77829

Моноклональні та рекомбінантні антитіла для експериментальної біології, медицини і ветеринарії

Реферат

Биология и генетика

Мета роботи полягала в одержанні та впровадженні в наукові дослідження і практику моноклональних і рекомбінантних антитіл. Наукова новизна: Вперше в Україні було впроваджено гібридомну технологію і отримані перші вітчизняні монАТ до різних антигенів, зокрема - фібриногену...

Украинкский

2015-02-05

4.34 MB

2 чел.

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ

Моноклональні та рекомбінантні антитіла для експериментальної біології, медицини і ветеринарії

РЕФЕРАТ

Комісаренко Сергій Васильович   академік НАН України та НАМН України, завідувач відділу молекулярної імунології, директор Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України – керівник роботи

Луговськой Едуард Віталійович  член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, завідувач відділу структури та функцій білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Колибо Денис Володимирович   доктор біологічних наук, головний науковий співробітник відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Колеснікова Ірина Миколаївна   кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник відділу структури та функцій білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Олійник Олена Сергіївна  кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Костюченко Олена Петрівна  молодший науковий співробітник відділу структури та функцій білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Глузман Данило Фішелевич   доктор медичних наук, завідувач відділом імуноцитохімії та онкогематології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Сидоренко Світлана Павлівна   доктор біологічних наук, в.о. завідувача лабораторії сигнальних каскадів клітин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Скляренко Лілія Михайлівна  доктор медичних наук, провідний науковий співробітник відділу імуноцитохімії та онкогематології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Шлапацька Лариса Миколаївна   кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник відділу регуляторних механізмів клітини Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Київ – 2014


РЕФЕРАТ

Моноклональні антитіла (монАТ) це - моноспецифічні та однакові по структурі антитіла (імуноглобуліни). МонАТ синтезуються та секретуються однаковими за специфічністю гібридомними клітинами, які походять від однієї клітини-попередника, яка створюється злиттям злоякісної мієломної та антитіло-продукуючої клітини (В лімфоцита). Створення гібридом – продуцентів монАТ є одним із найвидатніших винаходів в експериментальній біології, за який у 1984 році Georges Kohler та Cesar Milstein отримали Нобелівську премію. Було отримано безлімітний ресурс унікальних реагентів для аналізу молекулярних механізмів, які лежать в основі функціонування клітин в нормі і при патології.

Перші роботи по одержанню і використанню монАТ в Україні і, можливо, в СРСР було розпочато у 1980-1981 роках у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна АН УРСР групою вчених під керівництвом С.В. Комісаренка. Трохи пізніше, незалежно і паралельно, отримання та використання монАТ почалося в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України під керівництвом Д.Ф. Глузмана та С.П. Сидоренко. Ці два Інститути були піонерами в Україні створення та впровадження монАТ. Від 2003 року в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України під керівництвом С.В Комісаренка також отримують рекомбінантні одноланцюгові антитіла, які створені генно-інженерними методами об’єднанням генів для варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів імуноглобулінів.

Представлена робота містить узагальнені результати багаторічних досліджень щодо отримання, характеристики та впровадження моноклональних і рекомбінантних антитіл для фундаментальних досліджень та створення на їх основі діагностичних засобів. Використання імуноцитохімічних методів і вітчизняних монАТ у діагностиці захворювань крім соціального значення, дає великий економічний ефект заощадженням коштів на придбання реагентів зарубіжного виробництва.

Мета роботи полягала в одержанні та впровадженні в наукові дослідження і практику моноклональних і рекомбінантних антитіл.

Наукова новизна: Вперше в Україні було впроваджено гібридомну технологію і отримані перші вітчизняні монАТ до різних антигенів, зокрема - фібриногену, фібрину та їх фрагментів, а також до антигенів лейкоцитів людини. Створено першу і єдину на даний час в Україні бібліотеку рекомбінантних scFv-антитіл людини. З’ясовано тонкі механізми утворення тривимірної сітки фібрину – каркасу тромбу та ідентифіковано та охарактеризовано нові антигени лейкоцитів людини. Отримано наукові дані, важливі для створення нової унітарної моделі гемопоезу і уточнення сучасної класифікації гемобластозів.

