8047

Исследование причин развития фиброза костного мозга при миелопролиферативных заболеваниях путем анализа воздействия тромбоцитарных факторов на мезенхимные стволовые клетки

Домашняя работа

Медицина и ветеринария

ВВЕДЕНИЕ Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) - это гетерогенная группа клональных заболеваний стволовых клеток крови, характеризующаяся избыточной пролиферацией клеток миелоидного ряда и относительно нормальным уровнем их созрев...

Русский

2013-02-01

451.5 KB

25 чел.

ВВЕДЕНИЕ

Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) – это гетерогенная группа клональных заболеваний стволовых клеток крови, характеризующаяся избыточной пролиферацией клеток миелоидного ряда и относительно нормальным уровнем их созревания, что приводит к повышению количества эритроцитов, тромбоцитов и/или гранулоцитов в периферической крови.  

Изучение этой группы заболеваний представляется актуальным, так как, несмотря на то, что частота их встречаемости не очень высокая, заболевания являются тяжелыми и нередко инвалидизирующими. Общим для всех заболеваний, среди прочего, является развитие фиброза костного мозга: для некоторых заболеваний из группы ХМПЗ это явление является обязательным (например, первичный миелофиброз), а для некоторых (например, эссенциальная тромбоцитемия) – редким, но тяжелым и ухудшающим прогнозы.

За последние годы многое стало известно о патогенезе ХМПЗ: открытие Филадельфийской хромосомы, мутаций генов различных тирозинкиназ, в том числе Jak2-киназы, дефектов тромбопоэтинового рецептора и т.д. Однако несмотря на прогресс в изучении ХМПЗ, остаются неясными механизмы регуляции клеток стромы костного мозга при миелофиброзе. Прогресс осложняется тем, что фиброзирование костного мозга делает процедуру получения аспирата маловероятной, а также тем, что in vitro мегакариоциты обладают низкой способностью к выживанию, являясь при этом источником ростовых факторов, играющих важную роль в процессе фиброзообразования. Использование тромболизата способно дать возможность изучения количественного влияния тромбоцитарных факторов на пролиферацию и секреторную активность клеток стромы костного мозга, а также дать возможность изучить изменения мегакариоцитарного ростка кроветворения при ПМФ на основе анализа тромболизата от больных.

Целью данной работы является изучение роли дисфункции мегакариоцит-тромбоцитарной системы в изменении функционирования мезенхимных стволовых клеток и, как следствие, фиброзировании костного мозга и нарушении костномозгового кроветворения.

Задачи исследования включают в себя:

- исследование пролиферативной активности и направлений дифференцировки МСК, культивируемых на экспериментальных средах с тромболизатом различной концентрации;

- количественное определение белка в экспериментальных системах, представляющих собой МСК, культивируемые на средах с тромболизатом различной концентрации;

- оценка пролиферативной активности МСК, культивируемых на средах с тромболизатом от больных ПМФ.

- оценка количества ростовых факторов в тромболизате от больных ПМФ по сравнению со здоровыми донорами


ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

  1.  Общие сведения о ХМПЗ

ХМПЗ представляет собой гетерогенную группу заболеваний, включающую, согласно классификации ВОЗ 2008 года,  хронический миелолейкоз (ХМЛ), истинную полицитемию (ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ), первичный миелофиброз (ПМФ), хронический нейтрофильный лейкоз, хронический эозинофильный лейкоз/гиперэозинофильный синдром, болезнь тучных клеток и миелопролиферативные опухоли неклассифицируемые (Tefferi et al. 2008).

Ежегодно количество случаев заболевания ИП составляет 1,97-3/100000 населения, а для ЭТ и ПМФ этот показатель равен 1,5-3 и 0,3-0,4, соответственно (Kutti et al., 2001, Johansson et al., 2004). Распространенное мнение о доброкачественности течения этих заболеваний не относится ко всем больным и не подтверждается статистическими данными: медиана выживаемости варьирует от 1,4 до 9,1 года. Частота бластной трансформации варьирует и для ПМФ достигает 30% (Barosi et al., 1999). Общая средняя продолжительность жизни больных составляет всего 5 лет (Thiele et al., 2003, Kvasnicka et al., 1997).

Общим в патогенезе всех ХМПЗ является активация тирозинкиназ. Наиболее изученным в этом отношении является ХМЛ, при котором всегда обнаруживается транслокация (9;22)(q34;q11) с образованием химерного гена BCR-ABL, что приводит к активации пролиферативных и антиапоптотических механизмов. При этом использование ингибиторов тирозинкиназ приводит к значительному улучшению течения заболевания, вплоть до молекулярной ремиссии. Механизмы патогенеза ИП, ЭТ и ПМФ до недавнего времени оставались полностью неизученными. В 2005 году появилось большое количество статей, авторы которых обнаружили мутацию в гене Jak2-киназы (JAK2V617F) (Levine et al, 2005; Kralovics et al, 2005; Baxter et al, 2005; James et al, 2005), а затем – мутацию в гене трансмембранного домена рецептора тромбопоэтина MPLW515 (Pardanani et al, 2006) при ХМПЗ, что позволило во многом объяснить гиперпролиферацию клеток миелоидного ряда, но не фиброз костного мозга, который в той или иной степени характерен для всех ХМПЗ. Миелофиброз, развивающийся в результате ИП (10-15%) и ЭТ (~2%), называется пост-ИП и пост-ЭТ миелофиброз, соответственно. Наиболее рано появляется и определяет клиническое течение фиброз костного мозга при ПМФ.

  1.  Современные представления о механизмах миелофиброза

В настоящее время считается, что одну из ключевых ролей в процессе миелофиброза играют вещества, продуцируемые мегакариоцитами, тромбоцитами и моноцитами (Колосков, 1997;  Reilly, 2006). В основном, они содержатся в альфа-гранулах мегакариоцитов и тромбоцитов (Kaplan et al, 1979), однако механизмы, с помощью которых эти факторы выделяются в гемопоэтическую нишу, до сих пор остаются дискутабельными.  

При ПМФ увеличена концентрация как в крови, так и внутри клеток таких цитокинов, как IL-1, PDGF, TGF-b, bFGF, VEGF и других (Leoni et al, 1994; Martyre et al, 1990, 1994, 1997; Le Bousse-Kerdiles et al, 1996).

Несмотря на большое количество новой информации, позволяющей получить представление о патогенетических механизмах миелофиброза, остается неясным, какое событие является первопричиной в развитии фиброза. Сам по себе факт увеличения количества мегакариоцитов в костном мозге не может быть такой первопричиной, так как при других ХМПЗ, например, при ЭТ, также имеется мегакариоцитоз костного мозга, однако миелофиброз развивается значительно реже. Существует мнение о том, что в основе развития фиброза лежит неэффективный мегакариоцитопоэз с дефектом созревания (Castro-Malaspina, 1984; Muth et al, 2010).

Миелофиброз – это гистологический термин, применяемый для обозначения избытка коллагена в костном мозге. Еще в 1979 году Charron показал, что при ПМФ в костном мозге количество коллагена значительно повышено по сравнению с нормой, в то время как содержание гликозаминогликанов снижалось (Charron et al., 1979). Известно, что в норме строма костного мозга содержит коллаген I и III типа, с преобладанием последнего. Базальные мембраны сосудов костного мозга содержат коллаген IV типа (Gay, 1978). Фиброзирование костного мозга на ранних этапах (так называемый, ретикулиновый фиброз) происходит в первую очередь за счет коллагена III типа, а на более поздних стадиях повышается удельный вес коллагена I типа, и при остеосклерозе он является преобладающим. Подобное изменение соотношения разных типов коллагена типично для различных заболеваний и повреждений: ПМФ, цирроз печени, заживление ран (Gay, 1978). Кроме того, поскольку при ПМФ на ранних стадиях обнаруживается гиперваскуляризация, количество коллагена IV типа также повышается за счет синтеза новых базальных мембран (Castro-Malaspina et al., 1984).

В норме  содержание коллагена в костном мозге определяется его продукцией и деградацией. Популяция клеток, продуцирующих коллаген в костном мозге, включает в себя фибробласты и эндотелиальные клетки. Фибробласты, имеющие мезенхимное происхождение, синтезируют преимущественно коллаген I и III типов, тогда как эндотелиальные клетки – коллаген IV типа. Оба типа клеток, наряду с остеоцитами и адипоцитами, происходящими из МСК, а также остеокластами, имеющими гемопоэтическое происхождение, формируют так называемые гемопоэтические ниши. Условно принято разделять ниши на два типа: эндостальные и околососудистые (Zhang et al., 2003, Papayannopoulou et al. 2008). Предполагается, что эндостальная ниша предназначена для поддержания ГСК в недифференцированном состоянии, за счет их контакта с остеобластами, экспрессирующими N-кадгерин (Calvi et al., 2003). Околососудистая ниша, в свою очередь, предназначена для пролиферации, дифференцировки и мобилизации ГСК (Kopp et al., 2005). Таким образом, выдвигается гипотеза о том, что равновесие между функционированием этих двух ниш обеспечивает гемопоэтический гомеостаз, а нарушение его может привести к возникновению различных опухолевых, в том числе миелопролиферативных, заболеваний.

