81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

28195. Бихевиоризм и необихевиоризм (Дж.Уотсон, Э.Толмен, Б.Скиннер и др.) 38.5 KB
  Бихевиоризм и необихевиоризм Дж. Предметом психологии бихевиоризм считает не сознание а поведение. Бихевиоризм от англ. Манифестом бихевиоризма считается статья его основателя американского психолога Дж.
28196. Психоанализ (З.Фрейд, К.Юнг, А.Адлер, К.Хорни и др.) 49.5 KB
  Наиболее существенными для развития личности Фрейд считал сексуальные инстинкты. Вместо того чтобы изучать сны Адлер обратился к исследованию ранних воспоминаний которые считал ключом к пониманию поведения мотивации и личности. Стиль жизни формируется к 5ти годам под влиянием творческой силы личности и в связи с ним формируется тип личности: Управляющий – активный антисоциальный; Берущий – низко активный паразитирующий; Избегающий – не активный нет социального интереса; Социальнополезный – высокий соц. В качестве механизмов...
28197. Гештальтпсихология (М.Вертгеймер, В.Келер, К.Коффка, К.Левин и др.) 41 KB
  История гештальтпсихологии берет начало в Германии в 1912 когда М. В противовес представлениям ассоцианистов о том что образ создается через синтез отдельных элементов и свойства целого определяются свойствами частей гештальтпсихологи выдвинули идею целостности образа свойства которого не сводимы к сумме свойств элементов в связи с этим часто подчеркивается роль гештальтпсихологии в становлении системного подхода в науке. Согласно гештальтпсихологии для человека существуют два отличных друг от друга мира: мир физический лежащий за...
28198. Предмет психологии. Специфические особенности и классификация психических явлений 68.5 KB
  Психология наука о закономерностях развития и функционирования психики как особой формы жизнедеятельности. Практическая психология ее задачи и роль в общественной практике. Психология изучает психику в закономерностях ее развития. Современная психология представляет собой широко развернутую область знаний включающую ряд научных дисциплин и направлений.
28199. Классификация методов современной психологии 37.5 KB
  Ананьева методы психологического исследования являются системами операций с психологическими объектами и вместе с тем являются гносеологическими объектами самой психологической науки.Пирогова: Собственно методы. Вспомогательные методы А Математические статистические Б Графические В Биохимические физиологические и др. Методические методы А Генетические Б Психофизиологические.
28200. Возникновение и развитие психики в процессе эволюции. Стадии развития психики 61 KB
  Под инстинктами понимаются действия или более менее сложные акты поведения которые появляются сразу как бы готовыми не зависят от выучки и индивидуального опыта будучи наследственно закрепленным продуктом филогенетического развития. Индивидуальноизменчивые формы поведения. Уже на ранних ступенях развития наблюдая поведение животных мы встречаем индивидуальноизменчивые формы поведения которые могут быть охарактеризованы как навыки новые реакции или действия которые возникают на основе выучки или индивидуального опыта и функционируют...
28201. Вклад В.Вундта в оформление психологии как самостоятельной науки. Создание психофизики (Г.Фехнер) 33 KB
  Кризис психологии выявился в наибольшей своей остроте когда сформировалась поведенческая психология рефлексология в России и бихевиоризм в Америке потому что поведенческая психология выдвинув поведение как предмет психологии с особенной остротой выявила кризис центрального понятия всей современной психологии понятия сознания. Согласно Вундту предметом изучения психологии является сознание а именно состояния сознания связи и отношения между ними законы которым они подчиняются. Используя метроном Вундт выделил ряд основных...
28202. Влияние идей И.М.Сеченова и И.П.Павлова на становление отечественной психологии 40.5 KB
  Иван Петрович Павлов 18491936 создатель материалистического учения о высшей нервной деятельности животных и человека. Учение Павлова о высшей нервной деятельности сложилось под влиянием материалистических традиций русской философии и развивало идеи И. В начале своей научной деятельности Павлов занимался преимущественно изучением сердца и кровеносных сосудов. Так было заложено начало павловского учения о трофической нервной системе особых нервных волокнах регулирующих процессы питания в тканях обмен веществ в них и тем самым...
28203. Вклад В.М. Бехтерева в развитие российской психологии 35.5 KB
  Бехтерева в развитие российской психологии. Бехтерев Владимир Михайлович 18571927 русский невропатолог психиатр физиолог психолог. Психологическое творчество Бехтерева можно условно разделить на два этапа. Бехтерев говорил о равноправном существовании двух психологий: субъективной основным методом которой должна быть интроспекция и объективной.