95465

Увеит - воспалительное заболевание сосудистой оболочки глаза

Контрольная

Медицина и ветеринария

В ночное время серотонин N-ацетилируется при участии серотонин-N-ацетилтрансферазы в непосредственный предшественник мелатонина N-ацетилсеротонин который в свою очередь после О- метилирования ферментом гидроксииндол-О-метилтрансферазой ГИОМТ превращается в конечный продукт мелатонин.

Русский

2015-09-23

971.25 KB

0 чел.

Глава 1. Увеит

Увеит – воспалительное заболевание сосудистой оболочки глаза, часто склонное к хронизации и приводящее к многочисленным осложнениям. Воспалительные заболевания глаз по обращаемости занимают 2-е место среди глазных болезней, уступая лишь аномалиям рефракции (в России – 2650 на 100 000 населения). К ним  относятся кератиты (воспаления роговицы), конъюнктивиты, увеиты и др. Социальная значимость увеитов связана с тем, что заболевания сосудистого тракта глаза наиболее часто возникают у лиц трудоспособного возраста и порой приводят к резкому снижения остроты зрения и слепоте. Примерно 5 – 15%  случаев слепоты в мире не зависимо от возраста, пола или расы приходится на последствия увеитов. По данным статистики МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца за последние 5 лет заболеваемость по  стране составляет 0,6 на 1000 населения. Доля увеитов среди всех заболеваний глаз составляет от 5 до 15% как среди взрослого населения, так и среди детей. У взрослых увеит как причина слабовидения составляет от 9 до 17,5%, и от 4 до 10%  от всех случаев слепоты. При тяжелых формах течения воспаления слепота на оба глаза возникает, в среднем, в 10% случаев, а инвалидность по зрению в 30% случаев. Один из самых неуклонно развивающихся и резистентных видов увеитов – это увеиты при системных и синдромных заболеваниях (ССЗ). Они составляют до 14% от количества всех увеитов. Ими страдают почти 23% всех больных ССЗ. В абсолютном  большинстве поражаются оба глаза. Увеиты при CCЗ очень часто рецидивируют – в среднем до 65% случаев  в зависимости от этиологии процесса, анатомической локализации, возраста пациента и других факторов. По данным статистики МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца они приводят к слабовидению в 13-17,5% случаев, инвалидности по зрению до 55% случаев, слепота развивается, в среднем, в 9 – 10%.

1.2 Классификация увеитов

Увеиты принято классифицировать по этиологии, локализации, активности процесса и  течению.

Классификация по анатомической локализации процесса:

1. Передние увеиты характеризуются поражением радужной оболочки и/или передней части цилиарного тела.

2. Периферические увеиты – вовлечение в воспалительный процесс задней части цилиарного тела, периферического отдела сетчатки, подлежащей части хориоидеи.

3. Задние увеиты, при которых происходят поражения хориоидеи и сетчатой оболочки за основанием стекловидного тела.

4. Панувеиты характеризуются развитием поражения всей сосудистой оболочки.

 

Классификация по характеру течения:

1. Острые увеиты начинаются  внезапно, с выраженными клиническими проявлениями и длительностью течения до 3 мес. При своевременно начатом лечении острый увеит может быть купирован за 10-15 дней, и в пораженном глазу не остается следов заболевания (рассасываются преципитаты и синехии, нормализуется внутриглазное давление (ВГД)). В некоторых случаях лечение может затянуться до 6 недель.

2. Хронические увеиты протекают более 3 мес. Клинические проявления мало выражены или отсутствуют, однако, возможно острое или подострое течение болезни. Рецидивирующее характер носят увеиты, сопровождающие хроническую инфекцию организма или системное заболевание. Например, при ревматическом увеите периоды обострений сопровождают суставные атаки ревматизма. Не установленный вовремя диагноз и значительное промедление с началом лечения, что часто наблюдается у пациентов из регионов, приводят к хронизации процесса и формированию серьезных осложнений, приводящих в дальнейшем к слабовидению и слепоте.

Классификация по этиологии:

  1.  Инфекционные. Нередко к увеитам приводят ожоги, травмы, контузии глаз, которые могут сопровождаться внедрением инфекции.
  2.  Инфекционно-аллергические. Чаще всего возникают на фоне хронической сенсибилизации организма к внутренней бактериальной инфекции или бактериальным токсинам, но могут быть вызваны и любой инфекцией, (бактериальной, грибковой, вирусной, паразитарной), в особенности хронической. Наиболее тяжелым течением отличаются увеиты вирусной (герпес, ВИЧ и др.) и грибковой природы.
  3.  Аллергические неинфекционные увеиты возникают при лекарственной и пищевой аллергии, после введения вакцин и сывороток, а также гемотрансфузии.  
  4.  Аутоиммунные увеиты часто возникают на фоне ревматизма, ревматоидного артрита, болезни Бехтерева, болезни Стила (детский хронический полиартрит) и др.
  5.  Увеиты при других патологических состояниях, в том числе при нарушениях обмена.

Клинические особенности:

Передний увеит:

1. Острый передний увеит характеризуется светобоязнью, болью, покраснением, снижением остроты зрения и слезотечением.

2. Хронический передний увеит может протекать бессимптомно или с небольшими покраснениями и ощущением «плавающих точек» перед глазами.

Задний увеит:

У пациентов с локализацией воспалительных очагов на периферии отмечаются жалобы на «плавающие точки» пред глазами, затуманивание зрения.

1.3 Патогенез увеита

В настоящее время хорошо известно, что любое воспаление опосредуется иммунной системой. Поэтому трудно переоценить роль иммунологических реакций в развитии и течении внутриглазного воспаления. Особое значение на развитие воспалительного процесса в глазу оказывает строение оболочек глаза и их кровоснабжение. Обладая известной автономией, глаз находится под контролем общей системы иммунитета и гипофиз-адреналовой системы. Установлено, что в локальном иммунном ответе участвуют не только элементы общей иммунной системы, но также иммуноактивные клеточные структуры глаза. В связи с этим при изучении патогенеза увеитов обращают особое внимание на строение сосудистой оболочки глаза, а также на ее иммунологические характеристики. Хорошее кровоснабжение хориоидеи (а по этому параметру ее можно сравнить разве что с почечными клубочками) приводит к отсеву в ней гематогенно распространяемой инфекции. Хориоидея обладает способностью действовать как депо иммуноактивных клеток, беря на себя в экстремальных случаях функцию лимфатического узла.

Концепции патогенеза увеитов активно развиваются, во многом остаются спорными и противоречивыми и, несмотря на значительные достижения в этой области, многие вопросы, касающиеся этиологии и патогенеза, до сих пор не решены. Однако на сегодняшний день большинство специалистов склоняется к тому, что патогенез увеитов можно представить в следующем виде.

При попадании микробного или тканевого антигена происходит общая сенсибилизация организма, а также местная сенсибилизация тканей глаза с нарушением гематоофтальмического барьера  (ГОБ). Нарушение ГОБ обнажает аутоантигены сетчатки, к которым нет иммунной толерантности, поскольку барьер образуется раньше, чем формируется центральная толерантность в тимусе. Большое значение имеет действие провоцирующих факторов внешней или внутренней среды, приводящих к повторному поступлению антигенов в ткани глаза из экстраокулярных очагов инфекции. Провоцирующими факторами являются охлаждение, травмы, эндокринные и нейрогуморальные сдвиги в организме, зрительное переутомление, колебания метеорологических условий и другие отрицательные ситуации, в результате которых снижается уровень неспецифического иммунитета. При повторном попадании антигена в глаз развивается иммунный конфликт по типу аллергической реакции III (иммуннокомплексного) типа. Фиксация  циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) на эндотелии сосудов хориоидеи приводит к образованию нескольких порочных кругов, каждый из которых взаимодействует с другими, усиливая тем самым общий воспалительный ответ.

В экспериментах на животных показано, что самому процессу воспаления предшествует инфильтрация увеального тракта и цилиарного тела. Первыми в ткани глаза появляются гранулоциты, активированная НАДФН-оксидаза которых приводит к усилению продукции АФК:

NADPH-оксидаза

2О2  + NADPH     NADP+    + H+ + 2O2-

Иммунные комплексы обладают сродством к тканям, взаимодействуют с комплементом и вызывают следующие явления: дегрануляцию тканевых базофилов, увеличение содержания эозинофилов, повышение проницаемости капилляров, пролиферацию эндотелия, развитие «респираторного взрыва», выброс большого количества протеолитических ферментов. Фиксация таких иммунных комплексов на стенке сосуда приводит к активации нейтрофилов, которые увеличивают проницаемость сосудистой стенки, что и приводит к развитию острого деструктивного процесса. Присутствие активированных нейтрофилов и активных компонентов комплемента являются ключевым моментом в повреждении кровеносных сосудов. В процессе фагоцитоза иммунных комплексов нейтрофилы продуцируют супероксид-анион радикал, который, по-видимому, является инициатором повреждения сосудистой стенки. Он повреждает клетки эндотелия, оголяя, таким образом, базальную мембрану, что приводит к активации факторов свертывания и кининовой системы. С одной стороны, это еще больше усиливает проницаемость ГОБ. С другой, медиаторы воспаления активируют систему комплемента,  ее компоненты служат аттрактантами для новых нейтрофилов, замыкая, тем самым, порочный круг.

Кроме того, супероксид-анион способен образовывать хемоаттрактант для нейтрофилов из арахидоновой кислоты. Таким образом, АФК способны усиливать воспалительный ответ, инициированный иммунными комплексами. Однако повреждающее действие обусловлено не только активными формами кислорода, но и их производными. Синтезируемый в норме О2- быстро превращается  супероксиддисумтазой в перекись и воду:

(реакция)

Однако при воспалительном процессе продукция О2- резко увеличивается, и СОД не справляется с возрастающей нагрузкой. Не нейтрализованный супероксиддисмутазой  супероксид-анион вступает в реакцию с NO, продуцируемой NO-синтазой. Продуктом реакции становится высоко реакционноспособный пероксинитрит.

(реакция)

Роль нитроксидного стресса в патогенезе воспаления

Пероксинитрит, во-первых, оказывает прямое токсическое действие нам мембраны клеток, приводящее к ПОЛ, а также окислению белков и повреждению ДНК, а во-вторых, индуцирует ряд транскрипционных факторов, в т.ч. NFB и активирующий белок (AP-1), что приводит к активному синтезу провоспалительных цитокинов, включая TNF, и IL-1, вызывающих обширное воспаление. Кроме этого, к усилению синтеза TNF и IL-1 приводит и постоянный избыток АФК. Активация NFB приводит к увеличению транскрипции генов провоспалительных агентов, таких как цитокины, хемокины, факторы роста, iNOS, цАМФ,циклооксигеназа-2 (ЦОГ-2). ЦОГ-2 приводит к усилению продукции простагландина Е2 (PGE2). Простагландин опять же усиливает генерацию АФК. В этот процесс также вовлекается ряд молекул адгезии и хемоаттрактантов для макрофагов и моноцитов. Также пероксинитрит снижает способность NO взаимодействовать с G-белком и таким образом вызывать расширение сосудов, из-за чего кровяное давление растет. ONOO- активирует матриксные металлопротеазы, в том числе коллагеназу MMP-9, разрушающие клеточные и внеклеточные белки, усугубляя тем самым нарушения проницаемости ГОБ, и запускает экспрессию селектинов (таких как P-, E-, L-селектины) и молекул клеточной адгезии(таких как ICAM, PECAM) через активацию NFB, что также приводит к усилению и распространению воспаления.  Активность MMP-9 повышается и под действием провоспалительных цитокинов, в частности, IL-1. Кроме того, пероксинитрит нитрозилирует цитохром С в митохондриях, в результате чего цитохром становится неспособен поддерживать перенос электронов по дыхательной цепи и не восстанавливается аскорбатом. Пероксинитрит нитрозилирует гуанин, в результате чего происходит разрыв цепей ДНК, что, в конечном счете, приводит либо к мутациям, либо к апоптозу.

