81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

45295. Принципы управления качеством обслуживания. Схема взаимодействия при обеспечении качества 104.47 KB
  Обязательства операторов перед потребителями услуг связи по базовым услугам. Принципы управления качеством обслуживания Система управления качеством обслуживания представляет систему мер которые обеспечивают соответствие качества услуг связи установленным требованиям. Стандарты систем управления качеством базируются на принципах индивидуальной ответственности поставщика услуг фиксировании данных о качестве услуг и разработки эффективных административных процедур. Базовый уровень требований к системе управления качеством услуг обозначен в...
45296. Управление качеством обслуживания в рамках концепции QoS. Требования к параметрам качества услуг: задержке, потере данных 435.78 KB
  Требования к параметрам качества услуг: задержке потере данных. Соглашения о предоставлении услуг SL. К решению проблем управления качеством услуг разработчики стандартов GSM подошли только на этапе создания GPRS так как использование пакетной коммутации предъявило высокие требования к основным параметрам сети. Причиной этому является то что трафик услуг передачи данных обрабатываемый с использованием технологии GPRS в сети GSM всегда имеет вторичный приоритет по сравнению с речевыми услугами т.
45297. Общие принципы построения систем радиосвязи и их место в сетях связи РФ. Архитектура сетей. Системы фиксированной и подвижной радиосвязи. Виды систем радиосвязи. Характеристики 1-5 поколений 299.5 KB
  Системы фиксированной и подвижной радиосвязи. Системы фиксированной радиосвязи Системы связи работающие в диапазонах низких средних и высоких частот Современные технические средства ВЧ радиосвязи и их модульная архитектура позволяют создавать системы сухопутной и морской связи самого различного назначения. С помощью этих систем можно организовать: линии двухсторонней радиотелефонной связи по принципу каждый с каж дым с возможностью выхода в общегосударственную либо учрежденческую телефонную сеть; системы дипломатической связи передачу...
45298. Классификация опорных сетей радиодоступа. Характеристики систем радиодоступа. Регламент радиосвязи РФ: содержание, виды радиосвязи, службы, выделение полос. Федеральные, региональные и международные стандарты системы радиосвязи 914 KB
  Классификация опорных сетей радиодоступа. Характеристики систем радиодоступа. Под сетью радиодоступа понимают радиальнозоновую сеть радиосвязи предназначенную для предоставления услуг связи с качеством не уступающим качеству проводных систем связи. В состав сети радиодоступа входят базовые станции коммутационное оборудование К вспомогательные технические средств и программное обеспечение с помощью которых формируется территориальная зона на которой возможны подключения через радиоинтерфейс абонентских станций: В систему...
45299. Классификация радиорелейных линий связи. РРЛ прямой видимости: принципы построения, методы разделения каналов 75.5 KB
  РРЛ прямой видимости: принципы построения методы разделения каналов. Тропосферные РРЛ. Радиорелейные линии РРЛ представляют собой цепочку приемопередающих радиостанций оконечных промежуточных узловых которые осуществляют последовательную многократную ретрансляцию прием преобразование усиление и пе редачу передаваемых сигналов. Классификация радиорелейных линий В зависимости от используемого вида распространения радиоволн РРЛ можно разделить на две группы: прямой видимости и тропосферные.
45300. Спутниковые системы связи. Принцип действия, классификация. Примеры спутниковых систем связи 47.5 KB
  Спутниковые системы связи. Примеры спутниковых систем связи. СС отличаются орбитами спутников: формой круговая эллиптическая высота над Землёй наклон к экватору экваториальные полярные наклонные. На ней несколько сотен спутников что потребовало международного регулирования.
45301. Классификация и особенности транкинговых систем связи. Системы подвижной радиосвязи: принципы построения и функционирования, диапазоны частот, методы аналоговой и цифровой модуляции, методы кодирования, управление в СПС 104.5 KB
  Используемый частотный диапазон 400 450 800 900 1800 1900 МГц 2. Возможность роуминга Эстафетная передача Принцип выбора базовой станции с наибольшим уровнем сигнала MPS800 усовершенствованная мобильная телефонная служба диапазон частот 800МГц. Система работает в диапазоне 824894 МГц и имеет 666 дуплексных каналов при ширине полосы каждого канала 30КГц. Диапазон частот 825890 МГц.
45302. Характеристики систем подвижной связи. Стандарт сотовых систем связи (ССС). Пути усовершенствования ССС 45 KB
  Характеристики систем подвижной связи. Стандарт сотовых систем связи ССС. Системы подвижной радиосвязи предназначены для связи между движущимся абонентом и абонентом ТФОП или между двумя движущимися абонентами. Виды систем связи подвижной службы К основным видам ССПС относятся: региональные мобильные системы наземной связи; глобальные мобильные системы спутниковой связи; системы персонального радиовызова СПРВ.
45303. Стандарт GSM: услуги, архитектура, назначение узлов MSC, кодирование и модуляция, интерфейсы, каналы сигнализации и трафика, хэндовер, протоколы, частотный план структура кадров трафика и управления, речевое кодирование 1.08 MB
  Стандарт GSM: услуги архитектура назначение узлов MSC кодирование и модуляция интерфейсы каналы сигнализации и трафика хэндовер протоколы частотный план структура кадров трафика и управления речевое кодирование. Система сотовой связи стандарта GSM. Разработка GSM началась в 1982 году группой из 26 Европейских национальных телефонных компаний. В 1989 году Европейский Телекоммуникационный Институт Стандартов ETSI взял ответственность за дальнейшее развитие GSM.