72044

МЕДИКАМЕНТОЗНИЙ ДИСБАКТЕРІОЗ У КОТІВ: ДІАГНОСТИКА ТА РОЗРОБКА ЗАСОБУ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ

Автореферат

Медицина и ветеринария

Кишкові дисбактеріози дрібних свійських тварин зокрема котів досить розповсюджені однак на цей час відсутні науково обґрунтовані дані щодо змін видового складу та кількісного співвідношення мікрофлори шлунковокишкового тракту при розвитку захворювання крім того при запровадженні...

Украинкский

2014-11-17

302.5 KB

0 чел.

PAGE   \* MERGEFORMAT 1

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ

І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

БОРДЮГОВА СВІТЛАНА СЕРГІЇВНА

УДК 619:616.34-07/.084:636.8

МЕДИКАМЕНТОЗНИЙ ДИСБАКТЕРІОЗ У КОТІВ: ДІАГНОСТИКА ТА РОЗРОБКА ЗАСОБУ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Київ – 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському національному аграрному університеті Міністерства аграрної політики та продовольства України

Науковий керівник – доктор ветеринарних наук, професор,член-кореспондент Національної академії аграрних наук України

Ушкалов Валерій Олександрович,

Державний науково-контрольний інститут біотехнології і штамів мікроорганізмів Міністерства аграрної політики та продовольства України, директор

Офіційні опоненти    доктор ветеринарних наук, доцент

Мазур Тетяна Василівна,

Національний університет біоресурсів і природокористування України, професор кафедри епізоотології та організації ветеринарної справи 

кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник

Обуховська Ольга Валерівна,

Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», завідувач лабораторії мікоплазмозів та сальмонельозів

Захист дисертації відбудеться  “14” червня 2011 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус №3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус №4, к. 28

Автореферат розісланий “13”травня 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради                       Н.Г. Грушанська

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Кишкові дисбактеріози дрібних свійських тварин, зокрема котів, досить розповсюджені, однак на цей час відсутні                    науково обґрунтовані дані щодо змін видового складу та кількісного співвідношення мікрофлори шлунково-кишкового тракту при розвитку захворювання, крім того, при запровадженні терапевтичних заходів практично не враховуються етіологічні фактори (Послов Г.А., Іларіонов В.Ю., 1999, 2006). Проте встановлення цих показників дасть можливість визначити не лише механізми розвитку дисбіотичних станів та їх тяжкості, але й дозволить розробити методику оцінки ефективності лікувальних та/або профілактичних заходів (Guilford W.G., 2001; Hall E.J., 2005; Jergens A.E., 2006). Необхідно зазначити, що нині є лише окремі повідомлення щодо методів корекції та профілактики дисбактеріозів котів (Данилевская Н.В., 2000; Washabau R.J., 2005; Marks S.L., 2006). З метою коригування дисбіотичних станів застосовують пробіотики – препарати, основу яких складають лакто- і біфідобактерії, виділені із шлунково-кишкового тракту інших видів тварин.   

Тому, актуальною проблемою є розробка пробіотичних препаратів на основі аутомікрофлори котів з метою їх подальшого застосування для лікування дисбактеріозів різної етіології (Janeczko S., 2008).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи є частиною наукових досліджень Луганського НАУ «Вивчення інфекційної патології молодняка сільськогосподарських і домашніх тварин, розробка ефективних заходів боротьби в господарствах південно-східної частини України» (державний реєстраційний номер – 0104U005403) та «Розробити систему заходів та ефективні засоби профілактики захворювань тварин, викликаних умовно-патогенними бактеріями» (державний реєстраційний номер – 0108U006381).

Мета і завдання дослідження. Встановити зміни видового складу та кількісного співвідношення кишкової мікрофлори  та фізіологічного стану котів при дисбактеріозі, розробити й апробувати пробіотично-сорбційний препарат, виготовлений на основі аутофлори кишечнику клінічно здорових котів.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

- встановити поширення захворювання котів на дисбактеріоз у місті Луганську;

- вивчити видовий склад та кількісне співвідношення мікрофлори кишечнику клінічно здорових котів та котів із розладами функції шлунково-кишкового тракту;

- визначити гематологічні, біохімічні та імунобіологічні показники в організмі котів при розвитку кишкового дисбактеріозу;

- створити пробіотично-сорбційний препарат для лікування котів при дисбактеріозах на основі лактобактерій, виділених із кишечнику клінічно здорових котів та визначити його ефективність.

Об’єкт дослідження – дисбактеріоз котів.  

Предмет дослідження – видовий склад мікробіоценозу шлунково-кишкового тракту котів у нормі та при дисбактеріозі, виробничі штами лактобактерій, технологія виготовлення препарату «Сорбелакт», метаболічні показники крові котів.

Методи дослідження. Під час виконання роботи використовували епізоотологічний аналіз, біологічний експеримент (визначення вірулентності ізолятів лактобактерій, біфідобактерій, ентеробактерій, стафілококів, ешерихій, псевдомонад, протея та дріжджоподібних грибів на лабораторних тваринах), бактеріологічні (дослідження основних культурально-морфологічних та біохімічних властивостей ізолятів бактерій), серологічні (визначення антигену збудника панлейкопенії котів), паразитологічні (визначення інвазійних чинників аскарозу, токсокарозу, лямбліозу та інших захворювань, які супроводжуються розладами шлунково-кишкового тракту та спричинені ендопаразитами), морфологічні дослідження показників крові, біохімічні (визначення основних біохімічних показників сироватки крові), імунологічні (дослідження факторів гуморального та клітинного імунітету), статистичні (підрахунок загальних статистичних показників числових експериментальних даних, визначення рівня вірогідності отриманих результатів, проведення дисперсійного, регресійного та пробіт-аналізів) методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вивчена динаміка змін видового складу та кількісного співвідношення мікрофлори шлунково-кишкового тракту у котів; встановлені етіологічні фактори , що зумовлюють розвиток дисбактеріозу; вперше запропановано комплексну методику діагностики дисбактеріозів у котів, визначено стадії дисбактеріозу у котів.

Отримано нові дані щодо біологічних властивостей (антагоністичної активності та адгезії) лактобактерій, які були виділені із шлунково-кишкового тракту котів. Встановлено вплив біологічних стимуляторів (аутолізат дріжджів, панкреатичний гідролізат казеїну, дріжджовий аутолізат крові) на накопичення біомаси лактобактерій. Розроблено новий пропис поживного середовища для культивування лактобактерій, використання якого забезпечує накопичення значно вищої (в 9,9 разів) порівняно з середовищем de Man, Rogosa, Sharpe (МРС), концентрації біомаси виробничих штамів лактобактерій. Одержані результати стали науковим підґрунтям розробки комплексного пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт». Отримано нові дані щодо терапевтичних ефектів, що виникають під впливом застосування розробленого препарату.

Наукова новизна одержаних результатів підтверджена деклараційними патентами № 28153 від 26.11.2007, № 32523 від 26.05.2008, №35832 від 10.10.2008, № 38395 від 12.01.2009.

Практичне значення одержаних результатів. 

Запропоновано до використання:

штам бактерії Lactobacillus plantarum «Victoria» 22 для виготовлення пробіотичного препарату;

спосіб виготовлення поживного середовища для культивування мікроорганізмів;

тверде поживне середовище «ПСЛ» для культивування лактобактерій.

Розроблено і випробувано в умовах виробництва комплексний пробіотично-сорбційний препарат «Сорбелакт» для корекції дисбіотичних порушень у котів, створений на основі лактобактерій, виділених із кишечнику клінічно здорових котів та іммобілізованих на сорбенті аеросил А-300 (ТУ У 24.4 – 00493669 – 004:2008 – 18. 12. 2008).

Матеріали досліджень є основою «Методичних рекомендацій щодо діагностики дисбактеріозів у котів» (Луганськ, 2009 р.), затверджених Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 2 від 25 грудня 2008 р.).

Теоретичні положення і практичні рекомендації, що отримані під час виконання дисертаційної роботи, впроваджені в навчальний процес факультету ветеринарної медицини ЛНАУ.