В системе взаимодействий в пределах ниш ключевую роль играют 3 компонента: внутриклеточные регуляторные механизмы, молекулы адгезии (N-кадгерин, CD44 и др.) и внеклеточные компоненты матрикса (цитокины, хемокины, гормоны, кальций, кислород и др.) (Lataillade et al., 2008).

Нарушение внутриклеточной регуляции в ГСК вследствие мутаций Jak2-киназы (JAK2V617F) и трансмембранного домена рецептора тромбопоэтина MPLW515 не только приводит к гиперпролиферации миелоидного ростка, но и  качественно изменяет функционирование клеток, в первую очередь, мегакариоцитов и, как следствие, тромбоцитов. Дисплазия мегакариоцитов может проявляться в виде микромегакариоцитоза, гипо- и гиперлобулярных мегакариоцитов, а также мегакариоцитов с асинхронным созреванием ядра и цитоплазмы.  Кроме того, в костном мозге больных ПМФ может наблюдаться повышенное количество мегакариоцитов с пикнотическими, фрагментированными ядрами и безъядерные формы, что свидетельствует о длительности жизни и деструкции этих клеток в костном мозге (Byelinska et al., 2004).

В последние годы появились сведения о том, что при ХМПЗ нарушен непосредственный процесс формирования тромбоцитов. Традиционным является представление о том, что зрелые мегакариоциты образуют псевдоподии, именуемые протромбоцитами, которые достигают синусоидов, в пределах которых отшнуровывают тромбоциты (Deutsch et al., 2006). В 2010 году было показано, что вследствие АТФ-зависимых изменений цитоскелета мегакариоцитов количество протромбоцитов при ХМПЗ резко увеличено (Muth et al., 2010). Эти данные были подтверждены исследованиями in vitro (Balduini et al., 2011).

Считается, что мегакариоциты в норме и при ПМФ содержат одинаковое количество и внутриклеточную локализацию ростовых факторов, следовательно, в патогенезе заболевания играет роль не избыточный синтез или накопление белков, а по всей вероятности, нарушение выделения этих веществ (Schmitt et al., 2000).

Повышенным количеством протромбоцитов можно объяснить увеличение количества ростовых факторов в костном мозге. Эти факторы синтезируются и при нормальном мегакариоцитопоэзе, однако принято считать, что в норме строма защищена от их фиброгенного действия за счет того, что тромбоциты отшнуровываются непосредственно в просвет синусоидов, а не в интерстиций. При таких условиях строма контактирует только с неактивными протромбоцитами, мегакариоциты же располагаются в непосредственной близости от синусоидов для максимального разобщения компонентов стромы и предшественников тромбоцитов. В таком случае, Wilkins объясняет повышенный неоангиогенез при ПМФ, как попытку уменьшить потенциальное фиброгенное действие протромбоцитов на строму.  В дальнейшем фиброзирующийся костный мозг и повышенное образование протромбоцитов образуют порочный круг, в котором количество тромбоцитарных факторов роста неминуемо растёт (Wilkins, 2010).

Другим объяснением повышенного содержания тромбоцитарных факторов в костном мозге при ПМФ может служить явление эмпериполеза – наличия одной клетки в пределах другой, как правило, без их взаимного повреждения (Cashell et al., 1992).  Впервые это явление было описано Lewis в 1925 году, который разграничил понятия эмпериполеза и фагоцитоза на основании того, что поглощенная клетка обладала собственной мембраной и не сливалась с лизосомами.

В экспериментальных моделях ПМФ было показано, что явление эмпериполеза при данном заболевании наблюдается весьма часто, коррелирует со степенью фиброза костного мозга и обладает определенными особенностями. Во-первых, наблюдается селективный захват мегакариоцитами нейтрофилов и эозинофилов. Во-вторых, в цитоплазме мегакариоцитов при этом наблюдались выраженные изменения. Наконец, поглощенные полиморфонуклеары имели морфологические повреждения с высвобождением лизосом в цитоплазму мегакариоцитов. Это приводит к лизису альфа-гранул с последующим высвобождением ростовых факторов (Schmitt et al., 2000, 2002). Усиление эмпериполеза связывают с повышением содержания Р-селектина в цитоплазме мегакариоцитов. Белки семейства селектинов необходимы для роллинга лейкоцитов,  экспрессирующих P-селектиновый лиганд 1, вдоль поверхности эндотелия. Когда полиморфонуклеары проникают внутрь мегакариоцита,  лиганд связывается с избыточным количеством цитоплазматического Р-селектина, что в последующем приводит к активации клеток и их апоптозу с последующим выделением содержимого лизосом в цитоплазму мегакариоцитов (Schmitt et al., 2002).

Другим следствием эмпериполеза может быть то, что нейтрофильные протеазы, выделяющиеся в гемопоэтическую нишу, могут расщеплять молекулы адгезии на поверхности ГСК, что в свою очередь способствует облегчению миграции ГСК и усилению внекостномозгового кроветворения (Centurione et al., 2004).

  1.  Тромбоцитарные факторы роста

Клетки стромы костного мозга отвечают повышением фиброгенной активности в ответ на ростовые факторы, по тем или иным причинам выделяемые клетками гемопоэточеского ряда, в первую очередь - мегакариоцитами. Среди них наибольший интерес представляют TGF-β, PDGF, bFGF, VEGF и PF-4. Примечательным является тот факт, что эти факторы, являющиеся регуляторами биосинтеза ВКМ, также представляют собой медиаторы, влияющие на пролиферацию фибробластов и эндотелиальных клеток (Le Bousse-Kerdiles et al., 2008).

  1.  TGFβ

TGFβ – гомодимерный пептид массой 25 000 Да, синтезируемый в мегакариоцитах и в высоких концентрациях обнаруживаемый в альфа-гранулах тромбоцитов; способствует хемотаксису моноцитов и фибробластов.

TGFβ, а особенно его первая изоформа, является одним из наиболее мощных ростовых факторов, влияющих на активность генов, отвечающих за синтез компонентов ВКМ (Massague, 1990). Этот цитокин способен увеличивать продукцию коллагена типов I, III и IV, фибронектина, тенасцина и протеогликанов, а также уменьшать деградацию ВКМ посредством угнетения синтеза коллагеназы и усиления экспрессии ингибиторов протеаз. Участие TGFβ в процессе фиброзирования при ПМФ впервые было показано Martyre M.C., которая обнаружила, что у данных пациентов повышен уровень этого цитокина в тромбоцитах (Martyre, 1991). При ЭТ, в свою очередь, уровень TGFβ находится в пределах нормы, при этом количество мегакариоцитов в костном мозге резко увеличено, а миелофиброз развивается нечасто, что также косвенно подтверждает важную роль данного фактора (Le Bousse-Kerdiles et al., 2008). 

Также было обнаружено, что, несмотря на то, что TGFβ в основном содержится в тромбоцитах, некоторые другие клетки, включая лимфоциты и моноциты/макрофаги, также способны синтезировать этот цитокин. У больных ПМФ показан повышенный синтез TGFβ клетками моноцитарного ряда (Martyre, 1994).

МСК способны сами синтезировать TGFβ, что было показано в модели in vitro по влиянию МСК-кондиционированных сред на продукцию коллагена легочными фибробластами (Salazar et al., 2009). Нельзя исключить тот факт, что подобное явление на аутокринном уровне может усиливать фиброзирование костного мозга при ПМФ.

TGFβ синтезируется клетками в виде латентной формы, которая должна быть активирована для того, чтобы рецепторы смогли распознать этот цитокин. Механизм активации до конца не ясен до настоящего времени, хотя известно, что определенную роль играет протеолитическое действие плазмина и матриксных металлопротеиназ (ММР), а также конформационные изменения молекулы. Не исключено, что при ПМФ нарушения в ферментных системах, регулирующих активацию TGFβ, приводят к пролонгированному действию цитокина, что усиливает процесс фиброзирования.

Любопытно отметить, что у пациентов с преимущественно ретикулиновым фиброзом, где коллаген III типа преобладает над I типом, уровень TGFβ наивысший (в 3 раза выше нормы) (Martyre, 1991). Подобные данные in vitro были получены Kimura: при обработке культуры человеческих фибробластов TGFβ вырабатывался не только коллаген I, но и III типа (Kimura et al., 1989).

Наиболее убедительно показана ключевая роль TGFβ в развитии миелофиброза в опытах Chagraoui: мышам, инфицированным  ретровирусом, кодирующим мышиный тромбопоэтин, трансплантировали ГСК дикого типа или гомозиготные ГСК с отсутствием гена, кодирующего TGFβ. Миелофиброз развивался только у мышей, которым пересадили ГСК дикого типа, в то время как у другой группы мышей не наблюдалось образования ретикулина (Chagraoui et al, 2002).

