня заснування ННЦ «ІЕКВМ» (м. Харків, 2008 р.); міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні проблеми біотехнології, стандартизації та забезпечення контролю якості ветеринарних препаратів, кормів та кормових добавок», присвяченій 10річчю Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (м. Київ, 2008 р.), міжнародній науково-практичній конференції «Моніторинг, прогнозування та профілактика інфекційних хвороб тварин з використанням сучасних методів епізоотології, молекулярної біології та біотехнології» (м. Феодосія, 2009 р.), міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Діагностика, лікування та профілактика хвороб тварин: проблеми, досягнення, перспективи» (м. Харків, 2010 р.), VIIй Всеросійській науково-практичній конференції «Молекулярна діагностика–2010» (м. Москва, Російська Федерація, 2010 р.).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковано у 13 наукових працях, з яких 9 — у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, у тому числі 2 одноосібні та описах двох патентів на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертації викладено на 124 сторінках комп’ютерного тексту та ілюстровано 16 таблицями і 24 рисунками. Робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів власних досліджень, висновків і пропозицій виробництву, списку джерел літератури, який містить 291 найменування, серед яких 249 — іноземних авторів, та додатків.


МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Роботу виконано в Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» впродовж
2004–2010 рр., частину досліджень проведено під час стажування у Ветеринарному університеті (м. Ганновер, Німеччина).

Аналіз геному M. hyopneumoniae 232 та пошук Вклітинних епітопів проводили за допомогою online програм Lipo, LipoP 1.0 та ABCpred. З метою вивчення імунної реактивності обраних епітопів використовували SPOTтехнологію (Frank R. et al., 2002).

M. hyopneumoniae культивували у модифікованому поживному середовищі Фріїса. Ізоляцію мікоплазм проводили у середовищі за пропису складу кандидата ветеринарних наук В. В. Кіприча.

Геномну ДНК M. hyopneumoniae 232 екстрагували за допомогою модифікованого фенол-хлороформного методу (Caron J. et al., 2000). Для напрацювання таргетних генів розраховували праймерні системи, що мали у своєму складі відповідні сайти рестрикції NotI, BsmBI та SmaI, а також заміни TGAкодонів на TGG. Клонування ділянок цільових генів і конструювання векторних систем на їх основі здійснювали за загальноприйнятою методикою (Sambrook J. et al., 1989), а також за допомогою комерційного набору TOPO TACloning (Invitrogen Inc., Німеччина) згідно з інструкцією виробника. Рекомбінантні клони E. coliносії генів M. hyopneumoniae отримували шляхом трансформації хімічно-компетентних клітин E. coli штаму DH5αF´ за допомогою експресійних векторних систем pGex5x3 з вбудованими ділянками таргетних генів.

Напрацювання GSTзлитих протеїнів здійснювали шляхом індукції tacпромотеру з використанням 1 мМ ІПТГ. Контроль експресії проводили за допомогою електрофоретичного розподілу білкових фракцій у 10,8 %му ПААГ за модифікованого методу U. Laemmli. Рекомбінантні протеїни очищали за допомогою вертикальної колонки Glutathion Sepharose 4B виробництва фірми Amersham Bioscience (Німеччина).

Очищені рекомбінантні протеїни використовували для іммобілізації на твердій фазі полістирольних планшетів «PolySorb» (Nunc, Данія) з метою проведення ELISA у трьох повтореннях.

Позитивну сироватку з антитілами до M. hyopneumoniae отримували від невакцинованих свиней, попередньо інфікованих інтратрахеально M. hyopneumoniae, штам 232, у дозі 10 см3 (105 колорзмінних одиниць (CCU) в 1 см3). Специфічна гіперімунна сироватка крові до M. hyopneumoniae була напрацьована за щеплення свиням комерційної вакцини Resiporc M. hyo 1 Shot (Impfstoffwerk, Dessau-Tornau GmbH, Німеччина) та використана в розведенні 1:100.

Гиперімунні сироватки крові кроликів з антитілами до M. hyopneumoniae J, M. hyorhinis BTS7, M. hyosynoviae S16 і M. flocculare MS42 виготовляли за такою методикою: отриманий центрифугуванням свіжої культури відповідного збудника та розчинений у ФСБ до загальної концентрації 500 мкг/см3 протеїн у рівних об’ємах з неповним ад’ювантом Фрейнда (Roche Diagnostics, Німеччина) вводили кроликам підшкірно на дорзальній поверхні дворазово з інтервалом в один місяць у дозі 1 см3 кожного антигену. Антитілоутворення контролювали за допомогою ІФА. Повне знекровлювання проводили через 3–4 тижні після другої вакцинації.

Зразки клінічного матеріалу від свиней з неблагополучних щодо пневмоній господарств різних регіонів України досліджували за допомогою висіву у поживні середовища і ПЛР. Екстракцію нуклеїнових кислот проводили за допомогою сорбентного методу (Boom R., 1990). Молекулярно-генетичні дослідження здійснювали методами класичної ПЛР (Kono Y., 1996; Sachse K., 2003; Staerk K. D., 1998; Герілович А. П., 2007) з метою детекції Mycoplasma spp. за геном 23S rRNA, M. hyopneumoniae — за геном mhp082, вірусів РРСС — за ORF6 та цирковірусів свиней другого серотипу за repгеном. Оптимізацію ампліфікаційних протоколів проводили шляхом визначення відповідних термічних (температури відпалу, денатурації та елонгації) і часових параметрів ампліфікаційних циклів, а також композицій реакційних сумішей. Польові зразки сироваток крові свиней досліджували із застосуванням комерційної тест-системи «IDEXX HerdChek M. hyopneumoniae» (IDEXX, США).

Під час виконання роботи використовували польові зразки M. hyopneumoniae: Mp18, Mp47, Mp73, Mp88, Mp182, Mp195, Mp263, Mp473, Mp529, Mp612, Mp654, що були виділені на території Данії; B2V2W20 та Oef91 — Бельгії; штам 3873 — Німеччини; VB_1A, VB_2A та VB_3A — Харківської обл.