Кроме того, было доказано, что ONOO- инактивирует некоторые ферменты, которые в критический момент включаются в ремонт поврежденной ДНК. На основе этих наблюдений можно предположить, что существуют дополнительные патологические пути, по которым пероксинитрит может не только повреждать ДНК, но также снижать ее способности к репарации.

К негативным свойствам ONOO- относится и его способность вызывать как апоптоз, так и некроз клеток. Механизм этого процесса связан с воздействием на поли-АДФ-рибозу-полимеразу (PARP-1). Ее основная биологическая функция — выявление повреждений ДНК, вызванных множеством нарушений, включая ионизирующее излучение, воздействие таких окислителей, как ОН- и ONOO-, и свободных радикалов. При разрушении цепочки ДНК PARP-1 передает единицы АФД-рибозы от NAD+ к различным ядерным белкам. С физиологической точки зрения, PARP-1 вовлечена в процесс

репарации ДНК, поддержание стабильности генома, регулирование

транскрипции и репарации ДНК. Однако эта функция реализуется при низком

уровне повреждения. При серьезных поломках геномного аппарата

сверхактивация PARP-1 истощает клеточные запасы NAD+, что приводит к

снижению выработки энергии и, следовательно, переходу на анаэробный гликолиз. В результате потеря NAD+ приводит к сокращению синтеза АТФ, что вызывает клеточную дисфункцию и гибель клетки от некроза.

Индуцибельная NO-синтаза (iNOS) вызывает образование в эндотелиоцитах в 1000 раз большего количества NO, чем конститутивная эндотелиальная (eNOS). Свободные радикалы  ингибируют еNOS и активируют iNOS. Кроме того, iNOS в основном экспрессируется макрофагами и клетками пораженных тканей в области воспаления. Уровень экспрессии iNOS коррелирует с выраженностью воспаления. Сочетание повышенной продукции NO с увеличением образования супероксид-анион радикала приводит к образованию большого количества пероксинитрита, с которым не справляются традиционные антиоксиданты. Активность eNOS и других конститутивных NOS  не высока, они быстро активируются, но функционируют в течение нескольких минут. Незначительное количество NO, синтезируемое ими, помогает поддерживать гомеостаз в клетках кровеносной и нервной систем. В отличие от них, iNOS после индуцирования активна в течение длительного времени (от нескольких часов до нескольких суток). Интересно, что в норме NO, синтезируемый eNOS, подавляет экспрессию генов iNOS и ЦОГ-2 путем блокирования поступления NFkB в ядро. Однако, в условиях воспаления NO, синтезируемый iNOS, напротив, потенцирует активность ЦОГ-2 через тот же NFkB, тем самым способствуя усилению воспаления.

Из-за высокой аффинности NO к супероксид-аниону традиционные антиоксиданты ни в физиологических, ни в фармакологических концентрациях не способны конкурировать с ним за связывание с О2- и поэтому не могут препятствовать образованию высокотоксичного пероксинитрита.  Даже эндогенная СОД не способна перехватывать О2- и не дать ему провзаимоддействовать с NO. Кроме того, пероксинитрит может ингибировать СОД, замыкая таким образом, порочный круг.

 

В глазу в норме существуют два типа защитных антиоксидантных систем, предотвращающих чрезмерную генерацию АФК. Ферментные системы представлены антиоскидантынми энзимами, такими как СОД, каталаза, глутатионпероксидаза (GSG-Px). К неферментным относят глутатион, урат, аскорбат, витамины Е и А. При увеите происходит истощение указанных защитных систем, уровень антиоксидантов существенно снижается, повреждение клеток активными формами кислорода усиливается, что создает благоприятны условия для прогрессирования заболевания.

Чрезмерно высокая продукция АФК ослабляет антиоксидантную защитную систему глаза, работающую при физиологических условиях. Это утверждение привело к предположению о том, что АФК – ключевое звено в инициации и прогрессировании увеита, а значит, использование антиоксидантов, тушителей и скавенджеров АФК может существенно усовершенствовать существующие методики лечения данного заболевания.

1.4 Осложнения увеита

1) глаукома. К наиболее серьезным осложнениям передних увеитов следует отнести вторичную глаукому. Патогенез вторичной увеальной глаукомы многообразен. Кроме очевидных факторов (заращение зрачка), ведущих к повышению внутриглазного давления, можно назвать и другие возможные причины развития вторичной глаукомы: увеличение продукции внутриглазной жидкости, затруднение оттока в углу передней камеры вследствие отека корнеосклеральной трабекулы, экссудации и отложения избыточного пигмента, а позднее - образование гониосинехи.

2) катаракта. Частое осложнение как передних, так и задних увеитов. Главными патогенетическими факторами, способствующими развитию осложненной катаракты при увеитах, являются нарушение питания хрусталика и изменения в его эпителии, действие токсинов. Обычно помутнения возникают сначала в заднем отделе. Постепенно мутнеют и другие его отделы, что приводит к развитию полной или почти полностью осложненной катаракты.

3) при хронических увеитах возникают спайки, стойкие сращения радужки и капсулы хрусталика, полное заращение зрачка, требующие хирургического лечения;

4) при переходе воспалительного процесса на стекловидное тело образуются грубые тяжи (шварты), которые могут привести к отслойке сетчатки;

5) при герпетическом увеите процесс может переходить на склеру и роговицу с образованием язв и очагов расплавления. В тяжелых случаях требуется трансплантация роговицы;

6) при тяжелом течении увеита глазная гипертензия сменяется гипотензией из-за склеивания и частичной атрофии ресничных отростков цилиарного тела, а в условиях гипотонии замедляются все обменные процессы в глазу, в результате чего возникает угроза субатрофии глазного яблока.

1.5 Лечение увеита

Лечение острого увеита должно быть начато как можно скорее. Промедление даже на 1-2 ч может серьезно осложнить ситуацию. Передняя камера глаза имеет небольшой объем(1-1,5 мл), и заполнение ее экссудатом, образование преципитатов и спаек происходит очень быстро. Времени на установление причины заболевания нет, поэтому особое значение имеют препараты, которые можно применять для купирования воспалительного процесса, независимо от его этиологии.

Первая помощь включает субконъюнктивальные инъекции дексаметазона (в довольно большой дозе – 0,5 мл 0,4% раствора), при наличии гнойного экссудата добавляют антибиотики широкого спектра действия, для устранения спаек радужки с хрусталиком и глазной гипертензии назначают мидриатики (3-6 раз в день), при необходимости – антигистаминные препараты. После установления этиологии заболевания проводят специфическую терапию, направленную на подавление инфекции, коррекцию иммунного статуса.

Лечение хронических увеитов длительное. Обострения купируются также субконъюнктивальными инъекциями дексаметазона, но большое значение имеют мероприятия, направленные на лечение основного заболевания, санацию очагов инфекции и т.п. Для профилактики рецидивов в настоящее время применяют иммуностимуляторы: продигиозан, т-активин, декарис, используют и специфическую гипосенсибилизацию.

Следует отметить, что по итогам 30-летнего изучения этиологии увеитов причину, вызвавшую увеит удается установить только у 30% больных, что увеличивает значимость лекарственных препаратов, оказывающих неспецифическое противовоспалительное действие. Лечение хронического воспаления увеального тракта длительное, иногда до 1 года и более. При лечении хронического увеита возникает проблема побочных эффектов кортикостероидов (ГК). Препаратом выбора является Дексметазон, применяемый в форме глазных капель, субконъюктивально, однако и в таком виде он проникает в системный кровоток и оказывает негативное действие на весь организм.  При отсутствии острых состояний рекомендуется назначать Дексаметазон курсами до 2-5 недель, однако при хроническом увеите приходится применять его постоянно, на протяжении всего периода лечения, что значительно усиливает побочные реакции. Особенно опасно длительное применение ГК у детей, так как у них развиваются кушингоподобные состояния –  угнетение функции надпочечников, замедление роста у детей и подростков, уменьшение плотности кости, катаракту и глаукому.

Дексаметазон является сильным индуктором изофермента CYP3A4 – фермента лекарственного метаболизма. Поэтому при применении его больными с увеитами на фоне болезней обмена и аутоиммунных заболеваниях (то есть состояниях требующих постоянного медикаментозного контроля), он будет влиять на лекарственный метаболизм и потребует коррекции дозы, а также может влиять на течение основного заболевания. В связи с этим встает вопрос о поиске новых лекарственных средств с наименьшими побочными эффектами.  В ближайшее время офтальмологи не смогут полностью отказаться от Дексаметазона, поэтому новые препараты должны при совместном применении  с глюкокортикоидами давать тот же эффект и позволить снизить их дозу. Так как этиология увеитов обширна и часто остается неизвестной, целесообразно сосредоточить поиски  не на этиологическом, а на патогенетическом лечении, а именно, коррекции окислительного стресса, являющегося ведущим звеном увеального воспаления.

Возможные точки приложения для новых лекарственных препаратов для борьбы с окислительным стрессом:

  1.  снижение продукции АФК
  2.  снизить истощение пула межклеточных антиоксидантных ферментов
  3.  стимулировать синтез внутриклеточных антиоксидантных ферментов
  4.  увеличить биодоступность NO, продуцируемого eNOS
  5.  инактивировать нитрогенные свободные радикалы
  6.  нормализовать активацию NFB и АР-1
  7.  снизить интенсивность ПОЛ
  8.  ограничить процессы перекисного окисления и нитрования белков
  9.  уменьшить синтез провоспалительных цитокинов
  10.  ограничить синтез молекул клеточной адгезии
  11.  блокирвоать активацию поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1, сохраняя таким образом запасы НАД+ и клеточной энергии
  12.  уменьшить повреждение ДНК, усилить ее репарацию

То есть необходим мультифункциональный препарат с антиоксидантными свойствами, ингибитор iNOS и скавенджер пероксинитрита. Всеми этими свойствами обладает гормон

эпифиза мелатонин.

Глава 2. Мелатонин

 Проведенные в США исследования показали, что регулярный прием витаминов С, Е или поливитаминных пищевых добавок не приводит к существенному снижению развития сердечно-сосудистых заболеваний и смертности от них. Другое исследование показало, что прием витаминов С, Е и каротиноидов не снижает риск инсультов у пациентов, не страдающих диабетом или сердечно-сосудистыми заболеваниями. У тех же, кто страдал такими заболеваниями, прием витамина Е по 400 IU в день в течение 4,5 лет не оказало никакого влияния на исход заболевания сердца и нефропатии. Отмечен случай повышения артериального давления у 2 пациентов с диабетом на фоне приема витамина Е. Антиоксидантные витамины не снижали риск смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, а в 11 исследованиях было отмечено, что высокие дозы витамина Е немного, но достоверно увеличивали общую смертность пациентов (от различных причин) по сравнению с плацебо. Другие 68 исследований, проведенные в общей сложности на 232 тысячах человек, также выявили повышение уровня общей смертности на фоне приема антитоксидантных витаминов.