  1.  bFGF

Основной фактор роста фибробластов синтезируется и выделяется различными типами клеток, включая мегакариоциты. Это потенциальный ангиогенный фактор (Chou et al., 2003), а также митоген для клеток стромы костного мозга (Молчанова и соавт., 2011). Было показано, что этот цитокин способен нарушать мегакариоцитопоэз, в частности посредством изменения мегакариоцитарно-стромального взаимодействия (Bruno et al., 1993). Martyre показала, что в мононуклеарах периферической крови больных ПМФ содержится достоверно большее количество bFGF, чем у здоровых доноров (Martyre et al., 1997). Преимущественно он локализован в циркулирующих мегакариоцитах и тромбоцитах. Также повышенное содержание цитокина было обнаружено в моче пациентов (Dalley A. et al., 1996). Тем не менее, интересно заметить, что, несмотря на высокое содержание фактора внутри клеток, в культуральной среде было обнаружено исключительно малое его количество (Sayinalp N. et al., 2004). Такое парадоксальное явление может быть объяснено особыми молекулярными характеристиками bFGF: все формы продуктов первичной трансляции этого цитокина не имеют секреторной сигнальной последовательности, поэтому предполагаются иные не традиционные пути экстернализации цитокина – экзоцитоз, сублетальное повреждение клеток и/или клеточный лизис. С учетом данных о поражении мегакариоцитарного ростка при ПМФ, аномалиях созревания и структуры мегакариоцитов, подобные механизмы представляются весьма вероятными. В пределах костного мозга bFGF связан с внеклеточным матриксом и гепарансульфатами базальной мембраны. Локально повышенные уровни этого цитокина могут аномально стимулировать пролиферацию клеток стромы (Martyre et al., 1997).

Кроме того, показано, что bFGF усиливает деление мегакариоцитов и их предшественников и способствует их адгезии к фибробластам. Экспрессия рецепторов I и II типа к данному фактору, структурно связанных с тирозинкиназами, повышена, что также способствует усиленной миелопролиферации CD34+ клеток больных ПМФ (Le Bousse-Kerdiles et al., 1996, 2001). Более того, bFGF усиливает колониестимулирующую активность интерлейкина-3, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и эритропоэтина на более коммиттированные клетки, такие как грануломакрофагальные, эритроидные и мегакариоцитарные предшественники посредством синергии с этими факторами, и стимулирует миелопоэз в долгоживущих культурах клеток костного мозга (Le Bousse-Kerdiles et al., 1996).  

Культуральные исследования МСК показали, что bFGF сигналлинг существенен для пролиферации этих клеток. Рецептор к цитокину является ключевым регулятором созревания остеобластов при остеогенезе. Таким образом, неудивительно, что ингибирование bFGF сигналлинга приводит к снижению остеогенной дифференцировки (Ng F et al., 2008).

Таким образом, bFGF способствует, как миелофиброзу, так и миелопролиферации.

  1.  VEGF

Среди всех миелопролиферативных заболеваний при ПМФ наблюдается наиболее выраженный неоангиогенез в костном мозге. Образование новых сосудов происходит в результате взаимодействия ангиогенных и антиангиогенных факторов. Среди прочих, VEGF оказывает наиболее специфичное и мощное митогенное действие на эндотелиальные клетки, а потому играет ключевую роль в неоангиогенезе при неопластических заболеваниях. Помимо васкулотропного эффекта, VEGF также повышает сосудистую проницаемость, миграцию клеток и способствует вазодилатации (Ho et al., 2005). Семейство цитокинов VEGF включает в себя 6 представителей, включая VEGF-A, который изучен больше всего. Обнаружено, что при ПМФ, как и при многих других онкологических заболеваниях, уровень VEGF повышен как в плазме крови и костном мозге (Lundberg, 2000, Steurer, 2006, Panteli, 2007, Alonci, 2008, Boiocchi, 2011), так и в тромбоцитах. Кроме того, мегакариоциты сами способны выделять данный цитокин в костном мозге. Однако представляется вероятным, что эти клетки являются не единственными источниками VEGF, поскольку Di Raimondo было показано, что линейная зависимость между количеством тромбоцитов и уровнем цитокина имеется только при тромбоцитопении (Di Raimondo, 2001). В случае некоторых солидных опухолей известно, что лейкоциты содержат больше VEGF, чем в контрольной группе (Salven et al., 1999), однако для ПМФ таких данных обнаружено не было. Клетки стромы костного мозга также активно продуцируют VEGF, что весьма вероятно играет роль в патогенезе ПМФ (Huang et al., 1999).

VEGF может играть роль паракринного ростового фактора для ГСК при ХМПЗ, так как показана корреляция между уровнем этого цитокина и количеством лейкоцитов при ПМФ, равно как и количеством эритроцитов при ИП (Alonci, 2008).

Рецепторы VEGF экспрессируются не только на поверхности клеток, но и внутри цитоплазмы ГСК. Предлагаются различные объяснения такому явлению: во-первых, после активации возможен эндоцитоз и компартментализация рецепторов, во-вторых, такое расположение может играть роль в аутокринном механизме активации клеток (Boiocchi, 2011).

Интересно отметить, что повышенная экспрессия VEGF в костном мозге обнаруживается только на стадии гиперклеточности, но не на фиброзной стадии, при этом уровень цитокина коррелирует с плотностью капилляров в костном мозге (Gianelli, 2007).

Прогностическая значимость VEGF может заключаться в том, что была показана корреляция между уровнем этого цитокина и сосудистыми осложнениями (Musolino et al., 2002).

Ведутся работы по изучению ингибиторов рецепторов VEGF, и в настоящее время показано, что такие агенты могут уменьшать пролиферативную активность клеток стромы костного мозга и ослаблять стимулирующие сигналы для ГСК (Dührsen, 2001).

  1.  Культивирование МСК в средах с тромболизатом

Опыт культивирования МСК на средах, содержащих человеческий тромболизат, невелик. Предпосылками к данным исследованиям были следующие положения: фетальная бычья сыворотка (ФБС), традиционно используемая для культивирования клеток, несет в себе риск контаминации прионами и вирусами. Кроме того, при использовании МСК, выращенных в средах с ксеногенным белком, высок риск иммунных реакций с образованием анти-ФБС антител из-за интернализации белковых компонентов клетками (Fekete et al., 2012). Также в ФБС содержатся определенные сиаловые кислоты, к которым большинство людей имеет циркулирующие антитела (Martin et al., 2005).  Предпосылкой к изучению тромболизата при культивировании стало успешное использование его в стоматологической практике с целью доставки ростовых факторов в высокой концентрации к участкам приживления костной ткани (Sanchez AR et al., 2003). Также выдвигается предположение о том, что МСК можно выращивать на собственном тромболизате пациента, что сведет к минимуму риск иммунных осложнений (Horn et al., 2010). Возможности использования человеческого тромболизата для культивирования МСК в настоящее время активно изучаются и представляются перспективными (Xia W et al., 2011; Sankaranarayanan K et al., 2011; Jenhani F et al., 2011).

Тромболизат способствует более быстрому росту колоний МСК, но не увеличению их количества, так что время достижения конфлюэнтности уменьшается. По всей видимости, такой эффект реализуется за счет ростовых факторов (bFGF, TGFβ, PDGF и др.), количество которых в тромболизате достаточно для амплификации МСК, что делает культивирование в данных условиях экономически выгодным. Их функциональные характеристики, такие как способность к остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировке, согласно литературным данным, принципиально не изменялись (Doucet Ch. et al., 2005), хотя различия тромболизатов от разных доноров могут вносить некоторую вариабельность (Horn et al., 2010).

Следует помнить о том, что культивирование МСК в стандартных условиях с добавлением ростовых факторов в том же количестве, что содержится в тромболизате, не приводит к такому же эффекту, как при культивировании непосредственно на тромболизате. Кроме того, блокирование известных факторов (PDGF, TGFβ, bFGF) не приводило полностью к исчезновению эффекта, полученного при культивировании на тромболизате. Это позволяет предположить, что в тромболизате содержатся дополнительные факторы, обсуловливающие выраженную эффективность при культивировании МСК (Fekete et al., 2012).  
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Пациенты

Образцы периферической венозной крови объемом 8-12 мл были получены от 11 пациентов (6 мужчин и 5 женщин) с диагнозом «Первичный миелофиброз», средний возраст которых составил 57 лет (24-74 года). Средняя длительность заболевания от момента верификации диагноза составила 66 месяцев (1-252 месяца). Семеро пациентов на момент обследования уже получали химиотерапевтические средства (гидроксимочевина, преднизолон). Терапию дезагрегантами получали также 7 пациентов, при этом последний прием препарата приходился на вечер суток, предшествующих забору крови. Данные о пациентах представлены в таблице 1.

Контрольные образцы были получены от семи доноров (3 мужчин и 4 женщины), не имеющих гематологических заболеваний. Средний возраст их составил 60 лет (55-65 лет).

