91908

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРЕДНЕСМЕРТЕЛЬНОЙ ДОЗЫ ЛД50 ЯДА ОБЫКНОВЕННЫХ ГАДЮК VIPERА BERUS НА СЕГОЛЕТКАХ ОЗЕРНОЙ ЛЯГУШКИ RANA RIDIBUNDA

Дипломная

Лесное и сельское хозяйство

Целью данной работы является: анализ внутривидовых различий токсичности яда обыкновенных гадюк Viperа berus из разных частей ареала в пределах Волжского бассейна. Определить среднесмертельную дозу ЛД50 образцов яда обыкновенных гадюк встречающихся в различных регионах Волжского бассейна.

Русский

2015-07-24

206 KB

0 чел.

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра зоологии

Д И П Л О М Н А Я   Р А Б О Т А

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРЕДНЕСМЕРТЕЛЬНОЙ ДОЗЫ ЛД50 ЯДА ОБЫКНОВЕННЫХ ГАДЮК VIPERА BERUS НА СЕГОЛЕТКАХ ОЗЕРНОЙ ЛЯГУШКИ RANA RIDIBUNDA

Работу выполнил______________________________________С. А. Дмитриев

Факультет биологический

Направление 020400.62 Биология

Научный руководитель, д-р биол.наук,проф.________________Т.Ю.Пескова

Нормоконтролер, канд. биол. наук, доц._________________ С.И. Решетников

Краснодар 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛД50– доза токсина, при воздействии которой выживает половина экспериментальных животных

ПА - протеолитическая активность

РЕФЕРАТ

Дипломная работа написана на 32 страницах печатного текста.

В списке литературы 30 авторов. Количество таблиц 6.

Ключевые слова: ОЗЕРНАЯ ЛЯГУШКА, ОБЫКНОВЕННАЯ ГАДЮКА, СРЕДНЕСМЕРТЕЛЬНАЯ ДОЗА ЯДА, ВНУТРИВИДОВЫЕ РАЗЛИЧИЯ ЯДА.

Целью данной работы является: анализ внутривидовых различий токсичности яда обыкновенных гадюк Viperа berus из разных частей ареала в пределах Волжского бассейна.

Для достижения цели были поставлены задачи:

1. Определить среднесмертельную дозу ЛД50 образцов яда обыкновенных гадюк, встречающихся в различных регионах Волжского бассейна.

2. Сравнить ЛД50 яда обыкновенных гадюк из различных популяций Волжского бассейна.

3. Сравнить ЛД50 яда гадюк различной подвидовой принадлежности (яда гадюк номинативного подвида V. berusberusи гадюки Никольского V. b. nikolskii.

Выводы:

1. Наиболее токсичным для сеголетков озерной лягушки оказался ядовитый секрет гадюк из Хвалынского района Саратовской области, а наименее токсичным яд обыкновенных гадюк из Самарской области.

2. Обнаружены статистически значимые различия (Р < 0,05) в значениях ЛД50 ядов обыкновенных гадюк номинативного подвида V. b. berus и гадюки Никольского V. b. Nikolski

3. Статистически значимых различий в значениях ЛД50 яда гадюки Никольского из различных популяций обнаружено не было (Р > 0,05), тогда как значения ЛД50 образцов яда гадюк номинативного подвида из трех исследуемых популяций в эксперименте достоверно различались (Р < 0,05).

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 6

1 Аналитический обзор

1.1 Таксономия и генетика обыкновенных гадюк 8

1.2 Свойства ядов гадюк………………………………………………….11

2 Материалы и методы исследований

2.1 Экспериментальные животные 18

2.2 Характеристика яда 19

3 Внутривидовые различия яда гадюк волжского бассейна

3.1 Определение среднесмертельной дозы ЛД50 22

3.2 Анализ внутривидовых различий ЛД50 яда обыкновенной гадюки.24

3.3. Анализ межпопуляционных различий ЛД50 яда обыкновенной гадюки……………………………………………………………………………25

Заключение 28

Библиографический список 29

ВВЕДЕНИЕ

Проблема вариабельности биологических характеристик змеиных ядов широко исследуется во всем мире. Изменчивость свойств ядовитого секрета рассматривается исследователями на разных уровнях, в том числе на межвидовом, внутривидовом и межпопуляционном [Chippaux, Williams, White, 1991].

Токсичность и ферментативные активности являются основными характеристиками биологической активности ядовитого секрета. Токсичность яда является интегральной характеристикой и отражает общее воздействие токсина на живой организм, тогда как ферменты змеиных ядов имеют конкретные точки приложения и механизмы действия. Экспериментально определенная среднесмертельная доза (ЛД50), т.е. доза токсина, при воздействии которой выживает половина экспериментальных животных, позволяет сравнить токсикологический эффект разных токсинов. Величина ЛД50 яда обыкновенных гадюк, обитающих в разных местах своего ареала, в силу их генетической специфики, а также ряда географических особенностей местообитаний может оказаться вариабельной величиной. Эти обстоятельства необходимо учитывать при проведении контроля качества ядов, организации промышленного производства ядов гадюк и при получении лекарственных препаратов на их основе [Протеолитическая активность…,2007].

Цель: анализ внутривидовых различий токсичности яда обыкновенных гадюк Viperа berus из разных частей ареала в пределах Волжского бассейна

Задачи:

1. Определить среднесмертельную дозу ЛД50 образцов яда обыкновенных гадюк, встречающихся в различных регионах Волжского бассейна.

2. Сравнить ЛД50 яда обыкновенных гадюк из различных популяций Волжского бассейна.

3. Сравнить ЛД50 яда гадюк различной подвидовой принадлежности (яда гадюк номинативного подвида V. berusberusи гадюки Никольского V. b. nikolskii.

