81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

55955. СТИЛІСТИЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ВИРАЖАЛЬНИХ ЗАСОБІВ МОВИ. ТИПОВІ ПОМИЛКИ У ТЕКСТІ ДОКУМЕНТА 50 KB
  Важливу роль у піднесенні мовної культури тексту документа відіграє стилістика як розділ лінгвістики що допомагає використовувати виражальні засоби мови у різних умовах спілкування відповідно до мети і змісту. Наприклад: українська мова в ході розслідування...
55956. ДОДЕРЖАННЯ НОРМ СУЧАСНОЇ УКРАЇНСЬКОЇ ЛІТЕРАТУРНОЇ МОВИ - УМОВА УСПІШНОГО СПІЛКУВАННЯ 114.5 KB
  Мовну підготовку слід розглядати як обовязковий елемент професійної підготовки правознавця - практичного працівника. Тому нашим завданням і є звернутися до грамотності, й, насамперед, до норм орфографії, граматики, морфології тощо.
55957. ГРАМАТИЧНА ПРАВИЛЬНІСТЬ ЯК ОЗНАКА КУЛЬТУРИ УСНОГО ТА ПИСЕМНОГО СПІЛКУВАННЯ 71 KB
  Відмінювання іменників Іменники це слова які називають предмети істоти опредмечені назви процесів дій ознак і відповідають на питання хто що закон право юрист арбітраж суддя слідчий офіцер правнича фундація документ ділова мова...
55958. КУЛЬТУРА УСНОГО ДІЛОВОГО СПІЛКУВАННЯ 186 KB
  Інтерв’ю Візитна картка та її використання Орфоепія і культура усного мовлення Участь у дебатах Мистецтво публічного виступу Без спілкування люди не могли б жити в суспільстві працювати й передавати свій досвід і знання іншим.
55959. Сенсорне виховання дітей раннього віку «Ігровий майданчик» 76.5 KB
  Хід гризаняття Вихователь ставить на стіл будиночок теремок за яким розташовується 23 мотрійки і говорить малюкам що в будиночку живуть мотрійки. У третій частині заняття діти розглядають предмети витягнуті з іграшок наприклад серветки. Гразаняття Дві мотрійки Складання мотрійки з одним вкладишем Мета: розвивати навички виконувати прості дії з предметами відкривати та закривати мотрійки вкладати і виймати предмети; збагачувати сенсорний досвід під час знайомства з розміром.
55960. Його величність - серце 51 KB
  Мета: Продовжити знайомство учнів з серцевосудинною системою людини. Вивчивши серцевий цикл встановити причину інтенсивної роботи серця. На уроці ми переглянемо біологічний журнал Його величність серце.
55961. Органи кровообігу. Серце, його будова 140 KB
  Застосовувати знання для: кровоносні судини; органи кровообігу на малюнках; особливості будови серцевого м’яза; профілактики серцево-судинних хвороб. Кожна хребетна тварина яка має кров має серце. Прислухайся у грудях серце стука Вистукує один і той же ритм...
55962. The Ecological Problems of our Settlement 34 KB
  Good afternoon, everybody! I am glad to see you at our ecological party which is called "A Boomerang". I am sure that everybody who has come here is indifferent to everything that is around us, and understands that the Earth is our home. Today we will discuss and try to solve the environmental problems of our settlement.
55963. Пори року. Техніка - модульне орігамі 2.31 MB
  Вона складається із старого клубка ниток обмотаного грофованим папером білого кольору. Обличчя намальоване фломастерами, волосся і корона з двостороннього кольорового паперу.