Таблица 1

Номер

Возраст/Пол

Гемоглобин,
г/л

Лейкоциты, *109

Тромбоциты, *109

1

61/м

96

3,6

371

2

62/ж

150

8,9

650

3

62/ж

135

14,5

235

4

74/м

144

12,4

608

5

50/ж

109

18,6

601

6

59/ж

145

12,9

266

7

45/м

83

5,8

899

8

24/м

106

6,9

253

9

71/ж

100

5,7

100

10

64/м

97

34

34

11

58/ж

83

17,3

70

2.2. Получение тромболизата

8-12 мл периферической венозной крови больных ПМФ и контрольной группы забирали в вакуумные пробирки с К3ЭДТА. Затем её центрифугировали при 300g в течение 10 минут для получения плазмы, богатой тромбоцитами, которую разводили 1:1 в фосфатно-буферном растворе и центрифугировали при 3000g 20 минут. Надосадочную жидкость убирали, а осадок замораживали на -400С. Замораживание и оттаивание осуществлялось трижды для лизирования тромбоцитов, после чего полученный лизат центрифугировали для осаждения мембран тромбоцитов. Полученная надосадочная жидкость являлась тромболизатом.

Тромболизат из пулированного тромбоконцентрата от 4 здоровых доноров был получен на Станции переливания крови ФГБУ «ФЦСКЭ им. В.А.Алмазова».

2.3. Получение МСК костного мозга

Доноры костного мозга, которые принимали участие в исследовании, относятся к группе пациентов без гематологических заболеваний.

Аспирация костного мозга проводилась квалифицированным персоналом в условиях гематологической манипуляционной. Забор образцов аспирата костного мозга для выделения клеточных популяций производился в пробирки с К3ЭДТА, которые после перемешивания транспортировались на криопакетах в лабораторию. Выделение клеточных популяций из образцов аспирата костного мозга во всех случаях производилось максимум в течение 4 часов после забора.

Для получения фракции мононуклеаров из костного мозга применяли метод фиколльного градиента:

1) однородную суспензию костного мозга центрифугировали в течение 15-20 минут при 2000g. Центрифугирование проводили при помощи центрифуги Allegra X – 12R Centrifuge (Beckman Coulter);

2) после центрифугирования надосадочную жидкость удаляли;

3) затем к пробе добавляли 3 части от объема исходной пробы фосфатного буфера;

4) суспензию костного мозга осторожно наслаивали на 13 мл раствора фиколла «Pharmaca»;

5)центрифугировали в течение 20 минут при 2000g.

После центрифугирования клетки разделялись по градиенту плотности: появлялся осадок, образованный эритроцитами и полиморфоядерными гранулоцитами, а на границе раздела плазмы и смеси фиколла образовывалось тонкое кольцо из мононуклеаров.

Далее кольцо мононуклеаров осторожно собирали при помощи пипетки Пастера и переносили в новую пробирку, добавляли фосфатный буферный раствор и 2 раза центрифугировали в течение 15-20 минут при 2000g.

Затем при помощи камеры Горяева подсчитывали количество мононуклеаров. При малой концентрации клеток для повышения точности подсчета полученный осадок клеток предварительно ресуспензировали в малом объеме культуральной среды.

Для селекции по адгезии выделенные на фиколльном градиенте клетки высевались в культуральные флаконы и культивировались в минимальной среде Игла в модификации альфа с добавлением  10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин). Через 24-48 часов неприкрепившиеся клетки отмывались. Смена питательной среды осуществлялась раз в 2-3 дня.  В случае необходимости, замораживание образцов МСК для долговременного хранения производили в среде, содержащей 90% сыворотки и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) с использованием непрограммируемого замораживателя типа StrataCooler (Stratagene) или аналога. После инкубации на -800С в течение минимум 24 часов маркированные криовиалы с клетками переносились в жидкий азот и хранились в жидкой фазе до последующего применения.

После образования монослоя МСК совершали пересев клеток с использованием раствора трипсина:

1) Осторожно отбирали пипеткой культуральную среду из фласка;

2) Обрабатывали монослой МСК 2 мл  раствора трипсина, затем ставили фласк в инкубатор при 370С не более чем на 5 минут;

3) Инактивировали раствор трипсина добавлением культуральной среды; считали клетки в камере Горяева.

Для получения следующего пассажа МСК их высаживали во фласк площадью 75 см2  и далее культивировали с использованием культуральной среды во влажной атмосфере с 6% СО2 при 37 С0.

2.4. Оценка пролиферативной активности МСК

Количество жизнеспособных клеток в культуре определяли колориметрически с помощью реагента МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромид; Sigma) (Mossman, 1983). Кристаллы МТТ растворяли в фосфатном буферном растворе (PBS) в концентрации 5 мг/мл и фильтровали для удаления крупных нерастворимых частиц. Полученный стоковый раствор разбавляли в 10 раз и добавляли к клеткам, после чего инкубировали их при 370С в течение 2 часов. Для растворения кристаллов формазана к клеткам добавлялся диметилсульфоксид (ДМСО). Спустя несколько минут при комнатной температуре, после того как все кристаллы растворились, измерялась интенсивность окрашивания при длине волны 570 нм на спектрофотометре Synergy 2 BioTeK.

2.5. Количественное определение белков внеклеточного матрикса

Мы использовали метод, основанный на взаимодействии ионов меди с белками в щелочных условиях, что приводит к переходу катионов меди (II) в медь (I), которые детектируются с высокой чувствительностью бицинхониновой кислотой (ВСА). При этом зеленый цвет реагента меняется на пурпурный, причем интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации белка в растворе. Реакция протекает при низких температурах и является результатом взаимодействия меди и BCA с аминокислотными остатками цистеина, цистина, триптофана и тирозина. При повышении температуры пептидная связь также ответственна за развитие окраски. Таким образом, проведение реакции при 37°С, а не при комнатной температуре повышает чувствительность и уменьшает колебания измерений в зависимости от аминокислотного состава белков. После 37°С оптическая плотность контрольной пробы увеличивается примерно на 2% за каждые 10 мин, поэтому после охлаждения пробы до комнатной температуры следует сразу же приступать к измерению. BCA образует комплекс с Cu+, который имеет максимум поглощения при 562 нм. Преимущество этого реагента в том, что он не взаимодействует со многими компонентами буферных смесей, особенно с детергентами.

Этот метод можно использовать для измерения белка в широком диапазоне (до 2000 мкг/мл), причем линейность калибровочного графика наблюдается практически во всем диапазоне концентраций (Wiechelman et al., 1988, Степанченко и др., 2011).

Для измерения концентрации белков внеклеточного матрикса МСК снимали с пластика с помощью холодного раствора Версена. Достоверность снятия всех клеток подтверждалась микроскопически. Затем белок растворялся с помощью 0,5 М раствора NaOH. К полученному раствору добавляли реагент ВСА, инкубировали 30 минут при 370С, после чего регистрировали интенсивность окрашивания при 562 нм.

2.6. Определение способности к остеогенной и адипогенной дифференцировке

Для стимуляции адипогенной дифференцировки к обычной культуральной среде добавляли: 1мкМ дексаметазона (Sigma), 5 мкг/мл инсулина  (Gibco-BRL; Carlsbad), 0,5 мМ изобутилметилксантина (Sigma).

Для стимуляции остеогенной дифференцировки добавляли:1мкМ дексаметазона (Sigma), 10 mM бета-глицерофосфата (Sigma) и 50мкМ аскорбиновой кислоты.

Для этого заменяли культуральную среду в лунках на остеогенный или адипогенный дифференцирующий раствор и инкубировали во влажной атмосфере с 6% СО2 при 370С.

Остеогенная дифференцировка индукторами длилась 3 недели. Адипогенная дифференцировка индукторами длилась 2 недели.

Идентификация адипогенной дифференцировки проводилась с помощью красителя Oil Red, а остеогенной - Alizarin R.

Перед окраской клетки фиксировали холодным 70% этанолом, предварительно удалив среду и промыв лунки холодным PBS, и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После фиксации лунки промывали 2 раза водой. Затем добавили красители и инкубировали 30 минут.

После окрашивания краситель удаляли и фотографировали лунки для получения результатов дифференцировки.

2.7. Измерение концентрации ростовых факторов в ТЛ больных ПМФ

Для иммунофлюоресцентного анализа (ИФА) с целью количественного определения ростовых факторов (bFGF, VEGF) в тромболизате больных ПМФ использовались стандартные наборы ELISA (R&D Systems). Для этого тромболизаты стандартизировали по количеству белка с использованием реагента ВСА (методику см. выше); полученная концентрация тромболизатов соответствовала 5% раствору тромболизата от здоровых доноров. Затем 100 мкл образца добавлялось в лунки 96-луночной платы, предварительно покрытые связывающими антителами. Спустя 2 часа лунки промывались и добавлялись меченые ферментом специфические антитела. После добавления субстрата (H2O2) и последующей остановки реакции интенсивность окраски растворов измеряли при длине волны 450 нм на спектрофотометре Synergy 2 BioTeK.

2.8. Статистическая обработка данных

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью программного пакета Microsoft Excel.


ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Морфология клеток при культивировании в разных условиях

Фотографии клеток стромы костного мозга при микроскопии на третий день культивирования в разных условиях (10% ФБС, 10% ТЛ, 20% ТЛ) представлены на рисунке 1. На стадии субконфлюэнтности клеток наблюдались некоторые различия их морфологии. При культивировании на 10% ФБС чаще встречались крупные вытянутые клетки, расположенные менее компактно, чем при культивировании на ТЛ. При использовании 10% и 20% ТЛ форма самих клеток принципиально не отличалась: в основном встречались небольшие округло-веретенообразные клетки. Однако при более высокой концентрации ТЛ клетки приобретали тенденцию к более кучному и менее равномерному заполнению площади пластика.

