81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

30575. Природа эстетического творчества 40 KB
  Эстетическое начало способно пробуждать мощные духовные потенции ужас какой Хорошо хоть не импотенции в наших чувствах и мыслях способно организовать их и стимулировать. Эстетическое сфера субъектобъектных отношений в которой творчески активное восприятие объекта или создание его сопровождается бескорыстным незаинтересованным удовольствием. Фазы эстетического восприятия: эстетическая установка настроенность на восприятие: волевой акт чка сознательно пришедшего в театр кино музей или отправившегося полюбоваться природным...
30576. Эстетика и творчество 36.5 KB
  Как красота в природе или в жизни будучи воспринята нами мобилизует наши духовные силы так и эстетическое начало в орнаменте музыкальной ритмике и ритмике танца организуют естественно эстетически наш внутренний мир. Однако ритм только тогда эстетически и художественно действует на наше восприятие когда он преобразуясь в соответствующие психологические импульсы способен привести наш духовный мир в особое состояние эстетическое настроение. Недаром художники писатели журналисты понимают эстетическое начало как тот вид...
30577. К.С. Станиславский о творчестве 24 KB
  Анализ роли через действие не может быть оценено иначе как открытие гениальное это самый главный и самый верный способ воздействия на актерское воображение стимулятор его работы. Ввел понятие перспектива роли т. Зерно роли душевное типическое изображение героя.
30578. Розанов о тв-ве, таланте, литературе («Уединенное», «Опавшие листья») 77.5 KB
  Розанов о твве таланте литературе Уединенное Опавшие листья Василий Васильевич Розанов целое явление в русской философии отдельное от всех не принадлежащее ни к какому течению. Розанов выработал собственный стиль а стиль это душа вещей как он писал сам. Розанов интересен еще тем что он не был устоявшимся раз и навсегда мыслителем который всю свою научную карьеру отстаивает какието свои убеждения и мысли или развивает их свои идеи он постоянно обновлял или подвергал критике. Среди работ важных для понимания...
30579. Лосев А. о творчестве 34.5 KB
  Лосев А. Лосев 23. Лосева учителя математики страстного любителя музыки скрипачавиртуоза и Н. Лосевой дочери настоятеля храма Михаила Архангела протоиерея о.
30580. Неосферные трансформации СМИ 34 KB
  Война и мир цивилизаций Лукьянов: все культуры имеют единый генетический код; есть единый культурный архетип. Война: агрессор стремится разрушить перепрограммировать массовое сознание. 3я мировая информация психологическая война. С 3 мая 1946 речь Черчилля в Фултоне Стадии: холодная война до1988 информационнопсихологическая война с 1988 Медиа как военные средства.
30581. Творчество Юрия Роста 27.61 KB
  Творчество Юрия Роста.Юрий Михайлович РОСТ родился в 1939 году в городе Киеве.Юрий Рост очень интересный человек. Работал в Комсомолке Литературке на RENTV Конюшня Роста в Общей газете.
30582. Информационные потоки и их особенности 30.69 KB
  В его рамках объединены и производство и распространение МИП причем во всей сложности того и другого. В отличие от всех этих видов творчества ориентированных на создание определенного типа произведений жка оказывается еще и деятельностью направленной на производство МИП.Что представляет собой структура распространения МИП В ней четко определяются три взаимосвязанных обусловливающих друг друга элемента:1 тиражирование информационных продуктов;2 хранение их;3 доставка получателю.А если в качестве основания для рассмотрения взять...
30583. История журналистской профессии 20.29 KB
  Но журналистика могла развернуться лишь с появлением печатных периодических изданий возникших в Европе в XVI веке в России в XVII веке.Массовой журналистика стала после отмены крепостного права.Дореволюционная журналистика знала замечательных репортеров профессионалов мастеров своего дела умеющих быть мобильными находчивыми остроумными и подчас смелыми людьми писал Б.После 1917 года журналистика изменилась другими стали требования к журналисту.