86845

Бактерію виду Gluconobacter oxydans (Acetobacter suboxydans), яка використовується для виготовлення аскорбінової кислоти

Курсовая

Биология и генетика

Експерти прогнозують значне розширення впливу результатів досліджень у галузі біотехнології на провідні напрями науково – технологічного розвитку в сучасному світі. Вони звертають увагу на те, що роль сучасної біотехнології є вирішальною для становлення цілого ряду високотехнологічних виробництв...

Украинкский

2015-04-11

502.33 KB

11 чел.

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

Кафедра біотехнології і мікробіології

РОЗРАХУНКОВО-ПОЯСНЮВАЛЬНА ЗАПИСКА

До курсової роботи з дисципліни «Загальна мікробіологія і вірусологія»

Виконала студентка групи БТЕК-3-4                                                   Моісеєва К.М.

Перевірила                                                                                          ас. Берегова Х.А.

Київ НУХТ 2014

Реферат

Дана курсова робота виконана згідно отриманого завдання. Структура курсової роботи відповідає вимогам щодо порядку оформлення курсових робіт, вказаних в «Методичних вказівках до виконання курсової роботи» (номер 7999).

Зміст даної курсової роботи викладений на 40 сторінках. Курсова робота містить 13 малюнків, 3 таблиці,  35 літературних джерел.

У загальній частині курсової роботи представлена характеристика бактерії Acetobacter suboxydans, що використовується для виробництва аскорбінової кислоти.

У розрахунково графічній частині містяться розв’язки розрахунково графічних завдань курсової роботи.

У розділі «Визначення показників швидкості росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів» розраховані показники росту мікроорганізмів при періодичному культивуванні.

У розділі «Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів» проаналізовано склад поживного середовища і придатність його для вирощування мікроорганізмів, розраховано теоретично можливий рівень біомаси за кількістю азоту і вуглецю, що містяться у поживному середовищі.

У розділі «Енергетичний баланс окислення субстрату» проведено аналіз енергетичного балансу окислення глюкози за заданих умов.

Ключові слова: Acetobacter suboxydans, експоненційний ріст, біомаса, лаг- фаза, поживні середовища, цикл трикарбонових кислот


ЗМІСТ

ВСТУП……………………………………………………………………………… 4

ЗАГАЛЬНА ЧАСТИНА

Розділ 1. Обґрунтування вибору біологічного агента…………………………….. 8

1.1. Особливості синтезу аскорбінової кислоти……………………………….… 8

1.2. Мікробіологічний синтез аскорбінової кислоти ………………………….... 9

1.2.1. Порівняння деяких штамів Gluconobacter оxydans які синтезують аскорбі-нову кислоту…………………………………………………………………….……. 11

1.3. Відомі продукти аскорбінової кислоти ………………………………....…. 14

Розділ 2. Характеристика біологічного агента………………………………….… 17

2.1. Морфолого культуральні та фізіолого біохімічні ознаки бактерій Acetobacter suboxydans…………………………………….………………………..... 18

2.2. Особливості метаболізму біологічного агента…………………………….. 19

РОЗРАХУНКОВО-ГРАФІЧНА ЧАСТИНА

Розділ 3. Визначення показників росту при періодичному культивуванні мікроор-ганізмів………………………………………………………………………………… 21

3.1. Визначення параметрів кривої росту……………………………………... 21

3.2. Визначення типу живлення………………………………………………..…26

3.3. Визначення константи швидкості поділу та тривалості генераці……….. 27

Розділ 4. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів…………....... 28

4.1. Склад поживного середовища……………………………………………... 28

4.2. Розрахунок теоретично-можливого рівня біомаси………………………. 30

Розділ 5. Енергетичний баланс окиснення субстрату……………………………… 32

5.1. Окиснення сорбіту бактеріями Acetobacter suboxydans………………….. 35

ВИСНОВКИ…………………………………………………………………………… 37

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ………………………………………... 38

Додатки………………………………………………………………………………… 41


Вступ

Біотехнологія (слово походить від грецьких bios  життя, techne  мистецтво, майстерність і logos  слово, навчання) – використання живих організмів та біологічних процесів у виробництві. Біотехнологія міждисциплінарна галузь, що виникла на стику біологічних, хімічних і технічних наук. З її розвитком пов'язують вирішення глобальних проблем людства ліквідацію недостачі продовольства, енергії, мінеральних ресурсів, поліпшення стану охорони здоров'я і якості навколишнього середовища [1].

Під «використанням живих організмів» мається на увазі, перш за все, використання їх біохімічних процесів (їх метаболізму) з метою отримання різних продуктів. Варто також сказати, що біотехнологія використовується також для синтезу речовин, що вже отримуються іншими шляхами (наприклад, хімічним), але з меншими матеріальними та трудовими затратами.

Україна чи не єдина Європейська держава, яка нині не приділяє належної уваги формуванню ринку біотехнологічної продукції. Сучасний стан біотехнологічної галузі України характеризується наявністю науково-технологічного потенціалу і практично повною відсутністю структури, яка б сприяла широкому впровадженню біотехнологічних розробок. Тому медична, сільськогосподарська та промислова галузі, які використовують мікробні біотехнологічні препарати і процеси майже повністю залежить від постачання цієї продукції із-за кордону [2].

Для створення повноцінної біотехнологічної продукції та її реалізації в економіці в інститутах відсутні відповідні умови і кошти, а в державі органи і організації, які б заповнювали проміжок між інститутами і підприємствами. Це є однією із причин низької інноваційної активності вітчизняних виробників біотехнологічної продукції, в тому числі представників малого і середнього підприємництва. Вони не можуть ризикувати своїм бізнесом через переважну непідготовленість науково-технічних розробок і винаходів до їх безпосереднього впровадження у виробництво. До цього ще й додається недосконала система контролю за авторськими правами, що дозволяє нечесним підприємцям використовувати розробки інститутів без їх дозволу.

Експерти прогнозують значне розширення впливу результатів досліджень у галузі біотехнології на провідні напрями науково технологічного розвитку в сучасному світі. Вони звертають увагу на те, що роль сучасної біотехнології є вирішальною для становлення цілого ряду високотехнологічних виробництв, а отже, для забезпечення структурної трансформації економіки України у бік нарощування в ній сектору високих технологій. Для цього є необхідний науковий потенціал: нині в Україні успішно розвивається низка напрямів біотехнології і в них досягнуто здобутків світового рівня. Найбільш успішними з поміж них і такими, результати яких можуть бути активно використані на практиці у прогнозованому періоді, названо: технології виробництва біопалива, біодеструкції та утилізації відходів, створення пробіотиків, біофармакологічні, генно  інженерні, діагностичні розробки. При цьому розробки в галузі клітинних та генних технологій, а також імунобіотехнології є цілком конкурентоспроможними у світі й можуть стати основою для виведення вітчизняних товарів і технологій на міжнародний ринок. Використання біотехнологічних розробок зробить можливим у найближчі роки розв’язання цілого ряду актуальних завдань сучасної медицини, сільського господарства, фармакології, екології, низки галузей промисловості, особливо тих, що пов’язані з життєдіяльністю людини та станом довкілля.

У наш час мікробіологія з повним правом вважається однією з основних дисциплін біології, оскільки без знань особливостей мікроорганізмів неможливо зрозуміти всієї різноманітності життя на Землі, умов його появи та еволюції [2]. Вивчення мікроорганізмів за останні роки зробило суттєвий внесок у вирішення важливих проблем загальної біології. Мікроорганізми досить зручні у роботі. Завдяки швидкому росту, високій здатності до адаптації та ряду інших цінних властивостей вони є улюбленим об’єктом досліджень для біохіміків та генетиків. Велику роль мікроорганізми відіграють у розвитку таких наук, як молекулярна біологія, біофізика, екологія та ін.

Виникнення і швидкий розвиток біотехнології ґрунтується насамперед на використанні мікроорганізмів як продуцентів практично цінних продуктів (антибіотики, ферменти, органічні кислоти, амінокислоти, вітаміни, полісахариди та ін.).

Цікавим напрямком на даний момент є також виробництво аскорбінової кислоти або вітаміну С, який є  самим популярним з вітамінів. Ще в той час, коли про нього нічого не було відомо, лікарі помічали, що у хворих на цингу (авітаміноз С) відкриваються старі рани, а нові погано рубцюються. Тепер ми знаємо, що пояснюється це порушенням освіти важливого для загоєння ран білка колагену. Цей білок пов'язує окремі клітини в єдине ціле, а аскорбінова кислота необхідна для його синтезу в організмі. Настільки ж вона необхідна для продукції іншого сполучнотканинного білка еластину, що створює основу стінок кровоносних судин. Ось чому при нестачі вітаміну С стінки судин, особливо дрібних, стають крихкими. Їх ламкість призводить до кровоточивості, на шкірі з'являються численні крововиливи, «звичні» синці.