Особистий внесок здобувача. Здобувач за участю наукового керівника обґрунтувала науковий напрям, визначила програму досліджень, самостійно провела аналіз літературних джерел, провела лабораторні досліди, виконала статистичну обробку матеріалів, аналіз отриманих результатів та їх інтерпретацію, висновки і практичні пропозиції. Імунологічні дослідження виконано на базі міжкафедральної лабораторії кафедри педіатрії із інфекційних хвороб та дитячої хірургії Луганського державного медичного університету. Гематологічні та біохімічні дослідження крові піддослідних тварин виконували на базі приватного науково-виробничого підприємства «Полівет» м. Луганськ.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на: Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 10-річчю заснування факультету ветеринарної медицини Луганського НАУ (26–28 вересня 2007 р., Луганськ); VІІ Міжнародній науково-практичній ветеринарній конференції з проблем дрібних тварин (3–5 червня 2008 р, Одеса);  Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Діагностика, лікування та профілактика хвороб дрібних тварин: проблеми, досягнення, перспективи» (14–16 квітня 2010 р., Харків);  науково-технічному товаристві ім. І.Г. Мороза факультету ветеринарної медицини Луганського НАУ (20 квітня 2007 р.); щорічних звітних наукових конференціях Луганського національного аграрного університету 20062009 рр.

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладено у 11 наукових працях, у тому числі 8 статей у фахових виданнях і 1 методичні рекомендації, отримано 4 патенти України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 155 сторінках, складається зі вступу, 4-х розділів власних досліджень, висновків, пропозицій виробництву, списку використаних джерел, який включає 343 найменування, з них – 62 латиницею; містить 37 таблиць і 18 рисунків та у додатках наведено 8 документів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ,

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ

Робота виконана в період з 2006 по 2011 рр. на базі лабораторії факторних інфекцій кафедри епізоотології, патанатомії та судової ветеринарії та лабораторії кафедри хірургії і хвороб дрібних тварин факультету ветеринарної медицини ЛНАУ, імунологічні дослідження здійснювали на базі міжкафедральної лабораторії кафедри педіатрії із інфекційних хвороб та дитячої хірургії Луганського державного медичного університету, гематологічні та біохімічні дослідження проводили на базі приватного науково-виробничого підприємства «Полівет» м. Луганськ.

Досліджували біологічний матеріал, відібраний від 82 котів віком від 4-х місяців до 12 років із ознаками дисбактеріозу (діарея, здуття живота, блювота, відмова від корму, зневоднення). У піддослідних тварин відбирали зразки фекалій із прямої кишки для бактеріологічних та паразитологічних досліджень та проби крові для морфологічних, біохімічних та імунологічних досліджень.

Методи бактеріологічних досліджень. Від піддослідних тварин безпосередньо із прямої кишки відбирали 1,0 г фекалій стерильним ватним тампоном та переносили у стерильні, попередньо зважені пробірки з ізотонічним розчином в об’ємі 9 см3. З першої пробірки, яка вважалась за розведення 10-1, готували подальші розведення до 10-10, послідовно переносячи по 0,1 мл та 1 мл суспензії у пробірки з вихідним розведенням у наступні пробірки, у яких містилось по 9,9 см3 та 9,0 см3 відповідно стерильного ізотонічного розчину хлориду натрію.

Потім проводили посіви розведень на чашки Петрі з МПА, середовищем Сабуро, Ендо, Плоскирєва, Блаурока, MRS, пептонно-сольовим, магнієвим середовищем, жовтково-сольовим та вісмут-сульфіт агаром.

Кількість мікроорганізмів у 1 мл вихідного матеріалу (С) розраховували за формулою: С= (N/V)×К, де N – середня кількість колоній в одній бактеріологічній чашці; V – об’єм суспензії, яку наносять під час посіву на поверхню агару; К – кратність розведення.

Морфологію бактерій вивчали в мазках, пофарбованих за Грамом та Буррі-Гінсом. Подальшу ідентифікацію мікроорганізмів здійснювали за біохімічними властивостями відповідно до «Определителя бактерий Берджи» (1997). Було ізольовано 338 культур мікроорганізмів, які належать до 14 видів бактерій.

Для підтвердження або виключення медикаментозного дисбактеріозу визначали рівень антибіотика у крові за методом Козьмін-Соколова                  (Борисов Л.Б., Козьмін-Соколов Б.Н., 1984). Під час визначення в дослідній рідині пеніциліну, тетрациклінів, енрофлоксацину як тест-бактерії використовували типову культури Staphylococcus. aureus, а під час визначення стрептоміцину, цефазоліну, цефтріаксону та еритроміцину – Escherichia coli. Після інкубації висівів за температури 37 0С протягом (18–20) годин обліковували результати досліду за зміною прозорості середовища та його забарвлення індикатором, внаслідок розщеплення глюкози тест-бактеріями.

Концентрацію антибіотика визначали множенням найбільшого розведення дослідної рідини, затримуючого ріст тест-бактерій, на мінімальну концентрацію еталонного антибіотика, затримуючої ріст тих же тест-бактерій (Gales A.C., 2005).

Для встановлення дисбактеріозу паразитарної етіології використовували методи гельмінтоскопії та гельмінтоовоскопії. Гельмінтоовоскопію з метою знаходження яєць гельмінтів та спороцист простіших проводили методами нативного мазка за Г.А. Котельниковим та В.М. Хреновим (Котельников Г.А., 1991). 

З метою визначення збудника панлейкопенії використовували набір  парво-тесту, що призначений для експрес-діагностики парвовірусної інфекції м’ясоїдних шляхом виявлення антигену збудника парвовірусного ентериту собак, панлейкопенії котів та вірусного ентериту норок у фекаліях інфікованих тварин.

Після індикації та ідентифікації в ізольованих культурах мікроорганізмів визначали чутливість до антибактеріальних препаратів за допомогою методу серійних розведень у поживному агарі. У цьому разі було використано 11 антибактерійних препаратів (Moyaert H., 2005). Для порівняння ефективності антибактеріальних засобів робили розрахунок MIC50 за допомогою пробіт-аналізу.

Антагоністичну активність мікроорганізмів вивчали на щільних поживних середовищах за методом Н.С. Єгорова (Єгоров Н.С., 1979).

Адгезивні властивості молочнокислих бактерій, «кандидатів» у пробіотик, вивчали з використанням еритроцитів теляти, барана, кози, кроля, кота. Лактобактерії, що входять до складу препарату, вирощували протягом 1–2 діб на середовищі МРС-2. Як клітинний субстрат, використовували еритроцити барана, теляти, кози, кроля, кота, попередньо двічі відмиті фосфатно-буферним розчином шляхом центрифугування (300–1000 об/хв). Буфер являв собою 0,1М розчин натрію фосфату на ізотонічному розчині натрію хлориду (pH=7,2–7,3), на якому готували суміш еритроцитів концентрацією 100 млн/мл. Для постановки досліду на предметне скло наносили одну краплю буферного розчину, у якому суспензували по одній краплі (мікробіологічною петлею) суміші еритроцитів і мікроорганізмів з поживного середовища. Предметне скло з еритроцитами і мікроорганізмами поміщали у вологу камеру на 30 хв при температурі 37 oC, потім препарат висушували при тій же температурі, фіксували жаром; мікроорганізми фарбували за Грамом. Вивчення адгезії проводили за допомогою світлового мікроскопа. При оцінці адгезивних властивостей використовували середній показник адгезії (СПА), за який брали середню кількість мікроорганізмів, що прикріпилися до одного еритроцита. Підраховували не менше 25 еритроцитів за умови наявності не більше 5 еритроцитів в одному полі зору.

Методика виготовлення поживного середовища для культивування мікроорганізмів роду Lactobacillus. Тверде поживне середовище «ПСЛ» для культивування лактобактерій готували так: у колбу з хімічно чистого скла об’ємом 2000 см3 наливали 500 см3 дистильованої води, яку підігрівали до 50–60 ºС. Потім у колбі за вказаною послідовністю розчиняли такі компоненти: глюкозу (10,0 г), дріжджований аутолізат крові (50 см3), панкреатичний гідролізат казеїну (50 см3), агар мікробіологічний (25,0 г). Після розчинення інгредієнтів у колбу додавали дистильовану воду до 1000 см3, кип’ятили, доводили рН до 7,2, фільтрували дворазово через паперовий фільтр та автоклавували 30 хвилин за температури 121 ºС.

Методи контролю пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт». Визначення контамінації сторонньою мікрофлорою проводили згідно з ДСТУ 4483:2005.

Для визначення кількості мікроорганізмів в одиниці об’єму робили 10-кратні розведення на стерильному ізотонічному розчині натрію хлориду       (0,9 %). По 0,5–1,0 см3 кожного розведення переносили на поживні середовища: МРС-2, «ПСЛ», агар з гідролізованим молоком, знежирене молоко. Культивували посіви за температури 37 0С протягом (24–72) годин. Найбільше розведення, за якого не спостерігали ріст бактерій, приймали за кінцевий титр.
Перевірка на біохімічну активність проводилась шляхом посіву культури у пробірки із знежиреним молоком (доза посіву 0,2 см3 на 5 см3 молока).
Визначення нешкідливості цього препарату проводили шляхом біологічної проби на білих мишах. З цією метою розчин препарату вводили трьом дорослим білим мишам орально в дозі 0,5 см3. Спостереження за тваринами здійснювали протягом 3 діб.