Представляет некоторые трудности количественное описание наблюдаемых различий, однако известно, что подобные типы субпопуляций МСК и их пространственного взаимодействия в культуре также были описаны в литературе (Horn et al., 2010).

А

Б

В

Рисунок 1. Клетки стромы костного мозга при культивировании в разных условиях; 72 часа; увеличение 50х.  А – 10% ФБС, Б  - 10% ТЛ, В – 20% ТЛ.


3.2. Пролиферативная активность МСК

При культивировании МСК в средах с различным содержанием ТЛ мы наблюдали, что максимальное количество жизнеспособных клеток на 7-9 день наблюдалось при высоких концентрациях ТЛ, а именно 15-30% (рис.2). При данных концентрациях количество клеток достоверно не отличалось от такового при культивировании МСК на 10% ФБС (по данным t-теста Стьюдента для 15% ТЛ р=0,07, для 20% ТЛ р=0,12, для 30% ТЛ р=0,07), в остальных случаях количество клеток было достоверно меньше (р≤0,01). В целом, полученные результаты сходны с известными из литературных источников (Horn et al., 2010), хотя некоторые авторы получали даже большую экспансию МСК при культивировании на тромболизате, чем при использовании ФБС  (Xia et al., 2011). Примечательным является тот факт, что даже при культивировании без добавления сыворотки, остаются жизнеспособные клетки, что может свидетельствовать о возможном самоподдержании культуры в течение некоторого времени за счет выделения ростовых факторов самими МСК.

 

Рисунок 2. Оптическая плотность (OD) при использовании метода МТТ в культурах МСК, выращенных в различных условиях.

3.3. Синтез белков ВКМ клетками стромы КМ

При культивировании клеток в средах с различной концентрацией тромболизата нами было обнаружено, что максимальное количество белков внеклеточного матрикса синтезируется клетками в случае 15%-ного ТЛ. Концентрация белков была вне пределов разрешения калибровочной кривой, в связи с чем не представляется возможным определить их точное количество. В целом, имелась тенденция к усилению выработки белков ВКМ с повышением содержания тромболизата, что может свидетельствовать о том, что факторы, содержащиеся в нём, способствуют более активной деятельности МСК по производству ВКМ, и в первую очередь – коллагена.

 

Рисунок 3. Оптическая плотность (OD) при использовании реагента ВСА для определения концентрации белков ВКМ.
3.4. Направления дифференцировки МСК

При микроскопии МСК, окрашенных ализарином красным, не было обнаружено тенденции к изменению остеогенной дифференцировки в зависимости от культуральных сред (рис.4): количество субстрата, выраженно окрашенного ализарином, визуально было одинаковым во всех лунках, что свидетельствует о сохранении способности МСК к дифференцировке в остеобласты в различных культуральных условиях.  Не исключено, что ТЛ способствует большей остеогенной дифференцировке, чем стандартная сыворотка, о чем свидетельствует мировая литература (Horn et al, 2010; Xia et al, 2011), однако для подтверждения необходима количественная оценка. С этой целью можно использовать метод подсчета CFU (colony-forming units), который в настоящее время проводится в лаборатории.

Рисунок 4. Окраска МСК ализарином красным на кальцинированный белок. А – 10% ФБС, Б – 5% ТЛ, В – 10% ТЛ, Г – 20% ТЛ. Увеличение 50х.

В отношении адипогенной дифференцировки визуально наблюдалась четкая тенденция к снижению количества адипоцитов, то есть клеток, окрашенных на жир красителем Oil Red, при повышении концентрации ТЛ в среде (рис.5). Это также соотносится с данными вышеупомянутых авторов.

Рисунок 5. Окраска адипоцитов жирорастворимым красным. А – 10% ФБС, Б – 5% ТЛ, В – 10% ТЛ, Г – 20% ТЛ. Увеличение 50х.

Визуальные данные о снижении адипогенной дифференцировки подтверждаются при прямом подсчете адипоцитов при микроскопии (рис.6). В то время как количество адипоцитов при культивировании МСК на 5% ТЛ достоверно не отличалось от стандартной 10% ФБС (р=0,06), при 10%-ном и 20% содержании тромболизата в среде количество этих клеток было достоверно меньше (р=0,009 и р=0,04, соответственно).

Рисунок 6. Количество адипоцитов в поле зрения при прямом подсчете при микроскопии.

3.5. Культивирование МСК на тромболизате от больных ПМФ

При культивировании МСК на тромболизате, полученном от больных ПМФ, на 3-ий день не было получено достоверных различий в количестве жизнеспособных клеток (р=0,2), однако имелась неоспоримая тенденция, подтверждаемая неоднократными повторами опыта, к более активной пролиферации клеток стромы при культивировании их на тромболизате от больных (рис.7).

Рисунок 7. Оптическая плотность (OD) при использовании метода МТТ в культурах МСК, выращенных на тромболизате от больных ПМФ или контрольной группы.


3.6. Содержание ростовых факторов в тромболизате

Концентрация таких ростовых факторов, как bFGF и VEGF, которые вероятно играют роль в патогенезе миелофиброза, была повышена в тромболизате от больных ПМФ по сравнению с пациентами контрольной группы. Среднее содержание bFGF при этом составило в группе больных 172,67 пг/мл, а в контрольной группе – 72,7 пг/мл. Различие между двумя группами было достоверно (р=0,0009).

Средняя концентрация VEGF также достоверно отличалась (р=0,01). При этом в группе больных она составляла 514,25 пг/мл, а в контрольной группе – 205,26 пг/мл.

Рисунок 8. Содержание ростовых факторов в тромболизате от больных ПМФ и контрольной группы.


3.7. Обсуждение результатов

Полученные результаты свидетельствуют о том, что тромболизат, как источник тромбоцитарных ростовых факторов, может оказывать определенное влияние на клетки стромы костного мозга.

Усиление пролиферативной активности, проявляющееся в увеличении количества жизнеспособных клеток при повышении концентрации тромболизата в среде, указывает на дозозависимое влияние в определенных границах тромбоцитарных факторов на способность клеток к митозу. Некоторое уменьшение интенсивности сигнала при максимальной (30%-ной) концентрации по сравнению с 15-20%-ным содержанием ТЛ при проведении теста МТТ может быть объяснено проявлением действия ингибирующих факторов, содержащихся в лизате, после вовлечения предельного количества рецепторов к активирующим ростовым факторам на МСК, однако эта гипотеза требует дальнейшего подтверждения.

Значительное увеличение количества белков внеклеточного матрикса при культивировании МСК в средах с высоким содержанием тромболизата, по сравнению со стандартными условиями культивирования,   позволяет предположить, что тромбоцитарные факторы роста могут иметь значение в фиброзировании костного мозга. Примечательным является тот факт, что в случае 15%-ного содержания ТЛ в среде количество синтезированного белка на единицу оптической плотности МТТ (то есть на клетку) значительно превышало таковое по сравнению со стандартными условиями. Это означает, что тромбоцитарные факторы в большей степени стимулируют синтетическую функцию МСК, а не их пролиферацию.

Снижение способности к адипогенной дифференцировке и сохранение (а, возможно, даже усиление) – к остеогенной вкупе объясняют возможность развития стадии остеомиелосклероза после миелофибротической под воздействием тромбоцитарных факторов, минуя выраженное жировое перерождение костного мозга.

Отсутствие значимых различий между пролиферативной активностью МСК при культивировании их на ТЛ от больных ПМФ и от контрольной группы, с одной стороны, может поддерживать ранее высказанную идею Schmitt о том, что содержание факторов в тромбоцитах больных не отличается от нормы, а нарушен только способ их высвобождения (Schmitt et al., 2000), но наши результаты по прямому измерению количества тромбоцитарных факторов роста (bFGF, VEGF) в тромболизате свидетельствуют об обратном. Данное явление может быть объяснено недостаточным временем культивирования клеток в этих условиях, тогда возможно при увеличении продолжительности культивирования имеющаяся тенденция к усилению пролиферации на ТЛ от больных станет более очевидной.

Повышенное количество bFGF и VEGF в тромболизате больных ПМФ свидетельствует о важной роли этих факторов в изменении функционирования клеток стромы костного мозга. Целесообразно в дальнейшем изучить более широкий спектр факторов роста для всесторонней характеристики влияния содержимого альфа-гранул тромбоцитов и мегакариоцитов на МСК.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение механизмов фиброза костного мозга при хронических миелопролиферативных заболеваниях, в частности, при первичном миелофиброзе, осуществлялось путём воздействия тромбоцитарных факторов, содержащихся в тромболизате, на клетки стромы костного мозга.

Результаты, полученные согласно поставленным задачам, характеризуются следующим образом: пролиферативная активность МСК повышается при увеличении концентрации тромболизата в среде и не отличается от пролиферации при культивировании в стандартных условиях. Дифференцировочный потенциал при этом сохраняется во всех случаях в отношении остеогенного направления, а адипогенная дифференцировка имеет тенденцию к снижению при повышении концентрации тромболизата в среде.