В останні роки вчені висловлюють припущення, що цей вітамін бере участь в окисненні і виведення з організму холестерину і тим самим грає важливу роль в попередженні порушень ліпідного (жирового) обміну, що ведуть до розвитку одного з найбільш грізних захворювань сучасної людини - атеросклерозу.

Доведено, що вітамін С запобігає утворенню в організмі нітрозамінів - речовин, що володіють потужним канцерогенною дією, тобто здатність викликати розвиток ракових захворювань.

Аскорбінова кислота полегшує всмоктування в кишечнику заліза. Тому для профілактики і лікування анемії призначають препарати заліза разом з аскорбіновою кислотою.

Є підстави стверджувати, що аскорбінова кислота відіграє важливу роль у захисті організму від інфекції і токсичних речовин, що потрапляють повітряним шляхом: недарма її концентрація в рідині, що вистилає легеневі альвеоли, 1000 разів вище, ніж у плазмі крові.

Потреба в аскорбіновій кислоті досить велика: для дітей 4 10 років  50 60 міліграм, більш старшого віку і для дорослих 60 80 міліграм в день.

Оскільки речовини, що потрапляють в організм людини з тютюновим димом, руйнує аскорбінову кислоту, курці мають отримувати цього вітаміну в 1,5 2 рази більше до 150 міліграмів на день [3].

У харчовій промисловості аскорбінову кислоту використовують як антиоксидант за відповідними європейськими номерами E добавок в їжі:

E300 – аскорбінова кислота;

E301 – аскорбінат натрію;

E302 – аскорбінат кальцію;

E303 – аскорбінат калію;

E304 – складні ефіри жирної кислоти аскорбінової кислоти, аскорбілу пальмітат, аскорбілу стеарат [4].

Отже застосувань у аскорбінової кислоти є дуже багато і потреби світового ринку у її виробництві є значні. А оскільки продукти мікробіологічної промисловості є значно дешевшими за своїх конкурентів, то створення проектів на тему виробництва аскорбінової кислоти за допомогою надсинтезуючих штамів мікроорганізмів є надзвичайно актуальними на даний момент [3].

Загальна частина

Розділ 1. Обгрунтування вибору біологічного агенту

Аскорбінова кислота в світовому промисловому виробництві вітамінної продукції займає найбільшу частку близько 40 тис. тон на рік. Вперше виділена в чистому вигляді у Сцент  –  Гіоргі в 1928 році під назвою гексуронова кислота. У 1933 році дослідники встановили її структуру. Синтез її здійснено вперше Рейхштейном в Швейцарії, Гевортом в Англії, який використовується до теперішнього часу [5].

Мікробіологічна трансформація почала інтенсивно розвиватися після 1934 року, коли було з'ясовано, що за допомогою культури Acetobacter suboxydans з D-сорбіту можна отримати L-copбозу, необхідну для синтеза аскорбінової кислоти [6].

1.1. Особливості синтезу аскорбінової кислоти

Дана кислота синтезується деякими методами:

1. Бензоїновий метод. В основі лежить конденсація треози і етилгліокислоти. Метод неперспективний через дефіцитність сировини, низького виходу.

2. Ціангідриновий метод. Отримання аскорбінової кислоти отримують з L-ліксози або L-ксилози. Практичного застосування не має через відсутність сировини.

3. Отримання аскорбінової кислоти з бурякового «жому» (відходи виробництва цукру з буряка). Метод запропонований американцями в 1904 році. Метод потребує значного вдосконалення: з 100 кг жому отримують всього 2,5 кг аскорбінової кислоти.

4. Частково мікробіологічний метод отримання аскорбінової кислоти з D-глюкози. Включає 5 стадій, в тому числі 3 хімічних. В основі методу лежить окиснення D-глюкози оцтовокислими бактеріями до кальцієвої солі 5-кето-b-глюконової кислоти, яку потім гідролізують і отримують L-аскорбінову кислоту. Метод привертає увагу обмеженим застосуванням хімічних реагентів. Однак вихід продукту низький, а процеси мікробіологічного синтезу важко керовані.

5. Синтез Рейхштейна. Синтез L-аскорбінової кислоти з 2-кето-L-гулонової кислоти. Основна сировина (D-глюкоза) і допоміжні реагенти, застосовувані для синтезу, використовуються в харчовій та хімічній промисловості. В даний час окремі стадії його удосконалюються в НВО «Вітаміни».

Метод Рейхштейна складається з 6 стадій, включаючи 1 стадію мікробного синтезу:

1 стадія. Отримання D-сорбіта з D-глюкози методом каталітичного відновлен-ня воднем.

2 стадія. Отримання L-сорбози з D-сорбіту шляхом його глибинного аеробно-го окислення оцтовокислими бактеріями.

3 стадія. Отримання діацетон-L-сорбози з L-сорбози шляхом її ацетонювання.

4 стадія. Отримання гідрату діацетон-2-кето-L-гулонової кислоти за шляхом окиснення діацетон-L-сорбози.

5 стадія. Отримання L-аскорбінової кислоти з гідрату діацетон-2-кето-L-гуло-нової кислоти (діацетонювання  ‘’етерифікація’’  ‘’енолізація’’  ‘’лакто-нізація’’).

6 стадія. Отримання медичної аскорбінової кислоти. Перекристалізація техніч-ної аскорбінової кислоти [5].

За допомогою лише генетичних маніпуляцій (впливом на регуляцію метабо-лізму) були отримані штами мікроорганізмів, які виробляють в десятки тисяч разів більше вітамінів, ніж необхідно для їхнього росту.

Мікробіологічні технології дозволили вирішити задачу виробництва аскорбінової кислоти [7].

1.2. Мікробіологічний синтез аскорбінової кислоти

Аскорбінову кислоту синтезують деякі гриби, що відносяться до сімейства Aspergillaceae. Промисловий біосинтез аскорбінової кислоти мікроорганізмами в даний час не має поширення.

Синтез вітаміну відбувається хімічним шляхом, лише на одному з етапів при окислюванні сорбіту в сорбозу використовують мікроорганізми. Найбільш детальне дослідження біосинтезу аскорбінової кислоти було виконано такими вченими як І. Митєв, І. Пашев, М. Харізановой, Б. Ламбревим і М. Бешковим (1957).  Як продуцентів аскорбінової кислоти ними були використані культури Aspergillus oryzae та A. niger. У A. niger здатність до синтезу виявилася найбільш сильно вираженою.

Для спрямованого процесу біосинтезу необхідними умовами є аеробна ферментація, температура 30°С і вихідна величина pH середовища повинна бути в межах 2,0 3,0. Сахароза в якості єдиного джерела вуглецю повинна бути в концентрації не нижче 10 %. Джерелом азоту є нітрат амонію. Сприятливий вплив на біосинтез надає молібден, що вводиться в поживне середовище у вигляді молібдату амонію.

Утворення аскорбінової кислоти починається одночасно з розвитком вегетативного міцелію. Крім зазначеного способу, біосинтез аскорбінової кислоти в Японії проводять двома культурами: Acetobacter suboxydans що окиснює глюкозу, а потім мутантний штам Pseudomonas fluorescens, який доводить процес до утворення вітаміну. Вихід спостерігається в кількості 40 45 % від введеного в середу кількості глюкози.

Біохімічний механізм синтезу молекули вітаміну мікроорганізмами дозволений ще не повністю [8].

Синтез аскорбінової кислоти є багатостадійним хімічним процесом, в якому тільки одна стадія представлена біотрансформацією. Ця стадія трансформації d-сорбіту в L-сорбозу за участю бактерій Gluconobacter oxydans, раніше відомий як Acetobacter suboxydans [9].

Для отримання сорбози використовують глибинну ферментацію, коли культуру продуцента G. oxydans вирощують в ферментерах періодичного режиму з мішалкою і барботером для посилення аерації та масообміну протягом 20 40 годин з результатом  виходу сорбози до 98 % від початкової кількості сорбіту в середовищі.

Зазвичай для досягнення такого високого виходу цільового продукту в живильне середовище вносять кукурудзяний або дріжджовий екстракт у кількості близько 20 %. Після закінчення ферментації сорбозу виділяють з культуральної рідини. Крім оптимізації середовища можна удосконалювати і технологічну апаратуру. Наприклад, перехід від періодичного культивування продуцента G. oxydans до безперервного в апараті колоночного типу збільшує швидкість утворення сорбози в 1,7 разів.

В даний час широке використання біотехнологічних процесів дозволяє удосконалювати синтез аскорбінової кислоти, скорочуючи багатоетапні і дорогі хімічні стадії.