Уже довольно большое количество исследований показали, что мелатонин значительно лучше, чем классические антиоксиданты противостоит свободнорадикальному повреждению биологических макромолекул. В исследованиях in vivo мелатонин оказался эффективнее витамина Е, -каротина и витамина С. Кроме того, мелатонин безопасен для глаза, высоколипофилен и хорошо проникает в ткани глаза. Он сочетает антиоксидантные и антиадренэргические свойства, что может обеспечить его эффективность при лечении как увеита, так и глаукомы.                                      

Мелатонин – основной гормон пинеальной железы (эпифиза). Его секреция происходит в ночное время из аминокислоты триптофана под действием 4 ферментов. Уровень активности этих ферментов регулируется супрахиахматическим ядром (СХЯ) гипоталамуса, несущим информацию о сменен режимов дня. В митохондриях пинеалоцитов триптофан при помощи триптофангидроксилазы окисляется до 5-гидрокситриптофана, который декарбоксилируется в цитозоле декарбоксилазой ароматических аминокислот до серотонина. В ночное время серотонин N-ацетилируется при участии серотонин-N-ацетилтрансферазы в непосредственный предшественник мелатонина N-ацетилсеротонин, который, в свою очередь, после О-

метилирования ферментом гидроксииндол-О-метилтрансферазой (ГИОМТ) превращается в конечный продукт мелатонин.

2.1 Рецепторы мелатонина

У человека и млекопитающих действие мелатонина опосредуется двумя видами рецепторов – мембранными, связанными с G-белками, и ядерными, относящимся к суперсемейству рецепторов ретиноевой кислоты. Экспрессия рецепторов, как и синтез мелатонина, подчиняется циркадианным ритмам.

Мембранные рецепторы МТ1 и МТ2 расположены в роговице, склере, сетчатке и кровеносных сосудах сетчатки человека, крысы, и многих других видов. Кроме того, рецептор МТ1несут две трети дофаминэргических нейронов. Экспрессия МТ1 имеет суточные колебания и противофазу к колебаниям синтеза мелатонина. Показано, что мелатонин регулирует экспрессию МТ1 как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровне, подавляя экспрессии гена МТ1, и одновременно индуцирует интернализацию существующих рецепторов за счет β-аррестин-опосредованного механизма. Рецепторы, попавшие внутрь клетки, могут быть вторично использованы или убиквитинизированы и разрушены.У мышей, нокаутных по гену МТ1, с возрастом происходило значительное (на 25-30%) уменьшение числа ганглиозных клеток сетчатки. Это позволяет предположить, что МТ1 специфичны для этих клеток. Авторы исследования предлагают использовать таких мышей в качестве модели для изучения глаукомы, поскольку наблюдалось по крайней мере 2 признака открытоугольной глаукомы: повышенное ВГД  и уменьшенное количество ганглиозных клеток. В тоже время  у нокаутов по МТ1 было зафиксировано небольшое (2 мм рт. ст.), но достоверное снижение ВГД ночью. Рецепторы МТ1 обнаружены на клетках адвентиции сосудов сетчатки, что может означать, что мелатонин способен непрямым образом воздействовать на гладкие мышцы сосудистой стенки.

Рецептор МТ2 в основном экспрессируется в сетчатке и отделах промежуточного мозга. Его активация подавляет высвобождения NO и синтез цГМФ в клетках непигментного эпителия, продуцирующего водянистую влагу. Это свидетельстует о том, что мелатонин может участвовать в регуляции продукции водянистой влаги именно через рецепторы МТ2. У мышей, нокаутных по гену МТ2, с возрастом наблюдалось уменьшение числа клеток в наружном ядерном слое сетчатки.

Существует и третий тип мембранных молекул, имеющий сайт связывания с мелатонином – хинон-редуктаза II . Иногда его называют мелатониновым рецептором МТ3, что не совсем корректно, так как он не вызывает инициализации сигнальных путей. Его активность угнетается при повышении концентрации мелатонина. Селективный антагонист МТ3 5-карбоксикарбониламино-N-ацетилтриптамин вызывает снижение внутриглазного давления у кроликов. Локализация МТ3 пока не установлена, но предположительно они должны находиться в цилиарном теле и трабекулярной сети. Не вполне ясен механизм их действия на ВГД – действуют ли они на продукцию водянистой влаги или, наоборот, усиливают ее отток, либо влияют каким-то другим способом.

И МТ 1, и МТ2 рецепторы обнаружены в сетчатке – во внутреннем ядерном (горизонтальные и амакриновые клетки) слое, внутреннем плексиморфном слое, на ганглиозных клетках и пигментном эпителии. Кроме того, они присутствуют в цилиарном теле.

Ядерные рецепторы мелатонина принадлежат суперсемейству ретиноевой кислоты RZR/ROR. RORα (NR1F1) и RORβ (NR1F2) (ранее их относили к семейству ретиноидных/тиреоидных  ядерных гормональных рецепторов). RORα имеет несколько изоформ, их работа связана с убиквитиновой активностью. Мелатонин ингибирует экспрессию RORα за счет модуляции Са2+-кальмодулиновой сигнальной системы, подавляющей активность транскрипционных и посттрансляционных факторов RORα. Зафиксировано участие Са2+-кальмодулин-зависимых протеинкиназ 2-го типа в этой системе.  Рецептор RORβ обнаружен только в сетчатке, структурах головного и спинного мозга, с максимальным уровнем экспрессии в СХЯ гипоталамуса, pars tubularis (РТ) гипофиза, таламусе и эпифизе.

Связывание мелатонина с МТ1или МТ2 рецепторами через вторичные мессенджеры и каскады фосфорилирования активирует рецепторы RZR/ROR. Однако есть данные, что мелатонин осуществляет регуляцию ядерных рецепторов через кальций-кальмодулиновый сигнальный путь посредством изменения концентрации внутриклеточного кальция при связывании с МТ1/МТ2 либо напрямую связываясь с кальмодулином.

2.2 Свойства мелатонина

Использование классических генетических технологий привело к идентификации значительного числа генов, экспрессия которых изменяется под воздействием мелатонина. В нейронах сетчатки он стимулирует экспрессию 6 генов и ингибирует транскрипцию 8. В клетках пигментного эпителия сетчатки стимулирует экспрессию 15 генов и ингибирует транскрипцию 2 генов. В сердечной ткани были обнаружены 212 генов, экспрессия которых изменялась при действии мелатонина, из них экспрессия 146 генов усиливалась, а 66 – угнеталась.

2.3 Мелатонин и регуляция биологических ритмов

Под биологическими ритмами подразумевают периодически повторяющиеся через равные промежутки времени физиологические процессы, отличающиеся интенсивностью и сложностью вовлекаемых структур (периодически повторяющиеся изменения характера и интенсивности биологических процессов и явлений свойственны живой материи на всех уровнях ее организации – от молекулярных    и субклеточных до биосферы). Ритмы, имеющие период 24-28 часов, называются циркадианными (циркадными). Роль эпифиза заключается в том, что он служит основным ритмоводителем функций организма, прежде всего с помощью гормона мелатонина, выполняющего роль фоторегулятора циркадианного ритма. Кроме эпифиза его синтез обнаружен в сетчатке, ЖКТ, сердце, тимусе, клетках иммунной системы, антральных фолликулах и половых железах. Синтез экстрапинеального мелатонина не имеет собственной периодичности и задается секрецией мелатонина в эпифизе. Мелатонин и дофамин являются антагонистами и работают как сигнальные молекулы дневной и ночной активности. В опыте на  кроликах мелатонин ингибировал кальций-зависимое высвобождение дофамина клетками сетчатки.

2.4 Антиоксидантные свойства

Антиоксидантные свойства мелатонина изучали Stasica et al. авторы исследования считают, что гидроксильный радикал атакует С2 атом индольного кольца. Скавенджер алкоксильных радикалов. C перекисью реагирует в две фазы. Во время второй фазы образуется метаболит АФМК, который, как будет сказано далее, тоже обладает антиоксидантными свойствами. Взаимодействует с хлорноватистой кислотой, корую выделяют активированные нейтрофилы в очаге воспаления. При аутооксилении рибофлавина под действием света, мелатонин подавляет образование синглетного кислорода. В этой системе был обнаружен АФМК, однако путь его образования остается неизвестным. Позднее (Zang) были подтверждены свойства мелатонина как тушителя синглетного кислорода.  В исследовании Roberts et al. было подтверждено, что мелатонин является скавенджером синглетного кислорода.

 Как было сказано выше, значительную роль в патогенезе увеального воспаления играет окислительный и нитроксидный стресс. Остановимся подробнее на антиоксидантных свойствах мелатонина.

Мелатонин является основным скавенджером свободных радикалов как кислородного так и азотного происхождения в том числе пероксинитрита, а также карбонатного радикала CO3 образующегося в присутствии физиологических количеств СО2 , при чем проявляет свойства скавенджера и в физиологических, и в фармакологических концентрациях.

Не только мелатонин, но и некоторые из его метаболитов могут ингибировать свободные радикалы и их производные

Важная особенность, выделяющая его из ряда других антиоксидантов, - это отсутствие прооксидантных свойств. Все классические антиоксиданты в определенной концентрации становятся прооксидантами. Мелатонин же является только скавенджером свободных радикалов (по данным электрон-резонансной спектроскопии) и не участвует в окислительно-восстановительных реакциях. Из-за этого его относят к так называемым терминальным, или суицидальным антиоксидантам.

Существенное преимущество мелатонина перед классическими антиоксидантами заключается в том, что он не только взаимодействует со свободными радикалами, но и оказывает геномное воздействие – регулирует экспрессию генов антиоксидантных ферментов – СОД и глутатионпероксидазы – и стимулирует активность -глутамилцистеинсинтазы, усиливая, таким образом, продукцию другого внутриклеточного антиоксиданта – глутатиона (GSH). Глутатион является наиболее важным тиолом небелковой природы в живых системах. При оксилении тиоловой группы образуется глутатиондисульфид (GSSG). Влияние на гены, возможно, осуществляется через эпигенетические механизмы. Кроме того, активность антиоксидантных ферментов, как и экспрессии их генов подчиняется циркадным ритмам, что позволяет предположить участие мелатонина в их регуляции. Молекулярный механизм этого влияния пока неясен. По данным Mayo он опосредован рецепторами МТ1/МТ2 и вторичным мессенджером цАМФ, фосфолипазой С и концентрацией внутриклеточного кальция. Кроме того, связывание мелатонина с мембранными рецепторами может стимулировать каскад МАР-киназы (Mitogen activated protein) и таким образом активировать ряд транскрипционных факторов. Интересно, что в опытах на культурах клеток экспрессия генов увеличивалась только при наномолярных концентрациях мелатонина (10-9 М в среде), а при бóльших дозах эффект отсутствовал. Такие концентрации соответствуют уровню мелатонина в сыворотке крови во время ночного пика in vivo. В большинстве опытов на животных вводимые дозы мелатонина превышали этот уровень, однако положительный эффект все же наблюдался. Вероятно, в данном случае мелатонин действовал в большей степени как скавенджер свободных радикалов, снижал таким образом уровень окислительного стресса, на что клетки отвечали активацией экспрессии генов антиоксидантных ферментов. Впрочем, и в опытах на животных более низкие дозы часто оказывались более эффективными.

В норме мелатонин улавливает свободные радикалы, образующиеся в митохондриях, снижает утечку электронов из дыхательной цепи, поддерживая таким образом, синтез АТФ.

Мелатонин снижает проницаемость эндотелия, возрастающую под влиянием провоспалительного IL-1, который играет важную роль в патогенезе развития  и поддержания воспаления.

Проницаемость тканевого барьера зависит, в частности, от коллагеназы ММР-9, которая способна нарушать эндотелиальные межклеточные контакты, разрушая входящие в их состав белки VE-кадгерин и окклюдин. Мелатонин, снижая экспрессию MMP-9, препятствуя проникновению в ядро факктора NFB, и усиливает экспрессию гена ингибитора TIMP-1, защищая, таким образом, эндотелиальный барьер.