Секвенування ДНК здійснювали з використанням методу термінаторів (Sanger F., 1980) і його сучасних модифікацій з автоматичним обліком у ДНКаналізаторі. З метою секвенування було використано фрагменти гена mhp366 M. hyopneumoniae (n = 19), напрацьовані за допомогою класичної ПЛР.

Під час філогенетичного дослідження послідовностей ДНК за допомогою програм BioEdit v. 5.1.1.7, MEGA v. 4.0, AmplifX v. 1.4, Clone Manager 7.0, FASTA online, BLAST online, Clustal W online та інших складали дендрограми, які аналізували за допомогою алгоритму Neighbor Joining. Аналіз філогенетичного дерева здійснювали шляхом візуальної оцінки його топографії і попарних відстаней між компонентами вибірки.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Отримання рекомбінантних протеїнів M. hyopneumoniae. За допомогою біоінформатичного аналізу повного геному референтного штаму M. hyopneumoniae для подальших досліджень було обрано 35 генів, які ймовірно кодують поверхневі ліпопротеїни. Комп’ютерний аналіз первинної та вторинної структури білків, що кодуються обраними генами, дозволив виявити три найбільш імовірні області формування локусів антигенних детермінант. За результатами цих досліджень було обрано 105 амінокислотних послідовностей та за допомогою SPOTтехнології сформовано панель синтетичних поліпептидів у трьох повтореннях 15вимірних ланцюжків з кроком 3 а. з. на нітроцелюлозній мембрані.

За допомогою сироватки крові свиней-реконвалесцентів установлено високу антигенну активність епітопу з протеїну Mhp366, проте реактивності по відношенню до гіперімунної сироватки крові не виявлено. Для більш поглибленого вивчення цього антигену необхідно було отримати його повний синтетичний аналог у формі ф’южн-протеїну.

Аналіз даних літератури показав, що серед усіх неохарактеризованих ліпопротеїнів мембрани M. hyopneumoniae найбільш перспективним прототипом був Mhp377. Тому наша увага була приділена отриманню рекомбінантного протеїну на основі цього білка.

Розраховані системи праймерів, що містили сайти ендонуклеаз та змінені кодони TGA, дозволили напрацювати ділянки генів mhp366 довжиною 802, 152, 345, 402 п. н. і mhp377 — 891, 192, 266, 299, 453 п. н., які вбудовували до експресійного вектора pGex5x3. Таким чином було сконструйовано дві експресуючі плазміди pMhp366500 та pMhp377500 довжиною 6 570 п. н. та 6 926 п. н. відповідно (рис. 1). Отриманими плазмідами проводили трансформацію хімічно-компетентних клітин E. coli з наступним відбором клонів за допомогою ампіцилінової селекції. У результаті серії проведених досліджень встановлено, що найбільший вихід білка (до 15 мг/дм3 культури) можна отримати за культивування бактеріальної маси впродовж 3 годин та додавання 1 мМ ІПТГ з метою індукції експресії цільових плазмід у клітинах E. coli.

Рис. 1. Карти сконструйованих експресійних векторів pMhp366500 і pMhp377500, у складі яких показані ділянки генів mhp366 і mhp377 M. hyopneumoniae референтного штаму 232.

Після проведення очищення (ефективність складала 97 %) концентрація препаративної форми білків GSTMhp366 та GSTMhp377 складала 0,28 та 0,3 мг/см3 відповідно.


Визначення рекомбінантних протеїнів.
Отримані протеїни використовували в якості антигену в непрямому варіанті ІФА з сироватками крові свиней-реконвалесцентів та гіперімунними сироватками крові свиней, а також поліклональними сироватками крові кроликів, що містили антитіла до M. hyorhinis BTS7, M. hyosynoviae S16 і M. flocculare MS42. У результаті проведеної перевірки найвищі показники оптичної щільності (OD) були отримані за розведення 1:100 сироваток крові хворих на ЕПС свиней (2,0385 ± 0,0112 — GSTMhp366, 2,2922 ± 0,0124 — GSTMhp377), у той час як гіперімунні сироватки мали значно меншу активність з отриманими химерними протеїнами (1,2379 ± 0,0131 — GSTMhp366, 1,4571 ± 0,0111 — GSTMhp377).

У реакції з сироватками крові кроликів, що містили антитіла до M. hyopneumoniae, було отримано високі показники оптичної щільності (2,9448 ± 0,0124 — GSTMhp366; 3,2813 ± 0,0298 — GSTMhp377). Поряд з цим при перехресній реакції для сироваток крові кроликів з антитілами проти M. hyorhinis показники становили 0,4021 ± 0,0141 — GSTMhp366 і 1,3614 ± 0,0131 — GSTMhp377, проти M. flocculare — 0,7767 ± 0,0128 — GSTMhp366 і 1,1217 ± 0,0114 — GSTMhp377, а проти M. hyosynoviae — 0,615 ± 0,0127 — GSTMhp366 і 0,7828 ± 0,0121 — GSTMhp377, що свідчило про високу специфічність химерних протеїнів. Крім зазначеного, отриманий протокол був порівняний за показниками чутливості та специфічності з комерційним набором «IDEXX HerdChek M. hyopneumoniae» (табл. 1).

Таблиця 1

Результати ELISA рекомбінантних протеїнів,
застосованих у якості антигену у порівнянні
з комерційною тест-системою фірми «IDEXX» (M ± m)

Сироватки крові імунізо-ваних кроликів (1:100)

GST-Mhp366,

OD405

GST-Mhp377,

OD405

IDEXX,

OD405

M. hyopneumoniae

2,9448 ± 0,0124

3,2813 ± 0,0298

3,1236 ± 0,0341

M. hyorhinis

0,4021 ± 0,0141

1,3614 ± 0,0131

1,4921 ± 0,0369

M. hyosynoviae

0,6150 ± 0,0127

0,7828 ± 0,0221

0,7352 ± 0,0419

M. flocculare

0,7767 ± 0,0128

1,1217 ± 0,0114

2,4767 ± 0,0246

Поряд із високим показником оптичної щільності в реакції з сироватками кроликів з антитілами проти M. hyopneumoniae (3,1236 ± 0,0341) було отримано високі показники також по відношенню до інших видів мікоплазм, зокрема до M. flocculare (2,4767 ± 0,0246) та M. hyorhinis (1,4921 ± 0,0369).