Наприклад, синтез вітаміну С здійснюють енолізацією його найважливішого проміжного продукту -2-кето-b-гулоновой кислоти, яку, в свою чергу, отримують методом двухстадійного мікробіологічного синтезу, що складається з окислення d-глюкози в 2,5-дікето-b-глюконовую кислоту (2,5-ДКДГК) і біотрансформації останньої в 2-кето-b-гулонову кислоту (2-КГК) [10].

1.2.1. Поріняння деяких штамів Gluconobacter oxydans які синтезують аскорбінову кислоту

Штам Gluconobacter oxydans ВНДІ 2053 отримано з ВНДІ 1672 методом спонтанної мутації має оптимум рН 5,8 6,5, оптимум температури 30 33°С. Штам стійкий до бактеріофагів, зберігає окиснену активність 8,3 г сорбози/1 г сухої біомаси л.г.

Відомі виробничі штами G. oxydans 64 в колекції ВНДІ № 1672, 1671, 1901. Однак недоліком їх виявляється висока чутливість до зараження фагом (відомі два види фагів GS1 і GS2 виділені при фаговому спалахі на виробництві що призводить до зупинки виробництва і великим економічним втратам 1 г сорбози та 1 г сухої біомаси в 1 л за 1 год.).

G. oxydans штам 64 ВНДІ - продуцент сорбози зберігається в колекції культур мікроорганізмів Всесоюзного науково-дослідних інституту антибіотиків під № 2053

Використання штаму для одержання сорбози:

Культуру вирощують при 28°С протягом доби на агаризованому середовищі наступного складу: агар 2 %, рН 5,5. Отриману культуру змивом переносять в колби ємністю 750 мл з 50 мл ферментаційного середовища наступного складу: сорбіт 10 %, ферментолізат безклітковий 0,5 %, вода водопровідна, рН 6,0.

Після культивування протягом 19 годин при 30°С інокулят в кількості 10 % переносять в колби об'ємом 750 мл з 50 мл середовища, що містить сорбіт 22 %, ферментолізат дріжджів безклітковий 0,2 %, рН 6,0. Ферментацію проводять протягом 43 годин при 220 об/хв.

Визначення сорбози проводять поляриметричним методом. Відносна похибка визначення на рівні значущості 0,95 складає 2,5 %. Ступінь конверсії (% трансформації в сорбозу) складає  97,5% при окисної активності культури 8,3 г сорбози/г сухої біомаси л.г [11].

Штам Gluconobacter oxydans ВНДІ генетика 16 С12 (ВКПМ В 4160) отриманний методом багатоступінчастої селекції на стійкість до виробничих фагів GS1 і GS2, який було отримано з виробничого штаму G. oxydans 15. На кожній стадії селекції здійснювалася оцінка окисної активності отриманих клонів за допомогою поляриметричного виміру утворюючої сорбози за методикою, рекомендованою промисловим регламентом на виробництво аскорбінової кислоти. Бєлгородського вітамінного комбінату.

При культивуванні в виробничих умовах на дріжджоаммонійному середовищі з 2% сорбітом штам дозволяє за 30-36 годин ферментації досягти окиснення собріта в сорбозу 95%.

Ще одним цікавим штамом є Gluconobacter oxydans ВНДІ генетика 16 С12, який зберігається в Всесоюзної колекції промислових мікроорганізмів і має реєстраційний номер ВКПМ В 1460. Штам депонований також в колекції Всесоюзного науково-дослідного інституті антибіотиків і має реєстраційний номер 1898.

Використання штаму для одержання кристалічної сорбози:

Вихідну культуру вирощують протягом 2 діб при 33°С на косяках з агаризованим середовищем наступного складу: рН 5,6, сорбіт 100 г, дріжджовий автолізат (11 % сухих речовин) 60 мл, азоткислий амоній 1 г, вода водопровідна (артезіанська) 1 л.

Культуру бактерій з косяків засівають в пробірки, що містять по 10 мл рідкого середовища вищевказаного складу, і ростять 2 доби при 33°С. Для розмноження отриманої культури її 3 рази послідовно пересівають розводячи після 2 діб росту при 33°С 20-кратним об'ємом свіжоприготовленого середовища. 

Отриманий посівний матеріал контролюють на відсутність сторонньої мікрофлори. При повній стерильності культуру використовують для промислової ферментації.

Отримання сорбози в промислових умовах ведуть в ферментері об'ємом 5000 л, що містить 2500 л середовища, що включає 20 % сорбіту, 0,01 % дріжджового автолізату і 0,01 % азоткислого амонію (рН 5,3).

Окиснення ведуть при інтенсивній аераціі, подаючи в ферментер не менше 3 л стерильного повітря на 1 л середовища/хв. Через 36 годин глибина окиснення сорбіту в сорбозу досягає  94 %. Для виділення сорбози з окисленого розчину його упарюють під вакуумом при температурі не менше 60°С, потім охолоджують до 18-20°С, і ведуть кристалізацію сорбози при перемішуванні.

Випавші кристали сорбози сушать гарячим (50°С) повітрям, просівають і збирають у відповідну тару.

Порівняно з відомим штамом Gluconobacter oxydans 15, штам Gluconobacter oxydans 16 С12 стійкий до фагів, що дозволяє ввести процес культивування у виробничих умовах без фаголізису. Тим самим скорочуючи витрати на виробництво аскорбінової кислоти і збільшенням обсягу готового продукту з  живильного середовища.

А  надсорбіційний механізм стійкості штаму дозволяє використовувати його в якості сорбенту для очищення виробничих ферментерів і комунікаційних ліній від цих фагів, крім того штам дозволяє рекомендувати його для використання в безперервному способі ферментації [12].

Таким чином, на підставі проведених досліджень можна зробити висновок, що пропонований штам Gluconobacter oxydans 16 С12 (ВКПМ В 4160)  є новим штамом, що володіє здатністю до надсинтезу аскорбінової кислоти: синтезує сорбозу за 30  36 годин ферментації окисненням собріта з виходом 95 %. А також штам Gluconobacter oxydans ВНДІ 2053, що за 43 години при окисненні сорбіту синтезує 8,3 г/л сорбози з виходом 97,5 %. На підставі даних проведених досліджень штами бактерій G. oxydans 16 С12 (ВКПМ В 4160)  та G. oxydans ВНДІ 2053 рекомендовані як продуценти при виробництві аскорбінової кислоти.

1.3. Відомі продукти аскорбінової кислоти

Біологічна активність аскорбінової кислоти:

  1.  Бере участь у регулюванні окислювально-відновних процесів, вуглеводного обміну, згортання крові, регенерації тканин; підвищує стійкість організму до інфекцій, зменшує судинну проникність, знижує потребу у вітамінах B1, B2, А, Е, фолієвої кислоти, пантотенової кислоти.
  2.  Бере участь у метаболізмі фенілаланіну, тирозину, фолієвої кислоти, норепінефрину, гістаміну, заліза, засвоєнні вуглеводів, синтезі ліпідів, білків, карнітину, імунних реакціях, гідроксилюванні серотоніну, підсилює абсорбцію негемового заліза.
  3.  Володіє антиагрегантними і виражені антиоксидантні властивості.
  4.  Регулює транспорт водню у багатьох біохімічних реакціях, поліпшує використання глюкози в циклі трикарбонових кислот, бере участь в утворенні тетрагідрофолієвої кислоти і регенерації тканин, синтезі стероїдних гормонів, колагену, проколагену.
  5.  Підтримує колоїдний стан міжклітинної речовини і нормальну проникність капілярів (пригнічує гіалуронідазу).
  6.  Активує протеолітичні ферменти, бере участь в обміні ароматичних амінокислот, пігментів і холестерину, сприяє накопиченню в печінці глікогену. За рахунок активації дихальних ферментів у печінці посилює її дезінтоксикаційну і білковоутворюючу функції, підвищує синтез протромбіну.
  7.  Покращує жовчовиділення, відновлює зовні секреторну функцію підшлункової залози і інкреторну щитовидної.
  8.  Регулює імунологічні реакції, сприяє фагоцитозу, підвищує опірність організму інфекціям (рис 1.1).
  9.  Гальмує вивільнення і прискорює деградацію гістаміну, пригнічує утворення медіаторів запалення та алергічних реакцій.
  10.  У низьких дозах (150 250 мг/добу всередину) покращує комплексоутворюючих функцію дефероксаміну при хронічній інтоксикації препаратами Fe, що веде до посилення екскреції останнього [13].

Рис. 1.1. Деякі лікарські засоби які використовуються у медицині.

