81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

85444. Технико–экономические показатели для предметно-замкнутого участка для детали Вал 320.08 KB
  Важнейшими задачами промышленности являются более полное удовлетворение потребностей народного хозяйства в средствах производства, а населения в товарах народного потребления, повышение качества продукции на основе всемерного использования достижений научно – технического прогресса.
85446. Разработка конструкции ПП. Предварительный расчет надежности 627.55 KB
  Печатная плата ПП - изделие состоящее из плоского изоляционного основания с отверстиями пазами вырезами и системой токопроводящих полосок металла проводников которые используют для установки и коммутации электрорадиоизделия ЭРИ и функциональных узлов в соответствии с электрической принципиальной схемой
85448. Расчет кинематических параметров манипулятора и моделирование в среде SimMechanics 383.02 KB
  Расчет кинематических параметров манипулятора и моделирование в среде SimMechanics. На Рис.1 показана схема четырехзвенного манипулятора. Необходимо: Определить параметры манипулятора по представлению Денавита - Хартенберга (системы координат и параметры звеньев).
85449. Изучение конструкции компрессорных установок, работы основных элементов аппаратуры, технических характеристик 1.35 MB
  Существующий унифицированный комплект аппаратуры автоматизации шахтных компрессорных станций типа УКАСМ предназначен для автоматического управления шахтными компрессорными станциями оборудованными поршневыми и центробежными компрессорами.
85450. Сети нового поколения. Концепция NGN 1.21 MB
  При этом ресурсы одной сети не могут использоваться другой сетью по ряду причин правовые конкурентные рыночные и др. В первой главе я попытаюсь дать описание сети нового поколения обозначить её преимущества и актуальность внедрения на российский рынок связи. В результате обеспечивается централизация при которой число иерархических уровней в телекоммуникационной сети начинает уменьшаться вследствие роста производительности процессоров. Наиболее простым вариантом реализации обмена данными между двумя точками является связь двух персональных...