Розробка методики виявлення ДНК M. hyopneumoniae. З метою створення методики видоспецифічного виявлення ДНК M. hyopneumoniae на основі напівгніздової ПЛР нами були використані олігонуклеотиди oMhp366B та oMhp366Н (прямі), а також oMhp366A (зворотний), попередньо розраховані з метою клонування ділянки гена mhp366. Ці олігонуклеотиди фланкували фрагмент розміром 1 699 п. н. на першому етапі та 802 п. н. — на другому за умов гібридизації ДНК, виділеної з M. hyopneumoniae 232. З огляду на наявність у складі цього фрагмента варіабельної ділянки розмір амплікону складав 1 699 ± 20 та 790 ± 20 п. н. у залежності від ізоляту.

Отримані дані теоретичного аналізу системи праймерів oMhp366A/B/H шляхом порівняння їх послідовностей за алгоритмами BLAST та FASTA показали відсутність комплементарності до послідовностей ДНК інших бактерій, вірусів або еукаріот. Під час розробки методики виявлення ДНК збудника ЕПС необхідно було провести оптимізацію реакції за ряду параметрів, що включали температурні режими, кількість циклів, концентрації праймерів та іонів магнію. За результатами цих тестувань було встановлено, що за температури відпалу в межах від 47 до 50 °C поряд зі специфічним ампліконом з’являються неспецифічні за розміром смуги, що свідчать про димерізацію праймерів, а в інтервалі температур від 59 до 62 °C монофрагмент специфічного розміру взагалі не ампліфікується.

Було підібрано оптимальний склад реакційної суміші, який за об’єму в 25 мкл містив 2,5 мкл десятикратного ПЛР-буфера (з 1,5 мМ MgCl2), 2,5 ОД TaqДНКполімерази — 0,7 мкл, по 1 мкл кожного праймера oMhp366A/B/Н (з концентрацією 20 пМ/мкл), 2 мкл розчину dNTP (по 2,5 мМ/мкл кожного), 4 мкл розчину досліджуваної проби сумарної ДНК та 13,8 мкл деіонізованої води. Оптимальний протокол ампліфікації при цьому включав 35 (для напігніздового варіанта у двох раундах) та 40 ампліфікаційних циклів (класичний варіант), кожний з яких складався з денатурації за температури 94 °C впродовж 30 с, відпалу праймерів за температури 55 °C — 30 с та елонгації за температури 72 °C — 60 с. У результаті оцінки чутливості запропонованої методики з’ясовано, що поріг детекції її складає 100 фг/мкл або 90–100 мікробних клітин (напігніздовий варіант) або 0,8–10 пг/мкл ДНК, що приблизно дорівнює 8,3×103 клітинам M. hyopneumoniae (класична ПЛР). В якості позитивного контролю нами запропоновано плазмідну ДНК pMhp366500, сконструйовану на попередніх етапах досліджень.

Розроблена методика увійшла до рекомендацій щодо виявлення M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, A. pleuropneumoniae, H. parasuis, B. bronchiseptica, P. multocida та S. suis за допомогою ПЛР.

На основі розробленої методики була створена діагностична тест-система «SuiDNAtestM. hyo» (ТУ У 24.400497087110:2010), яка успішно пройшла міжлабораторні тестування та застосовується у моніторингових дослідженнях за господарчими договорами. На відміну від існуючих закордонних аналогів запропонована тест-система показала високі відсотки чутливості (до 95 %) та специфічності (до 100 %).

Моніторингові дослідження щодо виявлення хворих на ЕПС свиней в свиногосподарствах України. Наступні наші дослідження були спрямовані на виявлення ДНК M. hyopneumoniae за допомогою розробленої тест-системи у зразках клінічного матеріалу від хворих або загиблих тварин. Було досліджено 422 зразки клінічного матеріалу від свиней з респіраторною патологією та різним ступенем ураженості, що належали 68 господарствам з різних регіонів України (табл. 2).

Таблиця 2

Результати епізоотологічного моніторингу щодо ЕПС у 2005–2010 рр.

Область

Кількість
обстежених господарств
/ кількість господарств, в яких виявлено
М. hyopneumoniaе

Кількість дослід-жених свиней/ виявлено ДНК М. hyopneumoniaе 

Захворю-
ваність,
%

Харківська

23 /12

109 / 49

20–80

Дніпропетровська

6 / 3

69 / 16

40–60

Донецька

6 / 2

45 / 13

12–40

Полтавська

6 / 3

40 / 20

20–40

Луганська

3 / 1

26 / 3

до 30

Чернігівська

3 / 2

22 / 7

до 40

Інші області (11)

21/ 14

111 / 52

20–60

Разом

68/37

422/160

у серед-
ньому
40

З метою порівняння діагностичної чутливості розробленої методики виявлення ДНК збудника ЕПС та комерційної ELISA тест-системи «IDEXX HerdCheck M. hyopneumoniae CHEKIT» фірми «IDEXX» (США) при мікоплазмозі свиней були досліджені зразки сироваток крові ремонтних свинок віком 4–5 місяців, свиней на відгодівлі віком до 6 місяців та основних свиноматок, отриманих з НВП «Олімпекс-Агро» (Дніпропетровська обл.), філіалу «Єленовський» ТОВ «Агротіс» (Донецька обл.), двох приватних свиногосподарств (Херсонська обл.) й учбового господарства «Прогрес» Харківської державної зооветеринарної академії (Харківська обл.) на наявність антитіл до M. hyopneumoniaе, а також від цих тварин відбирали носові змиви з метою виявлення ДНК збудника ЕПС. Усього було досліджено матеріал від 91 тварини без клінічних ознак хвороби.

У результаті тестування зразків сироваток крові було встановлено, що 53 (58 %) з них мали антитіла до M. hyopneumoniae (значення S/P дорівнювало в різних пробах 0,8–1,3), що свідчило про мікоплазманосійство. У той же час за допомогою нашої методики ДНК мікоплазм було виявлено у 60 зразках (65 %) (табл. 3).