Вітамін С (Е300)  також широко використовується і в харчовій промисловості (рис.1.2) в наступних областях:

  1.  в ковбасному і консервному виробництві, для запобігання утворення N- нітрозо-амінов з нітратів і нітритів;
  2.  при виробництві всіх видів м'ясопродуктів, для прискорення утворення забарвлення, поліпшення їх зовнішнього вигляду і підвищення стабільності кольору при зберіганні;
  3.  у виробництві пряжене тваринних жирів і масел, маргаринів;
  4.  у виробництві хлібобулочних і макаронних виробів;
  5.  у виробництві соків, вина, пива, безалкогольних напоїв;
  6.  у виробництві сухих продуктів (напоїв, дієтичних продуктів);
  7.  у виробництві картопляних напівфабрикатів;
  8.  у виробництві солодощів;
  9.  у виробництві фруктових та овочевих консервів, джемів.

Аскорбінова кислота використовується в таких цілях:

• для збагачення продуктів харчування вітаміном С (фруктові соки, безалкогольні напої, сухі напої, фруктові та овочеві пюре, сухі сніданки, льодяники, мармелад, жувальна гумка, консерви);

• для стабілізації продуктів харчування і напоїв, як антиоксидант (додавання в процесі переробки або перед упаковкою дозволяє зберегти колір, запах і поживну цінність);

• як поліпшувач борошна та тіста (покращує пекарські якості, тим самим заощаджуючи 4 8 тижнів, необхідних для дозрівання борошна після помелу);

• для стабілізації кольору свіжого м'яса і м'ясних продуктів, зниження необхідної кількості додаються нітритів і зменшення нітритного залишку в готовому продукті [14].

Рис. 1.2. Деякі продукти харчування з додаванням Е300.

Найбільш багаті аскорбіновою кислотою плоди: барбадоська вишня (1000 3300 мг/100 г), свіжа шипшина (650 мг/100 г), болгарський червоний перець (250 мг/100 г), чорна смородина і обліпиха (200 мг/100 г), перець зелений солодкий і петрушка (150 мг/100 г), брюссельська капуста (120 мг/100 г), кріп і черемша (100 мг / 100 г), ківі (90 мг/100 г), суниця садова (60 мг/100 г), цитрусові (38 60 мг/100 г), яблука (містять 4,6 мг/100 г), а також недостиглі плоди волоського горіха, хвоя сосни та ялиці [15].

Розділ 2. Характеристика біологічного агента

Одним з напрямів розвитку науково-технічного прогресу є перехід від хімічної технології до біотехнології, що дозволяє отримувати відомі речовини і матеріали, що відрізняються високою якістю і низькою собівартістю, а також синтезувати нові продукти. Одним з прикладів цьому служить виробництво аскорбінової кислоти.

Дана кислота вироблялася такими методами:

  1.  Бензоїновий метод.
  2.  Ціангідриновий метод.
  3.  Метод Рейхштейна.
  4.  Мікробіологічний метод отримання аскорбінової кислоти з D-глюкози.

Відкриття мікроорганізмів, здатних продукувати вітамін С дало можливість здійснення економічно вигідного мікробіологічного способу її виробництва. Аскорбінова кислота широко використовується в харчовій і медицинській промисловості. Аскорбінова кислота (Е300) застосовується для поліпшення смакових якостей м'ясних, фруктових та овочевих блюд. Його використовують при консервації, заморожуванні або тривалому зберіганні. У медичній практиці вітамін С знаходить використання в лікуванні хвороби цинги (авітаміноз) [16].

Впродовж останніх 50-ти років особливий інтерес викликає мікробіологічне виробництво аскорбінової  кислоти оцтовокислими бактеріями A. subxydans за допомогою генетичних маніпуляцій (впливом на регуляцію метаболізму) були отримані різні над продуценти цільового продукту [17].

Систематика Acetobacter. Згідно з дев’ятим виданням керівництва Бергі з  фенотипової систематики бактерій  A. suboxydans відноситься до відділу Gracilicutes (грамнегативних еубактерій, які мають клітинну стінку) класу Scotobacteria родини Acetobacteriaceae, роду Acetobacter, виду Acetobacter suboxydans.

Згідно з другим виданням Керівництва Бергі з систематики бактерій (філогенетична класифікація) A. suboxydans відносится до відділу Proteobacteria, класу Alphaproteobacteria, порядку Rhodospirillales, родини Acetobacteraceae і роду Acetobacter [18].

2.1. Морфолого – культуральні та фізіолого – біохімічні ознаки бактерій виду Gluconobacter oxydans

Морфологічні ознаки. Клітини від еліпсоїдних до паличковидних, прямі або злегка зігнуті, 0,6 – 0,8 × 1,0 – 4,0, поодинокі, в парах або ланцюжках (рис. 2.1). У деяких штамів часто присутні форми, які можуть бути сферичними, подовженими, роздутими, булавовидними, вигнутими або ниткоподібними. Клітини рухомі або нерухомі; у рухливих жгутики перитрихіального або літерального виду. Ендоспор не утворюють. Структура зерниста.

Рис. 2.1. Клітини G.oxydans під мікроскопом

Культуральні ознаки. На середовищі  з сорбітом та дріжджовою водою колонії мають два види: 1) невеликі, округлі, випуклі, з блиском,  сіро–бежевого кольору; 2) крупні (2 – 3 мм в діаметрі), по краям  плоскі з випуклим блиском по центру матового кольору.  На середовищі з сорбітом, сусло – агаром колонії мають округлу форму, гладкі, блискучі, сірувато–білого кольору, старі культури ж потім набувають бежевого відтінку [19].

Фізіолого – біохімічні знаки. Облігатні аероби. Метаболізм дихального типу. Колонії на поживному середовищі бліді (рис. 2.2). Характерне утворення водорозчинних пігментів, бактерії мають рожеве забарвлення колоній за рахунок порфіринів. Каталазопозитивні і оксідазонегативні. Желатину не розріджують, індол і сульфід не утворюють.

Джерелами вуглецю є етанол, гліцерин і лактат. Утворюють кислоту з n-пропанолу, n-бутанолу та D-глюкози. За типом живлення – хемоорганотрофи. Оптимальна температура росту 25 – 30°С. Оптимальний діапазон рН 5,4 – 6,3.

Рис. 2.2. Колонії G .oxydans на чашках Петрі

Деякі представники можуть викликати рожеву хвороба плодів ананасів і гниль яблук і груш, тобто є фітопатогенами [20].

2.2. Особливості метаболізму біологічного агента

G. oxydans не повністю окиснюють цукри, цукрові кислоти і спирти, а лише за природних умов можуть повністю окиснити субстрати [21]. Вони мають мембранні дегідрогенази, які здійснюють процес неповного окиснення [22].

Метаболізм глюкози бактеріями G. oxydans здійснюється шляхом  гліколізу  (рис. 2.3). Процес пертворення глцеральдегід-3-фосфату пов'язаний з витратами енергії, але під час подальшого його окиснення до пірувату ця енергія вивільнюється. Пертворення 1,3-дифосфогліцертау на 3-фосфогліцерат спряжено з фосфирилюфанням АДФ і утворенням АТФ (фермент фосфогліцераткіназа). Ця реакція є одним із пунктів  гліколізу, в яких утворення АТФ відбувається фосфорилюванням на рівні субстрату.

Фосфоенолпіруват (ФЕП) – це друга сполука, яка містить фосфорильний зв'язок з високою енергією гідролізу: при утворенні пірвату з ФЕП фосфат переносится на АДФ з утворенням АТФ (фермент піруваткіназа). Ця реакція є другим пунктом утворення АТФ на рівні субстрату в цьому шляху для бактерій G. оxydans.

Піруват під дією піруватдегідрогенази окиснються до 2-гідроксиетилтіамінди-фосфату, який потім під дією  фумарат гідратази утворює ацетальдегід що розгалу-жується з утворенням ацетату і етанолу (ферменти алкогольдегідрогеназа і НАД – залежна альдегіддегідрогеназа) [11, 18].

                                                 Глюкоза

                                                         1                АТФ

                                          Глюкозо-6-фосфат

                                                         2                   

                                          Фруктозо-6-фосфат

                                                         3                 АТФ              

                                      Фруктозо-1,6-дифосфат

                                                         4                    

                                        Гліцеральдегід-3-фосфат

                                                         5                2 НАДН

                                      1,3-дифосфогліцерат

                                                         6                2 АТФ     

                                              3-фосфогліцерат

                                                         7                     

                                             2-фосфогліцерат

                                                         8                      

                                             Фосфоенолпіруват

                                                        9                 2 АТФ

                                                                  Піруват

                                                                  10                                         

                                    2-гідросиетилтіаміндифосфат       

                                                      11                 12               

                                                 Ацетальдегід            Етанол

                                                      13

                                                        Ацетат  

Рис. 2.3. Метаболізм глюкози G. oxydans H24.