1 Аналитический обзор

1.1 Таксономия и генетика обыкновенных гадюк

В последнее время почти всеми специалистами признаются, как минимум, 2 подвида: Vipera berus berus (Linnaeus, 1758) и V.b. bosniensis Boettger, 1889. При этом сахалинская гадюка считается самостоятельным видом V. sachalinensis Tzarevsky, 1916 или подвидом обыкновенной гадюки V. b. sachalinensis. Подвидовая форма V. b. seoanei Lataste, 1879 стала рассматриваться в качестве самостоятельного вида V. seoanei. Лесостепная гадюка, или гадюка Никольского выделяется либо как самостоятельный вид либо как внутриподвидовая форма номинативного подвида V. b. berus [Кузьмин, Семенов, 2006]. В настоящее время мы придерживаемся той точки зрения, что гадюка Никольского является самостоятельным подвидом обыкновенной гадюки [Обыкновенная гадюка, 2008].

Большое разнообразие гадюк (Vipera) (около 30 видов) до сих пор вызывает споры среди систематиков, и не исключено, что в скором времени этот обширный род будет разделен на ряд самостоятельных таксонов - родов и подродов. Род Vipera широко распространен по всему миру. Его представителей можно встретить в Европе, Азии и Африке. Их биотопы также разнообразны - рептилии живут и в пойменных ландшафтах рек, и в самых различных биотопах пустынь и полупустынь. В настоящее время в фауне Украины и РФ насчитывается 8 видов гадюк, из которых 5 видов рода внесены в Красные книги (гадюки Динника, Казнакова, Никольского, степная и гюрза).

Гадюка Никольского или, как ее еще называют, лесостепная гадюка, описанная украинскими герпетологами в 1984 г., получила свое научное название в честь известного герпетолога, академика А.Н.Никольского [Ведмедеря В. И. Грубант В.Н., Рудаева А.В, 1986].

Этот вид наиболее широко распространен в лесостепной и северной части степной зон Восточно-Европейской равнины от юго-востока Подольской возвышенности на западе (Украина) до Заволжья на востоке (Россия). Однако сведения о биологии и распространении крайне скудны, так как до недавнего времени вид рассматривался в составе Vipera berus в качестве меланистической формы. Именно поэтому большинство данных исследований по экологии этих рептилий не могут использоваться при характеристики вида, так как основаны они, в большей степени, на изучении обыкновенной гадюки [Табачишин, 1997].

Виды гадюк рода Vipera Laurenti, 1768 остаются объектом пристального внимания исследователей на протяжении длительного времени. Широкая морфологическая изменчивость, экологическая пластичность и относительно высокие темпы эволюции гадюковых змей характеризуют их как традиционные модельные объекты, на которых апробируются и применяются методы таксономического анализа и популяционной экологии. В данном отношении являются весьма показательными гадюка Никольского

(Vipera nikolskii (Vedmederja, Grubant, Rudaeva, 1986) и обыкновенная гадюка (Vipera berus (Linnaeus, 1758)). Обширный ареал обыкновенной гадюки охватывает большую часть Северной Евразии до 46-52º на юге, а гадюка Никольского распространена в лесостепных ландшафтах Восточной

Европы и обитает в пойменных и сопредельных биотопах [Табачишин, Завьялов, 2003; Tabatschischin, Sawjalow, 2004].

Однако, несмотря на хорошо выраженную экологическую сегрегацию этих

змей, в зонах их симпатрического распространения отмечаются особи, характеризующиеся признаками гибридогенного характера [Завьялов,

2006; Предварительные данные о генетической дифференциации..., 2007].

На основе использования молекулярно-генетических маркеров по микро сателлитному локусу 7-87 было установлено, что среди гадюк с территории

Поволжья аллель размером 152 п.н. является высокоспецифичным для Vipera

nikolskii. Абсолютное большинство экземпляров V. berus содержат аллели

размером от 176 до 192 п.н., отмечена тенденция увеличения длины аллелей

гадюк в направлении от Республики Мордовия до Пермского края. Выявлены особенности генетической структуры популяций V. nikolskii и V. berus в зоне перекрывания их ареалов в Поволжье (между 52-54º с.ш.). Предполагается гибридогенный характер формирования некоторых популяций гадюк в зоне их симпатрического обитания в Поволжье, которая относительно узка:

глубина взаимного проникновения видоспецифичных аллелей гадюк в алло-

патричные области ограничивается лишь несколькими десятками километ-

ров. В качестве барьеров, ограничивающих генные потоки змей, преимуще-

ственно выступают ландшафтные особенности изучаемой территории, когда

довольно резко выражен переход от холмистой лесистой местности к откры-

той лесостепной равнине [Особенности генетической структуры..., 2008]

Организация геномной ДНК рептилий, в частности змей, исследована фрагментарно. Полные митохондриальные геномы представлены в базе данных GeneВаnk для двух видов змей Dinodonsemica rinatus[ Kumazawa и др., 1998] и Ovophiso kinavens [Dong, Kumazawa, 2005].

Среди гадюк наиболее изученным в этом плане объектом является обыкновенная гадюка (Vipera berus). Для нее последовательность нуклеотидов определена для ряда отдельных генов, таких как гены цитохрома В(cytb), 16Sрибосомальной РНК (16SrRNA), субъединицы 2 НАДН- дегидрогеназы (ND2), фосфолипазы и некоторых других[цит. по Генетическая дивергенция..., 2006].

Гадюка Никольского (Vipera nikolskii) [Vedmederja, Grubant, Rudaeva, 1986] представляет интерес, поскольку некоторые вопросы ее систематики и филогении трудно решить без привлечения молекулярно-генетических данных [Морфометрическая дифференциация…., 1996].

В настоящее время не существует однозначного и общепринятого мнения по поводу внутривидовой систематики обыкновенной гадюкиVipera berus. Мы полагаем, что Волжский бассейн населяют два подвида - номинативный V. b. berus и гадюка НикольскогоV. b. nikolskii [Обыкновенная гадюка, 2008].

Зона интерградации этих двух форм занимает значительную часть бассейна Волги [Зиненко, 2003; Мильто, 2003; Milto, Zinenko, 2005].

Во многих поволжских популяциях обнаруживаются морфологические признаки обоих подвидов, а чистые популяции номинативного подвида обыкновенной гадюки известны для Верхнего Поволжья, гадюки Никольского - для бассейна Дона [Зиненко, 2003; Мильто, 2003; Milto, Zinenko, 2005].

