81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

18136. Геометрическая оптика световодов 1.5 MB
  Лекция 2. Геометрическая оптика световодов Световод представляет собой две диэлектрические среды сердечник и оболочку. Электромагнитные колебания распространяются по сердечнику благодаря явлению полного внутреннего отражения ПВО. Условия прохождения луча чер
18137. Фокон, как один из элементов ВОЛС 501.69 KB
  Лекция 3. Фокон как один из элементов ВОЛС Как оптический элемент фокон имеет важное значение. Он может быть применен для согласования источника излучения и световода световода и фотоприемника соединения световодов разных диаметров между собой и в других функциона
18138. Волоконный световод как канал передачи информации. Затухание в оптических волокнах и кабелях 712.6 KB
  Лекция 4. Волоконный световод как канал передачи информации. Затухание в оптических волокнах и кабелях Процесс распространения электромагнитной волны в оптическом волокне можно анализировать методами геометрической оптики и методами волновой теории путем решен
18139. Дисперсия и параметры быстродействия световодов 155.6 KB
  Лекция 5. Дисперсия и параметры быстродействия световодов Одним из важных явлений процесса распространения импульсных сигналов по оптическим кабелям является дисперсия рассеяние во времени спектральных или модовых составляющих оптического сигнала. В результате д...
18140. Методы стыковки световода с источником излучения (прямая стыковка, применение фоконов) 214.29 KB
  Лекция 6. Методы стыковки световода с источником излучения прямая стыковка применение фоконов Существенный вклад в потери излучения вносит несоответствие параметров излучателя и входных характеристик световода. Основными факторами определяющими потери явля
18141. Ввод излучения в световод с применением микролинз, градиентных и сферических линз 441.39 KB
  Лекция 7. Ввод излучения в световод с применением микролинз градиентных и сферических линз Согласующие устройства с применением микролинз В качестве микролинз в устройствах ввода излучения применяют полусферы и сферы. Схема устройства ввода излучения в световод с
18142. Ввод излучения в световод различными композициями линз. Потери излучения при соединении световодов 346.36 KB
  Лекция 8. Ввод излучения в световод различными композициями линз. Потери излучения при соединении световодов. Расчет длины регенерационного участка. Схема использования двух сферических линз для ввода излучения в световод показана на рисуснке 8.1. Рис. 8.1. Схема ис...
18143. Оценка взаимных влияний световода в оптических кабелях 214.79 KB
  Лекция 10. Оценка взаимных влияний световода в оптических кабелях. Определение помехозащищенности световода. Надежность ВОЛС. Даже при соблюдении явления ПВО часть энергии переходит из сердечника в оболочку световода. Эта энергия уменьшается по экспоненциальному з...
18144. Принципы построения ВОЛС 385.61 KB
  Лекция 11. Принципы построения ВОЛС Для любой ВОЛС большое значение имеют 3 фактора: информационная емкость системы которая определяется числом каналов связи и скоростью передачи информации; затухание сигнала определяющее максимальную длину ВОЛС без ретра...