Зважаючи на відсутність антитіл у частини свиней, можна припустити, що інфекція була на ранніх стадіях, або індукція гуморального імунітету не відбувалась за рахунок імуносупресивного впливу інших збудників, наприклад, цирковірусу свиней другого серотипу (ЦВСІІ). З метою виявлення чинників, що ускладнюють перебіг ЕПС, нами були проведені додаткові дослідження клінічного матеріалу щодо наявності ДНК ЦВСІІ. У 34 з 91 зразка крові виявляли ДНК цирковірусів ІІго серотипу, що складало 37 % досліджуваних тварин. Завдяки ранньому виявленню мікоплазманосіїв у зазначених господарствах було розпочато своєчасну терапію, що в свою чергу дозволило ефективно локалізувати захворювання.

Таблиця 3

Результати дослідження зразків клінічного матеріалу
щодо ЕПС за ELISA та ПЛР (n = 91)

Вікові групи тварин

Кількість
обстежених тварин

З них позитивних
у ELISA/ПЛР

Основні свиноматки

39

28/30

Ремонтні свинки віком 4–5 місяців

29

14/19

Поросята на відгодівлі віком
до 6 місяців

23

11/11

Розлади респіраторного апарату у свиней різних статевовікових груп відмічали у 52 % дослідженого поголів’я. За допомогою загальнородової детекції установлено наявність генетичного матеріалу представників класу Mollicutes у 46 % зразках. У результаті проведення ідентифікації виявляли M. hyopneumoniae в 35 % від загальної кількості досліджених зразків клінічного матеріалу. Крім цього, 123 зразки додатково були досліджені щодо наявності вірусів РРСС та ЦВС2. У 4 % зразків виявляли тільки ДНК M. hyopneumoniae. У більшості випадків мікоплазмози перебігали в асоціації з ЦВСінфекцією (13 %) та РРСС (близько 11 %). У 8 % досліджених зразків виявляли генетичний матеріал вірусів РРСС і цирковірусів, а також M. hyopneumoniae. У негативних щодо мікоплазм зразках реєстрували РНК вірусу РРСС у 26 %, ДНК цирковірусів — у 23 % та асоціацію двох вказаних збудників — у 15 % досліджених зразків (рис. 2).

Рис. 2. Етіологічна структура змішаних респіраторних інфекцій свиней (n = 123).

Філогенетичні дослідження ізолятів M. hyopneumoniae. З огляду на встановлені нами можливості застосування антигенних детермінант протеїну Mhp366 з метою диференціації інфікованих і вакцинованих тварин нами було проведено детальне дослідження щодо виявлення замін у варіабельній ділянці гена mhp366 різних ізолятів M. hyopneumoniae, виділених у різних географічних регіонах. Для вирішення цієї задачі були досліджені екстракти ДНК з розплодок 17 ізолятів M. hyopneumoniae, які циркулювали на території Данії (n = 11), України (n = 3), Бельгії (n = 2) і Німеччини (n = 1). На підставі результатів попередніх досліджень нами було проведено ПЛР з праймерами oMhp366A та oMhp366B, що фланкують варіабельну ділянку довжиною 790 ± 20 п. н., для подальшого секвенування. Користуючись триплетним кодом, з отриманих нуклеотидних послідовностей отримували амінокислотні ланцюги, які потім вирівнювали за допомогою комп’ютерної програми BioEdit.

Множинне вирівнювання амінокислотних послідовностей продемонструвало тільки дві заміни у позиціях 75 (N/K) та 82 (N/D) відповідно, що підтвердило високу консервативність областей, які кодували імуногенні епітопи. За результатами проведених досліджень установлено, що VNTRділянка була представлена в усіх зразках.

Кількість тандемних повторень варіювала від 3 до 5, причому, більшість послідовностей містила по 4 копії, які відповідали амінокислотним послідовностям [KR] TE. Секвеновані фрагменти гена mhp366 ізолятів VB1A, VB2A, VB3A M. hyopneumoniae, що циркулювали в обстежених господарствах України, виявились ідентичними. В аналізованих послідовностях протеїну Mhp366 українських ізолятів було виявлено 6 амінокислотних замін у порівнянні з референтним штамом M. hyopneumoniae 232, протеїн якого використовували як матрицю вирівнювання.

За результатами філогенетичного аналізу отриманих послідовностей було побудовано дендрограму (рис. 3), яка показала наявність двох основних гілок. До першої гілки входило 2 кластери, перший з яких був сформованим з двох підкластерів. Ця група послідовностей включала 10 ізолятів, виділених від свиней в Данії, з невеликим відсотком дивергенції у середині групи — 2,2 %.

Другий підкластер містив послідовності місцевих ізолятів M. hyopneumoniae з показником числового індексу гілкування (BootStrap) 81. При цьому кількість відмінностей нуклеотидних послідовностей з референтним штамом 232 складала 11,8 %, а найвищі рівні дивергенції спостерігали по відношенню до штамів 7448, 3873, B2V2W20 та Oef91 — 14,3 %. До другого кластера увійшли референтний штам J, датський штам Мр47, а також бразильські PMS і 7442. Ця група мала показник числового індексу гілкування (BootStrap) від 51 до 62, дивергенція всередині групи складала 2,2 %.

Друга основна гілка була сформована двома кластерами, перший з яких містив референтний штам 233, що демонстрував 11,8 % відмінностей за аналізованою областю в порівнянні з другим кластером. Ця група включала штами, ідентифіковані в Бельгії та Німеччині, а також штам 7448, виділений у Бразилії. Зазначений кластер мав найвищий показник числового індексу гілкування (BootStrap) — 88, що свідчило про достовірність отриманих результатів.

Проведені філогенетичні дослідження протеїну Mhp366 збудника ЕПС показали, поперше, наявність цього протеїну в усіх досліджених ізолятах з різних географічних районів Європи. Подруге, отримані дані показали широкий діапазон замін амінокислотних залишків у межах протеїну Mhp366 у залежності від географічного походження ізолятів M. hyopneumoniae. Проведений аналіз дозволив визначити кореляцію послідовностей протеїну Mhp366 місцевих ізолятів з відповідними послідовностями інших ізолятів.

Рис. 3. Філогенетичні зв’язки між штамами та ізолятами M. hyopneumoniae (Neighbor Joining, Bootstrap = 1000, ізоляти, виділені в Україні, позначені кругом).