Против нитроксидного стресса

Традиционные антиоксиданты не взаимодействуют с пероксинитритом. Поэтому их вклад в уменьшение воспаления ограничивается влиянием на окислительный стресс, в то время как на нитроксидный они могут воздействовать лишь косвенно, уменьшая количество О2-, но не имея возможности прямо нейтрализовать высокотоксичный пероксинитрит.

Мелатонин является мощным ингибитором экспрессии генов NOS-1 и NOS-2, уменьшая тем самым генерацию NO и пероксинитрита. Также он способен напрямую связывать NO с образованием стабильного продукта N-нитрозомелатонина.

Как было сказано выше, при повреждении ДНК пероксинитритом происходит сверхактивация фермента репарации PARP-1, который в процессе работы потребляет слишком много NAD+,что приводит к энергетическому дефициту клетки. Сохранение NAD+ и увеличение выработки клеточной энергии могут облегчить репарацию. Именно этим процессам способствует мелатонин, сохраняя клеточную выработку энергии и защищая поврежденную ДНК.

2.5 Влияние на внутриглазное давление

Местное применение мелатонина снижает ВГД у человека и крыс. Пинеалэктомия у цыплят не влияет на суточные колебания ВГД,  по-видимому, их обеспечивает местный мелатонин, синтезируемый клетками непигментного эпителия.. Колебания содержания мелатонина в водянистой влаге и плазме крови совпадают, пик приходится на ночное время. Известно, что секреция влаги коррелирует с суточными изменениями ВГД, поэтому было высказано предположение, что мелатонин регулирует ВГД путем изменения секреции влаги. Мелатонин изменяет трансмембранный транспорт ионов в клетках тканей глаза в культуре, в частности, в клетках трабекулярной сети. Расслабление этих клеток должно вызвать увеличение оттока водянистой влаги. однако применение мелатонина перорально у здоровых людей снижало ВГД, но не влияло на отток водянистой влаги.

При системном применении  мелатонин вызывает существенные изменения глубины передней камеры и витреальной полости, что может свидетельствовать о его участии в росте и формировании глаза.

2.6 В роговице

Митотическая активность клеток эпителия роговицы максимальна ночью и снижается днем. У крыс суточные колебания особенно выражены на периферии роговицы. Показано, что эти колебания влияют на заживление ран роговицы и на действие лекарственных препаратов на эпителий. Так как эти колебания сохраняются и после деструкции фоторецепторов, можно предположить, что задаются они не мелатонином из сетчатки. Скорее всего, их задает мелатонин, синтезируемый в непигментном эпителии цилиарного тела. На опыте с белыми кроликами было показано, что мелатонин в микромолярных количествах ускоряет заживление ран роговицы. Этот эффект ингибировал его антагонист лизиндол.

Кроме того, мелатонин опосредует суточные колебания содержания воды в роговице (in vitro). Считается, что у человека это определяет суточные изменения толщины роговицы. Рецепторы к мелатонину у человека есть на эпителии, эндотелии и кератоцитах.

2.7 В сетчатке

Мелатонин синтезируется фоторецепторами сетчатки, но в кровеносное русло не выходит, работая внутри глаза, а вот плазменный мелатонин проникает в глаз. кроме этого. Он синтезируется цилиарным эпителием и выделяется в водянистую влагу. Также есть сведения о том, что его способны синтезировать клетки хрусталика.  

В сетчатке мелатонин действует как нейромодулятор, опосредующий темновую адаптацию и моторику сетчатки. Он ингибирует высвобождение дофамина и стимулирует выброс ГАМК. Дофамин подавляет синтез мелатонина фоторецепторами через рецепторы D2. Мелатонин подавляет ответ клеток горизонтального слоя сетчатки на активацию D1 рецепторов и потенцирует их активацию в ответ на глутамат, а также вызывает деполяризацию мембран Н1 горизонтальных клеток.  У человека совпадают суточные ритмы ЭРГ и колебания уровня мелатонина.

Мюллеровы клетки играют большую роль в поддержании и регуляции проницаемости гематоретинального барьера, поскольку находятся в непосредственной близости от сосудов сетчатки. Антиглиальный кислый белок (GFAP) является маркером реактивных астроцитов, и его экспрессия значительно меняется при патологии сетчатки. Мюллеровы клетки в норме начинают экспрессировать его при патологии. В исследованиях Sande выявлено, что инъекция ЛПС вызывает повреждение мюллеровых клеток, сопровождающееся повышением уровня GFAP. Мелатонин же этому препятствует.

2.8 Производные мелатонина

В качестве антиоксидантов выступает не только сам мелатонин, но и его метаболиты, образующиеся в процессе взаимодействия с радикалами. Антиоксидантую активность проявляют циклический 3-гидроксимелатонин, N1-ацетил-N2-формил-5-метоксикинурамин (АФМК) и, возможно, другие. АФМК имеет собственные биологические функции сообщалось о том, что он. как и мелатонин взаимодействовать с рецепторами, а также ингибировать синтез простагландинов. Кроме того, его физические свойства предполагают антирадикальнцю активность. В эксперименте было показано, что АФМК значительно снижает перекисное окисление ДНК, причем эффект зависит от дозы. Липиды он защищал в меньшей степени,  и, соответственно, в большей дозе(вероятно, потому что сам липофилен). В той же работе было показано, что он работает как скавенджер. Таким образом, АФМК является высокоэффективным низкомолекулярным антиоксидантом. Он вполне может выступать как эндогенный антиоксидант, функционирующий в составе естественной антиоксидантной системы организма. На культуре клеток гиппокампа было показано, что в нервной ткани защитный эффект АФМК даже выше, чем у мелатонина (неопубликованные данные авторов статьи).

2.9Протективные свойства

Применение мелатонина в дозе 1 мг в сутки снижало побочные эффекты дексаметазона у крысят, такие как уменьшение массы тела, атрофия тимуса и надпочечников (подтверждено гистологически), увеличение содержания в крови триглицеридов и свободных жирных кислот. Дексаметазон давали в дозе 0,01-0,04 мг в сутки. При более низких дозах дексаметазона защитный эффект был больше. На повышение в крови глюкозы и глутамат-пируват-трансаминазы под действием дексаметазона мелатонин не влиял. Позже было показано протективное действие мелатонина на молодых и на взрослых крысах, в краткосрочных и длительных опытах. Таким образом, защитное действие мелатонина не зависит ни от возраста, ни от продолжительности лечения кортикостероидами.

2.10 Применение мелатонина в офтальмологии

Современные методы лечения увеитов имеют ограниченную эффективность и большое количество побочных эффектов. В 2006-2008 годах Kukner и Sande изучали возможность применения мелатонина для лечения увеитов. В исследовании Kukner увеит у морских свинок индуцировали введением бычьего сывороточного альбумина в стекловидное тело. Мелатонин, витамин Е или апротинин вводили интраперитонеально в течение 3 суток после инъекции БСА. Все три вещества эффективно снижали отек сетчатки и содержание лептина в тканях глаза. Sande использовал модель эндотоксинового увеита, воспроизводимого путем интравитреального введения ЛПС золотистым хомячкам. Мелатонин в виде пеллет вводился подкожно за 2ч до инъекции, а также через 24ч и 8 суток после нее. Мелатонин снижал поступление белка и клеток в переднюю камеру, т.е. проницаемость ГОБ, активность NOS в сетчатке, содержание TNF- и NFB, равно как и выраженность клинических признаков и изменения ЭРГ. Результаты этих исследований показывают, что мелатонин уменьшает клинические, биохимические, гистологические, ультраструктурные и функциональные проявления увеита, вероятно, через NFB-зависимый механизм.

При экспериментальном аутоиммунном увеите/пинеалите у крыс ночной (пиковый) уровень мелатонина в сыворотке крови был в 3 раза ниже, чем у здоровых. Дневные значения также были ниже. У пациентов с увеитами (болезнь Бехчета, саркоидоз,  болезнь Вогт-Коянаги-Харада и др.)  ночные значения концентрации мелатонина в сыворотке также были значительно ниже, чем у здоровых.

Подобные  исследования проводились на пациентах с разными типами увеита: ирит, иридоциклит, хориоретинит, панувеит, и показали, что у всех пациентов уровень мелатонина в сыворотке был снижен.

В работе, в которй крыс иммунизировали S-антигеном, специфичным для сетчатки и эпифиза. У крыс развивались одновременно увеит и пинеалит. Есть вероятность, что то же происходит и у пациентов с увеитом.

В литературе есть данные об успешном применении мелатонина при фотокератите, катаракте, глаукоме, ретинопатии новорожденных и ишемии-реперфузии.

Мелатонин может также выступать в качестве нейпропротектора за счет способности взаимодействовать с кальмодулином и компонентами микротрубочек, блокировать повышение уровня внутриклеточного кальция, ингибировать синтез NO, снижать уровень VEGF, и концентрацию глутамата в синапсах сетчатки.

Было показано, что мелатонин ослабляет постишемическое повышение проницаемости ГЭБ после экспериментального ишемического инсульта у мышей, уменьшает отек мозга, также снижая проницаемость ГЭБ у крыс.

2.11 Противораковая активность

Снижение воспалительной инфильтрации и дистрофических изменений кишечного эпителия при болезни Крона. По сравнению со стандартным лечением, лечение с использованием мелатонина отмечалось достоверное уменьшение воспаления,  нормализация клеточного состава и секреторной активности клеток.

В опытах на различных моделях у животных и человека индуцированного химического канцерогенеза было обнаружено, что применение мелатонина оказывает угнетающее влияние на возникновение и развитие опухолей молочной железы, шейки матки и влагалища, кожи, подкожной клетчатки, легких, эндометрия, печени, толстой кишки, что свидетельствует о значительной широте спектра противоракового эффекта мелатонина. Возможные механизмы ингибирующего воздействия мелатонина на канцерогенез молочной железы интенсивно изучается в последнее время.

Глава 3. Модель увеита

В данной работе использовалась модель токсико-аллергического увеита, поэтому подробнее остановимся на патогенезе именно этой разновидности заболевания.

введение лошадиной сыворотки кроликам приводит к образованию антител Каждому виду животных свойственна характерная динамика образования иммуноглобулинов.  Она зависит от дозы антигена, пути проникновения его в организм и состояния реактивности организма. при первичном парентеральном введении антигена кроликам антитела обнаруживаются в сыворотке крови спустя 3-4 дня. В течение 6-12 дней титр антител нарастает, затем стабилизируется, а затем в течение 2-3 месяцев постепенно возвращается к исходному уровню. при первичном подкожном введении антигена в процесс иммунного ответа вовлекаются регионарные лимфоузлы. При введении антигена в процессе реакции  антиген-антитело образуются иммунные комплексы. Они обладают сродством к тканям, взаимодействуют с комплементом и вызывают следующие явления: дегрануляцию тканевых базофилов, повышение содержания эозинофилов, повышение проницаемости капилляров, пролиферацию эндотелия, активацию нейтрофилов с развитием "респираторного взрыва" и выбросом широкого спектра протеолитических  ферментов. Элиминацию иммунных комплексов  осуществляют макрофаги и нейтрофилы.

Повторное введение антигена в глаз приводит к иммунному конфликту в сосудистой оболочке глаза, так как иммунные комплексы тропны к кровеносным сосудам. Циркулирующие ИК фиксируются на сосудистой стенке, активируют нейтрофилы, которые начинают выделять биооксиданты, эластино- и коллагенолитические ферменты, вследствие чего увеличивается проницаемость сосудов, и развивается острый деструктивный процесс.

После завершения острой фазы воспаления состав клеточного инфильтрата меняется – вместо нейтрофилов в нем начинают преобладать макрофаги и моноциты, которые нацелены на удаление иммунных комплексов.