Гибриды гадюк восточной степной Vipera renardi и обыкновенной V. berus обнаружены в Спасском районе Республики Татарстан (Россия). Гибридизация данных видов в естественных условиях подтверждается результатами анализа ядерных генов BACH-1 и Rag-1, а также биохимическими и морфологическими данными и, скорее всего, имеет интрогрессивный характер. Обсуждаются причины разрушения репродуктивной изоляции вблизи северной границы ареала степной гадюки и ее возможное значение для происхождения гадюки Башкирова V. Renardi bashkirovi [Естественная гибридизация…, 2011].

К настоящему времени накоплено достаточно много сведений о гибридизации в естественных условиях между некоторыми видами гадюк рода Vipera, например, V. berus×V. ammodytes [Ispas, GhiraI, RakosyL, 2000; Venczel, Ghira, 1994], V. berus×V. Aspis [Duguy, Martinez, Saint, 1979], V. aspis×V. seoanei [Rykena, 2001], V. aspis×V. latastei [Martinez, Brito, Lizanaavia., 2006].

Имеются и экспериментальные данные о гибридизации ряда видов в условиях неволи – V. lotievi×V. Renardi и др. [Ширяев, 2003; Shiryaev, 2005].

1.2 Свойства ядов обыкновенных гадюк

Исследуя свойства ядовитого секрета гадюк Волжского бассейна, мы отметили тенденцию сопряженного изменения свойств яда: потеря желтой окраски ядовитого секрета, снижение активности протеаз и оксидазы L-аминокислот, изменение пептидного состава. Вектор этих изменений в бассейне Волги отмечен по направлению к бассейну Дона, от популяций с превалирующими морфологическими признаками номинативного подвида к популяциям с наиболее выраженными признаками гадюки Никольского [Змеи Самарской области, 2009].

Ядовитый секрет у разных видов змей отличается по ряду характеристик– токсичности, составу и активности ферментов, пептидному спектру, количеству отдельных пептидных компонентов и некоторым другим. Считается, что межвидовые различия в свойствах ядовитого секрета определяются генетическими причинами, а сходство биохимических свойств ядов говорит об одинаковых механизмах действия на организм жертвы [Зайцева, 2007].

В.Г. Старков с соавторами в экспериментах по определению ЛД50 яда гадюк на сверчках установил связь токсичности ядовитого секрета с энтомофагией [Starkov, 2007].

Те виды гадюк, у которых в рационе присутствует значительная доля прямокрылых насекомых, продуцируют яд, наиболее токсичный для сверчков. Известно, что в рацион таких видов как армянская гадюка, кавказская и степная гадюки в разных соотношениях входят прямокрылые, в то время как V. b. berus и V. b. nikolskii насекомыми практически не питаются. Вполне вероятно, что различия пептидного спектра исследуемых видов гадюк являются следствием пищевой специализации, и более богатый спектр пептидов у степной гадюки сформировался в ходе эволюции как приспособление к энтомофагии. Пептидный состав ядов двух подвидов обыкновенной гадюки между собой весьма схож. В яде номинативного подвида V. b. berus обнаруживается 7 основных пептидов, а в яде гадюки Никольского V. b. nikolskii– 6, причем 4 пептида присутствуют в обоих образцах и имеют одинаковую молекулярную массу. У гадюки Никольского отсутствует пептид с молекулярной массой 66.0 кДа и вместо пептида 16.5 кДа (как у номинативного подвида) обнаружен пептид массой 15.5 кДа. При этом количество пептида 15.5 кДа достигает 43% от общего белка в пробе, что позволяет говорить о нем как об основном (мажорном) пептиде, характерном для яда V. b. nikolskii. Но в целом пептидный состав обоих подвидов однотипен и не имеет таких существенных отличий, как другие пары образцов [Зайцева, 2007].

Приведены результаты определения протеолитической активности (ПА) в образцах яда обыкновенной гадюки Vipera berus, полученных из разных популяций в европейской части Российской Федерации и в Украине. Максимальноесреднее значение ПА (28,0 мкг тирозина/мг белка • мин.) отмечено в Майнском районе Ульяновской области России, минимальное (2,6) – в Змиевском районе Харьковской области Украины. В одной и той же популяции (Кондольский район Пензенской области, Россия) выявлено статистически достоверное различие ПА образцов яда – желтого цвета (10,5 мкг тирозина/мг белка • мин.) и бесцветного (7,8). В большинстве случаев бесцветный ядовитый секрет с низкими значениями ПА собран в популяциях, определенных как гадюка Никольского V. b. nikolskii. Высказано предположение, что ПА ядовитого секрета может служить дополнительным диагностическим признаком подвидов V. b. berus и V. b. nikolskii. Результаты экспериментального определения ПА в образцах ядовитого секрета обыкновенных гадюк приведены в таблице 1. Как видно из таблицы, минимальное среднее значение ПА (2,6 мкг тирозина/мг белка • мин.) отмечено для образца из Змиевского района Харьковской области, которое на порядок ниже максимального среднего значения ПА (28,0), отмеченного для образца из Майнского района Ульяновской области. Важно подчеркнуть, что, судя по имеющимся данным о распространении подвидов обыкновенной гадюки [Milto, Zinenko, 2005].

Первый образец взят из ареала V. b. nikolskii, а второй – из зоны интерградации данного подвида с V. b. berus, либо из ареала V. b. berus. Яд гадюк, отловленных в Нижегородской области, которая отнесена к ареалу V. b. berus, также имеет высокие значения ПА (20,6). В целом же можно отметить, что наиболее «чистые» популяции гадюки Никольского имеют низкую ПА яда, а наиболее удаленные от них популяции номинативного подвида имеют высокую ПА [Протеолитическая активность…, 2007].

Растянутый переход от минимальных значений ПА к максимальным свидетельствует в пользу наличия широкой зоны интрогрессии, предположение о существовании которой было высказано после морфологического анализа [Milto, Zinenko, 2005]. Переход от низких к высоким значениям ПА в общем происходит при продвижении с юга на север, но есть ряд исключений. К ним относится, к примеру, Тоншаевский район Нижегородской области и Майнский район Ульяновской области: первый находится севернее, но среднее значение ПА ниже.