Методи гематологічних, біохімічних та імунологічних досліджень. Вміст гемоглобіну у крові визначали гемоглобінціанідним методом, кількість еритроцитів та лейкоцитів – на сітці камери Горяєва, ШОЕ – в апараті Панченкова, лейкограму - у мазках крові, пофарбованих за Папенгеймом (Любина А.Я., Ілічева Л.П., Катасонова Т.В., 1984; Чумаченко В.Є., Висоцький О.М., Сердюк Н.О.,         Чумаченко В.В., 1990), лейкоцитарний індекс інтоксикації (ЛІІ) розраховували за формулою Кальф-Каліфа (1941). Визначення кількості Т-, В-лімфоцитів,                       Т-хелперів/індукторів, Т-супресорів/кілерів проводили в цитотоксичному тесті з моноклональними антитілами класів CD3+, CD4+, CD8+ і CD22+ (виробник Ortho Diagnostic Systems Inc., USA) за опублікованими методиками (Фролов В.М., 1990). Загальний рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та їх фракційний склад (великі, середні та дрібні) визначали методом преципітації за молекулярною масою в розчині поліетиленгліколю з молекулярною масою 6000 Дальтон (Digeon M., Laver M., Riza J., Bach J. F., 1970). Вміст загального білка визначали за біуретовим методом, сечовини – кольоровою реакцією з діацетилмоноксимом, креатиніну – кольоровою реакцією Яффе (з пікриновою кислотою), тимолової проби – за Хуерго і Поппер, активність α-амілази – методом Каравея, активність АлАТ і АсАТ – методом Райтмана і Френкеля, білірубіну – за методом Ієндрашика. Обчислювали також коефіцієнт Де Рітіса (Ткачук В.О., 2004).

Статистична обробка. Визначали середньоарифметичну (М), середньогеометричне (Мгеом), середньоквадратичне відхилення (σ), середньоквадратичну помилку (m), достовірність середньоквадратичної помилки (Pm), достовірність різниці (P), проводили пробіт-аналіз та регресійний аналіз за допомогою комп’ютерної програми Statіstіca 6.0 (Боровіков В.П., 2003;           Реброва О.Ю., 2002). Дисперсійний аналіз проводили за М.А. Плохінським (1970).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Поширення захворювання котів на дисбактеріоз у м. Луганськ. При проведенні аналізу даних ветеринарної звітності встановили, що у 40,2 % випадків реєструється захворювання вірусної етіології. Діагноз на бактеріальну патологію встановлювався у 28,1 % випадків, на паразитарні захворювання – 18,5 %, а на дерматофітози припадає 13,2 % від загальної кількості заразних хвороб. Визначили, що у групі захворювань бактеріальної етіології дисбактеріоз реєструється в 17,8 % випадків.

При дослідженні динаміки дисбактеріозу котів (n=89) встановлено, що серед самців дисбактеріоз зустрічається у 2 рази частіше, ніж серед самок: 69,7% та 30,3% відповідно. Максимальна захворюваність серед самців відмічається навесні (березень – травень), в середньому 20,3 %, у кішок максимальна захворюваність встановлена у травні та серпні – 6,8 %, взимку дисбактеріоз майже не зустрічається – 0–1,1 %. Найбільш високий відсоток захворювання відмічається у котів 1–5-річного віку (54,0 %).

Визначення змін видового складу та кількісного співвідношення мікрофлори фекалій клінічно здорових котів. При бактеріологічному дослідженні 14 проб фекалій від клінічно здорових котів було ізольовано 94 культури бактерій, які належать до 11 видів мікроорганізмів. Від усіх досліджених тварин було ізольовано культури Escherichia сoli (39,4 % ізольованих мікроорганізмів), від 11 тварин (78,6 % клінічно здорових тварин) – Lactobacillus acidophilus, Enteobacter aerogenes, Citrobacter freundii, що складає по 11,7 % від загальної кількості виділених мікроорганізмів. Значно рідше, (по 4,25 % ізольованих культур), виділяли Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus  plantarum, а Candida albicans та Staphylococcus aureus – лише по 2,1 %.

Встановлено, що кількісно переважають сапрофітні мікроорганізми родів Bifidobacterium (108-1010 колонієутворюючих одиниць (КУО) в 1 г фекалій), Lactobacillus (106-107 КУО в 1 г фекалій), а також умовно-патогенні мікроорганізми родів Staphylococcus та Escherichia (106 КУО в 1 г фекалій). Кількість таких умовно-патогенних ентеробактерій, як Klebsiellа та Citrobacter не перевищує 103 КУО в 1 г фекалій. Коефіцієнт співвідношення анаеробних та аеробних мікроорганізмів у здорових тварин 8,3±0,9 од. (коливався у межах від 6,5 до 10,1).

Вивчення етіологічних факторів дисбактеріозів. З цією метою було досліджено 82 проби фекалій, відібраних індивідуально. У цьому разі встановлено наявність антигену збудника панлейкопенії котів у 11 тварин (13,4 %) та у 33 котів (40,2 %) виділено інвазійні чинники збудників паразитарних захворювань (токсокарами заражені 15,8 % досліджених тварин, аскаридами – 11,0 %, діпілідіями – 7,3 % та лямбліями уражено 6,1 % котів), у 46,4 % тварин виявлено антибіотикоасоційований дисбактеріоз (рівень антибіотиків у крові більше, ніж    320 мкг/мл). У подальшому були проведені бактеріологічні дослідження проб фекалій (38 проб) тварин з антибіотикоасоційованим дисбактеріозом.

Визначення змін видового складу та кількісного співвідношення мікрофлори фекалій котів із розладами функцій шлунково-кишкового тракту. У результаті проведення бактеріологічних досліджень фекалій від 38 котів із розладами функції шлунково-кишкового тракту ізолювали 244 культури 14 видів бактерій. Частіше (39,7 % ізольованих мікроорганізмів) виділяли культури E. сoli як лактозопозитивні, так і лактозонегативні з гемолітичними властивостями. Від 24 тварин (63,1 %) виділили E. aerogenes (9,9 %), від 16 тварин (26,3 %) виділили C. freundii, C. albicans (по 6,6 %), L. plantarum виділені від 7 тварин (18,4 % досліджених тварин) та L. acidophilus від 15 тварин (39,5 %), що дорівнює 2,9 % та 6,1 % відповідно всіх ізольованих мікроорганізмів. Значно рідше, у 4–6 (10,5–15,8 %) тварин виділяли Bifidobacterium bifidum та Bifidobacterium аdolescentis (1,6–2,5 %). Необхідно відзначити появу у фекаліях хворих тварин мікроорганізмів, які не зустрічаються у клінічно здорових котів, а саме Proteus vulgaris (у 39,5 % випадків) – 6,1 % та Pseudomonas aeruginosa (у 10,5 % випадків) – 1,6 % від загальної кількості виділених мікроорганізмів.

За показником співвідношення анаеробів до аеробів у котів було встановлено чотири ступеня дисбактеріозу: коефіцієнт співвідношення анаеробів та аеробів 5,25±0,58 (діапазон співвідношення анаеробних мікроорганізмів до аеробних коливався у межах від 6,4 до 4,01) – дисбактеріоз першого ступеня; коефіцієнт співвідношення анаеробів та аеробів дорівнює 2,22±0,89 (4,0-0,42) – це другий ступінь дисбактеріозу; коефіцієнт співвідношення анаеробів та аеробів дорівнює 0,26±0,09 (0,44-0,08) – третій ступінь дисбактеріозу; відсутність анаеробних мікроорганізмів характеризує дисбактеріоз четвертого ступеня.

Вивчення антагоністичних властивостей молочнокислих бактерій, виділених із шлунково-кишкового тракту здорових котів. Встановили антагоністичну активність сапрофітних мікроорганізмів (представників родин Lactobacillus та Bifidobacterium) відносно до умовно-патогенних бактерій, виділених із шлунково-кишкового тракту котів із симптомами дисбактеріозу (табл. 1).

