81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

55103. Модель «IS – LM» 18.17 KB
  Модель IS-LM представляет собой модель совместного равновесия товарного и денежного рынков. Она является моделью кейнсианского типа, описывает экономику в краткосрочном периоде и служит основой современной теории совокупного спроса.
55104. Облік, аналіз та аудит торгівельних запасів на торговельному підприємстві 676.5 KB
  Правова організація і побудова обліку грошових розрахунків між підприємствами мають велике значення, оскільки забезпечують швидке завершення кругообороту коштів, перехід їх з товарної форми у грошову, створюють необхідні умови для оплати придбаних товарно-матеріальних цінностей.
55105. Государственный бюджет: принципы построения, доходы и расходы 19.77 KB
  Структура государственного бюджета в каждой стране имеет свои особенности. Они обусловлены не только национальными традициями, организацией образования и здравоохранения, но и главным образом характером административной системы, структурными особенностями экономики, развитием оборонных отраслей и др.
55107. Обследование курящего человека: спирометрия, определение концентрации метгемоглобина, тест для определения котинина. Методические указания 144.5 KB
  1 группа - характеризующие легочные объемы дыхательный оббьем резервный объем вдоха резервный объем выдоха остаточный объем и емкости общая емкость емкость вдоха функциональная остаточная емкость. 3 группа -– характеризующие состояние бронхиальной проходимости форсированная жизненная емкость легких максимальная объемная скорость дыхания во время вдоха и выдоха
55108. Общее учение о болезни 108.5 KB
  Цель: проверить и закрепить полученные знания о здоровье и болезни. Вопросы для самоподготовки: Определение понятия «здоровье» Критерии здоровья. Определение понятия «болезнь». Понятие о патологическом процессе и патологическом состоянии.
55109. Исследование систем управления 88 KB
  Методологии и практическим навыкам исследования надо учить вкус к исследовательской деятельности надо прививать способности к исследовательской работе надо развивать уже в процессе подготовки специалистов.
55110. Коммерческие банки и их функции 19.57 KB
  В механизме функционирования кредитной системы огромная роль принадлежит коммерческим банкам. Они аккумулируют основную долю кредитных ресурсов, предоставляют клиентам полный комплекс финансового обслуживания, включая выдачу ссуд, прием депозитов, расчеты, покупку-продажу и хранение ценных бумаг, иностранной валюты и т.д
55111. История развития генетики как фундаментальной науки. Методы исследования генетики человека 40 KB
  Мать и отец пробанда здоровы. Четыре сестры матери пробанда здоровы мужья их здоровы. О двоюродных сибсах со стороны матери пробанда известно: в одной семье один больной брат две сестры и брат здоровы; в двух других семьях по одному больному брату и по одной здоровой...