Обрана ділянка протеїну Mhp366 є досить варіабельним та формує декілька генетичних груп (кластерів). Досліджені ізоляти M. hyopneumoniae виявилися ідентичними та належали до одного кластеру. Однак, з огляду на розташування інших ізолятів у межах дендрограми у даному випадку генетичне різноманіття не було опосередковане ареалом збудника ЕПС. Філогенетична спорідненість польових ізолятів, які були виділені на території Харківської області, скоріш за все, пов’язана із занесенням інфекції у результаті переміщення племінних тварин-мікоплазмоносіїв у свинарських господарствах.

ВИСНОВКИ

1. У дисертаційній роботі на підставі проведеного комплексу клініко-епізоотологічних, патологоанатомічних, бактеріологічних, серологічних, молекулярно-генетичних та математико-біостатистичного аналізу вивчено епізоотичну ситуацію щодо ЕПС в Україні, визначено етіологічну роль M. hyopneumoniae у виникненні та поширенні ензоотичної пневмонії свиней та удосконалено систему її лабораторної діагностики за рахунок впровадження методології на основі полімеразної ланцюгової реакції.

2. Розроблено систему отримання синтетичних генів M. hyopneumoniae, що складається з напрацювання дев’яти ділянок фрагментів mhp366 та mhp377 довжиною від 152 до 891 п. н., які запобігають перериванню транскрипції, їх ампліфікації у клітинах E. coli, послідовного злиття у складі експресуючих плазмід pGex5x3 та реклонування. Отримані вектори-продуценти pMhp366500 та pMhp377500 мають виразні експресуючі властивості щодо продукції ф’южн-протеїнів у трансформованих бактеріях.

3. Очищені за методом GSTзалежної афінної хроматографії препаративні форми протеїнів GSTMhp366 та GSTMhp377 з концентрацією білка 0,28 і 0,3 мг/см3, індукованих в експресуючих клітинах E. coli, характеризуються високою імунореактивністю та специфічністю по відношенню до антитіл проти M. hyopneumoniae, які виявляються шляхом імуноблотингу та ELISA.

4. Розроблена методика виявлення ДНК M. hyopneumoniae з використанням праймерів oMhp366A/B/H на основі утворених ампліконів розміром 1699 ± 20 та 790 ± 20 п. н. дозволяє виявляти 90–100 мікробних клітин M. hyopneumoniae (100 фг/мкл ДНК) за гніздової ПЛР або 8,3×103 клітин (0,8–10 пг/мкл ДНК) за класичної ПЛР та повністю задовольняє діагностичні потреби. На основі зазначеної методики розроблена молекулярно-генетична тест-система «SuiDNAtestM. hyo», яка згідно комісійного тестування на відміну від існуючих ПЛР-методик є високочутливою (до 95 %) та специфічною (до 100 %) для детекції ДНК мікоплазм у клінічному матеріалі.

5. У результаті аналізу епізоотичного стану за допомогою ПЛР установлено циркуляцію збудника ензоотичної пневмонії свиней у 54,4 % обстежених свинарських господарств України, в яких середня ураженість свиней різних статевовікових груп сягає близько 40 %. У 13 % спалахів ЕПС хвороба мікоплазменної етіології реєструється в асоціації з цирковірусною інфекцією, у 11 % — з РРСС, у 8 % — РРСС та цирковірусною інфекцією. Генетичний матеріал M. hyopneumoniae виявляється у 4 % зразків матеріалу, вірусу РРСС —у 26 %, цирковірусу —у 23 % та асоціація цих збудників —у 15 %.

6. За результатами секвенування та вивчення генетичної спорідненості трьох ізолятів M. hyopneumoniae, виділених на території Харківської області, встановлено, що найбільша ступінь подібності властива їм по відношенню до ізолятів, виділених в Данії — 93,1 %, що може бути доказом їх спорідненості.

ПРОПОЗИЦІЇ ДЛЯ ПРАКТИКИ

1. Тест-система «SuiDNAtestM. hyo» (ТУ У 24.400497087110:2010) для виявлення ДНК M. hyopneumoniae (нормативна документація на технологію виготовлення розглянута та схвалена на засіданні методичної комісії ННЦ «ІЕКВМ», акт від 27 березня 2008 р.)

2. Методичні рекомендації щодо виявлення M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, A. pleuropneumoniae, H. parasuis, B. bronchiseptica, P. multocida та S. suis за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, які затверджені науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 1 від 23–24 грудня 2009 р.).

3. Спосіб отримання трансформованих E. coli штаму DHα5F’ носіїв генів mhp366 та mhp377, продукуючих рекомбінантний протеїн збудника ензоотичної пневмонії свиней (декл. патент України на корисну модель № 32904, 2008 р.).

4. Спосіб виявлення ДНК M. hyopneumoniae за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (декл. патент України на корисну модель № 31897, 2008 р.).