Таблиця 1

Антагоністична активність мікроорганізмів родів Bifidobacterium та Lactobacillus відносно до умовно-патогенних мікроорганізмів, виділених із кишечнику котів

Штами лакто- і                               біфідобактерій

Тест-культури

Зона затримки росту, мм

L. plantarum

«V» №22

L. acidophilus

№31Sd

L. acidophilus

№11L

L. acidophilus

№24

B. adolescentis

№23

B. bifidum

№25

E. сoli  O1 (n = 1)

0

0

0

0

0

0

E. сoli O2 (n = 1)

10

10

20

15

0

0

E. сoli O4 (n = 3)

10 – 21

0

0

16 – 24

0

0

E. сoli O9 (n = 2)

23 – 25

30

30

28 – 38

37

23

E. сoli O22 (n = 3)

18 – 23

4 – 15

3 – 25

19 – 23

20

17

E. сoli O83 (n = 6)

9-28

5 – 11

10 – 15

0 – 31

0

0

E. aerogenes (n = 4)

5 – 15

10 – 15

5 – 30

6 – 32

20

25

B.subtilis (n = 2)

12 – 28

1 – 11

20 – 24

8 – 30

0

0

C. freundii (n = 2)

20 – 23

15

18

22 – 27

22

18

K. pneumoniae (n = 5)

15 – 31

16 – 36

12 – 20

12 – 25

0

6

S. aureus (n = 4)

15 – 21

6 – 20

5 – 30

20 – 30

18

20

C. albicans (n = 2)

12 – 30

15

25

20 – 29

15

10

P. aeruginosa (n = 2)

30 – 34

2 – 3

1 – 3,5

18 – 36

S. pyogenes (n = 1)

24

30

S. lactis (n = 1)

0

0

0

0

P. vulgaris (n = 3)

12 – 18

11

1

11 – 30

Примітки: n – кількість ізолятів; до 10 мм – низька; 10-15 мм – середня; більш 15 мм – висока антагоністична активність; «–» – дослідження не проводили.

Проведені дослідження свідчать, що штами молочнокислих мікроорганізмів відрізняються за рівнем антагоністичної активності відносно до тест-культур: від низької (зона затримки росту (ЗЗР) тест-бактерій становить 0–3 мм) до високої (максимальна ЗЗР умовно-патогенних бактерій становить 38 мм).

Найвища антагоністична активність зареєстрована у штамів мікроорганізмів L. acidophilus № 24 та L. plantarum «Victoria» № 22.

Вивчення чутливості до антибіотиків мікроорганізмів, виділених із шлунково-кишкового тракту котів, хворих на дисбактеріоз. При визначенні чутливості 244 культур мікроорганізмів, виділених із кишечнику котів, хворих на дисбактеріоз до 11 антибактеріальних засобів встановлено, що in vitro найбільший інгібуючий вплив на усі виділені мікроорганізми мають амоксицилін, рифампіцин та цефтріаксон (МІК50 цих антибіотиків не перевищує 5 мкг/мл). МІК50 бензилпеніциліну натрієвої солі та гентаміцину сульфату варіює від 43,3 до                 93,5 мкг/мл, що свідчить про виникнення резистентності до цих антибіотиків як сапрофітної, так і умовно-патогенної мікрофлори і пояснює низьку терапевтичну ефективність цих антибактеріальних препаратів у клінічній практиці.

Визначення біологічних властивостей виробничих штамів лактобактерій, які входять до складу комплексного пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт». Для виготовлення комплексного пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт» використовували штами Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22 і Lactobacillus acidophilus № 24, які були ізольовані із фекалій клінічно здорових тварин і є не патогенними для білих мишей, мурчаків, собак та котів у дозі 1 млрд мікробних клітин за внутрішньочеревного введення.

Вони являють собою аспорогенні, нерухомі, грампозитивні палички завдовжки 4–6 мкм, правильної форми із заокругленими краями, які утворюють ланцюжки різної довжини. Це факультативні анаеробні мікроорганізми, які на живильному середовищі MRS-2 (рН – 6,5) дають щіткоподібний ріст у середній та нижній частинах пробірки. На поверхні твердих живильних середовищ (MRS-4, агар з гідролізованим молоком) ростуть у вигляді круглих, гладких, дрібних, блискучих, білих тягучої консистенції непрозорих колоній, краї колонії рівні.

Штами лактобактерій окиснюють глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, рафінозу та фруктозу з утворенням кислоти без газу. Крім зазначених цукрів, Lactobacillus plantarum «Victoria» №22 окиснює арабінозу та маніт, а Lactobacillus acidophilus № 24 – галактозу та саліцин.

Культура мікроорганізмів Lactobacillus acidophilus № 24 згортає знежирене молоко протягом 24–48 годин з концентрацією 106 м.к. у 1 см3, утворює кислоту у знежиреному молоці з кислотністю 1600 за Тернером. Культура Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22, яка згортає знежирене молоко протягом 48 годин з кислотністю 2180 за Тернером, у молоці має концентрацію 108 м.к. у 1 см3.

Встановлено, що досліджені штами були стійкими до дії бензилпеніциліну натрієвої солі, оксациліну, карбеніциліну, стрептоміцину, неоміцину, клафорану, гентаміцину, лінкоміцину, еритроміцину, левоміцетину, тетрацикліну, цефазоліну, поліміксіну та метронідазолу.

Адгезивні властивості штамів бактерій Lactobacillus acidophilus № 24 та Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22 наведено в табл. 2.

Таблиця 2

Індекси адгезивності мікроорганізмів – кандидатів у пробіотики

Мікроорганізми

Індекс адгезивності мікроорганізмів

до еритроцитів

теляти

барана

кози

кролика

кота

Lactobacillus acidophilus № 24

4,8

7,6

5,3

11,2

8,7

Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22

6,1

8,3

5,0

7,9

6,6

Середній показник адгезії для Lactobacillus acidophilus № 24 становив 7,52, для Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22 – 6,78, що розцінюється як адгезивність високого ступеня (за методикою від 4,01 і більше).

Стабільність основних властивостей штамів: штами бактерій Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22 та Lactobacillus acidophilus № 24 зберігають свої властивості у знежиреному молоці в умовах рефрижератора при + 4–6 °С протягом 6 місяців. Стабільність генетичних властивостей: у дослідних штамів не спостерігається дисоціація протягом 6 місяців при періодичних пересівах у знежирене молоко.

Розробка поживного середовища для культивування мікроорганізмів роду Lactobacillus. З метою розробки поживного середовища, застосування якого забезпечило би більш високе накопичення лактобактерій, дослідили дію трьох поживних домішок. За основу взяли пропис МПБ, до складу якого були введені аутолізат дріжджів (І), панкреатичний гідролізат казеїну (ІІ), дріжджовий аутолізат крові (ІІІ).

Введення до складу середовища 20,0 % домішки І забезпечувало накопичення лактобактерій в межах 11,775×10 9 КУО/см3, що в 2,9 разів більше ніж на середовищі МРС (показник сили впливу 0,95). При введені 20,0 % домішки ІІ реєстрували накопичення 68,225×10 9 КУО/см3, що в 9,9 разів більше ніж на МРС (показник сили впливу 0,98). Додавання до МПБ 20,0 % домішки ІІІ забезпечувало накопичення лактобактерій 35,5×10 9 КУО/см3, що в 7,2 разів більше ніж на МРС (показник сили впливу 0,94). Встановлені показники сили впливу вказували на те, що приріст лактобактерій залежить від поживних домішок на 95, 98 та 94 % і відповідно на 5, 2 та 6 % від інших факторів, які були невраховані в досліді. Емпіричний показник достовірності перевищував третє стандартне значення               (Fst =7,1), що вказує на стимулюючий вплив цих факторів росту на інтенсивність росту лактобактерій із найвищим ступенем вірогідності (B > 0,999).

На основі отриманих даних розробили склад середовища «ПСЛ» для культивування лактобактерій (Пат. № 35832 від 10.10.2008).

Спосіб виготовлення комплексного пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт». В основу створення комплексного пробіотично-сорбційного препарату для корекції дисбіотичних порушень у дрібних тварин «Сорбелакт» поставлено задачу використати отримані штами лактобацил, які мають виражені антагоністичні властивості відносно патогенних і умовно-патогенних бактерій – ініціаторів дисбіотичних кишкових зрушень у дрібних тварин.