Практична значимість: Розроблено і адаптовано для масштабного виробництва тест-системи кількісного визначення вмісту фібриногену, розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові людини. Запропоновано нові імунохімічні тест-системи для виявлення дифтерійного токсину і антитіл проти нього в сироватці крові людини. Отриманий химерний протеїн, що містить послідовності білків MPT63 та MPT83 мікобактерій, використано для створення високоефективного діагностикуму туберкульозу великої рогатої худоби. Створено першу вітчизняну панель монАТ для наукових, лабораторних та діагностичних досліджень, на яку отримано Свідоцтво про державну реєстрацію та ліцензію на використання в Україні. Розроблено і впроваджено в клінічну практику алгоритми імуноцитохімічної діагностики лейкозів і метастатичних уражень лімфатичних вузлів. Використання імуноцитохімічних методів і вітчизняних монАТ у діагностиці захворювань, крім соціального значення, дає великий економічний ефект за рахунок заощадження значних коштів для придбання реагентів зарубіжного виробництва.

Колективом авторів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України вперше було показано, що N-кінцевий фрагмент Bβ12-46 ланцюга фібриногену містить сайт полімеризації (сайт "С"), який функціонує до відщеплення фібринопептида В і одночасно з сайтом "A" (Аα17-19) бере участь у формуванні протофібрил фібрину. Показано, що епітоп монАТ FnI-3c і сайт латеральної асоціації локалізовані в 126-135 частині ділянки Вβ-ланцюга молекули фібрину. Вперше встановлено, що відщеплення фібринопептидів А тромбіном призводить до структурної перебудови в 121-138 ділянці Вβ-ланцюга суперспіральної області молекули, що призводить до утворення неоантигенної детермінанти та сайту, який бере участь у латеральній асоціації протофібрил.

Отримано ряд монАТ до αС-регіону молекули фібрин(оген)у. Показано, що αС-регіони зв’язані з фібринопептидами В (FpB) в молекулах фібриногену та мономерного і полімерного фібрину desA і відходять від остова молекули після відщеплення FpB тромбіном. З’ясовано, що в αС-регіоні знаходяться сайти, які беруть участь у процесі полімеризації фібрину (Рис. 1).

Рис. 1. Структурна схема молекули фібриногену із позначенням локалізації важливих епітопів, що розпізнаються різними моноклональними антитілами

Основним практичним результатом досліджень стала розробка унікальних імунологічних тест-систем, які не поступаються найкращім світовим аналогам за чутливістю і специфічністю або перевищують їх. Вперше в Україні розроблено і адаптовано для масштабного виробництва імунодіагностичні тест-системи для кількісного визначення вмісту фібриногену, розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові людини: «DIA-фібриноген» «DIA-фібрин розчинний» і «DІA-D-димер». Адаптація до умов масштабного виробництва розроблених тест-систем проведено на базі ЧАО НПК «Діапроф Мед» (Україна, Київ). Апробація тест-систем в провідних медичних установах України дозволила визначити оптимальний набір тестів, що дозволяє діагностувати загрозу тромбоутворення та контролювати ефективність антитромботичної терапії при патології серцево-судинної системи, запальних процесах, хірургічних втручаннях та в акушерській практиці. Зазначені тест-системи мають високу чутливість та специфічність.

В результаті виконання роботи в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України створено першу і єдину на даний час в Україні бібліотеку рекомбінантних scFv-антитіл людини. Одержана бібліотека містить понад мільярд клонів-продуцентів рекомбінантних антитіл різної специфічності і є як джерелом для одержання рекомбінантних антитіл людини до необхідних антигенів, так і моделлю для вивчення особливостей формування репертуару антитіл в ході імунної відповіді. Створення такої бібліотеки в Україні є підґрунтям для розвитку технології рекомбінантних антитіл в нашій державі та розкриває нові можливості у біотехнології антитіл, в першу чергу - дизайну новітніх терапевтичних та діагностичних засобів на основі монАТ. Було також сконструйовано ряд імунних бібліотек scFv-антитіл миші, з яких виділено рекомбінантні антитіла до низки діагностично-важливих антигенів і молекулярних маркерів патологічних станів. Зокрема, вперше одержано рекомбінантні токсин-нейтралізуючі scFv-антитіла проти дифтерійного токсину та scFv-антитіла до рецептора дифтерійного токсину, ростового фактору росту – HB-EGF, що залучений до регуляції низки фізіологічних та патологічних процесів. Отримано низку важливих для використання рекомбінантних білків: окремі субодиниці дифтерійного токсину, химерні флуоресцентні похідні субодиниці В дифтерійного токсину, розчинну форму рецептору дифтерійного токсину фактору росту – HB-EGF, функціональний фрагмент білка А золотистого стафілококу, антигени збудника туберкульозу МРВ63 та МРВ83 тощо.

