81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

57991. Environmental Problems on the Planet Earth 81 KB
  One half of it is habitable. The rest of the land is the mountains, deserts, ice and other places where people cannot live in. And now I’m cutting this half into 4 parts. It’s impossible to believe but only 1/4 gives us food and shelter.
57992. Епоха Катерини ІІ 87.5 KB
  Мета: з’ясувати велич і трагедію народів Російської імперії за часів Катерини ІІ підтвердити або спростувати ім’я російської імператриці як Катерини Великої. Задачі: дати оцінку історичному періоду який передував епосі Катерини ІІ...
57993. Дії з десятковими дробами 69 KB
  Мета: Узагальнити та систематизувати уміння та навички учнів виконувати дії з десятковими дробами. Ознайомити учнів із сучасною екологічною ситуацією в світі та в Україні. Формувати вміння переносити набуті знання у нові ситуації...
57994. Електронні таблиці. Побудова діаграм. Стратегія успіху або Як обрати професію 130.5 KB
  Мета уроку: сформувати: навики створювати діаграми; вміння аналізувати їх; вміння застосовувати діаграми на практиці; розвивати та вдосконалювати: навики роботи з ЕТ Excel; навики роботи на ПК; вміння працювати в групі...
57995. Емоції та почуття в житті людини 41 KB
  Мета уроку: надати загальне уявлення про емоції почуття та моральні почуття їх роль у житті людини; вчити наводити приклади емоцій та почуттів познайомити учнів про силу моральних почуттів; розвивати навички опанування термінів та роботи в групах...
57996. Учимся речевому этикету. Уроки вежливости 56.5 KB
  Цель урока: ознакомить учащихся с правилами вежливого поведения и речи; сформировать умение активно пользоваться различными этикетными формами в устной и письменной речи с учетом речевой ситуации; развивать образное и логическое мышление, чувства языка, языковой памяти, речевого слуха...
57997. Построение диаграмм и графиков на основе табличных данных 102 KB
  Напишу много чисел и попрошу их представить в порядке возрастания Легко представить А если я построю диаграмму или график Какие способы представления данных вам известны Ответ: таблицы схемы запись графики диаграммы т. Какие из этих способов вы считаете наиболее наглядными...
57998. Підсумки Microsoft Excel (MICROSOFT OFFICE 2010) 427.5 KB
  Мета: Отримання учнями практичних навичок впорядкування списків шляхом групування записів з виведенням проміжних результатів.
57999. Фізична та соціальна складова здоров’я. Інноваційний інтегрований урок з основ здоров’я та фізичної культури 973 KB
  Мета: Формувати позитивну мотивацію щодо здорового способу життя культури здоров’я; поліпшувати репродуктивне здоров’я дітей та підлітків; своєчасне попередження вживання шкідливих звичок серед молоді; підвищення особистісного і творчого потенціалу учнів їх прагнення до самореалізації життєвого успіху...