Комплексний пробіотично-сорбційний препарат для корекції дисбіотичних порушень у дрібних тварин «Сорбелакт» являє собою дрібнодисперсний порошок білого або кремового кольору. Один грам препарату містить: біомасу лактобактерій Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22 – 2,5 млрд мікробних клітин та Lactobacillus acidophilus № 24 – 2,5 млрд мікробних клітин, іммобілізовані на сорбенті (аеросил 300). Препарат виготовляли згідно із нормативною документацією (ТУ У 24.4 – 00493669-004:2008)

Визначення терміну життєздатності виробничих штамів лактобактерій, які входять до складу препарату «Сорбелакт». Термін придатності препарату при його зберіганні за кімнатної температури (+23± 20С), в умовах побутового холодильника (0+4 0C), у морозильній камері (–12±20С) та в термостаті при температурі +37±1 0С встановлювали шляхом визначення кількості живих мікроорганізмів, спостереження вели протягом 18 місяців. У процесі зберігання препарату проводили підрахунок мікроорганізмів в перші три місяці кожні 10 днів, у наступні три місяці – 1 раз на місяць, а потім – один раз на три місяці. Встановлено, що протягом 12 місяців зберігання за різних умов кількість живих мікроорганізмів у складі препарату знизилась на 20,0 %, що свідчить про термін придатності розробленого препарату без втрати активності 12 місяців.

Визначення лікувальної ефективності препарату «Сорбелакт» у котів. Для випробувань було сформовано чотири групи хворих тварин-аналогів (віком 3–5 років, безпородні, масою 4–5 кг), у яких за допомогою лабораторних досліджень встановлено антибіотикоасоційований дисбактеріоз. До першої групи належало 6 котів, яких лікували препаратом «Сорбелакт» До другої групи належало шість тварин, яких лікували з використанням пробіотика  Ветом 1.1. До третьої групи тварин належало 5 котів, для лікування яких використовували активоване вугілля. Четверта група тварин (5 голів) була контрольною, котів не лікували.

Ефективність лікувальних заходів контролювали комплексно, враховуючи клінічний стан, динаміку кількісних змін лакто-, біфідо- та ентеробактерій, біохімічні та морфологічні показники сироватки крові хворих котів.  

Результати мікробіологічних досліджень. Аналіз отриманих даних дає підстави стверджувати, що найбільш ефективним засобом для лікування тварин із розвинутим антибіотикоасоційованим дисбактеріозом порівняно з іншими, є розроблений препарат «Сорбелакт». Поліпшення стану котів, яких лікували вищенаведеним препаратом, наставало на 3–4 добу досліду (із дисбактеріозу ІV ступеня він переходив у дисбактеріоз ІІ ступеня), одужання – на 7-му (при І-ІІІ ступені дисбактеріозу) або 11–13 добу (при ІV ступені). У котів із ІV ступенем дисбактеріозу на початку лікування лактобактерії із вмісту кишечнику не висівались. У тварин І групи ці мікроорганізми з’явилися на 3 добу лікування, у котів ІІ групи – на 5 добу, а в котів ІІІ та ІV груп вони заселили кишечник лише на 23 добу лікування.

Гемолітичні ешерихії, кількість яких на початку лікування становила 107–108 КУО в 1 г фекалій, зникали із вмісту кишечнику котів І групи на 5–7 добу лікування, у котів ІІ групи на 7–11 добу лікування, у котів ІІІ дослідної групи на 9-у (тварини із І–ІІІ ступенем дисбактеріозу) та 15-у добу (ІV ступінь), у тварин контрольної групи зазначені ешерихії зникають із вмісту фекалій на 17 та 23 (ІV ступінь дисбактеріозу) добу досліду. До початку лікування коефіцієнт співвідношення у кількісному складі серед виділених анаеробних та аеробних мікроорганізмів становив у першій групі 0,2±0,05 од. у другій групі – 0,15±0,05 од., у третій групі котів 0,14±0,02 од. та у контрольній групі тварин 0,13±0,01 од.

На 7-му добу лікування коефіцієнт співвідношення поміж виділеними культурами анаеробів та аеробів становив у І групі тварин 8,6±0,2 од. (референтний інтервал 8,1–9,1); у ІІ – 6,6±0,1 од. (5,6-7,6); у ІІІ – цей коефіцієнт дорівнював 3,15±0,4 од. (2,15–4,15); у ІV групі 3,02±0,4 (2,02–4,02). Це свідчить про те, що застосування препарату «Сорбелакт» призводить до встановлення найбільш сприятливої рівноваги поміж сапрофітними та умовно-патогеними мікроорганізмами.

Результати морфологічних, біохімічних та імунологічних досліджень крові котів. До початку терапевтичного курсу морфологічні та біохімічні показники крові котів усіх дослідних груп вірогідно не відрізнялися (табл. 3).

Таблиця 3

Показники крові котів до початку терапевтичного курсу

Показники

Клінічно здорові,

n=6

Контрольна група,

n=5

Перша дослідна група, n=6

Друга дослідна

група, n=6

Третя дослідна група, n=5

ЛІІ, од.

1,5±0,07

1,9±0,1○○

2,5±0,3○○

3,0±0,44○○

2,3±0,2

АлАТ, ммоль/год.×л

0,38±0,04

1,12±0,06

1,07±0,08

1,16±0,06 ○○○

1,13±0,07

АсАТ, ммоль/год.×л

0,32±0,01

0,77±0,05

0,97±0,1○○

0,63±0,07

0,84±0,1

Загальний білок, г/л

61,8±0,67

53,4±1,8

53,6±1,5

54,7±1,4

53,6±1,8○○

Примітки: -р<0.05; ○○<0,01; ○○○<0,001 – порівняно з клінічно здоровими.

Спостерігалося значне підвищення лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛІІ), зростання активності аспарагінової та аланінової трансаміназ та зниження вмісту загального білка у сироватці крові хворих котів до початку лікування, що свідчить про деструкцію гепатоцитів та розвиток ендогенної інтоксикації внаслідок отруєння організму котів продуктами життєдіяльності умовно-патогенних бактерій, які розмножуються у шлунково-кишковому тракті за дисбактеріозу.

На 7-му добу лікування відбулося зниження ЛІІ у котів першої групи на 40,0 %, що у межах клінічно здорових тварин, у котів другої групи зазначений показник знизився на 46,7 %, у тварин третьої групи на 19,6 %, що вище лейкоцитарного індексу інтоксикації у клінічно здорових тварин на 6,25 % та 18,9 % відповідно. ЛІІ у котів контрольної групи не змінювався (табл. 4).

Таблиця 4

Показники хворих котів, які характеризують дисбактеріоз на 7-му добу лікування

Показники

Клінічно здорові, n=6

Контрольна група, n=5

Перша дослідна група, n=6

Друга дослідна

група, n=6

Третя

дослідна група, n=5

ЛІІ, од.

1,5±0,07

1,9±0,1 ○○

1,5±0,1 ○○ ***

1,6±0,1 **

1,85±0,2 **

АлАТ, ммоль/г×л

0,38±0,04

1,1±0,06

0,4±0,06 *

1,0±0,03 ○○○

1,07±0,09

АсАТ, ммоль/г×л

0,32±0,01

0,76±0,04

0,37±0,04 ○○ *

0,6±0,06

0,8±0,07

Загальний білок, г/л

61,8±0,67

53,2±1,3

60,3±2,1 **

56,6±1,6 *

54,4±1,9 ○○ *

Примітки:

1. -р<0.05; ○○<0,01; ○○○<0,001 – порівняно з клінічно здоровими;

2. *-р<0.05; **-р<0,01; ***-р<0,001 – порівняно з контролем.

У котів, яких лікували препаратом «Сорбелакт», рівень загального білка у сироватці крові збільшився на 12,5 % (наближався до рівня клінічно здорових тварин), у котів, яких лікували препаратом Ветом 1.1 – на 3,4 %, у тварин яких лікували активованим вугіллям на 1,5 %, а у котів контрольної групи знизився на 0,4 %. У крові котів першої групи активність ферментів АсАТ та АлАТ зменшилась у 2,6 раза, що було у межах показників клінічно здорових тварин. У котів другої групи активність АсАТ та АлАТ знизилась на 4,7 % та 13,8 % та перебували у 1,9 та 2,6 раза відповідно вище ніж показники клінічно здорових тварин. У котів третьої дослідної групи активність АсАТ та АлАТ знизилась на 4,8 % та 5,3 % відповідно, що у 2,5 та 2,8 раза вище ніж у клінічно здорових тварин. У крові тварин контрольної групи активність аспарагінової та аланінової амінотрансфераз знизилась на 1,0 % та 1,8 %, що у 2,4 та 2,9 раза відповідно вище активності зазначених амінотрансфераз клінічно здорових тварин. Оскільки активність трансаміназ завжди підвищується при порушеннях функції печінки, які викликані не повним засвоєнням кормів внаслідок зменшення корисної мікрофлори, котра бере участь у процесах травлення, зниження концентрації зазначених показників у тварин першої групи на 7-му добу лікування свідчить про відновлення функції печінки.