По-видимому, значительная вариабельность ПА в яде обыкновенных гадюк из разных популяций обусловлена многими причинами. Существенные различия в ПА образцов из близко расположенных географических пунктов могут быть связаны с труднопреодолимыми для гадюк преградами. Так, Самарская область находится в пределах контактной зоны подвидов V. b. berus и V. b. nikolskii [Milto, Zinenko, 2005].

Здесь в высшей степени статистически достоверные различия (0,1%-ый уровень значимости) ПА яда выявлены у гадюк из г. Самара (20,2 мкг тирозина/мг белка • мин.) и национального парка «Самарская Лука» (14,3). Расстояние по прямой между местами отлова в Самаре и национальном парке составляет менее 100 км. Однако названные пункты разделены широкой рекой так, что первый пункт находится на левом берегу Волги, а второй – на правом.

Любопытно, что ПА ядовитого секрета гадюк двух образцов разного цвета (желтого и бесцветного) в пределах одной популяции могут достоверно различаться. Нами установлено, что отдельно собранные в Кондольском районе Пензенской области России образцы яда, отличающиеся по цвету, имеют и статистически достоверные различия средних значений ПА: по сравнению с бесцветным ядом у желтого уровень ПА выше (табл. 2). Считается, что для номинативного подвида обыкновенной гадюки характерен желтый яд, а для гадюки Никольского – бесцветный. Популяция из Кондольского района Пензенской области, находящаяся на границе Волжского и Донского бассейнов, вероятно, относится к зоне интерградации двух подвидов. Данная популяция, по сравнению с другими популяциями из бассейна Волги, имеет более низкие средние значения ПА. Одна часть гадюк в этой популяции имеет яд желтого цвета, а другая – бесцветный.Полученные нами данные о протеолитической активности подтверждают давно известный, но недостаточно освещенный в литературе факт отличия свойств яда номинативного и лесостепного подвидов обыкновенной гадюки. Приведенныематериалыпозволяютпредположить, что подвид V. b. Nikolskii имеет в среднем болемнизкизначения ПА по сравнению с V. b. berusи гибридными популяциями. Низкий уровень ПА ядовитого секрета может использоваться для диагностики гадюки Никольского, которая имеет важное значение для трактовки взаимоотношений V. b. berus и V. b. nikolskii представляет собой связь морфологии обыкновенных гадюк со свойствами их яда [Протеолитическая активность…,2007].

В ядовитом секрете обыкновенных гадюк из разных популяций Волжского бассейна нами отмечена положительная корреляция между активностью протеаз и оксидазыL-аминокислот(r = +0,72 ± 0,283, Р< 0,05). По- видимому, для гадюк, по морфологическим признакам близких кV. b. berus, характерен ярко-желтый яд с высоким уровнем активности обоих ферментов, в то время как гадюки, более близкие кV. b. nikolskii, имеют менее интенсивно окрашенный яд с низкой активностью протеаз и оксидазы L-аминокислот.


Таблица 1
- Значение протеолитической активности (ПА) яда обыкновенных гадюк из разных популяций России и Украины [Протеолитическая активность,2007].

Регион

Район отлова

n

ПА,

мкг тирозина/мг белка • мин.

lim

M±m

Самарская обл.*

г. Самара

15

14,6–26,1

20,2±0,85

Ставропольский р-н,

НП «Самарская Лука»

8

13,1–17,7

14,3±0,55

Нижегородская обл.*

Тоншаевский р-н

8

19,2–22,3

20,6±0,41

Ульяновская обл.*

Майнский р-н

5

24,2–31,3

28,0±1,33

Пермская обл.*

Кунгурский р-н

4

17,1–18,5

17,7±0,31

Республика Татарстан*

Лаишевский р-н

9

12,0–22,5

16,5±1,12

Лениногорский р-н

5

14,8–21,2

18,3±1,16

Зеленодольский р-н

4

21,9–27,7

23,7±1,35

Азнакаевский р-н

5

13,6–19,8

17,3±1,10

Республика Мордовия*

Ковылкинский р-н

9

14,4–18,9

16,7±0,47

Кочкуровский р-н

4

16,4–20,1

17,9±0,84

Большеигнатовский р-н,НП «Смольный»

9

6,7–19,7

13,3±1,54

Продолжение таблицы 1

Темниковский р-н

5

14,5–23,9

18,0±1,66

Республика Чувашия*

Алатырьский р-н

5

19,7–23,9

22,4±0,78

Киевская обл. **

Бориспольский р-н

3

12,4–14,7

13,3±0,74

Черниговская обл.**

Ичнянский р-н

3

12,5–13,8

13,2±0,39

Пензенская обл. *

Кондольский р-н

9

6,4–11,5

9,3±0,56

Пензенская и Саратовская обл.*

Долина р. Хопер на границе Бековского

иТамалинского

р-нов Пензенской обл.

сРтищевским р-ном Саратовской обл.

5

6,0–9,4

8,2±0,59

Саратовская обл.*

Аткарский р-н

4

7,4–8,0

7,8±0,13

Кировоградская обл.**

Знаменский р-н

4

6,5–8,3

7,2±0,42

Харьковская обл.**

Змиевский р-н

3

2,1–3,0

2,6±0,49

Примечание: * – Россия; ** – Украина.

территории России и Украины обширную зону интерградации с номинативным подвидом обыкновенной гадюки.

Таблица 2 - Значения ПА в образцах яда гадюк из Кондольского района Пензенской области [Протеолитическая активность, 2007].

Цвет яда

n

ПА, мкг тирозина/мг белка • мин.

P

lim

M±m

Желтый

5

9,4–11,5

10,5 ± 0,41

< 0,001

Бесцветный

4

6,4–8,8

7,8 ± 0,54

В ядовитом секрете степных гадюк также была обнаружена изменчивость активности ферментов. В яде V. r. renardi (n = 56) среднее значение протеолитической активности определено как 91,5 ± 2,34 мкг тирозина/мг белка в мин, а оксидазыL-аминокислот 3,4 ± 0,44 ед/мг белка в мин. При сравнении средних значений активности ферментов ядаV. r. bashkirovi с таковыми в ядеV. r. renardi выявлены в высшей степени статистически значимые различия< 0,001) для обоих ферментов. Заметим, что по средним значениям активности ферментов ядV. r. bashkirovi занимает промежуточное положение междуV. r. renardi и обыкновенной гадюкой[Ферментативные активности…,2009].