Ферменти:1) фосфоглюкомутаза [5.4.2.2.], 2) трансальдолаза [5.3.1.9.], 3) фруктозо-1,6-біфосфатаза [3.1.3.11. ], 4) фруктоза-1,6-бісфосфат альдолаза [4.1.2.13.],  5) гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа [1.2.1.12], 6) фосфогліцераткіназа [2.7.2.3.],  7) фосфогліцерат мутаза [5.4.2.12.],   8) енолаза [4.2.1.11.],  9) піруват кіназа [2.7.1.40.],  10) піруватдегідрогеназа [1.2.4.1.],  11) фумарат гідратаза [4.1.1.1.],  12) алкогольдегідрогеназа [1.1.1.1.],  13) НАД- залежна альдегіддегідрогеназа [1.2.1.3.].

Розрахунково-графічна частина

Розділ 3. Визначення показників швидкості росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів

Стадія ферментації є основною стадією в біотехнологічному процесі, тому що в її ході відбувається взаємодія продуцента із субстратом і утворення цільових продуктів (біомас, ендо- і екзопродуктів). Ця стадія здійснюється в біохімічному реакторі (ферментері) і може бути організована залежно від особливостей використовуваного продуцента й вимог до типу і якості кінцевого продукту різними способами. При періодичному способі культивування ферментер заповнюється вихідним живильним середовищем з інокулятом мікроорганізмів.

Протягом певного періоду часу в апараті відбувається взаємодія мікроорганізмів із субстратом, що супроводжується утворенням у культурі продукту. Біохімічні перетворення в цьому апараті тривають від десятків годин до декількох діб. Регуляція умов усередині ферментера - найважливіше завдання періодичного культивування мікроорганізмів. У ході періодичної ферментації вирощувана культура проходить ряд послідовних стадій: лаг-фазу, експонентну, уповільнення росту, стаціонарну й відмирання. При цьому відбуваються істотні зміни фізіологічного стану біооб’єкта, а також ряду параметрів середовища.

Цільові продукти утворюються в експонентній (первинні метаболіти - ферменти, амінокислоти, вітаміни) і стаціонарній (вторинні метаболіти - антибіотики) фазах, тому залежно від цілей біотехнологічного процесу в сучасних промислових процесах застосовують принцип диференційованих режимів культивування. У результаті цього створюються умови для максимальної продукції того або іншого цільового продукту [23, 24].

3.1. Визначення парметрів кривої росту

Завдання: визначити швидкість росту () між 24 та 32 год., культивування;

- рівень біомаси;

- економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація етанолу в середовищі становить 0,25 М;

- тривалість лаг-фази.

При внесенні у поживне середовище бактерії ростуть до тих пір, поки вміст якого-небудь необхідного компонента не стане мінімальним або не вичерпається, після чого ріст припиняється. Якщо впродовж усього цього часу в середовище не вносити ніяких поживних речовин і не виводити продукти метаболізму, то одержимо так звану періодичну культуру (популяцію клітин в обмеженому життєвому просторі [25].

Визначення швидкості експоненційного росту. Експоненційна фаза характеризується максимальною швидкістю поділу клітини. У цій фазі процеси росту проходять збалансовано (тобто подвоєння біомаси супроводжується подвоєнням кількості білка, ДНК, РНК та ін.). Можна сказати, що культура в експоненційній фазі складається із “стандартних” клітин. Але треба мати на увазі, що і в експоненційній фазі клітини періодичної культури зазнають змін, оскільки постійно змінюється середовище: зменшується концентрація субстрату, збільшується густина клітинної суспензії, накопичуються продукти обміну. 

У зв’язку з тим що в цій фазі швидкість поділу відносно постійна, вона найзручніша для визначення швидкості поділу та швидкості росту. Вплив факторів зовнішнього середовища, складу поживного середовища на ріст мікроорганізмів визначають, спостерігаючи за показником біомаси чи кількістю клітин саме під час експоненційного росту [26].

Рис. 3.1 Крива росту бактеріальної популяції

Швидкість експонеційного росту – це міра швидкості росту клітин в екпонеційній фазі. Згідно з умовою год,  год. Визначаємо (за рис 3.1) концентрацію біомаси у момент часу  та : =4,915 г/л;  г/л. Швидкість визначають за формолою (3.1) виходячи з початкової та кінцевої біомаси   та  у моменти часу  та :

Отже:

Рівень біомаси. Біомасу визначають за допомогою прямих і не прямих методів. У повсякденній практиці перевага надається непрямим методам (з використанням відповідного калібрувального графіка). Розглянемо детальніше прямі і непрямі методи визначення біомаси.

Існує кілька прямих методів визначення біомаси:

  1.  сиру біомасу визначають після осадження клітин центрифугуванням. Після висушування відмитих клітин можна визначити суху біомасу ;
  2.  визначення загального азоту (наприклад, за методом К’єльдаля) або загального вмісту вуглецю (наприклад, за методом Тюріна);
  3.   визначення вмісту білка (наприклад, за допомогою біуретового методу, методу Лоурі чи Фоліна).

Серед непрямих методів відомі наступні:

  1.  біомасу визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на суху біомасу за допомогою калібрувального графіка ;
  2.  визначення показників інтенсивності метаболізму, безпосередньо пов’язаних з ростом (поглинання кисню, утворення ) [27].

Рівень біомаси (концентрація біомаси) – це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій:

                                 (3.2)

Цю велечину визначають у граммах (міліграмах) сухої речовини, яка міститься у літрі (мілілітрі) культуральної рідини або клітинної суспензії. Згідно наведенного графіку ( рис 3.2) вихідний рівень біомаси становить 0,35 г/л, а рівень біомаси у стаціонарній фазі росту 5 г/л. Отже, згідно з рівнянням (3.2) концентрація біомаси становить: 5 - 0,35 = 4,65 г/л.

Рис. 3.2 урожай клітини (біомаса)

Економічний коефіцієнт. Важливим показником періодичного процесу э відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату – . Якщо ці дві величини виражені в вагових одтиницях, то відношення  називають - економічним коефіцієнтом (Y). Економічний коефіціент може бути разрахований також як відношення біомаси до заданного субстрату. Якщо врожай в граммах відноситься до кількості молей спожитого субстрату - молярним економічним коефіцієнтом.

Згідно з умовою, початкова контцентрація етанолу у середовищі становить 0,25 М, або  (молекулярна масса етанолу становить 46,07). Рівень біомаси становить 4,65 г/л, отже економічний коефіцієнт:

Тривалість лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом , в який культура досягла певної біомаси , і моментом ,  в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби відразу ж після інокуляції починався експоненційний ріст.

На реальній кривій росту проводять теоретичну криву (рис 3.3).

Рис 3.3 Теоретична крива на реальній кривій росту

Триваліcть лаг-фази визначають за формулою (3.3):

Де  визначають за формулою (3.4):   

За умовою ; приймаємо , таким, що дорівнює 3,2 г/л. На реальній і теоретичній кривих визначають час , потрібний для досягнення 3,2 г/л біомаси: д. 

Швидкість росту  розраховують за формулою (3.4) для реальної кривих в інтервалі часу д. За реальною кривою визначають . Отже, швидкість росту:

Знаючи швидкість росту, за формулою (3.2) можна визначити тривалість лаг-фази: 

Отже, тривалість лаг-фази становить 3 години.

3.2. Визначення типу живлення

Визначити тип живлення, якщо джерелом енергіє є , джерелом вуглецю – лактат і донором електронів - .

У класифікації типів живлення  у мікроорганізмів використовують термінологію, запропоновану у 1946р. на симпозіумі у Колд Спринг Харбор. Розглядають типи живлення (трофії) щодо:

  1.  джерела енергії(хемо – хімічне, фото – світлове);
  2.  донора електронів (органо – органічна сполука, літо – неорганічна);
  3.  джерела вуглецю (авто – вуглекислота, гетеро – органічна сполука).

Отже, згідно з умовою завдання, щодо джерела вуглецю (лактат-органічна сполука) тип живлення визначають як гетеротрофію, щодо джерела енергії (, хімічна неорганічна сполука) – як хемотрофію, щодо донора електронів (, неорганічна сполука) – як літотрофію. Тип живлення – хемолітогетеротрофія.

Такий тип живлення характерний для:

  1.  Метаноутворюючих археобактерій Methanobrevibacter smithii, які можуть перетворювати  і  в , але не здатні утворювати ацетил - коензим А з , оскільки в них відсутній СО- дегідрогеназа. Асиміляція інших джерел вуглецю (ацетату, метанолу, метиламин і інших) здійснюється завжди шляхом утворення ацетилкоензима А. [28].  
  2.  Тіонових бактерій Thiobacillus permetabolis і Thiobacillus trautweinii, які ростуть тільки на органічних середовищах. Однак їх зростання в таких умовах прискорюється в присутності тіосульфат , який вони окислюють до сульфату , для отримання енергії,  вважають, що для даних бактерій окислення тіосульфата не має істотного біологічного значення , а є побічною реакцією. Також  використовують вуглекислоту для утворення різних компонентів клітин.
  3.  Сіробактерій (Тіобактерій ) роду Paracoccus, Achromatium, Sulfolobus, Acidianus, Beggiatoa, які окислюють відновлені сполуки сірки. Енергію для синтезу органічних речовин вони отримують , окислюючи сірководень або інші відновлені сполуки сірки : сульфіди металів, полісульфіди , тіосульфати, молекулярну сірку. Основним продуктом окислення сполук сірки є сульфат [29].