Угнетение клеточного и выраженная реакция гуморального иммунитета при системных заболеваниях приводит к развитию хронических рецидивирующих аутоиммунных увеитов.


ГЛАВА № 6. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

6.1.Моделирование увеита.

Увеит моделировали по методу Baldwin [46], модифицированному в МНИИ ГБ им. Гельмгольца [31] путем двукратного введения животным нормальной лошадиной сыворотки. Первая доза сыворотки (5 мл) вводилась подкожно, вторая (0,07 мл) – интравитреально на 10 день после первой.

В результате развивался панувеит, однако мы оценивали проявления переднего увеита, поскольку быстро развивавшееся помутнение хрусталика не позволяло наблюдать состояние заднего отрезка глаза.

6.2.Оценка визуально наблюдаемых проявлений увеита.

Основные наблюдаемые проявления увеита оценивали  в условных единицах.  Оценку проводили путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы.

В работе для оценки изменения показателей интенсивности воспаления использована принятая в лаборатории условная шкала, характеризующая выраженность признака в баллах от 1 до 3.

Табл.6.2.1.Схема оценки выраженности симптомов при экспериментальном увеите у кроликов.

Признак

Выраженность клинических проявлений

Баллы

Отек век

слабо выраженный

выраженный

резко выраженный

1

2

3

Гиперемия

конъюнктивы

легкая

выраженная

резко выраженная

1

2

3

Отек роговицы

рисунок радужки виден

рисунок радужки не виден

радужка не видна

1

2

3

Отек радужки

гиперемия и слабо выраженный отек

выраженный

резко выраженный

1

2

3

Количество

фибрина в

передней камере

незначительное

среднее

большое

1

2

3

Эксперимент выполнен на 20 кроликах. У 16 кроликов моделировали увеит по описанной выше методике.

Кролики с увеитом (16 кроликов, 32 глаза) были разбиты на 2 группы по 8 животных. Одной группе ежедневно в течение 7 дней, начиная со дня введения разрешающей дозы, проводили инстилляции

Для лечения использовали препарат

Ежедневно проводили клиническую оценку течения увеита путем биомикроскопии с помощью щелевой лампы.

На 5-е сутки увеита у  4 кроликов из каждой группы отбирали из каждого глаза около 0,15 мл влаги передней камеры и выводили животных из эксперимента. На 8-е сутки забирали влагу передней камеры у оставшихся животных. Для контроля каждый раз забирали влагу передней камеры у 4 здоровых животных.

Слезную жидкость у животных забирали до увеита, на 1, 3 и 7 сутки увеита. Для контроля одновременно забирали слезную жидкость у 4 здоровых животных.

2. Сравнение эффективности инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их сочетания при экспериментальном увеите у кроликов.

Взятие биологического материала.

Слезную жидкость у кроликов забирали следующим образом: кружки из фильтро-вальной бумаги Ø5мм (3 кружка на 1 глаз) помещали в нижний конъюнктивальный мешок на 5 минут. Далее их переносили в пробирки эппендорф, элюировали буферным раствором (150 мкл) в течение 20 мин. Элюат центрифугировали, надосадочную жидкость использовали для определения активности СОД в тот же день.

Влагу передней камеры глаза забирали путем парацентеза инсулиновым шприцем после местной анестезии 0,4% Алкаином. После взятия водянистой влаги отбирали 20 мкл для приготовления мазка для подсчета лейкоцитов, оставшуюся часть центрифугировали, надосадочную жидкость отбирали и использовали для исследований.

Проведенные исследования.

1. В слезной жидкости кроликов определяли активность СОД.

2. Во влаге передней камеры определяли:

концентрацию общего белка по Лоури [28];

антиокислительную активность в отношении гидроксильного радикала (АОА-ОН•) [34];

уровень 2-макроглобулина (2-МГ) [36].  

3. Проводили подсчет лейкоцитов в водянистой влаге.

Хемилюминесцентный метод определения антиокислительной активности водянистой влаги передней камеры глаза.

В работе использован хемилюминесцентный метод определения антиокислительной активности биологического материала в модельной системе гемоглобин-люминол-перекись водорода, разработанный на кафедре биофизики медико-биологического факультета РГМУ (зав.каф. академик РАМН проф. Ю.А.Владимиров) Владимировым Ю.А., Любицким О.Б., Клебановым Г.И., Теселкиным Ю.О., Бабенковой И.В [10,28,34,35].

Принцип метода.

Метод хемилюминесценции (ХЛ) относят к прямым методам изучения свободных радикалов и их реакций [7].

Процесс  СРО  модельной  системы  Нb-ЛМ-Н2О2 сопровождается  испусканием квантов света хемилюминесценции. Зависимость  интенсивности  ХЛ  от времени называют кинетикой ХЛ. Основными параметрами  кинетики  ХЛ являются: величина латентного периода (время от  момента  индукции СРО  до  начала развития свечения), светосумма (площадь  под хемилюминесцентной кривой за время t), максимальная  интенсивность ХЛ [7-9,23,24].

В работе  для  изучения  антиокислительных  свойств исследуемых веществ  использована система гемоглобин-Н2О2-люминол, в  которой в  качестве  субстрата  окисления  выступает   люминол. Надо сказать, что люминол одновременно является как активатором хемилюминесценции, дающим мощное свечение в присутствии радикалов гидроксила [7], так и непосредственным участником химических реакций [9].

Молекула люминола (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-фталазин-1,4-дион) имеет следующую структуру:

В водных растворах при рН, близких к нейтральным, люминол существует в виде смеси двух таутомерных форм:

которые могут подвергаться ионизации:

 

При взаимодействии с активными формами кислорода (АФК) люминол подвергается свободнорадикальному окислению (СРО), в ходе которого испускаются кванты ХЛ [28,34,35].

В настоящей работе для инициирования СРО люминола использована смесь гемоглобина и Н2О2. В процессе их взаимодействия образуются радикалы-инициаторы окисления люминола, в качестве которых выступают феррил-радикалы гемоглобина и ОН.

Далее последовательность реакций выглядит следующим образом:

                                                                           

                                Х  +   LH                   ХН   +   L  ,                  (1)

. - феррил радикал гемоглобина или ОН., L. - семихинон радикал люминола)

                         .

                                L  +   O2                       L   + О2-•,                     (2)

О2-• +   L                       LO22 ,                          (3)

(LO22 - эндопероксид люминола)

Эндопероксид люминола является нестабильным соединением и легко разрушается. В результате его разрушения выделяется азот (N2) и образуется 3-аминофталат дианион в возбужденном состоянии (АфО22) (р-я 4). Последний переходит в основное состояние с испусканием квантов света ХЛ в видимой области спектра (р-я 5) [28].

                                LO22                 N2   +   (АфO22) ,                    (4)

(АфO22 - 3-аминофталат дианион)

                          (АфO22)                АфO22   +   h   (max=425 нм)   (5)

Введение  в  модельную  систему  антиоксидантов  приводит   к торможению СРО люминола. Это проявляется в изменении параметров кинетики ХЛ: увеличении  латентного  периода, уменьшении светосуммы и интенсивности свечения. Характер изменения указанных  параметров  зависит  от  механизма   антиокислительного действия  исследуемого  вещества.  Так,  например,  показано,  что антиоксиданты, взаимодействующие с феррил-радикалами гемоглобина и ОН.,  заметно  удлиняют латентный период, почти не влияя на интенсивность  ХЛ,  тогда  как антиоксиданты, перехватывающие  радикалы люминола и О2-•, понижают интенсивность ХЛ, не изменяя латентного периода [7,28,34].

Построение калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой используют тролокс (6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethyl-chroman), который представляет собой водорастворимый аналог витамина Е.  Из основного 0,256 мМ р-ра  тролокса готовят 4, 8, 16 мкМ растворы, которые используют для построения калибровочной кривой.

Для построения калибровочной  кривой на оси абсцисс откладывают значение концентрации, а на оси ординат величину ( tt 0)/  t0, где t0 - латентный период ХЛ или время, прошедшее от момента внесения Н2О2 в реакционную среду контрольной пробы до начала развития свечения ХЛ. Латентный период t0 определяется путем аппроксимирования прямолинейного участка кривой хемилюминесценции и ее экстраполяцией на ось абсцисс (Рис.6.6.1); t - время, прошедшее от момента внесения Н2О2 в реакционную среду опытной пробы до начала развития свечения хемилюминесценции (определяется аналогично t0) (Рис.6.6.2).

Рис.6.6.1  Зависимость интенсивности ХЛ от времени в контрольной пробе.

по оси абсцисс время в секундах  

по оси ординат интенсивность ХЛ в относительных единицах

Рис.6.6.2. Зависимость интенсивности ХЛ от времени в присутствии тролокса в концентрации 8 мкМ.

по оси абсцисс время в секундах

по оси ординат интенсивность ХЛ в относительных единицах

Внесение тролокса (антиоксидант) в пробу приводит к увеличению латентного периода кинетической кривой, при этом линейная зависимость между концентрацией тролокса и длительностью латентного периода сохраняется в области от  4мкМ до 16 мкМ тролокса (Рис.6.6.3), что позволяет использовать его в качестве калибратора в данной модельной системе.

Рис.6.6.3. Зависимость параметра (t-t0)/t0  от  концентрации  тролокса.

Калибровка по тролоксу и расчет антиоксидантной активности образца производятся автоматически при помощи программного обеспечения прибора "Биотокс-7".  

Реактивы.

1. 0,05 М фосфатный буфер, рН =7,4, содержащий 0,1 мМ ЭДТА (Sigma-Aldrich);

2. 5,0 мМ раствор гемоглобина (ICN Biomedicals Inc.)  в 0,05 М фосфатном буфере рН=7,4 (готовится  ex tempore);

3. 1 мМ раствор люминола в фосфатном буфере (основной раствор)

Хранится в пробирках эппендорф замороженном виде при  -18С. Рабочий раствор готовится в день проведения исследования путем  разведения основного раствора в 10 раз 0,5 М фосфатным буфером

4. 33% пергидроль - основной раствор. Рабочий реактив (0,98 мМ Н2О2 ) готовится в день проведения исследования путем разведения основного раствора в 10000 раз бидистиллированной  водой.

5. 0,256мМ раствор тролокса (6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethyl-chroman) (Sigma-Aldrich) - основной раствор на фосфатном буфере. Хранится в пробирках эппендорф замороженном виде при  -18С. Для построения калибровочной кривой используются 4, 8 и 16 мкМ концентрации тролокса, которые готовятся в день проведения исследования последовательным разведением основного раствора 0,5М фосфатным буфером.

Ход определения.

Контрольная проба: в пробирку эппендорф вносят 370 мкл фосфатного буфера и добавляют 50 мкл люминола и 50 мкл гемоглобина. Тщательно перемешивают. Для инициирования реакции СРО люминола добавляют 30 мкл рабочего раствора пероксида, перемешивают и точно фиксируют время внесения реактива. Пробирку помещают в хемилюминометр “Биотокс-7”, который регистрирует кинетику свободнорадикальной реакции в модельной системе. Прибор "Биотокс-7" подключен к компьютеру. Измерения производятся 1 раз в секунду, кинетическая кривая отображается на экране, программное обеспечение позволяет автоматически строить калибровочную кривую и рассчитывать величину АОА.

Опытная проба: в пробирку эппендорф вносят 340 мкл фосфатного буфера и добавляют последовательно 50 мкл люминола, 50 мкл гемоглобина и 30 мкл биологического материала или раствор тролокса (для калибровки). Тщательно перемешивают. Вносят 30 мкл рабочего раствора Н2О2, фиксируют время, перемешивают и регистрируют кинетику СРО на хемилюминометре (Табл.№ 6.6.1).

Таблица № 6.6.1. Схема анализа.