Отримані нами експериментальні дані свідчили про низький імунобіологічний статус котів із симптомами дисбактеріозу. У тварин дослідних груп суттєво нижче рівень СD3+ клітин (18,9–48,7 % в абсолютних числах і на 23,1–34,8 % у питомих величинах порівняно із клінічно здоровими тваринами) у котів контрольної групи в абсолютних числах рівень Т-лімфоцитів вище на         28,3 %. Показник субпопуляції СD4+ клітин у дослідних тварин поступається у 2 рази у відсотках та 2,5–3 рази в абсолютних числах показникам клінічно здорових тварин. Кількість 0-клітин збільшена на 18,2–38,5 % (перша–третя групи тварин) та у 2 рази (контрольна група котів). Зростання рівня 0-лімфоцитів вказує на диференційні зміни процесів імунопоезу (імунний дисбаланс) і характеризує низьку функціональну активність Т-лімфоцитів внаслідок депресії рецепторів СD3+ клітин.

Імунологічні показники СD 3+, СD 4+ та СD 8+ у котів першої дослідної групи перебували в межах норми з 7-ої доби лікування, у тварин другої групи – 14-ої доби, а в котів третьої дослідної групи із 21-ої доби і дорівнювали відповідно: кількість СD 3+ клітин 0,67±0,05 г/л, 1,0±0,08 г/л та 1,16±0,1 г/л; вміст СD 4+ клітин 0,46±0,04 г/л, 0,7±0,05 г/л та 0,8±0,05 г/л; рівень СD 8+ клітин 0,2±0,02 г/л, 0,3±0,03 г/л та 0,85±0,4 г/л. У тварин контрольної групи рівень СD 3+ клітин перебував у межах клінічно здорових тварин із 21-ої доби (0,8±0,09 г/л), рівень 0-лімфоцитів та ІРІ протягом періоду спостереження не досягали рівня клінічно здорових тварин.

Слід зазначити, що дрібно- та середньомолекулярні циркулюючі імунні комплекси довго знаходяться у крові та недостатньо фагоцитуються макрофагами; спроможні активувати систему комплементу і фіксуватися на ендотелії за допомогою рецепторів, викликаючи руйнацію ендотелію і, таким чином, проявляють більш патогенну дію, ніж великомолекулярні ЦІК. Тому слід докладніше зупинитися на коливаннях кількості зазначених імунних комплексів у процесі лікування (рис.1). У котів першої дослідної групи кількість середньо- та дрібномолекулярних ЦІК зменшується на 7-му добу досліду на 42,4 % та 54,3 % відповідно і перебувають у межах норми. У тварин другої групи кількість зазначених імунних комплексів досягає норми на 14-у добу лікування (кількість середніх знизився на 41,8 %, дрібних – на 66,7 %), а у тварин третьої групи на 21–у добу лікування (кількість дрібних зменшилась на 67,0 %, середніх – на 57,5 %). У тварин контрольної групи рівень середніх та дрібних ЦІК на 21-у добу лікування знизились на 14,3 % та 29,5 %, однак зазначені показники були у 1,7 та 1,8 разів відповідно вище рівня клінічно здорових тварин.

Рис. 1. Динаміка змін дрібно- та середньо молекулярних ЦІК у крові котів хворих на дисбактеріоз у процесі лікування. 

Порівнюючи отримані дані до та після проведеного лікування, встановили, що у крові котів, для лікування яких застосовували “Сорбелакт”, бактеріологічні, морфологічні, біохімічні та імунологічні показники наближаються до норми на 7-у добу лікування. Отже, стан клінічного одужання підтверджується стабілізацією показників природної резистентності. Слід зазначити, що показники природної резистентності у тварин інших дослідних груп наближаються до норми: у тварин першої групи – на 14-у добу лікування, в котів третьої групи на 21-у добу, а у котів контрольної групи тварин зазначені показники за період спостереження не досягають рівня клінічно здорових тварин.

Таким чином, було встановлено, що тривале застосування антибіотиків приводить до пригнічення корисної мікрофлори кишечнику і супроводжується системними порушеннями функції гепатобіліарної та імунної системи організму. Експериментально доведено, що застосування пробіотиків, створених на основі мікроорганізмів, виділених із кишечнику того виду тварин, у яких вони застосовуються, сприяє поліпшенню стану здоров’я та відтворенню кишкового мікробіоценозу у 2–2,5 раза швидше ніж при застосуванні пробіотиків на основі бактерій, виділених від інших видів тварин, у 3–4 рази скоріше ніж при застосуванні тільки сорбуючих препаратів, та у 4–5 разів скоріше ніж у нелікованих тварин.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення й нове вирішення наукової задачі, що виявляється у вивченні та обґрунтуванні діагностики та лікування котів з дисбіотичними порушеннями кишечника методом застосування пробіотично-сорбційного препарату на основі лактобактерій, іммобілізованих на аеросилі А-300 та визначення при цьому особливостей біохімічного та імунологічного статусу хворих тварин.

1. На підставі результатів бактеріологічних, гематологічних, біохімічних та імунологічних досліджень встановлено етіологію та експериментально обґрунтовано схему бактеріологічної діагностики дисбактеріозів котів і лікування із застосуванням розробленого пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт».

2. Розлади функції шлунково-кишкового тракту котів у 13,4 % випадків спричинені розвитком панлейкопенії, у 40,2% – інвазією гельмінтів і в 46,4 % випадків – застосуванням антибактеріальних препаратів (рівень яких у крові перевищує 320 мкг/мл), що спричинює порушення фізіологічного співвідношення анаеробних та аеробних мікроорганізмів.

3. Встановили, що при розвитку дисбактеріозу у котів мікробне число вмісту кишечнику збільшується за рахунок умовно-патогенних видів (з 105 до 108 колоній утворюючих одиниць в 1 г фекалій) та появи гнильної мікрофлори (більше ніж 107 колоній утворюючих одиниць в 1 г фекалій) з одночасним зменшенням молочнокислих бактерій менше, ніж 105–106 колоній утворюючих одиниць в 1 г фекалій (при нормі 107–109 колоній утворюючих одиниць в 1 г фекалій).

4. Виведено коефіцієнт співвідношення анаеробів та аеробів, який характеризує стадії розвитку дисбактеріозу: 8,3±0,9 од. (коливання у межах від 6,5 до 10,1) – у здорових тварин; коефіцієнт 5,25±0,58 од. (6,4–4,01) – дисбактеріоз першого ступеня; коефіцієнт 2,22±0,89 од. (4,0–0,42) – дисбактеріоз другого ступеня; коефіцієнт 0,26±0,09 од. (0,44–0,08) – дисбактеріоз третього ступеня; відсутність анаеробних мікроорганізмів – дисбактеріоз четвертого ступеня.

5. Дисбактеріоз котів характеризується ендогенною інтоксикацією, про що свідчить підвищення лейкоцитарного індексу інтоксикації понад 1,5±0,07 од., підвищення активності аспарагінової та аланінової трансаміназ в 2,8–3,0 рази, збільшення кількості дрібно- та середньомолекулярних циркулюючих імунних комплексів у 2,4–2,7 та у 1,8–2,3 раза відповідно та зниження вмісту загального білка на 11,5–13,6 %.

6. За результатами вивчення біологічних властивостей лактобактерій, ізольованих від здорових котів, відібрали виробничі штами лактобактерій: Lactobacillus acidophilus № 24 згортає знежирене молоко за 24–48 годин з утворенням кислоти 1600 за Тернером та концентрацією 106 м.к. у 1 см3, середній показник адгезії становив 7,52. Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22 згортає знежирене молоко протягом 48 годин з кислотністю 2180 за Тернером, у молоці має концентрацію 108 м.к. у 1 см3, середній показник адгезії становив 6,78. Ці штами мають середню та високу антагоністичну активність відносно до патогенних і умовно-патогенних бактерій, резистентні до дії 8 антибактерійних засобів.

7. Застосування препарату “Сорбелакт” при дисбактеріозі котів забезпечує нормалізацію мікробіологічних (коефіцієнт співвідношення поміж анаеробами та аеробами дорівнює 8,6±0,2 од.), гематологічних (зниження лейкоцитарного індексу інтоксикації на 40,0%, до 1,5±0,06 од.), біохімічних (зниження активності аспарагінової та аланінової трансаміназ до показників клінічно здорових тварин: 0,37±0,04 ммоль/год×л та 0,4±0,06 ммоль/год×л відповідно, збільшення вмісту загального білка до 60,3±2,1 г/л) та імунологічних (зменшення кількості дрібномолекулярних циркулюючих імунних комплексів на 54,3 %: з 16,2± 1,0 г/л до 7,4± 0,4 г/л) показників та скорочує термін лікування в 2,0–2,5 раза порівняно із пробіотичними препаратами, виготовленими на основі мікроорганізмів, виділених від інших видів тварин.