3.3. Визначення константи швидкості поділу і тривалості генерації

Визначити константу швидкості поділу (v) та тривалість  генерації (g), якщо:

  1.  Початкова концентрація клітин становить .

Бактерії розмножуються бінарним поділом, тому їх кількість збільшується в геометричній прогресії: . Якщо на одиницю об’єму періодичної культури, що росте, припадає  клітин, то після n поділів кількість клітин стане  Логарифмуючи, отримаємо:

,                                (3.5)

Звідси кількість клітинних поділів:

                           (3.6)

Кількість клітинних поділів за 1 годину (константа швидкості поділу v) визначають за формулою (3.6):

   (3.7)

Час, потрібний для одного циклу поділу (тривалість генерації g), визначають за формулою:

                                         (3.8)

Якщо за 8 годин кількість клітин у суспензії збільшується з , то константа швидкості поділу:

Тривалість генерації становить:  годин.

Розділ 4. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

Поживні середовища є основою мікробіологічної роботи, і їх якість нерідко визначає результати всього дослідження. Середовища повинні створювати оптимальні умови для життєдіяльності мікробів і повинні відповідати таким умовам:

1) містити в легко засвоюваному вигляді всі речовини, необхідні для задоволення харчових і енергетичних потреб мікроорганізмів;

2) мати оптимальну концентрацію водневих іонів - рН, так як тільки при оптимальній реакції середовища, що впливає на проникність оболонки;
        3) бути стерильними, так як сторонні мікроби перешкоджають росту досліджуваного мікроба, визначенню його властивостей і змінюють властивості середовища;

4) щільні поживні середовища повинні мати оптимальну консистенцію;
        5) володіти певним окисно-відновним потенціалом, тобто співвідношенням речовин, які віддають і приймають електрони (високий потенціал, для інших – низький);
         6) бути по можливості уніфікованим, тобто містити постійні кількості окремих інгредієнтів [30].

4.1. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

Завдання: визначити чи правильно вказаний склад поживного середовища (г/л)? Якщо так, для яких мікроорганізмів це середовище може бути використане?

Сахароза – 2%

Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, мають відповідати таким мінімальним вимогам: у них мають бути присутні всі елементи, з  яких будується клітина, причому в такій формі,  в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати. До складу бактеріальної клітини входять такі елементи, % до маси сухої речовини: вуглець – 50; кисень – 20; азот – 10–14; водень – 8; фосфор – 3; сірка, калій, натрій – 1; кальцій, магній, хлор – 0,5; залізо – 0,2; решта елементів ~ 0,3.

Тільки невелика кількість елементів періодичної системи потрібне мікроорганізмам у відносно високих концентраціях (). це десять головних біологічних елементів: вуглець, кисень, водень, азот, сірка, фосфор, калій, магній, кальцій та залізо (табл. 4.1). Крім деяких головних біоелементів, мікроорганізмам необхідні мінорні біоелементи, джерелом яких, як правило, є водопровідна вода (табл. 4.2) [7].

Таблиця 4.1

Десять головних біоелементів, їх джерела і функції

Елемент

Джерело

Функції в метаболізмі

C

Орг. спол., CO2

Входить до складу всіх органічних речовин клітини.

O

O2, H2O, орг. спол., CO2

Те саме. У вигляді О2 є акцептором електронів при аеробному диханні.

H

H2, H2O, орг. спол.

Входить до складу води і всіх оргонічних речовин клітини.

N

NH4+, NO3-, N2, органічні сполуки

Входить до складу білків, нуклеїнових кислот, коферментів.

S

SO4+, HS- , S0, S2O32-, орг. спол. сірки

Компонент цистеїну, метионіну, тиамін-пірофосфату, коферменту А, біотину та ліпоєвої кислоти.

P

HPO42

Компонент нуклеїнових кислот, фосфоліпідів, нуклеотидів, коферментів; участь в утворенні АТФ.

K

K+

Основний неорганічний катіон у клітині, кофактор ферментів.

Mg

Mg2+

Кофактор ферментів (наприклад, кіназ), присутній у клітинних стінках, мембранах та ефірах.

Ca

Ca2+

Кофактор ферментів, входить до складу екзоферментів (амілаз, протеаз), Са2+-дипіколінат є важливим компонентом ендоспор.

Fe

Fe2+, Fe3+

Міститься в цитохромах, фередоксинах, інших залізосіркопротеїдах, кофактор ферментів.

Таблиця 4.2

Мінорні біоелементи, їх джерела і функції в клітині

Елемент

Джерело

Функції в обміні речовин

Zn

Zn2+

Міститься в ферментах (алкогольдегідрогеназа, лужна фосфатаза, альдолаза, PHK- та ДНК-полімераза).

Mn

Mn2+

Міститься в бактеріальній пероксиддисмутазі, кофактор ферментів.

Na Cl

Na+ ,Cl-

Необхідні галофільним бактеріям.

Mo

MoO42-

Міститься в ферментах (нітратредуктаза, нітрогена-за, форміатдегідрогеназа).

Se

SeO32

Міститься в ферментах (гліцинредуктаза, форміатдегідрогеназа).

Co

Co2+

Міститься в коферменті вітамін-В12-ферментів (глута-матмутаза, метилмалоніл-КоА-мутаза).

Cu

Cu2+

Міститься в цитохромоксидазах та оксигеназах.

W

WO42-

Міститься в деяких форміатдегідрогеназах.

Ni

Ni2+

Міститься в уреазі, необхідний для автотрофного росту водневих бактерій.

У середовищі наведеного складу сахароза є джерелом вуглецю, кисню та водню, хлорид амонію – азоту та хлору, дегідрофосфат калію – калію і фосфору, хлорид кальцію – кальцію, сульфат магнію – сірки і магнію, хлорид заліза – джерело заліза. З необхідних10 головних біоелементів у даному середовищі присутні усі елементи.

Отже, таке середовище наведеного складу придатне для вирощування не ферментуючих аеробних грамнегативних бактерій, які не ферментують цукри, й представляють собою по номенклатурі умовну групу збудників інфекційної патології людини. Призначене для виділення та первинної діагностики мікроорганізмів роду Pseudomonas, Alcaligenes [31].

4.2. Визначення теоретично-можливого рівня біомаси

Концентрація нітрату калію в середовищі для вирощування бактерій становить 1,5 г/л, а глюкози – 10 г/л. Розрахуйте теоретично можливий рівень біомаси.

Вміст азоту в біомасі бактерій становить від 10 до 14 % від маси сухої речовини. Для визначення рівня біомаси, якого можна досягнути при культивуванні бактерій на середовищі 1,5 г/л нітрату калію потрібно розрахувати вміст елементарного азоту в даній солі.

Молекулярна маса нітрату калію - 101. Отже, у 101 г нітрату калію міститься 14 г азоту,  а в 1,5 г цієї солі вміст азоту становить: 

. Якщо у біомасі міститься 10% азоту, то з 0,21 г азоту можна одержати 2,1 г/л біомаси.

Вміст вуглецю в біомасі бактерій становить 50% від маси сухої речовини. Для визначення рівня біомаси, якого можна досягнути при культивуванні бактерій на середовищі з10 г/л глюкози розрахуємо вміст вуглецю у даній сполуці. Молекулярна маса глюкози  -  180.

Отже, у 180 г  сполуки міститься 72 г вуглецю,  а в 10 г даної сполуки: г. Якщо в біомасі міститься 50% вуглецю, то з 10 г можна було б отримати г біомаси. Але відомо, що 50% спожитого клітиною вуглецю йде на енергетичний метаболізм. Тому в даному випадку на тез піде г вуглецю.

Отже теоретично можливий рівень біомаси становитиме г/л.

Згідно разрахунку у наведеному поживному середовищі лімітувати ріст мікроорганізмів буде концентрація нітрату калію. Теоретично можливий рівень біомаси буде 2,1 г/л.

Розділ 5. Енергетичний баланс окислення субстрату

Завдання: скласти енергетичний баланс окиснення глюкози за наступних умов:

а) катаболізм здійснюється через глюконат;

б) Р/О=1;

в) глюконокіназа відсутня;

г) НАДФ є джерелом відновлювальних еквівалентів;

д) глюкозодегідрогеназа є НА - залежним ферментом.