проба

реактивы

контроль

тролокс

опыт

буфер, мкл

370

340

340

люминол, мкл

50

50

50

гемоглобин, мкл

50

50

50

тролокс, мкл

-

30

-

исслед.

материал, мкл

-

-

30

перемешать

перекись

водорода, мкл

30

30

30

перемешать

6.7.Определение активности СОД по автоокислению кверцетина.

В работе использован спектрофотометрический метод определения активности супероксиддисмутазы в биологическом материале в модельной системе  автоокисления кверцетина [22], модифицированный для определения активности СОД в слезной жидкости.

Принцип метода.

Прямое определение активности фермента требует весьма сложного оборудования, отсутствующего в большинстве биохимических лабораториях и медицинских учреждениях. Вместе с тем активность СОД является одним из наиболее часто определяемых показателей в различных экспериментальных и клинических исследованиях. В связи с чем и был разработан этот метод.

Окисление кверцетина в 0,015 М фосфатном буфере при нейтральном и слабощелочном рН ингибируется ЭДТА и ускоряется при добавлении ионов двухвалентного железа. Роль О2-. в этом процессе, по-видимому, незначительна поскольку СОД не ингибирует окисление кверцетина (результаты не приводятся). Добавление в инкубационную среду ТМЭДА сдвигает рН раствора до 10,0. В этих условиях интенсивное окисление кверцетина, сопровождаемое разрушением хромофора с максимумом поглощения при 406 нм и увеличением поглощения при 335нм, протекает в присутствии 0,08 мМ ЭДТА (Рис.6.7.1).

Рис. №6.7.1. Динамика спектральных изменений, отражающая процесс аутоокисления кверцетина при рН 10,0 в присутствии ТМЭДА (0,8мМ) и ЭДТА (0,08мМ).

1-спектр поглощения неокисленного кверцетина (1,4*10-5 М); 2-5 – спектры поглощения кверцетина после 5,10,15 и 20 мин окисления соответственно.

При этом между количеством окисленного кверцетина, оцениваемого по величине оптической плотности при 406 нм, и длительностью реакции сохраняется в течение первых 20 мин линейная зависимость (Рис. №6.7.2).

Рис. №6.7.2. Кривая, описывающая ход реакции окисления кверцетина (1,4*10-5 М) во времени.

Реактивы:

  1.  0,02 М фосфатный буфер, содержащий 0,08мМ ЭДТА, рН 10,2
  2.  Тетраметилэтилендиамин (ТМЭДА, ТЕМЕД) (Helicon, Россия):

к 160 мл фосфатного буфера добавить 200 мкл ТЕМЕД (ex tempora), выдержать 2 часа при комнатной температуре

  1.  Кверцетин (Диаэм, Россия):

1,5 мг растворить в 10 мл ДМСО (ex tempora)

Буфер, смешанный с ТЕМЕД можно использовать в течение одного рабочего дня.

Ход определения.

Контрольная проба: в микрокювету вносят 930 мкл буфера и 30 мкл кверцетина, быстро перемешивают многократным пипетированием, сразу же измеряют абсорбцию в кювете при 406 нм против воды. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин., точно после истечения 20 мин снова измеряют величину абсорбции. Для более точных результатов используют измерения нескольких контрольных проб, вычисляют среднее значение.

Опытная проба: в микрокювету вносят 900 мкл буфера, 30 мкл элюата, 30 мкл кверцетина, быстро перемешивают многократным пипетированием, измеряют абсорбцию в кювете при 406 нм, инкубируют в течении 20 мин, точно после истечения 20 мин снова измеряют величину абсорбции.

Измерения оптической плотности проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-160A (Япония).

Расчет активности СОД.

Присутствие СОД тормозит автоокисление кверцетина, поэтому через 20 мин абсорбция в образцах оказывается меньше, чем в контроле. Вычислив разность между абсорбцией при первом и втором измерениях, сравнивают ее с таковой в контроле и рассчитывают % ингибирования по сравнению с контролем. Затем по калибровочной кривой определяют активность СОД.

Калибровочную кривую строили по Cu,Zn-CОД человека (препарат "Рексод", ООО "НПП Ферментные технологии", Россия)

6.8.Измерение активности 2-макроглобулина в исследуемом материале.

Для определения активности 2-МГ  во влаге передней камеры использовали метод К.Н. Веремеенко и Л.И. Волохонской  в модификации Т.А. Кримштейн и В.Б. Хватова, модифицированный для микроанализа [36].

Принцип метода.

Белки семейства макроглобулинов играют весьма существенную роль в развитии воспалительной реакции, контролируя, прямо, либо посредством связывания и транспортировки различных регуляторных лигандов, практически все ключевые моменты ответа организма на внешние, либо внутренние патогенны [15].

Определение активности 2-МГ основано на том, что комплекс 2-МГтрипсин сохраняет протеолитическую активность по отношению к низкомолекулярным субстратам, и на эту активность не влияет ингибитор трипсина из бобов сои.

Молекула 2-макроглобулина необратимо ингибирует участок связывания трипсина с высокомолекулярными субстратами, оставляя при этом открытым участок связывания с низкомолекулярными веществами. В результате при таком взаимодействии образуется комплекс (2-МГтрипсин) с активным участком на трипсине. Добавление к такому комплексу низкомолекулярных хромогенных субстратов (БАПНА), позволяет судить об уровне 2-макроглобулина в исследуемом материале по накоплению окрашенного продукта реакции (пропорционален изменению окраски образца).

Коэффициенты в формуле для расчета активности 2-макроглобулина в слезе и влаге передней камеры были определены при помощи калибровочной кривой, построенной по стандартному раствору р-нитроанилина.


Реактивы:

  1.  0,2М Трис-HCl буфер, рН 7,4
  2.  4% раствор трипсина в 0,001Н HCl
  3.  Ингибитор трипсина из бобов сои 0,005% раствор в Трис-HCl буфере
  4.  БАПНА (N-бензоил-DL-аргинин-p-нитроанилид) 0,06% раствор в Трис-HCl буфере
  5.  0,001Н HCl 

Растворы трипсина, ингибитора и БАПНА использовать в день приготовления, буфер хранить в холодильнике.

Биологический материал можно хранить в холодильнике, не замораживая, не более 3 суток.

Ход определения.

Контрольная проба: В лунки 96-луночного планшета вносят по 40 мкл физиологического раствора. К нему добавляют 50 мкл Трис-HCl буфера. Инкубируют при комнатной температуре на 15 мин. После добавляют 100 мкл раствора БАПНА и 10 мкл раствора соевого ингибитора в Трис-HCl буфере, инкубируют при 37С 30 мин при перемешивании в шейкере-инкубаторе. Реакцию останавливают, внося в лунки по 25 мкл НСl. Затем в лунки вносят 50 мкл раствора трипсина.

Опытная проба: В лунки 96-луночного планшета вносят по 40 мкл исследуемого материала. К нему добавляют 50 мкл Трис-HCl буфера, 50 мкл 4% раствора трипсина в 0,001Н НСl,. Инкубируют при комнатной температуре на 15 мин. После добавляют 100 мкл раствора БАПНА, 10 мкл раствора соевого ингибитора в Трис-HCl буфере и инкубируют при 37С 30 мин при перемешивании в шейкере-инкубаторе. Реакцию останавливают внося в лунки по 25 мкл НСl. Регистрируют оптическую плотность при длине волны 410 нм.

Оптическую плотность образцов регистрировали с помощью многофункционального фотометра для микропланшет Synergy MX (BioTek, USA).


Таблица №.6.8. 1. Схема анализа.

проба

реактивы

Опытная проба

Контрольная

проба

Слеза, мкл

40

Физиологический раствор, мкл

40

Буфер, мкл

50

50

Трипсин, мкл

50

Инкубировать 15 мин при комн. температуре

Ингибитор, мкл

10

10

БАПНА

100

100

Инкубировать 30 мин при 37 С

0,5Н НСl, мкл

25

25

Трипсин, мкл

50

Расчет активности 2-МГ в слезной жидкости:

(D - Dk) •0,108 = А (нмоль/мин•мл)

удельная активность = А/(m•0,04),   где

А - активность фермента

D - оптическая плотность образцов слезы, измеренная при 410 нм.

Dk - оптическая плотность контрольных образцов

m – содержание белка в пробе в мг/мл

0,108- коэффициент, рассчитанный с помощью калибровочной кривой, построенной по р-нитроанилину.

6.9.Определение  количества лейкоцитов во влаге передней камеры.

Количество лейкоцитов во влаге передней камеры отображает интенсивность воспалительной реакции при увеите.

Количество лейкоцитов во влаге передней камеры подсчитывали под световым микроскопом в неокрашенном мазке, приготовленном из 20 мкл влаги передней камеры сразу после ее отбора. Определяли среднее количество лейкоцитов в поле зрения после подсчета в пяти полях зрения.

6.10.Статистическая обработка данных.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием статистического пакета программ "Excel" и Statistica 6.0. Исследуемые выборки были подвергнуты тесту на нормальность распределения. Показатели с нормальным распределением представлены как среднее значение (М) и стандартная ошибка среднего арифметического отклонение (m), достоверность различий между группами, с уровнем значимости не менее 95%  оценена с помощью параметрического t–критерия Стьюдента.

В таблицах для выраженности клинических признаков ожоговой болезни представлены значения выборочного среднего с указанием доверительного интервала, покрывающего это значение с надежностью 0,95. Поскольку данные показатели являются дискретными, для оценки различий между группами применен непараметрический U-критерий Манна-Уитни.


  1.  Оценка выраженности визуально наблюдаемых признаков увеита.

На 2 сутки после введения разрешающей дозы лошадиной сыворотки у всех кроликов наблюдалась характерная картина переднего увеита. Конъюнктива была отечна и гиперемирована, наблюдался отек роговицы, отек и гиперемия радужки, во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживался фибрин. На поверхности передней капсулы хрусталика обнаруживались крупные и мелкие преципитаты, сгустки фибрина. Хрусталик становился диффузно мутным, стекловидное тело сквозь него визуализировалось с трудом.

У нелеченных животных с течением времени увеит прогрессировал: отек век и гиперемия конъюнктивы усиливались, появилось гнойное отделяемое, усиливался отек роговицы. Сохранялась выраженная отечность и гиперемия радужки. Помутнение хрусталика прогрессировало.

У животных, получавших инстилляции раствора мелатонина, клиническая картина значительно отличалась. Признаки конъюнктивита были выражены незначительно, перикорнеальная инъекция конъюнктивы – умеренно.

Данные в таблицах представлены в виде среднего значения М и стандартной ошибки среднего арифметического m в условных баллах.


Сутки

2

3

4

7

8

10

Лечение мелатонином

2,13±0,94

1,75±0,49

1,75±0,32

1,25±0,32

1,00±0,52

0,25±0,32

Контроль

2,88±0,25

2,13±0,25

2,00±0,37

1,75±0,72

1,50±0,74

0,63±0,52

Таблица 1. Влияние инстилляций мелатонина на отек век у кроликов при экспериментальном  увеите по сравнению с контрольной группой.