Количественная оценка синтеза белков внеклеточного матрикса также показала зависимость от концентрации тромболизата в среде: чем выше содержание ТЛ, тем более выражена синтетическая способность МСК. Также стало известно, что продукция белков внеклеточного матрикса опережает скорость деления МСК при культивировании на средах с тромболизатом, что, вероятно, объясняет развитие выраженного фиброза при незначительном увеличении количества клеток стромы in vivo.

Полученные сведения о повышенном содержании ростовых факторов (bFGF, VEGF) в тромболизате больных первичным миелофиброзом вместе с данными о выраженной тенденции к усилению пролиферации МСК на средах с тромболизатом от этих больных подтверждают предположение о том, что нарушенное мегакариоцитарно-тромбоцитарное звено при данном заболевании может являться причиной изменения функции клеток стромы костного мозга, что впоследствии приводит к фиброзу.

В дальнейшем предполагается продолжать и углублять исследования по данному вопросу, а именно количественную оценку белка произвести более чувствительными методами для получения возможности точного определения концентраций белка; определить качественный состав белков внеклеточного матрикса, в том числе удельный вес различных типов коллагена в нём, при культивировании клеток стромы в разных условиях; продолжить опыты по культивированию МСК на средах, содержащих тромболизат от пациентов; расширение изучения и характеристики CD34+ клеток при сокультивировании их с МСК в различных культуральных условиях.

Следует также отметить, что работа имеет практическую значимость, так как, во-первых, понимание сути и конкретных механизмов развития фиброза позволит найти подходы к разработке таргетной терапии, направленной на остановку и обратное развитие процессов фиброзирования, а, следовательно, поможет в поиске альтернативы аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, являющейся в настоящее время единственным радикальным методом лечения первичного миелофиброза. Во-вторых, всесторонняя характеристика МСК, культивированных на тромболизате, позволит оценить пригодность этого субстрата, как альтернативу фетальной бычьей сыворотке. В случае успеха это позволит избавиться от ряда проблем, связанных с трансплантацией МСК, культивированных на среде с ксеногенным белком: опасность заражения вирусными и прионными заболеваниями, выработка антител к белкам бычьей сыворотки, интернированным клетками, а также наличие антител к сиаловым кислотам, содержащимся в ФБС.


ВЫВОДЫ

  1.  Увеличение концентрации тромболизата в культуральной среде приводит к профибротическим изменениям клеток стромы костного мозга. Они не только активно пролиферируют под действием тромбоцитарных факторов, не теряя при этом своей дифференцировочной способности, но и синтезируют большое количество белков внеклеточного матрикса. Такая взаимосвязь была показана впервые в контексте патогенеза первичного миелофиброза.
  2.   Тромболизат больных первичным миелофиброзом способствует усилению процессов фиброзирования за счёт содержания большего количества профибротических ростовых факторов (bFGF, VEGF),  а также обладает выраженной способностью к стимуляции пролиферации клеток стромы костного мозга. Такие опыты были осуществлены впервые. Продолжение работы в данном направлении представляет интерес как в фундаментальном плане, так и для решения клинических задач по поиску новых путей терапии пациентов с первичным миелофиброзом.