8. За результатами проведених досліджень підготовлено та впроваджено спосіб діагностики дисбактеріозу котів і розроблено технологію виготовлення вітчизняного пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт» для лікування дисбіотичних порушень у дрібних тварин (Пат. № 38395 від 12.01.2009,ТУ У 24.4 – 00493669-004:2008), застосування якого забезпечує відновлення фізіологічного стану тварин.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Діагностику дисбактеріозів у котів пропонуємо здійснювати згідно з розробленими методичними рекомендаціями «Діагностика дисбактеріозів у котів», які затверджені Науково-методичною радою Державного Комітету ветеринарної медицини України (протокол № 2 від 25 грудня 2008 р.).

2. Для культивування лактобактерій запропоновано тверде поживне середовище «ПСЛ» (Пат. № 35832 від 10. 10. 2008), яке забезпечує високу ефективність щодо накопичення молочнокислої мікрофлори, підвищення виходу бактеріальної маси, активності готових пробіотичних біопрепаратів.

3. Для практичного застосування рекомендується пробіотично-сорбційний препарат «Сорбелакт», що призначений для корекції дисбіотичних порушень у дрібних тварин (собаки, коти), на який є розроблена і затверджена необхідна науково-технічна документація на його виробництво та застосування: ТУ У 24.4 – 00493669-004:2008.

СПисок праць, опублікованих за темою дисертації

Руденко П. Аналіз розповсюдження дисбактеріозів у котів (за даними клінік ветеринарної медицини м. Луганська) / П. Руденко, С. Садова (Бордюгова) // Ветеринарна медицина України.  2007. – № 7. – С. 1719. (Здобувач провела аналіз ветеринарної звітності клінік м Луганська, обробила та узагальнила дані, підготовила матеріали статті).

Руденко П. А. Вивчення кишкової аутофлори у клінічно здорових котів /              П. А. Руденко, С. С. Садова (Бордюгова), С. О. Гужвинська // Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету, присвячений 10-річчю факультету ветеринарної медицини. – 2007. – №78/101 – С. 530–535. (Здобувач провела частину експериментальних досліджень, обробку отриманих даних, підготовила статтю до друку).

Садова (Бордюгова) С. С. Вивчення кількісного і якісного складу кишкової мікрофлори у клінічно здорових котів / С. С. Садова (Бордюгова) // Вісник Полтавської державної аграрної академії. – 2007. – № 4. – С. 231–235.

Бордюгова С. С. Вивчення властивостей пробіотичної мікрофлори, ізольованої з кишкового тракту клінічно здорових котів / С. С. Бордюгова // Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету. – 2008. – № 84. – С. 22–26.

Бордюгова С. С. Чутливість до антибіотиків мікрофлори травного тракту клінічно здорових котів / С. С. Бордюгова // Матеріали VІІ Міжнародної науково-практичної конференції з проблем дрібних тварин. (Одеса, 3–5 червня 2008 р.). – 2008. – С. 32–34.

Бордюгова С. С. Вивчення мікрофлори кишечника котів з ознаками дисбактеріозу / С. С. Бордюгова // Ветеринарна біотехнологія: Матеріали конференції, присвяченої 10-річчю створення Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів. – 2008. – Т. 2, № 13 – С. 23–35.

Ушкалов В. О. Етіологічні фактори виникнення дисбактеріозу у тварин /           В. О. Ушкалов, П. А. Руденко, С. С. Бордюгова // Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету. – 2008. – № 92. – С. 67–71.

(Здобувач провела експериментальні дослідження, обробку отриманих даних, підготувала матеріали статті).

Руденко П. А. Сучасні методи корекцій дисбактеріозів / П. А. Руденко,              С. С. Бордюгова // Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету. – 2009. – № 4. – С. 228–231. (Здобувач провела лікування тварин, аналіз отриманих даних та брала участь у написанні статті).

Бордюгова С. С. Вивчення динаміки імунологічних показників організму котів, хворих на дисбактеріоз / С. С. Бордюгова // Ветеринарна медицина. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. – 2010. – № 93. – С. 64–71.

Руденко П. А. Пошук стимуляторів росту мікроорганізмів роду Lactobacillus /  П. А. Руденко, С. С. Бордюгова // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини. – 2010. – Вип.21, Т. 2, Ч. 2. – С. 236–242. (Здобувач провела лікування тварин, аналіз отриманих даних та брала участь у написанні статті).

Руденко П. А. Діагностика дисбактеріозів у котів: методичні рекомендації /            П. А. Руденко, С. С. Бордюгова, А. А. Руденко. – Луганськ, 2009. – 22 с. (Здобувач провела частину експериментальних досліджень, обробку отриманих даних, брала участь у написанні рекомендацій).

Пат. № 28153 МПК (2006) С 12 N 7/00. Штам бактерії Lactobacillus plantarum «Victoria» №22 для виготовлення пробіотичного препарату / П. А. Руденко,                   Б. Т. Стегній, С. О. Гужвинська, А. А. Руденко, С. С. Садова (Бордюгова); заявник та власник патенту Луганський національний аграрний університет. – № 28153; заявл. 26.07.2007; опубл. 26.11.2007, Бюл. № 24.

Пат. № 32523 МПК (2006) С 12 N 1/00. Спосіб виготовлення поживного середовища для культивування мікроорганізмів / П. А. Руденко, А. А. Руденко,           С. С. Садова (Бордюгова); заявник та власник патенту Луганський національний аграрний університет. – № 32523; заявл. 26.07.2007; опубл. 26.05.2008, Бюл. № 10.

Пат. №35832 МПК (2006) С 12 N 1/20. Тверде поживне середовище «ПСЛ» для культивування лактобактерій / П. А. Руденко, А. А. Руденко, С. С. Садова (Бордюгова), О. В. Комаров; заявник та власник патенту Луганський національний аграрний університет. – № 35832; заявл. 10.04.2008; опубл. 10.10.2008, Бюл. № 19.

Пат. № 38395 МПК (2006) С 12 N 1/00. Препарат комплексний пробіотично-сорбційний для корекції дисбіотичних порушень у котів «Сорбелакт /                   П. А. Руденко, А. А. Руденко, С. С. Садова (Бордюгова); заявник та власник патенту Луганський національний аграрний університет. – № 38748; заявл. 05.09.2008, опубл. 12.01.2009, Бюл. № 1.

Бордюгова С. С. Дисбактеріози у котів: діагностика та розробка засобу для лікування. – Рукопис.

Дисертаційна робота на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія. – Національний університет біоресурсів і природокористування України, Київ, 2011.

Основні положення роботи містять аналіз динаміки змін видового складу та кількісного співвідношення мікрофлори кишечнику, визначення гематологічних, біохімічних та імунобіологічних показників у організмі котів за дисбактеріозу.

Дисертація присвячена встановленню етіології розвитку дисбактеріозу у котів, визначенню змін видового складу та кількісного співвідношення мікрофлори кишечнику котів за дисбактеріозу, вивченню біологічних властивостей лактобактерій, виділених із шлунково-кишкового тракту клінічно здорових тварин та розробці комплексного пробіотично-сорбційного препарату «Сорбелакт» для корекції дисбіотичних порушень у котів, створеного на основі зазначених мікроорганізмів, іммобілізованих на сорбенті аеросил А-300.

Обґрунтована доцільність застосування розробленого препарату «Сорбелакт», який сприяє поліпшенню стану здоров’я та відтворенню кишкового мікробіоценозу у 2,0–2,5 раза швидше ніж при застосуванні пробіотиків на основі бактерій, виділених від інших видів тварин, у 3,0–4,0 раза швидше ніж при застосуванні тільки сорбуючих препаратів, та у 4,0–5,0 разів швидше ніж у нелікованих тварин.

Ключові слова: дисбактеріоз, шлунково-кишковий тракт, мікрофлора, лактобактерії, пробіотики.

Бордюгова С. С. Дисбактериозы у кошек: диагностика и разработка средства для лечения. – Рукопись.

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 – ветеринарная микробиология, эпизоотология, инфекционные болезни и иммунология. – Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев, 2011.