Рисунок 1. Влияние инстилляций мелатонина на отек век у кроликов при экспериментальном  увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 2. Влияние инстилляций мелатонина на гиперемию конъюнктивы у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Сутки

2

3

4

7

8

10

Лечение мелатонином

2,38±0,63

2,63±0,36

2,00±54

1,63±0,74

1,25±0,81

0,88±0,44

Контроль

3,00±0,00

3,00±0,00

2,75±0,32

2,38±0,63

1,75±0,81

1,13±0,69

Рисунок 2. Влияние инстилляций мелатонина на гиперемию конъюнктивы у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 3. Влияние инстилляций мелатонина на отек роговицы у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Сутки

2

3

4

7

8

10

Лечение мелатонином

1,38±0,90

1,88±0,78

2,13±0,69

2,00±0,83

1,63±0,74

1,63±0,82

Контроль

1,88±0,44

2,25±0,49

2,250±0,32

2,38±0,63

2,38±0,63

1,88±0,78

Рисунок 3.  Влияние инстилляций мелатонина на отек роговицы у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 4. Влияние инстилляций мелатонина на отек радужки у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Сутки

2

3

4

7

8

10

Лечение мелатонином

1,38±0,36

1,88±0,25

1,88±0,25

2,00±0,52

1,75±0,72

1,86±0,74

Контроль

1,13±0,25

2,25±0,32

2,38±0,36

2,57±0,37

2,43±0,37

2,00±0,57

Рисунок 4. Влияние инстилляций мелатонина на отек радужки у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

 

Таблица 5. Влияние инстилляций мелатонина на количество фибрина в передней камере у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Сутки

2

3

4

7

8

10

Лечение мелатонином

0,50±0,52

0,50±0,37

0,63±0,36

0,63±0,36

0,50±0,37

0,14±0,26

Контроль

1,00±0,00

1,13±0,25

1,38±0,52

0,86±0,48

0,57±0,37

0,57±0,37

Рисунок 5. Влияние инстилляций мелатонина на количество фибрина в передней камере у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 6. Влияние инстилляций мелатонина на образование задних синехий у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Сутки

2

3

4

7

8

10

Лечение мелатонином

2,13±0,58

2,63±0,36

2,50±0,37

2,38±0,52

2,38±0,52

2,29±0,52

Контроль

2,75±0,32

2,75±0,32

2,75±0,32

2,43±0,37

2,43±0,37

2,29±0,37

Рисунок 6. Влияние инстилляций мелатонина на образование задних синехий у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 7. Влияние инстилляций мелатонина на новообразование сосудов у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Сутки

2

3

4

7

8

10

Лечение мелатонином

0,00±0,00

0,00±0,00

0,00±0,00

0,63±0,25

0,81±0,26

0,88±0,31

Контроль

0,00±0,00

0,00±0,00

0,00±0,00

0,79±0,19

1,07±0,24

1,36±0,41

Рисунок 7. Влияние инстилляций мелатонина на новообразование сосудов у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

  1.  Определение влияния инстилляций мелатонина на изменения биохимических показателей слезы кролика.

Таблица 2.1. Влияние инстилляций мелатонина  на уровень α2-макроглобулина в слезе кроликов при экспериментальном по сравнению с контрольной группой.

Сутки

До лечения

1

3

7

Здоровые

2,24±0,62

1,70±1,10

1,78±0,39

3,36±1,70

Лечение мелатонином

3,36±1,43

3,02±1,07

3,87±2,00

2,86±1,22

Нелеченные

2,43±0,50

7,14±3,10

3,59±1,25

1,97±0,66

Рисунок 2.1. Влияние инстилляций мелатонина  на активность α2-макроглобулина в слезе кроликов при экспериментальном по сравнению с контрольной группой.

Таблица 2.2. Влияние инстилляций мелатонина на активность 2-макроглобулина в слезе кроликов при экспериментальном увеите в процентах от исходного.

Сутки

До лечения

1

3

7

Здоровые

100

100

100

100

Леченые мелатонином

100

152,38±44,70

201,44±62,09

64,09±15,35

Нелеченые

100

384,79±94,02

164,79±30,28

49,26±10,31

Рисунок 2.2. Влияние инстилляций мелатонина на активность 2-макроглобулина в слезе кроликов при экспериментальном увеите в процентах от исходного.

Таблица 3.1. Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную способность слезы кроликов  по отношению к гидроксильному радикалу в процентах от исходного.

Сутки

До лечения

1

3

7

Здоровые

100

100

100

100

Леченые мелатонином

100

95,81±14,29

67,22±12,07

83,86±15,39

Нелеченые

100

88,76±12,07

49,21±±9,03

54,95±6,00

Рисунок 3.1. Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную способность слезы кроликов  по отношению к гидроксильному радикалу в процентах от исходного.

Таблица 3.2 . Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную способность слезы кроликов  по отношению к супероксид-аниону в проценте от здоровых животных.

Сутки

До лечения

1

3

7

Здоровые

100

100

100

100

Леченые мелатонином

100

164,17±34,08

133,56±15,06

101,22±14,02

Нелечные

100

222,24±12,91

160,86±16,14

85,63±13,04

Рисунок 3.2 . Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную способность слезы кроликов  по отношению к супероксид-аниону в проценте от исходного.

Таблица 3.3.  Влияние инстилляций мелатонина на активность супероксиддисмутазы в слезе у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой в процентах от исходного.

Сутки

До лечения

1

3

7

Здоровые

110,86±11,03

110,86±14,93

101,60±8,77

120,90±12,60

Леченые мелатонином

90,16±19,52

115,24±6,91

102,91±13,04

107,09±10,47

Нелеченные

102,26±7,87

115,56±5,39

115,29±10,01

111,49±15,27

Таблица 3.4. Влияние инстилляций мелатонина на уровень белка в слезе кроликов при экспериментальном увеите в процентах от исходного.  

 Сутки

0

1

3

7

Здоровые

100

100

100

100

Леченые мелатонином

99,49±1,67

130,25±3,88

139,13±11,91

88,30±7,93

Нелеченные

102,45±1.32

106,84±8,27

129,19±10,14

67,77±4,54

Рисунок 3.4. Влияние инстилляций мелатонина на уровень белка в слезе кроликов при экспериментальном увеите, % от здоровых животных.

Таблица 3.5. Влияние инстилляций мелатонина на активность супероксидддисмутазы (U/ml) в слезе кроликов при экспериментальном увеите.

Сутки

До лечения

1

3

7

Здоровые

84,06±11,03

110,86±14,93

101,60±8,77

120,90±12,60

Мелатонин

90,16±19,52

115,24±6,91

102,91±13,04

107,09±10,47

Нелеченные

102,26±7,87

115,56±5,39

115,29±10,01

111,49±15,27

Рисунок 3.5. Влияние инстилляций мелатонина на активность супероксидддисмутазы в слезе кроликов при экспериментальном увеите в процентах от исходного.


  1.  Определение влияния инстилляций мелатонина на изменения биохимических показателей влаги передней камеры глаза кролика на 10 сутки экспериментального увеита.

Таблица 4.1. Влияние инстилляций мелатонина на количество лейкоцитов во влаге передней камеры глаза кроликов при экспериментальном увеите на 10 сутки по сравнению с контрольной группой.

Группа

Клеток в поле зрения

Здоровые

0,25±0,16

Лечение мелатонином

3,33±0,62

Нелеченые

1,64±0,30

Рисунок 4.1. Влияние инстилляций мелатонина на количество лейкоцитов во влаге передней камеры глаза кроликов при экспериментальном увеите на 10 сутки по сравнению с контрольной группой.

Таблица 4.2. Влияние инстилляций мелатонина на активность 2-макроглобулина во влаге передней камеры глаза кроликов при экспериментальном увеите на 10 сутки по сравнению с контрольной группой.

Группы

Активность, нмоль/мин*мл

Здоровые

3,31±1,82

Леченые мелатонином

9,8±1,65

Нелеченные

19,78±3,56

Таблица 4.2. Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную активность влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки увеита.

Группы

АОА,

мкМ тролокса

Здоровые

888,25±55,26

Мелатонин

534,86±19,05

Нелеченные

315,00±10

Рисунок 4.2. Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную активность влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки увеита.

Таблица 4.3.  Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную активность влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки увеита в процентах от исходного

Здоровые

100

Мелатонин

60,22

Нелеченные

38,28

Рисунок 4.3.  Влияние инстилляций мелатонина на антиокислительную активность влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита в процентах от исходного.

Таблица 4.4 Влияние инстилляций мелатонина на активность СОД влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита у кроликов.

Здоровые

35,27±7,69

Мелатонин

48,86±20,90

Нелеченные

51,06±13,21

Рисунок 4.4. Влияние инстилляций мелатонина на активность СОД влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита у кроликов.

Таблица 4.5. Влияние инстилляций мелатонина на активность СОД влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита у кроликов в процентах от исходного.

Здоровые

100

Мелатонин

138,5

Нелеченные

144,8

Рисунок 4.5. Влияние инстилляций мелатонина на активность СОД влаги передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита у кроликов в процентах от исходного.

Таблица 4.6. Влияние инстилляций мелатонина на количество лейкоцитов во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита.

Группы

Лейкоцитов в поле зрения

Здоровые

0,25±0,16

Мелатонин

3,33±0,62

Нелеченные

1,64±0,30

Рисунок 4.6. Влияние инстилляций мелатонина на количество лейкоцитов во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита.

Таблица 4.7. Влияние инстилляций мелатонина на содержание белка во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита.

Группы

Количество белка, мг/мл

Здоровые

0,84± 0,04

Мелатонин

12,61±0,94

Нелеченные

0,81±0,81

Рисунок 4.7. Влияние инстилляций мелатонина на содержание белка во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита.

Таблица 4.7. Влияние инстилляций мелатонина на содержание белка во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита в процентах от исходного.

Группы

Количество белка, %

Здоровые

100

Мелатонин

1501,2

Нелеченные

2476,2

Рисунок 4.7. Влияние инстилляций мелатонина на содержание белка во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита в процентах от исходного.

Таблица 4.8. Влияние инстилляций мелатонина на активность 2-макроглобулина во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита.

Группы

Активность, нг/мин*мл

Здоровые

3,31±1,82

Мелатонин

9,8±1,65

Нелеченные

19,78±3,56

Рисунок 4.6. Влияние инстилляций мелатонина на активность 2-макроглобулина во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита. 

Таблица 4.9. Влияние инстилляций мелатонина на активность 2-макроглобулина во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита в процентах от исходного.

Группы

Активность 2-МГ, %

Здоровые

100

Мелатонин

296,1

Нелеченные

597,6

Рисунок 4.9. Влияние инстилляций мелатонина на активность 2-макроглобулина во влаге передней камеры глаза кроликов на 10 сутки экспериментального увеита в процентах от исходного.


  1.  Оценка выраженности визуально наблюдаемых признаков увеита.

На 2 сутки после введения разрешающей дозы лошадиной сыворотки у всех кроликов наблюдалась характерная картина переднего увеита. Конъюнктива была отечна и гиперемирована, наблюдался отек роговицы, отек и гиперемия радужки, во влаге передней камеры в большом количестве обнаруживался фибрин. У некоторых животных  образовалась стафилома (перфорация склеры) и гифема (кровь в передней камере глаза). У 2 животных лопнул кровеносный сосуд и наблюдалось слабое  кровотечение.  На поверхности передней капсулы хрусталика обнаруживались крупные и мелкие преципитаты, сгустки фибрина. Хрусталик становился диффузно либо полностью  мутным, стекловидное тело сквозь него визуализировалось с трудом, а у некоторых животных не визуализировалось совсем.

У нелеченных животных с течением времени воспаление прогрессировало: отек век и гиперемия конъюнктивы усиливались, нарастал отек роговицы. Сохранялась выраженная отечность и гиперемия радужки. Помутнение хрусталика прогрессировало. Количество фибрина уменьшалось незначительно, фибриновые преципитаты рассасывались с трудом.