Розроблені методи для виявлення дифтерійного токсину і антитоксичних антитіл в сироватках крові людей, а також для диференційної оцінки рівня антитіл до різних субодиниць токсину були застосовані для створення відповідних діагностичних тест-систем, які мають потенціальну можливість виходу на світові ринки, що було продемонстровано відповідними маркетинговими дослідженнями.

За допомогою одержаних монАТ був ідентифікований антиген MPT83 мікобактерій, важливий для діагностики туберкульозу людини, а також його аналог у збудника туберкульозу бичачого типу (MPB83). Використання рекомбінантного аналогу MPB83 разом з антигеном МРВ63 було покладено в основу методу серологічної діагностики туберкульозу. Доведено можливість використання одержаних рекомбінантних антигенів збудника туберкульозу MPT63 та MPT83 для популяційної діагностики туберкульозу великої рогатої худоби. Отримано химерний білок, що містить послідовності білків MPT63 та MPT83 та доведено переваги його використання в порівнянні з окремими білками для діагностики туберкульозу. Отримані рекомбінантні аналоги антигенів мікобактерій були використані у розробці протитуберкульозної тест-системи. Розроблена тест-система для діагностування туберкульозу великої рогатої худоби поряд з туберкулінодіагностикою дозволяє значно підвищити ефективність діагностування (Рис. 2).

Рис. 2. Тест-набори для визначення антитіл до антигенів збудників дифтерії (а) та туберкульозу великої рогатої худоби (б)

 

В Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України завдяки отриманню монАТ до унікальних антигенів лімфоцитів людини було започатковано наукові дослідження по ідентифікації цих антигенів, вивченню їх експресії та функцій, а також сигнальних каскадів клітин, що регулюють різні програми життєдіяльності клітин. Колективу авторів цього Інституту належить пріоритет у відкритті клітинного рецептору CD150/IPO-3/SLAM, вивченні його структури, експресії та функцій, а також ідентифікації нового сигнального мотиву ITSM. В результаті багатовекторних та комплексних досліджень була отримана цілісна картина структури, експресії та функцій CD150, а також CD150-опосередкованих сигнальних каскадів в нормальних та злоякісно трансформованих Т- і В-клітинах людини (Рис. 3).

Рис. 3. Схема CD150-опосередкованих сигнальних каскадів і механізмів їх регуляції

Було також отримано монАТ ІРО-4, що розпізнає антиген, через який можна ініціювати запрограмовану смерть клітин, або апоптоз. В 1993 році в Бостоні на V Міжнародній Робочій Нараді по антигенам диференціювання лейкоцитів цей антиген отримав міжнародну номенклатуру CD95. МонАТ ІРО-4 (IgM) індукує апоптоз клітин без лігації вторинними антитілами і має найвищу аффінність до CD95 серед антитіл, що були досліджені в рамках Міжнародних Робочих Нарад. До маркерів, що експресовані на всіх активних стадіях клітинного циклу, належить ІРО-38 антиген, монАТ до якого було отримано в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. На відміну від Кі-67, ІРО-38 експресований на всіх активних стадіях клітинного циклу, крім G0, а також виявлений в ранній G1 фазі клітинного циклу, і тому показники експресії цього антигену є вищими за Кі-67. Нами показана важливість визначення цього маркера не тільки для оцінки відсотку проліферуючих клітин, але також його діагностична та прогностична цінність при злоякісних лімфопроліферативних захворюваннях, раку молочної залози, раку шлунка і пухлин центральної нервової системи.

В Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України створено широку панель монАТ для наукових, лабораторних та діагностичних досліджень. Низку монАТ захищено авторськими свідоцтвами та визнано як референтні антитіла для кластерів диференціювання. Ці монАТ після завершення технічних, пре-клінічних та клінічних випробувань було внесено до Державного реєстру медичної техніки та виробів медичного призначення України і дозволено для застосування в медичній практиці. Державною службою України з лікарських засобів 09.12.2011 було видано Свідоцтво про державну реєстрацію №11072/2011 на “Антитіла моноклональні ТУ У 24.4-05416946-002:2011”. Ці монАТ складають основу для тест-систем для оцінки імунологічного статусу, диференційної діагностики лейкозів та лімфом, діагностики різних гістологічних варіантів злоякісних новоутворень, а також проведення наукових досліджень. Наказом Державної служби України з лікарських засобів від 14.12.2012 р. № 1050 розробку внесено до державного реєстру медичної техніки та виробів медичного призначення і дозволено для застосування на території України (ліцензія MD № 033900), строк дії свідоцтва необмежений.