Считается, что индивидуальная изменчивость свойств ядовитого секрета находится под генетическим контролем и служит основой микроэволюционного процесса[Chippaux, Williams, White, 1991; Mebs, 1999]

Есть мнение, что географическая изменчивость свойств ядов наиболее сильно проявляется в крупных популяциях, где идет свободный обмен генетическим материалом, в то время как в малых и изолированных популяциях ядовитые змеи продуцируют более гомогенный по свойствам ядовитый секрет[Williams, White, 1987; Williams, White, 1988].

2 Материалы и методы исследований

2.1 Экспериментальные животные

Все эксперименты по определению острой токсичности ядов гадюк проводили на сеголетках озерной лягушки. Лягушек отлавливали в черте города, в прудах Ботанического сада КубГУ, в августе – сентябре 2012 г. После отлова всех лягушек взвешивали, формировали экспериментальные группы и рассчитывали среднюю массу животного в группе. В каждой экспериментальной группе средняя масса животных была одинаковая, т.к. это необходимо для расчета эффективной дозы яда. Общий диапазон масс лягушек для экспериментов составлял 1,6 – 2,2 г. Экспериментальная группа состояла из 50 сеголетков лягушек массой от 1,6 до 2,2 г, средняя масса в группе составляла 2,0 г. Аналогичные расчеты и измерения были проведены для каждой экспериментальной группы животных.

Для эксперимента использовалось пять груупп животных. Число животных в группе было 30-50.

В экспериментальной группе образца из Нижегородской области использовалось 30 животных, концентрация яда в растворе составляла 5,0 мг/мл; масса лягушек 3,0 – 3,9 г; средняя масса в группе – 3,4 г; количество лягушек в 1 кг составляет 294 шт. Из Самарской области 50 животных, концентрация яда в растворе составляет 4,0 мг/мл; масса лягушек 1,8 – 2,1 г; средняя масса в группе – 2,0 г; количество лягушек в 1 кг составляет 500 шт. Из Саратовской (Хвалынский район) 30 особей, концентрация яда в растворе составляла 5,0 мг/мл; масса лягушек 3,1 – 4,4 г; средняя масса в группе – 3,8 г; количество лягушек в 1 кг составляет 265 шт. Из Саратовской области (Аткарский район) 30 особей, концентрация яда в растворе составляла 3,0 мг/мл; масса лягушек 2,6 – 3,0 г; средняя масса в группе – 2,8 г; количество лягушек в 1 кг составляет 359 шт. Из Пензенской области 30 особей, концентрация яда в растворе составляла 4,0 мг/мл; масса лягушек 1,9 – 2,4 г; средняя масса в группе – 2,2 г; количество лягушек в 1 кг составляет 454 шт.

2.2 Характеристика яда

Образцы ядовитого секрета обыкновенной гадюки были получены в лаборатории герпетологии и токсинологии Института экологии Волжского бассейна РАН. Яды представляли собой высушенный (кристаллизованный) ядовитый секрет, полученный от нескольких (8 – 12 шт.) экземпляров обыкновенных гадюк из одной популяции.Яд высушивали две недели в эксикаторе над хлористым кальцием при комнатной температуре и хранили в стеклянной таре при температуре +50 - +60 С в холодильнике. В экспериментах использованы образцы яда гадюк, встречающихся на территории Нижегородской, Самарской, Саратовской и Пензенской областей.

Растворы ядовитого секрета гадюк готовили на физиологическом растворе в концентрации 3,0 – 6,0 мг/мл непосредственно перед экспериментом.

Инъекции раствора яда проводили внутрибрюшинно, в правую нижнюю область брюшной стороны лягушки. Для инъекций использовали микрошприц объемом 100 мкл.Расчет доз введенного яда рассчитывали на кг живого веса лягушек следующим образом таблице 4.

Для оценки ЛД50 каждого образца яда гадюк использовали несколько групп лягушек, которым вводили яд в возрастающих концентрациях. Конкретные условия проведения эксперимента указаны в примечаниях к таблицам, иллюстрирующим результаты работы. Наблюдения за животными вели в течение 24 часов (острый опыт), после этого подсчитывали количество умерших и выживших лягушек. Данные заносили в таблицу, сформированную в программе Excel, и определяли следующие величины: ЛД16, ЛД84, ЛД50, m (ошибка среднего значения) и m t (доверительный интервал).

Таблица 4  -  Расчет эффективных доз введения яда обыкновенной гадюки лягушкам

Концентрация исходного раствора яда, мг/мл

Объем введенного раствора на 1 лягушку, мкл

Кол-во введенного яда на 1 лягушку, мкг

Доза яда (кол-во введенного яда на кг живого веса), мг/ кг

5,0

5,0

25,0

7,4

5,0

10,0

50,0

14,7

5,0

15,0

75,0

22,1

5,0

20,0

100,0

29,4

5,0

30,0

150,0

44,2

Расчет ЛД50 проводили методом модифицированного пробит-анализа, который подробно описан в работе сотрудников кафедры экологии Нижегородского университета [Безруков и др., 1993].

Пробит-анализ позволяет не только вычислить ЛД50 конкретного вещества, но и сравнить токсикологический эффект разных соединений. Для сравнения двух образцов ядов гадюк мы определяли доверительный интервал и делали вывод о статистической значимости различий на 5 %-ном уровне значимости, принятом в биологии.


3 Внутривидовые различия яда гадюк волжского бассейна

3.1 Определение среднесмертельной дозы ЛД50 образцов яда обыкновенной гадюки из разных частей ареала в пределах Волжского бассейна.

Мы определили токсичность яда гадюк, встречающихся в разных регионах бассейна Волги по показателю среднесмертельной  дозы ЛД50. В работе использовали объединенные образцы ядовитого секрета гадюк из популяций Нижегородской, Самарской, Саратовской и Пензенской областей. Результаты определения среднесмертельной дозы приведены в таблицах 3 – 6.