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Полiмеразна ланцюгова реакція у практиці ветеринарної медицини та біологічних дослідженнях [Текст] : наук.-метод. посібник / Стегнiй Б. Т., Герілович А. П., Лиманська О. Ю., Головко В. О., Біленко В. А., Болотін В. І., Герілович І. О., Стегній М. Ю., Сапко С. А., Солодянкін О. С., Стегній А. Б., Головко М. А., Вовк С. І., Рудова Н. Г. ; під заг. ред. Б. Т. Стегнія та А. П. Геріловича. — Х. : «НТМТ», 2010. — 228 с. (Дисертант провів літературний пошук, розробив і представив засоби молекулярно-генетичної діагностики респіраторних бактеріозів свиней).
  2.  Полiмеразна ланцюгова реакція у практиці ветеринарної медицини [Текст] : наук.-метод. посібник / Стегнiй Б. Т., Герілович А. П., Лиманська О. Ю., Болотін В. І., Скрипник А. В., Сапко С. А., Анічин Р. Ю. ; під заг. ред. Б. Т. Стегнія та А. П. Геріловича. — Х. : ННЦ «IЕКВМ», 2006. — 110 с. (Дисертант провів літературний пошук, розробив і представив засоби молекулярно-генетичної діагностики мікоплазмозу свиней).
  3.  Болотін, В. І. Розробка дуплексної ПЛР для виявлення контамінації біологічних препаратів мікоплазмами та збудником вірусної діареї ВРХ [Текст] / Болотін В. І. // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. — Х., 2010. — Вып. 94. — С. 60–62.
  4.  Діагностика мiкоплазмозу тварин [Текст] / Анiчин Р. Ю., Стегнiй Б. Т., Коваленко А. М., Болотiн В. I. // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. — Х., 2005. — Вип. 85, т. I. — С. 50–53. (Дисертант брав участь в експериментальних дослідженнях, аналізі одержаних результатів і підготовці матеріалів до публікації).
  5.  Диагностические подходы к молекулярно-генетической индикации микоплазмозов животных [Текст] / Коваленко А. М., Аничин Р. Ю., Болотин В. И., Скрыпник А. В., Гузь С. А., Белоконов И. И., Хотцель Х. // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. — Х., 2005. — Вип. 85, т. I. — С. 515–520. (Дисертант приймав участь в експериментальних дослідженнях і провів літературний пошук).
  6.  Мониторинговые исследования на микоплазмоз и репродуктивно-респираторный синдром свиней с использованием ELISA и PCR тестов [Текст] / Стегний Б. Т., Коваленко А. М., Гузь С. А., Скрыпник А. В., Болотин В. И., Аничин Р. Ю., Lipowski A. // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. — Х., 2006. — Вип. 86. — С. 307–312. (Дисертант відбирав клінічний матеріал, брав участь в експериментальних дослідженнях, аналізі одержаних результатів і підготовці матеріалів до публікації).
  7.  Отримання рекомбінантних клонів E. coli – носіїв генів збудника ензоотичної пневмонії свиней [Текст] / Болотін В. І., Герілович А. П., Стегній Б. Т., Меенс Й. // Вет. медицина : мiжвiд. темат. наук. зб. — Х., 2008. — Вып. 89. — С. 59–66. (Дисертант розробив схему отримання рекомбінантних клонів, провів експериментальні дослідження та підготовив матеріали до публікації).
  8.  Експресія генів mhp366 та mhp377 Мycoplasma hyopneumoniae в рекомбінантних клонах Е. coli та вивчення специфічності їх продуктів [Текст] / В. І. Болотін, А. П. Герілович, Б. Т. Стегній, Й. Меенс // Вет. біотехнологія : бюл. — К. : Дорадо, 2008. — № 13, т. 1. — С. 300–308. (Дисертант особисто провів усі експериментальні дослідження та проаналізував отримані результати).
  9.  Діагностика ензоотичної пневмонії свиней за допомогою полімеразної ланцюгової реакції [Текст] / В. І. Болотін, Б. Т. Стегній, А. П. Герілович, С. І. Вовк // Вісн. аграр. науки. — К., 2008. — Спец. вип., вересень. — С. 47–49. (Дисертант провів дослідження клінічного матеріалу від хворих свиней, проаналізував та узагальнив результати).
  10.  Болотін, В. І. Філогенетичний аналіз М. hyopneumoniae та вивчення амінокислотної послідовності варіабельної ділянки протеїну Mhp366 [Текст] / В. І. Болотін, А. П. Герілович, Б. Т. Стегній // Вет. біотехнологія : бюл. — К. : ДОРАДОДРУК, 2009. — № 15. — С. 57–62. (Дисертант провів дослідження варіабельної ділянки протеїну, обробку даних та їх узагальнення).
  11.  Characterization of a highly immunogenic Mycoplasma hyopneumoniae lipoprotein Mhp366 identified by peptide-spot array [Text] / J. Meens, V. Bolotin, R. Frank, J. Böhmer, G.F. Gerlach // Veterinary Microbiology. — 2010. — Vol. 142, issues 3–4. — P. 293–302. (Дисертант провів усі експериментальні дослідження, обробку даних та їх узагальнення).
  12.  Деклараційний патент на корисну модель № 31897 Україна, МПК 2006 С12N 7/00. Спосіб виявлення ДНК M. hyopneumoniae за допомогою полімеразної ланцюгової реакції [Текст] / Болотін В.І. (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Інт експерим. і клініч. вет. медицини». — № u200714142 ; заявл. 17.12.07 ; опубл. 25.04.08, Бюл. № 8. — 4 с.
  13.  Деклараційний патент на корисну модель № 32904 Україна, МПК 2006 С12N 7/00. Спосіб отримання трансформованих E. coli штаму DHα5F’ носіїв генів mhp366 mhp377, продукуючих рекомбінантний протеїн збуднику ензоотичної пневмонії [Текст] / Стегній Б. Т., Герілович А. П., Болотін В. І. (Україна) ; заявник та правовласник Нац. наук. центр «Інт експерим. і клініч. вет. медицини». — № u200714144 ; заявл. 17.12.07 ; опубл. 10.06.08, Бюл. № 11. — 4 с.
  14.  Болотін, В. І. Індикація збудника ензоотичної пневмонії свиней [Текст] / Болотін В. І., Герілович А. П., Стегній Б. Т. // Здоров’я тварин і ліки. — 2009. — № 4 (89). — С. 16–17. (Дисертант провів дослідження клінічного матеріалу від хворих свиней, проаналізував та узагальнив результати).
  15.  Болотин, В. И. Получение рекомбинантных клонов E. coli – носителей гена mhp639 M. hyopneumoniae [Текст] / Болотин В. И., Меенс Й. // VIIя Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Молекулярная диагностика – 2010», г. Москва, 24–26 нояб. 2010 г. : сб. тр. / Под ред. В. И. Покровского. — M., 2010. — Т. II. — С. 62–65. (Дисертант провів усі експериментальні дослідження, обробку даних та їх узагальнення).

Болотін В. І. Діагностика ензоотичної пневмонії свиней методами полімеразної ланцюгової реакції та імуноферментного аналізу. — Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 — ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія. Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини». Харків, 2011.

Дисертаційна робота присвячена удосконаленню діагностики ензоотичної пневмонії свиней (ЕПС) шляхом впровадження молекулярно-генетичних методів на основі ПЛР і застосування рекомбінантних антигенів для серодіагностики.