Диссертация посвящена изучению этиологии кишечного дисбактериоза у котов, определению изменений видового состава и количественного соотношения микрофлоры кишечника при дисбактериозе, изучению биологических свойств лактобактерий, выделенных из фекалий клинически здоровых животных, и разработке комплексного пробиотически-сорбционного препарата «Сорбелакт» для коррекции дисбиотических нарушений у котов, созданного на основе указанных микроорганизмов, иммобилизованных на сорбенте аэросил А-300.

Объект исследования – дисбактериоз котов. Цель: определить количественный и качественный состав микрофлоры кишечника при дисбактериозе, разработать и испытать пробиотически-сорбционный препарат, изготовленный на основе аутофлоры кишечника клинически здоровых котов.

Предмет исследования – видовой состав микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у котов в норме и при развитии дисбактериоза и его коррекция.

Методы исследования – эпизоотологический анализ, биологический эксперимент (определение вирулентности изолятов лактобактерий, бифидобактерий, энтеробактерий, стафилококков, эшерихий, псевдомонад, протея и дрожжеподобных грибов на лабораторных животных), бактериологические (исследование основных культурально-морфологических и биохимических свойств изолятов бактерий), серологические (обнаружение антигена возбудителя панлейкопении котов), паразитологические (установление инвазионных факторов аскароза, токсокароза, лямблиоза и других паразитарных заболеваний, сопровождающихся расстройствами функции желудочно-кишечного тракта и обусловленных эндопаразитами), общеклинические, биохимические, иммунологические и статистические методы.

В работе представлены результаты клинико-лабораторного исследования 96 котов (14 клинически здоровых и 82 животных с симптомами дисбактериоза); котов – 64,6 %, кошек – 35,4 %.

Установлено, что клиническое проявление расстройства функции желудочно-кишечного тракта в 13,4 % случаев спровоцировано развитием вирусных заболеваний (панлейкопении), у 40,2 % – паразитированием гельминтов и 46,4 % случаев нарушением соотношения между анаэробными и аэробными микроорганизмами, а это, в свою очередь, обусловлено применением антибактериальных препаратов.

Анализ полученных данных бактериологического исследования фекалий от кошек с расстройствами желудочно-кишечного тракта свидетельствует о том, что у всех  больных выявлена E. сoli как с нормальными, так и с измененными биохимическими свойствами (не ферментирует лактозу, обладает гемолитической активностью). У 39,5 % животных обнаружены P. vulgaris, у 10,5 % – P. аeruginosa, которые отсутствуют в фекалиях клинически здоровых котов. У животных было установлено четыре степени дисбактериоза.

Выведен коэффициент соотношения анаэробных и аэробных микроорганизмов, который характеризует стадии развития дисбактериоза: коэффициент 5,25±0,58 ед.– дисбактериоз первой степени; коэффициент соотношения анаэробов и аэробов 2,22±0,89 ед. – это вторая степень дисбактериоза; коэффициент соотношения анаэробов и аэробов 0,26±0,09 ед. – третья степень дисбактериоза; отсутствие анаэробных микроорганизмов – это дисбактериоз четвертой степени.

Установлено, что in vitro наибольшее ингибирующее влияние на все выделенные микроорганизмы имеют амоксицилин, рифампицин и цефтриаксон (МИК50 этих антибиотиков не превышает 5 мкг/мл).

Разработана пропись твердой питательной среды «ПСЛ» для культивирования лактобактерий (Патент на корисну модель № 35832, от 10.10.2008), использование которой обеспечивает повышение уровня накопления бактериальной массы в 9,9 раза больше, чем на среде МРС.

Изучены биологические свойства штаммов Lactobacillus acidophilus      № 24 и Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22, выделенных от здоровых котов. Эти микроорганизмы имеют среднюю и высокую антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Устойчивы к действию многих антибактериальных средств, обладают высоким уровнем адгезивности. Lactobacillus acidophilus № 24 сворачивает обезжиренное молоко в течение 24–48 часов с образованием кислоты 1600 по Тернеру и концентрацией 106 м.к. в 1 см3 , Lactobacillus plantarum «Victoria» № 22 сворачивает обезжиренное молоко в течение 48 часов с образованием кислоты 2180 по Тернеру и концентрацией 108 м.к. в 1 см3.

Разработан пробиотически-сорбционный препарат “Сорбелакт”, который показал высокую лечебно-профилактическую эффективность при научных испытаниях. Его применение обеспечивает сокращение срока лечения в 2,0–2,5 раза: восстановление гематологических, биохимических и иммунологических показателей (лейкоцитарного индекса интоксикации, активность АлАТ и АсАТ, уровня общего белка) по сравнению с использованием других сорбционных и пробиотических препаратов

Ключевые слова: дисбактериоз, желудочно-кишечный тракт, микрофлора, лактобактерии, пробиотики.

Bordyugova S. S. Disbakteriozy at cats: diagnostics and working out of means for treatment. – Manuscript.

The dissertation on reception of the candidate of veterinary sciences scientific degree on a speciality 16.00.03.– Veterinary microbiology, epizootology, infectious diseases and immunology. – National University of Life and Environmental Science of Ukraine, Kyiv, 2011.

Work substantive provisions contain the analysis of dynamics of quantitative and qualitative changes of microflora of intestines, studying hematology, biochemical and immunology change of cats at disbacteriosis development.

The dissertation is devoted a method etiology factor disbacteriosis of cats, studying of quantitative and qualitative changes of microflora of intestines the cats at disbacteriosi, studying of biological properties lactobacteria, clinically healthy animals allocated from a gastroenteric path and working out complex probiotic-sorbtsion quality of preparation «Sorbelact» for correction disbacterial infringements at the cats, created on the basis of the specified microorganism attached on a sorbent of aeroforces А-300.

The expediency of application of the developed preparation «Sorbelact » which promotes improvement of a current of disease and normalisation of microecology of intestines is proved.

Key words: dysbacteriosis, gastroenteric path, microflora, lactobacteria, probiotic.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

4402. Вивчення впливу зовнішнього оточення організації на її діяльність 111 KB
  Вступ Не існує жодної організації, що не мала б зовнішнього оточення і не знаходилася б з ним у стані постійної взаємодії. Успіх будь-якої організації залежить не тільки від факторів діючих всередині організації, але, вирішальним чином, залежи...
4403. Розрахунки чеками та векселями 51.5 KB
  Чек — грошовий документ встановленої форми, що містить беззаперечне письмове розпорядження власника рахунка (клієнта) банкові, який обслуговує його, сплатити певну суму грошей пред'явникові чека або іншій вказаній у чеку особі
4404. Агропомышленный комплекс Новосибирской области 92.5 KB
  Введение Новосибирская область: государственно-территориальное образование, входящее в состав Российской Федерации на правах ее равноправного субъекта, расположена в географическом центре страны, в юго-восточной части Западно-Сибирской равнины, глав...
4405. Фанализ - филосовско-аналитическая теория истины 152 KB
  Эта работа была задумана для рассмотрения более объективной оценки окружающего мира. Здесь рассматриваются более двадцати вопросов, наиболее значимых, при объяснении такого подхода поиска истины как Фанализ. Этот взгляд должен дать толчок для самора...
4406. Разработка тягового и топливно-экономического расчета автомобиля 1.09 MB
  В курсе теории автомобиля тяговый и топливно-экономический расчет является одним из важнейших разделов. Этот расчет позволяет по некоторым заданным параметрам определить остальные конструктивные и эксплуатационные параметры...
4407. Адвокат в гражданском процессе 268.5 KB
  Адвокат в гражданском процессе Введение Современный человек постоянно сталкивается с ситуациями, в которых ему необходимо руководствоваться теми или иными правовыми предписаниями, то есть законодательно закрепленными общеобязательными правилами пове...
4408. Административная ответственность за нарушение налогового законодательства 311 KB
  Административная ответственность за нарушение налогового законодательства Введение Процесс формирования норм налогового законодательства выявил особую актуальность установления ответственности за налоговые нарушения. Прямая зависимость государственн...
4409. Адвокатура Украины. Организация современной адвокатуры Украины 63 KB
  Адвокатура Украины. Организация современной адвокатуры Украины. Принципы и гарантии адвокатской деятельности. Согласно Закону адвокатура Украины является добровольным профессиональным общественным объединением, призванным содействовать защите прав, свобо...
4410. Альтернативные источники энергии 62 KB
  Perpetuum-mobile Сенсационное сообщение пришло из Англии. Изобретатель Джон Серл сконструировал летательный аппарат в виде вращающегося диска. Аппарат потребляет энергию только при разгоне, а затем летит сам по себе по классическому варианту вечного...