Таблица 5 - ЛД50 яда гадюк из различных популяций (т = 30)

Локализация популяции гадюк

Доза вещества, мг/кг

% гибели лягушек

ЛД50 ± m, мг/кг

Нижегородская область

7,4

0

34,7 ± 2,86

14,7

0

22,1

0

29,4

16,7

44,2

100

Самарская область

40,0

0

69,5 ± 13,89

80,0

70

120,0

90

160,0

80

200,0

100

Саратовская область (Хвалынский район)

10,0

50,0

9,6 ± 2,71

20,0

66,6

40,0

100

Продолжение таблицы 5

Саратовская область (Аткарский район)

3,2

0

13,5 ± 3,14

10,8

33,3

16,2

83,3

21,6

100

32,3

83,3

Пензенская область

36,3

66,6

16,8 ± 4,33

72,6

83,3

109,0

100

145,3

100

181,6

100

Все результаты токсикометрии ядов обыкновенной гадюки сведены в одну общую таблицу, таблица. 8. Для каждого исследованного образца яда мы просчитали еще и доверительный интервал, который определяется по таблице «t-распределения Стьюдента». При 5 %-ном уровне значимости и для числа степеней свободы f = n – 1 для всех выборок в 30 экземпляров лягушек критическое значение t –критерия Стьюдента составляет 2,05, а для выборки в 50 экземпляров (для яда гадюк из Самарской популяции) имеет значение 2,00. Это позволило оценить верхние и нижние доверительные границы полученных значений ЛД50.

Таблица 6 - Результаты определения ЛД50 образцов ядов обыкновенной гадюки

на сеголетках озерной лягушки

Места отлова гадюк

ЛД50 ± m,

мг/кг

ЛД50 ± m t,

мг/кг

1

Самарская обл.

69,5 ± 13,89

69,5 ± 27,78

(41,72 – 97,28)

Продолжение таблицы 6

2

Нижегородская обл.

34,7 ± 2,86

34,7 ± 5,86

(28,84 – 40,56)

3

Саратовская обл.

(Хвалынский район)

9,6 ± 2,71

9,6 ± 5,56

(4,04 – 15,16)

4

Саратовская обл.

(Аткарский район)

13,5 ± 3,14

13,5 ± 6,44

(7,06 – 19,94)

5

Пензенская обл.

16,8 ± 4,33

16,8 ± 8,87

(7,93 – 25,67)

Таким образом, из таблицы видно, что среднесмертельная доза ЛД50 образцов яда обыкновенных гадюк из разных мест обитания имеет разные значения.

3.2 Анализ внутривидовых различий ЛД50 яда обыкновенной гадюки

Теперь проанализируем данные таблицы 8 с точки зрения подвидовой принадлежности гадюк. Надо отметить, что образцы яда № 1, 2, 3 (гадюки из Самарской, Нижегородской областей и Хвалынского района Саратовской области) получены от гадюк, которые по морфологическим признакам соответствуют номинативному подвиду Vipera berus berus, а образцы яда № 4 и 5 – получены от гадюк Никольского Vipera berus nikolski. Можно заметить, что значения ЛД50 яда гадюки Никольского ниже таковых у номинативного подвида. Сравнение ЛД50 любого образца яда гадюки Никольского (образцы № 4 и 5) с ЛД50 яда гадюк номинативного подвида (образцы № 1 и 2) показывает наличие статистически значимых различий на 5 %-ном уровне значимости (доверительные интервалы не перекрываются).

Исключение составляет образец яда № 3, полученный от гадюк номинативного подвида из Хвалынского района Саратовской области. По морфологическим признакам гадюки этой популяции соответствуют номинативному подвиду, но по значению ЛД50 яд ближе к ядовитому секрету гадюки Никольского. Ранее уже отмечалось, что по активности ферментов (протеаз и оксидазы L–аминокислот) ядовитый секрет обыкновенных гадюк из Хвалынского района Саратовской области ближе к гадюке Никольского, а по пептидному составу вовсе идентичен таковому у гадюки Никольского [Змеи Самарской области, 2009]. Не следует забывать и тот факт, что данная популяция находится на самой южной границе распространения номинативного подвида, и некоторые морфологические признаки обитающих здесь гадюк совпадают с таковыми у гадюки Никольского. Скорее всего, этот феномен можно объяснить существованием в Волжском бассейне обширной зоны интерградации указанных подвидов, где многие диагностические признаки смешаны или имеют промежуточное значение.


3.3 Анализ межпопуляционных различий ЛД50 яда обыкновенной гадюки

Из приведенных данных табл. 8 можно заметить, что даже между образцами яда гадюк номинативного подвида обыкновенной гадюки существуют различия. Речь идет о сравнении образцов № 1 и 2 – статистически значимые различия между значениями ЛД50 наблюдаются на 5 %-ном уровне значимости. Эти различия, скорее всего, могут быть обусловлены сложившимся характером питания гадюк. Большой процент в рационе питания гадюк из Нижегородской области составляют земноводные, тогда как гадюки из Самарской области питаются в основном мышевидными грызунами. Вполне вероятно, что по этой причине яд «нижегородских» гадюк более специфичен и токсичен для лягушек, чем таковой у «самарских» гадюк.

Закономерную связь величины ЛД50 яда от пищевого рациона нескольких видов гадюк рода Pelias установили Старков В.Г. с соавторами на банановых сверчках [Starkov и др., 2007]. В этой работе было показано, что чем выше процент насекомых в рационе гадюк, тем выше токсичность их ядовитого секрета.

Здесь же следует отметить, что проведенный ранее анализ ЛД50 яда обыкновенных гадюк на белых лабораторных мышах не выявил каких-либо статистически значимых внутривидовых или межпопуляционных различий [Протеолитическая активность, 2007].

Об отсутствии достоверных различий в значениях ЛД50 яда говорит и сравнение между собой образцов яда гадюки Никольского (образцы № 4 и 5 – гадюк из Аткарского района Саратовской области и Пензенской области). Здесь перекрываются и верхние, и нижние доверительные интервалы значений ЛД50.