Глюкоза найпоширеніша органічна речовина на Землі, в перетворенні якої беруть участь представники всього живого світу (рослини, тварини, мікроорганізми). Крім того, вуглеводи є найуживанішим субстратом для культивування промислово важливих мікроорганізмів, які є об’єктами біотехнології [18].

Деякі бактерії (наприклад псевдомонади) здатні розкладати глюкозу через глюконат. При цьому глюкоза під дією глюкозодегідрогенази окиснюється до глюконату. За умови що глюконокіназа відсутня глюконат під дією ферменту  глюконатдегідрогенази окиснюється до 2-кетоглюконату,  який потім під дією кетоглюконаткінази перетворюється на 2-кето-6-фосфоглюконат що фосфори-люється і відновлюється утворюючи 6-фосфоглюконат, який катаболізується далі за шляхом Ентнера Дудорова.

Шлях Ентнера  Дудорова, називають також КДФГ  шляхом який був відкритий в 1952 році американськими вченими Натаном Ентнером і Михайлом Дудоровим [32]. Цей шлях поширений в природі надзвичайно широко і використовується різними групами грампозитивних і грамнегативних бактерій, а також деякими археями і навіть еукаріотами [33].

Аналіз окисно-відновних потенціалів (див. таблицю) показує, що у дихальному ланцюгові є тільки три етапи окиснення, на яких вивільнюється стільки енергії, скільки міститься в одному макроергічному зв’язку.

Р/О – це число молекул АТФ, утворюваних у розрахунку на один атом кисню. У мітохондріальному дихальному ланцюгові цей коефіцієнт дорівнює трьом, якщо донор електронів є НАДН, і двом, якщо донор електронів ФАД.

Відомі пункти утворення АТФ:

  1.  дегідрування НАДН;
  2.  окиснення цитохрому b; 
  3.  окиснення цитохрому а.

 Таблиця

Компоненти дихального ланцюга

Комп. дихального ланцюга

Окисно-відновний потенціал (Е01), В

Різниця потенціалів, В

Зміна вільної енергії (- G01), кДж/моль

Водень

- 0,42

0,10

0,24

0,04

0,31

0,02

0,52

19,3

46,4

7,7

59,8

3,8

100,4

НАД

- 0,32

Флавопротеїн

- 0,08

Цитохром b

- 0,04

Цитохром c

+ 0,27

Цитохром a

+ 0,29

Кисень

+ 0,81

Знаючи співвідношення Р/О, можна скласти енергетичний баланс окиснення субстрату [34].

За умовою катаболізм здійснюється через глюконат, тоді сумарна реакція розщеплення глюкози має вигляд:

Глюкоза → 2 Піруват + АТФ + НАДН + НАДФН .

Далі піруват окислюється до ацетил-КоА, який далі окислюється у циклі Кребса.

Але за умовою що НАДФ є джерелом відновлювальних еквівалентів, тому на 1 моль використаної глюкози кількість утворених відновлюваних еквівалентів (НАДН та НАДФ) становить (рис. 5.1 та 5.2):

  1.  при окисленні глюкози до пірувату – 2 моль НАДН і 2 моль НАДФН;
  2.  при дегідруванні пірувату – 2 моль НАДН;
  3.  у циклі трикарбонових кислот – 2×3=6 моль НАДН і 2 моль ФАДН.

При умові Р/О= 1, кількість АТФ становитиме: 12×1+2×1=14 моль АТФ.

Якщо до цього добавити 1 моль АТФ, яка синтезувалася в КДФГ-шляху, та 2 моль АТФ, які утворюються у циклі Кребса, одержимо: 14+3=175 моль АТФ.

Отже, при окисленні 1 моль глюкози за заданим шляхом утворюється 17 моль АТФ.

                                                      Глюкоза

1                       НАДН

                                                     Глюконат

2                    НАДФН

                                              2-Кетоглюконат

3                         АТФ

                                           2-кето-6-фосфоглюконат

4                    НАДФН

                                                 6-фосфоглюконат

                                                      5          

                                   2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат

6                     Піруват

                                      Гліцеральдегід-3-фосфат

7                       НАДН

                                         1,3-дифосфогліцерат

8                        АТФ

                                             3-фосфогліцерат

                                                                  9  

                                                 Фосфоенолпіруват

10                         АТФ

                                                        Піруват

Рис.5.1. Катаболізм глюкози через глюконат:

ферменти: 1) глюкозодегідрогеназа; 2) глюконатдегідрогеназа; 3) кетоглюконаткі –наза; 4) 2-кето-6-фосфоглюконатдегідрогеназа; 5) фосфоглюконатдегідратаза; 6) 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолаза; 7) гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа; 8) фосфогліцераткіназа;  9)  гліцератфосфомутаза, фосфогліцератфосфомутаза та енолаза; 10) піруваткіназа.

Піруват

Ацетил-КоА

Оксалоацетат

Цитрат

Ізоцитрат

2-Оксоглутарат

Сукциніл-КоА

Сукцинат

Фумарат

Малат

НАДН

СО2

СО2

НАДН

СО2

НАДН

ФАДН

НАДН

1

2

3

4

5

6

7

8

9

АДФ

АТФ

Рис.5.2 Цикл трикарбонових кислот:

ферменти: 1) піруватлегідрогеназа; 2) цитратсинтаза; 3) аконітаза; 4) ізоцитратде –гідрогеназа; 5) 2-оксоглутаратдегідрогеназа; 6) сукцинаттіокіназа; 7) сукцинатде –гідрогеназа; 8) фумараза; 9) малатдегідрогеназа.

5.1. Окиснення сорбіту бактеріями Acetobacter suboxydans

A. suboxydans використовується в промисловості для окиснення вуглеводів таких як гліцерин, D-фруктози, D-глюкози, а також сорбіту в сорбозу, які безпосередньо беруть участь у виробництві L-аскорбінової кислоти [35].

А. suboxydans володіє сорбіт-дегідрогеназами, які повністю окиснюють D-сорбіт до L-сорбози за допомогою правила Бертрана – Хадсона: "поліоли з цис-розташування двох вторинних гідроксильних груп D-конфігурації із суміжної первинної спиртової групи окиснюється до відповідної кетози".

Де трансформація D-сорбіту до L-сорбози каталізується мембранно-звязаною поліолдегідрогеназою, яка найбільш активна при pH 5,0 та розчинна  НАДФ – за-лежною при pH 8,0 і більше [36].

Рис. 5.3. Окиснення D-сорбіту до L-сорбози

Так, у присутності D-сорбіту, сорбіт-дегідрогенази ефективно окиснюють його з ~ 60% виходом, до L-сорбози, який потім піддають серії реакцій, які в кінцевому рахунку дають вітамін С (аскорбінову кислоту) [37].

ВИСНОВКИ

1. У загальній частині даної курсової роботи було розглянуто бактерію виду Gluconobacter oxydans раніше відома як Acetobacter suboxydans, яка використовується для виготовлення аскорбінової кислоти.

2. Розглянуто загальні характеристики даного мікроорганізму, його морфо-фізіологічні властивості та таксономічний статус.

3. В розрахунково  графічній частині визначили показники росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів та отримали такі результати:

  1.  Швидкість росту між 24 та 32 год культивування становить 0,731 
  2.  Рівень біомаси дорівнює 4,735 г/л.
  3.  Економічний коефіцієнт становить 41%
  4.  Тривалість лаг-фази становить 3,8 год.

4. Встановлено тип живлення: джерела вуглецю – лактат (органічна сполука) тип живлення визначають як гетеротрофію, що до джерела енергії - (хімічна) тип живлення – хемотрофія, донором електронів виступає (неорганічна сполука), тому літотрофія. Тип живлення – хемолітогетеротрофія.

5. Константа швидкості поділу () та тривалість генерації (g) відповідно становлять 1,66 та 0,6 год.

6. Наведене в завданні поживне середовище придатне для росту мікроорганізмів роду Pseudomonas та Alcaligenes.

7. Теоретично можливий рівень біомаси становить 2,1 г/л.

8. При катаболізмі глюкози за гліколітичним шляхом за умови, що Р/О дорівнює 1, кількість синтезованих АТФ дорівнює 17 моль.

Література

1. Быховский В.Я. Микробиология: М.: Мир, 1998.  320 с.

2. Маруненко І.М. “Біотехнологія: перспективи розвитку”: № 7, 1997.

3. Спиричев В.Б., Рисаренко Т.В. Вітамін С, або аскорбінова кислота: Журнал здоровя № 89/4.

4. Вітамін С (аскорбінова кислота) URL: http://vitaminz.su/vitamin-C.html

5. Акинин Н.И. Промышленная экология принципы, подходы, технические решения: М.: Техноиздат, 2002.

6. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию: М.: 1978. – 228 с.

