81431

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография

Доклад

Биология и генетика

Метод выделения белков основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочноземельных металлов вызывают обратимое осаждение белков т. Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония NH42SO4.

Русский

2015-02-20

104.42 KB

6 чел.

Методы выделения индивидуальных белков: осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография.

Высаливание. Метод выделения белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония - (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит. Для выделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства. Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор". Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы. Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул.

Электрофорез белков. Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Ионообменная хроматография. Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы. Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли и разным рН.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству. Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом . Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

12436. Створення діаграм взаємодії 66 KB
  Лабораторна робота № 4. Створення діаграм взаємодії. Мета роботи: отримати навички побудови діаграм послідовності та кооперації. Завдання: створити діаграму послідовності та кооперації для одного зі сценаріїв будьякого прецеденту створеного в лабораторній ро
12437. Створення діаграми станів 34.5 KB
  Лабораторна робота № 5. Тема: Створення діаграми станів. Мета роботи: отримати навички побудови діаграм станів. Завдання: розробити діаграму станів для класу що описаний у прикладі виконання роботи та одного з раніше розроблених класів або прецедентів. Зміс...
12439. Использование сервисов сети интернет для публикации видеофайлов 51.5 KB
  Лабораторная работа Тема: Использование сервисов сети интернет для публикации видеофайлов. Цель: Познакомиться с основными сервисами по размещению и публикации видеофайлов в сети интернет. Научиться размещать видеоролики в сети интернет на основных видеохостингах: ...
12440. Организация и проведение мероприятий по защите персональных данных 176.39 KB
  Практическая работа Тема Организация и проведение мероприятий по защите персональных данных Цель работы: научиться организовывать мероприятия по защите ПДн. Разрабатывать документацию по защите ПДн. Введение В соответствии с пунктом 1 статьи 16 Федерально
12441. Размещение сайта на хостинге в сети Интернет 272.22 KB
  Лабораторная работа № 9 Тема: Размещение сайта на хостинге в сети Интернет Цель: Познакомиться с сервисами размещения сайта в сети интернет. Научиться размещать сайт на бесплатном сервисе narod.ru Ход выполнения работы: 1. Введение Знакомство с Интернетом часто начин...
12442. Запись информации на компакт диск 1015.91 KB
  Лабораторная работа № 4 Тема: Запись информации на компакт диск Цель: Научиться записывать информацию на компакт диск. Ход выполнения работы 1. Общая информация Запись CD производится только на компьютерах имеющих записывающее CD/DVD устройство имеет надпись ...
12443. Создание медиатеки. Использование программы Picasa 17.27 KB
  Лабораторная работа № 2 Тема: Создание медиатеки. Использование программы Picasa. Цель: Научиться использовать программу Picasa для поиска и организованного размещения фотографий на персональном компьютере. Научиться использовать программу для создания коллажа из фотогра...
12444. Создание, структурирование и организация мультимедийной информации спомощью программы iTunes 229.42 KB
  Лабораторная работа № 3 Тема: Создание структурирование и организация мультимедийной информации спомощью программы iTunes. Цель: Научиться организовывать структурированное хранение мультимедийной информации используя возможности программы iTunes. Ход выполнения ра...