Как указывалось выше, статистически значимых различий в величине ЛД50 яда гадюк из Аткарского района Саратовской области и яда «пензенских» гадюк (образцы № 4 и 5) не выявлено, хотя эти образцы имеют определенные различия. Эти два образца яда получены от гадюк Никольского, но популяция «пензенских» гадюк географически локализована на границе Волжского и Донского бассейнов, а «аткарская» популяция относится уже к бассейну Дона. Другое отличие этих образцов – цвет ядовитого секрета: яд гадюк «пензенской» популяции имел желтую окраску, а яд гадюк из Аткарска был бесцветным. Существует мнение, что обыкновенные гадюки продуцируют ядовитый секрет желтого цвета, а для гадюки Никольского характерен бесцветный яд [Milto, Zinenko, 2005]. В монографии «Змеи Самарской области» [Змеи Самарской области, 2009] описаны исключения из этого правила и подробно рассмотрены биохимические свойства ядов гадюк, обитающих на водоразделе Волги и Дона. В частности, было отмечено, что часть гадюк Никольского из «пензенской» популяции продуцирует бесцветный ядовитый секрет, тогда как другая – продуцирует яд желтого цвета с промежуточными значениями ферментативных активностей. Исследование свойств ядовитого секрета обыкновенных гадюк подтверждает сложность и запутанность исторической картины расселения и обмена генетическим материалом у обыкновенной гадюки, особенно на границе Волжского и Донского бассейнов.

Полученные экспериментальные результаты по определению ЛД50 яда обыкновенных гадюк в Волжском бассейне носят предварительный характер и требуют в дальнейшем более пристального внимания и детального исследования.


Заключение

По результатам работы можно сделать следующие выводы:

1. Установлены среднесмертельные дозы ЛД50 образцов яда обыкновенных гадюк из различных районов Волжского бассейна. Наиболее токсичным для сеголетков озерной лягушки (минимальное значение ЛД50 = 9,6 ± 2,71 мг/кг) оказался ядовитый секрет гадюк из Хвалынского района Саратовской области, а наименее токсичным (максимальное значение ЛД50 = 69,5 ± 13,89) – яд обыкновенных гадюк из Самарской области.

2. Обнаружены статистически значимые различия (Р < 0,05) в значениях ЛД50 ядов обыкновенных гадюк номинативного подвида V. b. berus и гадюки Никольского V. b. nikolski – ядовитый секрет гадюки Никольского оказался более токсичен для лягушек, чем яд гадюк номинативного подвида.

3. Статистически значимых различий в значениях ЛД50 яда гадюки Никольского из различных популяций обнаружено не было (Р > 0,05), тогда как значения ЛД50 образцов яда гадюк номинативного подвида из трех исследуемых популяций в эксперименте достоверно различались (Р < 0,05).

Библиографический список

1. Ведмедеря В.И., Грубант В.Н., Рудаева А.В. К вопросу о названии черной гадюки европейской части СССР // Вестн. Харьк. ун-та. 1986. №288. С. 83-85.

2. Генетическая дивергенция некоторых видов гадюк (Reptilia:Vipiredae,Vipera) по результатам секвенирования генов НАДН-дегидрогеназы и 12S рибосомальной РНК/ Великов В. А. [и др.] // Современная герпетология 2006. С 41 – 49.

3. Естественная гибридизация гадюк восточной степной Vipera renardi и обыкновенной Vipera berus / Павлов А. В. [и др.]  // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13 №5. С 172 – 177.

4.ЗиненкоА.И. Особенности морфологии Vipera berus (Linnaeus, 1758) и Vipera nikolskii Vedmederja, Grubantet Rudaeva, 1986 - следствие интрогрессивной гибридизации // Змеи Восточной Европы: Материалы Междунар. конф. / Ин-т экологии Волж. бассейна РАН. Тольятти 2003. С. 20 - 22.

5. Змеи Самарской области / Бакиев А.Г. [и др.] // Тольятти: 2009. Кассандра. 170 с.

6. Кузьмин С.Л., Семенов Д.В. Конспект фауны земноводных и пресмыкающихся России. М.: Тов-во науч. изд. КМК, 2006. 139 с.

7. Мильто К. Д. Распространение и морфологические особенности чёрной лесостепной гадюки // Змеи Восточной Европы: Материалы Междунар. Конф. Тольятти 2003. С. 56-57.

8. Морфометрическая дифференциация и токсономический статус пресмыкающихся сем. Colubridue и Viperidae / Табачишин  В. Г. [и др.]  // Фауна Саратовской области Проблемы изучения нопулнинданогобиоразно-нбрыияиизменчивости животных Сарятой: Изд-но Сарат. ун-та. 1996, Г 1, ныи. 2, С. 39 70.

9. Обыкновенная гадюка Vipera berus (Reptilia, Viperidae) в Волжском бассейне: материалы по биологии, экологии и токсинологии / Бакиев А.Г. [и др.] // Бюл. «Самарская Лука» 2008. Т. 17, № 4. С. 759 - 816.

10. Особенности генетической структуры популяций годюк Никольского (Vipera nikolskii) и обыкновенной (Vipera berus) в зонах симпотрического обитания в Поволжье / Р. В. Ефимов [и др]. // Самарская лука. 2008 Т. 17, №4 с 718-722

11. Предварительные данные о генетической дифференциации Нижеволжских популяций гадюки Никольского (Vipera nikolskii, Viperidae) по результатам секвенирования генов 12S рибосомной РНК и цитохромоксидазы III / Р. В. Ефимов, [и др]. // Современная герпетология. 2007 Т-7 вып. 1/2 с 69-75

12. Протеолитическая активность нативного и сухого яда самцов и самок обыкновенной гадюки/ Маленев А.Л. [и др.]  // Актуальные проблемы герпетологии и токсинологии: Сб. науч. тр. Вып. 9. Тольятти, 2007.

13. Ферментативные активности яда обыкновенной гадюки из двух популяций Среднего Поволжья/ Зайцева О.В. [и др.]// Материалы науч. конф. «Татищевские чтения: актуальные проблемы науки и практики». Тольятти: ВУиТ им. В.Н. Татищева, 2007.