Авторами в панель гістогенетичних маркерів введено антигени, для визначення яких використовуються нові вітчизняні монАТ. Завдяки цьому в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України вперше в Україні була здійснена уточнена діагностика В-клітинного хронічного лімфолейкозу, В-пролімфоцитарного і волосатоклітинного лейкозу, основних форм неходжкінських лімфом із зрілих периферичних В-лімфоцитів на ранніх стадіях лейкемізації процесу (фолікулярної лімфоми, лімфоїдних пухлин із клітин мантійної і маргінальної зони, лімфоплазмоцитарної, дифузної В-великоклітинної). Розроблено і впроваджено в клінічну практику алгоритми імуноцитохімічної діагностики гострих лейкозів мієлоїдного і лімфоїдного походження, мієлоїдних новоутворень і мієлодиспластичних синдромів (передлейкозів), різних форм лімфопроліферативних захворювань В-, Т- і НК-клітинної природи (Рис. 4).

Рис. 4. Вітчизняні моноклональні антитіла в діагностиці злоякісних новоутворень різного гістогенезу. А – бластний криз хронічного мієлолейкозу, Б – лейкемізація В-клітинної неходжкінської злоякісної лімфоми, В – хронічний лімфолейкоз, Г – метастаз раку підшлункової залози в кістковий мозок, Д – неходжкінська злоякісна лімфома, Є – рак шлунка.

Вперше була здійснена уточнена діагностика Т-клітинного пролімфоцитарного лейкоза, лейкоза з великих грануловмісних лімфоцитів, агресивного НК-клітинного лейкоза. Одержано принципово нові наукові дані при вивченні мієлодиспластичних синдромів (передлейкозів) і мієлоїдних новоутворень – хронічного мієлолейкоза, первинного мієлофіброза, есенціальної тромбоцитопенії. Підтверджено концепцію про існування динамічного компартменту лейкемічних стовбурових клітин при прогресуванні хронічного мієлолейкоза від хронічної фази захворювання до бластної кризи.

Проведення масштабних досліджень у хворих з широким спектром пухлинних захворювань кровотворної і лімфоїдної тканин дало можливість отримати нові наукові дані, важливі для створення нової унітарної моделі гемопоезу і уточнення сучасної класифікації гемобластозів. Підтверджено, що в оновленому вигляді схема кровотворення, крім класу поліпотентних гемопоетичних стовбурових клітин, повинна включати клас мультипотентних клітин-попередників, які, проходячи функціонально незворотні стадії дозрівання, дають початок оліголінійним клітинам-попередникам.

З урахуванням результатів багатопланових досліджень сформульовані теоретичні основи і принципи використання імуноцитохімічних досліджень в онкоморфології, зокрема, для ранньої діагностики метастазів рака та інших форм злоякісних пухлин в лімфатичних вузлах, кісткового мозку, ексудатах із серозних порожнин. Імуноцитохімічні методи були апробовані і широко використовуються в діагностичних дослідженнях у хворих з різних областей України.

В результаті виконання роботи одержано принципово нові фундаментальні дані щодо імунохімічного дослідження системи фібриноген–фібрин за допомогою монАТ до існуючих та неоантигенних детермінант фібрин(оген)у; дослідження антигенів мікроорганізмів, зокрема мікобактерій; ідентифікації та вивчення структури та функцій нових антигенів лейкоцитів людини; використання монАТ в онкології для виявлення гістогенетичних та пухлино-асоційованих антигенів, діагностики різних форм раку, а також лейкозів мієлоїдного і лімфоїдного походження.

Висновки 

Робота містить узагальнені результати багаторічних досліджень, спрямованих на отримання, аналіз, характеристику та на впровадження моноклональних і рекомбінантних антитіл. як для фундаментальних досліджень, так і на створення на їх основі діагностичних засобів. Зокрема:

  1.  Вперше в Україні було впроваджено гібридомну технологію, завдяки якій отримані перші вітчизняні монАТ до ряду протеїнів, пептидів та нових поверхневих рецепторів клітин. 

  1.  Вперше в Україні та СНД отримано моноклональні антитіла до фібриногену/фібрину. На їх основі отримано нову інформацію про механізми формування фібринового каркасу тромбу; розроблено і адаптовано до масштабного виробництва тест-системи кількісного визначення вмісту фібриногену, розчинного фібрину та D-димеру фібрину в плазмі крові людини. Апробація тест-систем в медичних закладах показала можливість своєчасного виявлення загрози тромбоутворення та контролю ефективності антитромботичної терапії.