СПИСОК
 ЛИТЕРАТУРЫ

  1.  Alonci A., Allegra A., Bellomo G., Penna G., D’Angelo A., Quartarone E., Musolino C. Evaluation of circulating endothelial cells, VEGF and VEGFR2 serum levels in patients with chronic myeloproliferative diseases. // Hematol Oncol. – 2008. – V.26. – P.235-239.
  2.  Balduini A., Badalucco S., Pugliano M.T., Baev D., De Silvestri A., Cattaneo M., Rosti V., Barosi G. In Vitro megacaryocyte differentiation and proplatelet formation in Ph-negative classical myeloproliferative neoplasms: distinct patterns in the different clinical phenotypes. //PLoS One. – 2011. – V.6. – e21015. – P.1-10.
  3.  Barosi G., Ambrosetti A., Finelli C., Grossi A., Leoni P., Liberato N.L., Petti M.C., Pogliani E., Ricetti M., Rupoli S., Visani G., Tura S. The Italian Consensus Conference on Diagnostic Criteria for Myelofibrosis with Myeloid Metaplasia. // Br J Haematol. – 1999. – V.104(4). – P.730-7.
  4.  Baxter E.J., Scott L.M., Campbell P.J., East C., Fourouclas N., Swanton S., Vassiliou G.S., Bench A.J., Boyd E.M., Curtin N., Scott M.A., Erber W.N., Green A.R. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. // Lancet. – 2005. -  V.365. – P.1054–61.
  5.  Boiocchi L., Vener C., Savi F., Bonoldi E., Moro A., Fracchiolla N.S., Iurlo A., Deliliers G.L., Coggi G., Bosari S., Gianelli U. Increased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 correlates with VEGF and microvessel density in Philadelphia chromosome-negative myeloproliferative neoplasms. // J Clin Pathol. – 2011. – V.64. – P.226-231.
  6.  Bruno E., Cooper R.J., Wilson E.L., Gabrilove J.L., Hoffman R. Basic fibroblast growth factor promotes the proliferation of human megakaryocyte progenitor cells. // Blood. – 1993. – V.82. – P.430-435.
  7.  Byelinska I.V., Kabachenko I.N., Dyagil I.S. Megacaryocytes morphology in idiopathic (primary) myelofibrosis. // Rep Pract Oncol Radiother. – 2004. – V.9. – P.223-8.
  8.  Calvi L.M., Adams G.B., Weibrecht K.W., Weber J.M., Olson D.P., Knight M.C., Martin R.P., Schipani E., Divieti P., Bringhurst F.R., Milner L.A., Kronenberg H.M., Scadden D.T. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. // Nature. – 2003. – Vol.425 (23). – P.841-6.
  9.  Cashell A.W., Buss D.H. The frequency and significance of megakaryocytic emperipolesis in myeloproliferative and rective states. // Ann Hematol. – 1992. – V.64. – P.273-276.
  10.  Castro-Malaspina H. Pathogenesis of myelofibrosis: role of ineffective megakaryopoiesis and megakaruocyte components. // Progress in clin and biol research. – 1984. - Vol.154. - P.427-54.
  11.  Centurione L., Baldassarre AD, Zingariello M., Bosco D., Gatta V., Alba Rana R., Langella V., Di Virgilio A., Vannucchi A.M., Migliaccio A.R. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1 low mice. // Blood. – 2004. – V.104. – P.3573-3580.
  12.  Chagraoui H., Komura E., Tulliez M., Giraudier S., Vainchenker W., Wendling F. Prominent role of TGF-b1 in thrombopoietin-induced myelofibrosis in mice. // Blood. – 2002. – V.100. – P.3495-3503.
  13.  Charron D., Robert L., Couty M-C, Binet J-L. Biochemical and Histological Analysis of Bone Marrow Collagen in Myelofibrosis. // British Journal of Hematology. – 1979. – V.41. – P.151-161.
  14.  Chou J.M., Li C.Y., Tefferi A. Bone marrow immunohistochemical studies of angiogenic cytokines and their receptors in myelofibrosis with myeloid metaplasia. // Leuk Res. – 2003. – V.27(6). – P.499-504.
  15.  Dalley A., Smith J.M., Reilly J.T., Mac Neil S. Investigation of calmodulin and basic fibroblast growth factor (bFGF) in idiopathic myelofibrosis: evidence for a role of extracellular calmodulin in fibroblast proliferation. // Br J Haemat. – 1996. – V.93. – P.856-862.
  16.  Deutsch V.R., Tomer A. Megacaryocyte development and platelet production. // Br J Haemat. – 2006. – V.134. – P.453-466.
  17.  Di Raimondo F., Azzaro M.P., Palumbo G.A., Bagnato S., Stagno F., Giustolisi G.M., Cacciola E., Sortino G., Guglielmo P., Giustolisi R. Elevated vascular endothelial growth factor (VEGF) serum levels in idiopathic myelofibrosis. // Leukemia. – 2001. – V.15. – P.976-980.
  18.  Doucet Ch, Ernou I., Zhang Y., Llense J-R, Begot L., Holy X., Lataillade J-J. Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion: a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications. // Journal of cellular physiology. – 2005. – V.205. – P.228–236.
  19.  Duhrsen U., Martinez T., Vohwinkel G., Ergun S., Sun L., McMahon G, Durig J, Hossfeld D.K., Fiedler W. Effects of vascular endothelial and platelet-derived growth factor recertor inhibitors on long-term cultures from normal human bone marrow. // Growth Factors. – 2001. – V.19. – P.1-17.
  20.  Fekete N., Gadelorge M., Furst D., Maurer C., Dausend J., Fleury-Cappellesso S., Mailander V., Lotfi R., Ignatius A., Sensebe L., Bourin Ph., Schrezenmeier H., Rojewski M.T. Platelet lysate from whole blood-derived pooled platelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for the isolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells: production process, content and identification of active components. // Cytotherapy. – 2012. – Early Online. – P.1-15.
  21.  Gay S. Immunohistological studies on collagen type distribution in tissues. // Suppl Thromb Haemost. – 1978. – V.63. – P.171-9.
  22.  Gianelli U., Vener C., Raviele P.R., Savi F., Somalvico F., Calori R., Iurlo A., Radaelli F., Fermo E., Bucciarelli P., Bosari S., Coggi G., Deliliers G.L. VEGF expression correlates with microvessel density in Philadelphia chromosome-negative chronic myeloproliferative disorders. // Am J Clin Pathol. – 2007. – V.128. – P.966-973.
  23.  Ho C-L, Arora B., Hoyer J.D., Wellik L.E., Mesa R.A., Tefferi A. Bone marrow expression of vascular endothelial growth factor in myelofibrosis with myeloid metaplasia. // Eur J Haematol. – 2005. – V.74. – P.35-39.
  24.  Horn P, Bokermann G, Cholewa D., Bork S., Walenda Th., Koch C., Drescher W., Hutschenreuther G., Zenke M., Ho A.D., Wagner W. Impact of individual platelet lysates on isolation and growth of human mesenchymal stromal cells. // Cytotherapy. – 2010. – V.12. – P.888-898.
  25.  Huang Y-Q, Li J-J, Hu L, Karpatkin S. Thrombin induces vascular endothelial cell growth factor (VEGF) in human tumor cells and fibroblasts. // Blood. – 1999. – V.94 (Suppl. 1). – P.12a, Abstr. 40.
  26.  James C., Ugo V., Casadevall N., Constantinescu S.N., Vainchenker W. A JAK2 mutation in myeloproliferative disorders: pathogenesis and therapeutic and scientific prospects. // Trends in Molecular Medicine. – 2005. - V.11. – P.546-554.
  27.  Jenhani F., Durand V., Ben Azouna N., Thallet S., Ben Othmen T., Bejaoui M., Domenech J. Human cytokine expression profile in various conditioned media for in vitro expansion bone marrow and umbilical cord blood immunophenotyped mesenchymal stem cells. // Transplantation Proceedings. – 2011. – V.43. – P.639-643.
  28.  Johansson P., Kutti J., Andreasson B., Safai-Kutti S., Vilen L., Wedel H., Ridell B. Trends in the incidence of chronic Philadelphia chromosome negative (Ph-) myeloproliferative disorders in the city of Goteborg, Sweden, during 1983–99.// Journal of Internal Medicine. – 2004. – V.256. – P.161–165.
  29.  Kaplan D.R., Chao F.C., Stiles C.D., Antoniades H.N., Scher C.D. Platelet alpha granules contain a growth factor for fibroblasts. // Blood. – 1979. – V.53. – P.1043-1052.
  30.  Kimura A., Katoh O., Hyodo H., Kuramoto A. Transforming growth factor-beta regulates growth as well as collagen and fibronectin synthesis of human marrow fibroblasts. // British Journal of Haematology. – 1989. – V.72. – P.486-491.
  31.  Kopp H-G, Avecilla S.T., Hooper A.T., Rafii Sh. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. // Physiology. – 2005. – V.20. – P.349-356.
  32.  Kralovics R., Passamonti F., Buser A.S., Teo S-S, Tieldt R., Passweg J.R., Tichelli A., Cazzola M., Skoda R.C. A Gain-of-Function Mutation of JAK2 in Myeloproliferative Disorders. // N Engl J Med. – 2005. – V.352. – P.1779-90.
  33.  Kutti J., Ridell B.. Epidemiology of the myeloproliferative disorders: essential thrombocythaemia, polycythaemia vera and idiopathic myelofibrosis. // Pathol Biol. – 2001. – V.49. – P.164-6.
  34.  Kvasnicka H.M., Thiele J., Werden C., Zankovich R., Diehl V., Fischer R. Prognostic Factors in Idiopathic (Primary) Osteomyelofibrosis. // Cancer. – 1997. – V.80. – P.708-719.
  35.  Lataillade J.J., Pierre-Louis O., Hasselbach H.C., Uzan G., Jasmin C., Martyre M-C, Le Bousse-Kerdiles M-C. Does primary myelofibrosis involve a defective stem cell niche? From concept to evidence. // Blood. – 2008. – V.112. – P.3026-3035.
  36.  Le Bousse-Kerdiles M.C., Chevillard S, Charpentier A., Romquin N., Clay D., Smadja-Joffe F., Praloran V., Dupriez B., Demory J.L., Jasmin C., Martyre M.C. Differential expression of transforming growth factor-beta, basic fibroblast growth factor, and their receptors in CD34+ hematopoietic progenitor cells from patients with myelofibrosis and myeloid metaplasia. // Blood. – 1996. – V.88. – P.4534-4546.
  37.  Le Bousse-Kerdilès M-C, Martyre  M-C., Samson M.  Cellular and molecular mechanisms underlying bone marrow and liver fibrosis: a review. // Eur. Cytokine Netw. – 2008. - V.19. – P.69-80.
  38.  Le Bousse-Kerdiles M-C, Martyre M.C., Members of the French INSERM research network on Idiopathic Myelofibrosis. Involvement of the fibrogenic cytokines, TFG-beta and bFGF, in the pathogenesis of idiopathic myelofibrosis. // Pathol Biol. – 2001. – V.49. – P.153-7.
  39.  Leoni P., Rupoli S., Lai G., Brunelli M.A., Belmonte M.M., Pugnaloni A., Rabini R.A., Mazzanti L., Biagini G.  Platelet abnormalities in idiopathic myelofibrosis: functional, biochemical and immunomorphological correlations. // Hematologica. – 1994. – V.79. – P.29-39.
  40.  Levine R.L., Wadleigh M., Cools J., Ebert B.L., Wernig G., Huntly B.J.P., Boggon T.J., Wlodarska I., Clark J.J., Moore S., Adelsperger J., Koo S., Lee J.C., Gabriel St., Mercher T., D’Andrea A., Frohling S., Dohner K., Marynen P., Vandenberghe P., Mesa R.A., Tefferi A., Griffin J.D., Eck M.J., Sellers W.R., Meyerson M., Golub T.R., Lee S.J., Gilliland G.  Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. // Cancer Cell. -  2005. –V.7. – P.387-397.
  41.  Lundberg L.G., Lerner R., Sundelin P., Rogers R., Folkman J., Palmblad J. Bone marrow in polycythemia vera, chronic myelocytic leukemia, and myelofibrosis has an increased vascularity. // Am J Pathol. – 2000. – V.157. – P.15-19.
  42.  Martin M.J., Muotri A., Gage F., Vakri A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. // Nature Medicine. – 2005. – V.11. – P.228-232.
  43.  Martyre M.-C., Le Bousse-Kerdiles M-C, Romquin N., Chevillard S., Praloran V., Demory J-L, Dupriez B.  Elevated levels of basic fibroblast growth factor in megakaryocytes and platelets from patients with idiopathic myelofibrosis. // Br J Haemat. – 1997. – V.97. – P.441-448.
  44.  Martyre M.C., Romquin N., Le Bousse-Kerdiles M.C., Chevillard S., Benyahia B., Dupriez B., Demory J.L., Bauters F. Transforming growth factor-p and megakaryocytes in the pathogenesis of idiopathic myelofibrosis. // British Iournal ofHuernutology. – 1994. – V.88. – P.9-16.
  45.  Martyre M-C, Magdelenat H., Bryckaert M-C, Laine-Bidron Ch., Calvo F. Increased intraplatelet levels of platelet-derived growth factor and transforming growth factors in patients with myelofibrosis with myeloid metaplasia.// British journal of Haematology. – 1991. – V.77. – P.80-86.
  46.  Massague. The transforming growth factor-beta family. // Annu. Rev. Cell Biol. - 1990. – V.6. – P.597-641.
  47.  Mossmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. // Journal of Immunological Methods. – 1983. – V.65. – P.55-63.
  48.  Musolino C, Calabro L, Bellomo G, Martello F, Loteta B, Pezzano C, Rizzo V, Alonci A. Soluble Angiogenic Factors: Implications for chronic myeloproliferative disorders. // Am J Hematol. -  2002. – V.69. – P.159–163.
  49.  Muth M., Büsche G., Bock O., Hussein K., Kreipe H. Aberrant proplatelet formation in chronic myeloproliferative neoplasms. // Leukemia Research. – 2010. – V.34. – P.1424–1429.
  50.  Ng F., Boucher Sh., Koh S., Sastry K.S.R., Chase L., Lakshmipathy U., Choong C., Yang Zh., Vemuri M.C., Rao M.S., Tanavde V.  PDGF, TGF- and FGF signaling is important for differentiation and growth of mesenchymal stem cells: transcriptional profiling can identify markers and signaling pathways important in differentiation of MSCs into adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineages. // Blood. – 2008. – V.112. – P.295-307.
  51.  Panteli K., Bai M., Hatzimichael E., Zagorianakou N., Agnantis N.J., Bourantas K. Serum levels, and bone marrow immunohistochemical expression of, vascular endothelial growth factor in patients with chronic myeloproliferative diseases. // Hematology. – 2007. – V.12(7). – P.481-486.
  52.  Papayannopoulou Th., Scadden D.T. Stem-cell ecology and stem cells in motion. // Blood. – 2008. – V.111(8). – P.3923-30.
  53.  Pardanani A.D., Levine R.L., Lasho T., Pikman Y., Mesa R.A., Wadleigh M., Steensma D.P., Elliott M.A., Wolanskyj A.P., Hogan W.J., McClure R.F., Litzow M.R., Gilliland D.G., Tefferi A. MPL515 mutations in myeloproliferative and other myeloid disorders: a study of 1182 patients. // Blood. -  2006. – V.108. – P.3472-3476.
  54.  Reilly J.T. Idiopathic myelofibrosis: pathogenesis to treatment. //  Hematol Oncol. – 2006. – V.24. – P.56–63.
  55.  Salazar K.D., Lankford S.M., Brody A.R. Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF-1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. – 2009. – V.297. – P.L1002-L1011.
  56.  Salven P, Oprana A, Joensuu H. Leukocyte and platelets of patients with cancer contain high levels of vascular endothelial growth factor. // Clin Cancer Res. – 1999. – V.5. – P.487–491.
  57.  Sánchez AR, Sheridan PJ, Kupp LI. Is platelet-rich plasma the perfect enhancement factor? A current review.// Int J Oral Maxillofac Implants. – 2003. – V.18(1). – P.93-103.
  58.  Sankaranarayanan K., Chandana T., Gency Ponrose G., Malini V., Prithika U., Renny C.M., Raghavan U., Sai Babu R., Guhathakurta S., Cherian K.M. Humanized substitutes for animal sera in human mesenchymal stem cell culture and differentiation. // Cell Biology International Immediate Publication. Published on 15 Apr 2011 as manuscript CBI20100649.
  59.  Sayinalp N., Cinar H., Uner A., Haznedaroglu I.C., Buyukasik Y., Goker H., Aksu S., Ozcebe O.I., Karakus S., Kirazli S., Dundar S.V. Plasma basic fibroblast growth factor and bone marrow fibrosis in clonal myeloproliferative disorders. // Clin. Lab. Haem. – 2004. – V.26. – P.265-268.
  60.  Schmitt A., Drouin A., Masse J-M., Guichard J., Shagraoui H., Cramer E.M. Polymorphonuclear neutrophil and megacaryocyte mutual involvement in myelofibrosis pathogenesis. // Leukemia and Lymphoma. – 2002. – V.43 (4). – P.719-724.
  61.  Schmitt A., Jouault H., Guichard J., Wendling F., Drouin A., Cramer E.M. Pathologic interaction between megacaryocytes and polymorphonuclear leukocytes in myelofibrosis. // Blood. – 2000. – V.96. – P.1342-1347.
  62.  Steurer M., Zoller H., Augustin F., Fong D., Heiss S., Strasser-Weippl K., Gastl G., Tzankov A. Increased angiogenesis in chronic idiopathic myelofibrosis: vascular endothelial growth factor as a prominent angiogenic factor. // Human Pathology. – 2007. – V.38. – P.1057-1064.
  63.  Tefferi A, Vardiman JW. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. // Leukemia. – 2008. -  V. 22. – P.14–22.
  64.  Thiele J., Kvasnicka H.M., Schmitt-Graeff A., Diehl V. Dynamics of fibrosis in chronic idiopathic (primary) myelofibrosis during therapy: a follow-up study on 309 patients. // Leuk Lymphoma. – 2003. – V.44(6). – P.949-53.
  65.  Wiechelman K.J., Braun R.D., Fitzpatrick J.D. Investigation of the Bicinchoninic Acid Protein Assay: Identification of the Groups Responsible for Color Formation // Anal. Biochem. - 1988. - V. 175. - P. 231-237.
  66.  Wilkins B.S. Proplatelet production and stromal fibrosis in myeloproliferative neoplasms. // Leukemia Research. – 2010. – V.34. – P.1417-14-19.
  67.  Xia W, Li H, Wang Zh., Xu R., Fu Y., Zhang X., Ye X., Huang Y., Xiang A.P., Yu W. Human platelet lysate supports ex vivo expansion and enchances osteogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. // Cell Biology International Immediate Publication. Published on 14 Jan 2011 as manuscript CBI20100361. -  P.1-10.
  68.  Zhang J, Niu Ch, Ye L., Huang H., He X., Tong W-G, Ross J, Haug J, Johnson T., Feng J.Q., Harris S., Wiedemann L.M., Mishina Y., Li L. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. // Nature. – 2003. - V.425 (23). – P.836-841.
  69.  Колосков А.В. Мегакариоциты и фиброз костного мозга. // Гематол. и трансфузиол. – 1997. – т.42. – с.29-31.
  70.  Молчанова Е.А., Буеверова Э.И., Старостин В.И., Домарацкая Е.И. Чувствительность к действию факторов роста EGF, bFGF и PDGF субпопуляций мезенхимных стромальных клеток, происходящих из органов миелоидного кроветворения и отличающихся по времени проявления адгезивных свойств. // Известия РАН, серия биологическая. – 2011. - №2. – с.133-144.
  71.  Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Мошков И.Е. Количественное определение содержания белка. // Физиология растений. – 2010. – Т.58. - №4. – С.624-630. 