Охарактеризовано мембранні ліпопротеїни Mhp366 та Mhp377 M. hyopneumoniae, що мають імунологічне значення, синтетичні копії яких отримано in vitro у складі злитих GSTф’южнпротеїнів за допомогою технології рекомбінантних ДНК. Експериментально доведено їх високу специфічність і доцільність використання в якості антигену для проведення скринінгу свинопоголів’я щодо мікоплазмоносійства.

Розроблено методичні прийоми конструювання засобів молекулярної діагностики ЕПС (M. hyopneumoniae) на основі ПЛР. Створено діагностичну тест-систему «SuiDNAtestM. hyo» для виявлення ДНК M. hyopneumoniae, яка у комплексі з комерційними ELISA та засобами детекції вірусів, ускладнюючих перебіг ЕПС, дозволяє ефективно провести моніторингові дослідження, установити ступінь інфікованості поголів’я та мікоплазмоносійство, яка затверджена науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України.

Уперше проведено молекулярно-епізоотологічні та філогенетичні дослідження українських ізолятів M. hyopneumoniae, визначено їх зв’язки з іншими ізолятами збудника.

Ключові слова: ензоотична пневмонія свиней, Mycoplasma hyopneumoniae, методики виявлення ДНК, молекулярна епізоотологія, філогенетичний аналіз, секвенування, рекомбінантний протеїн, ліпопротеїн.

Болотин В. И. Диагностика энзоотической пневмонии свиней методами полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 — ветеринарная микробиология, эпизоотология, инфекционные болезни и иммунология. Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины». Харьков, 2011.

Диссертационная работа посвящена усовершенствованию диагностики энзоотической пневмонии свиней (ЭПС) путём использования молекулярно-генетических методов на основе ПЦР и создания рекомбинантных антигенов для серологической диагностики.

При проведении ряда экспериментов с помощью SPOTтехнологии и Вестерн блотинга при использовании сывороток крови свиней-реконвалесцентов определены иммунореактивные свойства липопротеина Mhp366 М. hyopneumoniae. Для этого на первом этапе исследований с применением биоинформатических методов прогнозирования иммунологично значимых пептидов была сконструирована панель, которая включала 105 потенциальных линейных Вклеточных эпитопов 35 предполагаемых липопротеинов, которые были, в свою очередь, также определены путём анализа insilico полного генома М. hyopneumoniae штамма 232.

Вместе с тем, согласно данным литературы, наиболее перспективным прототипом для изучения антигенных свойств возбудителя ЭПС считается липопротеин Mhp377. Указанные белки были выбраны с целью получения их синтетических копий. Сконструированы плазмиды pMhp366500 и pMhp377500 со встроенными генами mhp366 и mhp377 М. hyopneumoniae 232 для трансформации компетентных клеток E. coli DH5, с проведением последующей экспрессии и наработки рекомбинантных протеинов в составе GST (глутатионSтрансфераза)слитых белков, их очистки и изучения иммунологической реактивности и специфичности.

Проведенные исследования позволили получить два фьюжнпротеина GSTMhp366 и GSTMhp377, препаративная форма которых содержала 0,28 и 0,3 мг/см3 белка соответственно, что позволило использовать их в качестве антигенов при твердофазном варианте ELISA и постановке Вестерн блотинга. В результате этих исследований было показано их высокую активность и специфичность по отношению к сывороткам крови свиней-реконвалесцентов, а также к гипериммунным сывороткам крови свиней и кроликов, содержащих антитела против М. hyopneumoniae. Для определения специфичности полученных протеинов использовали гипериммунные сыворотки крови, содержащие антитела к основным видам микоплазм свиней (M. hyorhinis, M. flocculare и M. hyosynoviae). При этом была установлена незначительная перекрестная реакция GSTMhp377 с антителами к М. hyorhіnis, в то время как GSTMhp366 не прореагировал с данными сыворотками, что свидетельствовало об их высокой специфичности.

Разработана методика амплификации специфического участка гена mhp366 длиной 1699 ± 20 и 790 ± 20 п. н. с использованием праймеров oMhp366A/B/H при гнездовом и классическом вариантах ПЦР. Она позволяет обнаруживать 90-100 микробных клеток М. hyopneumoniae в 1 см3 образца, что полностью удовлетворяет мониторинговые потребности. На основе этой методики была создана диагностическая тест-система «SuiDNAtestM. hyo» для обнаружения М. hyopneumoniae в клиническом материале, которая показала высокую чувствительность и специфичность при проведении комиссионных испытаний. Использование этой тест-системы и коммерческих ИФАнаборов в комплексе с обнаружением вирусов, осложняющих течение ЭПС, позволили эффективно провести мониторинговые исследования и показать высокую степень распространённости данной инфекции среди свиней в 17 областях Украины.

По результатам проведенных исследований установлено циркуляцию возбудителя ЭПС в 54,4 % обследованных свиноводческих хозяйств Украины, при этом отмечали патологию дыхательных путей в среднем у 40 % свиней различных половозрастных групп. В 46 % случаев обнаруживали генетический материал микоплазм при использовании общеродовой ПЦР. В 37 % всех образцов выявляли ДНК М. hyopneumoniae. Для установления ассоциации М. hyopneumoniae, цирковирусов свиней 2-го серотипа и вирусов РРСС проведены дополнительные исследования 123 проб на наличие генетического материала указанных возбудителей. При этом 4 % проб исследуемого материала содержали только ДНК М. hyopneumoniae. В 13 и 11 % случаев микоплазменная инфекция протекала в ассоциации с ЦВСII и РРСС соответственно. 8 % исследованных образцов содержали генетический материал всех трёх возбудителей. В образцах, которые не содержали микоплазм, находили РНК вируса РРСС в 26 %, ДНК ЦВСII — в 23 % и наличие двух вирусов — в 15 % исследованных проб.

Впервые проведены ДНК-анализ и филогенетические исследования украинских изолятов М. hyopneumoniae. Гомологи вариабельного участка протеина Mhp366 были выявлены в 19 штаммах и изолятах M. hyopneumoniae, выделенных от свиней в разных странах. В результате проведенных исследований было установлено, что украинские изоляты M. hyopneumoniae показали наиболее высокий уровень подобия (93,1 %) по отношению к изолятам, выделенным на территории Дании.

Ключевые слова: энзоотическая пневмония свиней, Mycoplasma hyopneumoniae, методики выявления ДНК, молекулярная эпизоотология, филогенетический анализ, секвенирование, рекомбинантный протеин, липопротеин.