7. Поляков Е.С. Реферат : «Производство витаминов»  URL: http://otherreferats.allbest.ru/biology/00020546_0.html

8. Красільнікова Т.М.,  Корольов П.М., Поморцева Н.В., Ведерніков Е.И.,

Петрова Л.Ф., Тивиков В.І. Gluconobacter oxydans продуцент сорбози., URL: http://findpatent.com.ua/img_show/3234624.html

9. Т.М. Григор'єва, Т.А. Смирнова, Т.А. Левіна, Л.И.Сироткина, М.Ф. Макаренко Штам Gluconobacter oxydans продуцент сорбози.,

URL: http://findpatent.com.ua/img_show/7004484.html

10. Будущее биотехнологии URL: http://beregrusskij.narod.ru/index-673.html

11. РГАУ-МСХА Зооинженерный факультет: биосинтез аскорбиновой кислоты URL: http://www.activestudy.info/biosintez-askorbinovoj-kisloty/

12.  Sue Macauley, Brian McNeil, and Linda M. Harvey. 'The Genus Gluconobacter and Its Applications in Biotechnology'. Critical Reviews in Biotechnology, 21:1, 125.

13. Блинова К. Ф. и дрБотанико фармакогностический словарь: Справ. пособие / Под ред. К. Ф. Блиновой, Г. П. Яковлева:  М.: Высш. шк., 1990.  С. 19.  ISBN 5-06-000085-0.

14. Пищевая промышленность URL: http://ascorbicacid.com.ua/application/pishchevaya-promyshlennost

15. Скурихин И. М., Волгарев М.Н. Химический состав пищевых продуктов: Справочник (книга 1). М.: Агропромиздат, 1987.  224 с.

16. Ecological occurrence of Gluconacetobacter diazotrophicus and nitrogen-fixing Acetobacteraceae members: their possible role in plant growth promotion 2008. Microb. Ecol. 55(1):130 40.

17. Formation of cellulose by certain species of Acetobacter Biochem J. 1951 May; 48(5): 618 621.

18. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія: Підруч. – 2-е вид., доп. і перероб. – К.: НУХТ, 2010. – 632 с.

19. Хоулт Дж. Определитель бактерий Берджи Том 1: М.: Мир, 1997. 421 с.  

20. C. Gatgens, U. Degner, S. and U. Herrmann. 'Biotransformation of glycerol to dihydroxyacetone by recombinant Gluconobacter oxydans DSM 2343'. Biotechnological Products and process engineering. April 2007.

21. J. Katrlik, I. Vostiar, J. Sefcovicoa, J. Tkac, V. Mastihuba, M. Valach, V. Stefuca, and P. Gemeiner. 'A novel microbial biosensor based on cells of Gluconobacter oxydans for the selective determination of 1,3-propanediol in the presence of glycerol and its application to bioprocess monitoring'. Analytical and Bioanalytical Chemistry, Springer-Verlag 2007.

22. Електронна база KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) URL: http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html

23. Аиба Ш., Хемфри А., Миллс Н. Биохимическая технология и аппаратура. – М., 1967. 

24. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. - М.: Агропромиздат, 1987. 

25. Шлегель Г. Загальна мікробіологія: М.: Мир, 1972. – 559 с.

26. Тренкеншу Р.П.  Проста модель зростання мікроводоростей: УДК 582.26 / 27: 581.143: 519.24, 2005. – 97 с.

27. Методи загальної бактеріології: Пер. з англ. / Під. ред. Ф. Гархардта та ін. – М.: Мир, 1983. – 563 с.

28. Русанов И.И. Биотехнологический цикл метана на северо-западном шельфе Черного моря // Микробиология. 2002. – Т.71. – Вып. 4 –  558  566 с.

29. Современная микробиология. Прокариоты: В 2-х томах / Под ред. Й. Ленглера, Г. Древса, Г. Шлегеля.  М.: Мир, 2005.

30. Прозоркина Н. В., Рубашкина Л. А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений. Ростов: Феникс, 2002. – 416 с.

31. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медецинской микробиологии: Санкт-Петербург, 2002. 80 c.

32. Conway T. The Entner-Doudoroff pathway: history, physiology and molecular biology. (англ.) // FEMS microbiology reviews.  1992.  Vol. 9.  1.  P. 1 27. 

33. Гудзь С.П., Кузнєцова  Р.О., Кучерас Р.В., Коструба М.Ф., Білінська І.С., Полулях О.В. Основи мікробіології: К.: НМК ВО., 1991. – 101 с.

34. Гунський Ю.І.  Біологічна хімія: Підручник. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000.
35.
S. Macauley, B. McNeil, and L.M. Harvey. 'The Genus Gluconobacter and Its Applications in Biotechnology'. Critical Reviews in Biotechnology, 21:1, 125.

36. Егоров Н.С.   Промышленная микробиология: М.: книга по требованию., 677 с.

37. Joshi V.K. Fermentative Production of L-sorbose from D-sorbitol by Acetobacter suboxydans (Vinegar Isolate). Indian Journal of Experimental Biology  September 1974. Vol. 12  Р. 422 424.

Додаток


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

74807. Работа переменной силы. Кинетическая, потенциальная энергии 144.5 KB
  Кинетической энергией называют механическую энергию всякого свободно движущегося тела и измеряют ее той работой, которую могло бы совершить тело при его торможении до полной остановки.
74808. Закон сохранения энергии в механике. Консервативные, диссипативные системы. Примеры 26 KB
  В замкнутой системе тел, силы взаимодействия между которыми консервативны (потенциальны), отсутствуют взаимные превращения механической энергии в другие виды энергии. Такие системы называются замкнутыми консервативными и для них справедлив закон сохранения энергии...
74809. Динамика вращательного движения абсолютно твердого тела. Центр массы. Момент инерции. Кинетическая энергия 57.5 KB
  Неподвижная ось вращения z может проходить как через центр инерции тела (ось вращения маховика, ротора турбины и т.п.), так и вне его (например, ось вращения самолета, выполняющего мертвую петлю). Если известен момент инерции тела относительно оси, проходящей через его центр масс...
74810. Основной закон динамики вращательного движения. Закон сохранения момента импульса. Примеры 87 KB
  Векторная сумма моментов всех внешних сил приложенных к телу называется результирующим или главным моментом внешних сил относительно точки О: Векторная сумма моментов импульса всех материальных точек тела называется моментом импульса тела относительно точки...
74811. Элементы теории поля. Потенциал, градиент потенциала и напряженность поля. (Пример - гравитационное поле) 66 KB
  Потенциал градиент потенциала и напряженность поля. Гравитационное взаимодействие между телами осуществляется с помощью поля тяготения или гравитационного поля. Основное свойство поля тяготения заключается в том что на всякое тело массой т внесенное в это поле действует сила тяготения...
74812. Закон всемирного тяготения. Движение в поле тяготения. Центральные силы. Гравитационное поле и его напряженность 38.5 KB
  Если материальная точка совершает движение под действием центральной силы с центром O, то момент количества движения точки сохраняется, а она сама совершает движение в плоскости, перпендикулярной вектору момента количества движения относительно точки O и проходящей через эту точку O.
74813. Особенности творческого пути А.С. Грибоедова. История создания и публикации «Горя от ума». Чацкий как герой эпохи 1810 –1820-х годов и «вечный» конфликт «старого и нового». Элементы классицизма, романтизма и реализма в комедии 15.67 KB
  Элементы классицизма романтизма и реализма в комедии. Замысел комедии возник в 1820 году по некотором данным уже в 1816 но активная работа над текстом начинается в Тифлисе после возвращения Грибоедова из Персии. В 1825 году с большими цензурными сокращениями были напечатаны отрывки из I и III актов комедии но разрешение на её постановку получить не удалось. Роль Чацкого главная роль без которой не было бы комедии а была бы пожалуй картина нравов.
74814. А.С. Пушкин и начало «золотого века» русской литературы. Периодизация творчества писателя и его структура 15.17 KB
  Золотой век русской литературы – это плеяда гениев искусства слова, прозаиков и поэтов, которые благодаря своему изысканному и непревзойденному творческому мастерству, определили дальнейшее развитие русской культуры. Без сомнений, одним из ярчайших представителем Золотого века русской литературы является знаменитый поэт, отец русского литературного языка А. С. Пушкин.
74815. Полемика о творчестве А.С. Пушкина и литературно-эстетическое самосознание писателя. Значимость наследия А.С. Пушкина в истории русской и мировой культуры и опыт его осмысления 15.66 KB
  Пушкина и литературно-эстетическое самосознание писателя. Пушкина в истории русской и мировой культуры и опыт его осмысления. Пушкин был певцом и вдохновителем освободительного движения своего времени: как поэт свою заслугу перед народом он видел в том что будил чувства добрые и в свой жестокий век восславил свободу. Пушкин самый яркий выразитель чувств дум и стремлений своего времени.