81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

64054. Исследование качества питьевой воды методом турбидиметрического фотометрирования 3.54 MB
  Вода, которая не вредит здоровью человека и отвечает требованиям действующих стандартов качества называется питьевой водой, в случае необходимости, чтобы вода соответствовала санитарно-эпидемиологическим нормам её проверяют...
64055. Организация рационального использования земель сельского поселения 1.21 MB
  Организация рационального использования земель и их охраны является важнейшим фактором и главными условием развития всех отраслей экономики страны и определяющей частью земельной политики государства. Отечественная практика и мировой опыт показывают что землеустройство является основным механизмом осуществления проводимой земельной политики...
64056. Значение гигиены полости рта в профилактике заболеваний пародонта 1.39 MB
  Я выбрал эту тему потому что она актуально в наше время современные эпидемиологические данные свидетельствуют не только о значительной распространенности патологии пародонта у детей и взрослых но и о влиянии на частоту заболевания зубных отложений гигиены полости рта...
64057. Проект частной мастерской по ремонту кузовов легковых автомобилей в условиях с.Ребриха 1.26 MB
  Зубило используют для прямолинейной рубки деталей из тонких листов для обрезания фасок на толстых металлических листах при отсутствии шлифовальной машинки а также для рубки металлических прутков и т. Рубку листа осуществляют зубилом установленным под углом к обрабатываемой поверхности...
64058. Разработка технологического процесса сборки и сварки подкрановой балки 773.5 KB
  Устройство поясов из нескольких листов, сваренных по продольным кромкам, менее предпочтительно ввиду необходимости сварки протяжённых швов, сложности обеспечения плотного прилегания поясных листов друг к другу, неравномерности распределения напряжений.
64059. РАЗРАБОТКА ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОГРАММ ДЛЯ РЕСТОРАНА КЛАССА «ЛЮКС» НА 100 ПОСАДОЧНЫХ МЕСТ (ШВЕДСКИЙ СТОЛ) 633 KB
  Основными типами являются: Городские рестораны и кафе Располагаются в городах предполагают разнообразный набор блюд специализируются в предоставлении обедов ужинов работают в определенные часы и имеют многочисленную клиентуру; Рестораны и кафе самообслуживания...
64061. Создание благоприятного социально-психологического климата на уроках английского языка 643 KB
  В работе рассматривается вопрос использования различных подходов к созданию благоприятного психологического климата на уроках в совокупности с современными методиками обучения. В литературе имеется немало исследований посвященных проблеме формирования благоприятного социально-психологического климата...
64062. Фонетические, лексические и грамматические особенности говора пос. Береславка 378 KB
  Таким образом наблюдается смешение и параллельное существование черт Северорусского и Южнорусского наречий а также Среднерусских говоров. Одним из важнейших определителей отнесённости говора к определённому наречию является такая характеристика как тип предударного вокализма.