 У животных, получавших инстилляции раствора мелатонина,

У животных, получавших инстилляции Дексаметазона,

У животных, получавших инстилляции Дексаметазона с мелатонином,  по сравнению с нелеченными наблюдалось достоверное уменьшение признаков конъюнктивита (уменьшение отека век, гиперемии конъюнктивы, отек роговицы, количества фибрина в передней камере глаза; к концу  острого периода наблюдалось уменьшение задних синехий). По данным показателям инстилляции мелатонина с дексаметазоном по эффективности сравнимы с применением Дексаметазона.  

Данные в таблицах представлены в виде среднего значения М и стандартной ошибки среднего арифметического m в условных баллах.

Во всех таблицах * означает достоверное отличие от нелеченных животных, ** - достоверное отличие от животных, леченных мелатонином и Дексаметазоном;

*** - достоверное отличие от животных, леченых Дексаметазоном;

**** - достоверное отличие от здоровых животных;

***** - достоверное отличие от животных, леченых мелатонином.

Таблица 1. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на отек век у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

отек век, баллы

группы

1

2

3

4

7

мелатонин

1,38±0,74*

1,75±0,49*

1,63±0,52**

1,38±0,36**

0,38±0,36*

мелатонин+дексаметазон

1,00±0,00*

1,43±0,40*

1,00±0,00*

0,43±0,40*

0,14±0,28*

дексаметазон

1,33±0,36*

1,80±0,31*

1,20±0,31*

1,40±0,62

0,20±0,31*

нелеченные

2,75±0,61***** ** ***

3,00±0,00 ***** ** ***

2,13±0,25 ** ***

1,75±0,32 **

1,25±0,49 ** ***

Рисунок 1. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на отек век у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 2. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на гиперемию конъюнктивы у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

гиперемия, баллы

группы

1

2

3

4

7

мелатонин

2,88±0,25**

2,88±0,25**

2,38±0,03**

1,88±0,58*

1,50±0,91

мелатонин+дексаметазон

2,00±0,56* *****

2,14±0,28* *****

1,29±0,56* *****

1,29±0,56*

0,57±0,58*

дексаметазон

2,50±0,38*

2,20±0,58*

2,20±0,58

1,80±0,58*

0,60±0,38*

нелеченные

3,00±0,00** ***

3,00±0,00** ***

2,88±0,25 **

2,75±0,49** ***** ***

2,13±0,69 ** ***

Рисунок 2. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на гиперемию конъюнктивы у кроликов при экспериментальномувеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 3. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на отек роговицы у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

отёк, баллы

группы

1

2

3

4

7

мелатонин

0,75±0,32*

1,25±0,32*

1,50±0,37* **

1,50±0,37* **

1,50±0,37**

мелатонин+дексаметазон

1,25±0,34*

1,29±0,36

1,00±0,00* *****

1,00±0,00* *****

1,00±0,00*

дексаметазон

1,17±0,28*

1,60±0,38

1,20±0,31*

1,20±0,31*

1,00±0,00*

нелеченные

1,63±0,36 ** ***** ***

2,00±0,52 *****

2,38±0,52** *****  ***

2,50±0,52 ** *****  ***

2,00±0,64 ** ***

Рисунок 3. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на отек роговицы у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 4. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на отек радужки у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

отек, баллы

группы

1

2

3

4

7

мелатонин

1,00±0,00* ***

2,00±0,00*

2,25±0,32

2,50±0,37

2,38±0,36

мелатонин+дексаметазон

1,13±0,47

1,75±0,34*

1,86±0,51*

2,29±0,56

2,00±0,60*

дексаметазон

1,50±0,38 *****

2,20±0,58

2,20±0,31

2,20±0,58*

1,80±0,31

нелеченные

1,67±0,36 *****

2,50±0,38 ***** **

2,67±0,36 **

2,67±0,36 ***

2,86±0,48 **

Рисунок 4. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на отек радужки у кроликов при экспериментальномувеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 5. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на количество фибрина в передней камере глаза у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

фибрин, баллы

группы

1

2

3

4

7

мелатонин

1,38±0,36*

1,50±0,52

1,63±052

1,75±0,61

1,50±0,64

мелатонин+дексаметазон

1,50±0,89

1,29±0,56*

1,14±0,28

1,43±0,40

1,00±0,43

дексаметазон

1,17±0,52*

1,20±0,31*

1,00±0,00

1,00±0,49

1,00±0,00

нелеченные

2,38±0,74***** ***

2,38±0,74 ** ***

2,13±0,86

2,13±0,86

2,00±1,05

Рисунок 5. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на количество фибрина в передней камере глаза у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

Таблица 6. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на образование задних синехий у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

синехии, баллы

группы

1

2

3

4

7

мелатонин

3,00±0,00**

3,00±0,00**

2,38±0,36

2,38±0,36

2,88±0,28** ***

мелатонин+дексаметазон

2,00±0,56*** *****

2,00±0,00* *** *****

2,14±0,28

2,14±0,28*

2,00±0,00* *****

дексаметазон

2,83±0,28 **

2,60±0,38 **

2,20±0,31

2,00±0,00*

2,00±0,00* *****

нелеченные

2,63±0,52

2,63±0,52 **

2,50±0,52

2,75±0,32 ** ***

2,75±0,49 ** ***

Рисунок 6. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на образование задних синехий у кроликов при экспериментальном увеите по сравнению с контрольной группой.

  1.  Определение влияния инстилляций мелатонина, Дексаметазон и их комбинации на изменения биохимических показателей влаги передней камеры глаза кролика на 8 сутки экспериментального увеита.

Таблица 1. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на количество лейкоцитов во влаге передней камеры глаза кроликов при экспериментальном увеите на 8 сутки.

Группы

 Лейкоциты, кл. в п/зрения

мелатонин

2,83±0,74 ****

мелатонин+дексаметазон

4,9±0,98 ****

дексаметазон

3,43±0,74****

нелеченные

6,21±1,51****

здоровые

0,5±0,25 * ** *** *****

Рисунок 1. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на количество лейкоцитов во влаге передней камеры глаза кроликов при экспериментальном увеите на 8 сутки.

Таблица 2. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на активность 2-макроглобулина во влаге передней камеры глаза кроликов при экспериментальном увеитена 8 сутки по сравнению с контрольной группой.

Группы

Альфа2-МГ  (нмоль/мг*мл)

мелатонин

5,44±1,12 *** ****

мелатонин+дексаметазон

5,76±0,69 *** ****

дексаметазон

3,44±0,81 * ** **** *****

нелеченные

6,34±0,86 **** ***

здоровые

1,26±0,48 ***** ** ***

Рисунок 2. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на активность 2-макроглобулина во влаге передней камеры глаза кроликов при экспериментальном увеите на 8 сутки.

Таблица 3. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на антиокислительную активность влаги передней камеры глаза кроликов на 8 сутки увеита.

группы

 АОА, мкм тролокса

мелатонин

203,42±19,20* *** ****

мелатонин+дексаметазон

153,08±26,56 * ****

дексаметазон

120,36±17,05 * **** *****

нелеченные

68,57±14,00 **** ** ***

здоровые

1243,79±115,22 * **  *****

Рисунок 3. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазон и их комбинации на антиокислительную активность влаги передней камеры глаза кроликов на 8 сутки увеита.

Таблица 4. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на активность СОД влаги передней камеры глаза кроликов на 8 сутки экспериментального увеита.

Группы

Активность СОД, U/ml

мелатонин

109,27±1,34 *** ****

мелатонин+дексаметазон

113,66±10,65 *** ****

дексаметазон

94,84±7,28 * ** **** *****

нелеченные

118,88±6,54 ** *** ****

здоровые

19±3,97 * ** *** *****

Рисунок 4. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на активность СОД влаги передней камеры глаза кроликов на 8 сутки экспериментального увеита.

Таблица 6. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на содержание белка во влаге передней камеры глаза кроликов на 8 сутки увеита.

Группы

 Белок (мг/мл)

мелатонин

18,26±0,67 * *** ****

мелатонин+дексаметазон

16,69±0,68 * *** ****

дексаметазон

12,61±0,56 * ****

нелеченные

25,12±1,77 ****

здоровые

2,35±0,16 * ** *** *****

Рисунок 6. Влияние инстилляций мелатонина, Дексаметазона и их комбинации на содержание белка во влаге передней камеры глаза кроликов на 8 сутки увеита.


 

А также другие работы, которые могут Вас заинтересовать

47299. Исследование института авторских прав в российском гражданском праве 97.32 KB
  Первооткрывателем в сфере авторского права стала Великобритания где в 1710 г. Однако практическая реализация указанных прав и обеспечение их эффективной охраны в некоторых случаях зависят от добросовестности лиц обладающих субъективными правами на произведения науки литературы и искусства. Систематизация законодательства об авторских и смежных правах и об интеллектуальной собственности в целом в том числе норм об обязательствах позволила исключить некоторые противоречия например между законодательством о произведениях и программах для...
47300. Электроснабжение района города и развивающегося промышленного предприятия 8.61 MB
  Проверка выбранных кабелей по потерям напряжения. Проверка кабелей 10 кВ по нагреву в послеаварийном режиме и допустимым потерям напряжения.3 Проверка кабелей 10 кВ по допустимым потерям напряжения. Проверка кабелей 10 кВ по нагреву в послеаварийном режиме и допустимым потерям напряжения.
47301. Контроль знаний и умений учащихся по математике в школе 390 KB
  Проблема контроля за учебной деятельностью учащихся не нова, и педагогический опыт накопленный в этой области богат и разносторонен. В этой работе систематизированы накопленные сведения по проблеме контроля знаний учащихся. Эта система сведений применена при изучении темы “Тела вращения”
47302. Качество напряжения на электроприемниках жилых и общественных зданий микрорайона 2.33 MB
  Объектом электроснабжения является район города, состоящий из двух микрорайонов и располагающийся в г. Казань. Все потребители электроэнергии в заданном районе условно можно разделить на две группы: жилые дома и общественно-коммунальные учреждения. В состав района входят электроприемники, относящиеся к I категории надежности электроснабжения. Это лифтовые установки, аварийное освещение и системы противопожарной безопасности в 25-этажных жилых домах.
47303. Теория и методика преподавания иностранных языков и культур 125.5 KB
  Методическое пособие по подготовке и защите выпускной квалификационной работы для студентов специальностей 031201. кандидат педагогических наук Челябинск 2008 НАЗНАЧЕНИЕ ВЫПУСКНОЙ КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ ПО СОДЕРЖАНИЮ РАБОТЫ Одним из видов итоговой аттестации выпускника специальностей ТИМ и Перевод и переводоведение является защита выпускной квалификационной работы которая выполняется в форме дипломной работы. Написание дипломной работы имеет целью: систематизацию закрепление и расширение...
47304. Промышленное и гражданское строительство 404 KB
  Методические указания разработаны с учетом содержания учебного плана ГОУ ВПО ТюмГАСУ составленного на основании Государственного образовательного стандарта высшего и профессионального образования требований кафедры СПОФ и смежных кафедр к содержанию и объему соответствующих разделов дипломного проекта для студентов очной и заочной форм обучения специальности 270102 Промышленное и гражданское строительство.3 Методика работы над дипломным проектом. 7 2 Разработка отдельных разделов дипломного проекта.2 Вариантное...
47306. Основы обороны государства 807.2 KB
  Россия – одна из крупнейших стран мира, имеющая богатые исторические и культурные традиции. Ее экономический, научно–технический и военный потенциал, уникальное географическое положение на Евразийском континенте позволяют Российской Федерации играть важную роль в современном мире.
47307. Анализ производственной деятельности ОАО «Уссурремтехснаб» 1.19 MB
  В процессе выполнения сельскохозяйственных работ детали и узлы машин изнашиваются. Износ деталей вызывает простои машин из-за технических неисправностей и нарушение агротехнических сроков. Снижается качество работы, падает производительность и увеличиваются расходы на содержание машин.