  1.  Створено першу і єдину на даний час в Україні бібліотеку рекомбінантних scFv-антитіл людини, що є джерелом для одержання рекомбінантних антитіл людини до потрібних антигенів та моделлю для вивчення особливостей формування репертуару антитіл при розвитку імунної відповіді. Запропоновано нові імунохімічні тест-системи для виявлення дифтерійного токсину та визначення антитіл до антигенів збудників дифтерії людини та туберкульозу великої рогатої худоби.

  1.  Створено першу вітчизняну панель моноклональних антитіл для медико-біологічних досліджень. Проведена комплектація наборів моноклональних антитіл для диференційної діагностики пухлин різного гістогенезу, імунофенотипування лейкозів і лімфом оцінки імунологічного статусу людини та функціональних досліджень. Отримано Свідоцтво про державну реєстрацію №11072/2011 на “Антитіла моноклональні ТУ У 24.4-05416946-002:2011”. Наказом Державної служби України з лікарських засобів від 14.12.2012 р. № 1050 розробку внесено до державного реєстру медичної техніки та виробів медичного призначення і дозволено для застосування на території України (ліцензія MD № 033900).

  1.  Розроблено і впроваджено в клінічну практику алгоритми імуноцитохімічної діагностики гострих лейкозів мієлоїдного і лімфоїдного походження, мієлоїдних новоутворень і мієлодиспластичних синдромів (передлейкозів), різних форм лімфопроліферативних захворювань В-, Т- і НК-клітинної природи, а також метастатичних уражень лімфатичних вузлів, кісткового мозку і серозних порожнин.

За результатами роботи отримано 17 патентів України, Свідоцтво про державну реєстрацію №11072/2011 на “Антитіла моноклональні ТУ У 24.4-05416946-002:2011”, захищено 6 докторських і 17 кандидатських дисертацій, опубліковано 10 монографій, 250 статей. Результати роботи представлено більш ніж на 150 закордонних та вітчизняних наукових конференціях. Згідно бази даних SCOPUS, результати роботи представлено в 197 реферованих роботах із загальною кількістю цитувань 2208, загальний h-індекс публікацій авторів становить 49.

Комісаренко С.В.    Костюченко О.П. 

Луговськой Е.В.      Глузман Д.Ф.

Колибо Д.В.      Сидоренко С.П. 

Колеснікова І.М.     Скляренко Л.М. 

Олійник О.С.      Шлапацька Л.М.

PAGE  1


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

60075. Зима прийшла і свята привела 87.5 KB
  Варвара Великомучениця. У другій половині ІІІ століття в багатого та знатного Діоскора була дочка на імя Варвара. Варвара заслуговувала всього цього. Залишена наодинці відірвана від суспільства Варвара знаходила для себе втіху роздивляючись природу з високої вежі.
60076. ДЖЕНТЛЬМЕН-ШОУ! 64.5 KB
  Чтоб с улыбкою весенней подружиться вы смогли и в хорошем настроении день сегодня провели Песня Мы вам честно сказать хотим Джентльмен 1. Приветствуем вас леди и джентльмены на нашем концерте посвящённом Международному женскому дню.
60078. Яким має бути добро на Землі? 33 KB
  Обладнання: малюнки про добро малюнок дуба калини сонечко. Вступ Діти усміхнімось один одному скажімо: Доброго дня і на краплинку сонця побільшає у світі на краплинку щастя на краплинку радіснішим стане життя вихователь вивішує на дошку...
60079. Ми діти твої, Україно! 59.5 KB
  Мета: стимулювати в учнів інтерес до історії України; формувати національну свідомість школярів; розвивати почуття відповідальності за долю своєї держави; виховувати почуття патріотизму та національної гідності.
60080. Подаруємо ялинці новорічні шати 65.5 KB
  Мета: 1. Виховна: виховувати любов до природи, до народних календарних свят, акуратність, організованість, дисциплінованість. 2. Корекційна: корекція мовлення, розвиток уваги, дрібної моторики рук.
60081. Людина починається з добра 72 KB
  Вчитель: Доброго дня дорогі діти шановні гості А день сьогодні дійсно добрий тому що людським теплом і добротою зігріте серце. Людина в світ приходить для добра Щоб в світі цім добро творити Вам розуміти діточки пора Що серденьку з любовю треба жити.
60082. Что такое счастье и как его измерить? 46.5 KB
  Цель: раскрыть историческое происхождение слова счастья. Соедините первые буквы каждого слова и прочитайте полученное слово Счастье. Тема занятия: Что такое счастье и как его измерить.