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

20253. Модельні теорії рівняння стану. Рівняння Френкеля 24.5 KB
  Модельні теорії рівняння стану. Це рівння стану належить до діркової теорії рівнянь стану. Рівняння стану Френкеля : Δυ – зміна об‘єму дірки при зміні термодинамічних параметрів; VpT – об‘єм що займає рідка система при тискові Р та температурі Т. В модельних теоріях рівняння стану постулюється структура речовини характер взаємодії і розміщення молекул чи атомів.
20254. Модельні теорії рівняння стану. Рівняння Ленарда – Джонса 95.5 KB
  Решітка має форму додекаедра об’єм якого а – стала решітки; 3 за межі комірки частинка не виходить але вона може покидати центр і рухатися в межах комірки; 4 частинки взаємодіють із потенціалом рух частинки в комірці відбувається в силовому полі; 5 ідея Ейнштейна – Грюнайзера: якщо одна частинка покинула центр то всі інші сидять в центрах своїх комірок. Якщо пакування щільне – середнє поле – сферично – симетричне бо комірки тотожні. інтеграл комірки на 1 част. db – об’єм комірки енергія середнього поля в будь – якій...
20255. Теорія Релея розсіяння світла в газах. Криитка теорії Реле 75 KB
  Теорія Релея розсіяння світла в газах. Розсіяння світла зміна характеристики потоку оптичного випромінювання світла при його взаємодії з речовиною. Якщо енергія випромінювання фотона = енергії поглинутого то розсіяння св називається Релеївським або пружнім. При розсіяння світла супроводжується перерозподілом енергії між випроміненням і речовиною і назив непружнім.
20256. Поширення звуку в газах 64.5 KB
  Поширення звуку в газах Для ізотермічного середовища запишемо рівняння неперервності. Хвилі в газах поширюються переважно в одному напрямку: Звук в газах – повздовжня хвиля згущення і розрідження Тоді: ; підставити 1 .
20257. В`язкість газів 51 KB
  Основний закон в`язкої течії був встановлений Ньютоном: де F – тангенційна дотична сила що викликає зсув шарів газу один відносно одного. Схема однорідного зсуву: шар газу рідини висотою h між двома пластинами з яких А нерухома а В під дією тангенційної сили F рухається з постійною швидкістю υ0. динамічної в`язкості характеризує опір газу зміщенню його шарів. [м2 c] В газах відстань між молекулами значно більша за радіус дії молекулярних сил тому в’язкість газів – наслідок хаотичного теплового руху молекул в результаті якого...
20258. Одержання рівняння стану методом статистичних сум 70.5 KB
  Для ідеального газу: Для неідеального газу: Враховуючи лише парні взаємодії: Розіб’ємо весь фазовий простір на область де суттєві взаємодії між молекулами і на де вони несуттєві.
20259. Полегшена дифузія. Перенос кисню за допомогою Hb i Mb 150.5 KB
  В залежності від конц. При високій конц. Нехай: С – конц. О2 ; Ср – конц.
20260. Модель Ізінга Теорія середнього поля (ще наз наближення Брега-Вільямса) 93.5 KB
  Модель Ізінга Теорія середнього поля ще наз наближення БрегаВільямса. Модельний Гамільтоніан такої системи: 1 де Н – напруженість магнітного поля. Тобто в системі за відсутності магнітного поля існує спонтанна намагнічуваність. Наближення для моделі Ізінга наближення середнього поля.
20261. Дифузія в газах 43 KB
  Дифузія має місце в газах рідинах і твердих тілах причому дифундувати можуть як частинки сторонніх речовин що в них знаходяться так і власні частинки самодифузії якщо речовина неоднорідна. Швидкість дифузії залежить від температури. При дифузії молекули переміщуються з тих частин речовини де їх концентрація більше в ті її частини де вона менше. Основній закон дифузії – закон Фіка: густина дифузійного потоку I пропорційна градієнту концентрації n взятому з протилежним знаком: D – коеф.