14. Ферментативные активности яда обыкновенной гадюки из двух популяций Среднего Поволжья/ Шуршина И.В. [и др.]  // Материалы науч. конф. «Татищевские чтения: актуальные проблемы науки и практики». Тольятти: ВУиТ им. В.Н. Татищева, 2007.

15. Ширяев К.А. Исследования репродуктивной биологии гадюк рода Vipera в Тульском областном экзотариуме // Змеи Восточной Европы: Материалы междунар. конф. Тольятти, 2003. С. 90-92.

16. Animprovedmethodtoanalyzesnakeschromosomecomplement/ IspasG. [идр.]  // EvolutionandAdaptation, 2000. T. 6. P. 157-160.

17. Chippaux J.P., Williams V., White J. Snake venom variability: methods of study, results and interpretation // Toxicon. 1991. V. 29.

18. Dong S., Kumazawa Y. Complete mitochondrial DNA sequences of six snakes: phylogenetie relationships and molecular evolution of genomic features // J. Mol. Evol. 3005. Vol. 61, №1. p 12- 22.

19.Duguy R, Martinez Rica J-P, Saint Girons H. La repartition des viperes dans les Pyrenes et dans les regions voisines de l’Espagne // Bull. Soc. Hist. Nat. Toulouse. 1979. № 115. P. 359-377.

20. Kumazawa Y. The complete nucleotide sequence of a snake (Dinodonsemicarinatus) mitochondrial genome with two identical control regions// Genetics 1998, Vot. 150, №1. P. 313-329

21. Martinez F., Brito J. C., LizanaaviaM.Intermediate forms and syntopy among vipers (ViperaaspisandV. latastei) in Northern Iberian Peninsula // Herpetological bulletin. 2006. № 97. P. 14-18.

22. Mebs D. Snake venom composition and evolution of Viperidae // Kaupia. 1999. V. 8. P. 168–172.

23. Milto K.D., Zinenko O.I. 2005. Distribution and Morphological Variability of Vipera berus in Eastern Europe // Rus. J. Herpetol. Vol. 12, Suppl.: HerpetologiaPetropolitana: Proc. of the 12th Ord. Gen. Meeting Soc. Eur. Herpetol. / Eds. N. Ananjeva, O. Tsinenko. Saint- Petersburg. P. 64 - 73.

24. Rykena S. Experimental hybridization in Green Lizards (Lacerta s. str.), a tool to study species boundaries. Mertensiella. 2001. V. 13. P. 78-88

25. Shiryaev K.A. New Data on Reproductive Biology of Caucasian Species of the Genus Vipera // HerpetologiaPetropolitana. Saint-Petersburg, 2005. Р. 213-215.

26. Starkov V.G., Osipov A.V., Utkin Y.N. Toxicity of venoms from vipers of Pelias group to crickets Gryllusassimilis and its relation to snake entomophagy // Toxicon. 2007. V. 49. P. 995–1001.

27. Tabatschischin W.G., Sawjalow E.W. Zur präzisierung der südlichen Grenze des

Verbrei-tungsareals der Waldsteppenotter (Vipera nikolskii) im europäischen Teil Russlands // Mauritiana (Altenburg). 2004. Bd. 19, heft 1. Р. 83-85.

28. Variation in venom proteins from isolated population of tiger snakes (Notechisaterniger, N. scutatus) in South Australia /Williams V. [ идр.] // Toxicon. 1988. V. 26..

29. Venczel, M., Ghira, I. A preliminary study on the osteology of nose-horned viper (Viperaammodytesammodytes L. 1758) from Boiu de Sus, Romania. // «Sargetia» Series ScienciaNaturae. 1994. V. XVI. P. 145-150.

30. Williams V., White J. Variation in venom constituents within a single isolated population of Peninsula tiger snake (Notechisaterniger) // Toxicon. 1987.

PAGE   \* MERGEFORMAT 1


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

63505. Философские аспекты понимания общества. Специфика социального познания 78 KB
  Философские аспекты понимания общества. Социальное строение жизни общества изучает прежде всего социология вопросы управления общественной жизнью политология хозяйственную деятельность в материальном производстве экономическая теория и т.
63506. Формационная и цивилизационная концепции общественного развития 76.5 KB
  Да и времени не оставили нам уже не только людьми созданные но и природой уготованные 21 веку глобальные проблемы вокруг решения которых надо скорее всему человечеству объединиться несмотря на все цивилизационные различия и групповые эгоистичные мечты амбициозных правителей.
63507. Онтология. Единство мира. Монистические и плюралистические концепции бытия 64.5 KB
  Монистические и плюралистические концепции бытия. Уже автор термина бытие Парменид в тезисе о тождестве бытия и мышления утверждал познаваемость мира человеческим мышлением. Вопрос о единстве мира всего бытия или изначальной множественности значит и невозможности...
63508. Проблемы происхождения, эволюции и сохранения жизни во Вселенной 75 KB
  Например и в мозге человека есть но особенно для навигации птицы и пчелы удачно используют магнетит залетающий на Землю с Марса. Материальное это понятие обозначающее объективное бытие телесных вещей их свойств и отношений а идеальное это субъективная реальность высшая форма опережающего отражения бытия вменяемого...
63509. Структура научного познания, его формы. Фундаментальные и прикладные знания 107.5 KB
  Деление условно рамки отдельной науки часто мешают решению проблем это надо учитывать при структурировании научной работы. По сферам использования науки делятся на фундаментальные и прикладные отраслевые: нефтепереработки геологоразведки авиастроения...
63511. Теория урока теоретического обучения 73 KB
  При коллективном обучении то что знает один то должны знать все и то что знают все должен знать один Функции коллективной формы обучения: Наличие у всех участников общей цели. а уроки производственного обучения.
63513. Страховые взносы в государственные внебюджетные фонды (ГВБФ) 140.5 KB
  Главным нормативным актом регулирующим взаимоотношения плательщиков социальных взносов с государством является ФЗ от 24. Во первых основным правовым актом который регулирует порядок исчисления и уплаты новых страховых взносов является....