Bolotin V. I. Diagnostics of porcine enzootic pneumonia by PCR and ELISA. — Manuscript.

The dissertation thesis for the scientific degree of the candidate of veterinary sciences, speciality 16.00.03 — veterinary microbiology, epizootology, infectious diseases and immunology. National Scientific Center ‘Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine’. Kharkiv, 2011.

The thesis is devoted to the improvement of porcine enzootic pneumonia (PEP) diagnostic tools by the introduction of molecular genetic methods based on PCR and using recombinant antigens for serology tests. As the first step a peptide spot array was constructed. It was presented by 105 potential linear Bcell epitopes found in 35 putative lipoproteins, which were identified using insilico analysis in the genome of M. hyopneumoniae strain 232.

For the examination of the immunological reactivity and specificity two plasmids pMhp366500 and pMhp377500, carrying the mhp366 and mhp377 genes of M. hyopneumoniae were cloned and constructed. The expression and purification of the recombinant GST (glutathioneStransferase)fused proteins from an E. coli expression system were leaded. After cloning in E. coli DH5 two derived GSTfusion proteins containing Mycoplasma lipoproteins were isolated. Both proteins were recognized by porcine hyperimmune and convalescent serum in Western blotting. The purified recombinant GSTMhp377 shown in ELISA an insignificant cross-reaction only with M. hyorhіnis specific rabbit hyperimmune serum, whereas GSTMhp366 was only recognized by the positive control serum directed against M. hyopneumoniae, thereby indicating its species-specificity.

The amplification of mhp366 gene specific region with the length of 1699 ± 20 and 790 ± 20 bp using primers oMhp366A/B/H in nested and classic PCR was conducted. It allows detecting 90-100 microbial cells of M. hyopneumoniae in 1 ml (100 fg/ml DNA) sample that fully meets the diagnostic requirements. The diagnostic kit «SuiDNAtestM. hyo» was designed, which have shown highly sensitive and specific for M. hyopneumoniae detection in clinical material.

In 46 % of cases Mycoplasma spp. were detected. From the point of species identification, about 37 % belong to M. hyopneumoniae DNA. In the most cases, mycoplasma infection was in association with PCVII (16 %) and PRRS (11 %). 8 % of the studied samples showed genetic material of all mentioned agents. M. hyopneumoniae negative samples contained RNA of PRRS virus in 26 %, DNA of PCVII — in 23 %, and association of these two agents — in 15 % of the studied samples.

For the first time molecular-phylogenetic studies of Ukrainian isolates of M. hyopneumoniae were carried out. Homologs of the variable part of Mhp366 protein were shown to be present in 19 M. hyopneumoniae field and referent strains from different geographic origins. It was shown that Ukrainian isolates have much similarity to the Danish strains. With this, the homology was 93.1 %.

Keywords: Porcine enzootic pneumonia, Mycoplasma hyopneumoniae, DNA detection, molecular epizootology, phylogenetic analysis, sequencing, recombinant protein, lipoprotein.


EMBED MSGraph.Chart.8 \s


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

71329. ОСНОВЫ АВТОМАТИКИ. СИСТЕМЫ АВТОМАТИЗАЦИИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ПРОЦЕССОВ. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ 294.5 KB
  Автоматические системы применяемые при автоматизации производственных процессов в зависимости от характера и объема операций выполняемых ими можно разделить на системы автоматического контроля автоматического регулирования автоматического управления следящие...
71330. ЭЛЕМЕНТЫ АВТОМАТИКИ 886.5 KB
  Состав и конструкция сенсора определяются типом измеряемой величины и методом ее восприятия особенностями размещения датчика. Статическая характеристика датчика представляет собой зависимость изменения выходной величины от входной величины...
71331. Исполнительные элементы систем автоматики 856.5 KB
  В качестве исполнительных элементов в системах автоматики в основном применяют мощные электромагнитные реле магнитные пускатели контакторы электромагниты электромагнитные муфты электрические двигатели мембранные и поршневые гидравлические и пневматические двигатели.
71332. Общие сведения о микроэлектронике 183.5 KB
  Полупроводниковые ИМС полупроводниковый кристалл в толще которого выполняются все компоненты схемы: полупроводниковые приборы и полупроводниковые резисторы. Кристалл полупроводника помещают в герметизированный пластмассовый или стеклянный корпус имеющий выводы во внешнюю цепь.
71333. Становление полисной системы в Древней Греции 673.5 KB
  Время упадка переходный смутный хаотичный период между греческим классицизмом и могуществом Римской империи Нибур Период распространения эллинской культуры на Востоке и усвоения ее достижений народами Азии Дройзен Тарн Мейер Бенгтстон Политические и экономическое единство созданное...
71334. Історія України: Конспект лекцій 1000 KB
  Необхідність вивчення історії України у вищій школі випливає із актуальності і значимості досвіду минулих поколінь у нашому теперішньому і майбутньому житті, а також із громадянського обов’язку пошани і любові до своєї родини і Батьківщини.
71335. Избранные лекции по медицине катастроф: Учебное пособие 851.5 KB
  Включает: величину и характер возникших санитарных потерь; нуждаемость пораженных в различных видах медицинской помощи; условия проведения лечебно-эвакуационных мероприятий в зоне ЧС; санитарно-гигиеническую и санитарно-эпидемиологическую обстановку сложившуюся в результате ЧС...
71336. Методы компьютерных вычислений и их приложение к физическим задачам 1.99 MB
  Численные методы раздел математики который со времен Ньютона и Эйлера до настоящего времени находит очень широкое применение в прикладной науке. Примеры современных физических задач для решения которых используются численные методы – моделирование астрономических событий рождение...
71337. ПЕРВАЯ МИРОВАЯ ВОЙНА И ПОСЛЕВОЕННОЕ УСТРОЙСТВО МИРА 264.5 KB
  Обострение противоречий проявилось в ряде политических кризисов в начале века: Марокканский кризис Итало-турецкая война Боснийский кризис Балканские войны. В 1917 году Россия фактически выходит из войны; в апреле 1917 г. В ответ были выдвинуты контрпретензии: платой царских долгов ставили...